KR101602138B1

KR101602138B1 - 염화칼슘 미세입자가 봉입된 온도 의존성 고체지질입자 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101602138B1
Application number: KR1020140163372A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 김성수
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2016-03-10

Abstract

본 발명은 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자가 봉입된 온도 의존성 고체지질입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 봉입된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 온도 변화에 따라 선택적으로 방출하는 효과를 발휘한다.

Description

염화칼슘 미세입자가 봉입된 온도 의존성 고체지질입자 및 그 제조방법 {Temperature dependent solid lipid particle with calcium chloride particle and manufacturing method thereof}

본 발명은 염화칼슘(calcium chloride, CaCl₂) 미세입자가 봉입된 온도 의존성 고체지질입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고체지질입자가 융점온도(melting point) 이상에서 에멀젼 액적(emulsion droplet)이 되어 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 방출하는 온도 의존성 고체지질입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.

엔캡슐레이션(encapsulation)은 코어물질(core materials)을 벽체물질(wall materials)로 둘러싸거나 코팅하여 봉입(envelopment)하는 기술이다. 코어물질이 약물인 경우 엔캡슐레이션(encapsulation)은 코어물질의 부작용 경감, 방출 제어 및 화학적 안정성을 향상시킨다. 이때, 온도변화, pH 변화, 광 조사(light irradiation), 자기장(magnetic field), 전기장(electric filed), 산화/환원 반응(redox reaction)과 같은 외부자극들이 코어물질의 방출을 제어하는 변수로서 사용된다.

이와 같은 외부자극에 반응하여 코어물질을 방출할 수 있는 특징을 가진 물질이 엔캡슐레이션(encapsulation)의 벽체물질(wall materials)로 이용되고 있다. 벽체물질(wall materials) 중 하나인 리포좀은 열에너지가 가해지면 외부의 온도 감응성 고분자 사슬이 수축하고, 리포좀 막에 기계적인 스트레스가 부과되어 코어물질을 방출하는 기작을 지닌다. 특정한 인지질 (예를 들면, dimiristoyl phosphatidylcholine, dipalmitoyl phosphatidylcholine, distearoyl phosphatidylcholine)로 구성된 리포좀은 리포좀 막이 특정한 온도에서 고체 겔(solid gel)에서 액정(liquid crystal)으로 상 전이(phase transition)하기 때문에, 온도 변화에 민감하게 반응하여 내용물을 방출한다.

한편, 최근 10년간 리포좀(liposome) 또는 폴리머 입자의 대안으로서 고형지질나노입자(solid lipid nanoparticles; SLN)가 연구되어 왔는데, 이 시스템의 일반적인 장점은 약물의 제어방출, 약물 타겟팅, 약물의 안정성 증대, 고효율의 약물 봉입율, 약물수송체의 무독성, 유기용매를 사용하지 않는 제법, 대량 생산의 용이성 등을 들 수 있다.

고형지질나노입자는 초기에는 주사용 약제개발에 연구되어 왔으며(Mehnert, and Mader, Adv. Drug Deliv. Rev., 47 , 165-196, 2001; Muller et al, Eur. J Pharm. Biopharm., 50 , 161-177, 2000), 경구 및 국소외용제로의 연구도 진행되고 있다.

한편, 염화칼슘(CaCl₂)은 복염(複鹽)으로서, 타키하이드라이트 등의 광물로서 산출되며, 바닷물 속에 0.15% 함유되어 있다. 염화칼슘(CaCl₂) 무수물은 조해성이 있는 사방정계의 백색 결정으로 약간 비틀어진 루틸 구조를 띄고 있으며, 화학식량은 111.0, 녹는점은 772℃, 끓는점은 1935℃(anhydrous), 비중은 2.15이다. 물에 대한 용해도, 즉 물 100 g에 최대로 녹는 염화칼슘의 g수는 74.5 g(20℃)으로 상당히 높은 편이며 알코올, 아세톤에도 잘 녹는다.

염화칼슘은 탄산칼슘과 묽은염산을 반응시키면 수득할 수 있는데, 탄산칼슘에 묽은염산을 작용시켜 생성된 용액을 증발시키면 온도에 따라 여러 가지 염화칼슘 수화물을 얻을 수 있다. -54.9~29℃ 온도의 포화용액에서는 육수화물(CaCl₂·6H₂O), 29~45℃ 온도의 포화용액에서는 사수화물(CaCl₂·4H₂O), 45℃ 온도 이상의 포화용액에서는 이수화물(CaCl₂·2H₂O)로 석출된다. 또한, 175℃ 온도에서는 일수화물(CaCl₂·H₂O), 약 300℃ 온도에서는 무수물인 염화칼슘(CaCl₂)이 생성된다.

이수화물 및 무수물은 조해성이 강하여 수분을 잘 흡수하므로 장마철 건조제로 많이 이용되고 있다. 또한, 육수화물(CaCl2·6H2O)을 얼음과 1.44 대 1의 비율로 섞어서 만든 냉각제(한제)는 －54.9℃까지 온도를 낮출 수 있다. 겨울철에 눈 위에 염화칼슘을 뿌리면 그 주변의 습기를 흡수하여 녹게 되는데 녹으면서 내놓는 열이 주변의 눈을 다시 녹인다. 염화칼슘으로 녹은 물은 -54.9℃가 되어야 다시 얼 수 있기 때문에 눈으로 빙판이 된 길을 녹이고 또한 다시 얼어붙지 않게 만드는 제설제로 아주 유용하다.

또한, 염화칼슘은 의약품으로도 이용되는데 칼슘제 중에서 가장 흡수가 빠른 특성이 있다. 다만, 직접 복용하면 위를 해치기 때문에 주로 주사제로 사용된다.

대한민국 등록특허 제10-0818033호(발명의 명칭:포스파티딜세린 함유 고체 지질 나노입자 조성물 및 그의 제조방법)에는, 포스파티딜세린 및 유지를 포함하는 수용액의 형태로서, 상기 포스파티딜세린은 상기 유지에 둘러싸여 있고, 상기 유지에 둘러싸인 포스파티딜세린은 상기 수용액에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린 함유 고체 지질 나노입자 조성물에 대해 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제0-2010-0103846호(발명의 명칭: 내부 고체 코어 내에 성장 호르몬을 함유하는 고체 지질 마이크로캡슐)에는, 성장 호르몬, 벌크제, 계면활성제를 함유하는 하나 이상의 내부 고체 코어 및 1 종 이상의 지질을 포함하는 외부 쉘을 포함하는 마이크로캡슐에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 특정 온도 이하에서는 염화칼슘(CaCl₂)을 방출하지 않고 특정온도 이상에서만 염화칼슘을 방출하는 전달 매개체를 개발하여 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자가 지질입자 내부에 봉입된 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자를 제공한다.

본 발명의 온도 의존성 고체지질입자에 있어서, 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자는 바람직하게 염화칼슘(CaCl₂) 분말을 분산제와 1:0.005~1:0.33의 중량비로 혼합하여 균질화하여 제조된 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 1:0.01~1:0.2인 것이 좋으며, 가장 바람직하게는 1:0.02~1:0.1인 것이 좋다. 이때, 1:0.005보다 낮은 비율에서는 분산제의 양이 너무 적어 염화칼슘(CaCl₂)의 분산이 어렵고, 1:0.33보다 높은 비율에서는 분산제의 양이 많아 염화칼슘(CaCl₂) 분말이 뭉쳐 균질화가 어렵다. 나아가서는 온도 의존성 고체지질입자의 형성을 방해한다.

본 발명의 온도 의존성 고체지질입자에 있어서, 상기 분산제는 일 예로 트윈(tween)80과 스판(span)80의 혼합물, 트윈(tween)20 및 친수성 친유성 평형(HLB, hydrophilic lipophilic balance) 5~12의 계면활성제 중 선택되는 하나일 수 있다.

본 발명의 온도 의존성 고체지질입자에 있어서, 상기 트윈(tween)80과 스판(span)80의 혼합물은 바람직하게 1:1.5~1:3의 중량비로 혼합되어진 것이 좋다.

본 발명의 온도 의존성 고체지질입자에 있어서, 상기 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자와 지질입자는 바람직하게 1:50~1:200의 중량비로 혼합되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 1:10~1:100인 것이 좋고, 가장 바람직하게는 1:2~1:10인 것이 좋다. 이때, 1:50보다 낮은 비율에서는 지질 대비 염화칼슘(CaCl₂)의 양이 너무 많아 수상에 용출되어 나올 수 있고, 1:200보다 높은 비율에서는 염화칼슘(CaCl₂)이 지질입자에 봉입 및 방출되는 양이 매우 적어 표적에 효과를 미치기가 어렵다.

본 발명은 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자 및 지질 용융액을 수상에 첨가하는 단계 (a); 상기 단계 (a) 후, 교반 및 유화시켜 지질유화액을 제조하는 단계 (b); 및 상기 지질유화액을 교반 및 냉각하여 고체지질입자로 제조하는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자의 제조 방법을 제공한다.

이하에서는 본 발명의 온도 의존성 고체지질입자의 제조 방법에 대하여 각 단계별로 자세히 설명하겠다.

<(a) 염화칼슘(CaCl ₂ ) 미세입자 및 지질 용융액을 수상에 첨가하는 단계>

본 단계는 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자 및 지질 용융액을 각각 제조하여 수상에 첨가하는 단계이다.

이때, 상기 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자는 바람직하게 염화칼슘(CaCl₂) 분말을 분산제와 1:0.005~1:0.33의 중량비로 혼합하여 균질화하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 1:0.01~1:0.2인 것이 좋으며, 가장 바람직하게는 1:0.02~1:0.1인 것이 좋다. 이때, 1:0.005보다 낮은 비율에서는 분산제의 양이 너무 적어 염화칼슘(CaCl₂)의 분산이 어렵고, 1:0.33보다 높은 비율에서는 분산제의 양이 많아 염화칼슘(CaCl₂) 분말이 뭉쳐 균질화가 어렵다. 나아가서는 온도 의존성 고체지질입자의 형성을 방해한다.

또한, 상기 분산제는 일 예로 트윈(tween)80 과 스판(span)80의 혼합물, 트윈(tween)20 및 친수성 친유성 평형(HLB, hydrophilic lipophilic balance) 5~12의 계면활성제 중 선택되는 하나일 수 있으며, 상기 트윈(tween)80과 스판(span)80의 혼합물은 바람직하게 1:1.5~1:3의 중량비로 혼합되어진 것이 좋다.

한편, 상기 지질 용융액은 지질을 80~90℃ 온도에서 용융시키는 것이 좋다.

한편, 상기 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자와 지질 용융액은 바람직하게 1:50~1:200의 중량비로 혼합되어 수상에 첨가되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 1:10~1:100인 것이 좋고, 가장 바람직하게는 1:2~1:10인 것이 좋다. 이때, 1:50보다 낮은 비율에서는 지질 대비 염화칼슘(CaCl₂)의 양이 너무 많아 수상에 용출되어 나올 수 있고, 1:200보다 높은 비율에서는 염화칼슘(CaCl₂)이 지질입자에 봉입 및 방출되는 양이 매우 적어 표적에 효과를 미치기가 어렵다.

한편, 상기 수상과 지질 용융액의 부피비는 바람직하게 1:0.1~1:0.3인 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 1:0.02~1:0.2인 것이 좋고, 가장 바람직하게는 1:0.03~1:0.1인 것이 좋다. 이때, 1:0.1보다 낮은 부피비에서는 생성되는 고체지질입자의 양이 적어 비경제적이고, 1:0.3보다 높은 부피비에서는 지질의 양이 너무 많아, 유화가 어렵고, 상분리 현상이 발생한다. 나아가서는 온도 의존성 고체지질입자의 형성을 방해한다.

<(b) 지질유화액을 제조하는 단계>

본 단계는 상기 단계 (a)에서 수상에 첨가된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자 및 지질 용융액의 온도를 80~90℃로 교반 및 유화하여 지질유화액을 제조하는 단계이다.

이때, 교반은 바람직하게 1~800 rpm의 속도로 하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 100~300rpm의 속도인 것이 좋다. 상기 범위 이하의 속도에서는 입자 직경이 매우 크고, 이상의 속도에서는 입자의 직경이 매우 작아 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 봉입이 어렵다.

<(c) 지질유화액을 교반 및 냉각하여 고체지질입자로 제조하는 단계>

본 단계는 상기 단계 (b)의 지질유화액을 교반 및 냉각하여 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 봉입한 고체지질입자로 제조하는 단계이다.

이때, 지질유화액은 10~30℃ 온도에서 교반 및 냉각시키는 것이 좋다.

한편, 상기 단계 (c) 후, 고체지질입자를 투석 및 냉각시키는 단계 (d);를 추가로 포함하는 것이 좋으며, 투석 전, 고체지질입자를 동결건조 할 수 있다.

본 발명의 고체지질입자 제조방법에 있어서, 상기 투석은 동결건조시, 고체지질표면에 침적되는 Ca²⁺이온을 제거할 수 있다.

본 발명은 지질입자 내부에 봉입된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 온도 변화에 따라 선택적으로 외부에 방출하는 효과를 발휘한다.

도 1은 '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비에 따라 제조된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자의 영상분석기 사진이다 (CaCl₂(1:0.2) (a), CaCl₂(1:0.1)(b), CaCl₂(1:0.05)(c), CaCl₂(1:0)(d)).
도 2는 '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비에 따라 제조된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자의 크기 분포 그래프이다 (CaCl₂ (1:0.1)(a), CaCl₂ (1:0.05)(b), CaCl₂ (1:0)(c)).
도 3A는 200 rpm(a), 400 rpm(b), 800 rpm(c)의 속도로 제조된 고체지질입자의 광학 현미경 사진이다.
도 3B는 200 rpm(a), 400 rpm(b), 800 rpm(c)의 속도로 제조된 고체지질입자의 크기 분포 그래프이다.
도 4는 투석액에서 시간경과에 따른 Ca²⁺ 농도를 측정한 그래프이다.
도 5는 투석하기 전(A)·후(B)에 CaCl₂(1:0.05)를 함유한 고체지질입자를 촬영한 SEM 사진이다.
도 6은 투석하기 전(A)·후(B)에 CaCl₂(1:0.05)를 함유한 고체지질입자의 분산형 X선 분광기(energy dispersive X-ray spectrometer, EDS) 스펙트럼이다.
도 7은 PBSA(a), CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입되지 않은 고체지질입자(b), Tween20(분산제)을 함유한 고체지질입자(c), CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자(d)의 DSC 열곡선이다.
도 8은 20 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃에서 22 시간 동안 고체지질입자로부터 방출되어 나온 Ca²⁺의 방출 그래프이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실험예 1: 염화칼슘( CaCl ₂ ) 미세입자 제조시 '염화칼슘( CaCl ₂ )/ 분산제 ' 중량비 결정]

본 실험예에서 염화칼슘(CaCl₂) 분말과 분산제인 Tween80/Span80 (35/65, w/w) 혼합물을 혼합하여 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 제조하여 그 크기를 측정함으로써, 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자에 대한 '염화칼슘(CaCl₂)/분산제' 중량비를 결정하고자 하였다.

염화칼슘(CaCl₂) 분말 2 g과 분산제인 Tween80/Span80 (35/65, w/w) 혼합물을 막자 사발(mortar)에 넣어, '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비가 1:0.2, 1:0.1, 1:0.05, 1:0이 되게 각각 혼합하여 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 제조하였다. 이하, '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비가 1:0.2, 1:0.1, 1:0.05, 1:0인 혼합물로 제조된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 각각 CaCl₂(1:0.2), CaCl₂(1:0.1), CaCl₂(1:0.05), CaCl₂(1:0)라고 명명하였다.

각각의 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 막자 사발에서 1시간 동안 갈고, 미세입자의 크기를 영상분석기(image analyser, Vernier, LQ2-LE)로 측정하였다.

실험결과, CaCl₂(1:0.2)의 사진에서는 분산되지 않은 큰 덩어리들이 관찰되었고, CaCl₂(1:0.1), CaCl₂(1:0.05), CaCl₂(1:0)의 사진에서는 분산된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자가 관찰되었다 (도 1). 도 1은 '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비에 따라 제조된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자의 영상분석기 사진이다 (CaCl₂(1:0.2) (a), CaCl₂(1:0.1)(b), CaCl₂(1:0.05)(c), CaCl₂(1:0)(d)).

한편, 도 2는 '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비에 따라 제조된 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자의 크기 분포 그래프이다 (CaCl2 (1:0.1)(a), CaCl2 (1:0.05)(b), CaCl2 (1:0)(c)). 도 2에 따르면, '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비가 CaCl₂ (1:0.1)인 경우, 가장 많이 발견되는 입자의 크기는 3~4 ㎛ 였다. 이와 같은 결과는, 분산제의 양이 과량이기 때문에 입자들을 뭉치게 한것으로 보여졌다. CaCl₂(1:0.05)의 경우, 입자의 크기는 1~5 ㎛이었고 가장 많이 발견되는 입자의 크기는 2~3 ㎛ 이었다. CaCl₂(1:0)의 경우, 크기는 수-수십 ㎛ 이었고, 가장 많이 발견되는 입자는 10 ㎛ 보다 큰 입자였다.

상기의 실험 결과에서 보듯이, '염화칼슘(CaCl₂)/분산제'의 중량비가 CaCl₂ (1:0.05)의 경우, 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자가 가장 잘 제조된 것으로 나타났다. 따라서, 하기 고체지질입자의 제조에서는 CaCl₂ (1:0.05)를 사용하기로 하였다.

[ 실험예 2: 고체지질입자 제조를 위한 교반 속도 결정]

본 실험예에서는 지질 유화액을 교반 및 냉각하여 제조한 고체지질입자의 크기를 측정함으로써, 고체지질입자 제조를 위한 교반 속도를 결정하고자 하였다. 이때, 지질은 PBSA(palm-base stearic acid)을 사용하였다.

트윈(Tween)20 (분산제) 0.2 g을 40 ml의 증류수에 용해시킨 후, 가열하여 85℃가 되게 하고 따로 준비해두었다. 그 후, PBSA 2 g을 85℃의 수조에서 용융시켜 지질 용융액을 제조하였다.

상기, 트윈(Tween)20 (분산제)이 용해된 증류수(수상)를 자성 교반자(stirring bar)를 이용하여 200 rpm, 400 rpm, 800 rpm의 속도로 각각 교반하면서 증류수에 지질 용융액을 서서히 첨가하고, 85℃에서 5분 동안 교반 및 유화하였다.

유화 직후에 지질유화액을 담고 있는 비이커를 500 ml 얼음물(ice water)에 담구고, 지질유화액이 약 20 ℃가 될 때까지 자성 교반자(stirring bar)로 교반을 계속하여 고체지질입자를 제조하였다. 그 후, 제조된 고체지질입자를 광학 현미경으로 관찰하였다.

실험결과, 교반속도가 800 rpm일 때, 입자의 직경은 5~40 ㎛ 이었고 가장 많이 발견되는 입자의 직경은 10~20 ㎛ 이었다. 교반속도가 400rpm일 때, 입자의 직경은 10~50 ㎛ 이었고 가장 많이 발견되는 입자의 직경은 10~30 ㎛ 이었다. 교반속도가 200 rpm일 때, 입자의 직경은 10~150 ㎛ 이었고 가장 많이 발견되는 입자의 직경은 50~150 ㎛ 이었다 (도 3). 도 3은 200 rpm(a), 400 rpm(b), 800 rpm(c)의 교반속도로 제조된 고체지질입자의 광학 현미경 사진과 크기분포 그래프이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 교반속도가 낮을수록 유화된 액적의 크기가 더 큰 것으로 나타났다. 본 발명의 목적들 중의 하나는 염화칼슘(CaCl₂)을 고체지질입자에 봉입하는 것이기 때문에, 고체지질입자의 크기가 클수록 염화칼슘(CaCl₂)을 봉입하는데 유리하다. 따라서, 하기 고체지질입자의 제조에서는 교반속도 200 rpm로 교반하기로 하였다.

[ 실시예 1: 염화칼슘이 봉입된 고체지질입자의 제조]

본 실시예에서 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자가 봉입된 고체지질입자를 제조하고자 하였다.

염화칼슘(CaCl₂) 분말과 분산제인 Tween80/Span80 (35/65, w/w) 혼합물을 중량비 1:0.05로 혼합하여 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자 0.42 g을 제조하여 따로 두고, PBSA(palm-base stearic acid) 2 g을 85℃의 수조에서 용융시켜 지질 용융액을 제조하여 따로 두었다.

그 후, 85℃의 수조에서 트윈(Tween)20 (분산제)가 용해된 증류수(수상)에 상기 PBSA(palm-base stearic acid) 용융액 2 g과 CaCl₂ (1:0.05) 0.42 g의 혼합물을 첨가하고, 자성 교반자(stirring bar)를 이용하여 200 rpm으로 교반 및 유화시켜 지질유화액을 제조하였다. 제조 후, 지질유화액을 20℃로 교반 및 냉각한 후, 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자' 100 mg을 수득하였다.

[ 실시예 2: 투석 과정을 추가로 거친 염화칼슘 봉입 고체지질입자의 제조]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득한 고체지질입자를 동결건조한 후, 투석하여 고체지질입자에 봉입되지 않은 염화칼슘(CaCl₂)을 제거하고자 하였다.

상기 실시예 1의 고체지질입자를 동결건조한 후, 동결건조된 고체지질입자 100 mg과 증류수 10 ml을 투석 주머니 (MWCO 10,000)에 넣고, 800 ml 증류수에서 담궈 24시간 동안 1차 투석하였다. 1차 투석 후, 동일한 양의 새로운 증류수로 교체한 후 다시 24시간 동안 2차 투석하였다. 2차 투석 후, 투석액에서 Ca²⁺의 농도를 칼슘농도 측정기(Vernier, LQ2-LE)를 이용하여 시간 경과에 따라 측정하였다.

실험결과, 1차 투석에서 Ca²⁺의 농도는 처음 8시간 동안 증가하였고, 나머지 시간 동안은 거의 변하지 않았다. 농도가 증가하는 것은 봉입되지 않은 염화칼슘(CaCl₂)이 증류수(수상)에 용해되어 Ca²⁺가 투석 주머니 밖으로 빠져 나온 것이고, 시간이 충분히 지난 후, 농도가 일정한 것은 투석 주머니 안의 수상과 밖의 수상 사이에서 평형상태가 이루어진 것으로 판단할 수 있었다.

2차 투석액에서 Ca²⁺의 농도가 거의 0에 근접하였고 24시간 동안 거의 일정하였다. 이것은 Ca² ⁺가 투석주머니로부터 제거되었다는 것을 의미한다 (도 4). 도 4는 투석액에서 시간경과에 따른 Ca² ⁺ 농도를 측정한 그래프이다.

한편, 투석액에서 측정된 Ca² ⁺농도를 이용하여 비탑재량(specific loading)을 계산하였는데, 1차 투석에서 0.034 mg/mg, 2차 투석에서 0.036 mg/mg 이었다.

[실험예 3: 주사전자현미경 및 분산형 X선 분광기 촬영]

본 실험예에서는 봉입되지 않은 염화칼슘(CaCl₂)을 투석으로 제거하기 전·후의 상태에 대해, 주사전자현미경 및 분산형 X선 분광기(scanning electron microscope-energy dispersive X-ray spectrometer, SEM-EDS)를 이용하여 촬영하고자 하였다.

봉입되지 않은 염화칼슘(CaCl₂)을 투석으로 제거하기 전·후의 고체지질입자 현탁액을 동결건조하고, 금으로 코팅하여 주사전자현미경(scanning electron microscope, Hitachi S-4800)에서 촬영하였다. 고체지질입자의 표면 조성은 분산형 X선 분광기(energy dispersive X-ray spectrometer)가 장착되어 있는 전자 현미경(electron microscope)에서 측정하였다.

실험결과, 투석 전·후에 촬영한 고체지질입자의 SEM 사진에서 입자의 직경은 큰 차이가 없는 것으로 보여졌고, 수십~100 ㎛ 이상의 입자들이 관찰되었다.

이와 같은 결과는 고체지질입자의 연속상을 이루고 있는 PBSA가 불연속상의 코어물질인 염화칼슘(CaCl₂)에 비해서 과량으로 존재(PBSA:CaCl₂ 중량비는 1:0.2 이다)하기 때문에 발생한 현상으로, 투석 과정을 거친다 하더라도 고체지질입자는 형상의 완전성(integrity)을 유지하여 고체지질입자의 크기가 크게 변화되지 않음을 의미한다.

한편, SEM 사진에서 입자의 표면을 관찰한 결과, 투석하기 전·후 모든 경우에 고체지질입자의 표면은 거칠었다. 고체지질입자가 증류수(수상)에서 제조되었기 때문에 오일액적의 경계면에 존재하는 염화칼슘(CaCl₂) 입자는 증류수(수상)에서 용해되어 지질입자 표면에 공극을 남기고 결과적으로 입자 표면이 거칠어진 것으로 판단되었다 (도 5). 도 5는 투석하기 전(A)·후(B)에 CaCl₂(1:0.05)를 함유한 고체지질입자를 촬영한 SEM 사진이다.

한편, 분산형 X선 분광기(energy dispersive X-ray spectrometer) 측정 결과, 투석하기 전에 고체지질입자의 EDS 스펙트럼에서, Ca 신호가 3.7 eV 부근에서 발견 되었고, 고체지질입자 표면에서 Ca 함량은 3.54 %(w/w)로 측정되었다. 투석하기 전이기 때문에 CaCl₂ (1:0.05)입자를 함유한 고체지질입자 현탁액은 지질입자 매트릭스 내부에 CaCl₂입자를 함유하고 있을 뿐만 아니라 수상에도 Ca² ⁺이온을 함유하고 있다. 이와 같이 고체지질입자 외부에 Ca² ⁺이온을 함유하는 현탁액을 동결건조하면 건조과정에서 수상에 용해되어 있는 Ca² ⁺이온이 고체지질표면에 침적될 수 있고, 이로인해 고체지질입자 표면에 Ca 신호가 검출되는 것으로 판단되었다.

한편, 투석 후, 고체지질입자의 EDS 스펙트럼에서 Ca 신호는 감지되지 않았다. 이는 CaCl₂ (1:0.05)를 함유한 고체지질입자 현탁액을 Ca² ⁺가 관찰되지 않을 때까지 투석하였기 때문에, 투석된 현탁액은 지질매트릭스 내에 CaCl₂ 입자를 봉입하고 있을 뿐이고 수상에서 Ca² ⁺를 함유하고 있지 않았기 때문인 것으로 추론되었다. 따라서, 동결건조 후에도 Ca² ⁺는 고체지질입자표면에 침적되지 않고, 이로인해 고체지질입자 표면에 Ca 신호가 검출되지 않는 것으로 판단되었다 (도 6). 도 6은 투석하기 전(A)·후(B)에 CaCl₂(1:0.05)를 함유한 고체지질입자의 분산형 X선 분광기(energy dispersive X-ray spectrometer, EDS) 스펙트럼이다.

[실험예 4. 열분석 (Differential scanning calorimetry)]

PBSA, CaCl₂ (1:0.05) 입자를 함유하지 않은 고체지질입자, Tween20(분산제)을 함유한 고체지질입자 및 상기 실시예 1에서 수득한 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자'를 각각 5 mg씩 알루미늄 팬(pan)에 넣고, 시차주사 열량계(differential scanning calorimeter, DSC Q2000, TA Instruments, USA)에서 2 ℃/min의 가열속도로 20~80℃ 온도범위에서 스캔하여 DSC 열 곡선을 얻었다.

실험결과, PBSA, CaCl₂ (1:0.05)입자를 함유하지 않은 고체지질입자, Tween20(분산제)을 함유한 고체지질입자 및 상기 실시예 1에서 수득한 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자'는 모두 56 ℃부근에서 흡열 피크(endothermic peak)를 나타내었다 (도 7). 도 7은 PBSA(a), 고체지질입자(b), Tween20(분산제)을 함유한 고체지질입자(c), CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자(d)의 DSC 열곡선이다.

상기와 같은 결과는 PBSA, CaCl₂ (1:0.05)입자를 함유하지 않은 고체지질입자, Tween20(분산제)을 함유한 고체지질입자 및 상기 실시예 1에서 수득한 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자'의 융점이 모두 같음을 보여주었다. 이는, PBSA를 용융시키고 고화시키는 과정 동안에 PBSA의 결정구조가 변하지 않았음을 의미하고, 분산제 및 염화칼슘(CaCl₂)이 고체지질입자의 내부결정구조에 영향을 미치지 않았음을 보여주는 것이다.

[실험예 5. 고체지질입자로 부터 Ca ²⁺ 방출]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 수득한 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자'의 온도 변화에 따른 Ca²⁺ 방출에 대해 측정하고자 하였다.

'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자' 20 mg을 20 ml 유리병에 담겨있는 2 ml 증류수에 넣고, 상기 유리병을 수조에 담구어 현탁액의 온도가 20 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃가 되게 하고, Ca²⁺의 농도를 칼슘 이온 측정기로 측정하였다. 방출 정도는 고체지질입자에 봉입된 총 염화칼슘(CaCl₂) 양에 대비하여 방출되어 나온 염화칼슘(CaCl₂) 양의 백분율로 정의하였다.

실험결과, 현탁액의 온도가 20~50 ℃일 때, Ca² ⁺가 거의 방출되지 않았다. 고체지질입자의 융점이 약 56 ℃이므로, 상기 온도범위에서 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자'는 고체상태로 존재한 것으로 판단되었다.

한편, 현탁액의 온도가 60 ℃일 때, 방출 정도는 처음 14시간 동안 서서히 증가하다가 나머지 기간 동안은 증가하지 않았고, 최대 방출 정도는 약 2.3 % 였다. 현탁액의 온도가 60 ℃일 때, 이는 고체지질입자의 융점보다 조금 높은 온도이기 때문에 지질 용융액은 다소 점성이 있고, 따라서 유상/수상 경계면 근처에 있는 염화칼슘(CaCl₂) 입자들만 수상과 접촉하고 지질이 용융되어서 형성된 오일 액적 깊숙이 있는 염화칼슘(CaCl₂) 입자들은 수상과 접촉할 수 없었던 것으로 판단되었다.

현탁액의 온도가 70 ℃일 때, 방출 정도는 60 ℃에서와 같이 포화형태로 증가하였다. 그러나 주어진 시간에서 방출 정도는 60 ℃에서의 방출정도 보다 훨씬 높았고, 지질 용융액의 점도는 60 ℃에서의 점도보다 낮았다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 'CaCl₂ (1:0.05)입자가 봉입된 고체지질입자'의 온도 변화에 따른 Ca² ⁺ 방출은 지질 용융액의 점도가 가장 낮고, 지질의 융점보다 높은 온도를 지니는 70 ℃에서 방출정도가 가장 높은 것으로 나타났다 (도 8). 도 8은 20 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃에서 22 시간 동안 고체지질입자로부터 방출되어 나온 Ca²⁺의 방출 그래프이다.

Claims

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염화칼슘(CaCl₂) 분말과 분산제를 1:0.05의 중량비로 혼합 및 균질화하여 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자를 제조한 후, 상기 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자 및 지질 용융액을 수상에 첨가하는 단계 (a);
상기 단계 (a) 후, 200rpm의 교반속도로 교반 및 유화시켜 지질유화액을 제조하는 단계 (b); 및
상기 지질유화액을 교반 및 냉각하여 고체지질입자로 제조하는 단계 (c);를 포함하고,
상기 지질 용융액은 팜 스테아린산(PBSA, palm-base stearic acid) 용융액인 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자의 제조 방법.
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제2항에 있어서,
상기 염화칼슘(CaCl₂) 미세입자와 지질 용융액은,
1:50~1:200의 중량비로 수상에 첨가되는 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체 지질입자의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (b)의 지질유화액은,
80~90℃ 온도에서 제조되는 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자의 제조방법.
삭제
제2항에 있어서,
상기 단계(c)의 고체지질입자는,
지질유화액을 10~30℃ 온도에서 교반 및 냉각시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (c) 후,
고체지질입자를 투석 및 냉각시키는 단계 (d);를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 분산제는,
트윈(tween)80 과 스판(span)80의 혼합물, 트윈(tween)20 및 친수성 친유성 평형(HLB, hydrophilic lipophilic balance) 5~12의 계면활성제 중 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 온도 의존성 고체지질입자의 제조방법.