ES2315146A1 - Antagonistas de receptor de muteina de il-4 modificada. - Google Patents

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ES2315146A1 ES200650017A ES200650017A ES2315146A1 ES 2315146 A1 ES2315146 A1 ES 2315146A1 ES 200650017 A ES200650017 A ES 200650017A ES 200650017 A ES200650017 A ES 200650017A ES 2315146 A1 ES2315146 A1 ES 2315146A1
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Abstract

Antagonistas del receptor de muteína de IL-4 modificado que comprende un antagonista del receptor de muteína de IL-4 acoplado a un polietilenglicol; composiciones relacionadas, dosificaciones y métodos de administración de las mismas con fines terapéuticos, proporcionando dichos antagonistas del receptor de muteína de IL-4, composiciones y métodos una opción de tratamiento para aquellos individuos afectados por un trastorno respiratorio, tal como, asma intensa, mediante la inhibición de la hipersensibilidad de las vías respiratorias y eosinofilia en las que intervienen IL-4 e IL-13, más particularmente, dichos antagonistas presentan una mayor duración del efecto frente a IL-4RA (antagonistas receptores) no modificados debido a una mayor semivida en plasma.

Description

Antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada.
Referencia cruzada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad para las Solicitudes Provisionales de EE.UU. Nº 60/498.906, presentada el 29 de Agosto de 2003; 60/528.228, presentada el 9 de Diciembre de 2003 y 60/530.182, presentada el 17 de Diciembre de 2003, cuyas descripciones se incorporan explícitamente mediante referencia aquí.
Campo de la invención
Esta invención trata de un antagonista del receptor de muteína de IL-4 acoplado a un polímero no proteínico tal como polietilenglicol. Además, se proporcionan formulaciones relacionadas, dosificaciones y métodos de administración de las mismas con propósitos terapéuticos. Estos antagonistas del receptor de muteína de IL-4 modificada y las composiciones y los métodos asociados son útiles para proporcionar una opción de tratamiento para individuos afectados de asma intensa, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y estados del pulmón relacionados.
Antecedentes de la invención
El asma se caracteriza por una obstrucción variable y reversible de las vías respiratorias y una hipersensibilidad de las vías respiratorias (AHR), asociadas con un infiltración de la mucosa bronquial con linfocitos T (células T) activados y eosinófilos. Estas células, junto con células cebadas residentes de las vías respiratorias, secretan una variedad de citoquinas y mediadores que representan un papel fundamental en la patogénesis de la enfermedad. Se cree que las células Th2 CD4+, a través de la liberación de citoquinas específicas (IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13), instrumentan el proceso patológico (1,2). En particular, las citoquinas Th2 IL-4 e IL-13 se consideran centrales para el desarrollo y el mantenimiento de la inflamación de las vías respiratorias y la hipersensibilidad de las vías respiratorias.
Un número de estudios in vivo también apoya el papel esencial de IL-4 e IL-13 en la patogénesis del asma. Usando animales deficientes en cualquier citoquina, o reactivos que neutralizan la función de IL-4 o IL-13, se observa un papel importante de estas citoquinas para regular la respuesta inmunitaria primaria y secundaria que conduce a inflamación de las vías respiratorias e hipersensibilidad de las vías respiratorias (3,4). Acumulativamente, estos datos sugieren que IL-4 e IL-13 pueden representar papeles tanto solapados como independientes en la respuesta alérgica de las vías respiratorias, y que orientar ambas citoquinas podría tener un beneficio añadido significativo con respecto a orientar cualquier citoquina sola.
Se han presentado en la literatura antagonistas de IL-4. Mutantes de IL-4 que funcionan como antagonistas incluyen la muteína antagonista de IL-4 IL-4/Y124D (Kruse, N., Tony, H.P., Sebald, W., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J. 11:3237-44, 1992) y una muteína doble IL-4[R121D/Y124D] (Tony, H. y otros, Design of Human Interleukin-4 Antagonists in Inhibitin Interleukin-4-dependent and Interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency, Eur. J. Biochem. 225:659-664 (1994)). La muteína simple es una substitución de tirosina por ácido aspártico en la posición 124 en la hélice D. La muteína doble es una substitución de arginina por ácido aspártico en la posición 121 y de tirosina por ácido aspártico en la posición 124 en la hélice D. Variaciones en esta sección de la hélice D se correlacionan positivamente con cambios en interacciones en la segunda región de unión.
Variantes mutantes de IL-4 que demuestran agonismo o antagonismo de IL-4 silvestre pueden ser útiles para tratar estados asociados con uno de los efectos pleiotrópicos de IL-4. Por ejemplo, los antagonistas de IL-4 serían útiles para tratar estados exacerbados por la producción de IL-4, tales como asma, alergia u otros estados relacionados con una respuesta inflamatoria. Los agonistas de IL-4 pueden ser útiles para tratar estados en los que la presencia de IL-4 está asociada con la mejora o atenuación de una enfermedad, por ejemplo una enfermedad autoinmune tal como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus insulinodependiente, etc. Estas enfermedades autoinmunes se caracterizan por una polarización en la producción de las poblaciones de células cooperadoras T, tipos 1 y 2 (Th1, Th2). Las células T CD4+ simples se diferencian en los subgrupos Th1 o Th2, dependiendo de la citoquina presente durante la estimulación. Un agonista de IL-4 cambiará idealmente la producción hacia la célula cooperadora T deseada, es decir, hacia Th2, teniendo de ese modo un efecto terapéutico.
PCT/US93/03613 describe una variante de IL-4 que tiene una secuencia Phe-Leu o Tyr-Leu en el dominio helicoidal alfa y un aminoácido cargado negativamente a la distancia de dos aminoácidos inmediatamente aguas arriba o aguas abajo de la secuencia Phe-Leu o Tyr-Leu, teniendo la variante una afinidad incrementada para el receptor de IL-4 en virtud del aminoácido cargado negativamente substituido por un aminoácido neutro. También se describe que la substitución específica de Trp-Leu o Phe-Leu dentro una hélice-a de IL-4 a la distancia de dos residuos de un residuo cargado negativamente da como resultado una afinidad mejorada. La variante es una proteína de fusión de IL-4 (con toxina de la difteria).
Una proteína de muteína recombinante (IL-4RA) derivada de IL-4 humana mutada en dos porciones de su secuencia de aminoácidos fue presentada previamente en las Patentes de EE.UU. 6.028.176 y 6.313.272. IL-4RA se une con alta afinidad a la cadena alfa del receptor de IL-4 humano, un componente de señalización funcional importante de los complejos receptores tanto de IL-4 como de IL-13. Esta muteína no tiene actividad agonista y actúa como un potente antagonista competitivo de receptores de IL-4 e IL-13 in vitro (véanse las Patentes de EE.UU. 6.028.176 y 6.313.272). Una desventaja significativa del uso de IL-4RA es su semivida relativamente corta in vivo (aproximadamente 3-6 horas). El modelado farmacocinético/farmacodinámico de IL-4RA en el modelo de asma en primates indica que la concentración en estado estacionario promedio eficaz para el efecto terapéutico óptimo es aproximadamente 60 ng/ml.
Un sistema para vencer la semivida corta es la administración frecuente de la muteína IL-4RA a un paciente, sin embargo, la administración frecuente (habitualmente mediante inyección o intubación traqueal) crea barreras muy significativas para la aceptación por el paciente de la terapia y la administración terapéutica en una clínica.
Sumario de la invención
La invención proporciona muteínas IL-4RA con mayor semivida que las muteínas presentadas previamente. La invención también proporciona reactivos y métodos para inhibir respuestas inmunitarias medidas por IL-4 e IL-13. Este y otros aspectos de la invención son proporcionados por una o más de las modalidades listadas posteriormente.
En una modalidad, la invención proporciona una preparación purificada de un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada que comprende un antagonista de receptor de muteína de IL-4 acoplado a un polímero no proteínico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol y polioxialquilenos. En un aspecto de esta modalidad, la preparación purificada comprende un polipéptido antagonista del receptor de muteína de IL-4 modificada que es codificado por una secuencia de nucleótidos que se indica en el Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 3, Nº ID SEC: 4, Nº ID SEC: 5, Nº ID SEC: 6, Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8. En otro aspecto, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 10, Nº ID SEC: 11, Nº ID SEC: 12, Nº ID SEC: 13, Nº ID SEC: 14, Nº ID SEC: 15 o Nº ID SEC: 16.
En otra modalidad, el polipéptido antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada puede acoplarse a un polímero no proteínico en el residuo de aminoácido de la posición 28, 36, 37, 38, 104, 105 ó 106 de IL-4. Tales posiciones se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la IL-4 silvestre (es decir, interleuquina 4 humana). En un aspecto de esta modalidad, el residuo de aminoácido en las posiciones 28, 36, 37, 38, 104, 105 ó 106 es cisteína.
En una modalidad, un antagonista de receptor de muteína modificada de la invención se une a la cadena alfa del receptor de IL-4 con una K_{d} de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM, de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 \muM o de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM.
En otra modalidad, el antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada inhibe la respuesta proliferativa de células TF-1 a IL-4 con una IC_{50} de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM, de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 \muM o de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM.
En otra modalidad más, el antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada inhibe la respuesta proliferativa de células TF-1 a IL-13 con una IC_{50} seleccionada de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM, de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 \muM o de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM.
En una modalidad adicional, el antagonista del receptor de muteína de IL-4 modificada inhibe la respuesta proliferativa de células B humanas a IL-4 con una IC_{50} seleccionada de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM, de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 \muM o de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM.
En otra modalidad, el antagonista del receptor de muteína de IL-4 modificada inhibe la respuesta proliferativa de células T humanas a IL-4 con una IC_{50} seleccionada del grupo que consiste en de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM, de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 \muM o de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM.
En otra modalidad más, un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de la invención tiene una semivida en plasma que es al menos aproximadamente 2-10 veces mayor que la de un antagonista de receptor de IL-4 no modificada.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada que se une al receptor de IL-4 humano; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un polinucleótido purificado que comprende (a) una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 2, Nº ID SEC: 3, Nº ID SEC: 4, Nº ID SEC: 5, Nº ID SEC: 6, Nº ID SEC: 7 o Nº ID SEC: 8; o (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 10, Nº ID SEC: 11, Nº ID SEC: 12, Nº ID SEC: 13, Nº ID SEC: 14, Nº ID SEC: 15 o Nº ID SEC: 16.
La invención también proporciona vectores de expresión que comprenden un polinucleótido de la invención y células huésped que comprenden un vector de expresión de la invención.
Además, la invención proporciona métodos para elaborar un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada, que comprende las etapas de: (a) cultivar la célula huésped descrita anteriormente bajo condiciones por las que se expresa el antagonista; y (b) purificar el antagonista del cultivo de células huésped. En un aspecto particular, un antagonista producido mediante un método de la invención puede inhibir la actividad mediada por IL-4 e IL-3 y está acoplado a un polímero no proteínico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol y polioxialquilenos.
La invención también proporciona métodos para tratar un trastorno humano asociado con la actividad incrementada de IL-4 e IL-13, que comprenden las etapas de: (a) proporcionar un ser humano que tiene un estado en el que la actividad de IL-4 e IL-13 está incrementada; y (b) administrar a dicho ser humano una cantidad eficaz de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de la invención o una composición farmacéutica de la invención. En un aspecto, el trastorno es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (tal como enfisema o bronquitis crónica) o estados pulmonares relacionados.
La invención también proporciona un método para preparar un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada en forma activa, antagonistas preparados mediante el método, composiciones que comprenden tales antagonistas y un método para tratar trastornos de seres humanos, que comprende administrar tales antagonistas y composiciones farmacéuticas que incluyen tales antagonistas. El método comprende las etapas de: (a) cultivar la célula huésped que se describe anteriormente bajo condiciones por las que se expresa el antagonista; (b) dejar que el antagonista se repliegue en presencia de ditiotreitol; y (c) purificar el antagonista del cultivo de células huésped. En una modalidad, el método comprende además las etapas de: (d) acoplar el antagonista a un polímero no proteínico; y (e) purificar el antagonista acoplado al polímero no proteínico.
Modalidades preferidas específicas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades preferidas y de las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una representación esquemática de la química de una reacción de PEGilacion.
Descripción detallada de la invención
Esta invención se refiere a antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada que comprenden un receptor de muteína de IL-4 acoplado a un polímero no proteínico, preferiblemente una molécula de polietilenglicol.
A no ser que se requiera otra cosa por el contexto, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular.
Los encabezamientos de secciones usados aquí tienen propósitos organizativos solamente y no han de considerarse limitativos de la materia descrita. Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente mediante referencia aquí.
Definiciones
El término "polinucleótido" o "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de DNA o RNA. El término abarca moléculas formadas a partir de cualquiera de los análogos básicos conocidos de DNA y RNA, tales como, pero no limitados a, 4-acetiltirosina, 8-hidroxi-N^{6}-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N^{6}-isopentiladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N^{6}-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N^{6}-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.
El término polinucleótido "purificado" o "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que (1) se ha separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales con los que se encuentra naturalmente cuando el ácido nucleico total se aísla de las células originarias, (2) no está ligada a la totalidad o una porción de un polinucleótido al que la "molécula de ácido nucleico aislada" está conectada en la naturaleza, (3) está operablemente conectada a un polinucleótido al que no está conectada en la naturaleza, o (4) no está presente en la naturaleza como parte de una secuencia polinucleotídica mayor. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está substancialmente libre de cualquier otra molécula o moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso en la producción de polipéptidos o su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o investigativo.
Por "numerado de acuerdo con la IL-4 silvestre" se entiende identificar un aminoácido elegido con referencia a la posición en la que el aminoácido normalmente está presente en IL-4 silvestre.
El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) usada para transferir información de codificación a una célula huésped.
El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped que contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción y reparación de RNA, si están presentes intrones.
El término "célula huésped" se usa aquí para referirse a una célula que se ha transformado o es capaz de ser transformada con una secuencia de ácido nucleico y a continuación expresar un gen de interés seleccionado. El término incluye la progenie de la célula parental, ya sea o no la progenie idéntica en morfología o en constitución genética al progenitor original, con tal de que esté presente el gen seleccionado.
El término "transducción" se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente por un fago. "Transducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus.
El término "transfección" se usa para referirse a la captación de DNA extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el DNA exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección es bien conocido en la especialidad y se incluye aquí. Véanse, por ejemplo, Graham y otros, 1973, Virology 52:456; Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis y otros, Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986) y Chu y otros, 1981, Gene 13:197. Tales técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de DNA exógenos en células huésped adecuadas.
El término "transformación", según se usa aquí, se refiere a un cambio en las características genéticas de una célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener un nuevo DNA. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente desde su estado natural. Después de la transfección o la traducción, el DNA que se transforma puede recombinarse con el de la célula integrándose físicamente en un cromosoma de una célula, puede mantenerse transitoriamente como un elemento episomático sin ser replicado o puede replicarse independientemente como un plásmido. Se considera que una célula se ha transformado establemente cuando el DNA se replica con la división de la célula.
El término "identidad", como se sabe en la especialidad, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, según se determina comparando las secuencias. En la especialidad, "identidad" también significa el grado de relación de secuencias entre moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, según sea el caso, según se determina por la semejanza entre cadenas de dos o más secuencias de nucleótidos o dos o más secuencias de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de semejanzas idénticas entre la menor de dos o más secuencias con los alineamientos de huecos (si los hay) dirigidos por un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos").
El término "similitud" es un concepto relacionado, pero, en contraste con la "identidad", la "similitud" se refiere a una medida de relación que incluye tanto semejanzas idénticas como semejanzas de substitución conservativas. Si dos secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10-20 aminoácidos idénticos y el resto son todas substituciones no conservativas, entonces el porcentaje de identidad y similitud serían ambos 50%. Si en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones más en las que existen substituciones conservativas, entonces el porcentaje de identidad sigue siendo 50%, pero el porcentaje de similitud sería 75% (15/20). Por lo tanto, en los casos en los que existen substituciones conservativas, el porcentaje de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el porcentaje de identidad entre esos dos polipéptidos.
La identidad y la similitud de ácidos nucleicos y polipéptidos relacionados pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, Nueva York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, Nueva York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Parte 1, (Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, Nueva York; Carrillo y otros, 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; y Durbin y otros, 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.
Métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor semejanza entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles públicamente. Métodos de programa informático preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux y otros, 1984, Nucl. Acid. Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol, 215:403-410). El programa BLASTX está disponible públicamente de the National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y otro, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul y otros, 1990, supra). El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también puede usarse para determinar la identidad.
Ciertos esquemas de alineamiento para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la semejanza solo de una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta aun cuando no exista una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. De acuerdo con esto, en ciertas modalidades, el método de alineamiento seleccionado (programa GAP) dará como resultado un alineamiento que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.
Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dos polipéptidos para los que ha de determinarse el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para la semejanza óptima de sus aminoácidos respectivos (el "intervalo semejante", según se determina por el algoritmo). En ciertas modalidades, un fallo de apertura de hueco (que se calcula como tres veces la diagonal promedio; donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la puntuación o el número asignado a cada semejanza de aminoácido perfecta por la matriz de comparación particular) y un fallo de extensión del hueco (que es habitualmente un décimo del fallo de apertura del hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo. En ciertas modalidades, también es usada por el algoritmo una matriz de comparación estándar (véanse Dayhoff y otros, 1978, Atlas of Protein Sequezzce and Structure, 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62).
En ciertas modalidades, los parámetros para una comparación de secuencias polipeptídicas incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y otros, 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453;
Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y otros, 1992, supra;
Fallo de hueco: 12
Fallo de longitud del hueco: 4
Umbral de similitud: 0
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El programa GAP puede ser útil con los parámetros anteriores. En ciertas modalidades, los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparaciones de polipéptidos (junto con falta de fallo para huecos extremos) usando el algoritmo de GAP.
Según se usa aquí, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen la utilización convencional. Véase IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS, 2ª Edición (E.S. Golub y D.R. Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991, incorporado aquí mediante referencia para cualquier propósito. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales; aminoácidos no naturales tales como aminoácidos \alpha,\alpha-disubstituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, \varepsilon-N,N,N-trimetil-lisina, \varepsilon-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, \sigma-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la anotación de polipéptidos usada aquí, la dirección izquierda es la dirección aminoterminal y la dirección derecha es la dirección carboxiloterminal, de acuerdo con la utilización y la convención estándar.
Los residuos presentes en la naturaleza pueden dividirse en clases basadas en propiedades comunes de la cadena lateral:
1)
hidrófobos: norleucina (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2)
hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3)
ácidos: Asp, Glu;
4)
básicos: His, Lys, Arg;
5)
residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
6)
aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
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Las substituciones de aminoácidos conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las substituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar residuos de aminoácidos no presentes en la naturaleza, que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en vez de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoácidos.
Las substituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos substituidos pueden introducirse en regiones de una proteína humana que son homólogas a proteínas no humanas, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Al hacer tales cambios, de acuerdo con ciertas modalidades, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobia y características de carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilamina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende en la especialidad (véase, por ejemplo, Kyte y otros, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden substituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropáticos similares y todavía retienen una actividad biológica similar. Al hacer cambios basándose en el índice hidropático, en ciertas modalidades, se incluye la substitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm2. En ciertas modalidades, se incluyen los que están dentro de \pm1 y, en ciertas modalidades, se incluyen los que están dentro de \pm0,5.
También se entenderá en la especialidad que la substitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente sobre la base de la hidrofilia, particularmente cuando la proteína o el péptido biológicamente funcional creado de ese modo se pretende usar en modalidades inmunológicas, según se describe aquí. En ciertas modalidades, la mayor hidrofilia promedio local de una proteína, según está gobernado por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Los siguientes valores de hidrofilia se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al hacer cambios basándose en valores de hidrofilia similares, en ciertas modalidades, se incluye la substitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro de \pm2, en ciertas modalidades, se incluyen los que están dentro de \pm1 y, en ciertas modalidades, se incluyen los que están dentro de \pm0,5. También pueden identificarse epítopos de secuencias de aminoácidos primarias sobre la base de la hidrofilia. Estas regiones también se denominan "regiones centrales epitópicas".
Substituciones de aminoácidos ejemplares se indican en la Tabla 1.
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TABLA 1 Substituciones de Aminoácidos
1
2
Un experto será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido según se indica aquí usando técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, un experto en la especialidad puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad eligiendo como diana regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En otras modalidades, el experto puede identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En modalidades adicionales, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a substituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente a la estructura del polipéptido.
Adicionalmente, un experto en la especialidad puede revisar estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. En vista de tal comparación, el experto puede producir la importancia de los residuos de aminoácido en una proteína que corresponden a residuos de aminoácido importantes para la actividad o la estructura en proteínas similares. Un experto en la especialidad puede optar por substituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácido importantes predichos.
Un experto en la especialidad también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos con relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la especialidad puede predecir el alineamiento de residuos de aminoácido de un polipéptido con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas modalidades, un experto en la especialidad puede elegir no hacer cambios radicales en los residuos de aminoácido que se predice que van a estar sobre la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Por otra parte, un experto en la especialidad puede generar variantes de prueba que contienen una sola substitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden rastrearse a continuación usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la especialidad. Tales variantes podrían usarse para reunir información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácido particular daba como resultado una actividad destruida, reducida indeseablemente o inadecuada, las variantes con tal cambio pueden evitarse. En otras palabras, basándose en la información reunida a partir de tales experimentos habituales, un experto en la especialidad puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deben evitarse substituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.
Un número de publicaciones científicas se ha dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véanse Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou y otros, 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou y otros, 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou y otros, 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou y otros, 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276 y Chou y otros, 1979, Biophys. J. 26:367-384. Por otra parte, están disponibles actualmente programas de ordenador para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en el modelado de homologías. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30% o una similitud mayor que 40% a menudo tienen topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de los datos de bases estructurales de proteínas (PDB) ha proporcionado una capacidad de predicción mejorada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm y otros, 1999, Nucl. Acid Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner y otros, 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que existe un número limitado de pliegues en un polipéptido o una proteína dados y que
una vez que se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se hará drásticamente más exacta.
Métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "enhebrado" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl y otros, 1996, Structure 4:15-19), "análisis de perfiles" (Bowie y otros, 1991, Science 253:164-170; Gribskov y otros, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov y otros, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358) y "conexión evolutiva" (Véase Holm, 1999, supra y Brenner, 1997, supra).
En ciertas modalidades, variantes de proteína incluyen variantes de glicosilación en las que el número y/o el tipo de sitios de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido parental. En ciertas modalidades, las variantes de proteínas comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación conectados a N que la proteína natural. Un sitio de glicosilación conectado a N se caracteriza por una secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido indicado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La substitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato conectada a N. Alternativamente, las substituciones que eliminan esta secuencia retirarán una cadena de carbohidrato conectada a N existente. También se proporciona una reordenación de cadenas de carbohidrato conectadas a N en las que se eliminan uno o más sitios de glicosilación conectados a N (típicamente los que están presentes en la naturaleza) y se crean uno o mas nuevos sitios conectados a N. Variantes preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en las que uno o más residuos de cisteína se eliminan de o se substituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando las proteínas deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína tienen generalmente menos residuos de cisteína que la proteína natural, y típicamente tienen un número par para minimizar interacciones resultantes de cisteínas desapareadas.
En modalidades adicionales, las variantes de proteínas pueden incluir mutaciones tales como substituciones, adiciones, deleciones o cualquier combinación de las mismas, y se producen típicamente mediante mutagénesis dirigida al sitio usando uno o más oligonucleótidos mutagénicos de acuerdo con métodos descritos aquí, así como de acuerdo con métodos conocidos en la especialidad (véanse, por ejemplo, Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N:Y. y Berger y Kimmel, METHODS IN ENZIMOLOGY, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA, que se incorporan aquí mediante referencia).
De acuerdo con ciertas modalidades, las substituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteínicos, (4) alteran afinidades de unión y/o (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos. De acuerdo con ciertas modalidades, pueden hacerse substituciones de aminoácidos simples o múltiples (en ciertas modalidades, substituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia presente en la naturaleza (en ciertas modalidades, en la porción del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). En modalidades preferidas, una substitución de aminoácido conservativa típicamente no cambia substancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, una substitución de aminoácido no debe tender a romper una hélice que está presente en la secuencia parental, o interrumpir otros tipos de la estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental. Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la especialidad se definen en PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman and Company, Nueva York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden y J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, Nueva York, N.Y.; y Thornton y otros, 1991, Nature, 354:105, cada uno de los cuales se incorpora aquí mediante referencia.
Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos". Véanse Fauchere, 1986, Adv. Drug. Res. 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p. 392 y Evans y otros, 1987, J. Med. Chem. 30:1229, que se incorporan aquí mediante referencia con cualquier propósito. Tales compuestos a menudo se desarrollan con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigmático (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como un péptido humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado de: -CH_{2}-NH-, -CH_{2}-S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-, mediante métodos bien conocidos en la especialidad. La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse en ciertas modalidades para generar péptidos más estables. Ademas, péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso substancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la especialidad (Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387, incorporado aquí mediante referencia con cualquier propósito); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
(a) Características de Antagonistas de Receptor de Muteína de IL-4 Modificados
"Antagonistas del receptor de muteína de IL-4 modificada", según se usa aquí, incluye la muteína IL-4RA descrita en las Patentes de EE.UU. 6.028.176 y 6.313.272 (incorporadas aquí mediante referencia en su totalidad) con substituciones de aminoácidos adicionales en donde dichas substituciones permiten el acoplamiento específico para el sitio de al menos un polímero no proteínico, tal como una molécula de polipropilenglicol, polioxialquileno o polietilenglicol (PEG), a la muteína. El acoplamiento específico para el sitio de PEG, por ejemplo, permite la generación de una muteína modificada que posee los beneficios de una molécula polietileno-glicosilada (PEGilada), a saber una semivida en plasma incrementada y una inmunogenicidad disminuida mientras que se mantiene una mayor potencia sobre estrategias de PEGilación no específicas tales como PEGilación N-terminal y en la cadena lateral de lisina. También es inherente a esta invención la selección del sitio específico de la substitución del aminoácido que permite un plegamiento apropiado de la molécula después de la expresión. Los antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada se unen a IL-4 e IL-13 con una pérdida de afinidad no mayor que 10 veces con relación a la de IL-4RA. Los antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada inhiben la actividad mediada por IL-4 e IL-13 con una pérdida de potencia no mayor que 10 veces con relación a la de IL-4RA. Además, los antagonistas del receptor de muteína de IL-4 modificada poseen una semivida en plasma que es al menos de 2 a 10 veces mayor que la de IL-4RA no modificada.
Las muteínas de IL-4 de esta invención también pueden caracterizarse por inserciones, deleciones, substituciones y modificaciones de aminoácidos en uno o más sitios o en los otros residuos de la cadena polipeptídica de IL-4 natural. De acuerdo con esta invención, cualesquiera de tales inserciones, deleciones, substituciones y modificaciones deben dar como resultado una muteína de IL-4 que retiene su actividad relacionada con IL-4.
Un aspecto adicional de esta invención es proporcionado en el método con el que la muteína se expresa y se repliega según se representa en el Ejemplo 2. La muteína de IL-4 debe purificarse apropiadamente para permitir una PEGilación eficaz. La purificación se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 2 posterior. Cuando la muteína se repliega en presencia de un agente protector de sulfhidrilo tal como beta-mercaptoetanol, glutationa o cisteína, la muteína purificada no puede PEGilarse debido a que el sulfhidrilo activo en la cisteína introducida en IL-4 está inactivado por el agente protector oxidado. Se forma una unión de disulfuro covalente entre la cisteína libre de la muteína de IL-4 y el agente protector. En contraste, el uso del agente protector de sulfhidrilo ditiotreitol (DTT), que se oxida para formar una unión de disulfuro estable, no formará una unión covalente con la cisteína libre de la muteína de IL-4, dejando así su grupo sulfhidrilo libre para reaccionar con el reactivo de PEG-maleimida. Las muteínas de IL-4 purificadas después de replegarse en presencia de beta-mercaptoetanol, glutationa o cisteína pueden reaccionar con el reactivo de PEG si se tratan con DTT, pero se genera una mezcla de productos monoPEGilados y multiPEGilados, sugiriendo que las cisteínas de IL-4 existentes también se PEGilan. La PEGilación de cisteínas existentes conduciría a productos mal plegados que son inactivos.
La K_{d} de antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada para el receptor de IL-4 puede ensayarse usando cualquier método conocido en la especialidad, incluyendo tecnologías tales como Análisis de Interacción Bimolecular (BIA) en tiempo real esbozado en el Ejemplo 4. El BIA es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Pueden usarse cambios en el fenómeno óptico resonancia de plasmones superficiales (SPR), como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
La capacidad de antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada para inhibir la respuesta proliferativa de células inmunitarias puede determinarse usando ensayos proliferativos como los esbozados en el Ejemplo 5 y esta capacidad expresarse como una concentración inhibidora 50% (IC_{50}).
En un ensayo BIAcore^{TM}, antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada de la presente invención se unen específicamente al receptor de IL-4 humana con una K_{d} preferida en el intervalo de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM. Modalidades más preferidas de la presente invención se unen a receptor de IL-4 humana con una K_{d} de aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1,0 \muM. Modalidades aún más preferidas de la presente invención se unen a receptor de IL-4 humana con una K_{d} de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM. Adicionalmente, los antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada de la presente invención, según se prevé, se unirán a receptor de IL-4 humana y neutralizarán su capacidad para promover la proliferación de células inmunitarias con una IC_{50} preferida que varía de aproximadamente 1,0 nM a aproximadamente 100 nM. Antagonistas humanos más preferidos se unen al receptor de IL-4 y neutralizan su capacidad de proliferación de células inmunitarias con una IC_{50} que varía de aproximadamente 0,5 nM a 1 \muM, uniéndose a inhibiendo los antagonistas más preferidos de esta invención el receptor de IL-4 con una IC_{50} de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 10 \muM.
Las modalidades presentes de antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada de la presente invención también exhiben una semivida en plasma que es preferiblemente al menos 2 a 10 veces mayor que la de IL4RA no modificada, exhibiendo las modalidades más preferidas de la presente invención una semivida en plasma que es 10-100 veces mayor que la de IL-4RA no modificada (véase el Ejemplo 7).
Un número de antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada con las características descritas anteriormente se han identificados rastreando candidatos con los ensayos anteriores. Las modalidades de la presente invención tienen las secuencias polipeptídicas mostradas en Tabla 2 (Nº ID SEC: 10-16).
TABLA 2 Secuencias Polipeptídicas
3
(b) Polipéptidos que codifican antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada
La invención también proporciona polinucleótidos que codifican antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada. Estos polinucleótidos pueden usarse, por ejemplo, para producir cantidades de los antagonistas para uso terapéutico.
Un polinucleótido de la invención puede obtenerse fácilmente de una variedad de modos, incluyendo, sin limitación, síntesis química, rastreo de bibliotecas de cDNA o genómicas, rastreo de bibliotecas de expresión y/o amplificación por PCR de cDNA.
Los métodos de DNA recombinante descritos aquí son generalmente los indicados en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratoy Press, 1989) y/o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds., Green Publishers Inc. y Wiley and Sons 1994). La invención proporciona moléculas de ácido nucleico como las descritas aquí y métodos para obtener tales moléculas.
Un método para obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, se prepara cDNA a partir de poli(A)+RNA o RNA total usando la enzima transcriptasa inversa. Dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas de un cDNA de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada, se añaden a continuación al cDNA junto con una polimerasa tal como polimerasa de Taq, y la polimerasa amplifica la región de cDNA entre los dos cebadores.
Otro medio para preparar una molécula de ácido nucleico de la invención es la síntesis química usando métodos bien conocidos por el experto tales como los descritos por Engels y otros, 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716-34). Estos métodos incluyen, entre otras cosas, los métodos del fosfotriéster, la fosforamidita y el H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis soportada en polímero usando química de fosforamidita estándar. Típicamente, el DNA tendrá varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 nucleótidos pueden sintetizarse como varios fragmentos usando estos métodos. Los fragmentos pueden ligarse a continuación entre sí. También pueden usarse otros métodos conocidos por el experto.
Polinucleótidos de la invención que pueden usarse para codificar los antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada se muestran en la Tabla 3 (Nº ID SEC: 2-8).
TABLA 3 Secuencias Polinucleotídicas
5
6
7 
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La invención también proporciona vectores de expresión que comprenden un polinucleótido de la invención y células huésped que comprenden un vector de expresión de la invención.
Un polinucleótido de la invención puede insertarse en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligación estándar. Un vector se selecciona típicamente para ser funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinara de la célula huésped de modo que puede producirse la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Un polinucleótido de la invención puede expresarse en células huésped procarióticas, de levadura, de insecto (sistemas baculovirales) y/o eucarióticas. La selección de la célula huésped dependerá de varios factores, tales como los niveles de expresión deseados. Para una revisión de los vectores de expresión, véase Meth. Enz., vol. 185 (D.V. Goeddel, ed. Academic Press 1990).
Típicamente, los vectores de expresión usados en una célula huésped contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente "secuencias de flanqueo" en ciertas modalidades, incluirán típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio de reparación donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región policonectora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que ha de expresarse, y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se analiza posteriormente.
Las secuencias de flanqueo pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o la cepa de la célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias de flanqueo de más de una fuente) o sintéticas, o las secuencias de flanqueo pueden ser secuencias naturales que funcionan normalmente para regular la expresión del antagonista de receptor de muteína de IL-4. Como tal, la fuente de una secuencia de flanqueo puede ser un organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, con tal de que la secuencia de flanqueo sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria de la célula huésped.
Secuencias de flanqueo útiles en los vectores de esta invención pueden obtenerse mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la especialidad. Típicamente, secuencias de flanqueo útiles aquí -distintas de las secuencias de flanqueo del gen del antagonista de receptor de muteína de IL-4- se habrán identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y pueden así aislarse de la fuente tisular apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, toda la secuencia de nucleótidos de una secuencia de flanqueo puede ser conocida. Aquí, la secuencia de flanqueo puede sintetizarse usando los métodos descritos aquí para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.
Cuando se conoce la totalidad o solo una porción de la secuencia de flanqueo, puede obtenerse usando PCR y/o rastreando una biblioteca genómica con un oligonucleótido adecuado y/o un fragmento de secuencia de flanqueo procedente de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia de flanqueo, un fragmento de DNA que contiene una secuencia de flanqueo puede aislarse de un trozo mayor de DNA que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede efectuarse mediante digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de DNA apropiado, seguido por aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por el experto. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para un experto normal en la especialidad. Un origen de replicación es típicamente una parte de aquellos vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, puede sintetizarse químicamente uno basándose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New Engalnd Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas y diversos orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o papilomarivus tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente del origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, el origen de SV40 se usa a menudo solo debido a que contiene el promotor
temprano).
Una secuencia de terminación de la transcripción se sitúa típicamente 3' del extremo de una región de codificación del polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de la transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia de poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos tales como los descritos aquí.
Un elemento de gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped desarrollada en un medio de cultivo selectivo. Genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina, para células huésped procarióticas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. Un gen de resistencia a la neomicina también puede usarse para la selección en células huésped procarióticas y eucarióticas.
Otros genes de selección pueden usarse para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que los genes que tienen mayor demanda para la producción de una proteína critica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se ponen bajo presión de selección en la que solo los transformantes se adaptan únicamente para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas bajo condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación tanto del gen de selección como del DNA que codifica un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada. Como resultado, se sintetizan cantidades incrementadas de un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada a partir del DNA amplificado.
Un sitio de unión al ribosoma habitualmente es necesario para la iniciación de la traducción de mRNA y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento se sitúa típicamente 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia de codificación de un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada. La secuencia de Shine-Dalgarno se varía pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente usando métodos indicados aquí y usados en un vector procariótico.
Una secuencia líder, o de señal, puede usarse para dirigir un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada fuera de una célula huésped. Típicamente, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de señal se sitúa en la región de codificación de una molécula de ácido nucleico de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada, o directamente en el extremo 5' de una región de codificación de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada. Se han identificado muchas secuencias de señal, y cualquiera de las que son funcionales en la célula huésped seleccionada puede usarse junto con una molécula de ácido nucleico de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada. Por lo tanto, una secuencia de señal puede ser homóloga (presente en la naturaleza) o heteróloga con la molécula de ácido nucleico de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada. Adicionalmente, una secuencia de señal puede sintetizarse químicamente usando métodos descritos aquí. En la mayoría de los casos, la secreción de un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada a partir de la célula huésped a través de la presencia de un péptido de señal dará como resultado la retirada del péptido de señal del antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada secretado. La secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte de una molécula de ácido nucleico de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada que está insertada en el
vector.
En muchos casos, la transcripción de una molécula de ácido nucleico se incrementa mediante la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando se produce un polipéptido en células huésped eucarióticas, especialmente células huésped de mamífero. Los intrones usados pueden estar presentes naturalmente dentro del gen de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada, especialmente cuando el gen usado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma. Si el intrón no está presente naturalmente dentro del gen, el intrón puede obtenerse a partir de otra fuente. La posición del intrón con respecto a las secuencias de flanqueo y el gen de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada es generalmente importante, ya que el intrón debe transcribirse para ser eficaz. Así, cuando se está transcribiendo una molécula de ácido nucleico de la invención, la posición preferida para el intrón es 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripción y 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción de poli-A. Preferiblemente, el intrón o los intrones estarán situados en un lado u otro (es decir, 5' o 3') del cDNA de modo que no interrumpan la secuencia de codificación. Cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo organismos virales, procarióticos y eucarióticos (plantas o animales), puede usarse para poner en práctica esta invención, con tal de que sea compatible con la célula huésped en la que se inserta. También se incluyen aquí intrones sintéticos. Opcionalmente, puede usarse más de un intrón en el vector.
Los vectores de expresión y clonación de la presente invención contendrán típicamente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está conectado operablemente a la molécula de ácido nucleico de la invención. Los promotores son secuencias no transcritas situadas aguas arriba (es decir, 5') con respecto al codón de iniciación de un gen estructural (generalmente a una distancia de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles incrementados de transcripción a partir de DNA bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Por otra parte, los promotores constitutivos inician la producción continua de productos génicos; esto es, existe poco o ningún control sobre la expresión génica. Es bien conocido un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Un promotor adecuado puede conectarse operablemente a una molécula de ácido nucleico de la invención retirando el promotor del DNA originario mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora deseada en el vector. La secuencia promotora del antagonista de receptor de muteína de IL-4 natural puede usarse para dirigir la amplificación y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención. Sin embargo, se prefiere un promotor heterólogo si permite una mayor transcripción y rendimientos superiores de la proteína expresada en comparación con el promotor natural, y si es compatible con el sistema de células huésped que se ha seleccionado para el uso.
Promotores adecuados para usar con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina; un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor de tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias se han publicado, permitiendo de ese modo que un experto en la especialidad los ligue a la secuencia de DNA deseada, usando conectores o adaptadores según sea necesario para suministrar cualesquiera sitios de restricción útiles.
Promotores adecuados para usar con huéspedes de levadura también son bien conocidos en la especialidad. Potenciadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Promotores adecuados para usar con células huésped de mamífero son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos de los genomas de virus tales como poliomavirus, poxvirus aviario, adenovirus (tal como adenovirus 2), papilomavirus bovino, sarcomavirus aviario, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y, lo más preferiblemente, virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores del choque térmico y el promotor de actina.
Promotores adicionales que pueden ser de interés para controlar la expresión génica incluyen, pero no se limitan a: la región promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-10); el promotor de CMV; el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y otros, 1980, Cell 22:787-97); el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner y oros, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster y otros, 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff y otros, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:727-31); o el promotor de tac (DeBoer y otros, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control transcripcional de animales, que exhiben especificidad tisular y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift y otros, 1984, Cell 38:639-46; Omitz y otros, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatolgoy 7:425-515); la región de control del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl y otros, 1984, Cell 38:647-58; Adames y otros, 1985, Nature 318:533-38; Alexander y otros, 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); la región de control de virus del tumor mamario del ratón que es activa en células testiculares, mamarias, linfoides y cebadas (Leder y otros, 1986, Cell 45:485-95); la región de control del gen de albúmina que se activa en el hígado (Pinkert y otros, 1987, Genes and Devel. 1:268-76); la región de control del gen de alfa-feto-proteína que es activa en el hígado (Krumlauf y otros, 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer y otros, 1987, Science 235:53-58); la región de control del gen de 1-antitripsina alfa que se activa en el hígado (Kesley y otros, 1987, Genes and Devel. 1:161-71); la región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram y otros, 1985, Nature 315:338-40; Kollias y otros, 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead y otros, 1987, Cell 48:703-12); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina que es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86); y la región de control del gen de hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo (Mason y otros, 1986, Science 234:1372-78).
Una secuencia potenciadora puede insertarse en el vector para incrementar la transcripción de una molécula de ácido nucleico de la invención por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de acción cis de DNA, habitualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para incrementar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición. Se han encontrado 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador procedente de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus son elementos de potenciación ejemplares para la activación de promotores eucarióticos. Aunque un potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a una molécula de ácido nucleico de la invención, típicamente se sitúa en un sitio 5' desde el promotor.
Vectores de expresión de la invención pueden construirse a partir de un vector de iniciación tal como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden contener o no todas las secuencias de flanqueo deseadas. Cuando una o más de las secuencias de flanqueo descritas aquí no están todavía presentes en el vector, pueden obtenerse y ligarse individualmente en el vector. Métodos usados para obtener cada una de las secuencias de flanqueo son bien conocidos para un experto en la especialidad.
Vectores preferidos para poner en práctica esta invención son aquellos que son compatibles con células huésped bacterianas, de insecto y de mamífero. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3 y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N^{2} (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (Publicación PCT Nº WO 90/14363) y pFast-BacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY).
Vectores adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero un experto en la especialidad reconocerá que el sistema vectorial debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos tales como derivados plasmídicos Bluescript® (un fagémido basado en ColE1 de alto número de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA), plásmidos de clonación por PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados con Taq (por ejemplo, el estuche TOPO^{TM} TA Cloning®, derivados plasmídicos PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA), y vectores de mamífero, levadura o virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados plamídicos pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA).
Después de que se haya construido el vector y una molécula de ácido nucleico de la invención se haya insertado en el sitio apropiado del vector, el vector completado puede insertarse en una célula huésped adecuada para amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión de la invención en una célula huésped seleccionada puede efectuarse mediante métodos bien conocidos incluyendo métodos tales como transfección, infección, cloruro cálcico, electroporación, microinyección, lipofección, método del DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped que ha de usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos para el experto y se indican, por ejemplo, en Sambrook y otros, previamente.
Las células huésped pueden ser células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células huésped eucarióticas (tales como una célula de levadura, insecto o vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, sintetiza un agonista de receptor de muteína de IL-4 modificada que puede recogerse subsiguientemente del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que lo produce (si no se secreta). La selección de una célula huésped apropiada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones del polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilación o fosforilación) y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.
Un número de células huésped adecuadas es conocido en la especialidad y muchas están disponibles de the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células CHO DHFR(-) (Urlaub y otros, 1980, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 97:4213-20), células de riñón embrionario humano (HEK) 293 ó 293T, o células 3T3. La selección de células huésped de mamífero adecuadas y métodos para la transformación, el cultivo, la amplificación, el rastreo, la producción de productos y la purificación son conocidos en la especialidad. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono y la línea celular CV-1. Células huésped de mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas celulares de primates y líneas celulares de roedor, incluyendo líneas celulares transformadas. También son adecuadas células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células posibles pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones suizos, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o HaK. Cada una de estas líneas celulares es conocida por y está disponible para los expertos en la especialidad de la expresión de proteínas.
Similarmente útiles que las células huésped adecuadas para la presente invención son las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5, DH10 y MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. También pueden emplearse en este método diversas cepas de B. subtilis, especies de Pseudomonas, otras especies de Bacillus, especies de Streptomyces y similares.
Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la especialidad también están disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.
Adicionalmente, cuando se desea, pueden utilizarse sistemas celulares de insecto en los métodos de la presente invención. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts y otros, 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72 y Lucklow y otros, 1993, J. Virol., 67:4566-79. Células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (invitrogen).
Los polinucleótidos de la presente invención en una célula huésped pueden aislarse libres de otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas y lípidos. Los polinucleótidos pueden aislarse de las células usando técnicas de purificación de ácidos nucleicos estándar, o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o usando un sintetizador automático. Métodos para aislar polinucleótidos son habituales y son conocidos en la especialidad. Cualquiera de tales técnicas para obtener un polinucleótido puede usarse para obtener polinucleótidos aislados que codifican antagonistas de la invención. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción y sondas para aislar polinucleótidos que codifican los antagonistas. Preferiblemente, los polinucleótidos aislados están en preparaciones que están libres o al menos 70, 80 ó 90% libres de otras moléculas.
Será apreciado por los expertos en la especialidad que las moléculas de ácido nucleico y polipéptido descritas aquí pueden producirse por medios recombinantes y otros. Por ejemplo, moléculas de cDNA de antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de la invención pueden elaborarse con técnicas de biología molecular estándar, usando mRNA como una plantilla. A continuación, las moléculas de cDNA pueden replicarse usando técnicas de biología molecular conocidas en la especialidad y descritas en el Ejemplo 1. El Ejemplo 2 describe la expresión recombinante específica y técnicas de purificación empleadas para generar los antagonistas de muteína de la invención.
(c) Determinación de la utilidad terapéutica de antagonistas humanos
Para determinar la eficacia potencial de un antagonista particular en la terapia del asma alérgica, el antagonista puede probarse in vitro en ensayos de proliferación celular según se detalla en los Ejemplos 5 y 6. Además, la semivida en plasma del antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada puede medirse in vivo con un estudio farmacocinético en ratas de acuerdo con el Ejemplo 6.
(d) Composiciones farmacéuticas
Cualquiera de los antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada descritos anteriormente puede proporcionarse en una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable es preferiblemente no pirogénico. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos otro agente activo, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en un portador farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, pero no limitado a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Puede emplearse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia en partículas. Estas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización bien conocidas convencionales (por ejemplo,
filtración).
Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera. Las substancias auxiliares aceptables preferiblemente son atóxicas para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. La composición farmacéutica puede contener substancias auxiliares para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disociación o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito sódico o hidrogenosulfito sódico), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de aumento de volumen (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saboreantes y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, iones conjugados formadores de sales (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabén, propilparabén, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes sacáricos (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics; PEG; ésteres de sorbitán; polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; Triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapol), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos -preferiblemente cloruro sódico o potásico- o manitol-sorbitol), vehículos de aporte, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990).
La concentración del antagonista de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente 0,5%, habitualmente en o al menos aproximadamente 1% hasta como mucho 15 ó 20% en peso, y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Si se desea, puede incluirse en una composición farmacéutica más de un tipo de antagonista, por ejemplo con diferente K_{d} para la unión al receptor de IL-4.
Las composiciones pueden administrarse a un paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y materiales auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos como preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente.
Los materiales de formulación aceptables son preferiblemente atóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.
La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disociación o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, anti-oxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfato sódico o hidrogenosulfito sódico), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de aumento de volumen (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas), agentes colorantes, saboreantes y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, iones conjugados formadores de sales (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabén, propilparabén, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes sacáricos (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics; PEG; ésteres de sorbitán; polisorbatos tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; Triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapol), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos -preferiblemente cloruro sódico o potásico- o manitol-sorbitol), vehículos de aporte, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990).
La composición farmacéutica óptima puede ser determinada por un experto dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración pretendida, el formato de aporte y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, previamente. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de depuración in vivo de la molécula de ácido nucleico o el modulador de la densidad ósea de la invención.
El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden tampón de Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5 o tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir además sorbitol o un substituto adecuado. En una modalidad de la invención, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, previamente) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, la composición puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para aporte parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para aporte a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la especialidad.
Los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para usar en la invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos que comprende la molécula deseada de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que la molécula se formula como una solución isotónica estéril apropiadamente conservada. Otra preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos polímeros (tales como poli(ácido láctico) o poli(ácido glicólico)), cuentas o liposomas, que proporciona la liberación controlada o sostenida del producto que a continuación puede aportarse a través de una inyección de depósito. También puede usarse ácido hialurónico, que puede tener el efecto de promover una duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de aporte de fármacos implantables.
En una modalidad, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o un modulador de la densidad ósea de la invención puede formularse como un polvo seco para inhalación. Las soluciones para inhalación también pueden formularse con un propelente para el aporte de aerosol. En otra modalidad más, las soluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la publicación PCT Nº WO 94/20069, que describe el aporte pulmonar de proteínas típicamente modificadas.
En otras modalidades, ciertas formulaciones pueden administrarse oralmente. En una modalidad de la invención, moléculas de ácido nucleico o moduladores de la densidad ósea de la invención que se administran de este modo pueden formularse con o sin los portadores usados habitualmente en la confección de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Agentes adicionales pueden incluirse para facilitar la absorción de la molécula o el modulador de la invención. También pueden emplearse diluyentes, saboreantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de tabletas y aglutinantes.
Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de moléculas de ácido nucleico o moduladores de la densidad ósea de la invención en una mezcla con excipientes atóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Disolviendo las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse soluciones en forma de dosis unitaria. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato o bicarbonato sódico, lactosa o fosfato cálcico; o agentes de unión, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato magnésico, ácido esteárico o talco.
Composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la especialidad, incluyendo formulaciones que implican moléculas de ácido nucleico o moduladores de la densidad ósea de la invención en formulaciones de aporte sostenido o controlado. Técnicas para formular una variedad de otros medios de aporte sostenido o controlado, tales como portadores liposómicos, micropartículas bioerosionables o cuentas porosas e inyecciones de depósito, también son conocidas por los expertos en la especialidad. Véase, por ejemplo, PCT/US93/00829, que describe la liberación controlada de micropartículas polímeras porosas para el aporte de composiciones farmacéuticas.
Ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (Patente de EE.UU. Nº 3.773.919 y Patente Europea Nº 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo gamma (Sidman y otros, 1983, Biopolymers 22:547-56), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer y otros, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno-acetato de vinilo (Langer y otros, previamente) o poli(ácido D(-)-3-hidroxibutírico) (Patente Europea Nº 133988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la especialidad. Véanse, por ejemplo, Eppstein y otros, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-92; y las Patentes Europeas Nº 036676, 088046 y 143949.
Una composición farmacéutica que ha de usarse para la administración in vivo típicamente debe ser estéril. Esto puede conseguirse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede efectuarse antes de o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se ponen en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o un vial para soluciones intravenosas que tiene un tapón perforable por una aguja hipodérmica para inyección.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse mediante cualquier número de rutas como las descritas aquí, incluyendo, pero no limitadas a, un medio oral, intravenoso, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmico, subcutáneo, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópico, sublingual o rectal.
Después de que se hayan preparado las composiciones farmacéuticas, pueden ponerse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un estado indicado. Tal etiquetaje debe incluir cantidad, frecuencia y método de administración.
(d) Métodos Terapéuticos
La presente invención proporciona métodos para mejorar los síntomas de un trastorno uniendo la cadena alfa del receptor de IL-4 e inhibiendo la actividad mediada por IL-4 e IL-13. Estos trastornos incluyen, sin limitación, hipersensibilidad de las vías respiratorias e inflamación de las vías respiratorias, incluyendo reclutamiento y activación de células cebadas, eosinófilos y linfocitos, asociados con el asma y otros trastornos inmunológicos o alérgicos.
En una modalidad de la invención, una dosis terapéuticamente eficaz de un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de la invención y/o una composición de la invención se administra a un paciente que tiene un trastorno caracterizado por actividad de IL-4 e IL-13 elevada, tales como los trastornos anteriores.
(e) Determinación de una Dosis Terapéuticamente Eficaz
La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está totalmente dentro de la capacidad de los expertos en la especialidad. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de antagonista que se usa para tratar eficazmente el asma en comparación con la eficacia que es evidente en ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz.
La dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en modelos animales, habitualmente ratas, ratones, conejos, perros, cerdos o primates no humanos. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración apropiado y la ruta de administración. Tal información puede usarse a continuación para determinar dosis y rutas de administración útiles en seres humanos.
La eficacia terapéutica y la toxicidad, por ejemplo, ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población) y LD_{50} (la dosis letal para 50% de la población) de un antagonista humano, pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales. La relación de dosis de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD_{50}/ED_{50}.
Se prefieren composiciones farmacéuticas que exhiban índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de estudios en animales se usan para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación contenida en tales composiciones está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varia dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la ruta de administración.
La dosificación exacta será determinada por el médico, a la luz de factores relacionados con el paciente que requiere tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del antagonista o para mantener el efecto deseado. Factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrase cada de 3 a 4 días, todas las semanas o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y la velocidad de depuración de la formulación particular.
Los polinucleótidos que codifican antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada de la invención pueden construirse e introducirse en una célula ex vivo o in vivo usando técnicas bien establecidas incluyendo, pero no limitadas a, transferencia de DNA mediada por policationes de transferrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de cuentas de látex revestidas con DNA, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, "pistola génica" y transfección mediada por DEAE o fosfato cálcico.
Las dosificaciones in vivo eficaces de un antagonista están en el intervalo de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug/kg, de aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 \mug/kg de peso corporal del paciente. Para la administración de polinucleótidos que codifican los antagonistas, las dosificaciones in vivo eficaces están en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 ng, de 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 500 \mug y de aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 100 \mug de DNA.
El modo de administración de composiciones farmacéuticas que contienen antagonistas de receptor de muteína de IL-4 modificada de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que aporte el antagonista al huésped. Composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intratraqueal o intranasal y otros modos de administración pulmonar.
Todas las patentes y solicitudes de patente citadas en esta descripción se incorporan expresamente aquí mediante referencia. La divulgación anterior describe generalmente la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa mediante referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se proporcionan solamente con propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.
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Ejemplos Ejemplo 1 Producción recombinante de muteínas de cisteína IL-4-RA e IL-4-RE
El sistema de expresión pET Directional TOPO® (Invitrogen) se seleccionó para la expresión recombinante de IL-4. El sistema usa una estrategia "TOPO® Cloning" de una etapa altamente eficaz para clonar direccionalmente un producto de PCR de extremos romos y un promotor T7lac para la expresión de alto nivel e inducible por IPTG del gen de interés en E. coli. Rasgos adicionales incluyen un gen lacI para reducir la transcripción basal, un origen de pBR322 para la replicación y el mantenimiento del plásmido y un gen de resistencia a la ampicilina para la selección.
IL-4 se clon en el vector pET101/D-TOPO para la producción de proteína de IL-4 recombinante. Los cebadores oligonucleotídicos se muestran en la Tabla 4. El cebador de PCR directo se diseñó con una proyección 5'CACC para facilitar la clonación direccional, seguido por un sitio de enzima de restricción NdeI único para la subclonación y el codón de iniciación ATG inicial. El cebador de PCR inverso incluía dos codones de parada para asegurarse de que no se incorporaban etiquetas C-terminales y un sitio de enzima de restricción BamHI único para la subclonación. Se generó un producto de PCR de IL-4 de extremos romos usando IL-4 humana previamente clonada como una plantilla. El producto se purificó en gel y se incubó con solución salina y vector TOPO® durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir clonar direccionalmente en el vector pET101/D-TOPO. El vector recombinante se transformó en E. coli One Shot TOP10 químicamente competente. El DNA plasmídico recombinante se trasladó a la secuenciación de DNA para confirmar la secuencia correcta.
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TABLA 4 Cebadores oligonucleotídicos para generar muteínas de cisteína IL-4-RE
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IL-4/pET1011D-TOPO servía como una plantilla para producir muteínas de cisteína IL-4-RE con el QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit de Stratagene. Cada muteína de cisteína se elaboró usando dos cebadores oligonucleotídicos, cada un complementario a hebras opuestas del vector y conteniendo el codón TGC o GCA para incorporar la mutación de cisteína deseada. La Tabla 4 lista los cebadores usados para producir las muteínas IL-4-RE. Un plásmido mutado que contenía mellas alternadas se generó usando parámetros y condiciones de ciclación definidos en el protocolo del fabricante. El producto se trató con endonucleasa DpnI durante 1 hora a 37ºC para digerir la plantilla de DNA parental no mutada metilada. El DNA tratado con DpnI se transformó en células supercompetentes XL-1 Blue donde las mellas del plásmido mutado se reparaban. El DNA plasmídico mutagénico se analizó de acuerdo con técnicas de secuenciación estándar para confirmar la secuencia correcta.
Ejemplo 2 Expresión Recombinante y Purificación
Células BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen) transformadas con los plásmidos que contenían proteína se caracterizaron para la expresión óptima y se hicieron crecer a 37ºC hasta que la DO_{600} alcanzaba aproximadamente 0,4 y se indujeron mediante IPTG 1 mM (Invitrogen) durante 3 horas a 37ºC. Un litro de células se nodulizó a 13.000 rpm durante 10 minutos, se pesó y se almacenó a -80ºC. El nódulo celular congelado se resuspendió en 8 ml de tampón de ruptura de células (tampón de fosfato 0,1M, pH 7,3, Triton X100 al 0,1%, EDTA 1 mM) por gramo de células y se sometió a ultrasonidos 4 veces durante 1 minuto con intervalos de 1 minuto. El lisado celular se retiró mediante centrifugación a 35.000 g durante 10 minutos. Los nódulos celulares se lavaron a continuación 2-3 veces mediante resuspensión en 30 ml de tampón de ruptura celular, mediante ultrasonidos durante 1 minuto, seguido por centrifugación. El nódulo celular final, cuerpos de inclusión, se almacenó a -20ºC. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 5 ml de tampón de solubilización (Tris 0,2 M, pH 9, hidrocloruro de guanidina 7 M) por gramo de células. Se añadieron reactivos de sulfotolisis (0,16 gramos de sulfito sódico, 0,08 gramos de tetrationato potásico por gramo de células) y los cuerpos de inclusión se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Los constituyentes no disueltos se retiraron a continuación mediante centrifugación a 35.000 g durante 20 minutos dejando cuerpos de inclusión solubilizados. Los cuerpos de inclusión se pasaron a continuación por una columna de exclusión por tamaños Superdex200 (Akta) para aislar la proteína. La columna se equilibró con dos volúmenes de columna (VC) de hidrocloruro de guanidina 6 M/PBS, pH 7, a un caudal de 1 ml/minuto y la proteína se eluyó en 1,5 VC. Las fracciones de los picos (1,5 ml cada una) se recogieron y se rastrearon mediante gel de electroforesis Bis-Tris-SDS al 12% o 4-20%. Las fracciones que contenían la proteína se reunieron y una concentración final de DTT 7,5 mM se añadió para reducir las moléculas de proteína. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó 5 veces con agua y se sometió a diálisis en 4,5 1 de NaH_{2}PO_{4} 3 mM, Na_{2}HPO_{4} 7 mM, KCl 2 mM, NaCl 120 mM. La diálisis se continuó durante 3-4 días con cambio por tampón reciente al menos 3 veces. El material dializado se filtró a continuación a través de un filtro de 0,2 \mum y el pH se ajustó hasta 5 con ácido acético. La columna se equilibró con 10 VC de tampón 1 (acetato amónico 25 mM, pH 5), seguido por un gradiente de 20 minutos hasta 100% de tampón B (acetato amónico a 25 mM, pH 5/NaCl 1 M) después de la inyección. Las fracciones de los picos (0,5 ml cada una) se recogieron y se rastrearon mediante electroforesis en gel Bis-Tris-SDS al 12% o 4-20%. Las fracciones que contenían producto se reunieron y se diluyeron 2 veces en Tampón A (TFA al 0,1%/agua). La proteína se cromatografió a continuación en C4 Reverse Phase-HPLC (Beckman system Gold), usando un circuito de 5 ml y un caudal de 1 ml/minuto con el siguiente programa: 10% de Tampón A a lo largo de la duración de la inyección, 10 minutos de gradiente hasta 40% de Tampón B (TFA al 0,1%/ACN), 30 minutos de gradiente hasta 50% de Tampón B y 5 minutos de gradiente hasta 100% de Tampón B. Las fracciones de los picos (0,5 ml cada una) se recogieron y se rastrearon mediante electroforesis en gel Bis-Tris-SDS al 12% o 4-20%. Las fracciones que contenían proteína se secaron y se resuspendieron en MES 0,1 M, pH 6,1, para el análisis y los ensayos.
Ejemplo 3 PEGilación de Cisteína Específica para el Sitio y Purificación
Se estableció un protocolo para PEGilar las muteínas IL4-RA que contienen cisteína a través de un enlace de tioéter estable entre el sulfhidrilo de la proteína y el grupo maleimida y un derivado de metoxi-polietilenglicol-maleimida de 22 kD lineal (Nektar Therapeutics). Un exceso molar de dos veces del reactivo de 22 kD de mPEG-MAL se añadió a 60 \muM de proteína disuelta en tampón de reacción, MES 0,1 M, pH 6. Después de 0,5 horas a temperatura ambiente, la reacción se terminó con un exceso molar doble de cisteína sobre mPEG-MAL 22 kD (Figura 1). La proteína PEGilada se purificó de mPEG-MAL 22 kD sin reaccionar (extinguida con cisteína) y muteína de cisteína IL4-RA sin reaccionar mediante intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaños. Las mezclas de reacción en bruto se aplicaron a columnas de intercambio catiónico Vivapure Mini S (Vivasciencie) equilibradas con 0,4 ml de MES 0,1 M, pH 6. Las columnas se lavaron dos veces con 0,4 ml de MES 0,1 M, pH 6, seguido por centrifugación a 2.000 x g después de cada lavado. Las muestras se eluyeron mediante centrifugación de la columna con 0,4 ml de NaCl 0,6 MIMES 0,1 M, pH 6. Las eluciones de 0,4 ml se cargaron a una columna de dimensionamiento de HPLC TSK-GEL G2000SWXL (Tosoh Biosep) usando un Beckman HPLC system Gold. Las muestras se resolvieron usando una fase móvil de solución salina tamponada con fosfato (PBS de Dulbecco) a un caudal de 1 ml/minuto durante 30 minutos. Las fracciones de los picos (0,5 ml) se recogieron y se evaluaron mediante electroforesis en gel Bis-Tris-SDS al 4-12% para la proteína PEGilada. Las fracciones que contenían el producto se reunieron y se concentraron usando un dispositivo Ultrafree Biomax-5 (Millipore) por protocolo del fabricante hasta aproximadamente 60 \muM (o \sim1 mg/ml) para el análisis y los ensayos in vitro. Las concentraciones finales para las proteínas PEGiladas se determinaron mediante análisis de aminoácidos. Los rendimientos finales se representan en la Tabla 5.
TABLA 5 Rendimientos de purificación para muteínas de cisteína IL4RA PEGiladas
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Ejemplo 4 Ensayo de Unión al Receptor de IL-4 BiaCore
El receptor de IL-4 se inmovilizó sobre un chip detector de calidad para investigación CM5 de BIAcore a través de acoplamiento con amina. La superficie del detector se activó con un impulso de EDC/NHS. El receptor de IL-4 se disolvió en tampón de acetato 10 mM (pH 5,0) y se inyectó en la célula de flujo 2 seguido por un impulso de etanolamina 1,0 M-HCl para desactivar la superficie. El nivel de inmovilización para el receptor era \sim300 RU. La célula de flujo 1 también se activaba sin un ligando para funcionar como un blanco. Se usó the Biacore Wizar para realizar el análisis cinético. Los antagonistas de IL4RE posibles se diluyeron en HBS-EP (tampón de recorrido) y se inyectaron a un caudal de 30 \mul/minuto durante 3 minutos y un tiempo de disociación de 15 minutos. La regeneración del chip se realizó mediante dos inyecciones de 30 segundos de glicina 10 mM, pH 2,5 (flujo 100 \mul/minuto) hasta la línea de base antes de la siguiente inyección en la serie de concentración. Se calcularon valores de la constante de disociación (K_{D}) para cada candidato basándose en la cinética de unión directa (Tabla 5). Los resultados muestran que los construc-
tos IL4-RE-A104C, IL4-RE-N105C e IL4-RE-Q106C daban todos constantes de disociación por debajo de 0,6 nM.
Ejemplo 5 Ensayo de Proliferación de Células TF-1
La respuesta proliferativa de células TF-1 a IL-4 (0,5 ng/ml, 0,033 nM) o IL-13 (5 ng/ml, 0,416 nM) se usó para determinar la actividad antagonista funcional de moléculas de IL-4RE. En este ensayo, las células TF-1 se cultivaron durante 2-4 días en placas de 96 pocillos (1 x 10^{4}/pocillo, 100 \mul de volumen) en RPMI + suero al 10% con o sin moléculas de IL-4 o IL-13 e IL-4RE. Se usó tratamiento con GM-CSF como un control positivo. Veinticuatro horas antes de la lectura final, se añadieron 10 \mul de AlamarBlue (10% en volumen) a cada pocillo. La fluorescencia se determinó a 530/590 nM usando un VALLAC Victor 2. La concentración inhibidora 50% (IC_{50}) se calculó basándose en la concentración de dosis de las moléculas de IL-4RE posibles. Un resumen de los resultados del bioensayo de TF-1 para la inhibición de IL4 e IL-13 se muestra en la Tabla 6. Los resultados indican que los constructos IL4-RE-K37C, IL4-RE-N38C e IL4-RE-A104C demostraban valores de IC_{50} comparables a los de IL-4-RA en presencia de IL-4 o IL-13.
TABLA 6 Ensayo de unión a BIAcore de PEG-IL4RE y evaluación de la bioactividad de muteínas PEGiladas frente a IL4RA en ensayos de proliferación de células TF-1
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Ejemplo 6 Ensayo de Proliferación de Células Primarias
La respuesta proliferativa de células primarias humanas (células T y B) a IL-4 también se evaluó después del pretratamiento con moléculas de IL-4RE. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron de sangre periférica y algunas se trataron con PHA durante 4 días para inducir la formación de blastos de células T. Las PBMCs también se trataron con anti-CD40 para activar la actividad de células B y se usaron inmediatamente. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (10^{5} células por pocillo). Las preparaciones de blastos de células T y células B con PHA se estimularon durante 3 días con IL-4 (10 ng/ml, 0,667 nM) en presencia de concentraciones variables de moléculas de IL-4RE. La incorporación de timidina tritiada en las últimas 20 horas de incubación se usó como un indicador de la proliferación. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 7. Los resultados indican que todos los constructos PEGilados demostraban una IC_{50} menos de 5 veces mayor que la de IL-4RA para ambos ensayos con células primarias.
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TABLA 7 Evaluación de la bioactividad de PEG-IL4RE en ensayos de proliferación de células B y blastos de células T
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Ejemplo 7 Estudios Farmacocinéticos en Ratas
Se usaron ratas Sprague-Dawley macho adultas que pesaban de 250 a 300 gramos. Las ratas se canularon con un catéter en la vena yugular para la recogida de muestras de sangre. Además, las ratas del grupo de dosis intravenosa (IV) se canularon con catéteres en la vena femoral para la administración de fármacos.
Se les administró a las ratas IL-4RA o un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada en dosis de 1 y 0,5 mg/kg, respectivamente. Se usaron las rutas de administración tanto IV como SC (subcutánea). La dosis IV se administró mediante inyección directamente en el catéter de la vena femoral entrante. La dosis SC se administró mediante inyección en la región torácica dorsal. Se usaron tres ratas para cada grupo de dosis.
Después de una sola inyección en bolo (IV o SC), se recogieron muestras de sangre antes de la dosis y en momentos predeterminados hasta 168 horas después de la dosis. La centrifugación para las muestras comenzaba en 1 hora desde la recogida. Se recogió plasma y se puso sobre hielo seco antes del almacenamiento a aproximadamente -70ºC.
Las concentraciones en plasma de IL-4RA y muteína modificada se cuantificaron con un inmunoensayo con enzimas ligadas. Se usó anti-anticuerpo IL-4 como revestimiento y reactivos de detección. El límite inferior de la cuantificación para este ensayo era 0,2 mg/ml. Los parámetros farmacocinéticos se derivaron mediante análisis no compartimental usando WinNonlin (Pharsight, Mountain view, CA). De particular interés es la determinación de la absorción y la cinética de eliminación, los volúmenes de distribución así como la cantidad absorbida.
Referencias
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2. Huang, S.K., H.Q. Xiao, J. Kleine-Tebbe, G. Paciotti, D.G. Marsh, L.M. Lichtenstein y M.C. Liu. 1995. IL-13 expression at the sites of allergen challenge in patients with asthma. J. Inmmunol. 155. 2688-2694.
3. Zhu, Z., RJ. Homer, Z. Wang, Q. Chen, G.P. Geba, J. Wang, Y. Zhang y J.A. Elias. 1999. Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation, mucus hypersecretion, subepithelial fibrosis, physiologic abnormalities, and eotaxin production. J. Clin. Invest. 103: 779-788.
4. Henderson, W.R.J., E.Y. Chi y C.R Maliszewski. 2000. Soluble IL-4 receptor inhibits airway inflammation following allergen challenge in a mouse model of asthma. J. Immunol. 164: 1086-1095.
5. Sambrook (1989) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., 1995.
<110> BAYER PHARMACEUTICALS CORPORATION
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PAN, Clark 
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ROCZNIAK, Steve 
\hskip1cm
GREVE, Jeffrey Michael 
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YUNG, Stephanie L. 
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LONGPHRE, Malinda 
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WONG, Teresa Mo-fun 
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TOMKINSON, Adrian 
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<120> ANTAGONISTAS DE RECEPTOR DE MUTEÍNA DE IL-4 MODIFICADA
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<130> AER01210WO
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44 
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<400> 30
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\hskip1cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (23)

1. Un polinucleótido purificado que comprende
a) una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC: 4, Nº ID SEC: 5, Nº ID SEC: 6, o
b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 12, Nº ID SEC: 13, Nº ID SEC: 14.
2. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Un método para elaborar un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada, que comprende las etapas de:
a) cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 3 bajo condiciones por las que se expresa el antagonista; y
b) purificar el antagonista del cultivo de células huésped.
5. Un método para elaborar un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada en forma activa, que comprende las etapas de:
a) cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 3 bajo condiciones por las que se expresa el antagonista;
b) dejar que el antagonista se repliegue en presencia de ditiotreitol; y
c) purificar el antagonista del cultivo de células huésped.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además las etapas de:
d) acoplar el antagonista a un polímero no proteínico; y
e) purificar el antagonista acoplado al polímero no proteínico.
7. Un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada producido mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el residuo de aminoácido en la posición 37, 38, ó 104 es cisteina y en donde el antagonista inhibe la actividad mediada por IL-4 e IL-13.
8. El antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de acuerdo con la reivindicación 7, acoplado a un polímero no proteínico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol y polioxialqui-
lenos.
9. Un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada acoplado a un polímero no proteínico en un residuo de aminoácido en la posición 37, 38 ó 104 de IL-4, en el que el polímero no proteínico es polietilenglicol, polipropilenglicol o un polioxialquileno
10. El antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada tiene una semivida en plasma que es al menos aproximadamente 2-10 veces mayor que la de un antagonista de receptor de IL-4 no modificada.
11. El antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada está acoplado al polímero no proteínico en un residuo de aminoácido en la posición 37, 38 ó 104, de IL-4.
12. El antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 12.
13. El antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 13.
14. El antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC: 14.
\newpage
15. Una composición farmacéutica que comprende:
a) el antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14; y
b) un portador farmacéuticamente aceptable.
16. Antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 para el tratamiento de un trastorno humano asociado con la actividad incrementada de IL-4 e IL-13.
17. Composición farmacéutica según la reivindicación 15 para el tratamiento de trastorno humano asociado con la actividad incrementada de IL-4 e IL-13.
18. Antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada de la reivindicación 16 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17, en el que es trastorno es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o estados pulmonares relacionados.
19. Antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada o composición farmacéutica según la reivindicación 18 en el que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica es enfisema o bronquitis crónica.
20. Uso de un antagonista de receptor de muteína de IL-4 modificada según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno humano asociado con la actividad incrementada de IL-4 e IL-13.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que es trastorno es asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o estados pulmonares relacionados.
22. Uso según la reivindicación 21, en el que la enfermedad pulmonar obstructiva crónica es enfisema o bronquitis crónica.
23. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 15 para el tratamiento de un trastorno humano asociado con la actividad incrementada de IL-4 e IL-13.
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KREITMAN RJ et al. Site-Specific Conjugation to Interleukin 4 Containing Mutated Cysteine Residues Produces Interleukin 4- Toxin Conjugates with Improved Binding and Activity. Biochemistry. 1994, Vol 33, páginas 11637-11644. Especialmente, página 11637, resumen, columna 1, párrafo 2 - columna 2, párrafo 1; página 11638, columna 1, párrafos 2-3; columna 2, párrafo 5; página 11640, columna 2, párrafos 4-5; página 11641, columna 2, párrafos 1-2, Tabla 2; página 11643, columnas 1-2. *

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