ES2315110A1 - Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina. - Google Patents
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Abstract
Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina. Uso de un producto de proteína neuregulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o preventivo de un estado o enfermedad asociados con la resistencia a la insulina en un mamífero, incluyendo un humano, donde el producto de proteína neuregulina actúa como sensibilizador de la insulina, y donde el estado o la enfermedad se selecciona entre la diabetes mellitus tipo 2, un síndrome de resistencia severa a la insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a la insulina, la obesidad, la intolerancia a la glucosa, la dislipidemia y el síndrome metabólico.
Description
Compuestos para el tratamiento de enfermedades
relacionadas con la resistencia a la insulina.
Esta invención se refiere al campo de la
medicina humana, y específicamente con el tratamiento de estados o
enfermedades relacionados con la resistencia a la insulina, como la
diabetes de tipo 2, la resistencia severa a la insulina, la
obesidad, la intolerancia a la glucosa, la dislipidemia y el
síndrome metabólico.
La resistencia a la insulina ha sido reconocida
como un problema terapéutico desde los años 30. Sin embargo, fue el
desarrollo de análisis sensibles para la insulina y de métodos
cuantitativos para estimar la acción de la insulina lo que permitió
definir el alcance del problema y sus implicaciones clínicas. La
resistencia a la insulina es un cambio en la regulación fisiológica
de modo que una dosis fija de insulina causa un efecto menor sobre
el metabolismo de la glucosa del que ocurre en individuos normales.
La respuesta compensatoria normal a la resistencia a la insulina es
un aumento en la secreción de la insulina que resulta en
hiperinsulinemia. Con el tiempo, el páncreas no puede seguir
abasteciendo la necesidad del cuerpo de insulina, y se acumula un
exceso de la glucosa en sangre (hiperglicemia). Mucha gente con
resistencia a la insulina tiene altos niveles de glucosa y de
insulina circulando en su sangre al mismo tiempo. Los niveles de
glucosa en sangre permanecen elevados y el cuerpo responde
produciendo más insulina, provocando todavía más intolerancia en
respuesta a los niveles elevados de insulina en la sangre. Las
personas con niveles de glucosa en sangre más altos que los
normales pero no todavía en el intervalo diabético tienen
"pre-diabetes". A veces los médicos se refieren
a este estado como nivel alterado de la glucosa en ayuno
("impaired fasting glucose", IFG) o tolerancia alterada a la
glucosa ("impaired glucose tolerance", IGT), dependiendo de la
prueba usada para diagnosticarla. La diabetes del tipo 2 aparece
cuando el páncreas ya no puede mantener este nivel de producción de
insulina.
Asociado con la resistencia a la insulina, sin
embargo, hay un conjunto de otras anormalidades metabólicas que
tienen que ver con la distribución de las grasas del cuerpo, el
metabolismo de lípidos, la trombosis y la fibrinólisis, la
regulación de la presión sanguínea y la función endotelial de la
célula. A este conjunto de anormalidades se le llama síndrome
metabólico. Los individuos con el síndrome metabólico tienen un
mayor riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2, síndrome ovárico
policístico ("polycystic ovarian syndrome", PCOS) y/o
aterosclerosis acelerada con sus complicaciones
cardiovasculares.
La diabetes de tipo 2 es la forma más común de
diabetes, representando cerca del 90% de todos los casos de
diabetes. La patogénesis de la diabetes de tipo 2 se caracteriza
por defectos en la acción de la insulina (resistencia a la
insulina) en el músculo, el tejido adiposo y el hígado, así como por
un fallo relativo de las células \beta pancreáticas en producir
suficientes cantidades de insulina. Tanto la resistencia a la
insulina como la deficiencia de insulina han mostrado tener
componentes genéticos. La diabetes de tipo 2 aparece por la acción
conjunta de múltiples factores genéticos y ambientales.
Bajo condiciones de abundancia alimenticia, una
gran fracción de la población acumula reservas excesivas de
lípidos. La obesidad está aumentando por encima del 30% de la
población en sociedades occidentales. La naturaleza hereditaria de
la obesidad se ha demostrado con estudios de familias, y estudios
de gemelos y de adopción han demostrado que el patrón familiar se
debe sobre todo a factores genéticos. Sin embargo, la obesidad se
asocia mucho con la resistencia a la insulina y constituye el factor
de riesgo principal para el desarrollo dula diabetes no dependiente
de insulina o diabetes mellitus de tipo 2. Las terapias existentes
para la obesidad están dirigidas a la administración de inhibidores
de depósitos de grasas o de estimuladores de la termogénesis del
tejido adiposo o lipolisis. Otras terapias se han centrado en
intentar encontrar las señales que transmiten la información sobre
el tamaño de la masa de tejido adiposo al cerebro. De todas formas,
hasta ahora, la terapia de la obesidad no es totalmente
satisfactoria, y se requieren agentes terapéuticos nuevos.
La clave para luchar contra la diabetes está en
supervisar y controlar los niveles de azúcar en sangre. Además de
la dieta y el ejercicio, las terapias actuales implican la
administración de agentes hipoglicémicos orales (OHAs, "oral
hypoglycemic agents"). Los OHAs se pueden clasificar en aquellos
que aumentan la sensibilidad a la insulina
("insulin-sensitizing agents" o agentes
sensibilizadores de la insulina); aquellos que su acción se asemeja
a la de la insulina ("insulin-mimetic agents" o
agentes miméticos de insulina); y aquellos que estimulan el
páncreas para que secrete más insulina. Los últimos incluyen las
sulfonilureas (p.ej. tolbutamida, clorpropamida, tolazamida,
gliburida, glipizida y glimepirida) y derivados del ácido benzoico
(repaglinida). Ejemplos de miméticos de la insulina son el ácido
alfa lipoico y varios compuestos tales como el vanadato o el
tungstato. Los sensibilizadores de la insulina ayudan a utilizar la
glucosa más eficientemente o a hacer que las células del tejido
sean más sensibles a la insulina, así que requieren de la presencia
de insulina para trabajar. Ejemplos de sensibilizadores de la
insulina actualmente en el mercado son las binaguidas (tales como la
metformina) y las tiazolidinedionas (TZDs) o glitazonas
(rosiglitazona y pioglitazona). Una glitazona, la troglitazona
(Rezulin®), fue retirada del mercado por su fabricante en marzo de
2000 debido a su potencial para causar daño al hígado. La
rosiglitazona y la pioglitazona tienen efectos similares sobre el
azúcar en sangre pero no tienen, al parecer, efectos nocivos
significativos sobre el hígado. Otros sensibilizadores de la
insulina en desarrollo son p.ej. la reglixana, la netoglitazona, la
balaglitazona, la rivoglitazona, el tesaglitazar y el ragaglitazar.
La estrategia de usar sensibilizadores de la insulina es
especialmente interesante puesto que la mayoría de los estados
caracterizados por una homeostasis deteriorada de la glucosa se
caracterizan por una respuesta deficiente a la insulina (resistencia
a la insulina). Otro tipo de agentes hipoglicémicos son los
inhibidores de la alfa-glucosidasa, que actúan
retrasando la absorción de la glucosa de los carbohidratos
injeridos. Ejemplos de ellos son la acarbosa y el miglitol.
Los fármacos antidiabéticos actualmente
disponibles -aunque, en general, han demostrado ser eficaces y bien
tolerados- tienen efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, los
efectos nocivos de las sulfonilureas incluyen hipoglicemia,
transtornos gastrointestinales y reacciones de hipersensibilidad.
Los efectos nocivos de la biguanida incluyen transtornos
gastrointestinales y acidosis láctica.
Muchas compañías farmacéuticas están trabajando
para producir nuevos fármacos para la diabetes de tipo 2. Éstos
incluyen nuevas clases de fármacos así como nuevos sensibilizadores
de insulina y nuevos estimuladores de la secreción de insulina.
Así, es conveniente identificar y llevar a la práctica clínica
nuevos agentes terapéuticos para disminuir la resistencia a la
insulina.
Los inventores han encontrado que las
neuregulinas pueden mejorar la resistencia a la insulina en sujetos
que tienen un estado o una enfermedad asociada con la resistencia a
la insulina. Cuando se mejora la resistencia a la insulina se
realza la acción endógena de la insulina, y entonces los niveles de
glucosa en sangre bajan a un nivel normal. Así, las neuregulinas
actúan como sensibilizadores de la insulina.
El término "resistencia a la insulina" será
entendido aquí según la técnica tal como se describe en el apartado
de estado de la técnica. Como se usa aquí, el término
"sensibilizador de la insulina" es un agente que ayuda a
utilizar la glucosa más eficientemente o a hacer las células del
tejido más sensibles a la insulina, es decir, un agente que
restaura la función deteriorada de un receptor de la insulina al
estado original y de esta manera mejora la resistencia a la
insulina. Así, el sensibilizador de la insulina se puede llamar
también "agente que mejora la resistencia a la insulina"
("insulin resistance-improving agent").
En consecuencia, la invención se refiere al uso
de un producto de proteína neuregulina para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de un
estado y/o enfermedad asociados con la resistencia a la insulina en
un mamífero, incluyendo un humano, donde el producto de proteína
neuregulina actúa como sensibilizador de la insulina, y donde el
estado y/o la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en:
la diabetes mellitus tipo 2, un síndrome de resistencia severa a la
insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a la
insulina, la obesidad, la intolerancia a la glucosa, la
dislipidemia y el síndrome metabólico.
Así, la invención se relaciona con un método
para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de un estado y/o
enfermedad asociados con la resistencia a la insulina en un
mamífero, donde el estado y/o la enfermedad es como se describe
antes, que comprende la administración a un mamífero
(particularmente un humano) que lo necesite una cantidad efectiva de
un producto de proteína neuregulina, actuando dicho producto de
proteína neuregulina como sensibilizador de la insulina.
Los inventores han encontrado que el tratamiento
con neuregulina realza la sensibilidad a la insulina, aumenta la
expresión del receptor de la insulina y aumenta la capacidad
oxidativa. Se observa un aumento de la biogénesis mitocondrial y un
aumento de complejos oxidativos y del potencial mitocondrial de la
membrana.
En este contexto, es relevante mencionar que la
técnica describe un efecto aditivo de la neuregulina por lo que se
refiere a la insulina (cfr. por ejemplo, el documento C. Cantó
et al., "Neuregulin signaling on glucose transport in
muscle cells", J. Biol. Chem. 2004, vol. 279, pp.
12260-8; y el documento E. Suarez et al.,
"A novel role of neuregulin in skeletal muscle. Neuregulin
stimulates glucose uptake, glucose transporter translocation, and
transporter expression in muscle cells", J. Biol. Chem.
2001, vol. 276, pp. 18257-64). De esta enseñanza,
un experto en la materia consideraría la neuregulina como un
posible mimético de la insulina y no como un sensibilizador de la
insulina, como se ha encontrado en la presente invención.
Las realizaciones particulares que se describen
a continuación no pretenden ser limitantes para la presente
invención.
Las neuregulinas (NRGs) son proteínas de
señalización célula-célula que son ligandos para
los receptores de tirosin-quinasas de la familia de
receptores ErbB. La familia de genes de neuregulina tiene cuatro
miembros: NRG1, NRG2, NRG3 y NRG4. El gen humano NRG1 (número de
acceso Genbank BK000383) tiene casi 1,4 megabases de largo. Menos
del 0.3% de esta longitud codifica la proteína. Como consecuencia
de un empalme ("splicing") alternativo rico y de múltiples
promotores, se producen por lo menos 15 isofomas diferentes de NRG
del mismo gen NRG1. Las tres características estructurales
conocidas para distinguir las isoformas con respecto a las
funciones in vivo y a las características biológicas de la
célula son el tipo de dominio similar a EGF
("EGF-like", EGF = "epidermal growth
factor", factor de crecimiento epidérmico), que puede ser del
tipo \alpha o \beta; la secuencia N-terminal
(tipo I, II, o III), y si la isoforma se sintetiza inicialmente como
una proteína transmembrana o de no membrana. A los tipos I y II de
NRGs se les llama conjuntamente a veces como
"Ig-NRGs" (Ig = immunoglobulina), y el tipo
III de NRGs se denomina a veces como "CRD-NRGs"
(CRD = "cysteine rich domain", dominio rico en cisteínas). En
la literatura se usaron primero otros nombres para referirse a las
diferentes isoformas de NRG, tales como, actividad inductora del
receptor de acetilcolina ("acetylcholine
receptor-inducing activity", ARIA), factor de
crecimiento glial ("glial growth factor", GGF), heregulina
(HRG), factor de diferenciación neu ("neu differentiation
factor", NDF) y factor derivado de neurona sensorial y motora
("sensory and motor neuron-derived factor",
SMDF). Sin embargo, estos nombres no se pueden tomar para indicar
las funciones biológicas específicas de las isoformas a las cuales
se han aplicado. Para más detalles sobre el gen de la neuregulina,
ver D.L. Falls, "Neuregulins: functions, forms, and signaling
strategies", Experimental Cell Research 2003, vol. 284,
pp. 14-30.
Según se usa aquí, el término "producto de
proteína neuregulina" se refiere a la proteína neuregulina
producida naturalmente o recombinante; a los fragmentos
polipeptídicos biológicamente activos naturales, sintéticos, o
recombinantes de proteína neuregulina; a las variantes
polipeptídicas biológicamente activas de proteína neuregulina o
fragmentos de las mismas, incluyendo proteínas de fusión híbridas o
dímeros; o a los análogos polipeptídicos biológicamente activos de
proteína neuregulina o fragmentos o variantes de los mismos. Los
análogos incluyen, pero no se limitan, a productos de proteína
neuregulina donde uno o más residuos de aminoácido han sido
substituidos por una aminoácido diferente. Se prefieren las
sustituciones de aminoácidos conservativas.
Productos de proteína neuregulina adecuados para
la invención incluyen productos de proteína derivados de los genes
NGR1, NRG2, NRG3 y NRG4. Son proteínas que se unen a los receptores
ErbB2, ErbB3 y ErbB4. ErbB1 no une neuregulinas. Ejemplos de
productos de proteína neuregulina adecuados para la invención se
describen en los documentos WO 99/02681, WO 92/18627, WO 94/00140,
WO 94/04560, WO 94/26298 y WO 95/32724.
Los fragmentos biológicamente activos de
neuregulina incluyen moléculas biológicamente activas que tienen
una secuencia de aminoácidos igual o similar a la de una proteína de
neuregulina humana natural. Un fragmento biológicamente activo de
neuregulina preferido para la invención es la secuencia de
aminoácidos correspondiente al dominio similar a EGF
("EGF-like domain"). Otro fragmento
biológicamente activo de neuregulina preferido es la secuencia de
aminoácidos que comprende el dominio similar a Ig
("Ig-like domain") y el dominio similar a
EGF.
En realizaciones particulares de la invención,
el fragmento es de neuregulina-1 (también conocida
simplemente como "neuregulina"), neuregulina-2,
neuregulina-3 y neuregulina-4,
pudiendo ser todas ellas de origen diferente. Particularmente, el
fragmento que comprende el dominio similar a EGF se selecciona
entre neuregulina-1 humana,
neuregulina-1 de ratón,
neuregulina-1 de rata, neuregulina-1
bovina, neuregulina-1 de pollo,
neuregulina-1 de conejo,
neuregulina-1 de hámster,
neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y
neuregulina-1 de pez cebra;
neuregulina-2 humana, neuregulina-2
de ratón y neuregulina-2 de rata;
neuregulina-3 humana y neuregulina-3
de ratón; y neuregulina-4 humana,
neuregulina-4 de ratón y
neuregulina-4 de pollo. Secuencias específicas para
estos fragmentos son las aquí descritas como SEQ ID NO:
1-17.
En otras realizaciones, el fragmento de
neuregulina además comprende el dominio similar a Ig y se
selecciona entre neuregulina-1 humana,
neuregulina-1 de ratón,
neuregulina-1 de rata, neuregulina-1
bovina, neuregulina-1 de conejo,
neuregulina-1 de hámster,
neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y
neuregulina-1 de pez cebra; y
neuregulina-2 humana, neuregulina-2
de ratón y neuregulina-2 de rata. Secuencias
específicas para estos fragmentos son las aquí descritas como SEQ
ID NO: 18-28.
En una realización preferida, el producto de
proteína neuregulina es un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO: 1 (heregulina-\beta1
(aminoácidos 177-244)).
Un ejemplo de un producto de neuregulina
actualmente disponible en el mercado es un producto de ADN
recombinante, expresado a través de E. coli, utilizado para
el paro cardíaco moderado y severo (Zensun, Shangai). Otro producto
en el mercado pero solamente para uso en investigación, es una
heregulina-b1/neuroregulina-1
recombinante humana (factor de diferenciación de neu) producida en
E. Coli. Es una cadena polipeptídica única, no glicosilada,
que contiene 61 aminoácidos, que comprende el dominio similar a
EGF, y tiene una masa molecular total de 7055 Dalton
(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd).
Según se usa aquí, el término "producto de
proteína neuregulina" también incluye una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica una proteína de neuregulina, o un fragmento
funcional de la misma. La secuencia de ácidos nucleicos aislada que
codifica la neuregulina, o el fragmento de la misma, se puede
también utilizar para la terapia génica in vivo o ex
vivo.
Los productos de proteína neuregulina de la
invención se pueden generar y/o aislar con cualquier medio conocido
en la técnica. Un procedimiento adecuado para producir un producto
de proteína neuregulina es transformar una célula hospedante
("host") con el ácido nucleico que codifica el producto
deseado de proteína neuregulina, cultivando la célula hospedante
transformada y recogiendo la neuregulina producida del cultivo de la
célula hospedante.
Los síntomas clínicos de los estados o de las
enfermedades relacionadas con la invención se sabe que están
asociados de alguna manera a la resistencia a la insulina. Por
ejemplo, son estados o enfermedades asociados a la resistencia a la
insulina la intolerancia a la glucosa, la resistencia severa a la
insulina, la diabetes tipo 2, la obesidad y el síndrome metabólico.
Otros estados que se asocian a la resistencia a la insulina
incluyen la hiperinsulinemia, la hiperglicemia, el síndrome ovárico
polístico, la resistencia a la insulina inducida por esteroides, la
diabetes gestacional, la dislipidemia, la hipertensión arterial y
la enfermedad cardiovascular, especialmente la aterosclerosis. La
invención es también aplicable cuando la resistencia a la insulina
está presente en el envejecimiento y en estados de capacidad baja
de ejercicio. El producto de proteína neuregulina como
sensibilizador de la insulina se puede utilizar para mejorar la
capacidad del ejercicio. En una realización preferida el estado o
enfermedad, como se describe aquí, se selecciona entre la
intolerancia a la glucosa, la diabetes mellitus tipo 2, la
obesidad, el síndrome metabólico, un síndrome de resistencia severa
a la insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a la
insulina o la dislipidemia. Está dentro del conocimiento general
del experto el identificar si p.ej. una persona tiene una de las
enfermedades relacionadas con la invención. Se hace referencia
p.ej. a the National Library of Medicine, USA (NLM) página web:
http://www.nlm.nih.gov, donde se describen detalles de estas
enfermedades.
La intolerancia a la glucosa es un estado muy
asociado a la diabetes tipo 2. Según lo explicado antes, los
médicos a veces se refieren a este estado como nivel alterado de la
glucosa en ayuno (IFG) o tolerancia alterada a la glucosa (IGT),
dependiendo de la prueba usada para diagnosticarla. Los niveles de
azúcar en sangre son elevados, pero no lo suficientemente altos
para justificar una diagnosis de la diabetes. El cuerpo todavía
produce insulina, pero en cantidades insuficientes para controlar
eficazmente los niveles de azúcar de sangre. La intolerancia a la
glucosa a menudo se considera una señal de alerta temprana para la
diabetes tipo 2: del uno al diez por ciento de la gente con
intolerancia a la glucosa desarrolla diabetes tipo 2 cada año. Las
causas de la intolerancia a la glucosa son similares a las
identificadas para la verdadera diabetes.
La diabetes de tipo 2 se define como la forma de
diabetes que se desarrolla cuando el cuerpo no responde
correctamente a la insulina, en oposición con la diabetes de tipo
1, en la cual el páncreas casi no produce insulina. La diabetes
mellitus de tipo 2 resulta de un defecto en la secreción de la
insulina y de una debilitación de la acción de la insulina en
tejidos periféricos, especialmente en tejido muscular y adipocitos.
Al principio, el páncreas afronta la demanda añadida produciendo
más insulina. Con el tiempo, sin embargo, pierde la capacidad de
secretar suficiente insulina en respuesta a las comidas. También
está presente un defecto en el post-receptor,
causando resistencia al efecto estimulante de la insulina sobre la
captación de glucosa, y se desarrolla una deficiencia no
dependiente de la insulina, a diferencia de la deficiencia absoluta
encontrada en pacientes con diabetes de tipo 1. Los factores
etiológicos específicos no se saben, pero los factores genéticos son
mucho más fuertes en el tipo 2 que en tipo 1.
El síndrome metabólico se describe como una
colección de factores de que aumente el riesgo de desarrollar
enfermedad cardíaca, paro cardíaco y diabetes. El síndrome está muy
asociado con el desorden metabólico generalizado llamado
resistencia a la insulina. Esta es la razón por la cual el síndrome
metabólico también es conocido como "síndrome de la resistencia a
la insulina", y también como el "síndrome X" y el
"síndrome dismetabólico". Los factores de riesgo incluyen la
obesidad, la resistencia a la insulina, la tolerancia alterada a la
glucosa, la hiperinsulinemia (niveles altos de insulina en sangre),
la hipertensión (tensión arterial alta), la dislipidemia (niveles
anormales de triglicéridos y del HDL-colesterol en
sangre) y el estado proinflamatorio. La resistencia severa a la
insulina es un estado patológico caracterizado por una extrema
resistencia a la insulina.
La obesidad es un estado caracterizado por un
peso mayor que el que generalmente se considera sano para una
altura dada. La obesidad puede causar muchos problemas de salud
debido a la tensión sobre órganos y articulaciones. Aumenta el
riesgo de algunos desórdenes extendidos y potencialmente fatales
tales como la diabetes, la tensión arterial alta, la dislipidemia,
la osteoartritis, la apnea del sueño y los problemas respiratorios,
algunos cánceres (endometrial, de mama, y de colon), la enfermedad
de la arteria coronaria y el paro cardíaco. Puede también conducir
a problemas psicológicos tales como la depresión. Los resultados de
la encuesta National Health and Nutrition Examination Survey para
1999-2002 estiman que un 30% de los adultos de los
Estados Unidos de más de 20 años -sobre 60 millones de personas-
son obesos, definidos por tener un índice de masa corporal ("body
mass index", BMI) de 30 o más alto (un BMI entre 25 y 29.9 se
considera exceso de peso). Se estima que un 16% de niños y
adolescentes con edades de 6-19 años tiene
sobrepeso.
Según la enseñanza de la presente invención, el
producto de proteína neuregulina puede administrarse a un mamífero
(particularmente un humano) para el tratamiento terapéutico y/o
preventivo de un estado y/o de una enfermedad asociada a
resistencia a la insulina. El propósito de la administración de
producto de proteína neuregulina puede ser preventivo (para evitar
el desarrollo de estas enfermedades) y/o terapéutico (para tratar
estas enfermedades una vez se hayan desarrollado/instaurado).
Se entiende que el producto de proteína
neuregulina se administra en una forma farmacéuticamente aceptable.
Los expertos en la materia pueden averiguar la dosis apropiada
usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis debe ser
una cantidad eficaz de producto de proteína neuregulina en el
sentido que la resistencia a la insulina mejore en el sujeto
tratado. Se conocen análisis adecuados para ensayar la mejora en la
resistencia a la insulina. Como ejemplos, dosis únicas adecuadas
para otros sensibilizadores de la insulina incluyen de 100 a 800 mg
de troglitazona y de 5 a 50 mg de pioglitazona.
El producto de proteína neuregulina de la
invención se puede administrar solo o en una composición con
portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las
composiciones se adaptan generalmente para la administración oral.
Sin embargo, pueden adaptarse a otros modos de administración, por
ejemplo la administración parenteral, sublingual o transdérmica.
Las composiciones pueden estar en forma de pastillas, cápsulas,
polvos, gránulos, supositorios, polvos reconstituibles o
preparaciones líquidas. Composiciones de liberación modificada
pueden ser composiciones de liberación retrasada, pulsada o
sostenida. Las composiciones pueden administrarse parenteralmente
por inyección del bolo o por liberación gradual en un cierto
periodo de tiempo. Puesto que el objetivo es la normalización del
nivel de glucosa, esto ofrece la posibilidad de por ejemplo,
administrar la composición como depot. Las composiciones pueden
comprender un producto de proteína neuregulina o más de un producto
de proteína neuregulina en combinación. Además, las composiciones
pueden comprender el producto de proteína neuregulina como único
agente sensibilizador de la insulina, combinaciones de estos
agentes o combinaciones con otros agentes terapéuticos dependiendo
de la enfermedad (otras clases de agentes hipoglucémicos orales o
otras clases de
fármacos).
fármacos).
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. El resumen de la solicitud se incorpora aquí
como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
La Fig. 1 muestra cómo la incubación crónica de
células L6E9 con neuregulinas incrementa el metabolismo
oxidativo.
La Fig. 2 muestra cómo la incubación crónica de
células L6E9 con neuregulinas incrementa la masa mitocondrial
celular.
La Fig. 3 muestra cómo la incubación crónica de
células L6E9 con neuregulinas incrementa la abundancia de complejos
oxidativos y el potencial de la membrana mitocondrial.
La Fig. 4 muestra cómo las neuregulinas
incrementan los niveles de PGC-1\alpha y median
la expresión inducida por calcio de
PGC-1\alpha.
La Fig. 5 muestra cómo el tratamiento crónico
con neuregulina incrementa la sensibilidad a la insulina.
La Fig. 1 muestra resultados en los que las
células L6E9 fueron incubadas en presencia o ausencia de 3 pM de
neuregulinas, antes de realizar los siguientes ensayos: Fig. 1A, se
realizaron ensayos de immunoblot (Western blot) con 10 \mug (para
los análisis de los niveles de proteína de MHC o de la subunidad
\alpha1 de la (Na^{+}/K^{+})ATPasa), 30 \mug (para
GLUT4 o GLUT1) o 40 \mug (para ErbB2 o ErbB3) de proteína de
lisados totales celulares. Se obtuvieron membranas plasmáticas
crudas (PM) y membranas microsomales de baja densidad (LDM) como se
describe en los métodos, y el efecto de las neuregulinas sobre la
presencia de GLUT4 en cada compartimiento fue analizado usando 10
\mug de proteína de PMs y 5 \mug de proteína de LDMs. Se
muestran imágenes representativas de 3-10
experimentos independientes. Fig. 1B, transporte de
2-[^{3}H]-desoxiglucosa (DU) en nmoles/mg de
proteína x 10 min. Fig. 1C, oxidación de la glucosa (GO) en
nmoles/mg de proteína x hora. Fig. 1D, oxidación de palmitato (PO)
en nmoles/mg de proteína x hora. Fig. 1E, liberación de lactato
(LR) en \mumoles/mg de proteína x hora. Fig. 1F, síntesis de
glucógeno en nmoles/mg de proteína x hora. Los resultados son la
media \pm SE of 3-12 experimentos diferentes. *
indica diferencias estadísticas significativas entre grupos control
(C) y tratados con neuregulina (Hrg) a
P< 0.01.
P< 0.01.
La Fig. 2 muestra resultados en los que las
células L6E9 se incubaron en presencia o ausencia de 3 pM de
neuregulinas, durante 48 horas antes de llevar a cabo los
siguientes ensayos: Fig. 2A, 20 \mug de lisados celulares totales
se utilizaron para la detección del contenido proteico de porina,
citocromo C y COX-I mediante análisis de western
blot. Se muestran las imágenes representativas y las
cuantificaciones densitométricas de 5 experimentos, expresadas como
valores promedio \pm SE. IR significa incremento relativo al
basal, en unidades arbitrarias relativas. * indica diferencias
estadísticamente significativas entre el grupo control (C) y el
grupo tratado con neuregulina (Hrg) a P < 0.05. La Fig. 2B
muestra resultados en los que la masa mitocondrial se midió como la
intensidad media de la fluorescencia procedente de la tinción con
el colorante NAO (unidades expresadas como % relativo al basal).
Los resultados se muestran como valores relativos, la media \pm
SE de seis experimentos. * indica diferencias estadísticas
significativas entre el grupo control (C) y el grupo tratado con
neuregulinas (Hrg) a P < 0.01.
La Fig. 3 muestra resultados en los que las
células L6E9 se incubaron en presencia (Hrg) o ausencia (C) de
neuregulinas durante 48 horas antes de llevar a cabo los siguientes
ensayos: Fig. 3A, las fracciones mitocondriales de células L6E9 se
obtuvieron tal y como se describe en los métodos, luego 20 \mug
de proteína se usaron para ensayos de western blot con el fin de
analizar la abundancia de los diferentes complejos de la
fosforilación oxidativa (CI = complejo I, subunidad de 39 kDa; CII
= complejo II, subunidad de 70 kDa; CIII = complejo III, del centro
2; CIV = complejo IV, subunidad COX IV; CV = complejo V, subunidad
\alpha; cyt C = citocromo C). Las imágenes mostradas son
representativas de tres experimentos. La Fig. 3B muestra resultados
en los que el potencial de membrana mitocondrial (MMP) relativo se
midió con la sonda potenciométrica JC-1 tal y como
se describe en métodos (unidades como % relativo al basal). Los
resultados mostrados son la media \pm SE de doce experimentos
independientes. * indica diferencias estadísticas significativas
entre el grupo control y el grupo tratado con neuregulinas a
P
< 0.01.
< 0.01.
La Fig. 4A muestra resultados en los que 120
\mug de lisados totales de células L6E9 incubadas en presencia
(Hrg) o ausencia (C) de 3 pM de neuregulinas, se utilizaron para la
detección por western-blot de
PGC-1\alpha. La imagen mostrada es representativa
de nueve experimentos y las cuantificaciones densitométricas,
mostradas abajo, están expresadas como incremento relativo al
basal, IR (en unidades arbitrarias relativas) como la media \pm
SE. * indica diferencias estadísticas significativas entre el grupo
control y el tratado con neuregulinas a P < 0.01. La Fig. 4B
muestra resultados en los que las células se incubaron en presencia
o ausencia de anticuerpos anti-ErbB3 contra el
dominio de unión de ligando (Ab) o de dantroleno (Dan) durante 30
minutos antes de añadir cafeína (Caff) o neuregulinas (Hrg) durante
3 horas. Luego se obtuvieron los lisados totales para analizar la
fosforilación de ErbB3. El medio de incubación de las 3 horas de
tratamiento se recogió para analizar la presencia de neuregulinas
liberadas (Hrg R). 200 \mul de medio se sometieron a
SDS-PAGE y posteriormente se realizó el inmunoblot
contra el fragmento común EGF de las neuregulinas. pErbB3 significa
ErbB3 fosforilado en tirosinas. Las imágenes mostradas son
representativas de tres experimentos. En la Fig. 4C, la abundancia
de PGC-1\alpha tras 15 horas de tratamiento con
cafeína y/o neuregulinas en presencia o ausencia de dantroleno
(Dan) o anticuerpos de bloqueo contra ErbB3 (Ab), se ensayó como se
describe en los métodos, usando 120 \mug (para
PGC-1\alpha) o 10 \mug (para detectar la
subunidad \alpha_{1} de la (Na^{+}/K^{+})ATPasa) de
proteína total para ensayos de western blot. Las imágenes mostradas
son representativas de tres experimentos (C, control; Hrg, grupo
tratado con neuregulinas).
La Fig. 5 muestra resultados en los que las
células L6E9 se incubaron en presencia (Hrg) o ausencia (C) de 3 pM
de neuregulinas, durante 48 horas antes de llevar a cabo los
siguientes ensayos: en la Fig. 5A, se muestran los resultados de
ensayos de captación de glucosa en dosis-respuesta a
la insulina. DU significa incremento de la captación de
2-[^{3}H]-desoxiglucosa sobre el basal, en
nmoles/mg de proteína x 10 min. El resultado mostrado es la media
\pm SE de cuatro experimentos. * indica diferencias estadísticas
significativas entre el grupo control (triángulos negros, línea
continua) y el grupo tratado con neuregulinas (círculos negros,
línea discontinua) a P < 0.01. La Fig. 5B muestra resultados en
los que para los ensayos de western blot se utilizaron 10 \mug de
membranas plasmáticas crudas (PM), obtenidas tal y como se describe
en la sección de métodos. La imagen mostrada es representativa de
tres experimentos. La Fig. 5C muestra resultados en los que 40
\mug de lisados celulares totales se utilizaron para los ensayos
de western blot para analizar la abundancia del receptor de
insulina (InsR), IRS-1, la subunidad reguladora p85
de la PI3K, PKB y PKC-\zeta. Las imágenes
mostradas son representativas de 3 experimentos. La Fig. 5D muestra
resultados en los que se examinó la respuesta de diferentes
efectores de la vía de señalización de la insulina tras 5 minutos
(InsR) o 15 minutos (el resto) de tratamiento a concentraciones
submáximas de insulina (100 nM). Tanto InsR como
PKC-\zeta se inmunoprecipitaron para analizar sus
niveles de fosforilación (ver métodos). La fosforilación de PKB en
Ser^{473} se analizó con un anticuerpo policlonal específico.
También se inmunoprecipitó la subunidad p85 de PI3K y se analizó
mediante inmunoblot su unión a IRS-1. Estas son
imágenes representativas de tres experimentos.
La línea celular de músculo esquelético de rata,
L6E9, fue amablemente cedida por el Dr. B.
Nadal-Ginard (Harvard University, Boston, MA). El
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), la glutamina y los
antibióticos se obtuvieron de BioWhittaker (Walkersville, MD), y el
suero fetal bovino ("Fetal Bovine Serum", FBS) se obtuvo de
Gibco (Invitrogen LTD). La insulina porcina purificada fue una
donación de Eli Lilly Co. (Indianapolis, IN). La neuregulina
recombinante,
heregulin-\beta1-(177-244) (Hrg)
fue una donación de Genentech, Inc. (South San Francisco, CA). La
mayoría de productos químicos habituales, así como la cafeína, el
dantroleno y el CCCP (carbonil cianida
m-clorofenilhidrazona), y el anticuerpo monoclonal
anti-\beta-actin se obtuvieron de
Sigma (St. Louis, MO). El anticuerpo monoclonal de bloqueo
anti-ErbB3 (Ab5) se obtuvo de Neomarkers (Fremont,
CA). Los anticuerpos monoclonales
anti-fosfo-tirosina,
anti-cadena \beta del receptor de insulina,
anti-IRS-1
(substrato-1 del receptor de la insulina) y
anti-caveolina-3, se obtuvieron de
Transduction Laboratories. Los anticuerpos policlonales
anti-PGC-1\alpha
(K-15), anti-ErbB2
(C-18) y anti-ErbB3
(C-17) se obtuvieron de Santa Cruz Inc. (Santa Cruz,
CA.). Los anticuerpos monoclonales anti-cadena
pesada de miosina (MF-20) y
anti-subunidad \alpha_{1} de la
(Na^{+}/K^{+})ATPasa (\alpha6F) se obtuvieron del
Developmental Studies Hybridoma Bank, que está bajo los auspicios
del NICHD y mantenido por la University of Iowa, Department of
Biological Sciences (Iowa City, IA). Los anticuerpos policlonales
anti-PKB,
anti-fosfo-Ser^{473}-PKB
y
anti-fosfo-Thr^{410}-PKC-\zeta
se obtuvieron de Cell Signaling (Danvers, MA). Los anticuerpos
policlonales anti-subunidad p85 de PI3K se
obtuvieron de Upstate Biotechnology Inc. (Charlottesville, VA). El
anticuerpo policlonal OSCRX (contra los 15 residuos aminoacídicos
C-terminales de GLUT4) fue producido en nuestro
laboratorio. El anticuerpo policlonal anti-GLUT1 se
obtuvo de Abcam (Cambridge, UK). El anticuerpo monoclonal
anti-porina se obtuvo de Calbiochem (La Jolla, CA).
El anticuerpo monoclonal anti-citocromo C se obtuvo
de PharMingen (San Jose, CA). Las sondas de NAO (naranja de nonil
acridina) y JC-1 (yoduro de
5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,1'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina)
así como los anticuerpos monoclonales contra diferentes subunidades
de los complejos de la fosforilación oxidativa se obtuvieron de
Molecular Probes (Eugene, OR). El reactivo de Bradford y todos los
materiales de electroforesis y los marcadores de peso molecular se
obtuvieron de Bio-Rad (Hercules, CA). El kit del
reactivo BCA de análisis de proteína se obtuvo de Pierce (Rockford,
IL). Immobilon polivinilidene difluoride (PVDF) se obtuvo de
Millipore Corp. (Bedford, MA). Los reactivos de ECL, la
2-desoxi-D-[^{3}H]-glucosa,
la D-[U-^{14}C]-glucosa y el
[U-^{14}C]-ácido palmítico se obtuvieron de
Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Todos los
productos químicos utilizados fueron de la mayor pureza
disponible.
Mioblastos L6E9 crecieron y se llevaron a la
formación de miotubos tal y como ya se ha descrito previamente
(cfr. E. Suárez et al., "A novel role for neuregulin in
skeletal muscle. Neuregulin stimulates glucose uptake, glucose
transporter translocation and transporter expression in muscle
cells", J. Biol. Chem. 2001, vol 276, pp.
18257-64). Para analizar el efecto crónico de las
neuregulinas, se añadieron 3 pM de heregulina recombinante (Hrg) 24
horas después de que las células se cambiaran a un medio de
diferenciación y los estudios se llevaron a cabo 48 horas más
tarde. Para los experimentos que analizaban los efectos agudos del
calcio sobre la liberación de neuregulinas y la fosforilación de
ErbB3, los miotubos L6E9 se ayunaron de suero durante 4 horas antes
de añadir cualquier tratamiento. El dantroleno (10 \muM) y el
anticuerpo anti-ErbB3/Ab5 (10 \mug/ml) se
añadieron 30 minutos antes de los tratamientos de cafeína (5 mM) y
neuregulinas (3 pM), que duraron 3 horas. Posteriormente, las
células se procesaron o se dejaron con medio al 2% de FBS (y
anti-ErbB3/Ab5 o dantroleno donde correspondía)
durante 15 horas más con el fin de analizar los niveles de proteína
de PGC-1\alpha. Los miocitos L6E9 también se
ayunaban de suero durante 4 horas antes de iniciar los tratamientos
con insulina, los cuales duraban 30 minutos.
Los extractos totales de miocitos L6E9 se
obtuvieron tal y como se describió previamente (cfr. Cantó et
al. "Neuregulin signaling on glucose transport in muscle
cells", J. Biol. Chem. 2004, vol 279, pp.
12260-8). Los niveles de proteína se midieron con
el método de Bradford. Las preparaciones de fracciones celulares
enriquecidas en mitocondrias se obtuvieron mediante homogenización
mecánica de los miocitos L6E9 con un tampón de homogenización
específico (sacarosa 0.25 M, EGTA 1 mM, Hepes 10 mM pH 7.4 e
inhibidores de proteasas añadidos justo antes del ensayo: PMSF 0.2
mM, leupeptina 1 \muM, pepstatina 1 \muM y aprotinin 1 U/ml), y
mediante el uso de un homogenizador de vidrio y un émbolo a motor.
El homogenado se centrifugó a 4500 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C.
El pellet se resuspendió con tampón de homogenización y se
centrifugó de nuevo de manera similar. El pellet resultante es la
fracción enriquecida en mitocondrias. Las membranas plasmáticas
crudas (PM) y las membranas microsomales de baja densidad (LDM) se
obtuvieron tal y como ya se ha descrito previamente (Suárez et
al.,
2001)
2001)
Los ensayos de inmunoprecipitación del receptor
de insulina, la subunidad p85 de la fosfatidilinositos
3-quinasa (PI3K) y PKC-\zeta se
llevaron a cabo tal y como ya se ha descrito (véase más arriba
Cantó et al., 2004). Las muestras de proteína que contenían
Laemmli Sample Buffer (LSB) se sometieron a una electroforesis en
geles de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de PVDF y
se realizó el inmunoblot como se describe (véase más arriba, Suárez
et al., 2001). Las proteínas se detectaron finalmente con el
método de ECL, y la señal cuantificada mediante escaneado
densitométrico.
Los ensayos de captación de
2-deoxiglucosa se realizaron tal y como ya se ha
descrito (véase más arriba, Suárez et al. 2001). La oxidación
de glucosa o de palmitato se cuantificó en células incubadas en el
medio de sales equilibrado de Hank (en presencia de FBS, 2%)
conteniendo 5 mM de D-glucosa y 0.32 \muCi de
D-[U-^{14}C]-glucosa (306
mCi/mmol), para los ensayos de oxidación de glucosa, o 0.1 mM de
palmitato con 0.1 \muCi de [U-^{14}C]-ácido
palmítico, (60 mCi/mmol) para los ensayos de oxidación de palmitato.
Las células se incubaron en este medio durante 3 horas y se captó
el ^{14}CO_{2} y se midió tal y como ya se ha descrito (cfr. N.
Auestad et al., "Fatty acid oxidation and ketogenesis by
astrocytes in primary culture", J. Neurochem. 1991, vol.
56, pp. 1376-86). Para las medidas de liberación de
lactato, los medios de células incubadas en presencia o ausencia de
neuregulinas durante 48 horas se recogieron y el lactato se midió
con un kit comercial disponible (Sigma 826-UV). La
síntesis de glucógeno se midió como incorporación de glucosa a
glucógeno, tal y como se ha descrito previamente (cfr. R.B. Ceddia
et al., "Creatine supplementation increases glucose
oxidation and AMPK phosphorylation and reduces lactate production
in L6 rat skeletal muscle cells", J. Physiol. 2004, vol.
555, pp. 409-21). Los niveles de proteína se
cuantificaron con el método
BCA.
BCA.
Los miocitos L6E9, incubados en ausencia o
presencia de 3 pM de neuregulinas durante 48 horas, se incubaron a
37°C durante 30 minutos con un medio libre de FBS que contenía 100
ng/ml de la sonda NAO. NAO es un colorante metacromático que se une
específicamente a la cardiolipina, un lípido de la membrana
mitocondrial interna, independientemente del estado energético.
Tras la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y
finalmente se tripsinizaron para medir la fluorescencia media
celular a 580 nm mediante citometría de flujo.
JC-1 es un colorante
fluorescente catiónico (de color verde como monómero; 539 nm) que
se acumula en la mitocondria de manera dependiente de potencial de
membrana. Su acumulación en la mitocondria conduce a la formación
de agregados de fluorescencia roja (agregados-J)
(597 nm). La concentración de monómeros verdes JC-1
en la mitocondria aumenta proporcionalmente al potencial de
membrana y forman agregados-J cuando la
concentración de monómeros verdes alcanza ciertos niveles en
potenciales de membrana que exceden los 240 mV. Así, el potencial
de membrana se puede analizar mediante la determinación de la tasa
de fluorescencia roja vs. la verde, independientemente del
número de mitocondrias medido. Para este fin, las células se
incubaron durante 30 minutos a 37°C en DMEM sin FBS conteniendo 1
\muM de JC-1. Luego, las células se lavaron tres
veces con PBS antes de tripsinizarlas y medir el promedio de las
fluorescencias verdes y rojas mediante citometría de flujo. La
adecuación y efectividad del método potenciométrico
JC-1 se validó con el uso de CCCP (10 \muM).
Las células crecidas en cubreobjetos se fijaron
durante 20 minutos con 3% de paraformaldehido en PBS a pH 7.4,
luego se lavaron tres veces en PBS y se incubaron durante 10
minutos en PBS conteniendo 50 mM de NH_{4}Cl, y luego 10 minutos
más en PBS con 20 mM de glicina. A fin de permeabilizar las
células, éstas se incubaron durante 10 minutos con PBS conteniendo
0.1% de Triton X-100 y 0.05% de desoxicolato sódico,
y luego, de nuevo se lavaron durante 10 minutos con PBS, tres
veces, antes de incubar las células durante 30 minutos con PBS
conteniendo 10% de FBS. Después los cubreobjetos se incubaron con
el anticuerpo primario de COX-I (citocromo oxidasa
I) a 0.5 \mug/ml, diluido en PBS con 10% de FBS durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de tres lavados de 10 minutos con PBS,
los cubreobjetos se incubaron con anticuerpos de secundarios de
cabra conjugados con un fluorocromo (Alexa-Red)
durante 45 minutos. Las células se lavaron tres veces más en PBS
antes de montarlas con mowiol (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH).
Las imágenes confocales se obtuvieron usando un microscopio de
fluorescencia confocal láser Olympus fluoview con un objetivo de 63x
a 1.5x para vistas generales y aumento de 3x para examinar posibles
alteraciones en la distribución perinuclear.
Los datos se muestran como media \pm error
estándar (SE). Las diferencias estadísticamente significativas se
establecieron usando test no pareados de t de Student.
Para comprobar los efectos metabólicos de las
neuregulinas sin alterar la miogénesis, la cual se potencia a
neuregulinas de 30 pM a 3 nM, los miocitos L6E9 se trataron con una
concentración muy baja de neuregulinas, 3 pM, durante 48 horas. A
esta baja concentración, las células tratadas con neuregulinas no
mostraron ningún cambio sobre la formación de los miotubos ni en
los niveles proteicos de marcadores miogénicos como la cadena
pesada de miosina (MHC) y la caveolina-3, o la
expresión de los receptores de neuregulinas, ErbB2 y ErbB3 (cfr.
Fig. 1A, Tabla 1). Sin embargo, al contrario que en tratamientos
crónicos con neuregulinas a 3 nM, los 3 pM de neuregulinas
incrementaron los niveles de GLUT4 mientras que la expresión de
GLUT1 no fue significativamente distinta de los niveles controles
(cfr. Fig. 1A, Tabla 1). El incremento en los niveles totales de
GLUT4 se reflejó en las membranas microsomales de baja densidad
(LDM), mientras que en la membrana plasmática (PM) los niveles de
GLUT4 permanecían inalterados. En consecuencia, no se observaron
cambios en la captación basal de glucosa entre las células control
y tratadas con neuregulinas. (cfr. Fig. 1B). Sin embargo, el
tratamiento con neuregulinas incrementó alrededor de un 80% tanto
la oxidación de glucosa como de palmitato en miocitos L6E9 (cfr.
Fig. 1C y 1D, respectivamente), mientras que disminuyó la producción
de lactato comparado con los niveles controles (cfr. Fig 1E). Bajo
estas circunstancias, la síntesis de glucógeno era similar a los
niveles control (cfr. Fig. 1F).
Con el fin de determinar si el incremento en los
parámetros oxidativos era debido a un incremento en el contenido
mitocondrial de los miocitos L6E9, se midió la abundancia de
diversos marcadores mitocondriales en lisados celulares totales.
Los niveles de porina, una proteína de la membrana mitocondrial
externa, los de citocromo C y los de COX-I
incrementaron tras el tratamiento con neuregulinas (cfr. Fig 2A).
Además, el colorante lipídico de membrana mitocondrial NAO confirmó
el incremento en contenido mitocondrial celular por neuregulinas
(cfr. Fig. 2B). Estudios de inmunofluorescencia confocal usando el
anticuerpo COX-I mostraron que el tratamiento con
neuregulinas no alteraba la arquitectura de la red mitocondrial de
los miocitos L6E9. El incremento en COX-IV inducido
por neuregulinas era superior proporcionalmente al de porina o
citocromo C, sugiriendo que había no sólo un incremento en
contenido mitocondrial global sino también que los complejos de la
fosforilación oxidativa mitocondrial pudieran estar particularmente
enriquecidos. Para analizar esta posibilidad, se analizó la
abundancia de los diferentes complejos de la fosforilación oxidativa
en fracciones mitocondriales de células L6E9 incubadas en ausencia
o presencia de neuregulinas durante 48 horas. Las neuregulinas
incrementaban la abundancia de todos los complejos de la
fosforilación oxidativa en las mitocondrias, mientras que el
contenido de porina y citocromo C por miligramo de proteína
mitocondrial era similar (cfr. Fig. 3A, Tabla 2). Además, la
estimación del potencial de membrana mitocondrial con la tinción de
JC-1 revelaba un incremento en células tratadas con
neuregulinas (cfr. Fig. 3B). En conjunto, las neuregulinas no sólo
incrementan el contenido mitocondrial, sino que también incrementan
su capacidad oxidativa.
Con el propósito de indagar cómo las
neuregulinas inducen la biogénesis mitocondrial, se analizó si
afectaban a la expresión de PGC-1\alpha, ya que se
ha tratado como un regulador clave de este proceso en músculo
esquelético. El tratamiento crónico con neuregulinas incrementó la
expresión de PGC-1\alpha en un 82% (cfr. Fig.
4A). Se probó si las neuregulinas podrían estar involucradas en
este proceso mediando los efectos del calcio. La incubación de
miotubos L6E9 con cafeína inducía la liberación de neuregulinas al
medio y la fosforilación de ErbB3 (cfr. Fig. 4B). Los efectos de la
cafeína sobre la expresión de PGC-1\alpha fueron
totalmente anulados mediante el uso de anticuerpos de bloqueo
contra el dominio de unión de ligando de ErbB3 (cfr. Fig. 4C). El
bloqueo de la liberación de calcio con dantroleno evitó todos los
efectos de la cafeína sobre la liberación de neuregulinas,
fosforilación de ErbB3 y expresión de
PGC-1\alpha, pero fue incapaz de bloquear los
efectos de las neuregulinas añadidas exógenamente estimulando la
expresión de PGC-1\alpha (cfr. Fig. 4B y 4C). Así,
los incrementos en calcio citosólico requieren de la liberación de
neuregulinas y activación de ErbB3 a fin de inducir la expresión de
PGC-1\alpha.
Se probó si el tratamiento crónico con
neuregulinas también incrementaba la sensibilidad a la insulina. La
captación de glucosa se examinó a distintas concentraciones de
insulina en células pre-tratadas o no tratadas con 3
pM de neuregulinas durante 48 horas. Las neuregulinas incrementaron
altamente la sensibilidad a la insulina en casi un orden de
magnitud, pero, a pesar de tener mayores niveles de GLUT4, la
respuesta máxima a insulina no se alteró (cfr. Fig. 5A). El
incremento en sensibilidad a insulina sobre la captación de glucosa
era paralelo a un incremento en la sensibilidad a la insulina sobre
el reclutamiento de GLUT4 a la membrana plasmática (cfr. Fig. 5B).
Para probar si el incremento en sensibilidad a la insulina sobre el
transporte de glucosa era debido a un incremento en los efectores
de la señalización de la insulina, se analizaron la abundancia y la
respuesta de diferentes mediadores de la insulina sobre la
captación de glucosa, como el receptor de la insulina,
IRS-1, la subunidad p85 de PI3K, PKB y
PKC-\zeta a concentraciones submáximas de
insulina (100 nM) en L6E9 pretratadas o no crónicamente con
neuregulinas. Las células tratadas con neuregulinas mostraron un
incremento en la expresión del receptor de la insulina,
IRS-1, la subunidad reguladora p85 de PI3K, PKB y
PKC-\zeta (cfr. Fig. 5C y Tabla 3) y un
incremento en su respuesta a concentraciones submáximas de insulina
(cfr. Fig. 5D). En conclusión, el pretratamiento con neuregulinas
incrementa la sensibilidad a la insulina para inducir la
translocación de GLUT4 y la captación de glucosa, probablemente
debido a un incremento en la abundancia y eficiencia de los
mediadores de la señalización de la insulina en respuesta a
concentraciones submáximas de
insulina.
insulina.
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<110> Universidad de Barcelona
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<120> Compuestos para el tratamiento de
enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina
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<130> Guma-1
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<140>
- - - - - - - -
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<141>
2006-07-14
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<160> 28
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> Human
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> Mouse
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> Rat
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 65
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<212> PRT
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<213> Bovine
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 68
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<212> PRT
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<213> Chicken
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 63
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<212> PRT
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<213> Rabbit
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 63
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<212> PRT
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<213> Hamster
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 71
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<212> PRT
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<213> Xenopus laevis frog
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<210> 9
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<211> 63
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<212> PRT
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<213> Zebrafish
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 65
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<212> PRT
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<213> Human
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 71
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<213> Rat
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<210> 12
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<212> PRT
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<213> Mouse
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<213> Human
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<400> 13
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\hskip0,7cm
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<210> 14
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<211> 67
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<212> PRT
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<213> Mouse
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\hskip0,7cm
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<210> 15
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<211> 65
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<212> PRT
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<213> Human
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<400> 15
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\hskip0,7cm
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<210> 16
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<211> 65
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<212> PRT
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<213> Mouse
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\hskip0,7cm
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<210> 17
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<211> 62
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<212> PRT
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<213> Chicken
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<210> 18
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<211> 208
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<212> PRT
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<213> Human
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<210> 19
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<211> 208
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<212> PRT
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<213> Mouse
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\hskip0,7cm
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<210> 20
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<211> 174
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<212> PRT
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<213> Rat
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<400> 20
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Bovine
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<400> 21
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\hskip0,7cm
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 204
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<212> PRT
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<213> Rabbit
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<400> 22
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hamster
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Xenopus laevis frog
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,5cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 25
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<211> 172
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zebrafish
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<400> 25
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,6cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rat
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mouse
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\hskip0,4cm
Claims (21)
1. Uso de un producto de proteína neuregulina
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento
terapéutico y/o preventivo de un estado y/o enfermedad asociados
con la resistencia a la insulina en un mamífero, incluyendo un
humano, donde el producto de proteína neuregulina actúa como
sensibilizador de la insulina, y donde el estado y/o la enfermedad
se selecciona del grupo que consiste en la diabetes mellitus tipo
2, un síndrome de resistencia severa a la insulina, un estado
caracterizado por resistencia severa a la insulina, la
obesidad, la intolerancia a la glucosa, la dislipidemia y el
síndrome metabólico.
2. Uso según la reivindicación 1, donde la
enfermedad es la diabetes mellitus tipo 2.
3. Uso según la reivindicación 1, donde la
enfermedad es un síndrome de resistencia severa a la insulina, o el
estado está caracterizado por resistencia severa a la
insulina.
4. Uso según la reivindicación 1, donde la
enfermedad es la obesidad.
5. Uso según la reivindicación 1, donde el
estado es la intolerancia a la glucosa.
6. Uso según la reivindicación 1, donde la
enfermedad es la dislipidemia.
7. Uso según la reivindicación 1, donde la
enfermedad es el síndrome metabólico.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde el producto de proteína neuregulina es un
fragmento biológicamente activo de una neuregulina, comprendiendo
dicho fragmento el dominio similar al factor de crecimiento
epidérmico ("epidermal growth factor-like
domain").
9. Uso según la reivindicación 8, donde la
neuregulina se selecciona del grupo que consiste en
neuregulina-1 humana, neuregulina-1
de ratón, neuregulina-1 de rata,
neuregulina-1 bovina, neuregulina-1
de pollo, neuregulina-1 de conejo,
neuregulina-1 de hámster,
neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y
neuregulina-1 de pez cebra.
10. Uso según la reivindicación 9, donde el
fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
1-9.
11. Uso según la reivindicación 8, donde el
fragmento de neuregulina comprende además el dominio similar a
inmunoglobulina ("immunoglobulin-like
domain").
12. Uso según la reivindicación 11, donde la
neuregulina se selecciona del grupo que consiste en
neuregulina-1 humana, neuregulina-1
de ratón, neuregulina-1 de rata,
neuregulina-1 bovina, neuregulina-1
de conejo, neuregulin-1 de hámster,
neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y
neuregulina-1 de pez cebra.
13. Uso según la reivindicación 12, donde el
fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
18-25.
14. Uso según la reivindicación 8, donde la
neuregulina se selecciona del grupo que consiste en:
neuregulina-2 humana, neuregulina-2
de ratón y neuregulina-2, de rata.
15. Uso según la reivindicación 14, donde el
fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
10-12.
16. Uso según la reivindicación 14, donde el
fragmento de neuregulina comprende además el dominio similar a
inmunoglobulina ("immunoglobulin-like
domain").
17. Uso según la reivindicación 14, donde el
fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
26-28.
18. Uso según la reivindicación 8, donde la
neuregulina se selecciona del grupo que consiste en
neuregulina-3 humana y neuregulina-3
de ratón.
19. Uso según la reivindicación 18, donde el
fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
13-14.
20. Uso según la reivindicación 8, donde la
neuregulina se selecciona del grupo que consiste en
neuregulina-4 humana y neuregulina-4
de ratón y neuregulina-4 de pollo.
21. Uso según la reivindicación 20, donde el
fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:
15-17.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601919A ES2315110B1 (es) | 2006-07-14 | 2006-07-14 | Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina. |
| PCT/ES2007/000419 WO2008006922A1 (es) | 2006-07-14 | 2007-07-12 | Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601919A ES2315110B1 (es) | 2006-07-14 | 2006-07-14 | Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2315110A1 true ES2315110A1 (es) | 2009-03-16 |
| ES2315110B1 ES2315110B1 (es) | 2009-12-30 |
Family
ID=38922965
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200601919A Active ES2315110B1 (es) | 2006-07-14 | 2006-07-14 | Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina. |
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|---|---|
| ES (1) | ES2315110B1 (es) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11242370B2 (en) | 2019-04-01 | 2022-02-08 | Eli Lilly And Company | Neuregulin-4 compounds and methods of use |
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|---|---|---|---|---|
| WO2014153385A2 (en) * | 2013-03-21 | 2014-09-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of treating metabolic disorders |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6825333B1 (en) * | 1999-08-20 | 2004-11-30 | Chiron Corporation | EGFH2 genes and gene products |
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- 2006-07-14 ES ES200601919A patent/ES2315110B1/es active Active
-
2007
- 2007-07-12 WO PCT/ES2007/000419 patent/WO2008006922A1/es active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6825333B1 (en) * | 1999-08-20 | 2004-11-30 | Chiron Corporation | EGFH2 genes and gene products |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CANTÓ, C., SUÁREZ, E., LIZCANO, J. M. et al. Neuroregulin signaling on glucose transport in muscle cells. The Journal of Biological Chemistry. Marzo 2004, Vol. 279, Nº 13, páginas 12260-12268. ISSN 0021-9258. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11242370B2 (en) | 2019-04-01 | 2022-02-08 | Eli Lilly And Company | Neuregulin-4 compounds and methods of use |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2315110B1 (es) | 2009-12-30 |
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