WO2008006922A1 - Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina - Google Patents

Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a la insulina Download PDF

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WO2008006922A1 PCT/ES2007/000419 ES2007000419W WO2008006922A1 WO 2008006922 A1 WO2008006922 A1 WO 2008006922A1 ES 2007000419 W ES2007000419 W ES 2007000419W WO 2008006922 A1 WO2008006922 A1 WO 2008006922A1
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neuregulin
insulin
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insulin resistance
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PCT/ES2007/000419
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Anna Maria GUMÀ GARCIA
Carles CANTÓ ÁLVAREZ
Antonio Zorzano Olarte
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Universidad De Barcelona
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • This invention relates to the field of human medicine, and specifically with the treatment of conditions or diseases related to insulin resistance, such as type 2 diabetes, severe insulin resistance, obesity, glucose intolerance , The dyslipidemia and the metabolic syndrome.
  • Insulin resistance has been recognized as a therapeutic problem since the 1930s. However, it was the development of sensitive analyzes for insulin and quantitative methods to estimate the action of insulin, which allowed defining the scope of the problem and its clinical implications Insulin resistance is a change in physiological regulation so that a fixed dose of insulin causes a lesser effect on glucose metabolism than occurs in normal individuals. The normal compensatory response to insulin resistance is an increase in insulin secretion that results in hyperinsulinemia. Over time, the pancreas can no longer supply the body's need for insulin, and excess glucose accumulates in the blood (hyperglycemia). Many people with insulin resistance have high levels of glucose and insulin circulating in their blood at the same time.
  • IGF impaired fasting glucose level
  • ITT impaired glucose tolerance
  • metabolic syndrome Associated with insulin resistance, however, there is a set of other metabolic abnormalities that have to do with the distribution of body fat, lipid metabolism, thrombosis and fibrinolysis, Ia regulation of blood pressure and endothelial function of the cell. This set of abnormalities is called metabolic syndrome. Individuals with metabolic syndrome have an increased risk of developing type 2 diabetes, polycystic ovarian syndrome (PCOS) and / or accelerated atherosclerosis with their cardiovascular complications.
  • PCOS polycystic ovarian syndrome
  • Type 2 diabetes is the most common form of diabetes, representing about 90% of all cases of diabetes.
  • the pathogenesis of type 2 diabetes is characterized by defects in the action of insulin (insulin resistance) in muscle, adipose tissue and liver, as well as a relative failure of pancreatic ⁇ cells to produce sufficient amounts of insulin
  • insulin resistance and insulin deficiency have been shown to have genetic components.
  • Type 2 diabetes appears due to the joint action of multiple genetic and environmental factors.
  • OHAs oral hypoglycemic agents
  • Ia insulin insulin sensitivity
  • insulin-mimetic agents insulin mimetic agents
  • Ia insulin insulin sensitivity
  • insulin-mimetic agents insulin mimetic agents
  • the latter include sulfonylureas (eg tolbutamide, chlorpropamide, tolazamide, glyburide, glipizide and glimepiride) and derivatives of benzoic acid (repaglinide).
  • insulin mimetics are alpha lipoic acid and various compounds such as vanadate or tungstate.
  • Insulin sensitizers help to use glucose more efficiently or make tissue cells more sensitive to insulin, so they require the presence of insulin to work.
  • Examples of insulin sensitizers currently on the market are binaguides (such as metformin) and thiazolidinediones (TZDs) or glitazones (rosiglitazone and pioglitazone).
  • a glitazone, troglitazone (Rezulin ® ) was recalled by its manufacturer in March 2000 due to its potential to cause liver damage. Rosiglitazone and pioglitazone have similar effects on blood sugar but do not appear to have significant harmful effects on the liver.
  • sensitizers of developing insulin are, for example, grommetazone, balaglitazone, rivoglitazone, tesaglitazar and ragaglitazar.
  • the strategy of using insulin sensitizers is especially interesting since most of the conditions characterized by impaired glucose homeostasis are characterized by a poor response to insulin (insulin resistance).
  • Another type of hypoglycemic agents are alpha-glucosidase inhibitors, which act by delaying the absorption of glucose from ingested carbohydrates. Examples of these are acarbose and miglitol.
  • the currently available antidiabetic drugs although, in general, have proven effective and well tolerated - have undesirable side effects.
  • the harmful effects of sulfonylureas include hypoglycemia, gastrointestinal disorders and hypersensitivity reactions.
  • the harmful effects of biguanide include gastrointestinal disorders and lactic acidosis.
  • neuregulins can improve insulin resistance in subjects who have a condition or disease associated with insulin resistance. When insulin resistance is improved, the endogenous action of insulin is enhanced, and then blood glucose levels drop to a normal level. Thus, neuregulins act as insulin sensitizers.
  • insulin resistance will be understood herein according to the technique as described in the state of the art section.
  • insulin sensitizer is an agent that helps to use glucose more efficiently or to make tissue cells more sensitive to insulin, that is, an agent that restores the impaired function of a blood receptor. The insulin to the original state and thus improves the resistance to insulin.
  • the insulin sensitizer can also be called “agent that improves insulin resistance” (“insulin resistance-improving agent").
  • the invention relates to the use of a neuregulin protein product for the manufacture of a medicament for the therapeutic and / or preventive treatment of a condition and / or disease associated with insulin resistance in a mammal, including a human , where the neuregulin protein product acts as an insulin sensitizer, and where the condition and / or disease is selected from the group consisting of: type 2 diabetes mellitus, a syndrome of severe insulin resistance, a state characterized by severe resistance to insulin, obesity, glucose intolerance, dyslipidemia and metabolic syndrome.
  • the invention relates to a method for the therapeutic and / or preventive treatment of a condition and / or disease associated with insulin resistance in a mammal, where the condition and / or the disease is as described above, which it comprises administration to a mammal (particularly a human) that needs an effective amount of a Neuregulin protein product, said neuregulin protein product acting as insulin sensitizer.
  • the inventors have found that treatment with neuregulin enhances insulin sensitivity, increases insulin receptor expression and increases oxidative capacity. An increase in mitochondrial biogenesis and an increase in oxidative complexes and mitochondrial potential of the membrane is observed.
  • Neuregulins are cell-cell signaling proteins that are ligands for the tyrosine kinase receptors of the ErbB receptor family.
  • the neuregulin family of genes has four members: NRG1, NRG2, NRG3 and NRG4.
  • the human NRG1 gene (Genbank accession number BK000383) is almost 1.4 megabases long. Less than 0.3% of this length encodes the protein. As a result of a rich alternative splicing and multiple promoters, at least 15 different NRG isophomas of the same NRG1 gene are produced.
  • EGF epidermal growth factor
  • epidemial growth factor growth factor epidermal
  • the sequence N- terminal (type I, II, or III), and if the isoform is initially synthesized as a transmembrane or non-membrane protein.
  • NRG neuron-derived factor
  • neuregulin protein product refers to the naturally occurring or recombinant neuregulin protein; to natural, synthetic, or recombinant biologically active polypeptide fragments of neuregulin protein; to biologically active polypeptide variants of neuregulin protein or fragments thereof, including hybrid fusion proteins or dimers; or to biologically active polypeptide analogs of neuregulin protein or fragments or variants thereof.
  • Analogs include, but are not limited to, neuregulin protein products where one or more amino acid residues have been replaced by a different amino acid. Conservative amino acid substitutions are preferred.
  • Neuregulin protein products suitable for the invention include protein products derived from the NGR1, NRG2, NRG3 and NRG4 genes. They are proteins that bind to the ErbB2, ErbB3 and ErbB4 receptors. ErbB1 does not bind neuregulins. Examples of neuregulin protein products suitable for the invention are described in WO 99/02681, WO 92/18627, WO 94/00140, WO 94/04560, WO 94/26298 and WO 95/32724.
  • Biologically active fragments of neuregulin include biologically active molecules that have an equal amino acid sequence or similar to that of a natural human neuregulin protein.
  • a biologically active fragment of neuregulin preferred for the invention is the amino acid sequence corresponding to the EGF-like domain ("EGF-like domain").
  • Another preferred biologically active fragment of neuregulin is the amino acid sequence comprising the Ig-like domain and the EGF-like domain.
  • the fragment is of neuregulin-1 (also known simply as "neuregulin"), neuregulin-2, neuregulin-3 and neuregulin-4, all of which may be of different origin.
  • the fragment comprising the EGF-like domain is selected from human neuregulin-1, mouse neuregulin-1, rat neuregulin-1, bovine neuregulin-1, chicken neuregulin-1, rabbit neuregulin-1, neuregulin- 1 hamster, neuregulin-1 frog Xenopus laevis and neuregulin-1 zebrafish; human neuregulin-2, mouse neuregulin-2 and rat neuregulin-2; human neuregulin-3 and mouse neuregulin-3; and human neuregulin-4, mouse neuregulin-4 and chicken neuregulin-4. Specific sequences for these fragments are those described here as SEQ ID NO: 1-17.
  • the neuregulin fragment further comprises the Ig-like domain and is selected from human neuregulin-1, mouse neuregulin-1, rat neuregulin-1, bovine neuregulin-1, rabbit neuregulin-1, neuregulin-1 of hamster, neuregulin-1 from frog Xenopus laevis and neuregulin-1 from zebrafish; and human neuregulin-2, mouse neuregulin-2 and rat neuregulin-2. Specific sequences for these fragments are those described here as SEQ ID NO: 18-28.
  • the neuregulin protein product is a polypeptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 (heregulin- ⁇ 1 (amino acids 177-244)).
  • neuregulin product is a recombinant DNA product, expressed through E.coli, used for moderate and severe cardiac arrest (Zensun, Shanghai).
  • Another product on the market but only for research use is a human recombinant heregulin-b1 / neuroregulin-1 ( neu differentiation) produced in E.Coli. It is a single, non-glycosylated polypeptide chain, containing 61 amino acids, comprising the EGF-like domain, and has a total molecular mass of 7055 Dalton (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd).
  • neuregulin protein product also includes a nucleic acid sequence that encodes a neuregulin protein, or a functional fragment thereof.
  • the isolated nucleic acid sequence encoding the neuregulin, or the fragment thereof, can also be used for gene therapy in vivo or ex vivo.
  • the neuregulin protein products of the invention can be generated and / or isolated with any means known in the art.
  • a suitable method for producing a neuregulin protein product is to transform a host cell ("host") with the nucleic acid encoding the desired neuregulin protein product, culturing the transformed host cell and collecting the neuregulin produced from the host cell culture.
  • the clinical symptoms of the conditions or diseases related to the invention are known to be associated in some way with insulin resistance.
  • states or diseases associated with insulin resistance are glucose intolerance, severe insulin resistance, type 2 diabetes, obesity and metabolic syndrome.
  • Other states that are associated with insulin resistance include hyperinsulinemia, hyperglycemia, polycystic ovarian syndrome, steroid-induced insulin resistance, gestational diabetes, dyslipidemia, arterial hypertension and cardiovascular disease, especially atherosclerosis .
  • the invention is also applicable when insulin resistance is present in aging and in states of low exercise capacity.
  • the neuregulin protein product as an insulin sensitizer can be used to improve exercise capacity.
  • condition or disease is selected from glucose intolerance, type 2 diabetes mellitus, obesity, metabolic syndrome, a syndrome of severe resistance to Ia insulin, a state characterized by severe resistance to insulin or dyslipidemia. It is within the general knowledge of the expert to identify if, for example, a person has one of the diseases related to the invention. Reference is made eg to the National Library of Medicine, USA (NLM) web page: http://www.nlm.nih.gov, where details of these diseases are described.
  • NLM National Library of Medicine, USA
  • Glucose intolerance is a state very associated with type 2 diabetes. As explained above, doctors sometimes refer to this state as an altered fasting glucose level (IFG) or impaired glucose tolerance (IGT) , depending on the test used to diagnose it. Blood sugar levels are high, but not high enough to justify a diagnosis of diabetes. The body still produces insulin, but in insufficient amounts to effectively control blood sugar levels. Glucose intolerance is often considered an early warning signal for type 2 diabetes: one to ten percent of people with glucose intolerance develop type 2 diabetes every year. The causes of glucose intolerance are similar to those identified for true diabetes.
  • IGF altered fasting glucose level
  • ITT impaired glucose tolerance
  • Type 2 diabetes is defined as the form of diabetes that develops when the body does not respond properly to insulin, as opposed to type 1 diabetes, in which the pancreas produces almost no insulin.
  • Type 2 diabetes mellitus results from a defect in the secretion of insulin and a weakening of the action of insulin in peripheral tissues, especially in muscle tissue and adipocytes. At first, the pancreas faces the added demand producing more insulin. Over time, however, it loses the ability to secrete enough insulin in response to meals.
  • a defect in the post-receptor is also present, causing resistance to the stimulant effect of insulin on glucose uptake, and a deficiency not dependent on insulin develops, unlike the absolute deficiency found in patients with type 1 diabetes
  • the specific etiological factors are not known, but the genetic factors are much stronger in type 2 than in type 1.
  • Metabolic syndrome is described as a collection of factors that increase the risk of developing heart disease, cardiac arrest and diabetes.
  • the syndrome is very associated with the generalized metabolic disorder called insulin resistance. This is the reason why the metabolic syndrome is also known as “insulin resistance syndrome", and also as “syndrome X” and “dismetabolic syndrome”.
  • Risk factors include obesity, insulin resistance, impaired glucose tolerance, hyperinsulinemia (high levels of insulin in the blood), hypertension (high blood pressure), dyslipidemia (abnormal triglyceride and HDL levels -cholesterol in blood) and the pro-inflammatory state.
  • Severe insulin resistance is a pathological state characterized by extreme insulin resistance.
  • Obesity is a state characterized by a weight greater than what is generally considered healthy for a given height. Obesity can cause many health problems due to tension on organs and joints. It increases the risk of some extended and potentially fatal disorders such as diabetes, high blood pressure, dyslipidemia, osteoarthritis, sleep apnea and respiratory problems, some cancers (endometrial, breast, and colon), disease of the coronary artery and cardiac arrest. It can also lead to psychological problems such as depression.
  • body mass index body mass index
  • the neuregulin protein product can be administered to a mammal (particularly a human) for the therapeutic and / or preventive treatment of a condition and / or a disease associated with insulin resistance.
  • the purpose of the administration of neuregulin protein product can be preventive (to prevent the development of these diseases) and / or therapeutic (to treat these diseases once they have been developed / established).
  • the neuregulin protein product is administered in a pharmaceutically acceptable form.
  • the dose must be an effective amount of neuregulin protein product in the sense that insulin resistance improves in the treated subject. Suitable analyzes are known to test the improvement in insulin resistance.
  • single doses suitable for other insulin sensitizers include 100 to 800 mg of troglitazone and 5 to 50 mg of pioglitazone.
  • the neuregulin protein product of the invention can be administered alone or in a composition with pharmaceutically acceptable carriers or excipients.
  • the compositions are generally adapted for oral administration. However, they can be adapted to other modes of administration, for example, parenteral, sublingual or transdermal administration.
  • the compositions may be in the form of pills, capsules, powders, granules, suppositories, reconstitutable powders or liquid preparations. Modified release compositions may be delayed, pulsed or sustained release compositions.
  • the compositions can be administered parenterally by bolus injection or by gradual release over a certain period of time. Since the objective is the normalization of the glucose level, this offers the possibility of, for example, administering the composition as depot.
  • compositions may comprise a neuregulin protein product or more than one combination neuregulin protein product.
  • compositions may comprise the neuregulin protein product as the sole insulin sensitizing agent, combinations of these agents or combinations with other therapeutic agents depending on the disease (other classes of oral hypoglycemic agents or other classes of drugs).
  • FIG. 1 shows how chronic incubation of L6E9 cells with neuregulins increases oxidative metabolism.
  • FIG. 2 shows how the chronic incubation of L6E9 cells with neuregulins increases the cellular mitochondrial mass.
  • FIG. 3 shows how the chronic incubation of L6E9 cells with neuregulins increases the abundance of oxidative complexes and the potential of the mitochondrial membrane.
  • FIG. 4 shows how neuregulins increase PGC-1 ⁇ levels and mediate the calcium-induced expression of PGC-1 ⁇ .
  • FIG. 5 shows how chronic treatment with neuregulin increases insulin sensitivity.
  • FIG. 6 shows how the chronic incubation of myocytes L6E9 with palmitic acid causes insulin resistance.
  • FIG. 7 shows how NRGs improve the metabolic profile of L6E9 myocytes treated with palmitic acid.
  • FIG. 8 shows how NRGs reverse the decrease in mitochondrial protein expression induced by palmitic acid treatment.
  • FIG. 9 shows how NRGs improve the situation of insulin resistance induced by palmitate treatment.
  • FIG. 10 shows how NRGs prevent the accumulation of GAD in response to palmitate treatment.
  • FIG. 11 shows how NRGs prevent insulin resistance induced by palmitate.
  • FIG. 1 shows results in which L6E9 cells were incubated in the presence or absence of 3 pM of neuregulins, before performing the following tests: FIG. 1A, immunoblot assays (Western blot) were performed with 10 ⁇ g (for the analysis of the MHC protein levels or the ⁇ 1 subunit of Ia (Na + / K + ) ATPase), 30 ⁇ g (for GLUT4 or GLUT1) or 40 ⁇ g (for ErbB2 or ErbB3) of used total cell protein.
  • FIG. 1A immunoblot assays (Western blot) were performed with 10 ⁇ g (for the analysis of the MHC protein levels or the ⁇ 1 subunit of Ia (Na + / K + ) ATPase), 30 ⁇ g (for GLUT4 or GLUT1) or 40 ⁇ g (for ErbB2 or ErbB3) of used total cell protein.
  • FIG. 1 B transport of 2- [ 3 H] -deoxiglucose (DU) in nmoles / mg of protein x 10 min.
  • FIG. 1C oxidation of glucose (GO) in nmoles / mg of protein per hour.
  • FIG. 1 D palmitate (PO) oxidation in nmoles / mg protein x hour.
  • FIG. 1 B transport of 2- [ 3 H] -deoxiglucose (DU) in nmoles / mg of protein x 10 min.
  • FIG. 1C oxidation of glucose (GO) in nmoles / mg of protein per hour.
  • FIG. 1 D palmitate (PO) oxidation in nmoles / mg protein x hour.
  • FIG. 1 E lactate release (LR) in ⁇ moles / mg protein x hour.
  • FIG. 1 F 1 glycogen synthesis in nmoles / mg protein x hour. The results are the mean ⁇ SE of 3-12 different experiments. * indicates significant statistical differences between control groups (C) and treated with neuregulin (Hrg) at P ⁇ 0.01.
  • FIG. 2 shows results in which L6E9 cells were incubated in the presence or absence of 3 pM neuregulins, for 48 hours before carrying out the following tests:
  • FIG. 2A 20 ⁇ g of total used cell phones were used for the detection of the protein content of porin, cytochrome C and COX-IV by western blot analysis. Representative images and densitometric quantifications of 5 experiments, expressed as mean values ⁇ SE, are shown.
  • IR means increase relative to baseline, in relative arbitrary units. * indicates statistically significant differences between the control group (C) and the group treated with neuregulin (Hrg) at P ⁇ 0.05.
  • FIG. 2B shows results in which the mitochondrial mass!
  • FIG. 3 shows results in which L6E9 cells were incubated in the presence (Hrg) or absence (C) of neuregulins for 48 hours before carrying out the following tests:
  • the images shown are representative of three experiments.
  • FIG. 3A the mitochondrial fractions of L6E9 cells were obtained as described in the methods, then 20 ⁇ g of protein were used for western blot assays in order to analyze the abundance of the different oxidative phosphorylation complexes
  • MMP relative mitochondrial membrane potential
  • FIG. 4A shows results in which 120 ⁇ g of total used L6E9 cells incubated in the presence (Hrg) or absence (C) of 3 pM neuregulins, were used for the detection by westem-blot of PGC-1 ⁇ .
  • the image shown is representative of nine experiments and the densitometric quantifications, shown below, are expressed as an increase relative to baseline, IR (in relative arbitrary units) as the mean ⁇ SE. * indicates significant statistical differences between the control group and the one treated with neuregulins at P ⁇ 0.01.
  • the FlG. 5 shows results in which L6E9 cells were incubated in the presence (Hrg) or absence (C) of 3 pM neuregulins, for 48 hours before carrying out the following tests: in FIG. 5A, the results of glucose uptake tests in dose-response to insulin are shown. DU means an increase in the uptake of 2- [ 3 H] -deoxiglucose over the baseline, in nmoles / mg of protein x 10 min. The result shown is the mean ⁇ SE of four experiments. * indicates significant statistical differences between the control group (black triangles, solid line) and the group treated with neuregulins (black circles, dashed line) at P ⁇ 0.01. FIG.
  • FIG. 5B shows results in which 10 ⁇ g of raw plasma membranes (PM) were used for the western blot assays, obtained as described in the methods section. The image shown is representative of three experiments.
  • FIG. 5C shows results in which 40 ⁇ g of total used cell phones were used for western blot assays to analyze the abundance of the insulin receptor (InsR), IRS-1, the p85 regulatory subunit of the PI3K, PKB and PKC- ⁇ . The images shown are representative of 3 experiments.
  • FIG. 5D shows results in which the response of different effectors of the insulin signaling pathway after 5 minutes (InsR) or 15 minutes (the rest) of treatment at submaximal insulin concentrations (100 nM) was examined.
  • FIG. 6 shows how the chronic incubation of myocytes L6E9 with palmitic acid causes insulin resistance.
  • the L6E9 myocytes were incubated with oleic acid (Ole, 0.4 mM) or palmitic acid (Palm, 0.15 mM) for 72 hours from the beginning of the differentiation.
  • Ole oleic acid
  • Palm palmitic acid
  • FIG. 6A 2-deoxyglucose transport assays were performed at different insulin concentrations. The results, expressed as absolute increase with respect to baseline, are shown as mean ⁇ S. E. of 4 independent experiments, "mg mus" means mg of muscle. * indicates statistical differences vs. control (-) at similar insulin concentrations, P ⁇ 0.05.
  • Triacylglycerols (TAG) content was measured in total homogenates using a commercial kit, "mg prot” means mg of protein. The results are shown as the mean ⁇ S. E of 4 to 6 independent experiments. * Indicates significant statistical differences vs. The basal levels with P ⁇ 0.05.
  • FIG. 7 shows how NRGs improve the metabolic profile of L6E9 myocytes treated with palmitic acid.
  • the L6E9 myocytes were cultured and subjected to different treatments.
  • the triglyceride content (“Trig c") (FIG. 7A)
  • the oxidation of glucose (Gluc ox)
  • the oxidation of palmitate (Palm ox)
  • FIG. 8 shows how NRGs reverse the decrease in mitochondrial protein expression induced by palmitic acid treatment.
  • Treatment with palmitic acid conjugated with BSA (0.15 mM) was started at the beginning of differentiation (unconjugated BSA was used as a control).
  • palmitic acid Hrg (3pM) was added and then total homogenates were obtained.
  • Protein levels of the different markers and subunits of the respiratory complexes were analyzed by westem-blot. Densitometric quantifications are expressed as the mean ⁇ S. E of 3 to 4 independent experiments.
  • "ReI. Prot. L.” means relative levels of protein. * indicates significant statistical differences vs. the controls, treated with BSA (dashed line), with P ⁇ 0.05.
  • FIG. 9 shows how NRGs improve the situation of insulin resistance induced by palmitate treatment.
  • FIG. 9A Transport tests of 2-deoxyglucose in response to insulin (Ins, 1 ⁇ M) were carried out in L6E9, 24 hours after the start of differentiation, in the presence or absence of palmitate (Palm, 0.15 mM) . The results are expressed as the mean ⁇ S. E. of 3 independent experiments.
  • FIG. 9B L6E9 myocytes were incubated with palmitic acid (Palm 0.15 mM) for 72 hours at the beginning of the differentiation and Hrg (3 pM) was added during the last 48 hours. Next, transport tests of 2-deoxyglucose were carried out at different insulin concentrations.
  • FIG. 9D L6E9 myocytes were incubated with palmitic acid (Palm, 0.15 mM) for 72 hours from the start of differentiation and Hrg (3 pM) was added during the last 48 hours. The effect of an acute incubation with Hrg (3 nM) on the transport of 2-deoxyglucose was then measured. The results are shown as the mean ⁇ S. E. of 4 independent experiments. * indicates statistical differences vs. the control group corresponding to P ⁇ 0.05.
  • FIG. 10 shows how NRGs prevent the accumulation of GAD in response to palmitate treatment.
  • L6E9 myocytes differentiated for 72 hours in the presence or absence of Hrg 3 pM during the last 48 hours were subjected to a 16-hour treatment with palmitic acid conjugated to BSA (0.15 mM).
  • BSA palmitic acid conjugated to BSA
  • TAG c triacylglycerols
  • FIG. 11 shows how NRGs prevent insulin resistance induced by palmitate.
  • L6E9 myocytes differentiated for 72 hours in the presence or absence of Hrg 3 pM during the last 48 hours of differentiation. They were subjected to a treatment of palmitic acid conjugated with BSA (0.15 mM) for 16 hours. As a control, unconjugated BSA was used.
  • FIG. 11A 2-deoxyglucose transport assays were carried out in basal conditions as well as in exposure to submaximal (100 nM) or maximum (1 ⁇ M) insulin (Ins) concentrations for 30 minutes. The results are shown as the mean ⁇ S. E. of 4 independent experiments. * indicates significant statistical differences vs. the respective control myocytes, not treated.
  • the rat skeletal muscle cell line, L6E9 was kindly provided by Dr. B. Nadal-Ginard (Harvard University, Boston, MA). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glutamine and antibiotics were obtained from BioWhittaker (Walkersville, MD) 1 and fetal bovine serum ("Fetal Bovine Serum", FBS) was obtained from Gibco (Invitrogen LTD.) Swine insulin Purified was a donation from EIi Lilly Co. (Indianapolis, IN). Recombinant neuregulin, heregulin- ⁇ 1- (177-244) (Hrg) was a donation from Genentech, Inc. (South San Francisco, CA).
  • Polyclonal anti-PGC-1o antibodies (K-15), anti-ErbB2 (C-18) and anti-ErbB3 (C-17) were obtained from Santa Cruz Inc. (Santa Cruz, CA.) - Anti-myosin heavy chain monoclonal antibodies (MF- 20) and anti-subunit ⁇ i of Ia (Na + / K + ) ATPase ( ⁇ 6F) were obtained from Developmental Studies Hybridoma Bank, which is under the auspices of NICHD and maintained by the University of lowa, Department of Biological Sciences (lowa City , IA). Polyclonal antibodies anti-PKB, anti-phospho-Ser 473 -PKB and anti-phospho-
  • Thr 410 -PKC- ⁇ were obtained from CeII Signaling (Danvers, MA).
  • P3K polyclonal anti-subunit antibodies of PI3K were obtained from Upstate Biotechnology Inc. (Charlottesville, VA).
  • the polyclonal antibody OSCRX (against the 15 C-terminal amino acid residues of GLUT4) was produced in our laboratory.
  • the polyclonal anti-GLUT1 antibody was obtained from Abcam (Cambridge, UK).
  • the anti-porin monoclonal antibody was obtained from Calbiochem (La JoIIa, CA).
  • the anti-cytochrome C monoclonal antibody was obtained from PharMingen (San Jose, CA).
  • the probes of NAO (nonyl acridine orange) and JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1, 1 ⁇ 3,1'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) as well as monoclonal antibodies against different subunits of the Oxidative phosphorylation complexes were obtained from Molecular Probes (Eugene, OR).
  • Bradford reagent and all electrophoresis materials and molecular weight markers were obtained from Bio-Rad (Hercules, CA).
  • the BCA protein analysis reagent kit was obtained from Pierce (Rockford, IL).
  • Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) was obtained from Millipore Corp.
  • ECL reagents 2-deoxy-D- [ 3 H] -glucose, D- [U- 14 C] -glucose and [U- 14 C] -palmitic acid were obtained from Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). All the chemicals used were of the highest purity available.
  • the L6E9 myotubes fasted serum for 4 hours before adding any treatment.
  • Dantrolene (10 ⁇ M) and anti-ErbB3 / Ab5 antibody (10 ⁇ g / ml) were added 30 minutes before caffeine (5 mM) and neuregulin (3 pM) treatments, which lasted 3 hours.
  • the cells were processed or left with 2% FBS medium (and anti-ErbB3 / Ab5 or dantrolene where appropriate) for an additional 15 hours in order to analyze the PGC-1 ⁇ protein levels.
  • the L6E9 myocytes also fasted serum for 4 hours before starting insulin treatments, which lasted 30 minutes.
  • Preparations of cell fractions enriched in mitochondria were obtained by mechanical homogenization of the L6E9 myocytes with a specific homogenization buffer (0.25 M sucrose, 1 mM EGTA, 10 mM Hepes pH 7.4 and protease inhibitors added just before the assay: 0.2 mM PMSF , 1 ⁇ M leupeptin, 1 ⁇ M pepstatin and 1 U / ml aprotinin), and by using a glass homogenizer and a motor plunger. The homogenate was centrifuged at 4500 rpm for 10 minutes at 4 0 C. The pellet was resuspended with homogenization buffer and centrifuged again in a similar manner. The resulting pellet is the fraction enriched in mitochondria. Crude plasma membranes (PM) and low density microsomal membranes (LDM) were obtained as previously described (Suárez et al., 2001)
  • the immunoprecipitation tests of the insulin receptor, the p85 subunit of the phosphatidylinositos 3-kinase (PI3K) and PKC- ⁇ were carried out as and as already described (see above Cantó et al., 2004).
  • Protein samples containing Laemmli Sample Buffer (LSB) were electrophoresed in sodium polyacrylamide dodecyl sulfate gels (SDS-PAGE), transferred to PVDF membranes and immunoblot was performed as described (see above, Suarez et al., 2001).
  • the proteins were finally detected with the ECL method, and the signal quantified by densitometric scanning.
  • the 2-deoxiglucose uptake assays were performed as described previously (see above, Suárez et al. 2001). Glucose or palmitate oxidation was quantified in cells incubated in Hank's balanced salt medium (in the presence of FBS, 2%) containing 5 mM D-glucose and 0.32 ⁇ Ci of D- [U- 14 C] -glucose (306 mCi / mmol), for glucose oxidation tests, or 0.1 mM palmitate with 0.1 ⁇ Ci of [U- 14 C] -palmitic acid, (60 mCi / mmol) for palmitate oxidation tests.
  • the L6E9 myocytes incubated in the absence or presence of 3 pM of neuregulin for 48 hours, incubated at 37 0 C for 30 minutes with free medium containing FBS 100 ng / ml of the probe NAO.
  • NAO is a metachromatic dye that specifically binds to cardiolipin, a lipid of the internal mitochondrial membrane, regardless of the state energetic. After incubation, the cells were washed three times with PBS and finally trypsinized to measure the average cell fluorescence at 580 nm by flow cytometry.
  • JC-1 is a cationic fluorescent dye (green as a monomer; 539 nm) that accumulates in the mitochondria in a manner dependent on membrane potential. Its accumulation in the mitochondria leads to the formation of aggregates of red fluorescence (J-aggregates) (597 nm).
  • J-aggregates red fluorescence
  • the concentration of JC-1 green monomers in the mitochondria increases proportionally to the membrane potential and forms J-aggregates when the concentration of green monomers reaches certain levels in membrane potentials exceeding 240 mV.
  • the membrane potential can be analyzed by determining the rate of red fluorescence vs. Ia green, regardless of the number of mitochondria measured. For this purpose, the cells were incubated for 30 minutes at 37 0 C in DMEM without FBS containing 1 uM JC-1.
  • Cells grown on coverslips were fixed for 20 minutes with 3% paraformaldehyde in PBS at pH 7.4, then washed three times in PBS and incubated for 10 minutes in PBS containing 50 mM NH 4 CI, and then 10 more minutes in PBS with 20 mM glycine. In order to permeabilize the cells, they were incubated for 10 minutes with PBS containing 0.1% Triton X-100 and 0.05% sodium deoxycholate, and then again washed for 10 minutes with PBS, three times, before incubating the cells. cells for 30 minutes with PBS containing 10% FBS.
  • the coverslips were then incubated with the primary COX-I antibody (cytochrome oxidase I) at 0.5 ⁇ g / ml, diluted in PBS with 10% FBS for 1 hour at room temperature. After three 10-minute washes with PBS, the coverslips were incubated with goat secondary antibodies conjugated with a fluorochrome (Alexa-Red) for 45 minutes. The cells they were washed three more times in PBS before mounting with mowiol (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH). The confocal images were obtained using an Olympus fluoview laser confocal fluorescence microscope with an objective of 63x to 1.5x for general views and 3x magnification to examine possible alterations in the perinuclear distribution.
  • the primary COX-I antibody cytochrome oxidase I
  • L6E9 myocytes were treated with a very low concentration of neuregulins, 3 pM, for 48 hours. At this low concentration, the cells treated with neuregulins did not show any change on the formation of the myotubes or on the protein levels of myogenic markers such as the myosin heavy chain (MHC) and the caveolin-3, or the expression of the receptors of Neuregulins, ErbB2 and ErbB3 (cf. FIG. 1A, TABLE 1).
  • MHC myosin heavy chain
  • the abundance and response of different insulin mediators on glucose uptake were analyzed, such as the insulin receptor, IRS-1, the p85 subunit of PI3K, PKB and PKC- ⁇ at submaximal insulin concentrations (100 nM) in L6E9 pretreated or not chronically with neuregulins.
  • Cells treated with neuregulins showed an increase in the expression of the insulin receptor, IRS-1, the regulatory subunit p85 of PI3K, PKB and PKC- ⁇ (cf. FIG. 5C and TABLE 3) and an increase in their response to submaximal insulin concentrations (cf. FIG. 5D).
  • pretreatment with neuregulins increases insulin sensitivity to induce translocation of GLUT4 and glucose uptake, probably due to an increase in Ia abundance and efficiency of the mediators of insulin signaling in response to submaximal insulin concentrations.
  • the next objective was to verify the effect of NRGs in the context of insulin resistance.
  • the effect of NRGs in two different circumstances was evaluated: (1) the effect of NRGs on insulin-resistant L6E9 myocytes and (2) the effect of NRGs on the prevention of insulin resistance states.
  • FFAs free fatty acids
  • the fatty acids were added to the medium at the beginning of the differentiation and the action of insulin on glucose transport was measured after 72 hours.
  • the results obtained showed that chronic incubation with 0.4 mM oleic acid did not induce significant insulin resistance despite greatly increasing the intracellular content of triacylglycerol (GAD), indicating that, effectively, oleic acid was being incorporated into myocyte.
  • GAD triacylglycerol
  • NRGs improve the metabolic profile of cells treated with oalmitate
  • NRGs improve insulin resistance induced by palmitate
  • palmitate treatment severely affected the action of insulin on glucose transport. This effect was already detectable after 24 hours of palmitate treatment, prior to the addition of NRGs (cf. FIG. 9A) and was maintained after 72 hours of incubation, at maximum and submaximal insulin concentrations.
  • NRGs are added to the medium during the last 48 hours of palmitate treatment, the action of insulin on glucose transport was recovered to control levels, both at maximum and submaximal insulin concentrations (cf. FIG. 9B).
  • Hrg did not increase insulin sensitivity above control levels. This may be due to the fact that the action of NRGs begins when a state of insulin resistance is already occurring.
  • NRGs prevent insulin resistance induced by palmitate in L6E9 myocytes
  • L6E9 myocytes were differentiated for 72 hours in the presence or absence of 3 pM of NRGs during the last 48 hours. They were then exposed to a palmitate treatment (0.15 mM) for 16 hours.
  • Several studies in the literature have highlighted how a lipid infusion can lead to insulin resistance in very short periods of action. Since exercise is one of the best therapeutic agents for the prevention of insulin resistance, the current hypothesis is that a greater capacity to metabolize FFA induced by NRGs could prevent the interference of said FFA on the action of insulin.
  • NRGs can improve and prevent the negative effects of palmitate on the stimulation of glucose transport by insulin.

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Abstract

Uso de un producto de proteína neuregulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o preventivo de un estado o enfermedad asociados con la resistencia a la insulina en un mamífero, incluyendo un humano, donde el producto de proteína neuregulina actúa como sensibilizador de la insulina, y donde el estado o la enfermedad se selecciona entre la diabetes mellitus tipo 2, un síndrome de resistencia severa a la insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a la insulina, la obesidad, la intolerancia a la glucosa, la dislipidemia y el síndrome metabólico.

Description

Compuestos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la resistencia a Ia insulina
Esta invención se refiere al campo de Ia medicina humana, y específicamente con el tratamiento de estados o enfermedades relacionados con Ia resistencia a Ia insulina, como Ia diabetes de tipo 2, Ia resistencia severa a Ia insulina, Ia obesidad, Ia intolerancia a Ia glucosa, Ia dislipidemia y el síndrome metabólico.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La resistencia a Ia insulina ha sido reconocida como un problema terapéutico desde los años 30. Sin embargo, fue el desarrollo de análisis sensibles para Ia insulina y de métodos cuantitativos para estimar Ia acción de Ia insulina Io que permitió definir el alcance del problema y sus implicaciones clínicas. La resistencia a Ia insulina es un cambio en Ia regulación fisiológica de modo que una dosis fija de insulina causa un efecto menor sobre el metabolismo de Ia glucosa del que ocurre en individuos normales. La respuesta compensatoria normal a Ia resistencia a Ia insulina es un aumento en Ia secreción de Ia insulina que resulta en hiperinsulinemia. Con el tiempo, el páncreas no puede seguir abasteciendo Ia necesidad del cuerpo de insulina, y se acumula un exceso de Ia glucosa en sangre (hiperglicemia). Mucha gente con resistencia a Ia insulina tiene altos niveles de glucosa y de insulina circulando en su sangre al mismo tiempo. Los niveles de glucosa en sangre permanecen elevados y el cuerpo responde produciendo más insulina, provocando todavía más intolerancia en respuesta a los niveles elevados de insulina en Ia sangre. Las personas con niveles de glucosa en sangre más altos que los normales pero no todavía en el intervalo diabético tienen "pre- diabetes". A veces los médicos se refieren a este estado como nivel alterado de Ia glucosa en ayuno ("impaired fasting glucose", IFG) o tolerancia alterada a Ia glucosa ("impaired glucose tolerance", IGT), dependiendo de Ia prueba usada para diagnosticarla. La diabetes del tipo 2 aparece cuando el páncreas ya no puede mantener este nivel de producción de insulina.
Asociado con Ia resistencia a Ia insulina, sin embargo, hay un conjunto de otras anormalidades metabólicas que tienen que ver con Ia distribución de las grasas del cuerpo, el metabolismo de lípidos, Ia trombosis y Ia fibrinólisis, Ia regulación de Ia presión sanguínea y Ia función endotelial de Ia célula. A este conjunto de anormalidades se Ie llama síndrome metabólico. Los individuos con el síndrome metabólico tienen un mayor riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2, síndrome ovárico policístico ("polycystic ovarían syndrome", PCOS) y/o aterosclerosis acelerada con sus complicaciones cardiovasculares.
La diabetes de tipo 2 es Ia forma más común de diabetes, representando cerca del 90% de todos los casos de diabetes. La patogénesis de Ia diabetes de tipo 2 se caracteriza por defectos en Ia acción de Ia insulina (resistencia a Ia insulina) en el músculo, el tejido adiposo y el hígado, así como por un fallo relativo de las células β pancreáticas en producir suficientes cantidades de insulina. Tanto Ia resistencia a Ia insulina como Ia deficiencia de insulina han mostrado tener componentes genéticos. La diabetes de tipo 2 aparece por Ia acción conjunta de múltiples factores genéticos y ambientales.
Bajo condiciones de abundancia alimenticia, una gran fracción de Ia población acumula reservas excesivas de lípidos. La obesidad está aumentando por encima del 30% de Ia población en sociedades occidentales. La naturaleza hereditaria de Ia obesidad se ha demostrado con estudios de familias, y estudios de gemelos y de adopción han demostrado que el patrón familial se debe sobre todo a factores genéticos. Sin embargo, Ia obesidad se asocia mucho con Ia resistencia a Ia insulina y constituye el factor de riesgo principal para el desarrollo del Ia diabetes no dependiente de insulina o diabetes mellitus de tipo 2. Las terapias existentes para Ia obesidad están dirigidas a Ia administración de inhibidores de depósitos de grasas o de estimuladores de Ia termogénesis del tejido adiposo o lipolisis. Otras terapias se han centrado en intentar encontrar las señales que transmiten Ia información sobre el tamaño de Ia masa de tejido adiposo al cerebro. De todas formas, hasta ahora, Ia terapia de Ia obesidad no es totalmente satisfactoria, y se requieren agentes terapéuticos nuevos.
La clave para luchar contra Ia diabetes está en supervisar y controlar los niveles de azúcar en sangre. Además de Ia dieta y el ejercicio, las terapias actuales implican Ia administración de agentes hipoglicémicos orales (OHAs, "oral hypoglycemic agents"). Los OHAs se pueden clasificar en aquellos que aumentan Ia sensibilidad a Ia insulina ("insulin-sensitizing agents" o agentes sensibilizadores de Ia insulina); aquellos que su acción se asemeja a Ia de Ia insulina ("insulin-mimetic agents" o agentes miméticos de insulina); y aquellos que estimulan el páncreas para que secrete más insulina. Los últimos incluyen las sulfonilureas (p.ej. tolbutamida, clorpropamida, tolazamida, gliburida, glipizida y glimepirida) y derivados del ácido benzoico (repaglinida). Ejemplos de miméticos de Ia insulina son el ácido alfa lipoico y varios compuestos tales como el vanadato o el tungstato. Los sensibilizadores de Ia insulina ayudan a utilizar Ia glucosa más eficientemente o a hacer que las células del tejido sean más sensibles a Ia insulina, así que requieren de Ia presencia de insulina para trabajar. Ejemplos de sensibilizadores de Ia insulina actualmente en el mercado son las binaguidas (tales como Ia metformina) y las tiazolidinedionas (TZDs) o glitazonas (rosiglitazona y pioglitazona). Una glitazona, Ia troglitazona (Rezulin®), fue retirada del mercado por su fabricante en marzo de 2000 debido a su potencial para causar daño al hígado. La rosiglitazona y Ia pioglitazona tienen efectos similares sobre el azúcar en sangre pero no tienen, al parecer, efectos nocivos significativos sobre el hígado. Otros sensibilizadores de Ia insulina en desarrollo son p.ej. Ia reglixana, Ia netoglitazona, Ia balaglitazona, Ia rivoglitazona, el tesaglitazar y el ragaglitazar. La estrategia de usar sensibilizadores de Ia insulina es especialmente interesante puesto que Ia mayoría de los estados caracterizados por una homeostasis deteriorada de Ia glucosa se caracterizan por una respuesta deficiente a Ia insulina (resistencia a Ia insulina). Otro tipo de agentes hipoglicémicos son los inhibidores de Ia alfa-glucosidasa, que actúan retrasando Ia absorción de Ia glucosa de los carbohidratos injeridos. Ejemplos de ellos son Ia acarbosa y el miglitol.
Los fármacos antidiabéticos actualmente disponibles -aunque, en general, han demostrado ser eficaces y bien tolerados- tienen efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, los efectos nocivos de las sulfonilureas incluyen hipoglicemia, transtornos gastrointestinales y reacciones de hipersensibilidad. Los efectos nocivos de Ia biguanida incluyen transtornos gastrointestinales y acidosis láctica.
Muchas compañías farmacéuticas están trabajando para producir nuevos fármacos para Ia diabetes de tipo 2. Éstos incluyen nuevas clases de fármacos así como nuevos sensibilizadores de insulina y nuevos estimuladores de Ia secreción de insulina. Así, es conveniente identificar y llevar a Ia práctica clínica nuevos agentes terapéuticos para disminuir Ia resistencia a Ia insulina.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado que las neuregulinas pueden mejorar Ia resistencia a Ia insulina en sujetos que tienen un estado o una enfermedad asociada con Ia resistencia a Ia insulina. Cuando se mejora Ia resistencia a Ia insulina se realza Ia acción endógena de Ia insulina, y entonces los niveles de glucosa en sangre bajan a un nivel normal. Así, las neuregulinas actúan como sensibilizadores de Ia insulina.
El término "resistencia a Ia insulina" será entendido aquí según Ia técnica tal como se describe en el apartado de estado de Ia técnica. Como se usa aquí, el término "sensibilizador de Ia insulina" es un agente que ayuda a utilizar Ia glucosa más eficientemente o a hacer las células del tejido más sensibles a Ia insulina, es decir, un agente que restaura Ia función deteriorada de un receptor de Ia insulina al estado original y de esta manera mejora Ia resistencia a Ia insulina. Así, el sensibilizador de Ia insulina se puede llamar también "agente que mejora Ia resistencia a Ia insulina" ("insulin resistance- improving agent").
En consecuencia, Ia invención se refiere al uso de un producto de proteína neuregulina para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de un estado y/o enfermedad asociados con Ia resistencia a Ia insulina en un mamífero, incluyendo un humano, donde el producto de proteína neuregulina actúa como sensibilizador de Ia insulina, y donde el estado y/o Ia enfermedad se selecciona del grupo que consiste en: Ia diabetes mellitus tipo 2, un síndrome de resistencia severa a Ia insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a Ia insulina, Ia obesidad, Ia intolerancia a Ia glucosa, Ia dislipidemia y el síndrome metabólico.
Así, Ia invención se relaciona con un método para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de un estado y/o enfermedad asociados con Ia resistencia a Ia insulina en un mamífero, donde el estado y/o Ia enfermedad es como se describe antes, que comprende Ia administración a un mamífero (particularmente un humano) que Io necesite una cantidad efectiva de un producto de proteína neuregulina, actuando dicho producto de proteína neuregulina como sensibilizador de Ia insulina.
Los inventores han encontrado que el tratamiento con neuregulina realza Ia sensibilidad a Ia insulina, aumenta Ia expresión del receptor de Ia insulina y aumenta Ia capacidad oxidativa. Se observa un aumento de Ia biogénesis mitocondrial y un aumento de complejos oxidativos y del potencial mitocondrial de Ia membrana.
En este contexto, es relevante mencionar que Ia técnica describe un efecto aditivo de Ia neuregulina por Io que se refiere a Ia insulina (cfr. por ejemplo, el documento C. Cantó et al., "Neuregulin signaling on glucose transport in muscle cells", J. Biol. Chem. 2004, vol. 279, pp. 12260-8; y el documento E. Suarez et al., "A novel role of neuregulin in skeletal muscle. Neuregulin stimulates glucose uptake, glucose transporter translocation, and transporter expression in muscle cells", J. Biol. Chem. 2001 , vol. 276, pp. 18257-64). De esta enseñanza, un experto en Ia materia consideraría Ia neuregulina como un posible mimético de Ia insulina y no como un sensibilizador de Ia insulina, como se ha encontrado en Ia presente invención.
Las realizaciones particulares que se describen a continuación no pretenden ser limitantes para Ia presente invención.
Ejemplos de productos adecuados de proteína neuregulina
Las neuregulinas (NRGs) son proteínas de señalización célula-célula que son ligandos para los receptores de tirosin-quinasas de Ia familia de receptores ErbB. La familia de genes de neuregulina tiene cuatro miembros: NRG1 , NRG2, NRG3 y NRG4. El gen humano NRG1 (número de acceso Genbank BK000383) tiene casi 1 ,4 megabases de largo. Menos del 0.3% de esta longitud codifica Ia proteína. Como consecuencia de un empalme ("splicing") alternativo rico y de múltiples promotores, se producen por Io menos 15 isofomas diferentes de NRG del mismo gen NRG1. Las tres características estructurales conocidas para distinguir las isoformas con respecto a las funciones ¡n vivo y a las características biológicas de Ia célula son el tipo de dominio similar a EGF ("EGF-like", EGF = "epidemial growth factor", factor de crecimiento epidérmico), que puede ser del tipo α o β; Ia secuencia N- terminal (tipo I, II, o III), y si Ia isoforma se sintetiza inicialmente como una proteína transmembrana o de no membrana. A los tipos I y Il de NRGs se les llama conjuntamente a veces como "Ig-NRGs" (Ig = immunoglobulina), y el tipo III de NRGs se denomina a veces como "CRD-NRGs" (CRD = "cysteine rich domain", dominio rico en cisteínas). En Ia literatura se usaron primero otros nombres para referirse a las diferentes isoformas de NRG, tales como, actividad inductora del receptor de acetilcolina ("acetylcholine receptor- inducing activity", ARIA), factor de crecimiento glial ("glial growth factor", GGF), heregulina (HRG), factor de diferenciación neu ("neu differentiation factor", NDF) y factor derivado de neurona sensorial y motora ("sensory and motor neuron-derived factor", SMDF). Sin embargo, estos nombres no se pueden tomar para indicar las funciones biológicas específicas de las isoformas a las cuales se han aplicado. Para más detalles sobre el gen de Ia neuregulina, ver D. L. FaIIs, "Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies", Experimental CeII Research 2003, vol. 284, pp. 14-30.
Según se usa aquí, el término "producto de proteína neuregulina" se refiere a Ia proteína neuregulina producida naturalmente o recombinante; a los fragmentos polipeptídicos biológicamente activos naturales, sintéticos, o recombinantes de proteína neuregulina; a las variantes polipeptídicas biológicamente activas de proteína neuregulina o fragmentos de las mismas, incluyendo proteínas de fusión híbridas o dímeros; o a los análogos polipeptídicos biológicamente activos de proteína neuregulina o fragmentos o variantes de los mismos. Los análogos incluyen, pero no se limitan, a productos de proteína neuregulina donde uno o más residuos de aminoácido han sido substituidos por una aminoácido diferente. Se prefieren las sustituciones de aminoácidos conservativas.
Productos de proteína neuregulina adecuados para Ia invención incluyen productos de proteína derivados de los genes NGR1 , NRG2, NRG3 y NRG4. Son proteínas que se unen a los receptores ErbB2, ErbB3 y ErbB4. ErbB1 no une neuregulinas. Ejemplos de productos de proteína neuregulina adecuados para Ia invención se describen en los documentos WO 99/02681 , WO 92/18627, WO 94/00140, WO 94/04560, WO 94/26298 y WO 95/32724.
Los fragmentos biológicamente activos de neuregulina incluyen moléculas biológicamente activas que tienen una secuencia de aminoácidos igual o similar a Ia de una proteína de neuregulina humana natural. Un fragmento biológicamente activo de neuregulina preferido para Ia invención es Ia secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio similar a EGF ("EGF- like domain"). Otro fragmento biológicamente activo de neuregulina preferido es Ia secuencia de aminoácidos que comprende el dominio similar a Ig ("Ig- like domain") y el dominio similar a EGF.
En realizaciones particulares de Ia invención, el fragmento es de neuregulina- 1 (también conocida simplemente como "neuregulina"), neuregulina-2, neuregulina-3 y neuregulina-4, pudiendo ser todas ellas de origen diferente. Particularmente, el fragmento que comprende el dominio similar a EGF se selecciona entre neuregulina-1 humana, neuregulina-1 de ratón, neuregulina- 1 de rata, neuregulina-1 bovina, neuregulina-1 de pollo, neuregulina-1 de conejo, neuregulina-1 de hámster, neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y neuregulina-1 de pez cebra; neuregulina-2 humana, neuregulina-2 de ratón y neuregulina-2 de rata; neuregulina-3 humana y neuregulina-3 de ratón; y neuregulina-4 humana, neuregulina-4 de ratón y neuregulina-4 de pollo. Secuencias específicas para estos fragmentos son las aquí descritas como SEQ ID NO: 1-17.
En otras realizaciones, el fragmento de neuregulina además comprende el dominio similar a Ig y se selecciona entre neuregulina-1 humana, neuregulina-1 de ratón, neuregulina-1 de rata, neuregulina-1 bovina, neuregulina-1 de conejo, neuregulina-1 de hámster, neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y neuregulina-1 de pez cebra; y neuregulina-2 humana, neuregulina-2 de ratón y neuregulina-2 de rata. Secuencias específicas para estos fragmentos son las aquí descritas como SEQ ID NO: 18-28.
En una realización preferida, el producto de proteína neuregulina es un polipéptido que tiene Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (heregulina- β1 (aminoácidos 177-244)).
Un ejemplo de un producto de neuregulina actualmente disponible en el mercado es un producto de ADN recombinante, expresado a través de E.coli, utilizado para el paro cardíaco moderado y severo (Zensun, Shangai). Otro producto en el mercado pero solamente para uso en investigación, es una heregulina-b1/neuroregulina-1 recombinante humana (factor de diferenciación de neu) producida en E.Coli. Es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 61 aminoácidos, que comprende el dominio similar a EGF, y tiene una masa molecular total de 7055 Dalton (ProSpec-Tany TechnoGene Ltd).
Según se usa aquí, el término "producto de proteína neuregulina" también incluye una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de neuregulina, o un fragmento funcional de Ia misma. La secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica Ia neuregulina, o el fragmento de Ia misma, se puede también utilizar para Ia terapia génica in vivo o ex vivo.
Los productos de proteína neuregulina de Ia invención se pueden generar y/o aislar con cualquier medio conocido en Ia técnica. Un procedimiento adecuado para producir un producto de proteína neuregulina es transformar una célula hospedante ("host") con el ácido nucleico que codifica el producto deseado de proteína neuregulina, cultivando Ia célula hospedante transformada y recogiendo Ia neuregulina producida del cultivo de Ia célula hospedante.
Estados o enfermedades asociados con Ia resistencia a Ia insulina
Los síntomas clínicos de los estados o de las enfermedades relacionadas con Ia invención se sabe que están asociados de alguna manera a Ia resistencia a Ia insulina. Por ejemplo, son estados o enfermedades asociados a Ia resistencia a Ia insulina Ia intolerancia a Ia glucosa, Ia resistencia severa a Ia insulina, Ia diabetes tipo 2, Ia obesidad y el síndrome metabólico. Otros estados que se asocian a Ia resistencia a Ia insulina incluyen Ia hiperinsulinemia, Ia hiperglicemia, el síndrome ovárico polístico, Ia resistencia a Ia insulina inducida por esteroides, Ia diabetes gestacional, Ia dislipidemia, Ia hipertensión arterial y Ia enfermedad cardiovascular, especialmente Ia aterosclerosis. La invención es también aplicable cuando Ia resistencia a Ia insulina está presente en el envejecimiento y en estados de capacidad baja de ejercicio. El producto de proteína neuregulina como sensibilizador de Ia insulina se puede utilizar para mejorar Ia capacidad del ejercicio. En una realización preferida el estado o enfermedad, como se describe aquí, se selecciona entre Ia intolerancia a Ia glucosa, Ia diabetes mellitus tipo 2, Ia obesidad, el síndrome metabólico, un síndrome de resistencia severa a Ia insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a Ia insulina o Ia dislipidemia. Está dentro del conocimiento general del experto el identificar si p.ej. una persona tiene una de las enfermedades relacionadas con Ia invención. Se hace referencia p.ej. a the National Library of Medicine, USA (NLM) página web: http://www.nlm.nih.gov, donde se describen detalles de estas enfermedades.
La intolerancia a Ia glucosa es un estado muy asociado a Ia diabetes tipo 2. Según Io explicado antes, los médicos a veces se refieren a este estado como nivel alterado de Ia glucosa en ayuno (IFG) o tolerancia alterada a Ia glucosa (IGT), dependiendo de Ia prueba usada para diagnosticarla. Los niveles de azúcar en sangre son elevados, pero no Io suficientemente altos para justificar una diagnosis de Ia diabetes. El cuerpo todavía produce insulina, pero en cantidades insuficientes para controlar eficazmente los niveles de azúcar de sangre. La intolerancia a Ia glucosa a menudo se considera una señal de alerta temprana para Ia diabetes tipo 2: del uno al diez por ciento de Ia gente con intolerancia a Ia glucosa desarrolla diabetes tipo 2 cada año. Las causas de Ia intolerancia a Ia glucosa son similares a las identificadas para Ia verdadera diabetes.
La diabetes de tipo 2 se define como Ia forma de diabetes que se desarrolla cuando el cuerpo no responde correctamente a Ia insulina, en oposición con Ia diabetes de tipo 1 , en Ia cual el páncreas casi no produce insulina. La diabetes mellitus de tipo 2 resulta de un defecto en Ia secreción de Ia insulina y de una debilitación de Ia acción de Ia insulina en tejidos periféricos, especialmente en tejido muscular y adipocitos. Al principio, el páncreas afronta Ia demanda añadida produciendo más insulina. Con el tiempo, sin embargo, pierde Ia capacidad de secretar suficiente insulina en respuesta a las comidas. También está presente un defecto en el post-receptor, causando resistencia al efecto estimulante de Ia insulina sobre Ia captación de glucosa, y se desarrolla una deficiencia no dependiente de Ia insulina, a diferencia de Ia deficiencia absoluta encontrada en pacientes con diabetes de tipo 1. Los factores etiológicos específicos no se saben, pero los factores genéticos son mucho más fuertes en el tipo 2 que en tipo 1.
El síndrome metabólico se describe como una colección de factores de que aumente el riesgo de desarrollar enfermedad cardíaca, paro cardíaco y diabetes. El síndrome está muy asociado con el desorden metabólico generalizado llamado resistencia a Ia insulina. Esta es Ia razón por Ia cual el síndrome metabólico también es conocido como "síndrome de Ia resistencia a Ia insulina", y también como el "síndrome X" y el "síndrome dismetabólico". Los factores de riesgo incluyen Ia obesidad, Ia resistencia a Ia insulina, Ia tolerancia alterada a Ia glucosa, Ia hiperinsulinemia (niveles altos de insulina en sangre), Ia hipertensión (tensión arterial alta), Ia dislipidemia (niveles anormales de triglicéridos y del HDL-colesterol en sangre) y el estado proinflamatorio. La resistencia severa a Ia insulina es un estado patológico caracterizado por una extrema resistencia a Ia insulina.
La obesidad es un estado caracterizado por un peso mayor que el que generalmente se considera sano para una altura dada. La obesidad puede causar muchos problemas de salud debido a Ia tensión sobre órganos y articulaciones. Aumenta el riesgo de algunos desórdenes extendidos y potencialmente fatales tales como Ia diabetes, Ia tensión arterial alta, Ia dislipidemia, Ia osteoartritis, Ia apnea del sueño y los problemas respiratorios, algunos cánceres (endometrial, de mama, y de colon), Ia enfermedad de Ia arteria coronaria y el paro cardíaco. Puede también conducir a problemas psicológicos tales como Ia depresión. Los resultados de Ia encuesta National Health and Nutrition Examination Survey para 1999-2002 estiman que un 30% de los adultos de los Estados Unidos de más de 20 años -sobre 60 millones de personas- son obesos, definidos por tener un índice de masa corporal ("body mass index", BMI) de 30 o más alto (un BMI entre 25 y 29.9 se considera exceso de peso). Se estima que un 16% de niños y adolescentes con edades de 6-19 años tiene sobrepeso.
Administración del producto de proteína neurequlina
Según Ia enseñanza de Ia presente invención, el producto de proteína neuregulina puede administrarse a un mamífero (particularmente un humano) para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de un estado y/o de una enfermedad asociada a resistencia a Ia insulina. El propósito de Ia administración de producto de proteína neuregulina puede ser preventivo (para evitar el desarrollo de estas enfermedades) y/o terapéutico (para tratar estas enfermedades una vez se hayan desarrollado/instaurado). Se entiende que el producto de proteína neuregulina se administra en una forma farmacéuticamente aceptable. Los expertos en Ia materia pueden averiguar Ia dosis apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que Ia dosis debe ser una cantidad eficaz de producto de proteína neuregulina en el sentido que Ia resistencia a Ia insulina mejore en el sujeto tratado. Se conocen análisis adecuados para ensayar Ia mejora en Ia resistencia a Ia insulina. Como ejemplos, dosis únicas adecuadas para otros sensibilizadores de Ia insulina incluyen de 100 a 800 mg de troglitazona y de 5 a 50 mg de pioglitazona.
El producto de proteína neuregulina de Ia invención se puede administrar solo o en una composición con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones se adaptan generalmente para Ia administración oral. Sin embargo, pueden adaptarse a otros modos de administración, por ejemplo Ia administración parenteral, sublingual o transdérmica. Las composiciones pueden estar en forma de pastillas, cápsulas, polvos, granulos, supositorios, polvos reconstituibles o preparaciones líquidas. Composiciones de liberación modificada pueden ser composiciones de liberación retrasada, pulsada o sostenida. Las composiciones pueden administrarse parenteralmente por inyección del bolo o por liberación gradual en un cierto periodo de tiempo. Puesto que el objetivo es Ia normalización del nivel de glucosa, esto ofrece Ia posibilidad de por ejemplo, administrar Ia composición como depot. Las composiciones pueden comprender un producto de proteína neuregulina o más de un producto de proteína neuregulina en combinación. Además, las composiciones pueden comprender el producto de proteína neuregulina como único agente sensibilizador de Ia insulina, combinaciones de estos agentes o combinaciones con otros agentes terapéuticos dependiendo de Ia enfermedad (otras clases de agentes hipoglucémicos orales o otras clases de fármacos).
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de Ia solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra cómo Ia incubación crónica de células L6E9 con neuregulinas incrementa el metabolismo oxidativo.
La FIG. 2 muestra cómo Ia incubación crónica de células L6E9 con neuregulinas incrementa Ia masa mitocondrial celular.
La FIG. 3 muestra cómo Ia incubación crónica de células L6E9 con neuregulinas incrementa Ia abundancia de complejos oxidativos y el potencial de Ia membrana mitocondrial.
La FIG. 4 muestra cómo las neuregulinas incrementan los niveles de PGC-1α y median Ia expresión inducida por calcio de PGC-1α.
La FIG. 5 muestra cómo el tratamiento crónico con neuregulina incrementa Ia sensibilidad a Ia insulina.
La FIG. 6 muestra como Ia incubación crónica de miocitos L6E9 con ácido palmítico provoca resistencia a Ia insulina.
La FIG. 7 muestra como las NRGs mejoran el perfil metabólico de los miocitos L6E9 tratados con ácido palmítico.
La FIG. 8 muestra como las NRGs revierten Ia disminución de Ia expresión de proteínas mitocondriales inducida por el tratamiento con ácido palmítico.
La FIG. 9 muestra como las NRGs mejoran Ia situación de resistencia a Ia insulina inducida por el tratamiento con palmitato.
La FIG. 10 muestra como las NRGs previenen Ia acumulación de TAG en respuesta al tratamiento con palmitato. La FIG. 11 muestra como las NRGs previenen Ia resistencia a Ia insulina inducida por palmitato.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Descripción detallada de los dibujos
La FIG. 1 muestra resultados en los que las células L6E9 fueron incubadas en presencia o ausencia de 3 pM de neuregulinas, antes de realizar los siguientes ensayos: FIG. 1A, se realizaron ensayos de immunoblot (Western blot) con 10 μg (para los análisis de los niveles de proteína de MHC o de Ia subunidad α1 de Ia (Na+/K+)ATPasa), 30 μg (para GLUT4 o GLUT1) o 40 μg (para ErbB2 o ErbB3) de proteína de usados totales celulares. Se obtuvieron membranas plasmáticas crudas (PM) y membranas microsomales de baja densidad (LDM) como se describe en los métodos, y el efecto de las neuregulinas sobre Ia presencia de GLUT4 en cada compartimiento fue analizado usando 10 μg de proteína de PMs y 5 μg de proteína de LDMs. Se muestran imágenes representativas de 3-10 experimentos independientes. FIG. 1 B, transporte de 2-[3H]-desoxiglucosa (DU) en nmoles/mg de proteína x 10 min. FIG. 1C, oxidación de Ia glucosa (GO) en nmoles/mg de proteína x hora. FIG. 1 D, oxidación de palmitato (PO) en nmoles/mg de proteína x hora. FIG. 1 E, liberación de lactato (LR) en μmoles/mg de proteína x hora. FIG. 1 F1 síntesis de glucógeno en nmoles/ mg de proteína x hora. Los resultados son Ia media ± SE of 3-12 experimentos diferentes. * indica diferencias estadísticas significativas entre grupos control (C) y tratados con neuregulina (Hrg) a P< 0.01.
La FIG. 2 muestra resultados en los que las células L6E9 se incubaron en presencia o ausencia de 3 pM de neuregulinas, durante 48 horas antes de llevar a cabo los siguientes ensayos: FIG. 2A, 20 μg de usados celulares totales se utilizaron para Ia detección del contenido proteico de porina, citocromo C y COX-IV mediante análisis de western blot. Se muestran las imágenes representativas y las cuantificaciones densitométricas de 5 experimentos, expresadas como valores promedio ± SE. IR significa incremento relativo al basal, en unidades arbitrarias relativas. * indica diferencias estadísticamente significativas entre el grupo control (C) y el grupo tratado con neuregulina (Hrg) a P < 0.05. La FIG. 2B muestra resultados en los que Ia masa mitocondria! se midió como Ia intensidad media de Ia fluorescencia procedente de Ia tinción con el colorante NAO (unidades expresadas como % relativo al basal). Los resultados se muestran como valores relativos, Ia media + SE de seis experimentos. * indica diferencias estadísticas significativas entre el grupo control (C) y el grupo tratado con neuregulinas (Hrg) a P < 0.01.
La FIG. 3 muestra resultados en los que las células L6E9 se incubaron en presencia (Hrg) o ausencia (C) de neuregulinas durante 48 horas antes de llevar a cabo los siguientes ensayos: FIG. 3A, las fracciones mitocondriales de células L6E9 se obtuvieron tal y como se describe en los métodos, luego 20 μg de proteína se usaron para ensayos de western blot con el fin de analizar Ia abundancia de los diferentes complejos de Ia fosforilación oxidativa (Cl = complejo I, subunidad de 39 kDa; CII = complejo II, subunidad de 70 kDa; CIII = complejo III, del centro 2; CIV = complejo IV, subunidad COX IV; CV = complejo V, subunidad α; cyt C = citocromo C). Las imágenes mostradas son representativas de tres experimentos. La FIG. 3B muestra resultados en los que el potencial de membrana mitocondrial (MMP) relativo se midió con Ia sonda potenciométrica JC-1 tal y como se describe en métodos (unidades como % relativo al basal). Los resultados mostrados son Ia media ± SE de doce experimentos independientes. * indica diferencias estadísticas significativas entre el grupo control y el grupo tratado con neuregulinas a P < 0.01.
La FIG. 4A muestra resultados en los que 120 μg de usados totales de células L6E9 incubadas en presencia (Hrg) o ausencia (C) de 3 pM de neuregulinas, se utilizaron para Ia detección por westem-blot de PGC-1α. La imagen mostrada es representativa de nueve experimentos y las cuantificaciones densitométricas, mostradas abajo, están expresadas como incremento relativo al basal, IR (en unidades arbitrarias relativas) como Ia media ± SE. * indica diferencias estadísticas significativas entre el grupo control y el tratado con neuregulinas a P < 0.01. La FIG. 4B muestra resultados en los que las células se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpos anti-ErbB3 contra el dominio de unión de ligando (Ab) o de dantroleno (Dan) durante 30 minutos antes de añadir cafeína (Caff) o neuregulinas (Hrg) durante 3 horas. Luego se obtuvieron los usados totales para analizar Ia fosforilación de ErbB3. El medio de incubación de las 3 horas de tratamiento se recogió para analizar Ia presencia de neuregulinas liberadas (Hrg R). 200 μl de medio se sometieron a SDS-PAGE y posteriormente se realizó el inmunoblot contra el fragmento común EGF de las neuregulinas. pErbB3 significa ErbB3 fosforilado en tirosinas. Las imágenes mostradas son representativas de tres experimentos. En Ia FIG. 4C, Ia abundancia de PGC-1α tras 15 horas de tratamiento con cafeína y/o neuregulinas en presencia o ausencia de dantroleno (Dan) o anticuerpos de bloqueo contra ErbB3 (Ab), se ensayó como se describe en los métodos, usando 120 μg (para PGC-1α) o 10 μg (para detectar Ia subunidad αi de Ia (Na+/K+)ATPasa) de proteína total para ensayos de western blot. Las imágenes mostradas son representativas de tres experimentos (C, control; Hrg, grupo tratado con neuregulinas).
La FlG. 5 muestra resultados en los que las células L6E9 se incubaron en presencia (Hrg) o ausencia (C) de 3 pM de neuregulinas, durante 48 horas antes de llevar a cabo los siguientes ensayos: en Ia FIG. 5A, se muestran los resultados de ensayos de captación de glucosa en dosis-respuesta a Ia insulina. DU significa incremento de Ia captación de 2-[3H]-desoxiglucosa sobre el basal, en nmoles/mg de proteína x 10 min. El resultado mostrado es Ia media ± SE de cuatro experimentos. * indica diferencias estadísticas significativas entre el grupo control (triángulos negros, línea continua) y el grupo tratado con neuregulinas (círculos negros, línea discontinua) a P < 0.01. La FIG. 5B muestra resultados en los que para los ensayos de western blot se utilizaron 10 μg de membranas plasmáticas crudas (PM), obtenidas tal y como se describe en Ia sección de métodos. La imagen mostrada es representativa de tres experimentos. La FIG. 5C muestra resultados en los que 40 μg de usados celulares totales se utilizaron para los ensayos de western blot para analizar Ia abundancia del receptor de insulina (InsR), IRS- 1 , Ia subunidad reguladora p85 de Ia PI3K, PKB y PKC-ζ. Las imágenes mostradas son representativas de 3 experimentos. La FIG. 5D muestra resultados en los que se examinó Ia respuesta de diferentes efectores de Ia vía de señalización de Ia insulina tras 5 minutos (InsR) o 15 minutos (el resto) de tratamiento a concentraciones submáximas de insulina (100 nM). Tanto InsR como PKC-ζ se inmunoprecipitaron para analizar sus niveles de fosforilación (ver métodos). La fosforilación de PKB en Ser473 se analizó con un anticuerpo policlonal específico. También se inmunoprecipitó Ia subunidad p85 de PI3K y se analizó mediante inmunoblot su unión a IRS-1. Estas son imágenes representativas de tres experimentos.
La FIG. 6 muestra como Ia incubación crónica de miocitos L6E9 con ácido palmítico provoca resistencia a Ia insulina. Los miocitos L6E9 se incubaron con ácido oleico (Ole, 0.4 mM) o ácido palmítico (Palm, 0.15 mM) durante 72 horas desde el inicio de Ia diferenciación. A continuación (FIG.6A) se realizaron ensayos de transporte de 2-desoxiglucosa a diferentes concentraciones de insulina. Los resultados, expresados como incremento absoluto respecto al basal se muestran como media ± S. E. de 4 experimentos independientes, "mg mus" significa mg de músculo. * indica diferencias estadísticas vs. control (-) a concentraciones similares de insulina, P < 0.05. (FIG. 6B) El contenido de triacilgliceroles (TAG) se midió en homogenados totales usando un kit comercial, "mg prot" significa mg de proteína. Los resultados se muestran como Ia media ± S. E de 4 a 6 experimentos independientes.* indica diferencias estadísticas significativas vs. Los niveles básales con P < 0.05.
La FIG. 7 muestra como las NRGs mejoran el perfil metabólico de los miocitos L6E9 tratados con ácido palmítico. Los miocitos L6E9 fueron cultivados y sometidos a diferentes tratamientos. A continuación, el contenido de triglicéridos ("Trig c") (FIG. 7A), Ia oxidación de glucosa ("Gluc ox") (FIG. 7B) y Ia oxidación de palmitato ("Palm ox") (FIG. 7C) se midieron según los métodos descritos. Todos los resultados se expresan como Ia media ± S. E. de 3 a 5 experimentos independientes. * indica diferencias significativas vs. el grupo control con P < 0.05.
La FIG. 8 muestra como las NRGs revierten Ia disminución de Ia expresión de proteínas mitocondriales inducida por el tratamiento con ácido palmítico. El tratamiento con ácido palmítico conjugado con BSA (0.15 mM) se comenzó al inicio de Ia diferenciación (BSA no conjugada se utilizó como control). Durante las últimas 48 horas de tratamiento con ácido palmítico se añadió Hrg (3pM) y posteriormente se obtuvieron homogenados totales. Los niveles de proteína de los diferentes marcadores y subunidades de los complejos respiratorios se analizaron por westem-blot. Las cuantificaciones densitométricas se expresan como Ia media ± S. E de 3 a 4 experimentos independientes. "ReI. Prot. L." significa niveles relativos de proteína. * indica diferencias estadísticas significativas vs. los controles, tratados con BSA (línea discontinua), con P < 0.05.
La FIG. 9 muestra como las NRGs mejoran Ia situación de resistencia a Ia insulina inducida por e\ tratamiento con palmitato. (FIG. 9A) Ensayos de transporte de 2-desoxiglucosa en respuesta a insulina (Ins, 1 μM) se llevaron a cabo en L6E9, 24 horas después del inicio de diferenciación, en presencia o en ausencia de palmitato (Palm, 0.15 mM). Los resultados se expresan como Ia media ± S. E. de 3 experimentos independientes. (FIG. 9B) Miocitos L6E9 se incubaron con ácido palmítico (Palm 0.15 mM) durante 72 horas al inicio de Ia diferenciación y se añadieron Hrg (3 pM) durante las últimas 48 horas. A continuación se realizaron ensayos de transporte de 2- desoxiglucosa a diferentes concentraciones de insulina. Los resultados se muestran como Ia media + S. E. de 4 experimentos independientes. * indica diferencias estadísticas significativas vs. el grupo control correspondiente (-, barra blanca) con las mismas concentraciones de insulina, P < 0.05. (FIG. 9C) Miocitos L6E9 se incubaron en ausencia (control) o presencia de ácido palmítico (Palm, 0.15 mM) durante 72 horas, al inicio de Ia diferenciación y/o Hrg (3 pM) durante las últimas 48 horas. A continuación se realizaron ensayos de transporte de 2-desoxiglucosa a concentración submáxima de insulina. X e Y representan el incremento neto en el transporte de glucosa inducido por el tratamiento crónico con Hrg. Los resultados se muestran como Ia media ± S. E. de 4 experimentos independientes. * indica Ia diferencia estadística provocada por el tratamiento con Hrg vs. el grupo no tratado con Hrg, P < 0.05. (FIG. 9D) Miocitos L6E9 se incubaron con ácido palmítico (Palm, 0.15 mM) durante 72 horas desde el inicio de Ia diferenciación y se añadieron Hrg (3 pM) durante las últimas 48 horas. A continuación se midió el efecto de una incubación aguda con Hrg (3 nM) sobre el transporte de 2-desoxiglucosa. Los resultados se muestran como Ia media ± S. E. de 4 experimentos independientes. * indica diferencias estadísticas vs. el grupo control correspondiente a P < 0.05.
La FIG. 10 muestra como las NRGs previenen Ia acumulación de TAG en respuesta al tratamiento con palmitato. Miocitos L6E9 diferenciados durante 72 horas en presencia o ausencia de Hrg 3 pM durante las últimas 48 horas se sometieron a un tratamiento de 16 horas con ácido palmítico conjugado con BSA (0.15 mM). Como control se empleó BSA sin conjugar. A continuación se midió el contenido de triacilgliceroles ("TAG c"). Los resultados se muestran como Ia media ± S. E. de 3 experimentos independientes. * indica diferencias estadísticas significativas vs. el grupo control de miocitos sin tratar, φ indica diferencias estadísticas significativas vs. los respectivos grupos no tratados con Hrg. En todos los casos P < 0.05.
La FIG. 11 muestra como las NRGs previenen Ia resistencia a Ia insulina inducida por palmitato. Miocitos L6E9 se diferenciaron durante 72 horas en presencia o ausencia de Hrg 3 pM durante las últimas 48 horas de diferenciación. Se sometieron a un tratamiento de ácido palmítico conjugado con BSA (0.15 mM) durante 16 horas. Como control se empleó BSA no conjugada. A continuación (FIG. 11A) se llevaron a cabo ensayos de transporte de 2-desoxiglucosa en condiciones básales así como en situación de exposición a concentraciones de insulina (Ins) submáxima (100 nM) o máxima (1 μM) durante 30 minutos. Los resultados se muestran como Ia media ± S. E. de 4 experimentos independientes. *indica diferencias estadísticas significativas vs. los respectivos miocitos control, no tratados. (FiG. 11 B) Se muestran los decrementos en el transporte de glucosa estimulado por insulina debido al tratamiento con palmitato. Los valores se obtienen por Ia resta de los valores de tratamiento con palmitato a los valores sin tratamiento de los grupos indicados. * indica diferencias estadísticas significativas vs. los grupos respectivos no tratados con Hrg. En todos los casos, P < 0.05.
Células, reactivos y materiales
La línea celular de músculo esquelético de rata, L6E9, fue amablemente cedida por el Dr. B. Nadal-Ginard (Harvard University, Boston, MA). El Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM), Ia glutamina y los antibióticos se obtuvieron de BioWhittaker (Walkersville, MD)1 y el suero fetal bovino ("Fetal Bovine Serum", FBS) se obtuvo de Gibco (Invitrogen LTD.) La insulina porcina purificada fue una donación de EIi Lilly Co. (Indianapolis, IN). La neuregulina recombinante, heregulin-β1-(177-244) (Hrg) fue una donación de Genentech, Inc. (South San Francisco, CA). La mayoría de productos químicos habituales, así como Ia cafeína, el dantroleno y el CCCP (carbonil cianida m- clorofenilhidrazona), y el anticuerpo monoclonal anti-β-actin se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). El anticuerpo monoclonal de bloqueo anti-ErbB3 (Ab5) se obtuvo de Neomarkers (Fremont, CA). Los anticuerpos monoclonales anti- fosfo-tirosina, anti-cadena β del receptor de insulina, anti-IRS-1 (substrato-1 del receptor de Ia insulina) y anti-caveolina-3, se obtuvieron de Transduction Laboratories. Los anticuerpos policlonales anti-PGC-1o; (K-15), anti-ErbB2 (C- 18) y anti-ErbB3 (C-17) se obtuvieron de Santa Cruz Inc. (Santa Cruz, CA.)- Los anticuerpos monoclonales anti-cadena pesada de miosina (MF-20) y anti- subunidad αi de Ia (Na+/K+)ATPasa (α6F) se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank, que está bajo los auspicios del NICHD y mantenido por Ia University of lowa, Department of Biological Sciences (lowa City, IA). Los anticuerpos policlonales anti-PKB, ant¡-fosfo-Ser473-PKB y anti-fosfo-
Thr410-PKC-ζ se obtuvieron de CeII Signaling (Danvers, MA). Los anticuerpos policlonales anti-subunidad p85 de PI3K se obtuvieron de Upstate Biotechnology Inc. (Charlottesville, VA). El anticuerpo policlonal OSCRX (contra los 15 residuos aminoacídicos C-terminales de GLUT4) fue producido en nuestro laboratorio. El anticuerpo policlonal anti-GLUT1 se obtuvo de Abcam (Cambridge, UK). El anticuerpo monoclonal anti-porina se obtuvo de Calbiochem (La JoIIa, CA). El anticuerpo monoclonal anti-citocromo C se obtuvo de PharMingen (San José, CA). Las sondas de NAO (naranja de nonil acridina) y JC-1 (yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1 ,1\3,1'- tetraetilbenzimidazolilcarbocianina) así como los anticuerpos monoclonales contra diferentes subunidades de los complejos de Ia fosforilación oxidativa se obtuvieron de Molecular Probes (Eugene, OR). El reactivo de Bradford y todos los materiales de electroforesis y los marcadores de peso molecular se obtuvieron de Bio-Rad (Hercules, CA). El kit del reactivo BCA de análisis de proteína se obtuvo de Pierce (Rockford, IL). Immobilon polivinilidene difluoride (PVDF) se obtuvo de Millipore Corp. (Bedford, MA). Los reactivos de ECL, Ia 2-desoxi-D-[3H]-glucosa, Ia D-[U-14C]-glucosa y el [U-14C]-ácido palmítico se obtuvieron de Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Todos los productos químicos utilizados fueron de Ia mayor pureza disponible.
Cultivo celular
Mioblastos L6E9 crecieron y se llevaron a Ia formación de miotubos tal y como ya se ha descrito previamente (cfr. E. Suárez et al., "A novel role for neuregulin in skeletal muscle. Neuregulin stimulates glucose uptake, glucose transporter translocation and transporter expression in muscle cells", J. Biol. Chem. 2001 , vol 276, pp. 18257-64). Para analizar el efecto crónico de las neuregulinas, se añadieron 3 pM de heregulina recombinante (Hrg) 24 horas después de que las células se cambiaran a un medio de diferenciación y los estudios se llevaron a cabo 48 horas más tarde. Para los experimentos que analizaban los efectos agudos del calcio sobre Ia liberación de neuregulinas y Ia fosforilación de ErbB3, los miotubos L6E9 se ayunaron de suero durante 4 horas antes de añadir cualquier tratamiento. El dantroleno (10 μM) y el anticuerpo anti-ErbB3/Ab5 (10 μg/ml) se añadieron 30 minutos antes de los tratamientos de cafeína (5 mM) y neuregulinas (3 pM), que duraron 3 horas. Posteriormente, las células se procesaron o se dejaron con medio al 2% de FBS (y anti-ErbB3/Ab5 o dantroleno donde correspondía) durante 15 horas más con el fin de analizar los niveles de proteína de PGC-1α. Los miocitos L6E9 también se ayunaban de suero durante 4 horas antes de iniciar los tratamientos con insulina, los cuales duraban 30 minutos.
Preparación de extractos de miocitos L6E9
Los extractos totales de miocitos L6E9 se obtuvieron tal y como se describió previamente (cfr. Cantó et al. "Neuregulin signaling on glucose transport in muscle cells", J. Biol. Chem. 2004, vol 279, pp. 12260-8). Los niveles de proteína se midieron con el método de Bradford. Las preparaciones de fracciones celulares enriquecidas en mitocondrias se obtuvieron mediante homogenización mecánica de los miocitos L6E9 con un tampón de homogenización específico (sacarosa 0.25 M, EGTA 1 mM, Hepes 10 mM pH 7.4 e inhibidores de proteasas añadidos justo antes del ensayo: PMSF 0.2 mM, leupeptina 1 μM, pepstatina 1 μM y aprotinin 1 U/ml), y mediante el uso de un homogenizador de vidrio y un émbolo a motor. El homogenado se centrifugó a 4500 r.p.m. durante 10 minutos a 4 0C. El pellet se resuspendió con tampón de homogenización y se centrifugó de nuevo de manera similar. El pellet resultante es Ia fracción enriquecida en mitocondrias. Las membranas plasmáticas crudas (PM) y las membranas microsomales de baja densidad (LDM) se obtuvieron tal y como ya se ha descrito previamente (Suárez et al., 2001 )
Inmunoprecipitación e inmunoblottinq
Los ensayos de inmunoprecipitación del receptor de insulina, Ia subunidad p85 de Ia fosfatidilinositos 3-quinasa (PI3K) y PKC-ζ se llevaron a cabo tal y como ya se ha descrito (véase más arriba Cantó et al., 2004). Las muestras de proteína que contenían Laemmli Sample Buffer (LSB) se sometieron a una electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de PVDF y se realizó el inmunoblot como se describe (véase más arriba, Suárez et al., 2001). Las proteínas se detectaron finalmente con el método de ECL, y Ia señal cuantificada mediante escaneado densitométrico.
Medidas metabólicas
Los ensayos de captación de 2-deoxiglucosa se realizaron tal y como ya se ha descrito (véase más arriba, Suárez et al. 2001 ). La oxidación de glucosa o de palmitato se cuantificó en células incubadas en el medio de sales equilibrado de Hank (en presencia de FBS, 2%) conteniendo 5 mM de D- glucosa y 0.32 μCi de D-[U-14C]-glucosa (306 mCi/mmol), para los ensayos de oxidación de glucosa, o 0.1 mM de palmitato con 0.1 μCi de [U-14C]-ácido palmítico, (60 mCi/mmol) para los ensayos de oxidación de palmitato. Las células se incubaron en este medio durante 3 horas y se captó el 14CÜ2 y se midió tal y como ya se ha descrito (cfr. N. Auestad et al., "Fatty acid oxidation and ketogenesis by astrocytes in primary culture", J. Neurochem. 1991 , vol. 56, pp. 1376-86). Para las medidas de liberación de lactato, los medios de células incubadas en presencia o ausencia de neuregulinas durante 48 horas se recogieron y el lactato se midió con un kit comercial disponible (Sigma 826-UV). La síntesis de glucógeno se midió como incorporación de glucosa a glucógeno, tal y como se ha descrito previamente (cfr. R.B. Ceddia et al., "Creatine supplementation increases glucose oxidation and AMPK phosphorylation and reduces lactate production in L6 rat skeletal muscle cells", J. Physiol. 2004, vol. 555, pp. 409-21). Los niveles de proteína se cuantificaron con el método BCA.
Estimación de Ia masa mitocondrial
Los miocitos L6E9, incubados en ausencia o presencia de 3 pM de neuregulinas durante 48 horas, se incubaron a 37 0C durante 30 minutos con un medio libre de FBS que contenía 100 ng/ml de Ia sonda NAO. NAO es un colorante metacromático que se une específicamente a Ia cardiolipina, un lípido de Ia membrana mitocondrial interna, independientemente del estado energético. Tras Ia incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y finalmente se tripsinizaron para medir Ia fluorescencia media celular a 580 nm mediante citometría de flujo.
Estimación del potencial de membrana mitocondrial (JC-D
JC-1 es un colorante fluorescente catiónico (de color verde como monómero; 539 nm) que se acumula en Ia mitocondria de manera dependiente de potencial de membrana. Su acumulación en Ia mitocondria conduce a Ia formación de agregados de fluorescencia roja (agregados-J) (597 nm). La concentración de monómeros verdes JC-1 en Ia mitocondria aumenta proporcionalmente al potencial de membrana y forman agregados-J cuando Ia concentración de monómeros verdes alcanza ciertos niveles en potenciales de membrana que exceden los 240 mV. Así, el potencial de membrana se puede analizar mediante Ia determinación de Ia tasa de fluorescencia roja vs. Ia verde, independientemente del número de mitocondrias medido. Para este fin, las células se incubaron durante 30 minutos a 37 0C en DMEM sin FBS conteniendo 1 μM de JC-1. Luego, las células se lavaron tres veces con PBS antes de tripsinizarlas y medir el promedio de las fluorescencias verdes y rojas mediante citometría de flujo. La adecuación y efectividad del método potenciométrico JC-1 se validó con el uso de CCCP (10 μM).
Estudios de microscopía confocal
Las células crecidas en cubreobjetos se fijaron durante 20 minutos con 3% de paraformaldehido en PBS a pH 7.4, luego se lavaron tres veces en PBS y se incubaron durante 10 minutos en PBS conteniendo 50 mM de NH4CI, y luego 10 minutos más en PBS con 20 mM de glicina. A fin de permeabilizar las células, éstas se incubaron durante 10 minutos con PBS conteniendo 0.1% de Tritón X-100 y 0.05% de desoxicolato sódico, y luego, de nuevo se lavaron durante 10 minutos con PBS, tres veces, antes de incubar las células durante 30 minutos con PBS conteniendo 10% de FBS. Después los cubreobjetos se incubaron con el anticuerpo primario de COX-I (citocromo oxidasa I) a 0.5 μg/ml, diluido en PBS con 10% de FBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados de 10 minutos con PBS, los cubreobjetos se incubaron con anticuerpos de secundarios de cabra conjugados con un fluorocromo (Alexa-Red) durante 45 minutos. Las células se lavaron tres veces más en PBS antes de montarlas con mowiol (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH). Las imágenes confocales se obtuvieron usando un microscopio de fluorescencia confocal láser Olympus fluoview con un objetivo de 63x a 1.5x para vistas generales y aumento de 3x para examinar posibles alteraciones en Ia distribución perinuclear.
Análisis estadísticos
Los datos se muestran como media + error estándar (SE). Las diferencias estadísticamente significativas se establecieron usando test no pareados de t de Student.
Las neurequlinas incrementan el metabolismo oxidativo
Para comprobar los efectos metabólicos de las neuregulinas sin alterar Ia miogénesis, Ia cual se potencia a neuregulinas de 30 pM a 3 nM, los miocitos L6E9 se trataron con una concentración muy baja de neuregulinas, 3 pM, durante 48 horas. A esta baja concentración, las células tratadas con neuregulinas no mostraron ningún cambio sobre Ia formación de los miotubos ni en los niveles proteicos de marcadores miogénicos como Ia cadena pesada de miosina (MHC) y Ia caveolina-3, o Ia expresión de los receptores de neuregulinas, ErbB2 y ErbB3 (cfr. FIG. 1A, TABLA 1 ). Sin embargo, al contrario que en tratamientos crónicos con neuregulinas a 3 nM, los 3 pM de neuregulinas incrementaron los niveles de GLUT4 mientras que Ia expresión de GLUT1 no fue significativamente distinta de los niveles controles (cfr. FIG. 1A, TABLA 1). El incremento en los niveles totales de GLUT4 se reflejó en las membranas microsomales de baja densidad (LDM), mientras que en Ia membrana plasmática (PM) los niveles de GLUT4 permanecían inalterados. En consecuencia, no se observaron cambios en Ia captación basal de glucosa entre las células control y tratadas con neuregulinas. (cfr. FIG. 1B). Sin embargo, el tratamiento con neuregulinas incrementó alrededor de un 80% tanto Ia oxidación de glucosa como de palmitato en miocitos L6E9 (cfr. FIG. 1C y 1 D, respectivamente), mientras que disminuyó Ia producción de lactato comparado con los niveles controles (cfr. FIG 1 E). Bajo estas circunstancias, Ia síntesis de glucógeno era similar a los niveles control (cfr. FIG. 1 F). El tratamiento crónico con πeurβαulinas incrementa el contenido v la actividad mitocondrial
Con el fin de determinar si el incremento en los parámetros oxidativos era debido a un incremento en el contenido mitocondrial de los miocitos L6E9, se midió Ia abundancia de diversos marcadores mitocondriales en usados celulares totales. Los niveles de porina, una proteína de Ia membrana mitocondrial externa, los de citocromo C y los de COX-IV incrementaron tras el tratamiento con neuregulinas (cfr. FIG 2A). Además, el colorante lipídico de membrana mitocondrial NAO confirmó el incremento en contenido mitocondrial celular por neuregulinas (cfr. FIG. 2B). Estudios de inmunofluorescencia confocal usando el anticuerpo COX-I mostraron que el tratamiento con neuregulinas no alteraba Ia arquitectura de Ia red mitocondrial de los miocitos L6E9. El incremento en COX-IV inducido por neuregulinas era superior proporcionalmente al de porina o citocromo C, sugiriendo que había no sólo un incremento en contenido mitocondrial global sino también que los complejos de Ia fosforilación oxidativa mitocondrial pudieran estar particularmente enriquecidos. Para analizar esta posibilidad, se analizó Ia abundancia de los diferentes complejos de Ia fosforilación oxidativa en fracciones mitocondriales de células L6E9 incubadas en ausencia o presencia de neuregulinas durante 48 horas. Las neuregulinas incrementaban Ia abundancia de todos los complejos de Ia fosforilación oxidativa en las mitocondrias, mientras que el contenido de porina y citocromo C por miligramo de proteína mitocondrial era similar (cfr. FIG. 3A, TABLA 2). Además, Ia estimación del potencial de membrana mitocondrial con Ia tinción de JC-1 revelaba un incremento en células tratadas con neuregulinas (cfr. FIG. 3B). En conjunto, las neuregulinas no sólo incrementan el contenido mitocondrial, sino que también incrementan su capacidad oxidativa.
Las neuregulinas inducen Ia expresión de PGC-1α
Con el propósito de indagar cómo las neureguiinas inducen Ia biogénesis mitocondrial, se analizó si afectaban a Ia expresión de PGC-1α, ya que se ha tratado como un regulador clave de este proceso en músculo esquelético. El tratamiento crónico con neuregulinas incrementó Ia expresión de PGC-1α en un 82% (cfr. FIG. 4A). Se probó si las neuregulinas podrían estar involucradas en este proceso mediando los efectos del calcio. La incubación de miotubos L6E9 con cafeína inducía Ia liberación de neuregulinas al medio y Ia fosforilación de ErbB3 (cfr. FIG. 4B). Los efectos de Ia cafeína sobre Ia expresión de PGC-1 a fueran totalmente anulados mediante el uso de anticuerpos de bloqueo contra el dominio de unión de ligando de ErbB3 (cfr. FIG. 4C). El bloqueo de Ia liberación de calcio con dantroleno evitó todos los efectos de Ia cafeína sobre Ia liberación de neuregulinas, fosforilación de ErbB3 y expresión de PGC-1α, pero fue incapaz de bloquear los efectos de las neuregulinas añadidas exógenamente estimulando Ia expresión de PGC- 1α (cfr. FIG. 4B y 4C). Así, los incrementos en calcio citosólico requieren de Ia liberación de neuregulinas y activación de ErbB3 a fin de inducir Ia expresión de PGC-1α.
Las neuregulinas incrementan Ia sensibilidad a Ia insulina
Se probó si el tratamiento crónico con neuregulinas también incrementaba Ia sensibilidad a Ia insulina. La captación de glucosa se examinó a distintas concentraciones de insulina en células pre-tratadas o no tratadas con 3 pM de neuregulinas durante 48 horas. Las neuregulinas incrementaron altamente Ia sensibilidad a Ia insulina en casi un orden de magnitud, pero, a pesar de tener mayores niveles de GLUT4, Ia respuesta máxima a insulina no se alteró (cfr. FIG. 5A). El incremento en sensibilidad a insulina sobre Ia captación de glucosa era paralelo a un incremento en Ia sensibilidad a Ia insulina sobre el reclutamiento de GLUT4 a Ia membrana plasmática (cfr. FIG. 5B). Para probar si el incremento en sensibilidad a Ia insulina sobre el transporte de glucosa era debido a un incremento en los efectores de Ia señalización de Ia insulina, se analizaron Ia abundancia y Ia respuesta de diferentes mediadores de Ia insulina sobre Ia captación de glucosa, como el receptor de Ia insulina, IRS-1 , Ia subunidad p85 de PI3K, PKB y PKC-ζ a concentraciones submáximas de insulina (100 nM) en L6E9 pretratadas o no crónicamente con neuregulinas. Las células tratadas con neuregulinas mostraron un incremento en Ia expresión del receptor de Ia insulina, IRS-1 , Ia subunidad reguladora p85 de PI3K, PKB y PKC-ζ (cfr. FIG. 5C y TABLA 3) y un incremento en su respuesta a concentraciones submáximas de insulina (cfr. FIG. 5D). En conclusión, el pretratamiento con neuregulinas incrementa Ia sensibilidad a Ia insulina para inducir Ia translocación de GLUT4 y Ia captación de glucosa, probablemente debido a un incremento en Ia abundancia y eficiencia de los mediadores de Ia señalización de Ia insulina en respuesta a concentraciones submáximas de insulina.
TABLA 1. Cuantificación de los efectos de Ia neuregulina sobre marcadores mioqénicos, receptores ErbB v niveles de proteína GLUT (PM. membranas plasmáticas crudas; LDM, membranas microsomales de baja densidad; NS, no hay diferencias estadísticamente significativas).
Control 3 pM neuregulinas Significado estadístico
MHC 100 + 3 102 + 6 NS
Caveolina -3 100 + 6 104 + 8 NS
ErbB2 100 + 9 109 ± 8 NS
ErbB3 100 + 7 116 ± 15 NS
GLUT1 100 + 9 126 + 18 NS
GLUT4
Total 100 + 5 181 + 20 p < 0.01
PM 100 + 5 102 + 3 NS
LDM 100 + 6 198 + 23 p < 0.01
TABLA 2. Efectos del tratamiento con neurequlina sobre Ia abundancia de diferentes proteínas mitocondriales en homoqenados celulares totales (TH) v en fracciones mitocondriales (MF) (NS, no hay diferencias estadísticamente significativas).
Figure imgf000028_0001
TABLA 3. Efectos de Ia neureαulina sobre Ia abundancia de diferentes miembros de Ia ruta de señalización de Ia insulina en respuesta a Ia insulina.
Control 3 pM neuregulinas Significado estadístico
Receptor insulina (IR) 100 ± 14 188 + 12 p < 0.05
IRS-1 100 + 8 151 ± 14 p < 0.05 p85 100 + 12 194 ± 26 p < 0.01
PKB 100 + 11 249 + 57 p < 0.05
PKC-ζ 100 + 7 175 ± 19 p < 0.05
El siguiente objetivo fue comprobar el efecto de las NRGs en el contexto de Ia resistencia a Ia insulina. Se evaluó el efecto de las NRGs en dos circunstancias diferentes: (1 ) el efecto de las NRGs en miocitos L6E9 resistentes a Ia insulina y (2) el efecto de las NRGs en Ia prevención de estados de resistencia a Ia insulina.
Efectos de las NRGs en miocitos L6E9 resistentes a Ia insulina
Los mecanismos que contribuyen al desarrollo de resistencia a Ia insulina en el músculo esquelético son aún poco conocidos, pero numerosos estudios han subrayado Ia importancia de los ácidos grasos libres circulantes ("free fatty acids", FFAs) así como una conexión entre Ia resistencia a insulina y Ia acumulación intramuscular de lípidos relacionada con el exceso calórico. El aumento de los niveles plasmáticos de FFAs, característico de Ia obesidad y Ia resistencia a insulina, es suficiente para afectar de manera significativa Ia regulación del metabolismo de Ia glucosa y del metabolismo lipídico en el músculo esquelético. Estas observaciones sugirieron Ia generación de resistencia a insulina en miocitos L6E9 mediante Ia incubación crónica con FFAs. Puesto que los ácidos grasos predominantes en el torrente sanguíneo son el ácido oleico (insaturado) y el ácido palmítico (saturado), ambos fueron probados con Ia finalidad de generar resistencia a Ia insulina. Los ácidos grasos se añadieron al medio al inicio de Ia diferenciación y se midió Ia acción de Ia insulina sobre el transporte de glucosa al cabo de 72 horas. Los resultados obtenidos mostraron que Ia incubación crónica con 0.4 mM de ácido oleico no indujo una resistencia a Ia insulina significativa a pesar de aumentar enormemente el contenido intracelular de triacilglicerol (TAG), indicando que, efectivamente el ácido oleico se estaba incorporando en el miocito. Concentraciones similares de ácido palmítico llevaron a niveles considerables de muerte de los miocitos L6E9, pero utilizando una concentración más baja de ácido palmítico (0.15 mM) se llevó el cultivo a una situación de resistencia a Ia insulina pronunciada, tanto a concentraciones máxima como submáxima de insulina, así como a un incremento en Ia acumulación de TAG en los miocitos L6E9 (cfr. FIG. 6).
Estos resultados mostraron que Ia acumulación intramuscular de TAG no está necesariamente ligada a Ia resistencia a Ia insulina y que únicamente los ácidos grasos saturados provocan situaciones de resistencia a Ia insulina, sugiriendo de esta manera acciones intracelulares específicas de los FFAs. De este modo, una vez establecido un modelo de resistencia a Ia insulina en miocitos L6E9 se comprobó Ia capacidad de las NRGs para superar los efectos inhibitorios del palmitato en Ia respuesta a insulina.
Las NRGs mejoran el perfil metabólico de las células tratadas con oalmitato
En experimentos de infusión lipídica, así como en pacientes de diabetes tipo 2 resistentes a Ia insulina, existe un perfil metabólico alterado, que comprende un aumento de Ia acumulación de lípidos intramiocelular y una disminución en Ia capacidad oxidativa. A estos factores se les atribuye un papel causal en el desarrollo de Ia resistencia a Ia insulina. Por este motivo se comprobó si el tratamiento con palmitato conducía a alteraciones en el perfil metabólico de los miocitos L6E9. Puesto que las NRGs provocaban un aumento en Ia capacidad oxidativa de los miocitos L6E9, se comprobaron también los efectos de las NRGs durante las últimas 48 horas del tratamiento con palmitato.
El contenido de triglicéridos se triplicó después de 72 horas de incubación con palmitato 0.15 mM, pero los valores volvieron a los niveles control cuando se añadió al medio Hrg durante las ultimas 48 horas de incubación (cfr. FIG. 7A). El aumento en el contenido de triglicéridos mostrado por los miocitos tratados con palmitato concordaba con una marcada disminución de Ia capacidad oxidativa para Ia glucosa y el ácido palmítico (cfr. FIG. 7B y 7C). Al añadir Hrg durante las últimas 48 horas de Ia incubación, Ia capacidad de oxidar glucosa no solo se restauró, sino que además mejoró (~80%) comparado con las células del grupo control (cfr. FIG. 7B). Hrg aumentó, además, Ia capacidad de oxidar palmitato en células resistentes a Ia insulina, pero sólo recuperando los niveles control (cfr. FIG. 7C). La disminución de Ia capacidad oxidativa de las células tratadas con palmitato fue acompañada de un descenso abrupto en el contenido de muchas de las proteínas que forman parte de los complejos respiratorios, así como de CPT-1 , mientras que en otros marcadores mitocondriales, como porina o el citocromo C (cfr. FIG. 8) no se daba esta caída. Esto sugiere que el palmitato no reduce el contenido total de mitocondrias sino que altera de manera específica Ia capacidad bioenergética de Ia mitocondria.
La adición de Hrg a las células tratadas con palmitato aumentó el contenido de complejos de fosforilación oxidativa por encima de los niveles control, recuperó los niveles de CPT-1 hasta los valores control, pero, contrariamente a Io descrito al tratamiento únicamente con Hrg no aumentó los niveles de porina o de citocromo C por encima de los niveles básales, indicando que el tratamiento con palmitato altera también ciertos efectos de las NRGs. En conjunto, estos resultados sugieren que las NRGs mejoran las perturbaciones metabólicas inducidas por el palmitato.
Las NRGs mejoran Ia resistencia a Ia insulina inducida por el palmitato
Como se mostró previamente, el tratamiento con palmitato afectaba severamente Ia acción de Ia insulina sobre el transporte de glucosa. Este efecto era ya detectable a las 24 horas de tratamiento con palmitato, previo a Ia adición de NRGs (cfr. FIG. 9A) y se mantenía después de 72 horas de incubación, a concentraciones máxima y submáxima de insulina. Cuando se añaden NRGs al medio durante las últimas 48 horas de tratamiento con palmitato, se recuperaba Ia acción de Ia insulina sobre el transporte de glucosa hasta niveles control, tanto a concentraciones máxima como submáxima de insulina (cfr. FIG. 9B). En las células tratadas con palmitato, Hrg no aumentaba Ia sensibilidad a Ia insulina por encima de los niveles control. Esto puede deberse al hecho que Ia acción de las NRGs empieza cuando ya se está dando un estado de resistencia a Ia insulina. De hecho, el incremento neto en sensibilización a Ia insulina es similar en ambas situaciones, a pesar de representar valores diferentes relativo a Ia acción basal de Ia insulina (cfr. FIG. 9C). Es interesante sin embargo, que Ia inducción del transporte de glucosa mediante un tratamiento agudo de NRGs se mantenía intacto en las células tratadas con palmitato (cfr. FIG. 9D). Se muestra así, que los efectos sobre Ia estimulación del transporte de glucosa derivados del tratamiento con palmitato, son específicos de Ia insulina. Este punto es de gran relevancia puesto que (1 ) Ia estimulación del transporte de glucosa por contracción no está afectada en condiciones de resistencia a Ia insulina, reforzando Ia ¡dea que las NRGs pueden actuar como un mediador de Ia contracción en el transporte de glucosa, y (2) indica que Ia acción del palmitato no esta afectando el mecanismo molecular que dirige Ia translocación de GLUT4 sino la transducción de Ia señal de Ia insulina para este proceso.
Las NRGs previenen Ia resistencia a Ia insulina inducida por palmitato en miocitos L6E9
Finalmente los estudios se centraron en como los efectos de las NRGs incrementando Ia capacidad oxidativa y el contenido mitocondrial de los miocitos L6E9 podían prevenir Ia inducción de resistencia a Ia insulina provocada por un tratamiento agudo con palmitato. Con este propósito, se diferenciaron miocitos L6E9 durante 72 horas en presencia o ausencia de 3 pM de NRGs durante las últimas 48 horas. A continuación fueron expuestos a un tratamiento con palmitato (0.15 mM) durante 16 horas. Varios estudios en Ia literatura han subrayado como una infusión lipídica puede conducir a resistencia a Ia insulina en periodos de acción muy cortos. Puesto que el ejercicio es uno de los mejores agentes terapéuticos para Ia prevención de Ia resistencia a Ia insulina, Ia hipótesis actual es que una mayor capacidad para metabolizar FFA inducida por las NRGs podría prevenir Ia interferencia de dichos FFA sobre Ia acción de Ia insulina.
En primer lugar se examinó si el aumento en Ia capacidad oxidativa mostrado por los miocitos tratados con 3 pM de Hrg era capaz de prevenir Ia acumulación de TAG en respuesta a palmitato. Los resultados mostraron que el tratamiento con palmitato de 16 horas conducía a un aumento elevado en Ia acumulación de TAG. En los miocitos tratados previamente con Hrg pese a no afectarse significativamente Ia acumulación basal de TAG se previno parcialmente Ia acumulación de TAG en respuesta al tratamiento con palmitato (cfr. FIG. 10). A continuación se comprobó si las NRGs podían prevenir Ia inducción de resistencia a Ia insulina debida a una exposición aguda al ácido palmítico. Los resultados mostraron que una incubación aguda con palmitato afectaba de manera abrupta Ia acción de Ia insulina (cfr. FIG. 11A). Como ya se ha mostrado, el tratamiento previo con Hrg aumentaba Ia sensibilidad a Ia insulina en las células control. El tratamiento previo de las células con Hrg previno Ia aparición de resistencia a Ia insulina inducida por el palmitato (cfr. FIG. 11A). Respecto a Ia acción de Ia insulina a concentración submáxima, mientras que el descenso en el transporte de glucosa estimulado por Ia insulina debido al tratamiento con palmitato fue similar en las células control y en las células pretratadas con Hrg (cfr. FIG. 11 B), el aumento del transporte de glucosa en las células pretratadas con Hrg y sometidas al tratamiento con palmitato fue similar al de las células control no tratadas. En contraste, a concentraciones máximas de insulina, las células tratadas con Hrg estaban significativamente menos afectadas por el tratamiento con palmitato (cfr. FIG 11 B). En resumen, estos resultados indican que el tratamiento con NRGs protege contra los efectos negativos del tratamiento con palmitato a corto plazo sobre Ia acción de Ia insulina.
En conjunto, estos resultados indican que las NRGs pueden mejorar y prevenir los efectos negativos del palmitato sobre Ia estimulación del transporte de glucosa por insulina.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un producto de proteína neuregulina para Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de un estado y/o enfermedad asociados con Ia resistencia a Ia insulina en un mamífero, incluyendo un humano, donde el producto de proteína neuregulina actúa como sensibilizador de Ia insulina, y donde el estado y/o Ia enfermedad se selecciona del grupo que consiste en Ia diabetes mellitus tipo 2, un síndrome de resistencia severa a Ia insulina, un estado caracterizado por resistencia severa a Ia insulina, Ia obesidad, Ia intolerancia a Ia glucosa, Ia dislipidemia y el síndrome metabólico.
2. Uso según Ia reivindicación 1 , donde Ia enfermedad es Ia diabetes mellitus tipo 2.
3. Uso según Ia reivindicación 1 , donde Ia enfermedad es un síndrome de resistencia severa a Ia insulina, o el estado está caracterizado por resistencia severa a Ia insulina.
4. Uso según Ia reivindicación 1 , donde Ia enfermedad es Ia obesidad.
5. Uso según Ia reivindicación 1 , donde el estado es Ia intolerancia a Ia glucosa.
6. Uso según Ia reivindicación 1 , donde Ia enfermedad es Ia dislipidemia.
7. Uso según Ia reivindicación 1 , donde Ia enfermedad es el síndrome metabólico.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el producto de proteína neuregulina es un fragmento biológicamente activo de una neuregulina, comprendiendo dicho fragmento el dominio similar al factor de crecimiento epidérmico ("epidemial growth factor-like domain").
9. Uso según Ia reivindicación 8, donde Ia neuregulina se selecciona del - grupo que consiste en neuregulina-1 humana, neuregulina-1 de ratón, neuregulina-1 de rata, neuregulina-1 bovina, neuregulina-1 de pollo, neuregul¡na-1 de conejo, neuregulina-1 de hámster, neuregulina-1 de rana Xenopus laevis y neuregulina-1 de pez cebra.
10. Uso según Ia reivindicación 9, donde el fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-9.
11. Uso según Ia reivindicación 8, donde el fragmento de neuregulina comprende además el dominio similar a inmunoglobulina ("immunoglobulin- like domain").
12. Uso según Ia reivindicación 11 , donde Ia neuregulina se selecciona del grupo que consiste en neuregulina-1 humana, neuregulina-1 de ratón, neuregulina-1 de rata, neuregulina-1 bovina, neuregulina-1 de conejo, neuregulin-1 de hámster, neuregulína-1 de rana Xenopus laevis y neuregulina-1 de pez cebra.
13. Uso según Ia reivindicación 12, donde el fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18-25.
14. Uso según Ia reivindicación 8, donde Ia neuregulina se selecciona del grupo que consiste en: neuregulina-2 humana, neuregulina-2 de ratón y neuregulina-1 de rata.
15. Uso según Ia reivindicación 14, donde el fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10-12.
16. Uso según Ia reivindicación 14, donde el fragmento de neuregulina comprende además el dominio similar a inmunoglobulina ("immunoglobulin- like domain").
17. Uso según Ia reivindicación 14, donde el fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26-28.
18. Uso según Ia reivindicación 8, donde Ia neuregulina se selecciona del grupo que consiste en neuregulina-3 humana y neuregulina-3 de ratón.
19. Uso según Ia reivindicación 18, donde el fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13-14.
20. Uso según Ia reivindicación 8, donde Ia neuregulina se selecciona del grupo que consiste en neuregulina-4 humana y neuregulina-4 de ratón y neuregulina-4 de pollo.
21. Uso según Ia reivindicación 20, donde el fragmento de neuregulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-17.
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