ES2314058T3 - Metodo y producto para tratar el cancer en perros. - Google Patents
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Abstract
Uso de un análogo de vitamina D seleccionado del 1alfa, 25-(OH) 2-16-ene-23-yne-D 3 (análogo V) o bien 1alfa, 25-(OH)2-22,24-dieno-24,26,27-trihomo-D3 (EB 1089) o bien de un estereoisómero del mismo en la preparación de un medicamento oral para su uso en el tratamiento del cáncer en un perro.
Description
Método y producto para tratar el cáncer en
perros.
La presente invención se refiere al uso de un
análogo de vitamina D en la fabricación de un medicamento oral para
tratar el cáncer en perros.
Los animales domésticos de compañía o mascotas
tienen un papel importante en la vida de muchas personas y como
consecuencia de ello muchos propietarios tienen un especial cuidado
en el tratamiento de sus animales en lo que se refiere a
enfermedades importantes como el cáncer. El cáncer es una de las
principales formas de mortalidad en animales como gatos y perros, y
por lo tanto los propietarios de dichos animales desean formas de
tratamiento de esta enfermedad para incrementar su longevidad. Sería
ideal y también económico que dichos tratamientos pudieran ser
administrados por los propietarios antes que por los
veterinarios.
Los métodos actuales para el tratamiento del
cáncer en animales domésticos se centran básicamente en la resección
quirúrgica de tumores sólidos. La cirugía es cara y además no es el
tratamiento adecuado para muchos tipos de cáncer. Entre estos se
encuentran la leucemia, los linfomas, donde la cirugía obviamente no
es una opción, pero esta clase incluye tumores malignos altamente
diseminados así como aquellos con márgenes mal definidos o bien los
que aparecen en zonas inoperables.
Por lo tanto sería deseable tener una forma de
tratamiento del cáncer en perros que se pudiera administrar de
forma rutinaria por los propietarios de los animales y a la que no
se opusiera el animal. Idealmente, dicho tratamiento podría ser
administrado con el alimento del animal.
La presente invención cumple estas necesidades
aportando el uso del análogo V o EB 1089, o bien un estereoisómero
del mismo (cuyas estructuras aparecen en la figura 1) en la
fabricación de un medicamento oral para tratar el cáncer en un
perro.
La figura 1 muestra las estructuras químicas de
vitamina D_{3}, 1,25-(OH)_{2} D_{3}, EB 1089, y el
análogo V;
La figura 2 es una microfotografía (X 300) de
células SCC 2/88 coloreadas por la técnica de inmunohistoquímica
con anticuerpo receptor de anti-vitamina D
monoclonal, después del tratamiento con
1,25(OH)D_{3} (izquierda) o con el vehículo
(derecha);
La figura 3 es una microfotografía (X 300) de
células SCC 2/88 coloreadas por inmunohistoquímica con proteínas
(PTHrP) relacionadas con la hormona paratifoidea
anti-humana de conejo (izquierda) y antisuero no
específico (derecha);
La figura 4 es un histograma que muestra el
crecimiento de las células SCC 2/88 después de la adición de
diferentes concentraciones de 1,25(OH)_{2}D_{3} y
de sus análogos al medio de cultivo;
La figura 5 es una microfotografía de contraste
de fases (X 100) que muestra la morfología de las células SCC 2/88
que crecen en las placas de 6 pocillos y se han tratado con (A)
vehículo, (B)1,25-(OH)_{2}D_{3}; (C)EB
1089; y (D) análogo V;
La figura 6 es una microfotografía de contraste
de fases (X 100) que muestra la morfología de las células SCC 2/88
que crecen en las placas de 6 pocillos el día 3 en ausencia de un
análogo de vitamina D.
La figura 7 es un histograma que muestra la
producción de PTHrP que se mide por la liberación de PTHrP (pg) por
el ADN (\mug) en las células de SCC 2/88 tratadas con análogos de
vitamina D en comparación con el control tratado con el
vehículo;
La figura 8 muestra un análisis por el método
Northern blot de la expresión del ARN mensajero en PTHrP en las
células SCC 2/88 tratadas con el vehículo
1,25(OH)_{2}D_{3}, TGF-\beta,
1,25(OH)_{2}D_{3} y TGF-\beta,
anti-TGF-\beta,
1,25(OH)_{2}D_{3} y
anti-TGF-\beta;
La figura 9 es un histograma que muestra la
expresión del ARN mensajero en PTHrP en las células tratadas con
1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7}M a las 24 horas y en
las células tratadas con 1,25(OH)_{2}D_{3}
10^{-7}M y TGF-\beta (1,5 ng/ml) a las 3 y 6
horas en comparación con el control tratado con el vehículo;
La figura 10 es un análisis por el método
Northern blot en función del tiempo de la expresión del ARN
mensajero en PTHrP en las células SCC 2/88 tratadas con el vehículo
o bien 1,25(OH)_{2}D_{3};
La figura 11 muestra una
SDS-PAGE y un análisis por el método
Western-blot para la involucrina en células SCC
2/88 con EB 1089(10^{-7}M) y V análogo (10^{-7}M y
10^{-9}M).
La vitamina D muestra una gama amplia de
actividades fisiológicas, que incluyen la estimulación del sistema
inmunitario, movilización del calcio del sistema esquelético y la
diferenciación celular, que han sugerido su uso para el tratamiento
de la hipertensión, la diabetes mellitus, las enfermedades
autoinmunitarias, el SIDA, las reacciones "injerto contra
huésped".
Para la presente invención es de particular
importancia la 1,25(OH)_{2}D_{3} que también
estimula la diferenciación de células e inhibe la proliferación
celular excesiva tal como ocurre en el cáncer. La patente americana
número 4.391.802 editada por Suda y colaboradores revela que los
compuestos de 1-alfa-hidroxivitamina
D inducen la diferenciación de las células de leucemia frente a los
macrófagos no malignos (monocitos) y son útiles en el tratamiento
de la leucemia en seres humanos. En otro ejemplo, Skowronski y
colaboradores informaban de las acciones
anti-proliferantes y diferenciantes de los análogos
de vitamina D_{3} en las estirpes celulares derivadas de los
cánceres de próstata humanos (Skowronski y cols., 1995). Además, la
patente americana Nº 5.795.882 describe el uso de la
1,25(OH)_{2}D_{3} en la preparación de
medicamentos orales para el tratamiento del cáncer en
mamíferos.
En cuatro estirpes celulares de carcinoma
anaplástico tiroideo, la 1,25-(OH)_{2}D_{3} provocaba el
crecimiento celular difásico en tres de las cuatro estirpes
celulares, mientras que el análogo 22-oxacalcitriol
de la vitamina D ostraba una inhibición dependiente de la dosis del
crecimiento celular en las cuatro estirpes celulares. (Suzuki y
cols. 1999) La 1,25-(OH)_{2}D_{3} presenta una actividad
antiproliferativa en algunos humanos y estirpes celulares del
cáncer de hígado de rata pero otras estirpes celulares resisten su
acción (Pourgholami y cols 2000).
La 1,25-(OH)_{2}D_{3} inhibe también
el crecimiento celular y promueven la diferenciación de forma
dosis-dependiente en una estirpe celular de cáncer
de próstata humano (Mofatt y colaboradores 1999). La
1,25-(OH)_{2}D_{3} tiene unos efectos antitumorales
significativos en el modelo tumoral (SCC) del carcinoma celular
escamoso murino in vitro e in vivo (Hershberger y
cols. 1999).
Además del efecto antiproliferativo de la
1,25(OH)_{2}D_{3} en las células tumorales, la
1,25(OH)_{2}D_{3} y sus análogos estimulan la
diferenciación en el carcinoma celular escamoso (McElwain y cols.
1995), (Kornfehl y cols. 1996), (Yu y cols 1995), (Hershberger y
cols 1999).
En la estirpes celulares derivadas de los
caninos, el tratamiento de cuatro estirpes celulares de osteosarcoma
con 1,25(OH)_{2}D_{3} aumenta la actividad de la
fosfatasa alcalina en una estirpe celular, la producción de
osteocalcina en dos estirpes y la producción de colágeno tipo I en
las tres estirpes (Noxaki y cols. 1999). En una estirpe celular de
carcinoma escamoso canino (SCC 2/88), la
1,25-(OH)_{2}D_{3} estimula la producción de la proteína
relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP), principal causante
de la hipercalcemia humoral del cáncer (Merryman y cols.,
1993).
Los solicitantes han averiguado que la
1,25(OH)_{2}D_{3}, la
22,24-dieno-24a, 26a,
27a-trihomo-1-alfa,25-dihidroxivitamina
D3 (EB 1089) y la
1,25-dihidroxi-16-ene-23-ine-vitamina
D (análogo V) inhiben la proliferación celular in vitro en
la estirpe celular SCC 2/88 derivada del canino en una concentración
de 10^{-7}M, mientras que la EB 1089 inhibe el crecimiento
celular de forma significativa en concentraciones del orden de
10^{-7}M y 10^{-9}M (en un tratamiento de 3 días de
duración).
La figura 1 muestra las estructuras químicas de
la vitamina D_{3}, de la 1,25(OH)_{2}D_{3}, la
1a,25(OH)_{2}-16-eno-23-ino-vitamina
D (análogo V), y la
1a,25-dihidroxi-22,24-dieno-24,26,27-trihomo
vitamina D(EB 1089).
La figura 2 es una microfotografía (X 300) de
las células 2/88 coloreadas por inmunohistoquímica con anticuerpo
receptor de la vitamina D (izquierda) y tratadas con antisuero no
específico. El lateral de mano izquierda de la figura 2 muestra la
expresión celular del receptor de vitamina D, mostrando un
etiquetaje positivo en todos los núcleos de las células tumorales
(puntas de flecha). La reacción positiva de la peroxidasa en los
núcleos de las células del carcinoma establece que estas células
derivadas del carcinoma celular escamoso canino tienen receptores
para la vitamina D. La sección de control (derecha) después de la
reacción con antisuero no específico en el lugar de un anticuerpo
primario específico muestra la ausencia de producto de reacción en
los núcleos celulares (puntas de flecha).
La figura 3 es una microfotografía (X 300) de
las células 2/88 coloreadas por inmunohistoquímica con proteína
relacionada con la hormona paratiroidea anti-humana
de conejo (izquierda) (PTHrP), que muestra la reacción positiva
para la PTHrP en el citoplasma celular (puntas de flecha) y las
células SCC 2/88 (derecha) después de la reacción con antisuero no
específico en lugar de un anticuerpo primario específico, lo que
demuestra la ausencia de producto de reacción en el citoplasma
celular.
La figura 4 es un histograma que muestra el
efecto de las diferentes concentraciones de la
1,25(OH)_{2}D_{3} y de sus análogos en el
crecimiento de las células SCC 2/88. La adición de un análogo de
vitamina D al medio de cultivo inhibía el crecimiento celular de
forma dosis-dependiente. El crecimiento de las
células SCC 2/88 reducía de forma significativa la concentración de
ADN (\mug/\mul) en 10^{-7}M de
1,25(OH)_{2}D_{3} (p<0,01), EB
1089(p<0,001), y análogo V(p<0,001) y en
10^{-9}M de EB 1089(p<0,05).
La figura 5 y la figura 6 son microfotografías
de contraste de fases (X 100) de células SCC 2/88 el día 3 en
presencia y ausencia (respectivamente) de
1,25(OH)_{2}D_{3} y de sus análogos en
concentraciones de 10^{-7}M y 10^{-9}M, lo que demuestra que no
existen diferencias significativas en la morfología celular.
La figura 7 es un histograma que muestra la
producción de PTHrP si se mide por la liberación de PTHrP (pg) por
el ADN (\mug). Los niveles de PTHrP (pg)/ADN (\mug) aumentaban
de forma significativa el día 3 en los tres grupos tratados con
sustrato (p<0,05) cuando se trataban con vitamina D 10^{-7}M,
en comparación con el control tratado con el vehículo. Para una
concentración 10^{-9}M ningún análogo de vitamina D producía una
diferencia significativa en la producción de PTHrP, medida por la
PTHrP (pg)/ADN (\mug).
Las células SCC 2/88 producían la PTHrP, que se
asocia a la hipercalcemia humoral del cáncer, en un nivel que
depende de la duración del cultivo y de la confluencia de las
células (Werkmeister y cols. 1993). La
1,25(OH)_{2}D_{3}, la EB 1089 y el análogo V
promueven la producción de PTHrP en la estirpe celular canina SCC
2/88 (Merryman y cols. 1993). Por el contrario, en las estirpes
celulares escamosas humanas, la 1,25(OH)_{2}D_{3}
inhibe la producción de PTHrP, elimina la transcripción genética de
la PTHrP e impide el desarrollo de la hipercalcemia humoral del
síndrome maligno (Yu y cols. 1995), (Falzon 1997), (Abe y cols.
1998, E1 Abdaimi y cols. 1999). Los efectos de los análogos de la
vitamina D en las células de las diferentes especies son, por lo
tanto, impredecibles.
La 1,25(OH)_{2}D_{3} se usaba
para investigar la expresión del ARN mensajero de la PTHrP. Los
factores de crecimiento transformantes (TGF-alfa,
TGF-beta) y la interleucina-1
(IL-1) son producidos junto con la PTHrP en la
hipercalcemia humoral del cáncer. En particular, la
TGF-beta se copurificaba con la PTHrP de muchos
cánceres humanos y animales asociados a la hipercalcemia humoral del
cáncer (Merryman y cols. 1994), (Insogna y cols, 1987). Por
consiguiente, también comparábamos los efectos de la
TGF-beta y de la
anti-TGF-beta en la expresión del
ARNm de la PTHrP con la vitamina D biológicamente activa,
1,25(OH)_{2}D_{3}.
En las células SCC 2/88, la
TGF-beta incrementa la producción de la PTHrP
mediante una regulación controlada de modo autocrino, lo que agrava
la importancia de la hipercalcemia (Merryman y cols, 1993)(Merryman
y cols, 1994). De un modo correspondiente, los niveles de ARNm de
PTHrP en las células SCC2/88 tratadas con TGF-beta
aumentan 2 hasta 20 veces tras 24 horas si se comparan con el
control, tratado con el vehículo, frente a las células tratadas con
anti-TGF-beta. Sin embargo, los
niveles de ARNm de PTHrP en células tratadas con
1,25(OH)_{2}D_{3} y TGF-beta
aumentaban menos que en las células tratadas con el
TGF-beta solo. Las células tratadas con
1,25(OH)_{2}D_{3} y TGF-beta
presentaban unos niveles de ARNm de PTHrP 1 a 3 veces superiores que
las células tratadas solamente con
1,25(OH)_{2}D_{3}.
Los niveles de ARNm de PTHrP entre el grupo tratado con 1,25(OH)_{2}D_{3} y el control tratado con el vehículo no diferían. La 1,25(OH)_{2}D_{3} y la TGF-beta pueden por tanto regular la producción de PTHrP y la expresión del ARNm en las células SCC 2/88, debido en parte a la elevada transcripción genética. Esto era básicamente evidente a las 6 hasta 12 horas posteriores al tratamiento. Además, la 1,25(OH)_{2}D_{3} probablemente influye en la TGF-beta reduciendo la expresión del ARNm de la PTHrP,
Los niveles de ARNm de PTHrP entre el grupo tratado con 1,25(OH)_{2}D_{3} y el control tratado con el vehículo no diferían. La 1,25(OH)_{2}D_{3} y la TGF-beta pueden por tanto regular la producción de PTHrP y la expresión del ARNm en las células SCC 2/88, debido en parte a la elevada transcripción genética. Esto era básicamente evidente a las 6 hasta 12 horas posteriores al tratamiento. Además, la 1,25(OH)_{2}D_{3} probablemente influye en la TGF-beta reduciendo la expresión del ARNm de la PTHrP,
\hbox{pero no directamente disminuyendo la expresión
del ARNm de la TGF-beta.}
La figura 8 muestra un análisis con el método de
Northern blot de la expresión del ARNm de la PTHrP en las células
SCC 2/88 tratadas con el vehículo, la
1,25(OH)_{2}D_{3}, la TGF-beta,
1,25(OH)_{2}D_{3} y TGF-beta, la
anti-TGF-beta, la
1,25(OH)_{2}D_{3} y la
anti-TGF-beta. El ARNm de PTHrP se
detectaba en todo momento (0, 3, 6,12 y 24 horas). Todas las
estirpes se estandarizaban con el control de carga del ARNm de la
glíceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa.
La figura 9 es un histograma que muestra
aproximadamente aumentos de 1 a 2 veces el ARNm de PTHrP en las
células tratadas con 1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7}M
al cabo de 24h y en las células tratadas con
1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7}M y
TGF-beta (1,5 ng/ml) al cabo de 3 y 6 horas en
comparación con el control tratado con el vehículo. Los niveles de
ARNm de PTHrP en las células tratadas con TGF-beta
(1,5 ng/ml) mostraban un incremento mayor de 5 a 20 veces, al cabo
de 6, 12 y 24 horas en comparación con el control tratado con el
vehículo. De un modo similar, los niveles de ARNm en PTHrP en las
células tratadas con 1,25(OH)_{2}D_{3} y
TGF-beta (1,5 ng/ml) mostraban un aumento de 10 a
15 veces mayor a las 12 y 24 horas, respectivamente, en comparación
con el control tratado con el vehículo. Por el contrario, las
células tratadas con anti-TGF-beta
(5 \mug/ml) o con una combinación de
1,25(OH)_{2}D_{3}(10^{-7}M) y
anti-TGF-beta (5 \mug/ml)
presentaban ligeros descensos en la expresión del ARNm de PTHrP a
las 24 horas si se compara con el control tratado con el
vehículo.
La figura 10 en un análisis según el método
Northern blot de la expresión del ARNm de la
TGF-beta en las células SCC 2/88 tratadas con el
vehículo y la 1,25(OH)_{2}D_{3}. El ARNm de
TGF-beta se detectaba en todos los momentos (0, 3,
6, 12 y 24 horas) y la expresión en las células tratadas con
1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7}M no difería de forma
significativa de la de las células de control tratadas con el
vehículo.
La figura 11 muestra una
SDS-PAGE y el análisis según el método Western blot
para la involucrina en las células SCC 2/88 tratadas con EB
1089(10^{-7}M) y con el análogo V (10^{-7}M y
10^{-9}M). Las células tratadas con EB 1089 o con el análogo V (a
10^{-7}M en cada caso) daban bandas en la página de la
nitrocelulosa (peso molecular aprox. 66 kDa) que se enlazaban a un
anticuerpo monoclonal de ratón frente a la involucrina. Las bandas
reactivas de anti-involucrina para EB 1089
(10^{-7}M) y para el análogo V (10^{-7}M) se definían de forma
más débil que las del control tratado con el vehículo. Las bandas
reactivas de anti-involucrina de las células
tratadas con análogo V 10^{-9}M eran más intensas que las de los
otros grupos tratados.
Los análogos de vitamina D inhiben el
crecimiento celular, de acuerdo con las determinaciones de
involucrina. La involucrina, un precursor del sobre cornificado
epidérmico, es un marcador para el epitelio escamoso y presenta una
diferenciación terminal tal que los descensos en la expresión de la
involucrina indican una marcada diferenciación celular. El
tratamiento de las células SCC 2/88 post-confluentes
con 1,25(OH)_{2}D_{3}, EB 1089 y el análogo V
(para una concentración 10^{-7}M) y con
1,25(OH)_{2}D_{3} y EB
1089(10^{-9}M)durante hasta 7 días disminuía la
expresión de la involucrina.
El tratamiento de las células con EB 1089
10^{-7}M y el análogo V daba lugar a unas bandas reactivas de
anti-involucrina sustancialmente ausentes o débiles
si se compara con las células tratadas con el vehículo
exclusivamente. El tratamiento de las células con EB 1089 10^{-9}M
también presentaba unos niveles reducidos de involucrina mediante
el análisis con el método Western Blot. Además, el tratamiento con
EB 1089 o el análogo V (cada uno de ellos 10^{-7}M) disminuía de
forma significativa el crecimiento celular (p<0,001); el
tratamiento con EB 1089 (10^{-9}M) reducía el crecimiento celular
en un nivel de confianza inferior (p<0,05). En contraste, el
tratamiento con el análogo V (10^{-9}M) daba una banda reactiva
anti-involucrina más intensa sin inhibición
significativa del crecimiento celular.
Los solicitantes han demostrado pues que los
análogos de vitamina D inhiben la proliferación y promueven la
diferenciación en las células cancerígenas de los caninos. La
administración parenteral de los análogos de vitamina D a animales
domésticos necesitaría la implicación de un veterinario, lo que
sustancialmente aumentaría el gasto. Sin embargo, los solicitantes
han averiguado que la administración intestinal de análogos de
vitamina D es también eficaz en la terapia en perros, y que
incorporar los análogos de vitamina D al alimento del perro es una
forma eficaz y práctica de administrar de forma rutinaria los
análogos de vitamina D a un animal doméstico que padece cáncer. En
la práctica, la eficacia terapéutica contra el cáncer de un alimento
que contiene vitamina D se evalúa mediante métodos bien conocidos
por los expertos en esa técnica. Por ejemplo, Valierus y
colaboradores explican con detalle la metodología empleada para
evaluar una variedad de terapias anticancerígenas y todo ello se ha
incorporado aquí como referencia (Valerius y cols. 1997).
El análogo de vitamina D incorporado al alimento
del perro puede ser tratado de acuerdo con los métodos
convencionales para producir agentes farmacéuticos que se
administrarán a pacientes, por ejemplo, en las mezclas con
excipientes convencionales como las sustancias portador orgánicas o
inorgánicas aceptables desde el punto de vista farmacéutico para su
administración oral, que no reaccionan de modo perjudicial con los
compuestos activos. Los portadores aceptables desde el punto de
vista farmacéutico incluyen pero no se limitan a agua, soluciones
salinas (tampón), alcoholes, goma arábiga, aceites minerales y
vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina,
carbohidratos como lactosa, amilasa o almidón, estearato de
magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite
perfumado, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres
de ácidos grasos del pentaeritritol, hidroximetilcelulosa y
polivinilpirrolidona. Los preparados farmacéuticos se pueden
mezclar, si se desea, con agentes auxiliares, por ejemplo,
lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes,
sales para influir en la presión osmótica, tampones, compuestos
activos aromáticos y/o colorantes, aromatizantes. Las formas de
dosificación pueden contener también adyuvantes, como adyuvantes de
estabilización o conservación. Estos pueden contener también otras
sustancias válidas desde el punto de vista terapéutico o pueden
contener más de uno de los compuestos especificados aquí y en las
reivindicaciones.
En general, la dosificación diaria de los
compuestos conforme a la invención es generalmente de 0,025 a unos
500 nmol/kg de peso corporal del paciente, y preferiblemente de unos
0,025 a aproximadamente 100 nmol/kg. En una configuración más
preferida, la dosificación diaria es de aproximadamente 0,025 a unos
10 nmol/kg de peso corporal del paciente y en una configuración más
preferida la dosificación diaria oscila entre 0,025 y
aproximadamente 1 nmol/kg de peso corporal del paciente.
Además, los expertos en la materia apreciarán
también que dichas dosificaciones puedan ser encapsuladas en
sistemas de suministro con liberación directa o retardada, mantenida
como un sistema de aporte de liposomas, los polisacáridos que
exhiben un mecanismo de liberación lenta, los implantes poliméricos
o las microesferas, así como aquellos donde el principio activo se
encuentra protegido de forma adecuada por uno o más revestimientos
degradables, por ejemplo, por microencapsulado, revestimiento
entérico, múltiples revestimientos etc.. y dichos medios aportan
una dosis continua de las composiciones que contienen. Por ejemplo,
un revestimiento entérico es aquel que resiste a la desintegración
en el jugo gástrico.
Se apreciará que las cantidades preferidas de
análogo activo en un caso específico variarán de acuerdo con el
compuesto específico que se utiliza, las composiciones especialmente
formuladas, el tipo de aplicación y los lugares especiales que
están siendo tratados. Las dosificaciones pueden ser determinadas
usando consideraciones convencionales, por ejemplo, mediante la
comparación habitual de las diferentes actividades de los compuestos
y de un agente conocido, por ejemplo, por medio de un protocolo
farmacológico convencional apropiado.
Las dosis específicas para cada paciente en
particular dependerán de una amplia gama de factores, por ejemplo,
de la eficacia del compuesto específico empleado, de la edad, del
peso corporal, del estado general de salud, del sexo del paciente,
de la dieta, del tipo y de la regulación de la administración, de la
velocidad de secreción, y de los medicamentos utilizados de forma
combinada y de la gravedad de los trastornos a los que se aplica la
terapia.
Las formas de dosificación pueden contener
también adyuvantes así como otras sustancias valiosas desde el
punto de vista terapéutico o bien pueden contener más de uno de los
compuestos especificados aquí. Por consiguiente, otro aspecto en el
objetivo de la presente invención es la administración de dosis
eficaces de los compuestos de la presente invención junto con la
administración de otras hormonas o bien otros agentes que se ha
demostrado que son eficaces en el tratamiento de las enfermedades y
los trastornos aquí descritos.
Por ejemplo, los compuestos de la presente
invención son administrados de forma apropiada conjuntamente con
los agentes conocidos para reducir las enfermedades o los trastornos
óseos. Dichos agentes óseos pueden incluir estrógenos conjugados o
bien sus equivalentes, antiestrógenos, calcitonina, bifosfonatos,
suplementos de calcio, agonistas receptores del calcio, cobalamina,
toxina pertussis, boro, dehidroespiandroesterona (DHEA) y otros
factores óseos como el factor beta de crecimiento transformante, la
activina o la proteína morfogénica ósea.
Tal como aquí se ha dispuesto se trata de
compuestos de la presente invención que son administrados
conjuntamente con agentes citotóxicos conocidos. Dichos agentes
incluyen fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina,
5-flúor-uracilo, melfalan,
hidroxiurea, mitomicina, idarubicina, metotrexato, adriamicina,
daunomicina, ciclofosfamida, doxorubicina (hidroxidaunorubicina),
vincristina (oncovina) y pregnisona. Se ha anticipado que la 1
alfa-hidroxivitamina D de la presente invención
utilizada en combinación con varios fármacos anticancerígenos puede
dar lugar a un efecto citotóxico significativamente elevado en las
células cancerígenas, aportando pues un mayor efecto terapéutico.
De forma específica, al obtenerse un efecto inhibidor del
crecimiento significativamente superior con las combinaciones
anteriormente reveladas si se utilizan concentraciones inferiores de
fármacos anticancerígenos en comparación con los tratamientos en
los que los fármacos se usan solos, se observa que existen pruebas
para administrar una terapia en la que los efectos secundarios
asociados a los fármacos anticancerígenos sean inferiores frente a
los normalmente observados con los fármacos utilizados solos en
dosis superiores. Los márgenes posibles de dosificación de estos
segundos agentes anticancerígenos administrados a la vez son
aproximadamente de 0,1 \mug a 1 \mug/kg/día.
Los compuestos de acuerdo con la presente
invención se administran de forma adecuada con agentes
antinflamatorios conocidos. Dichos agentes incluyen tanto agentes
antinflamatorios esteroideos (por ejemplo, corticosteroides) como
no esteroideos (por ejemplo, salicilatos, naproxeno). Se adelanta
que un compuesto de la presente invención utilizado en combinación
con estos fármacos anti-inflamatorios puede dar
lugar a una actividad anti-inflamatoria
significativamente elevada que proporciona un efecto terapéutico
elevado.
Para fines de tratamiento, los compuestos
activos de la invención se podrán formular como soluciones en
disolventes inocuos, o bien como emulsiones, suspensiones o
dispersiones en disolventes o portadores inocuos adecuados, o bien
como tabletas o cápsulas que contengan portadores sólidos conforme a
los métodos convencionales ya conocidos. Dichas formulaciones
pueden contener también otros excipientes no tóxicos, aceptables
desde el punto de vista farmacéutico como los estabilizantes,
anti-oxidantes, ligantes, agentes colorantes o bien
emulsionantes o modificantes del sabor.
La presente invención se explica a continuación
con los ejemplos siguientes que no se deberían crear limitando el
alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La vitamina D y sus análogos. Se preparaba una
solución madre 1 mM de 1,25(OH)_{2}D_{3} y cada
uno de sus análogos en etanol absoluto y se protegían de la luz. La
concentración máxima de etanol en el cultivo (\leq0,1%) no
influía en el crecimiento o diferenciación celular. Las soluciones
madre de cada uno de los compuestos se preparaban a base de etanol
y medios E Williams (W ME) para concentraciones de 10^{-7}M,
10^{-9}M y 10^{-11}M justo antes del cultivo.
Cultivo celular. Las células SCC 2/88 crecían en
W ME complementado con suero fetal bovino al 10%, 50 \mug/ml de
gentamicina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Gibco
BRL, Grand Island, NY), toxina de cólera 0,1 nM (Calbiochem, la
Jolia, CA) y L-glutamina 2 mM (Gibco BRL, Grand
Island, NY) a 37ºC, 5% de CO_{2}, atmósfera humidificada. Las
células se cultivaban con una densidad de 10^{5} células/pocillo
en placas de cultivo de 6 pocillos (Becton Dickinson, franklin
Lakes, NJ) y crecían durante 24 horas antes de empezar los
experimentos (día 0). Al cabo de un periodo de incubación de 24
horas a 37ºC, el medio que contiene el vehículo (etanol), el
1,25(OH)_{2}D_{3} o sus análogos (EB 1089 y
análogo V) se añadía en concentraciones de 10^{-7}M, 10^{-9}M y
10^{-11}M y se modificaba cada día hasta un máximo de 3 días. Cada
experimento se realizaba por triplicado. Los medios se recogían
cada 24 horas durante 3 días y se almacenaban a -70ºC hasta que se
analizaba el contenido de PTHrP mediante un ensayo
inmunoradiométrico. Al final del día 3, las células se recuperaban
de las placas de cultivo de 6 pocillos usando 250 \mul de GITC
(isotiocianato de guanidina 4M, sarcocil al 0,5%, citrato sódico 25
mM)por pocillo y se almacenaban a -70ºC hasta que se
realizaba un análisis de la proliferación celular mediante un
análisis de la concentración de ADN fluorescente.
Para el aislamiento del ARN, las células SCC
2/88 (2x10^{6} células/mL) se cultivaban en crisoles de cultivo
tisular de 90 mm (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y se deja
que crecieran hasta una confluencia del 70% en el medio W ME que
contiene un 10% de FBS. Las células se incubaban en el medio sin FBS
durante 24 horas antes del periodo de tratamiento. Las células se
trataban con 1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7}M, 1,5
ng/ml de TGFbeta y 5 \mug/ml de anti-TGFbeta
durante 0, 3, 6 y 12 horas. Las células se lavaban (solución salina
tamponada con fosfato), tripsinizaban y almacenaban a -70ºC hasta
que se efectuaba el análisis por el método Northern blot.
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido de ADN de los lisados celulares se
determinaba mediante fluorimetría del ADN utilizando un rector de
placa fluorescente y un analizador (Laboratorios IDEXX Inc.,
Westbrook, ME) y colorante 33258 de Hoechst (Hoefer Scientific
Instruments, San Francisco, CA)El AND del timo de ternero
(100 \mug/ml) servía de control de calibración.
\vskip1.000000\baselineskip
Todo el ARN se aislaba usando un estuche de
aislamiento del ARN Purescript® (Gentra systems, Mineapolis, MN)
según los procedimientos recomendados por el fabricante. Cantidades
similares de cada muestra de ARN (20 \mug cargados en cada línea)
se separaban en un gel de formaldehído de agarosa del 1,2% y se
transferían a una membrana de nylon (Poll Biosupport, East Hills,
NY). El método de Northern blot o de transferencia se realizaba
usando procedimientos estándar (Sambrook y cols. 1989). El soluto
transferido se hibridaba con una muestra de ADNc marcada con
^{32}P (productos NEN, Inc. Boston, MA). La membrana de nylon se
lavaba dos veces con una solución de 2 veces la solución tampón
estándar de citrato sódico y un 0,1% (p/v) de dodecilsulfato sódico
a temperatura ambiente durante 15 minutos, y luego se lavaba una
vez con una solución de 0,1x solución estándar salina tampón citrato
y 0,1% de dodecilsulfato sódico al 0,1%(p/v) durante 30 minutos a
60ºC con un lavado riguroso. Posteriormente, la membrana se exponía
usando una pantalla sensor de imágenes. Tras la exposición, la
membrana se deshacía y se hibridaba con una muestra de ADNc de
glíceraldehido 3-fosfatodeshidrogenasa para
normalizar la carga de
ARN.
ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaba el contenido en PTHrP por
triplicado y los días 0, 1, 2 y 3 en el medio (200 \mul) recogido
de las células tratadas con el vehículo, con
1,25(OH)_{2}D_{3} o bien con sus análogos (en
concentraciones de 10^{-7}M y 10^{-9}M). La PTHrP se medía
usando un equipo de ensayo inmunoradiométrico (DiaSorin Corp.,
Stillwater, MN) con PTHrP 1-84 recombinante humano
para los estándares y controles. El ensayo inmunoradiométrico se
realizaba enlazando el anticuerpo
anti-PTHrP1-40 a las perlas de
poliestireno y marcando el anticuerpo anti-PTHrP
57-80 con 125I. Las muestras se incubaban con los
anticuerpos y las perlas de poliestireno se lavaban luego para
eliminar cualquier anticuerpo marcado no enlazado. La radioactividad
remanente del anticuerpo marcado no ligado se medía con un contador
de radiación gamma. El contenido en PTHrp se medía usando un
programa GraphPadPrism^{TM} (GraphPad software Inc.,
San Diego, CA).
San Diego, CA).
Procedimiento de gránulos celulares para la
coloración inmunohistoquímica. Las células SCC 2/88 crecían del
orden de 8-9x10^{6} células en placas para el
cultivo tisular de 10 mm. Las células se tripsinizaban y
centrifugaban a 3000 G, 4ºC durante 10 minutos. Se aspiraba el
sobrenadante para separarse de los gránulos celulares. Se añadía
agarosa disuelta para mantener las células juntas. Inmediatamente,
los gránulos se fijaban en 2-metilbutano en
nitrógeno líquido durante 20 segundos y luego se colocaban en el
fijador (0,5% de glutaraldehido en etanol absoluto) durante la
noche a -70ºC. Los gránulos se deshidrataban en etanol absoluto
durante una hora y en acetona dos veces durante 30 minutos,
respectivamente. Los gránulos se incrustaban y cortaban en un tamaño
de 5 \mum para su evaluación inmunohistoquímica.
Inmunohistoquímica. La coloración para la
distribución del receptor de vitamina D se realizaba incubando
respectivamente con un 5% de suero caprino normal en solución
salina tamponada de fosfato (pH 7,4) durante 30 minutos, anticuerpo
primario-anticuerpo monoclonal de rata frente al
receptor de vitamina D (Chemicon Internacional Inc., Temecula, CA)
1:50 a 4ºC durante la noche, anticuerpo de cabra
secundario-anti-rata IgG (Chemicon
Internacional Inc.,Temecula, CA) 1:20 en solución salina tamponada
de fosfato durante 30 minutos,
peroxidasa-anti-peroxidasa de rata
(PAP)(Chemicon Internacional Inc., Temecula, CA) 1:200 en suero
caprino normal al 1% en solución salina tamponada de fosfato
durante 30 minutos, y un 0,05% de diaminobencidina y un 0,01% de
peróxido de hidrógeno en tampón tris 0,05M durante 5 minutos. Las
extensiones se lavaban entre etapa y etapa con solución salina
tamponada de fosfato, luego se deshidrataban, se trataban con
aqua-Mount y se visualizaban mediante microscopía
óptica.
Para la distribución de la PTHrP la coloración
se efectuaba bloqueando con un 3% de H_{2}O_{2} durante 20
minutos e incubando respectivamente con un 2% de suero de caballo
normal en solución salina de fosfato tamponada durante 20 minutos,
anticuerpo primario de conejo con PTHrP anti-humana
(productos de investigación oncogénica, Cambridge, MA) 1:100 en
diluyente de anticuerpo primario a 4ºC por la noche, anticuerpo
secundario biotinilado con IgG de cabra anti-conejo
(Calbiochem, La Jolia, CA) 1:500 en solución salina tamponada de
fosfato durante una hora, complejo de
avidina-biotina (Pierce, Rockford, IL) durante 30
minutos y diaminobencidina durante 5 minutos. Las extensiones se
lavaban entre etapa y etapa con solución salina tamponada de fosfato
y agua destilada, luego se deshidrataban y trataban con
aqua-Mount y se visualizaban mediante microscopía
óptica.
Diferenciación celular. La involucrina se
extraía de las células SCC 2/88 cultivadas que crecían en frascos
de cultivo de 175 cm^{2} (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)
durante una semana. Las células tras la fase de confluencia se
trataban con un vehículo, 1,25(OH)_{2}D_{3}, EB
1089, o bien V análogo en concentraciones de 10^{-7}M y
10^{-9}M durante 7 días. Las células se lavaban y liberaban del
frasco de cultivo con solución salina tamponada de fosfato que
contenía EDTA 20 mM. Las células se deterioraban con un sonificador
Branson (Branson Ultrasonic Corporation, Danbury, CT) en un ajuste
de 6 durante 3x30 segundos y se centrifugaban a 100.000 G durante
30 minutos a 10ºC. El sobrenadante (citosol) se preparaba al 10% en
glicerina y 62,5 mM en tris-HCl (pH 6,8) y se
calentaba durante 10 minutos a 100ºC. Las proteínas desnaturalizadas
se eliminaban por centrifugación a 15.000 G durante 15 minutos. La
involucrina del sobrenadante se recogía almacenada a -70ºC hasta
que se realizaba el análisis según el método Western blot.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas extraídas (20 \mug) se separaban
mediante electroforesis por medio de un gel de
SDS-poliacrilamida de dodecilsulfato sódico al 7,5%
y se transferían a la membrana de nitrocelulosa usando una técnica
de transferencia semi-seca (Bio-Rad
laboratories, Hercules, CA). Luego la membrana se bloqueaba en
solución de bloqueo (10% leche seca, 0,05% Tween 20 en solución
salina tamponada de fosfato) durante la noche a 4ºC. La membrana
prebloqueada se incubaba en anticuerpos monoclonales de ratón
frente a la involucrina (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ)
1:500 durante una hora y se lavaba de forma extensiva en PBS (pH
7,4) que contiene un 0,05% de Tween 20. El soluto
electrotransferido se incubaba luego en IgG
anti-ratón de cabra (peroxidasa de rábano
picante)(Bio-Rad laboratories, Hercules,
CA)1:500 durante una hora. Tras un posterior lavado en
solución salina tamponada de fosfato que contiene un 0,05% de Tween
20, el soluto se desarrollaba durante 1 minuto en el sustrato de
quimioluminiscencia LumiGLO (Kirkegaard y Perry Laboratories,
Gaithersburg, MD) y luego se exponía a una película de rayos X
durante 1-5 segundos. Tras la exposición, la
membrana se deshacía y se incubaba con anti-beta
actina monoclonal de ratón (Sigma, Saint-Louis, MO)
para normalizar la carga de proteínas. Alphalmager^{TM} (Alpha
Innotech Corporation, San Leandro) medía la densidad de las bandas
de involucrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos numéricos de la producción de PTHrP y
los estudios de la concentración del ADN se analizaban mediante un
análisis de varianza (ANOVA) y un test de comparaciones múltiples de
Turkey. Los datos del PTHrP (pg) por ADN (\mug) se analizaban
mediante un ensayo t y ANOVA. El nivel de significancia se
establecía en p<0,05, p<0,01 o p<0,001 usando el programa
Instat (Graph PAD software Inc. San Diego, CA). Los resultados se
expresaban como la media \pm error estándar de la media (SEM)
(n=3). Todos los grupos de tratamiento se analizaban por
triplicado.
Claims (10)
1. Uso de un análogo de vitamina D seleccionado
del 1\alpha,
25-(OH)_{2}-16-ene-23-yne-D_{3}
(análogo V) o bien 1\alpha,
25-(OH)_{2}-22,24-dieno-24,26,27-trihomo-D_{3}
(EB 1089) o bien de un estereoisómero del mismo en la preparación
de un medicamento oral para su uso en el tratamiento del cáncer en
un perro.
2. Uso conforme a la reivindicación 1, donde el
análogo de vitamina D es el 1\alpha,
25-(OH)_{2}-16-ene-23-yne-D_{3}
(análogo V) o un estereoisómero del mismo.
3. Uso conforme a la reivindicación 1, donde el
análogo de la vitamina D es el 1\alpha,
25-(OH)_{2}-22,24-dieno-24,
26,27-trihomo-D_{3} (EB 1089) o
un estereoisómero del mismo.
4. Uso conforme a la reivindicación 1 en la
fabricación de uno o más medicamentos donde los medicamentos
comprenden un agente óseo, un agente citotóxico, un agente
regulador de la respuesta inmunitaria, un agente
anti-inflamatorio o una combinación de todos
ellos.
5. Uso conforme a la reivindicación 1, donde el
análogo de vitamina D se administra por vía oral en forma
encapsulada en un vehículo líquido que puede ser ingerido por el
perro.
6. Uso conforme a la reivindicación 1, donde el
perro es alimentado por aproximadamente 0,025 hasta 500 nmol/kg de
peso corporal del paciente por día de análogo de vitamina D.
7. Uso conforme a la reivindicación 6, donde el
perro es alimentado por 0,025 hasta aproximadamente 100 nmol/kg de
peso corporal del paciente por día de análogo de vitamina D.
8. Uso conforme a la reivindicación 7, donde el
perro es alimentado por 0,025 hasta aproximadamente 10 nmol/kg de
peso corporal del paciente por día de análogo de vitamina D.
9. Uso conforme a la reivindicación 7, donde el
perro es alimentado por 0,025 hasta aproximadamente 1,0 nmol/kg de
peso corporal del paciente por día del análogo de vitamina D.
10. Uso conforme a la reivindicación 1, en la
fabricación de uno o más medicamentos de forma que los medicamentos
comprenden una dosificación eficaz desde el punto de vista
terapéutico de un análogo de vitamina D.
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