ES2312977T3 - Metodo y aparato para la monitorizacion bioprospeccion medio ambientales. - Google Patents
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Abstract
Método para la monitorización y bioprospección medioambientales para detectar microorganismos dentro de un entorno especificado, comprendiendo dicho método las etapas de: ubicar un dispositivo (1) de prueba en dicho entorno, incluyendo dicho dispositivo un recipiente (10) que tiene una entrada (12) y una salida (14) de fluido, estando configurado dicho recipiente para la entrada, el uso in situ y la salida de dicho entorno, una pluralidad de microcosmos (16) capilares situados dentro de dicho recipiente, teniendo cada uno de dichos capilares una entrada (18) y una salida (20) del capilar que están configuradas de modo que permiten que fluya fluido a través de dichos capilares (16), teniendo además cada uno de dichos capilares un medio para cubrir dicha entrada (18) y salida (18) del capilar de modo que se impide el flujo a través de dicho capilar, colocar en al menos uno de dichos capilares un medio para fomentar la recogida de microorganismos que son autóctonos de dicho entorno circundante cuando se permite fluir fluido de dicho entorno circundante a través de dicho capilar, abrir dicho medio de cubrición del capilar de modo que se permite fluir fluido de dicho entorno circundante a través de dicho recipiente y capilares, dejar dicho dispositivo (1) en dicho entorno durante una duración temporal suficiente para estudiar fenómenos que se producen dentro de dichos microcosmos (16) capilares, recuperar dicho dispositivo (1) de prueba, y analizar los fenómenos que se producen dentro de dichos microcosmos (16) capilares.
Description
Método y aparato para la monitorización y
bioprospección medioambientales.
Esta invención se refiere a la medición y a las
pruebas de fenómenos medioambientales y biológicos. Más
particularmente, la presente invención se refiere a métodos y
aparatos para la monitorización y bioprospección
medioambientales.
La biorremediación es una biotecnología eficaz y
sin embargo económica para eliminar agentes contaminantes orgánicos
e inorgánicos de entornos contaminados. Cuando se seleccionan como
diana radionúclidos y metales disueltos, el objetivo es convertir
especies tóxicas, solubles en agua, en productos insolubles, menos
tóxicos. Por ejemplo, puede eliminarse uranio de aguas subterráneas
contaminadas e inmovilizarse en el subsuelo mediante la inyección
de fuentes de carbono que estimulan la precipitación inducida de
manera microbiana de U (VI) disuelto en forma de U (IV) insoluble.
En este caso, el contaminante se trata "in situ" y el
proceso se denomina biorremediación in situ.
Cuando se diseñan estrategias de biorremediación
in situ, es esencial conseguir un entendimiento del tipo, la
actividad y los requisitos nutricionales de las comunidades
microbianas del subsuelo presentes en un sitio de limpieza
específico. La información de la comunidad microbiana también es
importante para convencer a las agencias reguladoras y a las partes
interesadas de que el contaminante está eliminándose (o, en el caso
de metales, inmovilizándose satisfactoriamente en el subsuelo) en
vez de diluyéndose o dispersándose en las aguas subterráneas.
Actualmente, la evaluación del potencial de
biorremediación en un sitio dado es tanto laboriosa como costosa.
Un enfoque típico para la implementación de la biorremediación
incluye las siguientes dos etapas: (1) estudios de selección de
microcosmos realizados en laboratorio para determinar el grado de
biorremediación intrínseca y para identificar el tipo, la cantidad
y la frecuencia de inyección de fuente de carbono que puede
necesitarse con el fin de acelerar el proceso de biorremediación
in situ; estos experimentos también sirven para estimar las
tasas de eliminación de contaminante pero no reflejan de manera
precisa las tasas de eliminación in situ reales debido a los
sesgos introducidos por "efectos cuello de botella" en
laboratorio, y (2) se obtienen perfiles de la comunidad microbiana
del microcosmos y muestras de campo para determinar los
microorganismos responsables de las reacciones de biotransformación
deseadas; dado que la mayoría de los microorganismos no pueden
crecer en medios de laboratorio, se usan comúnmente técnicas de
obtención del perfil independientes de cultivo (por ejemplo,
análisis basados en ADNr 16S).
El agua subterránea es la matriz de muestras
preferida habitual para obtener el perfil de las comunidades
microbianas, ya que está tanto fácilmente disponible como es
económica. Desafortunadamente, el estilo de vida de un
microorganismo diana dado tiene un impacto significativo sobre la
capacidad de detectarlo en esta matriz. En este extremo, un
microorganismo diana que sigue un estilo de vida sésil durante toda
su existencia será imposible de detectar en las aguas subterráneas
en un sitio incluso si está presente a densidades extremadamente
altas. Por tanto, la monitorización del agua subterránea sola puede
no reflejar de manera precisa la composición de la comunidad
microbiana y la dinámica de los entornos del subsuelo.
Recientemente, se redescubrieron muestreadores en fase sólida como
herramientas útiles para superar algunas de estas limitaciones.
En su configuración más sencilla, los
muestreadores en fase sólida no son más que una superficie física
incubada en un entorno de interés durante un periodo de tiempo
suficientemente largo como para permitir la colonización por
microorganismos. Se han usado de manera extensa portaobjetos de
vidrio enterrados o sumergidos para recoger microorganismos de
suelos, biorreactores y otros entornos. Tras la retirada de tales
muestreadores, se extraen los microorganismos y se identifican
mediante la detección de biomarcadores incluyendo ADN, fosfolípidos,
ácidos grasos y quinonas respiratorias. Puede argumentarse que los
microorganismos recogidos con un muestreador en fase sólida son más
representativos de la comunidad microbiana metabólicamente activa
que los obtenidos mediante la toma de muestras de aguas
subterráneas porque el dispositivo de toma de muestras requiere la
unión física activa por los microorganismos que van a capturarse.
Sin embargo, también pueden resultar atrapados microorganismos
muertos, residuos celulares y ADN. Herramientas sumamente sensibles
(por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa, PCR) pueden
detectar biomarcadores en material no vivo así como aquéllos de
miembros de la comunidad microbiana metabólicamente activos.
Recientemente, se han usado marcadores de
isótopos estables para distinguir microorganismos metabólicamente
activos de los que están latentes o no son viables. La exploración
con sondas de isótopos estables (SIP) explota el hecho de que el
ADN de un organismo que crece sobre fuentes de carbono enriquecidas
con carbono-13 se marca con ^{13}C ("más
pesado"), permitiendo de ese modo que se resuelva su ADN del ADN
de la comunidad total mediante centrifugación en gradiente de
densidad. Aunque representa una herramienta de investigación
poderosa, la exploración con sondas de isótopos estables parece
tener un potencial limitado para aplicarse para la monitorización
biológica rutinaria dado que esta técnica es muy laboriosa y
requiere mucho tiempo.
Un enfoque alternativo para la identificación de
microorganismos es buscar productos de expresión génica (es decir,
proteínas) en vez de sus secuencias de ADN características. Esto
puede realizarse con la última generación de instrumentación de
espectrometría de masas que ofrece una sensibilidad y velocidad
suficientes, mientras que permite también la automatización
completa del proceso de análisis.
La espectrometría de masas (EM) por
desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI) -
tiempo de vuelo (TOF), con su capacidad para inducir la desorción
de biomarcadores de proteína de bacterias, hongos, esporas y virus
intactos, proporciona una tecnología poderosa y rápidamente
emergente para la identificación de microorganismos rápida,
portátil y robusta. Las técnicas de EM MALDI-TOF son
muy rápidas (<5 minutos de tiempo de análisis por muestra),
tienen bajos requisitos de volumen de muestra (< 1 ml) y tienen
una capacidad genérica para identificar microorganismos.
Recientemente, se han integrado dispositivos
robóticos con instrumentos de MALDI-TOF para
proporcionar la automatización de esta técnica de análisis. La
última generación de robótica disponible comercialmente permite la
preparación y el análisis completamente automatizados de las
muestras, incluyendo la preparación y toma de imágenes de geles de
2D, la recogida y digestión de las manchas de proteína y la
aplicación de los digestos a dianas de MALDI-TOF de
múltiples muestras para el análisis.
G H Wagner, Soil Biol. Biochem. (1974) vol. 6
páginas 327-333 da a conocer un fluoroscopio con
capilares rectangulares para la toma de muestra y la observación de
microorganismos del suelo junto con un soporte para el fluoroscopio
con cubiertas deslizantes para tapar los extremos de los capilares
para impedir la evaporación de la humedad de los capilares durante
el examen microscópico.
A pesar de toda la técnica anterior en este
campo, existe todavía una necesidad en curso de métodos y aparatos
de prueba mejorados. Por ejemplo, una metodología y tecnología que
pudiesen integrar las tecnologías anteriores de modo que
proporcionen tanto perfiles de la comunidad microbiana como estudios
de selección de microcosmos en un procedimiento de una etapa, de
costes inferiores, contribuirían en gran medida a este campo. De
manera ideal, tales metodología y tecnología completamente
desarrolladas producirían información de qué tipos de organismos
están presentes, cuáles están vivos y metabólicamente activos, qué
tipo de nutrientes y dosificaciones de nutrientes deben usarse para
acelerar la biorremediación y qué tasas de biorremediación in
situ resultarían.
Tales metodología y tecnología nuevas también
deben demostrar ser bastante valiosas en otras aplicaciones in
situ; por ejemplo, en bioprospección en medios saturados, es
decir, para el descubrimiento de productos naturales, reacciones
químicas y microorganismos novedosos. Dado que se piensa que menos
de un uno por ciento estimado de microorganismos medioambientales
pueden crecer y funcionar en condiciones de laboratorio, una
metodología y herramienta nuevas para explorar procesos microbianos
in situ podría abrir eficazmente la puerta de la
investigación a una gran parte del mundo microbiano inexplorado.
El fundamento subyacente de una invención de
este tipo sería (dado que la mayoría de los microorganismos no
toleran la transferencia desde su hábitat natural hasta el
laboratorio) proporcionar el laboratorio a los microorganismos. El
impacto de una invención de este tipo sería beneficiar tanto a la
salud humana como medioambiental acelerando el descubrimiento de
procesos metabólicos, enzimas y microorganismos novedosos.
El presente inventor ha estado trabajando en
este campo técnico y hacia el desarrollo de una metodología mejorada
de este tipo durante algún tiempo. Gran parte de su investigación
anterior puede aplicarse a las metodologías descritas en el
presente documento. La mayor parte de este trabajo se ha documentado
en la bibliografía científica. Véase por ejemplo: Franklin, M. P.,
V. Madrid, S. Gregory, y R. U. Halden, "Spatial Analysis of a
Microbial Community Mediating Intrinsic Reductive Dechlorination of
TCE to cis-DCE at a DOE Superfund Site",
presentada en la 103ª Reunión General de la ASM (103rd ASM
General Meeting), Washington, D.C., 18-22 de
mayo de 2003; Halden, R. U., B. G. Halden, y D. F. Dwyer,
"Removal of dibenzofuran,
dibenzo-p-dioxin, and
2-chlorodibenzo-p-dioxin
from soils inoculated with Sphingomonas sp. strain RW1". Appl.
Environ. Microbiol., 65:2246-2249 (1999); Halden,
R. U., E. G. Peters, B. G. Halden y D. F. Dwyer, "Transformation
of mono- and dichlorinated phenoxybenzoates by
phenoxybenzoate-dioxygenase in Pseudomonas
pseudoalcaligenes POB310 and a modified
diarylether-metabolizing bacterium", Biotechnol.
Bioeng. 69:107-112 (2000); Halden, R. U., S. M.
Tepp, B. G. Halden y D. F. Dwyer, "Degradation of
3-phenoxybenzoic acid in soil by Pseudomonas
pseudoalcaligenes POB310(pPOB)", Appl. Environ.
Microbiol. 65:3354-3359 (1999); Colquhoun, D., E. S.
Wisniewski, D., A. Kalmykov y R. U. Halden, ``Identification of
Sphingomonas wittichii RW1 Through the Dioxin Dioxygenase Enzyme
Using Mass Spectrometry. 104ª Reunión General de la Sociedad
Americana de Microbiología (104th General Meeting of the American
Society for Microbiology), Nueva Orleans, LA, 23 - 27 de mayo
(2004); Halden, R. U., R. N. Cole, C. Bradford, D. Chen y K. J.
Schwab, "Rapid Detection of Norwalk Virus-like
Particles using MALDI-TOF MS y
ESI-MS/MS", 51ª Reunión de la Sociedad Americana
de Espectrometría de Masas (51st Meeting of the American Society
for Mass Spectrometry), Montreal, Quebec, Canadá,
8-12 de junio, 2003, http://www.inmerge.
com/aspfolder/ASMSSchedule2.asp; Lowe, M., E. L. Madsen, K.
Schindler, C. Smith, S. Emrich, F. Robb y R. U. Halden,
"Geochemistry and microbial diversity of a
trichloroethene-contaminated Superfund site
undergoing intrinsic in situ reductive dechlorination",
FEMS Microbiology Ecology 40:123-134 (2002);
Vancheeswaran, S., R. U. Halden, K. J. Williamson, J. D. Ingle y L.
Semprini, "Abiotic and biological transformation of
tetraalkoxysilanes and
trichloroethene/cis-1,2-dichloroethene
cometabolism driven by tetrabutoxysilane-degrading
microorganisms", Environ. Sci. Technol. 33:
1077-1085 (1999); y Vancheeswaran, S., S. H. Yu, P.
Daley, R. U. Halden, K. J. Williamson, J. D. Ingle y L. Semprini,
"Intrinsic remediation of trichloroethene driven by
tetraalkoxysilanes as co-contaminants: results from
microcosm and field studies", Remediation
13/14:7-25 (2003). Las enseñanzas y la descripción
de estos trabajos se incorporan por la presente al presente
documento como referencia.
Se ha resumido anteriormente, bastante en líneas
generales, los antecedentes que están relacionados con la presente
invención con el fin de que el contexto de la presente invención
puede apreciarse y entenderse mejor. En este aspecto, es
instructivo también considerar los objetos y ventajas de la presente
invención.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método mejorado, de coste inferior para la
monitorización y prospección medioambientales.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una herramienta y un método de evaluación de la
biorremediación mejorados que ayudarán más eficazmente a la
restauración medioambiental y a la gestión a largo plazo de sitios
contaminados.
Aún otro objeto de la presente invención es
proporcionar una herramienta y un método de evaluación de la
biorremediación mejorados que permitirán el análisis automatizado,
de volumen grande, de alto rendimiento de sitios de
biorremediación.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar una estrategia de análisis, una herramienta y un
método de monitorización que permitan la determinación automatizada,
rápida y simultánea de los siguientes parámetros: (1) calidad de
fluido y toxicidad, (2) potencial de biorremediación intrínseca, (3)
potencial de biorremediación acelerada tras la corrección de los
nutrientes, (4) estrategias de bioaumentación eficaces para la
limpieza medioambiental, (5) tasas de recambio de compuestos
naturales y agentes contaminantes medioambientales en condiciones
naturales y potenciadas, (6) síntesis de ADN y expresión de
proteínas in situ, (7) actividad metabólica y tasas de
crecimiento/muerte in situ de agentes biológicos nativos e
introducidos en condiciones medioambientales naturales y alteradas,
(8) estructura y dinámica de las comunidades microbianas autóctonas
de entornos naturales y (9) identidad y actividad de microorganismos
de valor potencial para su uso en biotecnología.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una herramienta y un método de monitorización que puede
aplicarse para evaluar el riesgo potencial que resulta de la
liberación de microorganismos no autóctonos, patógenos y
microorganismos modificados genéticamente en entornos naturales.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una herramienta y un método que tienen el valor
potencial de descubrir microorganismos, enzimas y productos
naturales de relevancia para la industria farmacéutica y el sector
de la biotecnología.
Estos y otros objetos y ventajas de la presente
invención resultarán fácilmente evidentes a medida que la invención
se entienda mejor en referencia al sumario, los dibujos y la
descripción detallada adjuntos que siguen.
Reconociendo las necesidades del desarrollo de
métodos y aparatos mejorados para la monitorización y bioprospección
medioambientales, la presente invención se refiere en general a
satisfacer las necesidades expuestas anteriormente y superar las
desventajas identificadas con los dispositivos y métodos de la
técnica anterior.
En una primera realización preferida, un método
de este tipo comprende las etapas de: (a) ubicar un dispositivo de
prueba en un entorno que va a investigarse, comprendiendo este
dispositivo: (i) un recipiente que tiene una entrada y una salida
de fluido, (ii) una pluralidad de microcosmos capilares situados
dentro del recipiente, teniendo cada uno de estos capilares una
entrada y una salida que están configuradas de modo que permiten
que fluya fluido a través de los capilares, teniendo además cada uno
de estos capilares un medio para cubrir su entrada y salida de modo
que se impide el flujo a través del capilar, (iii) una bomba
conectada a la entrada del recipiente, estando configurada la bomba
de modo que se extrae fluido del entorno circundante, tras lo cual
se fuerza hacia la entrada del recipiente y a través de los
capilares, (iv) conectado a la salida del recipiente, un medio para
recoger el flujo forzado a través de los capilares por la bomba y
(v) una válvula de retención conectada aguas abajo del recipiente
para impedir el flujo de retorno del fluido hacia el recipiente,
estando configurada esta pluralidad de capilares de modo que permite
el análisis automatizado de los capilares usando robótica
disponible comercialmente, (b) abrir los medios de cubrición de los
capilares de modo que se permite que fluya fluido del entorno
circundante a través del recipiente y los capilares, (c) dejar el
dispositivo in situ durante una duración temporal denominada
periodo de incubación suficiente para estudiar los fenómenos que se
producen dentro del microcosmos capilar, (d) recuperar el
dispositivo de prueba y (e) analizar fenómenos que se producen
dentro del microcosmos capilar usando sensores en tiempo real,
esquemas de análisis automatizados y robótica disponible
comercialmente.
En otra realización preferida, la presente
invención toma la forma del método descrito anteriormente más la
etapa de realizar, con el dispositivo, un estudio de selección entre
sustancias de prueba especificadas añadidas a los capilares para
determinar su capacidad asumida de acelerar un proceso de
biorremediación especificado en el entorno sujeto.
En una realización adicional aún más preferida,
la presente invención toma la forma de un dispositivo de prueba
para la monitorización y bioprospección medioambientales para
detectar microorganismos dentro de un entorno especificado. Esta
realización comprende: (a) un recipiente que tiene una entrada y una
salida de fluido, (b) una pluralidad de microcosmos capilares
situados dentro del recipiente, teniendo cada uno de los capilares
una entrada y una salida del capilar que están configuradas de modo
que permiten que fluya fluido a través de los capilares, teniendo
además cada uno de los capilares un medio para cubrir la entrada y
salida del capilar de modo que se impide el flujo a través del
capilar, (c) una bomba conectada a la entrada del recipiente,
estando configurada la bomba de modo que se extrae fluido del
entorno circundante y se fuerza a través de la entrada del
recipiente y de los capilares, (d) conectado a la salida del
recipiente, un medio para recoger el flujo forzado a través de los
capilares por la bomba y (v) una válvula de retención conectada
aguas abajo del recipiente para impedir el flujo de retorno del
fluido hacia el recipiente, en el que la pluralidad de capilares
está configurada de modo que permite el análisis automatizado de los
capilares usando robótica disponible comercialmente.
Aún en otra realización preferida, la presente
invención toma la forma del dispositivo de prueba descrito
anteriormente y en el que la pluralidad de capilares está
configurada de modo que ayuda en la identificación de
microorganismos autóctonos del entorno circundante en la ubicación
in situ del recipiente.
Por tanto, se ha resumido anteriormente,
bastante en líneas generales, la presente invención con el fin de
que la descripción detallada que sigue pueda apreciarse y entenderse
mejor. Por supuesto, hay características adicionales de la
invención que se describirán a continuación en el presente documento
y que formarán el contenido de cualquier reivindicación eventual
para esta invención.
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La figura 1 es una representación esquemática de
una realización preferida de la presente invención.
La figura 2 es una vista en sección transversal
de la carcasa mostrada en la figura 1, con representaciones
ampliadas de una placa de válvula adyacente a las entradas de
capilares tanto en sus posiciones abierta como cerrada.
La figura 3 es una vista en despiece ordenado
que muestra una placa de válvula de la figura 1 y los componentes
que se usan para provocar que se mueva lateralmente para abrir y
cerrar la entrada del capilar.
La figura 4 es una representación esquemática de
una realización preferida de la presente invención que está
extendiéndose hacia abajo en un pozo de monitorización de aguas
subterráneas.
Las figuras 5A-5C ilustran la
utilidad de la presente invención para realizar análisis de la
comunidad microbiana en un sitio contaminado con uranio. El
análisis de la comunidad microbiana convencional produce una imagen
tal como se muestra en la figura 5A. La presente invención permite
la determinación de 96 o más perfiles de comunidad determinados en
diversas condiciones medioambientales tal como se muestra en la
figura 5B. Las condiciones medioambientales en el muestreador de la
presente invención permiten el enriquecimiento selectivo de
bacterias que degradan agentes contaminantes; algunas de éstas
pueden detectarse por primera vez, tal como se muestra en la figura
5C.
La figura 6 muestra una posible configuración de
una placa de microtitulación de 96 pocillos configurada para la
monitorización y bioprospección medioambientales en un sitio
hipotético que contiene aguas subterráneas contaminadas con
hidrocarburos combustibles a partir de una fuente puntual y
dibenzofurano y el producto degradado de piretroide, ácido
3-fenoxibenzoico (3-POB), a partir
de fuentes no puntuales.
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Antes de explicar al menos una realización de la
presente invención en detalle, debe entenderse que la invención no
está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y a
las disposiciones de los componentes expuestos en la siguiente
descripción o ilustrados en los dibujos. La invención puede tener
otras realizaciones y ponerse en práctica y llevarse a cabo de
diversas formas. Además, debe entenderse que la fraseología y
terminología empleada en el presente documento son para el fin de
descripción y no deben considerarse limitativas.
Tal como se mencionó anteriormente, la presente
invención puede servir para muchos fines, incluyendo: la gestión y
biorremediación de sitios contaminados, la detección de
microorganismos en entornos terrestres y extraterrestres, la
evaluación del riesgo de microorganismos introducidos en entornos
naturales y la búsqueda de microorganismos, enzimas y/o compuestos
novedosos aplicables a biotecnología.
La presente invención proporciona tanto una
herramienta de monitorización como un método o una estrategia de
análisis. Esto permite la determinación automatizada, rápida y
simultánea de muchos parámetros de biorremediación clave y la
identificación de comunidades microbianas autóctonas de entornos de
agua y suelo naturales, y el descubrimiento de microorganismos de
valor potencial para su uso en biotecnología.
La presente invención permite por primera vez el
cultivo, el enriquecimiento selectivo y la caracterización
bioquímica completa de microorganismos en sus entornos naturales. Su
tecnología:
- (a)
- combina las siguientes herramientas/enfoques: técnicas de toma de muestras en fase sólida, enriquecimiento in situ y selección bioquímica, uso de pares de donadores/aceptores de electrones, marcaje con isótopos y selección paralela masiva con análisis automatizados,
- (b)
- hace uso de redes de microcosmos in situ junto con análisis de la comunidad microbiana independiente de cultivo para obtener una imagen completa de las comunidades microbianas,
- (c)
- puede proporcionar datos para cientos o incluso miles de escenarios medioambientales hipotéticos, permitiendo de ese modo determinar rápidamente y de manera automatizada las tasas probables de cambio medioambiental inducido por estas perturbaciones,
- (d)
- es adecuada para vincular microbios específicos a reacciones observadas usando técnicas de obtención de perfil substractivas asistidas por ordenador,
- (e)
- es completamente compatible con los sistemas robóticos existentes, permitiendo de ese modo el análisis rápido y completamente automatizado usando técnicas de análisis químicas, físicas, biológicas, genómicas y proteómicas,
- (f)
- permite determinar cómo microorganismos no nativos se las arreglarán en entornos naturales cuando se confrontan con agentes agresores físicos, biológicos y/o químicos,
- (g)
- puede optimizarse para aplicaciones ex situ, aplicaciones in situ exclusivas o una combinación de las dos, y
- (h)
- permite que se usen enfoques proteómicos para un análisis rápido y completamente automatizado (por ejemplo, espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF EM) y secuenciación de proteínas de digestos enzimáticos usando espectrometría de masas en tándem (EM/EM)).
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Una realización de la presente invención toma la
forma de un muestreador de red de microcosmos in situ (ISMA)
o dispositivo 1 de prueba. Tal como se muestra en las figuras
1-4, sus componentes principales incluyen: una
carcasa o recipiente 10 que tiene una entrada 12 y salida 14 de
fluido, una pluralidad de microcosmos 16 capilares situados dentro
de esta carcasa, constituyendo estos capilares 16 lo que se denomina
red de microcosmos, teniendo cada uno de estos capilares 16 una
entrada 18 y salida 20 que están configuradas de modo que permiten
que fluya fluido a través de los capilares 16, cada uno de estos
capilares contiene un material 22 de filtración que se selecciona
por su capacidad para fomentar la recogida de microorganismos en los
capilares individuales, placas de válvula superior 24 e inferior 26
que tienen aberturas 28 que están configuradas para poder alinearse
con las entradas 18 y salidas 20 de los capilares, un cilindro 30
neumático con medios 32 de acoplamiento y una colección de muelles
34 sirve para permitir que estas válvulas se muevan lateralmente de
modo que abran o cierren las entradas 18 y las salidas 20 de los
capilares, las almohadillas 36, 38 de junta sirven para impedir las
fugas de estas aberturas, una bomba 40 está conectada a la entrada
14 del recipiente y se dimensiona de modo que pueda extraer fluido
del entorno que circunda el recipiente 16 e impulsarlo a través de
la entrada 12 de recipiente y a través de los capilares 16, un
dispositivo de recogida o un depósito 42 está conectado a la salida
de la bomba y se usa para recoger el flujo a través del recipiente
16, una válvula 44 de retención conectada entre la bomba 40 y el
depósito 42 impide el flujo de retorno de fluido a través del
recipiente 16, un peso 46 sirve para proporcionar contrapeso para
suspender mediante un cable 48 umbilical el muestreador 1 hacia
abajo en un pozo perforado adecuadamente que se extiende en la
región de interés.
Los muestreadores prototipo de ISMA iniciales de
la presente invención se basaban en un formato de placa de
microtitulación de 96 posiciones (8 x 12) disponible comercialmente
(por ejemplo, Wheaton Scientific Products); podrían haberse usado
formatos de placa de 384, 1536 (o más) similares. Cada pocillo o
"microentorno" de los muestreadores prototipo iniciales
consistía en un bloque de teflón con 96 orificios de perforación que
representan capilares de microcosmos individuales (1,12 ml; 0,295
pulgadas [diámetro] x 1 pulgada [longitud]).
La inclusión en el muestreador 1 de ISMA de una
bomba 40, placas 24, 26 de válvula del mecanismo de cierre y
membranas semipermeables permite inocular en primer lugar y luego
incubar el dispositivo en el entorno sin eliminar (y dañar
potencialmente) los microbios residentes de su entorno natural. Las
configuraciones de la bomba diferentes de las mostradas en los
dibujos incluyen, pero no se limitan a, bombas de múltiples canales
y redes de bombas que suministran fluidos a la entrada de uno o más
capilares de microcosmos individuales.
El muestreador 1 de ISMA de la presente
invención puede equiparse con un dispositivo de recogida o un
depósito 42. El fluido que fluye a través de la red sale del
recipiente y se recoge en el depósito. Puede desearse el
desplazamiento de aire del dispositivo de recogida, y puede lograrse
mediante la inclusión en el dispositivo de recogida de una válvula
de purga que permite que el aire escape mediante una pieza de
tubería que se eleva a lo largo del cable umbilical hasta una
ubicación a cierta distancia por encima de la toma de fluido.
A medida que el fluido fluye a través del
dispositivo, pueden atraparse microorganismos y productos químicos
en los microcosmos 16 capilares. Cuando el dispositivo de recogida
está lleno, un flotador puede interrumpir la energía a la bomba y
activar la placas 24, 26 de válvula del mecanismo de cierre,
sellando de ese modo la red. Inmediatamente, o tras un periodo de
incubación adicional en modo discontinuo, puede retirarse el
dispositivo 1 del entorno para un análisis adicional.
El muestreador 1 de ISMA de la presente
invención puede diseñarse para volverse a usar. Para este fin, la
invención puede equiparse con un medio que permite el intercambio
rápido de las placas de microtitulación.
Las placas de microtitulación intercambiables
pueden fabricarse para permitir el almacenamiento a largo plazo
antes de su uso. Para este fin, el contenido de las placas de
microtitulación adaptadas puede liofilizarse y sellarse al vacío.
La rotura del vacío y la rehidratación del contenido de
microtitulación prepararán el dispositivo para las pruebas. Los
contenidos de microtitulación incluyen, pero no se limitan a, un
medio para contener una sustancia de prueba especificada, un
compuesto de prueba y un microorganismo u orgánulo de prueba.
El muestreador 1 de ISMA de la presente
invención puede equiparse con un medio para capturar microorganismos
y productos químicos de interés. Un medio de este tipo puede
elegirse del grupo comprendido por sorción, precipitación,
sedimentación, coagulación, filtración, tamizado, extracción,
cromatografía, separación por afinidad, separación por exclusión de
tamaño, unión pasiva a superficies presentadas y unión activa a
superficies presentadas.
El muestreador 1 de ISMA de la presente
invención puede equiparse con sistemas microfluídicos que permiten
el suministro de pequeños volúmenes de líquido y cantidades
definidas de orgánulos a la cámara de prueba antes de la contención
física y/o química de los especimenes capturados mediante barreras
que son o bien no permeables, semipermeables o bien completamente
permeables para compuestos químicos. Este aspecto permite, por
ejemplo, cultivar bacterias no cultivadas o "no cultivables"
en números suficientemente grandes para realizar una caracterización
e identificación bioquímicas.
Este muestreador también puede adaptarse para
estudiar el destino de agentes químicos o bien beneficiosos o bien
peligrosos en entornos naturales. En esta aplicación, se modifica el
muestreador 1 para que refleje tan estrechamente como sea posible
dentro de cada compartimento o microcosmos de prueba el entorno
físico, químico y biológico de interés (por ejemplo, células de
flujo a través equipadas con sedimento local, etc.). Se incluyen
productos químicos de prueba en el muestreador antes de su
utilización y difunden desde dentro del muestreador hasta el fluido
del ambiente. Tras la interacción con el entorno local, se capturan
todos los productos químicos en el depósito.
Este muestreador también puede adaptarse para
estudiar el destino de agentes biológicos o bien beneficiosos o
bien peligrosos en entornos naturales. En esta aplicación, se
modifica el muestreador 1 para que refleje tan estrechamente como
sea posible dentro de cada compartimento o microcosmos de prueba el
entorno físico, químico y biológico de interés (por ejemplo,
células de flujo a través equipadas con sedimento local, etc.). Se
inoculan microorganismos de prueba en el muestreador antes de su
utilización y se incuba el muestreador in situ permitiendo
la interacción de los microorganismos o especies de prueba con el
entorno sin permitir su liberación.
La modificación de las placas 24, 26 de válvula
del cierre del muestreador permite la apertura y el cierre
secuencial de sus compartimentos de microcosmos. Puede añadirse
equipo de monitorización y en tiempo real (pH, Eh, temperatura, DO,
etc.) al muestreador 1 para aumentar la funcionalidad y para
desencadenar reacciones en puntos específicos en el tiempo
seleccionados por cambios en el entorno diana (por ejemplo,
acontecimientos de precipitaciones fuertes). El uso de señalización
por radiofrecuencia y controles remotos puede sustituir el cordón
48 umbilical convencional que se usa para comunicarse con el
muestreador 1 y para determinar el cambio químico que se produce
durante la incubación.
Debe observarse que el diseño del dispositivo
puede alterarse para permitir la utilización del dispositivo en
entornos que muestran condiciones extremas que incluyen, pero no se
limitan a, condiciones extremas de pH, temperatura, presión,
radiación, gravedad diferentes de las del planeta tierra, etc.
Adicionalmente, muchos tipos de productos microfluídicos, filtros,
materiales sorbentes, membranas semipermeables y mecanismos de
cierre alternativos pueden integrarse en el muestreador para separar
en el tiempo su inoculación del periodo de incubación que permite
que el cambio químico tenga lugar dentro del muestreador 1.
Debe observarse además que el método y el
dispositivo pueden usarse para la bioprospección y monitorización
medioambiental en cualquier entorno que contenga fluidos que
incluye, pero no se limita a, entornos de subsuelo, entornos de
superficie, entornos saturados en el espacio y macroorganismos
muertos o vivos.
Pueden incorporarse sistemas de detección
ópticos y/o eléctricos en las configuraciones microfluídicas del
muestreador 1 para sellar microcosmos individuales tan pronto como
una única célula se emite a los microcosmos, aumentando enormemente
de este modo la tasa de éxito del aislamiento de microorganismos
novedosos.
Por ejemplo, los sensores ópticos que detectan
la entrada de microorganismos individuales en el dispositivo, puede
desencadenar la traslación de las placas de válvula que se mueven de
la posición "abierta" a la posición "cerrada". Pueden
presentarse diferentes superficies en la posición "cerrada". Si
la superficie presentada es impermeable al microorganismo y al
flujo de agua, se logra el confinamiento completo. Si la superficie
presentada es una membrana semipermeable, el agua puede continuar
fluyendo a través del dispositivo mientras que el microorganismo
se, mantiene en confinamiento.
El enfoque de la presente invención para la
identificación de microorganismos implica la búsqueda de productos
de expresión génica (es decir, proteínas) así como de las secuencias
de ADN características. Por ejemplo, se usan proteínas ribosómicas
como biomarcadores para identificar microorganismos mediante EM
MALDI-TOF.
Para la rápida detección automatizada de
microorganismos específicos mediante EM MALDI-TOF,
pueden configurarse microcosmos individuales para apoyar sólo el
crecimiento de microorganismos específicos. Esto se logra incluyendo
en el microcosmos productos químicos que fomentan el crecimiento
del microorganismo diana mientras que suprime el crecimiento y la
supervivencia de microorganismos no diana. Por ejemplo, una
combinación de sustratos selectivos y antibióticos pueden servir
para este fin. Este tipo de cultivo selectivo, una estrategia común
en el laboratorio de microbiología, está realizándoseahora in
situ. Haciendo esto, puede lograrse el crecimiento de
microorganismos específicos y la expresión de biomoléculas clave.
Entonces, el cultivo selectivo in situ de microorganismos
específicos permite la detección e identificación directa de estos
agentes biológicos mediante espectrometría de masas. Hace
innecesaria la necesidad de preparación y limpieza de muestras
frecuente debido a las características de señal/ruido mejoradas de
la muestra enriquecida.
Esta técnica de cultivo in situ también
puede usarse para determinar la actividad metabólica y catabólica
de microorganismos in situ. Para este fin, los productos
químicos presentados pueden contener marcas isotópicas tales como
isótopos de carbono-12 (por ejemplo, ^{13}C,
^{14}C).
El uso de la invención junto con SIP y
herramientas de obtención del perfil de las comunidades microbianas
no dependientes del cultivo es otra aplicación importante.
Las ventajas de este procedimiento se ilustran
en las figuras 5A - 5C tal como se aplica a la biorremediación de
entornos saturados de subsuelo que contienen uranio. El análisis de
las comunidades microbianas convencionales produce una imagen tal
como se muestra en la figura 5A; la técnica detecta la presencia de
todas las bacteria; sin embargo, no proporciona información sobre
su actividad metabólica. El uso de nutrientes marcados con isótopos
puede revelar cuáles de los microorganismos detectados son
metabólicamente activos (la mitad derecha de la comunidad mostrada
en la figura 5A).
El uso del muestreador 1 de ISMA permite la
determinación de 96 o más perfiles de comunidades determinadas en
diversas condiciones ambientales (por ejemplo, un estudio de
selección en el que está presentándose el uranio a diversas
concentraciones), véase la figura 5B. El análisis computacional de
los datos resultantes usando obtención del perfil sustractivo de
las comunidades permite la identificación de importantes
microorganismos que transforman agentes contaminantes dentro del
gran grupo de microorganismos activos (no todas las bacterias
metabólicamente activas participan en el proceso de
biorremediación).
Las condiciones ambientales en el muestreador
permiten el enriquecimiento selectivo de las bacterias que degradan
los agentes contaminantes; algunas de éstas pueden detectarse por
primera vez, véase la figura 5C. En condiciones apropiadas, una
población mal representada puede enriquecerse hasta un nivel que
permite la detección/identificación basada en EM
MALDI-TOF.
Para distinguir cuáles de los microorganismos
potencialmente relevantes detectables en un sitio dado están
llevando a cabo una reacción deseada, pueden usarse métodos de SIP.
Se usan isótopos estables como indicadores químicos para ayudar a
discriminar las bacterias metabólicamente activas de los miembros de
la comunidad latentes o muertos y de los que realizan funciones no
relacionadas con la biorremediación o bioestimulación deseada.
Los sustratos marcados con isótopos (por
ejemplo, acetato marcado con ^{13}C) pueden usarse como
indicadores químicos de la actividad de biotransformación en un
ISMA de pozo, miniaturizado, que puede utilizarse en campo. Tal
como se mencionó previamente, cada uno de estos dispositivos alberga
entornos de prueba diferentes, separados físicamente, "pocillos
de prueba" o microcosmos capilares.
El método de la presente invención comienza
colocando un ISMA adecuadamente configurado en el entorno que va a
examinarse (por ejemplo, un sitio subterráneo, contaminado, al que
se accede mediante un pozo de monitorización). Una vez que el ISMA
ha hecho descender dentro de un pozo de monitorización hasta la
profundidad deseada, se activa desde la superficie mediante una
señal eléctrica conducida mediante un hilo (o mediante otro medio
tal como un mecanismo incorporado programado). La activación del
dispositivo expone cada uno de los "pocillos de prueba" al
flujo de agua subterránea. Los microorganismos suspendidos en el
agua subterránea se unen a las superficies presentadas y quedan
atrapados en el dispositivo. Los microbios de vida libre adicionales
quedan atrapados una vez que el dispositivo recibe la señal de
cerrarse de nuevo.
Algunos de los pocillos de prueba pueden incluir
el contaminante de interés. Los pocillos de prueba individuales
también pueden contener, tal como se mencionó previamente, un
nutriente marcado con isótopos estables para determinar su efecto
sobre el crecimiento y la actividad microbianos. Se incuba el
dispositivo ahora cerrado in situ para permitir el
crecimiento de microorganismos sobre los sustratos marcados.
Durante este periodo de incubación, todas las
bacterias implicadas directa o indirectamente en la utilización de
donadores de electrones marcados con isótopos se enriquecen en ADN
marcado con isótopos. Tras recuperar la herramienta del pozo, se
recogen los microorganismos del dispositivo y se separa su ADN de
mayor densidad, marcado con isótopos del ADN del fondo mediante
centrifugación en gradiente de densidad. Entonces se analiza este
ADN de mayor densidad (y el ADN no marcado) usando técnicas
moleculares conocidas.
Los microalineamientos de oligonucleótidos
sirven para identificar/enumerar organismos específicos de diana
mientras que pueden usarse bibliotecas de clones para identificar
microorganismos novedosos, no cultivados. El dispositivo puede, de
manera ideal, usarse junto con la robótica disponible comercialmente
para la extracción automatizada de ADN.
El grado de corrosión inducida de manera
microbiana de metales/radionúclidos puede medirse ópticamente
explorando una superficie de metal situada dentro del ISMA con un
láser; alternativamente, puede detectarse la biotransformación
contaminante bioquímicamente mediante la adición de un
colorante/indicador o electroquímicamente mediante la medición de
la resistencia eléctrica. Pueden realizarse mediciones en tiempo
real in situ o tras la utilización mediante el análisis del
contenido capilar, del contenido del depósito, y de materiales
sorbentes que se integraron en el dispositivo y que tuvieron la
oportunidad de interaccionar químicamente con el fluido que entró en
el dispositivo.
Si el uranio es el contaminante de interés, el
análisis de una superficie recubierta con uranio permite la
determinación del grado de reducción de uranio y el cálculo de tasas
de eliminación de agente contaminante que se producen en
condiciones in situ.
Tal como se mencionó anteriormente, los pocillos
de prueba del dispositivo también pueden equiparse con una matriz
que permite la liberación lenta, continua de productos químicos (por
ejemplo, fuentes de carbono y energía externas; otros nutrientes;
agentes de acondicionamiento tales como agentes redox o de pH). La
matriz puede ser un polímero o una vesícula de membrana que
contiene el nutriente en cuestión. Las características de difusión
de la matriz/membrana se seleccionan para lograr niveles de
nutriente diferentes en cada uno de los pocillos de prueba si se
desea. Pueden añadirse nutrientes presentados en estado sólido,
líquido o gaseoso. Pueden presentarse fuentes de energía en
presencia y ausencia de recubrimiento con agente contaminante.
Algunos de los pocillos de prueba pueden
configurarse para funcionamiento de flujo a través continuo in
situ. El dispositivo de flujo a través puede ser pasivo o
activo. En dispositivos activos, una pequeña bomba 40 facilita el
movimiento de aguas subterráneas mientras que se usan tuberías de
diversa longitud y configuración para impedir que el efluente de
uno de los pocillos de prueba se convierta en el influente de
otro.
La figura 6 muestra una posible configuración de
una placa de microtitulación de 96 pocillos configurada para la
monitorización y bioprospección medioambientales en un sitio
hipotético que contiene aguas subterráneas contaminadas con
hidrocarburos combustibles de una fuente puntual, y dibenzofurano y
el producto degradado de piretroide, ácido
3-fenoxibenzoico (3-POB) de fuentes
no puntuales. Los capilares de 96 microcosmos se alinean en
paralelo en 12 columnas ("A" a "L") y 8 filas ("i" a
"viii"). En la placa de microtitulación adaptada para este
sitio, todos los capilares contienen un material de malla para
capturar microorganismos. Cerca de la entrada en la mitad frontal
de cada capilar de microcosmos, el material de malla contiene perlas
de agar noble que sirven como matriz difusiva inerte. Cerca de la
salida en la mitad posterior de cada capilar de microcosmos, el
material de malla contiene perlas de sorbente al que pueden sorberse
los contaminantes. El capilar Ai no contiene ningún microorganismo
ni sustancia de prueba. Cuando se utiliza el ISMA en el modo de
flujo a través en el acuífero contaminado, las condiciones químicas
notificadas para el microcosmos Ai por sensores en tiempo real
reflejan la calidad ambiental de las aguas subterráneas. De manera
similar, el análisis químico de las perlas de sorbente contenidas
en el microcosmos Ai proporcionarán una medición integrada en el
tiempo de la masa de contaminante que pasó a través del microcosmos
durante la utilización en las aguas subterráneas locales. Tras la
captura de los microorganismos en el ISMA durante el modo de flujo a
través, las placas de válvula se trasladan para cerrar el
dispositivo. Los datos de detección en tiempo real para el
microcosmos Ai, incubado ahora en modo discontinuo, informarán de la
cinética de degradación del agente contaminante en condiciones
ambientales (tasa de biorremediación intrínseca; pérdida de
contaminantes como función del tiempo).
Si las aguas subterráneas que pasan a través del
microcosmos Ai son anaerobias (ubicación 1 de utilización del ISMA;
inmediatamente aguas abajo del tanque de combustible con fugas), la
biodegradación de los hidrocarburos combustibles será lenta e
incompleta. Con el fin de acelerar el proceso de biodegradación,
pueden considerarse varios aceptores de electrones. Se logra la
selección rápida, simultánea de compuestos aceptores de electrones
comunes dentro del ISMA en microcosmos en la fila (i) (Bi a Ii). Los
compuestos aceptores de electrones individuales presentados en
estos microcosmos reflejan un gradiente redox que oscila desde
condiciones sumamente oxidantes hasta más reductoras: Bi,
formulación de liberación de oxígeno (a); Ci, nitrato (b); Di,
nitrito (c); Ei, óxido de manganeso (MnO_{2}) (d), Fi, hierro
(Fe^{(III)}) (e); Gi, uranio (U^{(VI)}) (f); Hi, cromo
(Cr^{(VI)}) (g); e Ii, sulfato (h). Incubando el ISMA en modo
discontinuo con estos aceptores de electrones presentes en
concentraciones en exceso en relación con los contaminantes, los
sensores en tiempo real de los microcosmos Bi a Ii notificarán
directamente los resultados de este estudio de selección de la
biodegradación de hidrocarburos combustibles en una variedad de
condiciones redox. Una vez que se han identificado las condiciones
redox óptimas, es de interés determinar qué dosificación se
necesita. Asumiendo que el recambio de agente contaminante era el
más rápido en el microcosmos Bi que contenía la formulación de
liberación de oxígeno (a), puede inferirse la dosificación óptima
de este "nutriente" comparando las tasas de degradación
obtenidas en microcosmos que contenían niveles 5 veces (Ji), 10
veces (Ki) y 50 veces (Li) superiores de formulación de liberación
de oxígeno en relación con el microcosmos Bi. Por tanto, los datos
obtenidos con la fila superior de microcosmos ya ha proporcionado
estimaciones de las tasas de biodegradación intrínseca y potenciada,
y dio como resultado la identificación de las condiciones redox más
favorables, así como la dosificación óptima de aceptores de
electrones. Pueden seleccionarse otros nutrientes y condiciones de
una forma similar.
La eficacia del tratamiento químico para la
limpieza de aguas subterráneas en el sitio de vertido de combustible
se investiga usando los microcosmos de la segunda fila Aii a Fii.
Se evalúa la eliminación de hidrocarburos por reactivo de Fenton
(m) y permanganato de potasio (n). En la configuración mostrada, se
cubren los microcosmos Aii y Bii con un filtro de membrana inerte
que permite que fluya líquido a través de los capilares mientras
que se impide la entrada de microorganismos. La incubación
secuencial de estos microcosmos en modo de flujo a través y
discontinuo permite una comparación in situ directa de los
dos agentes oxidantes o estrategias de tratamiento químico. Los
microcosmos Cii y Dii no están sellados con una membrana inerte,
pero por lo demás son idénticos a Aii y Dii, respectivamente. La
comparación directa de datos químicos de estos dos pares de
microcosmos permite evaluar si los procesos de biotransformación y
oxidación química pueden producirse simultáneamente.
Para fines de evaluación en el sitio, se
utilizarán muestreadores de ISMA idénticos en diversas ubicaciones
en un sitio dado. Para el sitio hipotético tratado en el presente
documento, la ubicación 2 de utilización está alejada aguas abajo
del sitio de liberación, fuera del penacho de contaminante de
hidrocarburo. En esta ubicación, se espera que las aguas
subterráneas sean aerobias y que contengan sólo contaminantes de
fuentes no puntuales. En este caso, están representados por ácido
3-fenoxibenzoico y dibenzofurano.
La siembra del muestreador de ISMA con
microorganismos viables (hidratados o liofilizados) es útil para
evaluar la bioaumentación y la evaluación del riesgo medioambiental
de microorganismos patógenos y no patógenos. El muestreador de ISMA
adaptado considerado en el presente documento se ha sembrado con 10
millones de microorganismos de una clase particular por microcosmos
(Eii a Hii): Eii, Escherichia coli O157:H7, un patógeno (o);
Fii, Sphingomonas wittichii RW1, una bacteria que degrada
dibenzofurano (p); Gii, Pseudomonas pseudoalcaligenes cepa
POB310, un microorganismo que degrada
3-fenoxibenzoato (q); y Hii, Pseudomonas sp.
cepa B13-D5, un microorganismo modificado
genéticamente (r) diseñado específicamente para degradar ácido
3-fenoxibenzoico rápida y completamente.
Una forma de evaluar la supervivencia de estos
microbios en el entrono diana es enumerar las células cultivables
tras la utilización, incubación y retirada del muestreador de ISMA.
El efecto de las condiciones medioambientales sobre la
supervivencia de los microorganismos sembrados puede evaluarse
comparando recuentos microbianos obtenidos para microcosmos
idénticos incubados en diferentes ubicaciones, por ejemplo la
supervivencia de la cepa de E. coli patógena en las
ubicaciones 1 y 2 de utilización puede evaluarse comparando los dos
recuentos viables obtenidos para el microcosmos Eii.
La cepa RW1 es una bacteria que se produce de
manera natural que puede utilizar dibenzofurano como fuente de
carbono y energía. Su detección en el acuífero contaminado con
dibenzofurano podría indicar un potencial de biorremediación
intrínseco para este producto químico en el sitio. Una técnica de
detección para el microorganismo es el uso de cebadores y sondas de
PCR específicos de la cepa. Alternativamente, puede detectarse la
bacteria mediante espectrometría de masas. Sin embargo, si la cepa
RW1 está presente en las aguas subterráneas del sitio, su densidad
medioambiental será de órdenes de magnitud inferiores a la requerida
para esta tarea. El compartimento Iii del ISMA está configurado
para superar esta limitación. El microcosmos Iii contiene el
sustrato selectivo dibenzofurano (s). Durante la incubación in
situ del microcosmos Iii en modo discontinuo en aguas
subterráneas aerobias, se permite que la cepa RW1 aumente en
densidad desde niveles no detectables hasta detectables haciéndola
crecer a expensas de dibenzofurano. La presencia de dibenzofurano
sirve para dos fines. En primer lugar, permite que la bacteria
diana (RW1) crezca hasta niveles suficientemente altos para la
detección mediante espectrometría de masas (>10^7 células
totales por microcosmos); en segundo lugar, aumenta la expresión de
dioxina dioxigenasa, una enzima característica que sirve como diana
para la identificación por espectrometría de masas de RW1. El
efecto combinado del crecimiento in situ de RW1 y la
inducción de altos niveles de dioxina dioxigenasa en células de RW1
es una razón señal/ruido durante el análisis por espectrometría de
masas (amplificación del biomarcador in situ): los niveles de
dioxina dioxigenasa son altos en relación con el fondo de proteínas
no diana contenidas en la mezcla de microorganismos
medioambientales.
En condiciones de inanición, los microorganismos
pueden dividirse varias veces para formar ultramicrobacterias: en
estos casos, los recuentos de células viables indican crecimiento
bacteriano (proliferación) mientras que, en realidad, la población
bacteriana local está al borde de la extinción. El ISMA puede ayudar
a distinguir entre el crecimiento microbiano verdadero y el efecto
de inanición descrito anteriormente. Este objetivo se logra con el
microcosmos Jii que contiene el microorganismo RW1 (p) y un análogo
de dibenzofurano (S) marcado con isótopo estable (que contiene
^{13}C). Tras la incubación del microcosmos in situ, puede
analizarse su contenido mediante espectrometría de masas. El
crecimiento in situ satisfactorio de la cepa RW1 se revelará
mediante la detección de una mezcla de péptidos ligeros (no
marcados) y pesados (marcados con isótopo) de la dioxina
dioxigenasa; la razón de isótopos pesados con respecto a isótopos
bajos detectada mediante espectrometría de masas informa sobre la
tasa de captación de ^{13}C-dibenzofurano in
situ, una medición que no puede obtenerse en pruebas de campo
porque la inyección masiva de compuestos marcados con isótopos es
prohibitiva y se enfrenta a obstáculos normativos.
Puede usarse el microcosmos Kii para ilustrar el
beneficio de la normalización de los datos que puede lograse
mediante la incorporación de microcosmos convencionales en el
muestreador de ISMA. El microcosmos Kii es idéntico a Jii pero
sellado con una membrana semipermeable inerte que excluye la entrada
de microorganismos autóctonos de las aguas subterráneas. Este
microcosmos puede servir como punto de referencia para la actividad
metabólica en la ubicación de toma de muestras. Por ejemplo, cuando
se utilizan muestreadores de ISMA durante todo el año en el
acuífero superficial de la ubicación 2 de utilización, el recambio
de ^{13}C-dibenzofurano y la asimilación de
^{13}C experimentarán una fluctuación estacional como resultado de
cambios sutiles en la temperatura del agua. La comparación directa
de conjuntos de datos obtenidos con ISMA configurados de manera
idéntica utilizados en puntos diferentes en el espacio y el tiempo
puede lograrse mediante la normalización de los resultados usando
las lecturas de microcosmos convencionales tales como Kii.
Haciéndolo así, los resultados para los microcosmos en la fila
"i" obtenidos a lo largo del transcurso del año pueden caer en
picado hasta un único valor. Si no lo hacen, esto puede indicar una
pérdida relativa de actividad de degradación de hidrocarburos en el
acuífero.
Tras la utilización y retirada del muestreador
de ISMA, puede analizarse la comunidad microbiana de cada
microcosmos capilar usando técnicas independientes de cultivo tales
como extracción de ADN, amplificación de los genes de ARN 16S,
separación de productos de amplificación mediante electroforesis en
gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y secuenciación de bandas
seguida por análisis de la secuencia filogenética. La vinculación de
la función microbiana y la filogenia es un objetivo importante. La
obtención del perfil sustractivo de la comunidad, es decir, la
eliminación de información irrelevante de grandes conjuntos de datos
restando múltiples conjuntos de datos entre sí, representa una
forma posible de identificación dentro de un gran número de
microorganismos de los que son responsables de un proceso bioquímico
de interés (figuras 5A-C).
Otro enfoque para lograr este objetivo es el uso
de exploración con sondas de isótopos estables. La tecnología de
ISMA potencia enormemente la utilidad de esta técnica por tres
razones. La primera, facilita un análisis por SIP económico
minimizando el volumen de líquido requerido al que van a añadirse de
manera conocida compuestos marcados con isótopos caros. La segunda,
permite la incubación discontinua que aumenta la eficacia del
marcaje espectacularmente en comparación con el marcaje en sistemas
abiertos. La tercera, evita los obstáculos normativos asociados con
la inyección de compuestos marcados con isótopos en entornos diana
durante las pruebas de campo.
La utilidad de la tecnología de ISMA para su uso
con SIP se ilustra mediante los microcosmos Aiii y Biii. El
microcosmos Aiii es idéntico al microcosmos Iii excepto por el hecho
de que el dibenzofurano contenido en el mismo está marcado con
^{13}C. Tras el uso del muestreador de ISMA en la ubicación 2 de
utilización, el análisis de la comunidad microbiana independiente
de cultivo del microcosmos Iii proporcionará un gran número de
secuencias de ADN, algunas de las cuales pueden corresponder a
microorganismos que degradan dibenzofurano que se producen de
manera natural. Sin embargo, éstos no pueden distinguirse fácilmente
de un fondo grande de otras bacterias. El análisis del microcosmos
Aiii mediante SIP ayudará en su identificación. Tras la utilización
in situ del muestreador de ISMA, se extrae ADN del
microcosmos Aiii. El ADN obtenido se centrifuga en un gradiente de
densidad de cloruro de cesio para separar el
^{12}C-ADN del ^{13}C-ADN. El
análisis del ^{13}C-ADN mediante PCR, DGGE y
secuenciación del ADN revelará la identidad de los microorganismos
implicados en el recambio de dibenzofurano.
Asumiendo que se detecta una secuencia
correspondiente a un único microorganismo marcado con ^{13}C, y
que su información de la secuencia de ADN es diferente de la de
RW1, entonces se ha descubierto con la tecnología de ISMA un
microorganismo novedoso que puede metabolizar dibenzofurano. Si los
metabolitos marcados con ^{13}C detectables en el microcosmos
Aiii son diferentes de los notificados para la cepa RW1, entonces se
ha detectado un proceso bioquímico novedoso, mientras que el propio
metabolito puede representar un producto natural novedoso de
potencial valor comercial. De manera similar, la detección de
crecimiento fúngico significativo en el microcosmos Biii (que
contiene sacarosa marcada con ^{13}C; T) y la carencia concurrente
de detección de ADN marcado con ^{13}C correspondiente a
bacterias Gram positivas puede revelar la presencia de un producto
fúngico natural adecuado para el tratamiento de infecciones por
bacterias Gram positivas en animales y seres humanos.
Pueden distribuirse aleatoriamente réplicas de
sistemas de prueba individuales dentro del formato de
microtitulación de 12 x 8. El análisis de sistemas de réplica
informa aproximadamente de la exactitud de los datos experimentales
obtenidos. Las réplicas mostradas en la figura 6 incluyen: para Ai -
Ciii a Liii, para la fila i-filas iv, vi y viii,
para la fila ii - filas v y vii.
Los sistemas de prueba dados a conocer en el
presente documento informarán sobre las tasas y el potencial de
biocorrosión intrínsecos (biorremediación). El análisis
computacional de los conjuntos de datos resultantes usando
obtención del perfil sustractivo añade un poder discriminatorio no
alcanzado hasta la fecha para el análisis tanto de la composición
de la comunidad microbiana como de la función en entornos del
subsuelo.
La tecnología de la presente invención usa
diversas técnicas y tecnologías probadas de una forma novedosa y no
obvia para lograr el objetivo deseado: el análisis automatizado
rápido de muestras de campo para determinar la composición de la
comunidad bacteriana, el potencial degradante y la actividad
degradante en condiciones prevalentes y en aquellas condiciones que
puedan crearse in situ para acelerar el proceso de
biorremediación. Las técnicas/tecnologías incorporadas en la
presente invención incluyen:
- 1)
- herramientas de pozo para tomar muestras para monitorizar pozos
- 2)
- pruebas con placas de microtitulación y análisis completamente automatizados
- 3)
- compuestos de liberación lenta para la liberación continua de nutrientes microbianos
- 4)
- tecnología de membranas para el suministro de nutrientes
- 5)
- sistemas microfluídicos
- 6)
- detección por láser de corrosión inducida de manera microbiana
- 7)
- extracción de ADN automatizada
- 8)
- marcaje con isótopos de microorganismos
- 9)
- análisis en gradiente de densidad para la separación de ADN marcado de alta densidad
- 10)
- análisis de la comunidad microbiana usando microalineamientos y bioinformática
- 11)
- obtención del perfil sustractivo de la comunidad para la identificación de microorganismos relevantes
- 12)
- materiales sorbentes que pueden analizarse para determinar la composición química del fluido en los compartimentos de prueba individuales.
Puede ayudarse adicionalmente a la utilidad de
los métodos analíticos de la presente invención mediante: (a) el
desarrollo de técnicas de espectrometría de masas para la
identificación de microorganismos en cultivos mixtos y (b) la
generación de algoritmos de búsqueda y programas de bases de datos
de identificación de microorganismos para interpretar los espectros
de masas MALDI TOF de microorganismos y biomarcadores
ribosómicos.
La velocidad y facilidad de análisis para la
presente invención se logra sustituyendo los análisis
moleculares-genéticos por otras técnicas de
medición más convenientes para distinguir las distribuciones de
isótopos (por ejemplo, uso de EM MALDI-TOF y
búsquedas en bases de datos de bioinformática para la identificación
automatizada de microorganismos). El procesamiento de muestras usa
robótica disponible comercialmente (por ejemplo, robótica de
Amersham Biosciences) y herramientas para la limpieza y el
procesamiento rápidos de las muestras (por ejemplo, Gyrolab MALDI
SP1 etc.) junto con etapas de digestión enzimática (por ejemplo,
digestión con tripsina).
Se recomiendan instalaciones de laboratorio
centrales para analizar muestreadores utilizados in situ.
Esto permite el análisis automatizado y un alto grado de
normalización. El análisis normalizado a su vez mejora la exactitud
de la medición y permite determinar los sesgos sistemáticos de la
técnica (debido a los "efectos cuello de botella") que pueden
limitar la exactitud de la medición. Una vez identificados, estos
sesgos pueden tenerse en cuenta y corregirse para permitir así
predecir con alta exactitud y precisión el cambio medioambiental
que va a observarse tras las intervenciones de ingeniería.
Experimentos de prueba de concepto con
componentes del dispositivo de prueba de la presente invención han
demostrado que:
- 1.
- Pueden obtenerse datos informativos de la comunidad microbiana con herramientas no dependientes de cultivo usando análisis de microcosmos de biorremediación y muestras de aguas subterráneas convencionales.
- 2.
- La selección de aceptores y donadores de electrones en microcosmos ayuda al poder discriminatorio/predic- tivo para obtener el perfil de la comunidad microbiana.
- 3.
- La integración de compuestos donadores de electrones marcados con isótopos estables en el diseño del microcosmos ayuda en la identificación de microorganismos metabólicamente activos.
- 4.
- Pueden usarse adaptaciones de análisis de espectrometría de masas de proteínas específicas de microorganismos para identificar microorganismos en cultivos medioambientales mixtos directamente sin la necesidad de técnicas de separación laboriosas y que requieren mucho tiempo.
- 5.
- La adaptación de algoritmos de identificación de microorganismos contenidos en el software de bases de datos de identificación de proteínas existentes permite el análisis de cultivos mixtos.
Aunque la descripción precedente se refiere a
realizaciones preferidas de la invención, se entiende que estos
detalles se han facilitado para los fines de aclaración sólo.
Claims (10)
1. Método para la monitorización y
bioprospección medioambientales para detectar microorganismos dentro
de un entorno especificado, comprendiendo dicho método las etapas
de:
ubicar un dispositivo (1) de prueba en dicho
entorno, incluyendo dicho dispositivo un recipiente (10) que tiene
una entrada (12) y una salida (14) de fluido, estando configurado
dicho recipiente para la entrada, el uso in situ y la salida
de dicho entorno, una pluralidad de microcosmos (16) capilares
situados dentro de dicho recipiente, teniendo cada uno de dichos
capilares una entrada (18) y una salida (20) del capilar que están
configuradas de modo que permiten que fluya fluido a través de
dichos capilares (16), teniendo además cada uno de dichos capilares
un medio para cubrir dicha entrada (18) y salida (18) del capilar de
modo que se impide el flujo a través de dicho capilar,
colocar en al menos uno de dichos capilares un
medio para fomentar la recogida de microorganismos que son
autóctonos de dicho entorno circundante cuando se permite fluir
fluido de dicho entorno circundante a través de dicho capilar,
abrir dicho medio de cubrición del capilar de
modo que se permite fluir fluido de dicho entorno circundante a
través de dicho recipiente y capilares,
dejar dicho dispositivo (1) en dicho entorno
durante una duración temporal suficiente para estudiar fenómenos
que se producen dentro de dichos microcosmos (16) capilares,
recuperar dicho dispositivo (1) de prueba, y
analizar los fenómenos que se producen dentro de
dichos microcosmos (16) capilares.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho dispositivo (1) incluye además una bomba (20) conectada a
dicho recipiente, estando configurada dicha bomba de modo que
provoca el flujo de fluido de dicho entorno circundante hacia la
entrada (18) del recipiente y a través de dichos capilares, un medio
para recoger dicho fluido que fluye a través de dichos capilares y
una válvula (44) de retención conectada aguas abajo de dicho
recipiente para impedir el flujo de retorno de dicho fluido hacia
dicho recipiente (10).
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha pluralidad de capilares (16) está configurada de modo que
permite el análisis automatizado de dichos capilares usando robótica
disponible comercialmente.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha pluralidad de capilares (16) está configurada de modo que
permite el análisis automatizado de dichos capilares (16) usando
robótica disponible comercialmente.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha pluralidad de capilares (16) está configurada en forma de
placas de microtitulación rápidamente intercambiables.
6. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha pluralidad de capilares (16) está configurada en forma de
placas de microtitulación rápidamente intercambiables.
7. Método según la reivindicación 5, en el que
el contenido de dichas placas de microtitulación está liofilizado y
sellado al vacío.
8. Método según la reivindicación 6, en el que
el contenido de dichas placas de microtitulación está liofilizado y
sellado al vacío.
9. Dispositivo (1) de prueba para la
monitorización y bioprospección medioambientales para detectar
microorganismos dentro de un entorno especificado, comprendiendo
dicho dispositivo:
un medio para proporcionar una pluralidad de
microcosmos (16) de prueba, separados físicamente que están
configurados de modo que permiten que fluya fluido a través de
dichos microcosmos,
un medio para contener y proteger dichos
microcosmos (16) de prueba cuando se colocan en dicho entorno,
proporcionando además dicho medio que el flujo de fluido de dicho
entorno circundante entre y fluya a través de dichos microcosmos
(16), y
un medio para cubrir dichas vías de flujo de
fluido a través de dichos microcosmos (16) de modo que se regula el
flujo a través de dichos microcosmos.
10. Dispositivo (1) de prueba según la
reivindicación 9:
en el que dicha pluralidad de microcosmos (16)
está configurada de modo que permite el análisis automatizado de
dichos microcosmos usando robótica disponible comercialmente.
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