ES2312767T3 - Vegf activo resistente a la proteolisis. - Google Patents
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Abstract
Variante de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), caracterizada porque la alanina está intercambiada en la posición del aminoácido 111 de VEGF nativo por prolina.
Description
VEGF activo resistente a la proteólisis.
Es objeto de la invención el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) en el que la alanina en la
posición del aminoácido 111 está intercambiada por prolina. La
arginina en la posición del aminoácido 110 puede estar sustituida a
este respecto por otro aminoácido. La invención se refiere también a
derivados del VEGF según la invención, a ácidos nucleicos, sistemas
de expresión, medicamentos y al uso de mutantes de VEGF de la
invención para el tratamiento de heridas crónicas.
Es un estado importante de la curación de
heridas cutáneas la formación de un tejido de granulación. Está
estrechamente ligada a esto último la migración de vasos recién
formados (neoangiogénesis). Numerosos estudios experimentales y
clínicos muestran que las heridas crónicas se caracterizan por una
angiogénesis alterada y por tanto por una formación reducida de
tejido de granulación.
Se conoce un gran número de mediadores que
estimulan la angiogénesis durante la curación de heridas. Entre
éstos, se cuentan por un lado aquellos factores que además de la
estimulación de células endoteliales activan también células
mesenquimáticas y/o epidérmicas (bFGF, aFGF, TGF-a,
PDGF) y por otro lado los denominados factores específicos de
células endoteliales, cuyos receptores están esencialmente limitados
a células endoteliales (VEGF, angiopoyetina). Múltiples reacciones
fisiológicas y patológicas con participación de los vasos sanguíneos
se correlacionan con una expresión elevada de VEGF y sus
receptores, de modo que al VEGF le corresponde un papel básico en
la angiogénesis de la piel. Se ofrecieron las primeras indicaciones
del posible significado del VEGF en las alteraciones en la curación
de heridas en el fundamento de experimentos para la expresión de
VEGF en ratones diabéticos (ratones db/db) (Frank et al.,
1995). En este modelo, podía mostrarse que la alteración de la
curación de heridas se correlaciona con una expresión reducida de
VEGF. El papel del VEGF en la curación de heridas pudo apoyarse
recientemente mediante otro modelo animal transgénico (Fukumura
et al., 1998) y la detección de VEGF en la serosidad de
heridas humanas agudas (Nissen et al., 1998).
Además, se ha mostrado que los ARNm de VEGF y
sus receptores se expresan aumentados en tejidos de heridas
crónicas (Lauer et al., 2000). Las investigaciones mediante
PAGE-SDS muestran sin embargo una descomposición de
la proteína VEGF en entorno de herida crónica, en contraposición con
heridas agudas. Esta descomposición conduce a un daño significativo
de la actividad biológica y por tanto, a pesar de la expresión
elevada de receptores de VEGF, puede motivar una estimulación
deficiente de la neoangiogénesis en entorno de herida crónica. Como
se ilustra anteriormente, ha podido mostrarse que la plasmina
participa en la escisión de VEGF en entorno de herida crónica
(Lauer et al., 2000).
La escisión de VEGF_{165} por plasmina conduce
a la separación de los dominios carboxiterminales, que se codifican
a partir del exón 7. Aunque las propiedades de unión de VEGF a los
receptores de VEGF Flt-1 y Flk-1/KDR
están determinadas por los exones 3 y 4, el exón 7 posee una
importancia crítica en la interacción de VEGF con
neuropilina-1 (Keyt et al. 1996). La
neuropilina-1 es una glucoproteína de 130 kDa de la
superficie celular. Hace poco se ha descrito su papel en la
potenciación del efecto mitogénico de VEGF sobre células
endoteliales (Soker et al. 1998). A este respecto, la
interacción de neuropilina-1 con
Flk-1/KDR parece significativa, ya que la sola
unión de VEGF a neuropilina-1 no ejerce ningún
efecto de señal.
La plasmina pertenece a la clase de las
serinproteasas. Estas enzimas son capaces de escindir enlaces
peptídicos. La escisión se realiza por la denominada triada
catalítica. A este respecto, desempeñan un papel esencial en el
centro catalítico particularmente la denominada serina, pero también
los aminoácidos histidina y aspartato, ya que el proceso de
escisión peptídico se realiza por ellos (Stryer 1987, pág. 231 y
siguientes). Aunque el mecanismo de escisión de enlace es idéntico
en todas las serinproteasas, se diferencia claramente en su
especificidad de sustrato. Así, la plasmina escinde igualmente que
la tripsina enlaces peptídicos después de los aminoácidos básicos
lisina y arginina. La especificidad de sustrato de la plasmina, que
se determina mediante la estructura del centro catalítico, conduce
sin embargo a que la plasmina no pueda escindir cada uno de estos
enlaces. La catálisis de la escisión de enlace peptídico puede
realizarse sólo si los correspondientes segmentos proteicos son
capaces de interaccionar con el centro catalítico de la enzima
(Powers et al. 1993; Stryer 1987). Hasta ahora, no es
conocida ninguna secuencia de consenso inequívoca para un sitio de
corte de plasmina.
El documento WO97/08313 da a conocer 30
mutaciones/variantes de VEGF, su preparación y uso (por ejemplo,
para el tratamiento de traumatismos vasculares). Las variantes de
VEGF dadas a conocer son, entre otras, VEGF D109A, R110A, R112A y
KKDR (107-110)AAAA. Las variantes de VEGF se
han expresado recombinantemente (codificadas mediante ADNc con
secuencia señal) en células 293 y se han ensayado. El documento
WO97/08313 se refiere a la configuración modular de VEGF y a
fragmentos de VEGF que se obtienen mediante la escisión con
plasmina.
La presente invención se basa en el objetivo de
proporcionar mejores agentes para la curación de heridas crónicas.
Sorprendentemente, se consigue este objetivo mediante la provisión
según la invención de una variante de factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) que se caracteriza porque la alanina en
la posición del aminoácido 111 del factor de crecimiento endotelial
vascular nativo está intercambiada por prolina.
Particularmente, en la variante de VEGF según la
invención, la arginina en la posición del aminoácido 110 del factor
de crecimiento endotelial vascular nativo y la alanina en la
posición del aminoácido 111 del factor de crecimiento endotelial
vascular nativo están sustituidas por prolina.
Los mutantes de VEGF según la invención se
presentan preferiblemente como una de las variantes de ayuste
VEGF_{121}, VEGF_{145}, VEGF_{165}, VEGF_{183},
VEGF_{189} o VEGF_{206}.
Los mutantes de VEGF según la invención no sólo
presentan una estabilidad claramente elevada frente a plasmina,
sino también una actividad comparable con VEGF de tipo natural.
Sorprendentemente, las variantes de VEGF según la invención
presentan además una estabilidad elevada en exudados de herida
crónica.
Las mutaciones se llevaron a cabo en uno de los
sitios críticos para la actividad biológica de la molécula de VEGF.
Por tanto, había de temerse que una modificación de la estructura de
proteína en esta zona influyera negativamente en la actividad de
VEGF_{165}. En el aminoácido prolina, que se introduce según la
invención en la posición 111, se trata de un
\alpha-iminoácido cíclico. Por la forma cíclica
del resto de pirrolidina, posee una conformación rígida que afecta
también a la estructura de la proteína respectiva. Así, la prolina
funciona, por ejemplo, como un fuerte interruptor de hélice
\alpha. Por tanto, es especialmente sorprendente que precisamente
mediante la sustitución de la alanina en posición 111 por prolina se
produzca un mutante de VEGF que sea estable frente a la proteasa
plasmina, estable en exudados de heridas crónicas y además presente
una actividad correspondiente a la proteína de tipo natural.
Son objeto de la invención particularmente
variantes de VEGF de ambas secuencias SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2.
Son también objeto de la invención variantes de
los mutantes de VEGF anteriormente indicados en las que las
secuencias de aminoácidos están modificadas o derivatizadas, o
contienen mutaciones, inserciones o deleciones. Particularmente,
esto se refiere a variantes de VEGF en las que otros aminoácidos
individuales están intercambiados y a aquellos que están
glucosilados, amidados, acetilados, sulfatados o fosforilados.
Preferiblemente, dichas variantes de VEGF tienen una actividad
comparable a o mayor que VEGF de tipo natural.
Las variantes de VEGF según la invención pueden
presentar también una secuencia señal.
Son también objeto de la invención ácidos
nucleicos que codifican los mutantes de VEGF anteriormente citados,
y vectores para la expresión de VEGF que contienen dichos ácidos
nucleicos.
Es también objeto de la invención un medicamento
que contiene los mutantes de VEGF anteriormente citados, así como
el uso de mutantes de VEGF para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de heridas crónicas, causadas por alteraciones
vasculares como insuficiencia crónica venosa (ICV), linfedema
primario/secundario, oclusión arterial, enfermedades metabólicas
como diabetes mellitus, gota o escaras por decúbito, enfermedades
inflamatorias crónicas como pioderma gangrenoso, vasculitis,
dermatosis perforantes como necrobiosis lipoídica diabética y
granuloma anular, enfermedades fundamentales hematológicas como
alteraciones de la coagulación, anemia de células falciformes y
policitemia vera, tumores como tumores cutáneos primarios y
metástasis exulceradas, así como inhibición de plasmina, para la
inducción de neoangiogénesis y/o para la inhibición de la
degradación de
matriz.
matriz.
La aplicación tópica de factores de crecimiento
representa un nuevo concepto terapéutico en la curación de heridas.
Ha podido observarse una mejora de la curación de heridas crónicas
en un gran número de estudios clínicos con la aplicación de EGF,
bFGF, PDWHF y PDGF (Scharffetter-Kochanek et
al. 2000). Sin embargo, debe señalarse críticamente que los
resultados de estos estudios están por debajo de las expectativas
que se han creado respecto a la buena eficacia de estos mediadores
en modelos animales (Lawrence et al. 1994). Es una
explicación esencial de esta eficacia limitada de los factores de
crecimiento seguramente la actividad proteolítica elevada en el
entorno de herida crónica, que conduce a la degradación de factores
administrados por vía tópica. Por tanto, se observa claramente que
la gestión local de heridas mediante la administración de factores
de crecimiento representa una nueva estrategia terapéutica
prometedora. Sin embargo, es necesario desarrollar estrategias que
controlen la actividad proteolítica en el entorno de herida crónica.
La preparación de citocinas patrón con estabilidad elevada en
entorno de herida crónica representa seguramente a este respecto un
nuevo principio terapéutico. Los mutantes de VEGF según la invención
son adecuados en gran medida debido a su alta estabilidad en
serosidad para el tratamiento tópico de heridas
crónicas.
crónicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante mutagénesis dirigida a sitio, se
prepararon cuatro mutantes efectuando los intercambios de aminoácido
selectivos en Arg_{110} y Ala_{111}. Se clonó el ADNc que
codifica VEGF_{165} humano en el vector de expresión de
replicación pcDNA 3.1 (compañía Invitrogen, De Schelp, Holanda)
usando los sitios de corte de BamHI y EcoRI en el sitio de
clonación. Para la mutagénesis in vitro dirigida a sitio, se
usó el sistema Gene Editor^{TM} de la compañía Promega
(Mannheim). Éste se basa en la adición de oligonucleótidos que
portan la correspondiente mutación a la secuencia de partida. La
secuencia de partida del VEGF_{165} en la zona de las mutaciones
es:
Para la introducción de mutaciones, se usaron
los siguientes oligonucleótidos "de apareamiento erróneo" como
cebadores:
Mutación 1: Mut_{Ala}:
Mutación 2: Mut_{Gln}:
Mutación 3: Mut_{Pro}:
Mutación 4:
Mut_{Lys-Pro}:
Los cebadores de mutagénesis usados se indican
respectivamente con las secuencias de aminoácidos obtenidas a
partir de ellas. Se marcan en cursiva las zonas con bases o
aminoácidos modificados frente a la secuencia de tipo natural.
En la mutación 1, se intercambió la
arginina_{110} por una alanina apolar. En la mutación 2, se
introdujo en la misma posición una glutamina polar no cargada. En
el mutante 3, no se intercambió la arginina_{110} básica, sino la
alanina en posición 111 por una prolina. En el mutante 4, se
intercambiaron dos aminoácidos. Aquí, se insertaron, en lugar de
arginina_{110} y alanina_{110}, lisina y prolina. Después de la
práctica de la mutagénesis, se realizó la verificación de las
mutaciones mediante análisis de secuencia. Los mutantes de VEGF
obtenidos tenían en los aminoácidos 109-112 las
siguientes secuencias:
- VEGF_{165}-tipo natural:
- -Asp_{109} Arg_{110} Ala_{111} Arg_{112}-
- Mut_{Gln}:
- -Asp_{109} Gln_{110} Ala_{111} Arg_{112}-
- Mut_{Ala}:
- -Asp_{109} Ala_{110} Ala_{111} Arg_{112}-
- Mut_{Pro}:
- -Asp_{109} Arg_{110} Pro_{111} Arg_{112}-
- Mut_{Lys-Pro}:
- -Asp_{109} Lys_{110} Pro_{111} Arg_{112}-
Los mutantes Mut_{Pro} y
Mut_{Lys-Pro} son mutantes según la invención,
mientras que Mut_{Gln} y Mut_{Ala} se preparan y ensayan con
fines comparativos. Los vectores de expresión de VEGF_{165}
obtenidos se usaron en los análisis adicionales.
Se realizó la expresión de proteína VEGF_{165}
en células COS-1 eucarióticas. El vector de
expresión pcDNA 3.1 usado contiene un origen de replicación de
SV-40. Éste sirve para la amplificación del vector
en células que expresan un antígeno T grande del virus
SV-40. Las células COS-1 usadas
poseen un correspondiente elemento integrado en el genoma, de modo
que se llega aquí a una replicación episómica del vector. De este
modo, se consigue una expresión de la proteína diana VEGF durante
varios días sin integración estable (transformación) del vector en
el genoma celular. Las células COS-1 se
transfectaron con los plásmidos de expresión obtenidos en la
mutagénesis. Para ello, se usó el reactivo de transfección Superfect
(QIAGEN, Hilden) según las instrucciones del fabricante.
Como un gran número de factores de crecimiento,
el VEGF_{165} posee también un sitio de unión a heparina que se
localiza en el extremo C básico. La unión a heparina se ha empleado
para la purificación de la proteína mediante cromatografía de
afinidad (Mohanraj et al. 1995). El aislamiento de VEGF y
variantes de VEGF se realizó mediante las siguientes etapas:
Se cultivaron células COS-1
transformadas con los plásmidos de expresión en DMEM (medio de Eagle
modificado por Dulbecco) exento de suero, que contiene 10% de suero
fetal bovino (FCS), L-glutamina 2 mM, penicilina
(10 U/ml) y estreptomicina (10 \mug/ml) y suplemento ITS (Sigma,
Deisenhofen). Se combinó después de 48 h con medio acondicionado
(200 ml) y se incubó durante 4 horas con 5 ml de
heparina-Sepharose (Pharmacia, Freiburg) a 4ºC. Se
empaquetó en una columna la heparina-Sepharose. Se
cargó ésta a un caudal de 25 ml/h con medio de cultivo. Se llevaron
a cabo las siguientes etapas:
A: Cromatografía de afinidad con
heparina-Sepharose
- 1.
- Lavado: NaCl 0,1 M; Tris 20 mM/pH 7,2
- 2.
- Lavado: NaCl 0,3 M; Tris 20 mM/pH 7,2
- 3.
- Elución: NaCl 0,9 M; Tris 20 mM/pH 7,2
B: Análisis de las fracciones obtenidas mediante
análisis de transferencia Western
C: Desalado de las fracciones que contienen VEGF
mediante filtración en gel con tampón de elución: Tris 10 mM/pH
7,2
D: Liofilización de la solución y determinación
de la concentración mediante ELISA
Se analizó el VEGF obtenido mediante
PAGE-SDS. La proteína VEGF obtenida a partir de
células COS-1 se diferencia en su comportamiento de
elución en PAGE-SDS de la VEGF_{165} usada
obtenida comercialmente (compañía R&D Systems). Además de la
señal detectable a 42 kDa (figura 1, carril 6), se identifica otra
banda con un peso molecular algunos kDa mayor. La razón de esta
doble banda de la proteína VEGF expresada en células
COS-1 es una glucosilación modificada del factor de
crecimiento. En células COS-1, se llega con la
expresión de VEGF a la formación de dos proteínas glucosiladas
diferentemente. Una forma (42 kDa) es idéntica en su glucosilación
a la VEGF_{165} recombinante usada hasta ahora, que se ha
producido en células de insecto con un sistema de expresión de
baculovirus (R&D Systems, figura 1, carril 1). Presenta en el
aminoácido asparagina en posición 74 una N-glucosilación
(Gospodarowicz et al. 1989; Keck et al. 1989). La
segunda banda se genera a mayor peso molecular (45 kDa) debido a
una glucosilación adicional de la proteína. La diferencia de
glucosilación es conocida para la expresión en células COS y no
tiene efecto sobre la actividad biológica del factor de crecimiento
(R&D Systems).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó en primer lugar en las cuatro
proteínas de VEGF mutadas purificadas su estabilidad frente a la
proteasa plasmina. Se analizó si las mutaciones efectuadas conducían
a un comportamiento de degradación modificado en comparación con
VEGF de tipo natural.
La Figura 1 muestra los resultados de una
incubación de VEGF de tipo natural y de mutantes de VEGF con
plasmina. La incubación de VEGF de tipo natural sintetizado en
células COS-1 (A, carriles 6-10)
mostró ya después de 15 minutos una degradación del factor de
crecimiento. A este respecto, es difícil la determinación exacta
del tamaño de los fragmentos generados mediante
PAGE-SDS, ya que se superponen las señales de ambas
bandas de proteínas glucosiladas diferentemente. El patrón de
degradación es sin embargo similar al de VEGF_{165} obtenible
comercialmente (Figura 1A, carriles 1-5). Así, puede
detectarse después de 45 minutos un fragmento con un peso molecular
de 38 kDa. Este corresponde al fragmento dimérico 110 de la variante
de VEGF menos glucosilada. Estos resultados muestran claramente que
también la proteína VEGF que se ha expresado en células
COS-1 se escinde con plasmina en las condiciones
seleccionadas.
En la Figura 1B (carriles 1-17),
se observan los resultados de la incubación de proteínas mutadas. En
primer lugar, se representa la incubación de la mutación de
arginina a alanina (carriles 1-5). En el momento
cero de la incubación, se detectan, como en el tipo natural, dos
bandas de las variantes de proteína VEGF glucosiladas
diferentemente. Sin embargo, éstas no están aquí tan inequívocamente
diferenciadas entre sí como en VEGF_{165} de tipo natural debido
a la mayor intensidad de señal. En contraposición con VEGF de tipo
natural, la proteína mutada no muestra hasta 240 minutos después de
la incubación ninguna modificación del comportamiento de
elución.
Esta observación plantea la suposición de que la
mutación arginina_{110} a alanina_{110} ha conducido a la
inactivación del sitio de corte de plasmina. Como se representa en
la Figura 1B, los otros tres mutantes Mut_{Pro}, Mut_{Gln} y
Mut_{Lys-Pro} presentan también después de
incubación con plasmina durante 240 minutos una estabilidad
comparable de las bandas de señal a 45 y 42 kDa. No se degrada un
control en el que se incubó VEGF_{165} de tipo natural durante 4
horas a 37ºC con tampón de plasmina (carriles 18 y 19). En total,
estos experimentos apuntan a que los mutantes de VEGF producidos y
purificados son estables frente a la proteasa plasmina.
En la siguiente etapa, se analizó la degradación
de los mutantes de VEGF en exudado de herida de pacientes con
heridas agudas y crónicas. En la incubación de VEGF_{165} de tipo
natural y todos los mutantes de VEGF en exudado de herida aguda, no
era detectable ninguna degradación después de 240 minutos.
La Figura 2 muestra el efecto de exudado de
herida crónica sobre la estabilidad de las proteínas VEGF. La
incubación de VEGF de tipo natural sintetizado en células
COS-1 (Figura 2A, carriles 1-4)
durante 240 minutos muestra una degradación del factor de
crecimiento con un fragmento de aprox. 38 kDa. Esto corresponde al
fragmento dimérico 110 de la variante de VEGF menos
glucosilada.
En contraposición con el tipo natural, los
mutantes de VEGF_{165} muestran otro comportamiento de degradación
en la incubación en exudado de herida crónica. Por un lado, se
observa en las mutaciones Mut_{Gln} (Figura 2B, carriles
13-16 y Mut_{Ala} (carriles 5-8)
un proceso de degradación que es comparable con el tipo natural. Se
generan ya después de 20 min fragmentos con un peso molecular de
aprox. 38 kDa.
Por otro lado, el análisis de los mutantes
Mut_{Pro} (carriles 9-12) y
Mut_{Lys-Pro} (carriles 1-4,
17-20) presenta un comportamiento de degradación
divergente del tipo natural y de los mutantes Mut_{Ala} y
Mut_{Gln}. Hasta 60 minutos después de la incubación, se muestra
en PAGE-SDS una señal estable a 42 y 45 kDa. Esto
apunta a una estabilización de las proteínas mutadas Mut_{Pro} y
Mut_{Lys-Pro} en el exudado de herida crónica.
Esta diferencia en el comportamiento de degradación de los mutantes
con aminoácidos neutros/apolares y aquellos con prolina plantea la
suposición de que, en entorno de herida crónica, participan además
de plasmina otras proteasas en la degradación de VEGF.
240 minutos después de la incubación en exudado
de herida crónica, se observa en todas las proteínas mutadas una
degradación. A este respecto, no se llega a la formación de
fragmentos de degradación claramente definidos, de hecho, se genera
después de 240 minutos una señal difusa entre 38 y 45 kDa.
Probablemente, se trata a este respecto de proteólisis en la zona
de los primeros 20 aminoácidos (sitio de reconocimiento del
anticuerpo), ya que la potencia de la señal se reduce claramente
después de 240 min.
En resumen, los resultados indican que los
mutantes de VEGF con prolina en la posición 111 se estabilizan en
primer lugar en exudado de herida crónica, pero se degradan a largo
plazo. Se observan resultados comparables en los exudados de
heridas de tres pacientes distintos con insuficiencia venosa
crónica. Los experimentos para los distintos exudados de heridas se
repitieron al menos dos veces (Figura 2B: paciente X, carriles
1-4; paciente Y, carriles 17-20). A
este respecto, el patrón de bandas generado permaneció siempre
igual.
En la Figura 2C se representa una valoración
densitométrica de la degradación de VEGF de tipo natural y
Mut_{Lys-Pro}. El objetivo del análisis era la
cuantificación de la estabilización de los mutantes de VEGF en
exudado de herida crónica. Con este fin, se determinó la
modificación dependiente del tiempo de la potencia de la señal en
el máximo de la señal de partida (zona de 42-45 kDa)
en comparación con la señal en el momento cero. Las densidades
densitométricas medidas en distintos momentos se representan como
porcentaje de la señal de partida. En este análisis densitométrico,
se observa claramente que, en cada momento de la medida, los
mutantes de VEGF muestran en comparación con VEGF de tipo natural
una señal más potente en la zona de 42-45 kDa y por
tanto se presenta la proteína VEGF_{165} intacta. Esta observación
plantea la suposición de que esta mutación conduce a una
estabilidad y bioactividad mejoradas de la proteína VEGF en entorno
de herida crónica. Ya 20 minutos después de la incubación, la
diferencia entre tipo natural y mutantes es estadísticamente
significativa. Las medidas se llevaron a cabo en tres experimentos
independientes con idéntico exudado de herida.
Se analizó si las mutaciones tienen influencia
sobre la actividad biológica de la molécula de VEGF. Se ensayó la
actividad biológica mediante un ensayo de proliferación de BrdU
(Roche Diagnostics, Mannheim) en células endoteliales de vena
umbilical humanas (células HUVE) según los datos del fabricante. A
este respecto, se cultivaron las células HUVE con adición de
distintos mutantes de VEGF, después se incubaron durante 6 horas
con solución de BrdU y se fijaron, tras de lo cual se llevó a cabo
un ELISA usando un anticuerpo específico de BrdU.
Se emplearon concentraciones de VEGF entre 1
ng/ml y 25 ng/ml. La proteína VEGF_{165} recombinante obtenible
comercialmente (R&D Sytems) y VEGF_{165} de tipo natural
sintetizada en células COS-1 mostraron una
estimulación semimáxima de la incorporación de BrdU a aprox. 3
ng/ml (Figura 3). Las proteínas VEGF mutadas se caracterizan por
una estimulación de la proliferación de células endoteliales
comparable a VEGF de tipo natural sintetizada en células
COS-1. La estimulación máxima de todas las proteínas
sintetizadas en células COS-1 era menor que por
VEGF_{165} de tipo natural obtenible comercialmente. La diferencia
entre ambos desarrollos de la curva puede justificarse por los
diferentes sistemas de expresión y procedimientos de purificación de
las proteínas (Mohanraj et al. 1995). La actividad biológica
de VEGF_{165} no se influye por tanto significativamente por las
mutaciones llevadas a cabo.
A continuación, se afrontó la pregunta de en qué
medida se influye la actividad biológica de VEGF_{165} de tipo
natural y mutantes de VEGF después de incubación en plasmina. Con
este fin, se incubaron las proteínas VEGF con plasmina y a
continuación se ensayó la actividad biológica mediante un ensayo de
proliferación de BrdU en células HUVE.
En la representación gráfica (Figura 4), se
representa la incorporación de BrdU como porcentaje de la señal de
partida (momento t = 0). La incubación de VEGF de tipo natural
(sintetizada en células COS-1 y de R&D Systems),
así como de los mutantes de VEGF Mut_{Ala} y
Mut_{Lys-Pro} en tampón de plasmina a 37ºC no
mostró ningún perjuicio de la actividad biológica de las proteínas
(Figuras 4 A-D). En contraposición con ello, la
incubación de VEGF de tipo natural en plasmina conduce a una clara
reducción de la actividad biológica (Figuras 4 A, B). Ya 20 minutos
después de la incubación, se muestra una pérdida de actividad de al
menos un 20%, que después cae de nuevo aproximadamente a un 50% de
la actividad de partida después de 240 minutos. Los mutantes
Mut_{Ala} y Mut_{Lys-Pro} no muestran ninguna
pérdida significativa de actividad después de incubación con
plasmina (Figuras 4 C, D). Estos resultados subrayan la
"resistencia a la plasmina" representada en transferencia
Western de los mutantes (Figura 1) y muestran que las proteínas
mutadas son también estables después de incubación con
plasmina.
Las mutaciones insertadas tienen por tanto como
consecuencia una inhibición de la escisión de VEGF por plasmina.
Mediante la mutación de Ala_{111} a Pro_{111}, puede inducirse
una estabilización de VEGF y por tanto una actividad biológica
elevada en entorno de herida crónica.
Figura 1: Las mutaciones de VEGF_{165} son
resistentes frente a la escisión por plasmina. La Figura muestra la
incubación de VEGF_{165} y las proteínas mutadas en una solución
de plasmina [0,01 U/ml] o solución tampón (B, carriles 18, 19)
durante el periodo dado. El análisis del comportamiento de
degradación se realizó mediante transferencia Western e
inmunodetección.
Figura 2: La mutación de Ala_{111} a
Pro_{111} eleva la estabilidad de VEGF en exudado de herida
crónica. A) en VEGF_{165} de tipo natural expresado en células
COS-1. B) Las variantes de VEGF se incubaron durante
los periodos dados en exudado de herida crónica y se representó el
comportamiento de degradación mediante inmunodetección. A este
respecto, se ensayaron los exudados de herida de dos pacientes
distintos: paciente X, carriles 1-16; paciente Y,
carriles 17-20. C) representación densitométrica de
la degradación de VEGF de tipo natural y
Mut_{Lys-Pro} en exudado de herida crónica. Se
representa la potencia relativa de señal de tres análisis de
transferencia Western llevados a cado independientemente (PM \pm
DE).
Figura 3: Los mutantes de VEGF son
biológicamente activos. Se incubaron VEGF_{165} de tipo natural y
mutantes de VEGF respectivamente a concentraciones crecientes con
células HUVE. Se representan las tasas de integración determinadas
mediante ELISA de BrdU del análogo de bases en el ADN de células en
proliferación (PM \pm DE, n= 3).
Figura 4: La plasmina no altera la actividad
biológica de los mutantes de VEGF_{165}. Se confronta la
incorporación relativa de BrdU a células HUVE mediante estimulación
con VEGF_{165} de tipo natural (A, B), Mut_{Ala} (C) y
Mut_{Lys-Pro} (D) después de la incubación de la
proteína dada en tampón o plasmina (valores medios \pm DE; n =
3).
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<160> 18
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: VEGF humano mutado
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<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 165
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: VEGF humano mutado
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<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 26
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido señal
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de partida de VEGF_{165} en la que se
introducen mutaciones
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (3)..(26)
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de partida de VEGF_{165} en la que se
introducen
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\hskip-.1em\dddseqskipmutaciones
\hfill
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<400> 5
\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "de apareamiento erróneo"
Mut_{pro} como cebador para la mutagénesis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (3)..(26)
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{pro} como cebador para la mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{Gln} como cebador para la mutagénesis
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (3) .. (26)
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<210> 9
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{Gln} como cebador para la mutagénesis
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<400> 9
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<210> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{Pro} como cebador para la mutagénesis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (3) .. (26)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{Pro} como cebador para la mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
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<210> 12
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{Lys-Pro} como cebador para la
mutagénesis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (3)..(26)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido "con apareamiento erróneo"
Mut_{Lys-Pro} como cebador para la
mutagénesis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: aminoácidos 109-112 de VEGF_{165} de
tipo natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: aminoácidos 109-112 de VEGF mutante
Mut_{Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: aminoácidos 109-112 de VEGF mutante
Mut_{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
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<210> 17
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: aminoácidos 109-112 de VEGF mutante
Mut_{Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: aminoácidos 109-112 de VEGF mutante
Mut_{Lys-Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
Claims (9)
1. Variante de factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF), caracterizada porque la alanina está
intercambiada en la posición del aminoácido 111 de VEGF nativo por
prolina.
2. Variante de VEGF según la reivindicación 1,
caracterizada porque adicionalmente está intercambiado al
menos otro aminoácido en una de las posiciones 109 a 112.
3. Variante de VEGF según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la variante de VEGF se presenta
como una de las variantes de ayuste VEGF_{121}, VEGF_{145},
VEGF_{165}, VEGF_{183}, VEGF_{189} o VEGF_{206}.
4. Variante de VEGF_{165} según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque presenta una de
las secuencias de aminoácidos
SEC Nº 1:
o SEC Nº ID
2:
5. Variante de VEGF según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la cadena de
aminoácidos presenta una secuencia señal.
6. Ácidos nucleicos que codifican variantes de
VEGF según una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Vectores que contienen ácidos nucleicos
según la reivindicación 6 para la expresión de variantes de VEGF
según una de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Medicamento que contiene variantes de VEGF
según una de las reivindicaciones 1 a 5, ácidos nucleicos según la
reivindicación 6 o vectores según la reivindicación 7.
9. Uso de variantes de VEGF según una de las
reivindicaciones 1 a 5, de ácidos nucleicos según la reivindicación
6 o de vectores según la reivindicación 7 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de heridas crónicas,
particularmente causadas por alteraciones vasculares como
insuficiencia crónica venosa (ICV), linfedema primario/secundario,
oclusión arterial, enfermedades metabólicas como diabetes mellitus,
gota o escaras por decúbito enfermedades inflamatorias crónicas
como pioderma gangrenoso, vasculitis, dermatosis perforantes como
necrobiosis lipoídica diabética y granuloma anular, enfermedades
fundamentales hematológicas como alteraciones de la coagulación,
anemia de células falciformes y policitemia vera, tumores como
tumores cutáneos primarios y metástasis exulceradas, para la
inhibición de plasmina, para la inducción de la neoangiogénesis y/o
para la inhibición de la degradación de matriz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02005186A EP1342783A1 (de) | 2002-03-08 | 2002-03-08 | Proteolyseresistenter aktiver VEGF |
| EP02005186 | 2002-03-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2312767T3 true ES2312767T3 (es) | 2009-03-01 |
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ID=27741149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (2) | EP1342783A1 (es) |
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