ES2311522T3 - Acidos nucleicos compactados, mejorados y liofilizables. - Google Patents

Abstract

Una composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados, estando cada complejo constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas, en la que dichos complejos se forman mezclando dicha molécula de ácido nucleico y dichas moléculas policatiónicas, teniendo dichas moléculas policatiónicas, antes de la mezcla, un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro, teniendo dichos complejos una forma de varilla cuando se visualizan con un microscopio electrónico de transmisión.

Description

Ácidos nucleicos compactados, mejorados y liofilizables.

Antecedentes de la invención

A pesar de la promesa de los modelos preclínicos para la terapia génica sistémica del hígado, pulmón y otros tejidos, actualmente no existe un producto de terapia génica comercial en el mercado. El fallo de la mayoría de las pruebas clínicas de terapia génica en seres humanos para tratar trastornos metabólicos y el cáncer ha sido atribuido a la relativa ineficacia de los sistemas de transferencia de genes víricos y no víricos. Los vectores víricos se han usado para la mayoría de los estudios de terapias génicas debido a su capacidad para infectar eficazmente células de cultivos tisulares. Sin embargo, es necesario aplicar una enorme carga útil de partículas en una inyección intravenosa para transducir células in vivo, y las toxicidades de los vectores víricos están bien documentadas [1], incluyendo la reciente toxicidad letal que tuvo lugar tras una inyección en la vena porta de un adenovirus recombinante [2]. Por el contrario, los sistemas no víricos se consideran en general seguros aunque ineficaces. Existe la opinión cada vez más generalizada de que los sistemas no víricos serán el vector elegido para aplicaciones in vivo una vez mejorada la eficacia de la transferencia génica.

Son varios los obstáculos que limitan los procedimientos no víricos de transferencia de genes, incluyendo: i) la estabilidad de partículas en la sangre y en los tejidos intersticiales; ii) la capacidad de la partícula de transferencia génica para salir de los capilares y transportarse hacia las células parenquimales; iii) la entrada de células por medio de la endocitosis mediada por receptores o la fusión celular; iv) la estabilidad en y la fuga de los compartimentos endosomiales y lisosomales; v) la velocidad de difusión en el citoplasma; vi) el tránsito por los poros nucleares; y vii) "el des-revestimiento" del ADN para permitir la función biológica en el núcleo. Por ejemplo, son numerosas las publicaciones que han documentado el fallo de los procedimientos no víricos para transfectar células de crecimiento detenido post-mitóticas [3-11], presumiblemente, porque la membrana nuclear intacta de las células no divisibles restringe la entrada del ADN desnudo en el núcleo a través de los poros nucleares de 25 nm [12-13].

Por lo tanto, existe una necesidad continua en la técnica por formulaciones y procedimientos mejorados para la administración de genes a animales y a seres humanos. Además, existe la necesidad en la técnica por formulaciones que sean estables al almacenamiento y conserven su actividad biológica.

Resumen de la invención

Estos y otros objetos de la invención son proporcionados por una o más de las realizaciones reveladas a continuación. En una realización de la invención, se proporciona un procedimiento para determinar la estabilidad coloidal de una preparación de ácidos nucleicos compactados. Se determina un parámetro de turbidez de una solución de ácido nucleico compactado. El parámetro de turbidez se define como la pendiente de una línea recta obtenida mediante la representación del logaritmo de la absorbancia aparente de la luz frente al logaritmo de la longitud de onda incidente de la luz. La longitud de onda usada es de entre aproximadamente 330 nm y 420 nm. Una preparación se identifica como coloidalmente estable si se determina un parámetro de turbidez menor de -3. Una preparación se identifica como coloidalmente inestable si se determina un parámetro de turbidez mayor o igual a -3.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. Las moléculas policatiónicas tienen un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro. El complejo es compactado hasta un diámetro que es menor de (a) el doble del diámetro teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, o (b) 30 nm, el que sea mayor. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. Las moléculas policatiónicas tienen un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro. El complejo está compactado hasta un diámetro que es menor de (a) el doble del diámetro teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, o (b) 30 nm, el que sea mayor. El ácido nucleico se mezcla con el policatión que tiene acetato, bicarbonato o cloruro como contraión, a una concentración de sales suficiente para la compactación del complejo. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

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Se proporciona otra realización de la invención como un procedimiento para preparar una composición que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas que tienen un contraión de acetato, bicarbonato o cloruro. Se mezcla una molécula de ácido nucleico con una molécula policatiónica a una concentración de sales suficiente para compactar el complejo hasta un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, ó 30 nm, el que sea mayor. Se forman complejos de ácido nucleico desagregados. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

La presente invención también proporciona una composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. Las moléculas policatiónicas tienen un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro. La molécula de ácido nucleico codifica al menos una proteína funcional. Dicho complejo está compactado hasta un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, ó 30 nm, el que sea mayor. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

También se proporciona otra composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ADNc bicatenario y una o más moléculas policatiónicas. Dichas moléculas policatiónicas tienen un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro. La molécula de ADNc codifica al menos una proteína funcional. El complejo está compactado hasta un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de dicha única molécula de ADNc y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, ó 30 nm, el que sea mayor. Los complejos de ácido nucleico están asociados opcionalmente con un lípido. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

La presente invención proporciona otra composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. Las moléculas policatiónicas tienen un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro. La molécula de ácido nucleico codifica al menos un ácido nucleico antisentido. El complejo está compactado hasta un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, ó 30 nm, el que sea mayor. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P 10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. La molécula policatiónica tiene un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro. La molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN. El complejo está compactado hasta un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, ó 30 nm, el que sea mayor. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

Otro aspecto de la invención proporcionado en la presente memoria es un procedimiento para preparar una composición que comprende complejos de ácido nucleico desagregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. Se mezcla una molécula de ácido nucleico con una molécula policatiónica en un disolvente para formar un complejo. La mezcla se realiza sin añadir sal, por lo que el ácido nucleico forma complejos solubles con la molécula policatiónica sin formar agregados. Cada complejo está constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas. Los complejos tienen un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de la única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada, ó 30 nm, el que sea mayor. El policatión tiene acetato, bicarbonato y cloruro como contraión. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

Finalmente, la presente invención proporciona el uso de las composiciones de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad u otra condición clínica en un sujeto. La cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una composición se administra intramuscularmente o en el pulmón. La composición comprende: complejos de ácido nucleico desagregados, estando cada complejo constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas, teniendo dicha molécula policatiónica acetato, cloruro o bicarbonato como contraión, estando dicho complejo compactado hasta un diámetro que es menor de (a) el doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1 en forma de una esfera condensada, o (b) 30 nm, el que sea mayor. El ácido nucleico es uno cuya integración, hibridación o expresión dentro de las células diana del sujeto previene o trata una enfermedad u otra condición clínica. Opcionalmente, la una o más moléculas policatiónicas de los complejos de ácido nucleico desagregados son CK15-60P10, en el que se usa el acetato como contraión. El CK15-60P10 es un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina con una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa unida al residuo de cisteína.

La presente invención aporta así al estado de la técnica mejores técnicas analíticas y terapéuticas para administrar ADN a células proporcionando composiciones de ácidos nucleicos compactados que tienen mejores propiedades de estabilidad y transfectabilidad.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los resultados de una inyección intramuscular (IM) usando TFA (trifluoroacetato) y acetato como contraiones de la polilisina usada para compactar el ADN.

La figura 2 muestra los resultados de una inyección intramuscular usando TFA (trifluoroacetato) como contraión de la polilisina usada para compactar el ADN.

La figura 3 muestra los resultados de una inyección intramuscular usando acetato como contraiones para la polilisina usada para compactar el ADN.

La figura 4 muestra los resultados de una inyección intramuscular usando acetato como contraiones para la polilisina usada para compactar el ADN.

La fig. 5 muestra una variedad de parámetros que varían y su eficacia en las inyecciones IM, incluyendo el tamaño de la polilisina (CK), la sustitución con polietilenglicol.

La fig. 6 muestra la instilación intratraqueal de 100 ug de ADN desnudo y 100 ug de ADN compactado en comparación con la cantidad de expresión en el pulmón del gen instilado (luciferasa) en función del tiempo tras la transferencia génica.

La fig. 7A muestra la instilación intratraqueal de ADN desnudo y ADN compactado en comparación con la cantidad de expresión en el pulmón del gen instilado (luciferasa) en función del tiempo tras la transferencia génica. La fig. 7B muestra una gráfica de los datos sobre el fondo de la fig. 7A.

La fig. 8 muestra gráficas del parámetro de turbidez en función del tamaño de la polilisina usada en la compactación y el contraión.

Las figuras 9A, 9B y 9C muestran una comparación de la estabilidad en suero, del parámetro de turbidez y de la sedimentación para diversas formulaciones de ácidos nucleicos compactados. La fig. 9D presenta los resultados en una tabla.

La fig. 10 muestra la influencia del contraión sobre la morfología del ADN compactado con CK30 PEG-sustituida según lo observado en el microscopio electrónico.

La fig. 11 muestra la estabilidad del ADN de PLASmin® tras congelar y liofilizar. Las partículas se analizaron con sacarosa, trehalosa o sin excipiente. Las partículas se analizaron con y sin polietilenglicol y con TFA o acetato como contraión. La estabilidad del ADN fue evaluada mediante una centrifugación baja (3.400 xg x 1 min) hasta obtener agregados nodulares y haciendo un seguimiento de la absorbancia del ADN en el sobrenadante. La estabilidad con acetato como contraión superó a otras formulaciones sin excipiente.

La fig. 12 muestra la evaluación del parámetro de turbidez antes y después de la liofilización usando diversos excipientes, contraiones y con o sin polietilenglicol. La sacarosa y la trehalosa son muy eficaces en el mantenimiento de las propiedades de las partículas previas a la liofilización. Similarmente, el acetato con PEG fue eficaz en el mantenimiento de las propiedades.

La fig. 13 muestra una visualización de las partículas en el microscopio electrónico. Para las partículas de acetato de CK30-PEG10k en presencia de trehalosa 0,5M, las partículas compactadas en forma de varilla presentaban un aspecto idéntico antes y después de la liofilización de, y la rehidratación.

La fig. 14 muestra una visualización de las partículas en el microscopio electrónico. Para las partículas hechas de TFA con CK30 en presencia de sacarosa 0,5M, las partículas elipsoidales del ADN compactado presentaban un aspecto idéntico antes y después de la liofilización, y de la rehidratación.

La fig. 15 muestra los resultados de los experimentos de transferencia génica usando complejos PLASmin® liofilizados. La enzima luciferasa fue codificada por los complejos y su actividad se midió como un procedimiento para controlar la transferencia génica. Mientras que la sacarosa y la trehalosa resultaron eficaces para proteger la actividad de la transferencia génica frente a todas las partículas, las partículas que contenían polietilenglicol (10 kDa) y acetato como contraión resultaron ser sorprendentemente estables a la liofilización, incluso en ausencia de excipiente crioprotector (disacárido).

La fig. 16 muestra una comparación de la estabilidad coloidal de complejos de ADN de CK30P10K y CK45P10K compactados usando diversos contraiones en NaCl al 0,9%. La estabilidad coloidal se evalúa mediante la sedimentación y el parámetro de turbidez.

La fig. 17 muestra una micrografía electrónica de ADN de plásmido compactado por CK45P10 con cloruro como contraión. Ampliación: 40.000. La barra muestra 100 nm.

La fig. 18 muestra una electroforesis sobre gel de agarosa de ADN compactado por polilisina pegilada (CK30P10K) con diversos contraiones. La influencia de los contraiones sobre la carga neta eficaz del ADN condensado se puede ver mediante la migración del ADN compactado a través del gel. La fig. 18 también muestra la estabilidad en suero de los complejos de CK30P10K-ADN con cada uno de los diferentes contraiones.

La fig. 19 muestra la expresión in vivo del plásmido de luciferasa compactado mediante diversas formas de contraión de polilisina pegilada (CK30P10K) tras una aplicación intramuscular. Cada punto representa un animal. La línea continua indica la señal de fondo del análisis de la luciferasa. La dosis fue de 100 \mug de ADN.

La fig. 20 muestra la expresión in vivo del plásmido de luciferasa compactado mediante diversas formas de polilisina pegilada tras una aplicación intranasal. Se usaron las formas de acetato, bicarbonato y TFA de CD30P10K y la forma de cloruro de CK45P10K. La formulación de acetato se preparó bien en solución salina o en agua. Cada punto representa un animal. La línea continua indica la señal de fondo del análisis de la luciferasa. La dosis fue de 100 \mug de ADN.

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Descripción detallada de la invención

Las patentes estadounidenses 5.844.107; 5.877.302; 6.008.336; 6.077.835; 5.972.901; 6.200.801 y 5.972.900, y las solicitudes con número de serie 60/145.970; 09/722.340; 09/311.553 y 60/207.949 forman el estado de la técnica. Los documentos US 5.844.107 y US 5.877.302 revelan complejos de ácido nucleico y policatión en los que el complejo comprende una sola molécula de ácido nucleico.

Los contraiones de los policationes usados para compactar ácidos nucleicos afectan profundamente a la forma de las partículas constituidas. La forma está asociada con la resistencia diferencial a la nucleasa en suero y a la estabilidad coloidal. Un sustituto para determinar tales propiedades que es fácil de medir es el parámetro de turbidez. Además, la forma afecta a la idoneidad y a la eficacia de los complejos de ácido nucleico compactados para transfectar células por diversas vías en un cuerpo de mamífero.

El contraión usado en la elaboración de complejos de ácido nucleico compactados también tiene un efecto significativo sobre la estabilidad de los complejos ante la liofilización. Como la liofilización es un procedimiento común para volver las sustancias biológicas fácilmente transportables y estables en almacenamiento, este descubrimiento tiene repercusiones significativas. Comúnmente, los polímeros de poliaminoácidos contienen trifluoroacetato (TFA) como contraión. Sin embargo, este contraión es mucho menos beneficioso que el acetato a efectos de liofilización de los polímeros de ácido nucleico, según se muestra a continuación. Las partículas elaboradas usando acetato conservan su naturaleza desagregada, i.e., permanecen mejor en disolución tras la liofilización y la rehidratación, conservan su forma y conservan su potencial de transferencia génica.

Las partículas según la presente invención contienen ácidos nucleicos, preferiblemente, una sola molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN, puede ser mono- o bicatenario, puede ser codificante de proteínas, codificante antisentido o no codificante. Los ácidos nucleicos también incluyen análogos de ARN y ADN que se modifican para aumentar la resistencia a la degradación in vivo. Un análogo preferido es un análogo de metilfosfonato de los mononucleósidos naturales. Más generalmente, el análogo de los mononucleósidos es cualquier análogo cuyo uso dé como resultado oligonucleótidos que tengan las ventajas de (a) una mejor capacidad para difundirse a través de las membranas celulares y/o (b) una resistencia a la digestión por nucleasas dentro del cuerpo de un sujeto (Miller, P. S. et al., Biochemistry 20: 1874-1880 (1981)). Tales análogos de nucleósido son conocidos en la técnica. La molécula de ácido nucleico puede ser un análogo de ADN o de ARN. La presente invención no se limita al uso de cualquier análogo de ADN o de ARN, siempre y cuando sea capaz de alcanzar el objetivo terapéutico, tenga una resistencia a las nucleasas adecuada, y una biodisponibilidad y una elevación celular adecuadas. El ADN o el ARN se puede hacer más resistente a la degradación in vivo por enzimas, p.ej., nucleasas, modificando los enlaces internucleosídicos (p.ej., metilfosfonatos o fosforotioatos) o incorporando nucleósidos modificados (p.ej., 2'-0-metilribosa o 1'-alfa-anómeros). Los procedimientos usados para formar las partículas son como los revelados en las patentes estadounidenses 5.844.107; 5.877.302; 6.008.336; 6.077.835; 5.972.901; 6.200.801 y 5.972.900 y las solicitudes con número de serie 60/145.970; 09/722.340; 09/311553 y 60/207949.

Los policationes según la presente invención comprenden preferiblemente poliaminoácidos tales como polilisina y derivados de polilisina. El policatión puede contener de 15-60 residuos de lisina, preferiblemente, en los intervalos de 15-30, 30-45 ó 45-60 residuos. Los derivados preferidos de polilisina son CK15, CK30, CK45, que tienen un residuo de cisteína más unido a los polímeros de polilisina de longitud de 15, 30 y 45 residuos, respectivamente. Se pueden unir fácilmente otros aminoácidos a la polilisina sin alejarse del espíritu de la invención. Se pueden usar otros polímeros de aminoácidos policatiónicos tales como poliarginina o copolímeros de arginina y lisina. También se podrían usar los polímeros de aminoácidos no proteínicos, tales como ornitina o citrulina. Se puede usar cualquier policatión farmacéuticamente autorizado o apropiado incluyendo, pero no limitándose a, protamina, histonas, lípidos policatiónicos, putrescina, espermidina, espermina, péptidos y polipéptidos. El policatión también puede contener un resto dirigido, que sea comúnmente un ligando que se una a un receptor sobre un determinado tipo de célula. El ligando dirigido puede ser un poliaminoácido u otro resto químico. La especificidad de la interacción del ligando y el receptor es importante a efectos de la dirección.

Las condiciones para elaborar partículas de ácido nucleico compactadas se revelan en las patentes y en las solicitudes mencionadas anteriormente. Las condiciones pueden incluir sal de 0-1M. La preferida es NaCl. Se pueden usar otras sales caotrópicas siempre y cuando sean toleradas por el animal (o las células) al que vayan a ser administradas. Los agentes adecuados incluyen sulfato de sodio (Na_{2}SO_{4}), sulfato de litio (Li_{2}SO_{4}), sulfato de amonio ((NH_{4})_{2}SO_{4}), sulfato de potasio (K_{2}SO_{4}), sulfato de magnesio (MgSO_{4}), fosfato de potasio (KH_{2}PO_{4}), fosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}), fosfato de amonio (NH_{4}H_{2}PO_{4}), fosfato de magnesio (MgHPO_{4}), cloruro de magnesio (MgCl_{2}), cloruro de litio (LiCl), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de cesio (CaCl), acetato de amonio, acetato de potasio, acetato de sodio, fluoruro de sodio (NaF), fluoruro de potasio (KF), cloruro de tetrametilamonio (TMA-Cl), cloruro de tetrabutilamonio (TBA-Cl), cloruro de trietilamonio (TEA-Cl) y cloruro de metiltrietilamonio (MTEA-Cl).

Si se usa un resto de unión a células diana (RUD), se debe unir específicamente a una estructura accesible (al "receptor") de las células diana deseadas. No es necesario que sea absolutamente específico de esas células, sin embargo, debe ser lo suficientemente específico para que el conjugado sea terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, su reacción de forma cruzada con otras células es menor del 10%, más preferiblemente, menor del 5%.

No existe una afinidad mínima absoluta que deba tener el RUD por una estructura accesible de la célula diana, sin embargo, cuanto mayor sea la afinidad, mejor. Preferiblemente, la afinidad es de al menos 10^{3} litros/mol, más preferiblemente, de al menos 10^{6} litros/mol.

El RUD debe ser un anticuerpo (o un fragmento que se una específicamente de un anticuerpo tal como un Fab, Fab, V_{M}, V_{L} o CDR) que se una específicamente a un epítopo sobre la superficie de la célula diana. Los procedimientos para generar anticuerpos frente a células, membranas celulares o antígenos de la superficie celular aislados son conocidos en la técnica: (a) la producción de células inmunes del bazo: inmunización con antígenos solubles, Hurrell, J. G. R. (1982) "Monoclonal Antibodies: Techniques and Applications". CRC Press, Boca Ratón, Fla. (b) inmunización con antígenos complejos: membranas, células enteras y microorganismos Hurrell, J. G. R. (1982) "Monoclonal Antibodies: Techniques and Applications". CRC Press, Boca Raton, Fla. (c) Producción de sobrenadantes monoclonales y líquidos ascíticos, Andrew, S. M. y Titus, J. A. (1991). "Purification of Immunoglobulin G. in Current Protocols in Immunology", (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. J. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, ed.) pp. A. 3.9-A. 3.12. Greene Publishing Wiley-Interscience, Nueva York. (d) Producción de antisuero policlonal en conejos. Garvey J. S., Cremer, N. E. y Sussdorf, D. H (Eds) (1977) "Methods in Immunology: A Laboratory Text for Instruction and Research", Tercera edición. W. A. Benjamin, North Hampton, Mass. (e) Producción de anticuerpos anti-péptido mediante el acoplamiento químico de péptidos sintéticos con proteínas vehículo. Jemmerson, R., Morrow, P. I., Klinman, N. I y Patterson, Y. (1985). "Analysis of an evolutionary conserved site on mammalian cytochrome C using synthetic peptides". Proc. Natl Acad. Sci, EE.UU. 82,1508-1512.

El RUD puede ser una lectina para la que haya una estructura de hidrato de carbono afín sobre la superficie celular. El resto de unión a células diana puede ser un ligando que se una específicamente mediante un receptor portado por las células diana. Una clase de ligandos de interés son los hidratos de carbono, especialmente, los mono- y oligosacáridos. Los ligandos adecuados incluyen galactosa, lactosa y mannosa. Otra clase de ligandos de interés son los péptidos (que aquí incluyen proteínas), tales como insulina, factor(es) de crecimiento epidérmico, factor de necrosis tumoral, prolactina, gonadotropina coriónica, FSH, LH, glucagón, lactoferrina, transferrina, apolipoproteína E, gp 120 y albúmina. La siguiente tabla enumera los restos de unión a células diana preferidos para diversas clases de células diana:

1

El uso de un resto de unión a células diana no es estrictamente necesario en el caso de la inyección directa del complejo de ácido nucleico compactado. La célula diana, en este caso, es pasivamente accesible al complejo compactado mediante la inyección del complejo en una zona próxima a la célula diana. Los restos de unión a células diana se pueden unir a residuos de lisina, residuos de cisteína o PEG usando interacciones covalentes o no covalentes.

Se ha descubierto que el contraión proporcionado en asociación con el policatión afecta profundamente a la forma, y que esa forma está asociada con propiedades fisiológicamente importantes para la administración de ácidos nucleicos. Por ejemplo, las partículas de trifluoroacetato (TFA) forman esferoides y varillas cortas de menos de aproximadamente 50 nm. El acetato conduce a varillas más largas de 100 a 200 nm. El cloruro conduce a partículas que son más largas y más estrechas que las partículas de acetato. El bicarbonato conduce a una mezcla de varillas de 100-200 nm y a toroides. El bromo se suministra comúnmente con polilisina de calidad reactiva. Se cree que el bromo es inferior a otros cationes según lo descrito en la presente memoria, especialmente, con respecto a la aceptabilidad fisiológica. Los contraiones se pueden suministrar a o sustituir sobre policationes por medio de, por ejemplo, cromatografía o diálisis. Por ejemplo, se puede unir el policatión a una resina de intercambio iónico y eluir con el contraión deseado. Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para este objetivo. Lo interesante es que se ha descubierto que una vez que una partícula ha sido compactada en una determina forma de partícula, la eliminación y el reemplazo del contraión, tal como mediante diálisis, no altera significativamente la forma adoptada. Por consiguiente, se puede obtener una forma favorable con una partícula usando un contraión no óptimo a efectos fisiológicos, pudiéndose reemplazar el contraión por un contraión superior, conservando a la vez la forma obtenida durante la compactación con el contraión original. Los efectos favorables sobre los ácidos nucleicos de los contraiones pueden no necesitar la compactación. De este modo, se pueden usar los policationes y los contraiones también con ácidos nucleicos no compactados.

El comportamiento de estas partículas de diferentes formas en la administración de genes a animales varía significativamente. Las partículas de acetato son superiores, por ejemplo, a las partículas de TFA para su administración al músculo y al pulmón. La administración a otras zonas del cuerpo también se puede realizar. Estas incluyen, sin limitación, las administraciones que son intratraqueales, por inhalación, intradérmicas, tópicas, en gotas para el ojo, subcutáneas, intratecales, por enema, enterales, intravenosas, intraarteriales, intralinfáticas, intraperitoneales, intrapleurales, intravesiculares, intraarticulares, intracardiacas, intracraneales, intratumorales, directas a un órgano, mediante gotas para el oído, mediante gotas para la nariz, intrauretrales, endoscópicamente al tracto gastrointestinal superior, al sigmoide o al colon, por citoscopia, por torascopia, por artroscopia, por mediastinoscopia, por colangiopancreatografía retrógrada endoscópica, por un depósito de Omaya, por angiografía incluyendo la cateterización cardiaca y la angiografía cerebral, intrauterinas, intravaginales, a la médula ósea, a los folículos pilosos, al humor vítreo y acuoso, a los senos, al uréter/pelvis del riñón, a la trompa de Falopio y a los nódulos linfáticos.

Los complejos tienen un diámetro que es menor del doble del diámetro mínimo teórico de un complejo de la única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada. A efectos de esta invención, "aproximadamente 1:1" engloba de 1,5:1 a 1:1,5.

El parámetro de turbidez se puede evaluar determinando la absorbancia de una composición. En una realización preferida, se usa un espectrómetro UV-Vis MCS501 de Zeiss. Se puede sustituir por otros espectrómetros conocidos en la técnica. Las longitudes de onda adecuadas para la recogida de las medidas de la absorbancia son de entre aproximadamente 330 nm y 420 nm.

La invención se explica en las aplicaciones concretas de los ejemplos que se presentan a continuación.

Ejemplos Ejemplo 1

La resistencia a las nucleasas en suero es, entre otras propiedades, una característica importante de cualquier vector de terapia génica eficaz diseñado para su administración sistémica. Lo ideal es que el diseño de esta resistencia no comprometa otras propiedades deseables de un vector, tal como su pequeño tamaño y su estabilidad coloidal. Hemos desarrollado reactivos y procedimientos que nos permiten compactar reproduciblemente ADN de plásmido con conjugados de polilisina-polietilenglicol (PEG) para formar pequeñas partículas que tengan una morfología definida (complejos PLASmin®). Algunas de estas formulaciones son estables en suero y no se agregan en solución salina fisiológica. Cambiando los componentes y las condiciones del procedimiento de compactación, se puede modificar el tamaño y la forma de las partículas. Para evaluar las posibles correlaciones entre la estabilidad en suero y el estado físico de los complejos PLASmin®, hemos preparado una matriz de 24 formulaciones usando polilisinas de diversas longitudes y sustituidas por PEG en diversos grados. Fig. 9D. Las polilisinas de exactamente 15, 30 y 45 residuos se obtuvieron mediante una síntesis en fase sólida. Estos polímeros contenían un residuo de cisteína N-terminal que fue usado para conjugar el PEG. Se usaron diversas mezclas de polilisinas sustituidas por PEG y sin sustituir para obtener diferentes complejos PLASmin®. Se analizó la estabilidad de los complejos en suero de ratón al 75% incubando ADN compactado a 37ºC durante hasta 5 días y determinando la vida media de la degradación del ADN. Se determinaron simultáneamente las características físicas de los complejos en NaCl 150 mM. La morfología se visualizó al microscopio electrónico de transmisión (Fig. 10 y Fig. 17). El ADN condensado con acetato y sales de bicarbonato de polilisina CK30 adoptó formas de varillas largas (100-300 nm ) y estrechas (10-20 nm), y toroides relajados (\sim50-100 nm de diámetro; 10-20 nm de ancho); la sal de TFA resultó en varillas mucho más cortas (<60 nm en 20-30 nm) y pequeños glóbulos (20-30 nm); la forma de cloruro de CK30 no compactó el ADN en absoluto (Fig. 10), mientras que el cloruro de CK45 (Fig. 17) dio resultados similares al acetato de CK30. Se evaluó la inestabilidad coloidal (tendencia a formar agregados) mediante un análisis de sedimentación. Además, se midió la difusión de la luz de las soluciones que contenían complejos PLASmin® y se expresó como un parámetro de turbidez (Fig. 8). Se descubrió que todos los complejos PLASmin® (Fig. 9A) eran mucho más estables en suero que el ADN desnudo. La vida media del ADN compactado varió de \sim2-17 h, mientras que el ADN desnudo fue completamente digerido en unos pocos minutos. También se encontró una correlación (r^{2} = 0,77) entre la vida media de la degradación y la inestabilidad coloidal de los complejos PLASmin®: las partículas que tendían a agregarse eran más resistentes a las nucleasas. La tendencia a agregarse también guardaba una correlación con la morfología de los complejos: los complejos de tipo varilla no se agregaron; de este modo, todos mostraron una estabilidad en suero muy similar, independiente de su composición (t_{1/2} \sim2-5 h). Por el contrario, los complejos esféricos mostraron diversos grados de tendencia a agregarse en función de la longitud de cadena de la polilisina y del contenido de PEG. Se encontró poca diferencia en la estabilidad en suero entre los glóbulos pequeños y las partículas de tipo varilla. En concordancia con la predicción de que las partículas agregadas deberían dispersar diversas longitudes de onda de la luz a diferencia de los complejos pequeños, se descubrió una buena correlación (r^{2} = 0,88) entre la inestabilidad coloidal de los complejos PLASmin® y la turbidez de sus soluciones (Fig. 9B): los complejos estables tenían un parámetro de turbidez de alrededor de -4 a -5 (según la ley de Rayleigh), mientras que para las partículas más grandes y menos estables, este valor aumentó hasta -1,3. Por consiguiente, el parámetro de turbidez también guardó correlación con la vida media de la degradación del ADN en suero (r^{2} = 0,73; Fig. 9C). De este modo, se concluye que el parámetro de turbidez, que es fácil de determinar, se puede usar convenientemente para rastrear preliminarmente diversas formulaciones de ADN compactado y predecir su estabilidad coloidal así como la estabilidad en suero.

Ejemplo 2

(sólo a modo informativo)

Una transferencia génica eficaz al pulmón facilitaría las terapias para enfermedades pulmonares tales como la fibrosis quística, y podría proporcionar un potente procedimiento de administración de vacunas por vía mucosa. Aunque la instilación directa del ADN desnudo en las vías respiratorias de los ratones genera una expresión transgénica medible, el nivel de expresión es bajo y la duración de la expresión es corta. Hemos desarrollado reactivos y procedimientos de formulación que compactan moléculas simples de ADN plasmídico en partículas de 20-25 nm (complejos PLASmin®). A diferencia del ADN desnudo, estos complejos están protegidos de la digestión por nucleasas y son estables en suero. Además, los complejos PLASmin® no se agregan en solución salina fisiológica y pueden ser concentrados hasta más de 12 mg/ml de ADN. Para determinar si los complejos PLASmin® generarían niveles significativos de expresión de genes en el pulmón, se han instilado ADN desnudo y complejos PLASmin® en los pulmones de ratones C57BL/6J mediante una administración intratraqueal directa. Estas partículas compactadas están constituidas por ADN de plásmido y polímeros de polilisina PEG-sustituida que están constituidos por 30 residuos de lisina. El constructo de plásmido codificaba un gen indicador de la luciferasa controlado transcripcionalmente por un potenciador del CMV, un promotor del factor de elongación 1-alfa (EF1-alfa), el primer intrón del EF1-alfa, el potenciador traduccional de RU5 del HTLV I y una señal de poliadenilación tardía de SV40. Se administró una dosis de ADN de 100 ug en 25 ó 50 ul de NaCl 150 mM. A los 2, 4, 5 ó 12 días de la transferencia génica, se prepararon extractos de ambos pulmones y se midió la actividad de la luciferasa como unidades relativas de luz por mg de proteína (Fig. 6). Mientras que el ADN desnudo generó una señal de aproximadamente 4.000 URL/mg el día 2 y 1.100 URL/mg el día 4, los complejos PLASmin® generaron aproximadamente 1.100.000 URL/mg el día 2 y 630.000 URL/mg el día 4. La expresión génica perduró durante al menos 12 días tras la transferencia génica, aunque a niveles bajos. Estas partículas de ADN compactadas produjeron una expresión génica 400 veces mayor que el ADN desnudo el día 2 y una expresión génica de más de 1.300 veces mejor el día 4. Al contrario de los extractos de pulmón entero, se apreció menos expresión génica en la traquea y ninguna expresión en el hígado (no se muestran los datos). En los estudios de sensibilidad a la dosis, se observaron niveles máximos de expresión transgénica usando una dosis de 100 ug (Fig. 7). En resumen, hemos determinado que los complejos PLASmin® administran y expresan eficazmente transgenes en pulmón de ratón tras una administración intratraqueal directa. En los estudios actualmente en desarrollo, se está utilizando el gen indicador de la beta-galactosidasa utilizado para definir el(los) tipo(s) de células que están siendo transfectadas. Los complejos PLASmin® pueden proporcionar un procedimiento de transferencia de genes apropiado para las diversas enfermedades pulmonares y/o vacunas por vía mucosa.

Ejemplo 3

La transferencia de genes a las células musculares tras una inyección intramuscular proporciona un procedimiento de vacunación seguro y eficaz, y proporciona niveles terapéuticos de proteínas recombinantes, tales como el factor IX, el factor VIII o la alfa-1 anti-tripsina.

Para optimizar las formulaciones de ADN de PLASmin® para una administración intramuscular, se administraron diversas preparaciones de ADN compactado codificante del gen indicador de la luciferasa a ratones CD2 mediante una sola inyección en el músculo tibial anterior. Se analizó la expresión génica diversos días posteriores a la transferencia génica, presentándose como unidades relativas de luz (URL)/mg de proteína. En la figura 1, se aumentó la expresión del ADN compactado formulado con la sal de acetato del policatión CK30 (que forma un complejo con PEG 10 kD), medida mediante la actividad de la luciferasa ambos días 1 y 3, en comparación con otras preparaciones de ADN formuladas con la sal de TFA de CK30 o CK45. Para definir más detalladamente las funciones del tipo de contraión, de la longitud de la polilisina y del porcentaje de sustitución del polietilenglicol (PEG), se realizaron más experimentos. Los animales recibieron inyecciones IM de complejos de TFA constituidos bien por CK30 o por CK45 y tamaños de PEG de bien 5 ó 10 kD. (Figura 2). La actividad de la luciferasa fue significativamente menor que la observada para los complejos de acetato de CK30 con PEG 10 kD, de la figura 1. Se confirmó el aumento de la expresión génica de los complejos preparados usando la sal de acetato de CK30 con PEG 10 kD (Figura 3). En este experimento, el policatión CK30 generó una mejor actividad de la luciferasa que el polímero CK45, y el CK30 proporcionó mayores niveles de actividad de la luciferasa cuando formaba complejo con PEG de 10 kD que con PEG de 5 kD. A continuación, se evaluó la duración de la expresión génica producida por los complejos de acetato constituidos bien por CK30 o por CK45, ambos formando complejo con PEG de 10 kD, y en la figura 4, se muestran los resultados. En este estudio, el policatión CK30 proporcionó el mejor nivel de actividad de gen indicador, siendo el nivel de actividad mejor el día 7 que en los días 1 ó 3. Se analizó una variedad de complejos de acetato en cuanto a la actividad génica según lo mostrado en la figura 5. Estas formulaciones incluían policationes CK15, CK30 y CK45 formando complejos con diversos porcentajes de PEG de 10 kD. El tiempo transcurrió hasta un total de 30 días. Aunque la expresión génica en los días 1, 3 y 7 pareció mejor usando CK15 en comparación con CK30, los tamaños de partícula de algunos complejos de CK15 fueron mayores de 30 nm o dos veces el diámetro teórico de un complejo de dicha única molécula de ácido nucleico y un número suficiente de moléculas policatiónicas para ofrecer una proporción de carga de aproximadamente 1:1, en forma de una esfera condensada. Para los días 1, 3, 7 y 15, al menos una preparación de ADN compactado con CK30 fue superior a cualquier preparación de CK45. Para CK30, los complejos con un 100% de PEG de 10 kD generaron una mejor actividad de los genes indicadores que las sustituciones de bien el 70% o el 40%. En resumen, la mejor formulación del ADN compactado en estos estudios fue la de sal de acetato del policatión CK30 con una sustitución del 100% con PEG de 10 kD.

Ejemplo 4

Antes de la inyección, los animales son anestesiados con una inyección intraperitoneal de cóctel de ketamina, xilazina y acepromazina de roedor. Se administra un volumen de 150 ul de anestésico por ratón a una concentración de 21,5 mg/ml de ketamina; 10,7 mg/ml de xilazina y 0,36 mg/ml de acepromazina. La dosis final es de 0,32 mg de ketamina; 1,6 mg de xilazina y 0,054 mg de acepromazina por ratón.

Se administra intratraquealmente a cada animal un volumen de 25 ml de cada formulación de ADN de plásmido usando una aguja de calibre 22. Se coloca un catéter de plástico en la tráquea de los ratones mediante un acceso percutáneo. La dosis resultante por animal es de 300 ug, 100 ug, 30 ug y 10 ug de ADN por ratón.

Tras la inyección, se anestesian los animales con dióxido de carbono y se sacrifican. Se sangran los animales y se aclaran intra-arterialmente con solución salina tamponada con fosfato. Se aíslan los pulmones, la tráquea y el hígado y se aclaran en la solución salina. Las muestras de tejido son congeladas inmediatamente sobre nitrógeno líquido y luego almacenadas a -70ºC.

Se homogeneiza el tejido pulmonar usando el Polytron en un tampón de lisis. Se determina la concentración de proteína. Se determina la actividad de la luciferasa de los homogeneizados mediante un análisis de la luciferasa.

Ejemplo 5

Se analizó la estabilidad del ADN de PLASmin® tras congelar y liofilizar. Las partículas se analizaron con sacarosa, trehalosa o sin excipiente. Las partículas se analizaron con y sin polietilenglicol, y con TFA o acetato como contraión del polietilenglicol. La estabilidad del ADN se evaluó mediante una centrifugación baja (3.400 xg x 1 min) hasta obtener agregados nodulares y haciendo un seguimiento de la absorbancia del ADN en el sobrenadante. Véase la fig. 11. La estabilidad de los complejos con acetato como contraión superó a otras formulaciones en ausencia de excipiente.

Ejemplo 6

El parámetro de turbidez se define como la pendiente de una línea recta obtenida mediante la representación del logaritmo de la absorbancia aparente de la luz frente al logaritmo de la longitud de onda incidente de la luz. La longitud de onda usada es de entre aproximadamente 330 nm y 420 nm. Una preparación se identifica como coloidalmente estable si se determina un parámetro de turbidez menor de -3. Una preparación se identifica como coloidalmente inestable si se determina un parámetro de turbidez mayor o igual a -3.

Se evaluó el parámetro de turbidez de las partículas de ácido nucleico compactadas antes y después de la liofilización usando diversos excipientes, contraiones y con o sin polietilenglicol. Véase la fig. 12. La sacarosa y la trehalosa resultaron muy eficaces en el mantenimiento de las propiedades de las partículas previas a la liofilización. Similarmente, el acetato con PEG fue eficaz en el mantenimiento de estas propiedades.

Ejemplo 7

Se observaron las partículas en el microscopio electrónico antes y después de la liofilización. Véase la fig. 13. Las partículas elaboradas con acetato de CK30 con PEG10k en presencia de trehalosa 0,5M presentan un aspecto similar al tipo varilla antes y después de la liofilización y de la rehidratación.

Ejemplo 8

(sólo a modo informativo)

Se observaron las partículas en el microscopio electrónico antes y después de la liofilización y de la rehidratación. Las partículas elipsoidales de ADN compactado elaboradas con TFA de CK30 (contraión) en presencia de sacarosa 0,5M presentan un aspecto idéntico antes y después de la liofilización y DE la rehidratación. Véase la fig. 14.

Ejemplo 9

Se realizaron experimentos de transferencia génica usando complejos PLASmin® liofilizados y rehidratados, comparándolos con las preparaciones previas a la liofilización. La enzima luciferasa fue codificada por los complejos y su actividad se midió como un procedimiento para controlar la transferencia génica. Mientras que la sacarosa y la trehalosa resultaron eficaces para proteger la actividad de transferencia génica a todas las partículas, las partículas que contenían polietilenglicol (10 kDa) y acetato como contraión resultaron ser sorprendentemente estables a la liofilización, incluso en ausencia de excipiente crioprotector (disacárido). Véase la fig. 15.

Ejemplo 10

Se obtuvieron polilisinas con una cisteína N-terminal y exactamente 30 ó 45 residuos de lisina (CK30 o CK45, respectivamente) como sales de trifluoroacetato (TFA) mediante una síntesis en fase sólida. Entonces se usó el residuo de cisteína para conjugar polietilenglicol (PM: 10.000) para formar polilisinas pegiladas CK30P10K y CK45P10K. Se intercambió el contraión de TFA con acetato, bicarbonato o cloruro mediante filtración sobre gel. Se condensó el ADN mediante estas polilisinas, se sometió a diálisis frente a NaCl al 0,9% y se concentró hasta obtener 1 ó 4 mg/ml usando concentradores centrífugos antes del análisis. Se usó ADN de plásmido con 5921 pb comprendido por genes de luciferasa y resistentes a la kanamicina, promotor y primer intrón del factor de elongación 1 alfa, potenciador del CMV, potenciador traduccional de RU5 del HTLV I, sitio de poliadenilación tardía de SV40 y el origen de replicación CoIE1.

Se determinó la estabilidad coloidal de los complejos de ADN midiendo la sedimentación del ADN condensado durante la centrifugación (3.400 durante 1 minuto) y difundiendo la luz (turbidez) en el intervalo de longitud de onda de 330-415 nm. El parámetro de turbidez es la pendiente de una línea recta obtenida mediante la representación del logaritmo de la absorbancia aparente (debida a la difusión) frente al logaritmo de la longitud de onda incidente en un intervalo fuera de la absorción verdadera por ADN o péptidos (330-415 nm). Según la ley de Rayleigh, las partículas que son pequeñas en comparación con la longitud de onda de la luz deberían tener un parámetro de turbidez de -4. Las partículas mayores, sin embargo, difunden la luz de distinta manera y tienen parámetros de turbidez en el intervalo de \sim-1 a -3. Los agregados muy grandes tienen un parámetro de turbidez de \sim-1. Se ha descubierto que todas las formulaciones de ADN analizadas eran coloidalmente estables en solución salina normal (NaCl al 0,9%) en base a las medidas de sedimentación y de turbidez. También encontramos que la capacidad de las polilisinas para condensar ADN depende del tipo de contraiones asociados y de la longitud de la polilisina. CK30P10k con cloruro representa el caso extremo, pues no condensa ADN o lo condensa muy poco. (Fig. 16).

Ejemplo 11

El ADN compactado por CK30P10K con diversos contraiones fue sometido a electroforesis a través de un gel de agarosa para examinar el efecto del contraión sobre la carga neta del ADN condensado. Se cargaron las muestras de ADN directamente sobre el gel (1,5 \mug) o tras un tratamiento con tripsina durante 40 min (0,2 \mug) para eliminar la polilisina, y visualizar la integridad del ADN y las cantidades relativas de las formas de plásmido superenrollado, mellado y lineal. El ADN bien emigró al cátodo (acetato de CK30, bicarbonato de CK30, cloruro de CK45), permaneció en el pozo (TFA de CK30) o emigró al ánodo (cloruro de CK30). (Fig. 18). Por lo tanto, los contraiones tienen una influencia sobre la carga neta eficaz del ADN condensado según lo visualizado mediante electroforesis sobre gel. El acetato y el bicarbonato unidos a CK30P10K y el cloruro unido a CK45P10k resultan en una carga neta ligeramente positiva, mientras que el TFA resulta en complejos eléctricamente neutros.

También se evaluó la estabilidad en suero para cada uno de los complejos de ADN compactado. Esto se evaluó incubando muestras de ADN con suero de ratón al 75% a 37ºC durante 2 h, eliminando la polilisina mediante tripsinización y evaluando la integridad del ADN mediante electroforesis sobre gel. En estas condiciones, el ADN condensado adecuadamente es estable, aunque se produce algo de mellado y linealización (muy poco). Por otro lado, el ADN desnudo es digerido completamente en unos pocos segundos (Fig. 18). Se descubrió que la capacidad de las polilisinas para condensar y proteger ADN depende del tipo de contraiones asociados y de la longitud de la polilisina. CK30P10k con cloruro vuelve a representar el caso extremo, pues no condensa ADN o lo condensa muy poco, ni tampoco lo protege frente a las nucleasas.

Ejemplo 12

Se analizó la administración intramuscular de genes para cada una de las formas de contraión de CK30P10K. Se inyectaron cincuenta \mul de ADN en el cuadriceps de cada pierna de ratones CD-1 (de 4-6 semanas de vida). La dosis total fue de 100 \mug. Antes de la inyección, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina, xilazina y acepromazina de roedor. Un día después de la inyección, se sacrificaron los ratones, y se extirparon los cuádriceps enteros y se procesaron. Se determinaron la actividad proteínica y de la luciferasa (Fig. 19).

La morfología de los complejos de ADN compactado parece haber influido en la eficiencia de su transfección in vivo. CK30/TFA proporcionó la expresión más baja (URL/mg de proteína), acetato de CK30 y bicarbonato de CK30 (estructuras más relajadas) proporcionaron 10-100 veces más URL/mg y cloruro de CK30 proporcionó la expresión al nivel del ADN desnudo (la misma o 10 veces mayor que acetato de CK30, dependiendo del día de la cosecha). Se ha descubierto que el ADN desnudo es más eficaz que el ADN condensado y que la formulación de TFA es mucho menos eficaz que otras formas de ADN condensado para la administración intramuscular de genes.

Ejemplo 13

Se analizó la administración intranasal de genes para cada una de las formas de contraión de CK30P10K. Se administraron veinticinco \mul de ADN en alícuotas de 5 \mul en los orificios nasales de ratones C57/BL6 usando una pipeta automática. La dosis total fue de 100 \mug. Antes de la inyección, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina, xilazina y acepromazina de roedor. Dos días después de la inyección, se sacrificaron los ratones, y se extirparon los pulmones enteros y se procesaron. Se determinó la actividad proteínica y de la luciferasa (Fig. 20). En aplicación intranasal, las formulaciones de acetato, de bicarbonato y de TFA de ADN condensado son las más eficaces entre las formulaciones analizadas, y el ADN desnudo y el CK45/cloruro fueron mucho menos eficaces. También se descubrió que el ADN condensado administrado intranasalmente en agua es aproximadamente 10 veces menos eficaz que el mismo ADN administrado en solución salina.

Bibliografía citada

1. Cooper, M. J., (1996) "Non-infectious gene transfer and expression systems for cancer gene therapy".

2. Semin. Oncol. 23: 172-188 Weiss, R. y Nelson, D. Washington Post, 9/29/99, página A1.

3. Takeshita, S., Gai, D., Leclerc, G., Pickering, J. G., Riesssen, R., Wier, L. e Isner, J. M. (1994). "Increased gene expression after liposome-mediated arterial gene transfer associated with intimal smooth muscle cell proliferation". J. Clin. Invest. 93: 652-661.

4. Zabner, J., Fasbender, A. J., Moninger, T., Poellinger, D. A. y Welsh, M. J. (1995), "Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid". J. Biol. Chem. 270: 18997-19007.

5. Wilke, M., Fortunati, E., van den Broek, M., Hoogeveen, A. T. y Scholte, B. J.(1996) "Efficacy of a peptide-based gene delivery system depends on mitotic activity". Gene Ther. 3: 1133-1142.

6. Fasbender, A., Zabner, J., Zeiher, B. G. y Welsh, M. J. (1997) "A low rate of cell proliferation and reduce DNA uptake limit cationic lipid-mediated gene transfer to primary cultures of ciliated human airway epithelia". Gene Ther. 41173-1180.

7. Sebestyen, M. G., Ludtke, J. J., Bassik, M. C., Zhang, G., Budker, V., Lukhtanov, E. A., Hagstrom, J. E. y Wolff. J. A. (1998), "DNA vector chemistry: the covalent attachment of signal peptides to plasmid DNA". Nat. Biotechnol. 16: 80-85.

8. Jiang, C., O'Connor, S. P., Fang, S. L., Wang, K. X., Marshall, J., Williams, J. L., Wilburn, B., Echelard, Y. y Cheng, S. (1998). "Efficiency of cationic lipid-mediated transfection of polarized and differentiated airway epithelial cells in vitro and in vivo".

9. Tseng, W. C., Haselton, F. R. y Giorgio, T. D. (1999), "Mitosis enhances transgene expression of plasmid delivered by cationic liposoms". Biochim. Biophy. Acta 1445: 53-64.

10. Mortimer, J., Tam, P., MacLachlan, I., Graham, R. W., Saravolac, E. G. y Joshi, P. B. (1999), "Cationic lipid-mediated transfection of cells in culture requires mitotic activity". Gene Ther. 6: 403-411.

11. Mirzayans, R., Aubin, R. y Paterson, M. (1992), "Differential expression and stability of foreign genes introduced into human fibroblasts by nuclear versus cytoplasmic microinjection". Mutat. Res. 281: 115-122.

12. Dworetzky, S. I. y Feldherr, C. M. (1988) "Translocation of RNA-coated gold particles through the nuclear pores of oocytes". J. Cell Biol. 106: 575-584.

13. Feldherr, C. M. y Akin D. (1991), "Signal-mediated nuclear transport in proliferating and growth-arrested BALB/c 3T3 cells". J. Cell Biol. 115: 933-939.

Claims (72)

1. \global\parskip0.900000\baselineskip

   1. Una composición no natural que comprende complejos de ácido nucleico desagregados, estando cada complejo constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas, en la que dichos complejos se forman mezclando dicha molécula de ácido nucleico y dichas moléculas policatiónicas, teniendo dichas moléculas policatiónicas, antes de la mezcla, un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro, teniendo dichos complejos una forma de varilla cuando se visualizan con un microscopio electrónico de transmisión.
2. 2. La composición de la reivindicación 1, en la que las moléculas policatiónicas son polilisina o un derivado de polilisina.
3. 3. La composición de la reivindicación 2, en la que el derivado de polilisina es péptido de polilisina con un residuo de cisteína.
4. 4. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos complejos con forma de varilla tienen una longitud de 100-300 nm cuando se visualizan con un microscopio electrónico de transmisión.
5. 5. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos complejos con forma de varilla tienen una longitud de 100-200 nm cuando se visualizan con un microscopio electrónico de transmisión.
6. 6. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos complejos con forma de varilla tienen un diámetro de 10-20 nm cuando se visualizan con un microscopio electrónico de transmisión.
7. 7. La composición de la reivindicación 1, en la que dichos complejos con forma de varilla tienen una longitud de 100-300 nm y un diámetro de 10-20 nm cuando se visualizan con un microscopio electrónico de transmisión.
8. 8. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha única molécula de ácido nucleico codifica al menos una proteína funcional.
9. 9. Un procedimiento para preparar una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende añadir el ácido nucleico al policatión que tiene acetato como contraión, a una concentración de sales suficiente para compactar el complejo.
10. 10. Un procedimiento para preparar una composición que comprende complejos de ácido nucleico desagregados, estando cada complejo constituido esencialmente por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas, comprendiendo dicho procedimiento:

    añadir una molécula de ácido nucleico a una molécula policatiónica mientras que se mezcla para formar una mezcla, teniendo dicha molécula policatiónica un contraión seleccionado del grupo constituido por acetato, bicarbonato y cloruro, mediante lo que se forman complejos de ácido nucleico desagregados, estando cada complejo esencialmente constituido por una sola molécula de ácido nucleico y una o más moléculas policatiónicas.

11. 11. El procedimiento de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que se controla la mezcla para detectar, prevenir o corregir la formación de complejos agregados o relajados.
12. 12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la sal es NaCl.
13. 13. El procedimiento de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico y el policatión están cada uno, en el momento de la mezcla, en una solución que tiene una concentración de sales de 0,05 a 1,5M.
14. 14. El procedimiento de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que la proporción molar de los grupos fosfato del ácido nucleico con respecto a los grupos cargados positivamente del policatión está en el intervalo de 4:1 a 1:4.
15. 15. El procedimiento de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico se añade al policatión, mientras se aplican movimientos vorticiales a gran velocidad.
16. 16. El procedimiento de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que se controla la mezcla mediante un procedimiento seleccionado del grupo constituido por microscopio electrónico, difusión de la luz, dicroísmo circular y medida de la absorbancia.
17. 17. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las moléculas policatiónicas son polilisina o un derivado de polilisina.
18. 18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el derivado de polilisina es péptido de polilisina con un residuo de cisteína.

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19. 19. La composición no natural de la reivindicación 1, en la que dicha molécula policatiónica tiene un resto de unión a ácidos nucleicos a través del cual forma un complejo con el ácido nucleico, y en la que dicha única molécula de ácido nucleico codifica al menos una proteína funcional.
20. 20. La composición de la reivindicación 19, en la que las moléculas policatiónicas son polilisina o un derivado de polilisina.
21. 21. La composición de la reivindicación 20, en la que el derivado de polilisina es péptido de polilisina con un residuo de cisteína.
22. 22. La composición no natural de la reivindicación 19, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende un promotor que controla la transcripción de una molécula de ARN codificante de la proteína funcional.
23. 23. La composición no natural de la reivindicación 19, en la que la proteína es terapéutica.
24. 24. La composición no natural de la reivindicación 1, en la que el complejo de ácido nucleico está compactado hasta un diámetro no mayor de 12 nm.
25. 25. La composición no natural de la reivindicación 1, en la que cada complejo está esencialmente constituido por una sola molécula de ADNc bicatenario y una o más moléculas policatiónicas.
26. 26. La composición no natural de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica al menos un ácido nucleico antisentido.
27. 27. La composición no natural de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN.
28. 28. El procedimiento para preparar una composición de la reivindicación 10, en el que dicha mezcla se realiza en ausencia de una sal añadida.
29. 29. La composición de la reivindicación 25, 26 ó 27, o el procedimiento de la reivindicación 28, en la que las moléculas policatiónicas son polilisina o un derivado de polilisina.
30. 30. La composición de la reivindicación 25, 26 ó 27, o el procedimiento de la reivindicación 28, en la que el derivado de polilisina es péptido de polilisina con un residuo de cisteína.
31. 31. Complejos compactados solubles no naturales de un ácido nucleico y una molécula policatiónica elaborados mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 y 28.
32. 32. Los complejos de la reivindicación 31, en los que las moléculas policatiónicas son polilisina o un derivado de polilisina.
33. 33. Los complejos de la reivindicación 32, en los que el derivado de polilisina es péptido de polilisina con un residuo de cisteína.
34. 34. Uso de la composición según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una enfermedad u otra condición clínica en un sujeto, siendo el medicamento para una administración intramuscular o en el pulmón del sujeto

    siendo dicho ácido nucleico uno cuya integración, hibridación o expresión dentro de las células diana de dicho sujeto previene o trata dicha enfermedad u otra condición clínica.
35. 35. El uso de la reivindicación 34, en el que la enfermedad u otra condición clínica se selecciona entre enfermedades pulmonares, trastornos metabólicos y cánceres.
36. 36. El uso de la reivindicación 34, en el que la enfermedad u otra condición clínica es fibrosis quística.
37. 37. El uso de la reivindicación 34, en el que el medicamento es para una administración por inhalación.
38. 38. El uso de la reivindicación 34, en el que el medicamento es para una administración por inyección intramuscular.
39. 39. El uso de la reivindicación 34, en el que las moléculas policatiónicas son polilisina o un derivado de polilisina.
40. 40. El uso de la reivindicación 39, en el que el derivado de polilisina es péptido de polilisina con un residuo de cisteína.
41. 41. La composición de la reivindicación 1, en la que los complejos de ácido nucleico están asociados con un lípido.
42. 42. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 25, 26 y 27 en la que el complejo de ácido nucleico está compactado hasta un diámetro no mayor de 12 nm.
43. 43. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que la mezcla se controla para detectar, prevenir o corregir la formación de complejos agregados o relajados.
44. 44. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que la proporción molar de los grupos fosfato del ácido nucleico con respecto a los grupos cargados positivamente del policatión están en el intervalo de 4:1 a 1:4.
45. 45. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que el ácido nucleico se añade al policatión, mientras se aplican movimientos vorticiales a gran velocidad.
46. 46. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que se controla la mezcla mediante un procedimiento seleccionado del grupo constituido por microscopio electrónico, difusión de la luz, dicroísmo circular y medida de la absorbancia.
47. 47. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho policatión es CK15-60P10 y el contraión es acetato, siendo CK15-60P10 un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina, estando unida al residuo de cisteína una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa.
48. 48. La composición de la reivindicación 19, en la que dicho policatión es CK15-60P10 y el contraión es acetato, siendo CK15-60 un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina, estando unida al residuo de cisteína una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa.
49. 49. La composición de la reivindicación 25, en la que dicho policatión es CK15-60P10 y el contraión es acetato, siendo CK15-60P10 un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina, estando unida al residuo de cisteína una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa.
50. 50. La composición de la reivindicación 26, en la que dicho policatión es CK15-60P10 y el contraión es acetato, siendo CK15-60P10 un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina, estando unida al residuo de cisteína una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa.
51. 51. La composición de la reivindicación 27, en la que dicho policatión es CK15-60P10 y el contraión es acetato, siendo CK15-60P10 un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina, estando unida al residuo de cisteína una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa.
52. 52. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicho policatión es CK15-60P10 y dicho contraión es acetato, siendo CK15-60P10 un polímero de poliaminoácidos de una cisteína N-terminal y 15-60 residuos de lisina, estando unida al residuo de cisteína una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de 10 kDa.
53. 53. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51, en la que la molécula policatiónica comprende 30 residuos de lisina.
54. 54. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51, en la que la molécula policatiónica comprende un resto dirigido.
55. 55. La composición de la reivindicación 47 o la reivindicación 48, en la que el complejo de ácido nucleico está compactado hasta un diámetro no mayor de 12 nm.
56. 56. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51 que está liofilizada.
57. 57. La composición de la reivindicación 47, que es rehidratada tras la liofilización.
58. 58. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 51, que no contiene un disacárido.
59. 59. Un procedimiento in vitro de administración de polinucleótidos a células que comprende:

    poner en contacto la composición de la reivindicación 57 con células, mediante lo cual el ácido nucleico es administrado a y elevado por las células.
60. 60. El procedimiento de la reivindicación 59, en el que la composición no contiene un disacárido.
61. 61. La composición no natural de la reivindicación 48, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende un promotor que controla la transcripción de una molécula de ARN codificante de la proteína funcional.
62. 62. La composición no natural de la reivindicación 48, en la que la proteína es terapéutica.
63. 63. La composición de la reivindicación 48 que es rehidratada tras la liofilización.
64. 64. Un procedimiento in vitro de administración de polinucleótidos a células que comprende:

    poner en contacto la composición de la reivindicación 63 con células, mediante lo cual se expresa la proteína.
65. 65. La composición de la reivindicación 49 que es rehidratada tras la liofilización.
66. 66. Un procedimiento in vitro de administración de polinucleótidos a células que comprende:

    poner en contacto la composición de la reivindicación 65 con células, en el que el polinucleótido codifica una proteína y mediante el cual se expresa la proteína.
67. 67. La composición de la reivindicación 50 que es rehidratada tras la liofilización.
68. 68. La composición de la reivindicación 67 que no contiene un disacárido.
69. 69. La composición de la reivindicación 51 que es liofilizada y rehidratada.
70. 70. Un procedimiento in vitro de administración de polinucleótidos a células que comprende:

    poner en contacto la composición de la reivindicación 69 con células, mediante lo cual el polinucleótido es administrado a y elevado por las células.
71. 71. El procedimiento de la reivindicación 52, que comprende además liofilizar los complejos de ácido nucleico desagregados.
72. 72. El procedimiento de la reivindicación 71, que comprende además rehidratar los complejos de ácido nucleico liofilizados.