ES2311039T3 - Proteina de tipo antigeno de a33 humano y acidos nucleicos que la codifican. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para detectar la amplificación y/o la sobreexpresión de un gen, comprendiendo el procedimiento el análisis de una muestra de tejido para la amplificación de un gen que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2 y/o la sobreexpresión de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2, en el que la amplificación y/o sobreexpresión es indicativa de que la muestra deriva de un tejido canceroso.

Description

Proteína de tipo antígeno de A33 humano y ácidos nucleicos que la codifican.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia en general a la identificación y aislamiento de un nuevo ADN y a la producción recombinante de polipéptidos nuevos codificados por dicho ADN.

Antecedentes de la invención

Las proteínas extracelulares juegan un papel importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, su proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células está gobernado generalmente por la información recibida de otras células y/o el entorno inmediato. Esta información, a menudo se transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización tras su secreción por la célula de forma específica alcanzan su sitio de acción en el entorno extracelular.

Las proteínas secretadas tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo las farmacéuticas, diagnósticas, los biosensores y los bioreactores. La mayoría de fármacos proteicos disponibles en la actualidad, como los agentes trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las eritropoyetinas, los factores estimulantes de la formación de colonias y diversas otras citocinas, son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen un potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se han realizado numerosos esfuerzos, tanto en la industria como en el ámbito académico para identificar nuevas proteínas de secreción. Muchos de los esfuerzos se han concentrado en el rastreo de librerías de ADN recombinante de mamífero para identificar secuencias codificantes de nuevas proteínas secretadas. En la literatura se describen diversos ejemplos de procedimientos y técnicas de rastreo [véase por ejemplo, Klein y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); patente americana U.S. 5.536.637)].

Las proteínas unidas a membrana y los receptores pueden desempeñar una importante función en la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, su proliferación, migración, o interacción con otras células está gobernado en general por la información recibida de otras células y/o el entorno inmediato. Esta información, a menudo se transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas unidas a membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, los receptores de citocinas, los receptores quinasas, los receptores fosfatasas, los receptores implicados en las interacciones célula-célula y las moléculas de adhesión como las selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está regulada en parte por la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las protein-tirosina quinasas, enzimas que catalizan dicho proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Se incluyen como ejemplos el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento nervioso.

Las proteínas unidas a membrana y las moléculas de receptor tienen diversas aplicaciones industriales, por ejemplo, como agentes farmacéuticos y diagnósticos. Los receptores inmunoadhesinas, por ejemplo, pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la interacción con el receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana también pueden utilizarse para el rastreo de inhibidores potenciales de moléculas pequeñas o de péptidos de la interacción relevante receptor/ligando. Se han realizado esfuerzos tanto en la investigación industrial como académica para identificar nuevas proteínas receptoras nativas. Muchos esfuerzos se han centrado en el rastreo de librerías de ADN recombinantes para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas receptoras.

En la presente invención se describe la identificación y la caracterización de nuevos polipéptidos de secreción y transmembrana, así como los nuevos ácidos nucleicos que los codifican.

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PRO362

El carcinoma colorrectal es una enfermedad neoplásica maligna que tiene una incidencia elevada en el mundo occidental, particularmente en los Estados Unidos. Los tumores de este tipo a menudo experimentan metástasis a través de los canales linfáticos y vasculares y dan lugar a la muerte anual de unas 62.000 personas en Estados Unidos.

El anticuerpo monoclonal A33 (mAbA33) es una inmunoglobulina murina del que se ha realizado un amplio análisis preclínico y estudios de localización en pacientes afectados de carcinoma colorrectal (Welt et al., J. Clin. Oncol. 8: 1894-1906 (1990) y Welt et al., J. Clin. Oncol. 12: 1561-1571 (1994)). Se ha observado que el mAbA33 se une a un antígeno hallado en las células de colon normales y células de cáncer de colon y en sus superficies. En carcinomas que se originan de la mucosa colónica, el antígeno de A33 se expresa de manera homogénea en más del 95% de los casos. Sin embargo, el antígeno de A33 no se ha detectado en un gran grupo de otros tejidos normales, es decir, su expresión parece ser bastante específica para órganos. Por lo tanto, el antígeno de A33 parece jugar un papel importante en la inducción del cáncer colorrectal.

Dada la importancia obvia del antígeno de A33 en la formación y/o proliferación de células tumorales, existe un interés sustancial en identificar homólogos del antígeno de A33. En este sentido, en la presente invención se describen la identificación y caracterización de un nuevo polipéptido con homología con la proteína antígeno de A33, denominada en la presente invención como PRO362.

Descripción resumida de la invención PRO362

Los solicitantes han identificado un clon de ADNc que codifica un nuevo polipéptido con homología con el antígeno de A33 y la proteína unida a membrana HCAR, donde el polipéptido se denomina en la presente solicitud como "PRO362", y proporcionan procedimientos tal y como se definen en las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una secuencia nucleotídica de ADNc de una secuencia nativa de PRO362, que es un clon denominado en la presente invención como "UNQ317" y/o "DNA45416-1251".

La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica derivada de la secuencia codificante mostrada en la Figura 1.

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "polipéptido PRO" y "PRO", tal como se usan aquí, y cuando van seguidos inmediatamente por una designación numérica se refieren a varios polipéptidos, en donde la designación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas como se describe aquí. Los términos "PRO/número polipéptido" y "PRO número" tal como se usan aquí comprenden secuencias polipeptídicas nativas y variantes polipeptídicas (que se definen con más en profundidad más adelante). Los polipéptidos PRO descritos aquí pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como tejidos humanos o de otra fuente o preparados mediante métodos de recombinación o sintéticos.

Una "secuencia nativa de un polipéptido PRO" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoacídica que el correspondiente polipéptido PRO natural. Dicha secuencia nativa de polipéptidos PRO puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante métodos recombinantes o sintéticos. El término "secuencia nativa de polipéptido PRO" comprende específicamente las formas truncadas naturales o las formas secretadas de un polipéptido PRO específico (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo, formas de ayuste alternativo) y variantes alélicas naturales del polipéptido.

"Aislado", cuando se usa para describir varios polipéptidos usados aquí, significa aquél polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos de naturaleza proteica o no proteica. En las realizaciones preferidas, el polipéptido será purificado (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de spinning cup, o (2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Comassie o, preferentemente, tinción con plata. El aislamiento del polipéptido incluye el polipéptido aislado en células recombinantes, en los que al menos un componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Un ácido nucleico que codifica para un polipéptido PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual está asociado habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de ácido nucleico de un polipéptido PRO aislado es aquella cuya forma es distinta de la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico para un polipéptido PRO aislado se distinguen, por tanto, de la molécula de ácido nucleico del polipéptido PRO específico ya que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico para un polipéptido PRO incluye moléculas de ácido nucleico para el polipéptido PRO contenidas en las células que ordinariamente expresan el polipéptido PRO en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias control" hace referencia a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretor está unido operativamente al ADN correspondiente a un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un intensificador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado de manera que facilite la traducción. Generalmente "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en dianas de restricción adecuadas. Si tales dianas no existen, se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos según prácticas convencionales.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio de la palabra y abarca específicamente anticuerpos monoclonales contra un solo polipéptido PRO (incluyendo agonistas, antagonistas y anticuerpos de neutralización) y composiciones de anticuerpos contra el polipéptido PRO con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que puedan estar presentes en cantidades inferiores.

"Activo" o "actividad" para los objetivos de esta invención se refiere a forma(s) del polipéptido PRO que retienen la actividad biológica y/o inmunológica del polipéptido PRO nativo o natural.

"Tratamiento" o "tratar" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que ya presentan el trastorno, como los propensos a padecerlo.

"Mamífero" para los propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos, de granja y del zoo, de competición deportiva o mascotas tales como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas, y similar. Preferentemente, el mamífero de la presente invención es un humano.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por los expertos en la materia y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sales. En general las sondas más largas requieren temperaturas más altas para que la hibridación sea adecuada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de sus temperaturas de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia a hibridar, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deriva que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas más bajas lo serían menos. Para detalles y explicaciones sobre la astringencia de las reacciones de hibridacion véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condiciones de astringencia" significa (1) emplear fuerzas iónicas bajas y temperaturas altas para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015M/citrato sódico 0,0015M/dodecil sulfato sódico 0,1% a 50ºC, o (2) emplear un agente desnaturalizante durante la hibridación, como por ejemplo formamida al 50% (vol/vol) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 nM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es usar formamida al 50%, 5X de SSC (NaCl 0,75M, citrato sódico 0,075M), fosfato sódico 50mM (pH 6/8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución Denhart 5X, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC en SSC 2X y SDS al 0,1%. Otro ejemplo más de hibridación usa un tampón de sulfato de dextrano al 10%, SSC 2X (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado a alta astringencia que consiste en SSC 0,1X conteniendo EDTA a 55ºC.

"Condiciones moderadamente astringentes" se describen en Sambrook y col., supra, e incluye el uso de una solución de lavado y de condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es una incubación durante la noche a 37ºC en una solución compuesta por: formamida al 20%, SSC 5X (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución Denhart 5X, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido de un lavado de los filtros en SSC 1X a aproximadamente 37-50ºC. El personal capacitado reconocerá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., como sea necesario para adaptarse a factores como la longitud de la sonda y similares.

El "análisis de Southern" o la "transferencia de Southern" es un método por el cual la presencia de secuencias de ADN en un ADN digerido con enzimas de restricción o una composición que contenga ADN se confirma por hibridación a un oligonucleótido marcado o a un fragmento de ADN conocidos. El análisis de Southern implica habitualmente la separación electroforética del ADN digerido en geles de agarosa, la desnaturalización del ADN después de la separación electroforética y la transferencia del ADN a un soporte de membrana de nitrocelulosa, nylon o cualquier otro soporte adecuado para el análisis con una sonda marcada radioactivamente, biotinilada o marcada enzimáticamente como se describe en las secciones 9.37-9.52 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

El "análisis de Northern" o la "transferencia de Northern" es un método usado para identificar secuencias de ARN que hibridan a una sonda conocida como un oligonucleótido, un fragmento de ADN, un fragmento de su ADNc o un fragmento de ARN. La sonda se marca con un radioisótopo como P^{32}, o por biotinilización o enzimáticamente. El ARN que va a analizarse habitualmente se separa electroforéticamente en gel de agarosa o poliacrilamida, transferido a una membrana de nitrocelulosa, nylon, o cualquier otra membrana adecuada, e hibridada con la sonda, usando técnicas estándar bien conocidas en el área como las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook y col., supra.

El término "vector de expresión" se usa para definir un vector, en el cual un ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO está unido operativamente a secuencias control capaces de afectar su expresión en una célula huésped adecuada. Los vectores habitualmente llevan un sitio de replicación (aunque éste no es necesario si se produce integración cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo E. coli típicamente se transforma con PBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar, y col., Gene 2:95 [1977]). El PBR322 contiene genes que codifican para resistencia a ampicilina y tetraciclina y por tanto proporciona un método sencillo para identificar las células transformadas para objetivos de clonación o expresión. Los vectores de expresión óptimamente también contendrán secuencias útiles para el control de la transcripción y la traducción, por ejemplo, promotores y secuencias Shine-Dalgarno (para procariotas) o promotores e intensificadores (para células mamíferas). Los promotores pueden ser, pero no necesariamente, inducibles; incluso promotores fuertes constitutivos como el promotor del CMV para huéspedes mamíferos se ha observado que produce el LHR sin toxicidad para la célula huésped. Aunque es posible que los vectores de expresión no necesiten contener ningún control de expresión, secuencias replicativas o genes de selección, su ausencia puede dificultar la identificación de transformantes híbridos y el logro de niveles de expresión elevados de la inmunoglobulina híbrida.

El término "lipopolisacárido" o "LPS" se usa aquí como sinónimo de endotoxina. Los lipopolisacáridos (LPS) son componentes característicos de la membrana externa de bacterias Gram-negativas,por ejemplo, Escherichia coli. Consisten en una parte de polisacárido y una lipídica denominada lípido A. El polisacárido, que varía de una especie bacteriana a otra, está compuesto por una cadena específica O (constituida a base de unidades repetidas de tres a ocho azúcares) y el núcleo de dos partes. El lípido A virtualmente siempre incluye dos azúcares de glucosamina modificados por un fosfato y un número variable de ácidos grasos. Para más información véase, por ejemplo, Rietschel and Brade, Scientific American Agosto 1992,54-61.

El término "choque séptico" se usa aquí en el sentido más amplio, incluyendo algunas definiciones descritas en Bone, Ann. Intern. Med. 114, 332-333 (1991). Específicamente, el choque séptico comienza con una respuesta sistémica a la infección, un síndrome llamado sepsis. Cuando este síndrome resulta en hipotensión y disfunción orgánica, se denomina choque séptico. El choque séptico puede ser iniciado por organismos Gram-positivos y hongos, así como por organismos Gram-negativos que contengan endotoxina. Por consiguiente, la definición indicada no se limita al "choque por endotoxina".

Las frases "amplificación génica" y "duplicación génica" son intercambiables y se refieren a un proceso por el cual en una célula o línea celular particular se forman múltiples copias de un gen o de fragmentos de un gen. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se denomina frecuentemente como "amplicón". Habitualmente la cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en proporción con el número de copias hechas del gen particular expresado.

"Tumor" tal y como se usa aquí, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásico, tanto maligno o benigno, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, aunque no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen el cáncer de mama, de próstata, de colon, el carcinoma de las células espinales, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer de cérvix, el cáncer de ovarios, el cáncer hepático, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer colorectal, el carcinoma de endometrio, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.

"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativas" son glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en su extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos aminoacídicos particulares forman una superficie entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y en la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida regularmente por todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en 3 segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las regiones de los dominios variables más altamente conservadas se denominan regiones de entramado (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada nativas comprende cuatro regiones FR, que adoptan una configuración de hoja beta, conectadas por 3 CDRs, los cuales forman bucles de conexión, y en algunos casos forman parte de la estructura hoja beta. Los 3 CDRs en cada cadena están unidos en proximidad con las regiones FR y, con los CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col, NIH Publ. Nº91-3242, Vol I páginas 647-669 (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden fracciones de un anticuerpo intacto, preferentemente las regiones de unión al antígeno o las región variables del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; anticuerpos biespecíficos, anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio simple de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc", una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da lugar a un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y que todavía es capaz de unirse al antígeno.

El fragmento "Fv" es el fragmento mínimo que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno y de unión completa. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión antígeno-anticuerpo en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs confieren la especificidad de unión del anticuerpo al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicas para un antígeno) tienen la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación usada aquí para Fab' en el cual el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de un anticuerpo originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente diferenciados, llamados kappa y lambda, basados en las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay 5 clases fundamentales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de ellas pueden ser divididas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena simple" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde dichos dominios se presentan en una cadena polipeptídica simple. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión sobre sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315 (1994).

El término "anticuerpos biespecíficos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión del antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un engarce demasiado corto para permitir la unión entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios están forzados a unirse con los dominios complementarios de otras cadenas y crear dos sitios de unión de antígeno. Los anticuerpos biespecíficos se describen en mayor profundidad en, por ejemplo, la patente europea 404.097; la patente mundial WO93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Son componentes contaminantes de su entorno natural materiales que interferirían en el uso diagnóstico o terapéutico del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos de naturaleza proteica o no proteica. En realizaciones preferentes, el anticuerpo podrá ser purificado (1) a más de un 95% en peso de anticuerpo determinado por el método de Lowry, y más preferentemente a más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo N-terminal o de la secuencia aminoacídica interna mediante el uso de un secuenciador de spinning cup o, (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Comassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo localizado dentro de las células recombinantes en el que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante una etapa de purificación.

La palabra "marca" cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un anticuerpo "marcado". El marcaje puede detectarse por sí mismo (por ejemplo, marcajes radioactivos o fluorescentes) o, en el caso del marcaje enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición substrato que es detectable.

Como "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas incluyen aquellos formados parcialmente o en su totalidad por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una purificación por columna (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término incluye también una fase sólida discontinua de partículas discretas, como las descritas en la patente americana U.S. 4.275.149.

Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que es útil para la vehiculización de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en formación de bicapa, similar a la disposición de las membranas biológicas.

La presente solicitud identifica y aísla secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos a los que se hace referencia en la presente invención como PRO362. En particular, los Solicitantes han identificado y aislado ADNc que codifica un polipéptido PPRO362, tal como se describe con detalle en los Ejemplos siguientes. Utilizando los programas informáticos de alineación de secuencias BLAST y FastA, los Solicitantes observaron que el polipéptido PRO362 tiene una similitud significativa con la proteíana ntígeno de A33, así como la proteína HCAR y la molécula de adhesión celular relacionada NrCAM. Por consiguiente, se cree que el polipéptido PRO362 descrito en la presente solicitud es un homólogo nuevo del antígeno de A33 y la proteína HCAR.

La presente invención proporciona procedimientos que se refieren a dichas secuencias nucleotídicas y el polipéptido PRO362.

Preparación de los Polipéptidos PRO

La descripción indicada más abajo se refiere principalmente a la producción de polipéptidos PRO mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico correspondiente al polipéptido PRO deseado. Por supuesto, se contempla que se puedan utilizar métodos alternativos para preparar el polipéptido PRO, bien conocidos en la materia. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO o fracciones del mismo, pueden producirse mediante síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida [véase, p. por ejemplo Stewart y col., Solid-Phas Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis proteica in vitro puede realizarse usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática puede conseguirse, por ejemplo, usando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias porciones del polipéptido PRO deseado separadamente y combinarlas usando métodos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO completo.

A. Aislamiento del ADN que codifica para el Polipéptido PRO

El ADN que codifica para el polipéptido PRO puede obtenerse de una librería de ADNc preparada a partir de un tejido que se considera que posee el ARNm del polipéptido PRO y que lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del polipéptido PRO humano puede ser obtenido adecuadamente a partir de una librería de ADNc preparada de un tejido humano, tal y como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica para el polipéptido PRO puede obtenerse también a partir de una librería genómica o mediante síntesis con oligonucleótidos.

Las librerías pueden ser cribadas con sondas (como anticuerpos contra el polipéptido PRO deseado u oligonucleótidos de alrededor de 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribaje de una librería de ADNc o genómica con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos estándar, como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Otro medio alternativo para aislar el gen que codifica para el polipéptido PRO deseado consiste en usar la metodología del PCR [Sambrook y col., supra: Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los Ejemplos mostrados más abajo describen técnicas para el cribaje de librerías de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente específicas como para minimizar falsos positivos. Preferentemente el oligonucleótido se marca de tal forma que tras la hibridación al ADN puede ser detectado en la librería que se está cribando. Los métodos de marcaje son bien conocidos en el área, e incluye el uso de marcadores radioactivos como ATP marcado con P^{32}, biotinilización o marcaje enzimático. Sambrook y col., supra proporciona las condiciones de hibridación, incluyendo una moderada y alta astringencia.

Las secuencias identificadas mediante dichos métodos de cribaje de librerías pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas en bancos de datos públicos disponibles como el GenBank u otros bancos de datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (tanto a nivel de aminoácidos como de nucleótidos) dentro de regiones definidas o a lo largo de la totalidad de la secuencia puede determinarse mediante el alineamiento de secuencia usando programas de ordenador como BLAST, ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplean diversos algoritmos para medir la homología.

El cribaje de librerías seleccionadas de ADNc o genómicas permite la obtención de ácidos nucleicos que tienen una secuencia codificante para la proteína usando la secuencia aminoacídica deducida descrita aquí por primera vez, y si es necesario, usando procedimientos convencionales de extensión de cebador como se describe en Sambrook y col., supra, para detectar precursores e intermediarios en el procesamiento del ARNm que no han sido inversamente transcritos en ADNc.

B. Selección y transformación de las células huésped

Las células huésped se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos aquí para la producción del polipéptido PRO y se cultivan en medio de cultivo convencional modificado para que sea más apropiado para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y demás, pueden ser seleccionados por el experto en la materia. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas, para maximizar la productividad de las células pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Aproach, M Butler, ed (IRL Press, 1991) y Sambrook y col., supra.

Los métodos de transfección son conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, el método del CaPO_{4} y la electroporación. La transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para las células dependiendo de la célula huésped utilizada. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, como se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación, generalmente se usan en procariotas u otras células que contienen barreras importantes como las paredes celulares. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para células mamíferas sin tales paredes celulares, puede emplearse el método de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology,52:456-457 (1978). Se han descrito aspectos generales de las transformaciones de sistemas de célula huésped de mamífero en la patente americana U.S. 4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente según el método de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, pueden usarse también otros métodos para introducir ADN en las células, tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo, polibrene o poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336:348-352 (1988).

Entre las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en vectores se incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Entre los procariotas apropiados se incluyen, aunque no están limitados a ellos, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas como E. coli. Se encuentran disponibles públicamente varias cepas de E. coli tales como la cepa E. coliK12 MM294 (ATCC 31, 446); E. coliX1776 (ATCC 31, 537); la cepa E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriáceas como Escherichia, p. por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli talescomo B. subtilis y B. Licheniformis (por ejemplo, B. Licheniformis41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. Aeruginosa, y Streptomyces. Se encuentran públicamente disponibles varias cepas de E. coli tales como la cepa E. coliK12 MM294 (ATCC 31, 446); E. coliX1776 (ATCC 31, 537); la cepa E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772(ATCC 53,635). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped particularmente preferido o un huésped parental porque es una cepa común para la generación de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para causar una mutación genética en los genes que codifican para proteínas endógenas del huésped; los ejemplos de tales huéspedes incluyen la cepa E. coli W3110 1A2, la cual tiene el genotipo completo tonA; la cepa E. coli W3110 9E4, que presenta el genotipo completo tonA ptr3; la cepa E. coli W3110 27C7 (ATCC 55,244) que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^{1}; la cepa E. coli W3110 37D6 que tiene el genotipo completo tonA ptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{1}; la cepa E. coli W3110 40B4 que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción degP no resistente a kanamicina; y una cepa E. coli que presenta una proteasa periplásmica mutada descrita en la patente americana U.S. 4.946.783 publicada el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, están disponibles métodos de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de las polimerasas de ácidos nucleicos.

Junto a procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados para clonación o expresión de vectores que codifican para el polipéptido PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior que se usa comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyce pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140[1981]; patente europea EP 139,383 publicado el 2 de Mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente americana U.S. 4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, p. por ejemplo, K lactis (MW98-8C,CBC683, CBS4574; Louvencort y col., J Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424) K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii, (ATCC 56,500), K. drosophilarium (ATCC 36,906; Van den Berg y col., bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Tricoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (patente europea EP 394.538 publicado el 31 de Octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Totypocladium (patente internacional WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commn., 112:284-289 [1983]; Tilburn y col., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. USA, 81: 1470-1474 [1984] y A. niger (Kelly y Hynes EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Son adecuadas aquí levaduras metilotroficas e incluyen aunque no se limitan a ellas, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas de los géneros Hansenula, candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Puede encontrarse una lista de especies específicas que son ejemplos de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen. Virol., 36:59 (1977); células de ovario de hámster chino deficientes en DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células humanas de pulmón (W138,ATCC CCL 75); células humanas de hígado (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped adecuada se tomar según el criterio del experto en la materia.

C. Selección y uso de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado puede ser insertado en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, un cósmido, una partícula viral, o un fago. La secuencia del ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio(s) apropiado reconocido por un enzima de restricción usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes de los vectores generalmente incluyen, aunque no están limitados a ello, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de finalización de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes requiere técnicas de ligación estándar conocidas por el experto en la materia.

El polipéptido PRO de interés puede producirse mediante recombinación no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un lugar específico de corte en el extremo N-terminal de la proteína madura o el polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o líderes de endotoxina II termoestables. Para la secreción en levaduras la secuencia señal puede ser por ejemplo, la del líder de invertasa de levadura, el líder factor alfa (incluidos los líderes de los factores \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente americana U.S. 5.010.182), el líder ácido fosfatasa, la secuencia líder de la glucoamilasa de C. Albicans (patente europea EP 362.176 publicada el 4 de Abril de 1990) o la señal descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tales como las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como líderes secretores virales.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para muchas bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido \mu es adecuado para levaduras, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.

Los vectores de clonación y expresión contienen típicamente un gen de selección, también llamado marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suplementan nutrientes críticos no disponibles en un medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica por la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de células competentes que llevan el ácido nucleico del polipéptido PRO, como la DHFR o la timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea la DHFR salvaje es la línea celular CHO deficiente en DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub y col., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 77:4216 (1980). El gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 es un gen de selección adecuado para ser usado en levadura [Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7:141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura a la que le falta la habilidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1 [Jones Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO para dirigir la síntesis del ARNm. Se conocen promotores reconocidos por una variedad de potenciales células huésped. Los promotores adecuados para ser usados en huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa [Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); patente europea EP 36.776], y promotores híbridos como el promotor tac [deBoer u col., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S. D.) unida operativamente al ADN que codifica por el polipéptido PRO deseado.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para ser usadas en huéspedes de levadura se incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glicolíticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, promotores inducibles con la ventaja adicional de tener la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. En la patente europea EP 73.657 se describen vectores adecuados y promotores para ser usados en la expresión en levaduras.

La transcripción del polipéptido PRO a partir de vectores en células huésped mamíferas se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, y el virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con el sistema de célula huésped.

La transcripción de un ADN que codifica para el polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores puede incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos del ADN que actúan en cis, habitualmente de alrededor de 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el intensificador SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el sitio tardío del origen de replicación, e intensificadores de adenovirus. El intensificador puede empalmarse en el vector en la posición 5' o 3' de la secuencia codificante del polipéptido PRO, pero es preferible que esté localizado en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles comúnmente en las regiones no traducidas en 5' y ocasionalmente en 3' de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la región no traducida del ARNm que codifica para los polipéptidos PRO.

Aún se describen otros métodos, vectores y células huésped adecuadas para ser adaptadas a la síntesis de polipéptidos PRO en cultivo de células de vertebrados recombinantes en Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); patente europea EP 117.060; y patente europea EP117.058.

D. Detección de la Amplificación/Expresión Génica

La amplificación génica y/o la expresión pueden medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional o transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda adecuada marcada, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluidos cadenas dobles de ADN, de ARN y cadenas dobles híbridas de ADN-RNA o ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar marcados y el ensayo puede llevarse a cabo en donde la cadena doble esté unida a una superficie, por lo que una vez se ha formado la cadena doble en la superficie, puede detectarse la presencia del anticuerpo unido a la cadena doble.

La expresión génica puede medirse de forma alternativa mediante métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de las células o secciones de tejido y ensayos del cultivo celular o de los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayos sobre fluidos de la muestra pueden ser tanto monoclonales como policlonales y pueden prepararse en cualquier animal. Es conveniente que los anticuerpos puedan preparase contra la secuencia nativa del polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas aquí o contra una secuencia exógena fusionada al ADN del polipéptido PRO y que codifique por un epitopo del anticuerpo específico.

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E. Purificación del polipéptido

Las formas del polipéptido PRO pueden ser recuperadas del medio de cultivo o de los lisados de las células huésped. Si están unidos a membrana, pueden liberarse de la membrana mediante una solución de detergente adecuada (por ejemplo, Tritón-X 100) o por ruptura enzimática. Las células empleadas en la expresión del polipéptido PRO pueden romperse a través de diversos mecanismos físicos o químicos como ciclos de congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica o agentes que lisan las células.

Puede desearse purificar los polipéptido PROs a partir de proteínas celulares recombinantes o polipéptidos. Los siguientes métodos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento o por columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con persulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar contaminantes como IgG; y columnas quelantes de metales para unirse a las formas epitopo-etiqueta del polipéptido PRO. Pueden usarse diversos métodos de purificación de proteínas, métodos conocidos en el área y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). El/Los paso(s) de purificación dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y en particular del polipéptido PRO sintetizado.

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Usos de los Polipéptidos PRO

Las secuencias nucleotídicas (o sus complementarias) que codifican el polipéptidos PRO362 tienen diversas aplicaciones en el área de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en mapeo cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO también será útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente invención.

La secuencia nativa completa del ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO o porciones de la misma, pueden usarse como sondas sobre una librería de ADNc para aislar el gen del polipéptido PRO completo o para aislar incluso otros genes (por ejemplo, aquellos que codifican para variantes naturales del polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras especies) que tienen una identidad de secuencia con las secuencias nucleicas del polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las sondas podrá ser de alrededor de 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de la secuencia nucleotídica de cualquiera de las moléculas de ADN descritas aquí o a partir de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos intensificadores e intrones de la secuencia de ADN nativa que codifica para el polipéptido PRO. A modo de ejemplo, un método de cribaje comprenderá el aislamiento de la región codificante del gen del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de unas 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con diversos marcadores, incluyendo radionucleótidos como P^{32} o S^{35}, o marcadores enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada con la sonda vía sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen del polipéptido PRO específico de la presente invención pueden usarse para analizar librerías de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de dichas librerías hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en más detalle más adelante en la sección de Ejemplos.

Los ESTs descritos en la presente solicitud pueden ser usados de forma similar como sondas, utilizando los métodos descritos aquí.

Las sondas pueden usarse también en técnicas de PCR para generar un banco de secuencias para la identificación de secuencias íntimamente relacionadas con el polipéptido PRO.

Las secuencias nucleotídicas que codifican para el polipéptido PRO pueden usarse también para construir sondas de hibridación que permitan mapear el gen que codifica para ese polipéptido PRO y para el análisis genético de individuos con desórdenes genéticos. Las secuencias nucleotídicas proporcionadas aquí pueden ser mapeadas en un cromosoma y a regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas como la hibridación in situ, el análisis de ligamiento contra marcadores cromosómicos conocidos, y el análisis de hibridación con librerías.

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Anticuerpos contra el Polipéptido PRO

La presente invención puede utilizar anticuerpos contra el polipéptido PRO. Algunos ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y heteroconjugados.

A. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos contra el polipéptido PRO puede comprender anticuerpos policlonales. El personal experto en la materia conoce métodos para la preparación de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden desarrollarse en un mamífero, por ejemplo, mediante la administración de una o más inyecciones de un agente inmunizante, y si se desea un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir al polipéptido PRO o a una proteína suya de fusión. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína que se conozca como inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Entre los ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque no están limitados a ellos, la hemocianina de lapa, la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden ser utilizados se incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa sintética dicorinomicolato). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por los expertos en la materia.

B. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos contra el polipéptido PRO pueden ser alternativamente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando los métodos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, un hámster u otro animal huésped adecuado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. De manera alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.

Típicamente, el agente inmunizante incluirá el polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan o bien linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos entonces se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Habitualmente las líneas celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedores, de origen bovino y de origen humano. Habitualmente se usan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en medios de cultivo adecuados que preferentemente contienen una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si a las células parentales les falta el enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), substancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, que sostienen niveles estables elevados de expresión del anticuerpo por las células seleccionadas productoras de anticuerpo, y que son sensibles a medios tales como el medio HAT. Las líneas de mieloma murino se encuentran entre las células inmortalizadas más preferidas, las cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, New York, (1987) pp. 51-63].

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede ser analizado para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de interés. Preferentemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y ensayos son conocidas en el área. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede ser determinada, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de que las células de hibridoma deseadas hayan sido identificadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y crecimiento según métodos estándar [Goding, supra]. El medio adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, medios como el Dulbecco's Modified Eagle's Medium y el RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados a partir del medio de cultivo o del fluido de los ascitas mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, proteína-A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse también mediante métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede incorporarse en vectores de expresión, los cuales son entonces transfectados en células huésped como las células de simio COS, las células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de lo contrario no producirían la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN puede modificarse también, por ejemplo, substituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes humanos de las cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homólogas [patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., supra] o por la unión covalente de toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina a la secuencia codificante para la inmunoglobulina. Dicho polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el área. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de una cadena ligera de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc para prevenir la unión de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo aminoacídico o se delecionan para prevenir la unión.

También son adecuados métodos in vitro para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede conseguirse usando técnicas de rutina conocidas en el área.

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C. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos contra el polipéptido PRO de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab)_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se substituyen residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor por residuos de un CDR de especies no humanas (anticuerpo donador) como ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la región de entrecruzamiento Fv de la inmunoglobulina humana por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en secuencias de la región de entrecruzamiento. En general el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todos o al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en el cual todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Se conocen bien en el área métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene un o más residuos aminoacídicos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no-humanos se denominan con frecuencia como residuos "de importación", los cuales típicamente son tomados de un dominio variable "de importación". La humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-1536 (1988)], substituyendo CDRs de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes a un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana U.S. 4.816.567), en donde substancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido substituido por la secuencia correspondiente de una especie no-humana. En la práctica los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos pueden producirse también usando diversas técnicas conocidas en el área, incluyendo librerías de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) y Boerner y col., J Inmunol., 147(1):86-95 (1991)].

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D. Anticuerpos Biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen especificidad de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es por el polipéptido PRO, y la otra es por cualquier otro antígeno, preferentemente por una proteína de superficie celular o un receptor o una subunidad de receptor.

Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en el área. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de 2 parejas de inmunoglobulina de cadena pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la aleatoria variedad de cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de los cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en la patente internacional WO 93/08829 publicada el 13 de Mayo de 1993 y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Se pueden fusionar dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación antígeno-anticuerpo) con secuencias de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferentemente se produce con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, y las regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican para las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados, y son co-transfectados en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

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E. Anticuerpos Heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas [patente americana U.S. 4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [patentes internacionales WO 91/00360; WO 92/2000373; patente europea EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito se incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo en la patente americana U.S. 4.676.980.

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Utilizaciones de los Anticuerpos contra el polipéptido PRO

Los anticuerpos contra el polipéptido PRO de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos contra el polipéptido PRO pueden usarse en ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos. Pueden usarse diversas técnicas de diagnóstico conocidas en el área, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados tanto en fases heterogéneas como homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con una fracción detectable. La fracción detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser un radioisótopo, como H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35}, o I^{125}, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina o la luciferina, o bien un enzima como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano. Puede emplearse cualquier método conocido en el área para conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter y col., Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos contra el polipéptido PRO pueden ser útiles también para la purificación por afinidad del polipéptido PRO a partir de cultivos celulares recombinantes o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el polipéptido PRO están inmovilizados sobre un soporte adecuado, como Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en el área. El anticuerpo inmovilizado se pone entonces en contacto con una muestra que contenga el polipéptido PRO a purificar, y a partir de entonces se lava el soporte con un solvente adecuado que eliminará substancialmente todo el material en la muestra excepto el polipéptido PRO, el cuál está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente apropiado que liberará el polipéptido PRO del anticuerpo.

Se ofrecen los siguientes ejemplos con propósitos únicamente ilustrativos, y no se pretende de ningún modo limitar el ámbito de la presente invención.

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Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente nombrados en los ejemplos se usan según las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de toda la especificación, por número de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

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Ejemplo 1 Cribado por homología de los dominios extracelulares para la identificación de nuevos polipéptidos y de los correspondientes ADNcs que los codifican

Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluidas las secuencias correspondientes al péptido señal de secreción, si existía) de alrededor de 950 proteínas conocidas secretadas procedentes del banco de datos público Swiss-Prot se utilizaron para la búsqueda de bancos de datos EST. Los bancos de datos EST, incluyeron los bancos de datos públicos (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bancos de datos en propiedad (por ejemplo, LIFESEC^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó mediante el programa informático BLAST o BLAST2 (Altxchul y Gish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) comparando las secuencias de proteína ECD con secuencias EST en 6 pautas de traducción. Estas comparaciones con una puntuación en el Blast de 70 (o en algunos casos 90) o mayor, que no codificaban para proteínas conocidas, se agruparon y combinaron en secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Gree, University of Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.
html).

Mediante esta búsqueda por homología del dominio extracelular, se ensamblaron secuencias consenso de ADN en relación a otras secuencias EST identificadas mediante Phrap. Además, las secuencias de ADN consenso obtenidas, fueron a menudo (pero no siempre) ampliadas con ciclos repetidos de BLAST y phrap para aumentar la secuencia consenso tanto como era posible en las fuentes de secuencias EST descritas más arriba.

En base a las secuencias consenso obtenidas tal como se ha descrito, se sintetizaron oligonucleótidos y se utilizaron por PCR para la identificación de una librería de ADNc que contenía la secuencia de interés y como sondas para el aislamiento de un clon con la secuencia codificante completa de un polipéptido PRO. Los cebadores para la PCR, sentido de la traducción (.f) y antisentido (.r), por lo general de 20 a 30 nucleótidos, se diseñaron frecuentemente para generar un producto de PCR con un tamaño de 100-1000 bp. La secuencia consenso es mayor que 1-1,5 kbp. Con el fin de cribar algunas librerías para un clon de secuencia completa, el ADN de las librerías se sometió a amplificación por PCR, tal como Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. Una librería positiva se utilizó a continuación para el aislamiento de clones codificantes para el gen de interés mediante un oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.

Las librerías de ADNc utilizadas para el aislamiento de clones de ADNc se construyeron mediante métodos estándares con reactivos disponibles comercialmente como los que facilita la firma Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con un oligo dT que contenía una diana NotI, unida con adaptadores romos SalI tratados con quinasas, se digirió con NotI, se separó por tamaño en electroforesis en gel y se clonó en una orientación determinada en un vector de clonado adecuado (como por ejemplo pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene lugares Sfil; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991))en las dianas únicas XhoI y NotI.

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Ejemplo 2 Aislamiento de clones de ADNc codificantes para la PRO362 humana

Se obtuvo una secuencia consenso en relación a una variedad de secuencias EST tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 más arriba, donde la secuencia consenso obtenida se denomina en la presente invención DNA42257. En base a la secuencia consenso DNA42257, se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR una librería de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para el aislamiento de un clon de la secuencia de longitud completa codificante para PRO362.

Se sintetizaron los cebadores de PCR (sentido y anti-sentido):

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Cebador PCR sentido 1 (42257.f1)\hskip2,18cm 5'-TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG-3'

Cebador PCR sentido 2 (42257.f2)\hskip2,17cm 5'-GTCGGAAGACATCCCAACAAG-3'

Cebador PCR anti-sentido 1 (42257.r1)\hskip1,5cm 5'-CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC-3'

Cebador PCR anti-sentido 2 (42257.r2)\hskip1,5cm 5'-AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC-3'

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De forma adicional, se construyó una sonda de hibridación de oligonucleótidos sintéticos a partir de la secuencia consenso DNA42257 que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos

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sonda de hibridación (42257.p1)

5'-TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT-3'

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Con el fin de cribar algunas librerías como fuente de clones de longitud completa, el ADN de las librerías se cribó mediante amplificación por PCR con las parejas de cebadores de PCR identificadas más arriba. Se utilizó entonces una librería positiva para el aislamiento de clones que codificaban para el gen de PRO362 utilizando la sonda de oligonucleótidos y uno de los cebadores de PCR. El ARN para la construcción de las librerías de ADNc se aisló de tejido humano fetal de cerebro (LIB1S3).

La secuenciación del ADN de los clones aislados tal como se ha descrito más arriba produjo la secuencia de longitud completa de ADN para PRO362 [designado en la presente invención como UNQ317 (DNA45416-1251)] y la secuencia derivada de la proteína para PRO362.

La secuencia completa de nucleótidos de UNQ317 (DNA 45416-1251) se muestra en la Figura 1. El clon UNQ317 (DNA45416-1251) contiene un marco de lectura abierto único con un lugar de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 119-121 y de finalización en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos 1082-1084 (Figura 1). El precursor polipeptídico predicho es de 321 aminoácidos de largo (Figura 2). La proteína PRO362 de longitud completa mostrada en la Figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 35.544 daltons y un pI de aproximadamente 8,51. El análisis del polipéptido PRO362 de longitud completa tal como se muestra en la figura 2 pone de manifiesto la presencia de un sitio de unión a glicosaminoglicano de aproximadamente el aminoácido 140 a aproximadamente el aminoácido 152 y un dominio transmembrana de aproximadamente el aminoácido 276 a aproximadamente el aminoácido 306. El clon UNQ317 (DNA45416-1251) ha sido depositado el 5 de febrero de 1998 en la ATCC y se le asignó un número de depósito ATCC no. 209620.

El análisis de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO362 de longitud completa sugiere que posee una similitud de secuencia significativa con la proteína antígeno de A33 y la proteína HCAR. Más específicamente, un análisis del banco de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35) puso de manifiesto una homología significativa entre la secuencia aminoacídica de PRO362 y las siguientes secuencias de Dayhoff, AB002341_1, HSU55258_1, HSC7NRCAM_1, RNU81037_1, A33_HUMAN. P W14158, NMNCAMRI_1, HSTITINN2_1, S71824_1 y
HSU63041_1.

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Ejemplo 3 Uso de ácidos nucleicos codificantes del polipéptido PRO como sondas de hibridación

El procedimiento siguiente describe el uso de secuencias de nucleótidos codificantes para polipéptidos PRO como sondas de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia codificante para el polipéptido PRO de interés tal como se ha descrito, puede emplearse como sonda o como material de base para la preparación de sondas que permitan la búsqueda de ADNs homólogos (como los que codifican para variantes del polipéptido PRO presentes en la población natural) en librerías de ADNc de tejido humano o de librerías genómicas de tejido humano.

La hibridación y el lavado de los filtros que contienen la librería de ADNs se realizó bajo condiciones de alta astringencia tal como se detalla a continuación. Una sonda marcada, derivada del ácido nucleico codificante para el polipéptido PRO, se hibrida con un filtro en formamida al 50%, SSX 5X, SDS 0,1%, 0,1% pirofosfato sódico, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, solución de Denhardts 2X, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de SSC 0,1 X y SDS 0,1% a 42ºC.

Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con la secuencia nativa codificante para el polipéptido PRO, puede a continuación ser identificada con técnicas estándares conocidas en este campo.

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Ejemplo 4 Expresión de polipéptidos PRO en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de un polipéptido PRO deseado por expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN codificante para el polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente con los cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener lugares de restricción para enzimas que corresponden con los lugares de restricción presentes en el vector de expresión seleccionado. Pueden emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo es el vector disponible pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)), que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. Este vector, se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias de PCR amplificadas se ligan al vector. El vector preferentemente incluye secuencias que codifican para un gen de resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un segmentos poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poli-His, y lugares de digestión por enteroquinasa), la región codificante para el polipéptido específico PRO, un terminador transcripcional de lambda y un gen argU.

La mezcla de ligación se utiliza a continuación para transformar una cepa de E. coli seleccionada con los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su habilidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN del plásmido puede aislarse y confirmarse por análisis de restricción y secuenciación.

Los clones seleccionados pueden crecer toda la noche en medio de cultivo líquido como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda una noche puede subsecuentemente utilizarse para el inóculo de un cultivo a gran escala. A continuación, se crecen las células hasta la densidad óptica deseada, tiempo durante el cual se activa el promotor.

Después del cultivo durante algunas horas, las células se recogen por centrifugación. El precipitado celular obtenido por centrifugación se solubiliza con varios agentes conocidos en la materia, y el polipéptido PRO solubilizado puede a continuación ser purificado con una columna de quelación de metales en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.

En la solicitud EP No. 99912321.9, el polipéptido PRO se expresaba en E. coli en una forma unida a un fragmento poli-His según el método que sigue a continuación. El ADN codificante para los polipéptidos PRO se amplificó primero los cebadores seleccionados para la PCR. Los cebadores contenían lugares para enzimas de restricción que corresponden a los lugares de restricción presentes en el vector de expresión, y otras secuencias útiles que proporcionan un lugar eficiente de inicio de la traducción, purificación rápida en una columna de quelación de metales, y digestión proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR y unidas a secuencias poly-His se ligaron después con un vector de expresión que se utilizó para transformar un huésped E. coli derivado de la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRTS)clpP(lacip). Los transformantes se crecieron primero en LB que contenía 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta una D.O. de 600 desde 3-5. Los cultivos se diluyeron entre 50-100 veces en medio CRPA (preparado por mezcla de 3,57 g (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico 2H2O, 1,07 g KCl, extracto de levadura de Difco 5.36 g, Sheffield Hycase SF 5,36 g en 500 ml de agua al mismo tiempo que 110 mM MPOS, PH 7,3, glucosa 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se crecieron durante 20-30 horas aproximadamente a 30ºC en agitación. Se tomaron muestras para verificar su expresión por análisis en SDS-PAGE, y el conjunto del cultivo se centrifugó y se obtuvo un precipitado celular. El precipitado celular se congeló hasta su purificación y replegado.

La pasta de E. coli procedente de fermentaciones de 0,5 a 1 L. (6-10 g de precipitado), se resuspendió en 10 volúmenes (p/v) de guanidina 7 M, tampón Tris 20 mM, PH 8. Se añadieron sulfito sódico sólido y tetrationto sódico, para unas concentraciones finales de 0,1 M y 0,01, respectivamente y la solución se dejó en agitación magnética durante toda la noche a 4ºC. Este paso resulta en desnaturalización de la proteína, con los residuos cisteínas bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de tampón de la columna quelante de metales (guanidina 6 M, 20 ml Qiagen Ni-NTA columna quelante de metales equilibrada en el tampón 53. La columna se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se precipitaron y almacenaron a 4ºC. La concentración de proteína se estimó por su absorbancia a 280 nm con el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se replegaron por dilución de la muestra lentamente en tampón de replegado preparado fresco que consistía en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se escogieron de manera que la concentración final de la proteína estuviera entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado se dejó en agitación magnética cuidadosa durante 12-36 horas a 4ºC. La reacción de replegado se enfrió por la adición de TFA a una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación ulterior de la proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 micras y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatrografió en una columna de fase reversa Poros R1/H con un tampón móvil de 0,1% TFA con elución en un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizaron en geles de poliacrilamida SDS y las fracciones conteniendo proteína replegada homogénea se precipitaron. En general, las especias replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas, se eluyeron a concentraciones menores de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas con su hidrofobicidad interior tapada por la interacción con la resina de fase reversa. Las especies agregadas se eluyeron habitualmente a altas concentraciones de acetonitrilo. Además para resolver las formas de proteínas no plegadas completamente de la forma plegada, el paso de la fase reversa también extrae la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contenían las proteínas PRO replegadas deseadas se precipitaron y el acetonitrilo se extrajo con evaporación de nitrógeno cuidadosamente directamente sobre la solución. Las proteínas se fomularon en Hepes 20 mM, pH 6,8 cloruro de sodio 0,14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel mediante resina Superfina G25 (Pharmacia) equilibrada en el tampón formulado y filtrado de manera estéril.

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Ejemplo 101 Expresión de Polipéptidos PRO en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de un polipéptido PRO deseado, mediante la expresión recombinante en células de mamíferos.

El vector pRK5 (véase la EP 307, 247, publicada el 15 de Marzo, 1989), se empleó como vector de expresión. De manera opcional, el ADN codificante para el polipéptido PRO se ligó a pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN del polipéptido PRO por los métodos de ligación descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denominó pRK5-polipéptido PRO.

En otra aplicación, las células huéspedes seleccionadas pueden ser las células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se crecen en confluencia en placas de cultivo de tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero bovino fetal y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos. Unos 10 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO se mezclan con 1 \mug de ADN codificante para el gen VA ARN [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl_{2}. A esta mezcla se añaden, en gotas, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, 1,5 mM NaPO_{4} y se deja progresar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspende y se añade a las células 293 dejándose durante cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan con medio de cultivo libre de suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se substituye por medio de cultivo solo o por medio que contiene 200 \muCi/ml^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml^{35}S-metionina. Después de 12 horas de incubación, el medio condicionante se recoge, concentra en un filtro en centrifugación, y se carga en un gel de SDS 15%. El gel procesado se seca y se expone por un período de tiempo que permita revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden someterse a una incubación adicional (en medio libre de suero), analizándose el medio en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, el polipéptido PRO puede introducirse en las células 293 de forma transitoria utilizando el procedimiento del dextrano de sulfato descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se crecen a una densidad máxima en un frasco de cultivo centrifugador y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO. Las células se concentran en el frasco centrifugador y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba con el sedimento celular durante cuatro horas. Las células se tratan a continuación con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con el medio de cultivo de tejidos y se re-introducen en el frasco centrifugador que contiene medio de cultivo, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y los restos celulares. La muestra que contenía el polipéptido PRO puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento, como la diálisis y/o la cromatografía por columna.

En otra realización, los polipéptidos PRO pueden expresarse en células CHO. El ADN de pRK5-polipéptido PRO puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos como el CaPO4 o el dextrano-DEAE. Tal como se describió más arriba, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con medio de cultivo (solo) o con medio que contenga un marcador radioactivo como la metionina-S35. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y luego se cosecha el medio condicionado. El medio que contenía el polipéptido PRO expresado pueden a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El polipéptido PRO etiquetado epitópicamente también puede expresarse en células huésped CHO. El polipéptido PRO puede subclonarse en otro vector distinto al pRK5. A continuación, mediante PCR se fusiona en la misma pauta de lectura el inserto del subclón con una etiqueta epitópicamente seleccionada como un poli-his en el vector de expresión en Baculovirus. El inserto polipéptido PRO-etiquetado con poli-His se subclona a continuación en un vector dirigido de SV40 que contiene un marcador de selección como el DHFR para la selección de clones estables. Por último, las células CHO se pueden transfectar (tal como se describió anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcaje se puede realizar, tal como se describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contenía el polipéptido PRO etiquetado con poli-His se concentra a continuación y se purifica mediante cualquier procedimiento seleccionado, como por ejemplo la cromatografía de afinidad con Ni^{2+}-quelato.

La expresión estable en células CHO se realiza utilizando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes de la forma soluble (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una región constante de IgGI que contenga la bisagra, los dominios CH2 y CH3 y/o una forma etiquetada con un poli-His.

Después de la amplificación, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión en CHO utilizando técnicas estándares, tal como se describió en Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley y Sons (1997). Se construyeron vectores de expresión en CHO con dianas de restricción compatibles en 5' y 3' del ADN de interés para permitir el barajamiento adecuado de los ADNcs. El vector utilizado para la expresión en CHO se describe por Lucas y col., Nucl. Acids. Res. 24:9 (1774-1779, (1996)) y utiliza el intensificador de la transcripción del promotor temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa
(DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.

Se introdujeron 12 \mug del ADN plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se crecieron tal como se describe en Lucas y col., supra. Aproximadamente, 3x10^{7} células se congelaron en una ampolla para el posterior crecimiento producción tal como se describe más adelante.

Las ampollas que contenían el ADN del plásmido se descongelaron colocándolas en un baño y se mezclaron mediante centrifugación. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (filtrado con un filtro PS20 de 0,2 \mum con suero bovino fetal al 5% filtrado con un filtro de 0,2 \mum). Las células se alicuotaron en tubos de centrifugación de 100 ml que contenían 90 ml de medio selectivo. Al cabo de 1-2 días, las células se transfirieron a un frasco de 250 ml que se rellenó con 150 ml de medio selectivo y se incubó a 37ºC. Al cabo de 2-3 días, se sembraron frascos de cultivo centrifugadores de 250, 500 y 2000 ml con 3x10^{5} células/ml. El medio celular se cambió por medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede utilizarse cualquier tipo de medio para CHO, se utilizó un medio de producción descrito en la patente americana U.S. 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Un frasco de cultivo centrifugador de 3 l se sembró con 1,2 x106 células/ml. El día 0, se determinó el número de células y el pH. El día 1, se obtuvo una muestra del cultivo y se inició la introducción de aire filtrado. El día 2, se obtuvo una muestra del cultivo, la temperatura se desplazó a 33ºC, y se añadieron 30 ml de una solución de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Durante la producción, se ajustó el pH para mantenerlo a aproximadamente 7,2. Al cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad descendiera por debajo del 70%, el cultivo celular se cosechó mediante centrifugación y se filtró con un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se guardó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para su purificación.

Para las construcciones etiquetadas con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni-NTA (Quiagen). Después de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se pasó por una columna de 6 ml N9-NTA equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después del cargado, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibrado que contenía imidazol 0,25 mM. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml de Pharmacia y se guardó a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron del medio condicionado de la manera siguiente. El medio condicionado se cargó en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lavó extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo alícuotas de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. A continuación, se desaló la proteína altamente neutralizada en tampón de almacenamiento, tal como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas poli-His. La homogeneidad se valoró en geles de acrilamida-SDS y por secuenciación N-terminal mediante degradación de Edman.

Los siguientes polipéptidos PRO se expresaron transitoriamente de manera satisfactoria en células COS: PRO362.

Los siguientes polipéptidos PRO se expresaron de manera estable de manera satisfactoria en células COS: PRO362.

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Ejemplo 5 Expresión de polipéptidos PRO en levaduras

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de un polipéptido PRO deseado en levaduras.

En primer lugar, los vectores de expresión en levaduras se construyeron para la producción o la secreción intracelular de polipéptidos PRO a partir de un promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica un polipéptido PRO deseado, una secuencia de péptido señal y el promotor se insertaron en dianas de restricción adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del polipéptido PRO. El ADN que codifica el polipéptido PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia líder/señal secretora del factor alfa de levaduras y las secuencias engarces (si fuera necesario) para la expresión del polipéptido PRO.

Las células de levaduras, como la cepa de levaduras AB110, pueden transformarse a continuación con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separarse mediante SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con Coomassie azul.

El polipéptido PRO recombinantes puede aislarse a continuación y purificarse eliminando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrar el medio utilizando cartuchos de filtros seleccionados. El concentrado que contiene el polipéptido PRO puede purificarse posteriormente utilizando columnas de resinas cromatográficas.

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Ejemplo 6 Expresión de los polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus.

El polipéptido PRO deseado se fusiona cadena arriba de una etiqueta epitópica en un vector de expresión de baculovirus. Dicha etiqueta epitópica incluye las etiquetas poli-his y las etiquetas de inmunoglobulinas (como las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los comercialmente disponibles como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante del dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica mediante PCR con cebadores complementarios en las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de restricción enzimática. El producto se digiere a continuación con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclonan en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera mediante co-transfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly y col., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).

A continuación, se purifica el polipéptido PRO-etiquetado con poli-His expresado, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con quelato-Ni-^{2+} de la manera siguiente. Se preparan los extractos de las células Sf9 infectadas con virus recombinantes, tal como se describe por Rupert y col., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 79; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%, EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 s en hielo. Los sonicados se aclaran mediante centrifugación y a continuación se diluye el sobrenadante 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de Quiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a una velocidad de flujo de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta alcanzar una A_{280} basal con tampón de carga, en dicho punto la fracción se inicia la recolecta de fracciones. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye específicamente la proteína unida. Después de alcanzar de nuevo la A_{280} basal, se hace pasar por la columna un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se analizan por SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia de western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían el polipéptido PRO etiquetado con His-10 se recogen, agrupan y se dializan contra tampón de carga.

Alternativamente, la purificación del polipéptido PRO etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía en columnas de Proteína A o G.

El PRO 362 se expresós satisfactoriamente en células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus. Aunque la expresión se realizó en realidad a una escala de 0,5-2 l, puede realizarse fácilmente a mayores escalas (por ejemplo, 8 L). Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que la región extracelular de la proteína se fusionó a una secuencia de región constante de una IgG1 que contenía los dominios bisagra, CH2 y CH3 y/o las formas etiquetadas con poli-His.

Para la expresión en células Sf9 en baculovirus, después de la amplificación por PCR, las secuencias codificantes respectivas en el vector de expresión de baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones proteicas con IgG y pb.PH.His.c para fusiones proteicas etiquetadas con poli-His) y el vector y el ADN del baculovirus Baculogold® (Pharmigen) se cotransfectaron en 10^{5} células de Spodoptera frugiperda (Sf9) (ATCC CRL 1711), utilizando Lipofectin (Gibco BRL). Los plásmidos pb.PH.His y pb.PH.IgG son modificaciones del vector pVL1393, vector de expresión de baculovirus ampliamente disponible comercialmente (Pharmigen), con regiones poliengarce modificadas para incluir las secuencias etiquetas His o Fc. Las células se crecieron en medio Hink TNM-FH suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se cosechó y se utilizó para la amplificación viral infectando células Sf9 en medio Hink TNM-FH suplementado con FBS al 10% a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se incubaron durante 30 días a 28ºC. El sobrenadante se cosechó y la expresión de las construcciones en el vector de expresión de baculovirus se determinó mediante unión del lote de 1 ml de sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas de Proteína-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG seguido por el análisis de SDS-PAGE, comparándolo con una concentración conocida de una proteína estándar teñida con de azul de Coomassie.

El sobrenadante de la primera amplificación viral se utilizó para infectar un cultivo en frascos centrifugadores (500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Sistemas de expresión LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosechó y filtró. Se repitieron los análisis de unión de lote y de SDS-PAGE, tantas veces como fue necesario, hasta confirmar la expresión de cultivo.

El medio condicionado de las células transfectadas (0,5 a 3 L) se cosechó mediante centrifugación para eliminar las células y se filtró con un filtros de 0,22 \mum. Para las construcciones etiquetadas con poli-His, la proteína se purificó con una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, y un tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargar, la columna se lavó con tampón de equilibrio adicional y se eluyó la proteína con el tampón de equilibrio que contenía imidazol 0,25M. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento con Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contenían Fc) de proteínas se purificaron del medio condicionado de la manera siguiente. El medio condicionado se hizo pasara por una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado en tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la columna se lavó extensamente con el tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en los tubos con 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló en tampón de almacenamiento tal como se describió para las proteínas etiquetadas con poli-His. Se verificó la homogeneidad de las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PEG) y secuenciación aminoacídica N-terminal mediante degradación de Edman.

El polipéptido PRO362 se expresó satisfactoriamente en células de insecto Hi5 infectadas con baculovirus. Aunque la expresión se realizó en realidad a una escala de 0,5-2 l, puede realizarse fácilmente a mayor escala para preparados más grandes (por ejemplo, 8 L).

Para la expresión de células de insecto Hi5 infectadas con baculovirus, el ADN codificante del polipéptido PRO se puede amplificar con sistemas adecuados, como la Pfu (Stratagene), o fusionarse cadena arriba (5' de) de etiqueta epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas etiquetas epitópicas incluyen las etiquetas poli-his y las etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos, incluyendo los derivados de plásmidos disponibles comercialmente como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante del dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica mediante PCR con los cebadores complementarios con las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionadas). A continuación, se digiere el producto con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo, los derivados de pVL1393 pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG) o una etiqueta histidina (pb.PH.His) cadena abajo (3' de) de la secuencia NOMBRE. Preferentemente, la construcción del vector se secuencia para su
verificación.

Las células Hi5 se crecen a una confluencia del 50% en condiciones de, 27ºC, sin CO2, sin penicilina/estreptomi-
cina. Para cada placa de 150 mm, 30 \mug del vector derivado de pIE que contiene el polipéptido PRO se mezcla con 1 ml de medio Ex-Cell (Medio: Ex-Cell + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (nota: este medio es sensible a la luz), y en un tubo separado, 100 \mul de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL #10362-010) (agitar con ayuda del vórtex hasta mezclado completo)), se mezclan con 1 ml de medio Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 8 ml de medio ExCell a 2 ml de la mezcla de ADN/CellFECTIN y todo ello se dispone sobre las células Hi5 previamente lavadas una vez con medio ExCell. La placa se incuba en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de ADN/CellFECTIN se aspira, y las células se lavan una vez con ExCell para eliminar el exceso de CellFECTIN. Se añaden 30 ml de medio ExCell fresco y las células se incuban durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosecha y la expresión del polipéptido PRO en el vector de expresión de baculovirus puede determinarse mediante ensayos de unión de lote de 1 ml de sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas Proteína A-Sepharose CL4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido del análisis de SDS-PAGE comparándolo con una concentración conocida de una proteína estándar por tinción de azul de Coomassie.

El medio condicionado de las células transfectadas (0,5 a 3 L) se cosechó mediante centrifugación para eliminar las células y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. Para las construcciones etiquetadas con poli-His, la proteína que comprende el polipéptido PRO se purifica utilizando una columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea a la columna de nI-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de cargar, la columna se lava con tampón de equilibrio adicional y se eluye la proteína con el mismo tampón que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala a continuación en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacena a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) de proteínas se purifican del medio condicionado de la manera siguiente. El medio condicionado se bombea en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada con tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 5,3. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala a continuación en tampón de almacenamiento tal como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad del polipéptido PRO se puede valorar mediante geles de poliacrilamida-SDS y secuenciación aminoacídica N-terminal por degradación de Edman y otros procedimientos analíticos, según se requiera.

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Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos que se unen a los polipéptidos PRO

Este ejemplo muestra la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un polipéptido PRO.

Las técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunoagentes que pueden utilizarse incluyen el polipéptido PRO purificado, las proteínas de fusión que contienen el polipéptido PRO y las células que expresan el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. La selección del inmunógeno puede realizarse por el experto en la materia sin excesiva experimentación.

Se inmunizaron ratones Balb/c con el inmunógeno polipéptido PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyectaron subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsionó en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en las almohadillas de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados se estimularon a continuación 10 a 12 días más tarde con inmunógeno adicional emulsionado con adyuvante seleccionado. Durante varias semanas después, también podían estimularse los ratones con inyecciones de inmunización adicionales. Se obtuvieron muestras de suero periódicamente de los ratones mediante sangrado retro-orbital para analizar en ensayos ELISA para detectar los anticuerpos contra el polipéptido PRO.

Después de haber detectado un anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden ser inyectados con una inyección intravenosa de polipéptido PRO. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se obtienen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan (utilizando polietilén glicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino seleccionada, como por ejemplo P3X63AgU.1, disponible del ATCC, CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden sembrarse en placas de cultivo de 96 pocillos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no-fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Las células de hibridomas se rastrearán en un ensayo ELISA por su reactividad contra el polipéptido PRO. La determinación de células de hibridoma "positivas" secretoras de anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO se halla dentro del ámbito de la materia.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c para producir ascitas que contengan anticuerpos contra el polipéptido PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse en frascos de cultivo o botellas de cultivo giratorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitas puede lograrse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede utilizar la cromatografía de afinidad mediante la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.

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Ejemplo 8 Polipéptidos PRO quiméricos

Los polipéptidos PRO pueden expresarse como proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos queladores de metales como los módulos histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una secuencia de engarce escindible como el Factor Xa o la enteroquinasa (Invitrogen, San Diego Calif) entre el dominio de purificación y se secuencia del polipéptido PRO puede ser de utilidad para facilitar la expresión del ADN codificante del polipéptido PRO.

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Ejemplo 9 Purificación de polipéptidos PRO utilizando anticuerpos específicos

Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes pueden purificarse mediante diversas técnicas estándares en la materia relativas a la purificación de proteínas. Por ejemplo, el pro-polipéptido PRO, el polipéptido PRO o el pre-polipéptido PRO se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye mediante acoplamiento covalente del anticuerpo contra el polipéptido PRO con una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir del suero bien mediante precipitación con sulfato amónico o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Al igual que los anticuerpos monoclonales se preparan de ascitas de ratones mediante precipitación con persulfato amónico o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica como la SEPHAROSE^{TM} activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se utiliza una columna de inmunoafinidad de dicho tipo en la purificación del polipéptido PRO mediante preparación de una fracción de células que contienen el polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de las células completas o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial con adición de detergente o por otros procedimientos bien conocidos en la materia. Alternativamente, el polipéptido PRO contiene una secuencia señal que puede secretarse en cantidad útil en el medio donde crecen las células.

Una preparación que contiene el polipéptido PRO soluble se pasa por la columna de afinidad, a continuación se lava la columna en condiciones que permiten la absorbancia preferencial del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones tales que se rompe la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo, un tampón con pH bajo de aproximadamente pH 2-3, o una concentración elevada de un agente caotrópico como la urea o el ión tiocianato) y por último se recoge el polipéptido PRO.

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Ejemplo 10 Ensayo Antiproliferativo in vitro

La actividad antiproliferativa de diversos polipéptidos PRO se determinó en el ensayo in vitro de investigación orientado a enfermedades para el descubrimiento de fármacos anticancerígenos del National Cancer Institute (NCI) utilizando un ensayo de unión a colorante de sulforrodamina B (SRB) esencialmente tal como se describe por Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112 (1990). Las 60 líneas de células tumorales utilizadas en este estudio ("el panel NCI"), así como las condiciones para su mantenimiento y cultivo in vitro han sido descritas por Monks et al., J. Natl. Cancer Inst. 83: 757-766 (1991). El objetivo de este cribado es evaluar inicialmente la actividad citotóxica y/o citostática de los compuestos de prueba frente a diferentes tipos de tumores (Monks et al., supra; Boyd, Cancer: Ptinc. Pract. Oncol. Update 3(10): 1-12 [1989]).

Las células de aproximadamente 60 líneas de células tumorales humanas se recogieron con tripsina/EDTA (Gibco), se lavaron una vez, se resuspendieron en IMEM y se determinó su viabilidad. Las suspensiones celulares se añadieron mediante pipeta (volumen de 100 \muL) en placas de microtitulación separadas de 96 pocillos. La densidad celular para la incubación de 6 días era inferior que para la incubación de 2 días para evitar el sobrecrecimiento. Los inoculados se sometieron a un periodo de preincubación de 24 horas a 37ºC para su estabilización. A tiempo cero se añadieron diluciones al doble de la concentración de prueba deseada en alícuotas de 100 \muL en los pocillos de las placas de microtitulación (dilución 1:2). Los compuestos de prueba se evaluaron en cinco diluciones de semilogarítmicas (1000 a 100.000 veces). Las incubaciones tuvieron lugar durante dos días y seis días en una atmósfera de 5% de CO_{2} y 100% de humedad.

Después de la incubación, se extrajo el medio y las células se fijaron en 0,1 ml de ácido tricloroacético al 10% a 40ºC. Las placas se enjuagaron cinco veces con agua desionizada, se secaron y se tiñeron durante 30 minutos con 0,1 ml de colorante de sulforrodamina B (Sigma) al 0,4% disuelto en ácido acético al 1%, se enjuagaron cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el colorante no unido, se secaron y la tinción se extrajo durante cinco minutos con 0,1 ml de 10 mM de Tris base [tris(hidroximetil)aminometano], pH 10,5. La absorbancia (DO) de la sulforrodamina B a 492 nm se midió utilizando un lector de placas de microtitulación de 96 pocillos interconectado con un ordenador.

Una muestra de prueba se considera positiva si muestra por lo menos un 50% de efecto inhibidor del crecimiento en una o más concentraciones. Los siguientes polipéptidos PRO dieron resultados positivos en por lo menos una línea de células tumorales: PRO362.

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Ejemplo 11 Amplificación génica

Este ejemplo muestra que los genes que codifican varios polipéptidos PRO se amplifican en el genoma de ciertos cánceres humanos. La amplificación está asociada con la sobreexpresión del producto génico, lo que indica que el polipéptido PRO es una diana útil para la intervención terapéutica en algunos cánceres, tales como cáncer de colon, cáncer de pulmón y otros cánceres. El agente terapéutico pueden tomar la forma de antagonistas de genes que codifican el polipéptido PRO, por ejemplo, anticuerpos quiméricos murino-humano, humanizados o humanos contra el polipéptido PRO.

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El material de partida para el cribado fue el ADN genómico aislado de varios cánceres. El ADN se cuantificó de manera precisa, por ejemplo, fluorimétricamente. Como control negativo, se aisló ADN de las células de 10 individuos sanos normales que se agruparon y utilizaron como controles del ensayo para la copia génica en individuos sanos (NorHu).

Se utilizaron el ensayo de la nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan^{TM}) y la PCR cuantitativa a tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^{TM} (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)) para encontrar los genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los resultados se utilizaron para determinar si el ADN que codifica el polipéptido PRO está sobrerrepresentado en cualquiera de los cánceres de pulmón y colon que se cribaron. El resultado se describió en unidades Delta CT. Una unidad corresponde a 1 ciclo de PCR o aproximadamente una amplificación de 2 veces con respecto al normal, dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades a una amplificación de 8 veces, etc. La cuantificación se obtuvo utilizando cebadores y una sonda fluorescente TaqMan^{TM} derivada del gen que codifica el polipéptido PRO. Las regiones del polipéptido PRO que más probablemente contienen secuencias de ácido nucleico únicas y que menos probablemente tienen intrones ayustados son las preferidas para la derivación del cebador, por ejemplo, la región 3' no traducida.

La reacción del ensayo de la 5'nucleasa es una técnica basada en la PCR fluorescente que utiliza la actividad 5'-exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para controlar la amplificación a tiempo real. Se utilizan dos cebadores oligonucleotídicos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar una secuencia nucleotídica localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extensible por la enzima Taq ADN polimerasa, y está marcada con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente inhibidor. Cualquier emisión inducida por láser del colorante informador es inhibido por el colorante inhibidor cuando los dos colorantes se localizan muy próximos como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa corta la sonda de forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante informador liberado se libera del efecto inhibidor del segundo fluoróforo. Una molécula del colorante informador se libera para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante informador no inhibido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

El procedimiento de la 5'nucleasa se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real tal como el de ABI Prizm 7700^{TM} Sequence Detection. El sistema consiste en un termociclador, un láser, una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por el láser se recoge a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96 pocillos, y se detecta en la CCD. El sistema incluye el programa informático para poner en marcha el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de 5' nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Esto se define como el ciclo en el que se acumula la señal del informador sobre el nivel de base de la fluorescencia. Los valores de Ct se utilizan como una medición cuantitativa del número relativo de copias iniciales de una secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico.

Se observó que los genes que codifican los siguientes polipéptidos PRO se amplificaban en el ensayo anterior: PRO362.

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Ejemplo 12 Hibridación in situ

La Hibridación in situ es una técnica potente y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico en las preparaciones celulares o de tejidos. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución en el tejido, identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico y con la ayuda del mapeo cromosómico.

La hibridación in situ se realizó según la versión optimizada del protocolo de Lu y Gillet, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando las ribosondas marcadas con P^{32} generadas por PCR. En resumen, los tejidos humanos incluidos en parafina, fijados en formalina se seccionaron, desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC y se procesaron posteriormente para la hibridación in situ tal como se describió por Lu y Gillet, supra. Una ribosonda antisentido marcada con UTP-P^{32} se generó de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante la noche. A continuación los portaobjetos con las hibridaciones se sumergieron en la emulsión fotográfica Kodak NTB2 y se expusieron durante 4 semanas.

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Síntesis de la ribosonda marcada con ^{33}P

6,0 \mul de UTP-P^{32} (125 mCi) (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron al vacío. Y a cada tubo que contenía el UTP-P^{32} secado se añadieron los siguientes ingredientes:

2,0 \mul de tampón de transcripción 5X

1,0 \mul de DTT (100 mM)

2,0 \mul de mexcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul de cada GTP, CTP, TTP y ATP a 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)

1,0 \mul de UTP (50 \muM)

1,0 de ARNsin

1,0 \mul de ADN molde (1 \mug)

1,0 \mul de H2O

1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3= antisentido, T7= sentido 5', generalmente)

Los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se añadió 1,0 \mul de DNasa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (10 mM de Tris pH 7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y la mezcla se pipeteó en papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó con el programa 2 (3 minutos). En la última recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul de producto final sobre papel DE81 y se contaron en 6 ml de Biofluor II.

La sonda se migró en un gel de TBE/urea. Se añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN Mrk II a 3 \mul de tampón de carga. Se calentó la mezcla a 95ºC en termobloque durante 3 min e inmediatamente después se colocó en hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la muestra y se migró a 180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en saran-wrap y se expuso a una película XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 1 h a toda la noche.

Hibridación con ^{33}P A. Pretratamiento de secciones congeladas

Los portas se sacaron del congelador, se colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en el incubador a 55ºC durante 5 minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% en hielo en la campana de gases y se lavaron en 0,5XSSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de 20XSSC + 975 ml de H_{2}O SQ). Después de desproteinizar con proteinasa K a 0,5 \mug/ml durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de solución madre de proteinasa K en 250 ml de tampón sin ARNsa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100%, durante 2 min en cada baño.

B. Pretratamiento de secciones incluidas en parafina

Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron en H_{2}O SQ y se lavaron dos veces con 2XSSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones de embriones humanos se desproteinizaron con proteinasa K 20 \mug/ml (500 \mul de una solución madre de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin ARNsa; 37ºC, 15 minutos), o 8X proteinasa K (100 \mul en 250 ml de tampón sin ARNsa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. A continuación, se realizaron lavados en 0,5XSSC y se deshidrataron tal como se describió anteriormente.

C. Prehibridación

Las preparaciones de los portaobjetos se colocaron en una cajita de plástico con tampón Box (4XSSC, formamida al 50%) - saturada con papel de filtro. El tejido se recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de Dextrano de sulfato + 6 ml de H2O SQ), se mezcló con ayuda del vórtex y se calentó en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Después de enfriar las cajas con los tejidos en hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20XSSC y 9 ml de H2O SQ, se volvió a mezclar bien con el vórtex y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.

D. Hibridación

Un sonda de 1,0x10^{6} cpm y 1,0 \mul de tRNA (50 mg/ml de solución madre) por porta se calentaron a 95ºC durante 3 minutos. Los portas se enfriaron en hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por porta. Después de mezclar con el vórtex, se añadieron 50 \mul de P3 a 50 \mul de solución de prehibridacicón sobre el porta. Y se incubaron durante toda la noche a 55ºC.

E. Lavados

Se realizaron dos lavados durante 10 minutos con 2XSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20XSSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, Vf= 4L), seguido de un tratamiento con ARNsa a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNsa = 20 mg/ml). Los portas se lavaron 2x10 min con 2XSSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de astringencia del lavado fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 SSC, EDTA (20 ml de 20XSSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4 L).

F. Oligonucleótidos

El análisis in situ se realizó con diversas secuencias de ADN descritas en la patente europea EP 99912321.9. Los oligonucleótidos utilizados para estos análisis se derivaron de secuencias nucleotídicas descritas en la patente europea 99912321.9 y por lo general tuvieron una longitud de 40 a 55 nucleótidos.

G. Resultados

Se realizó un análisis in situ sobre una serie de secuencias de ADN descritas en la presente invención. Los resultados de estos análisis son los siguientes.

DNA45416-1251 (PRO362)

La expresión de esta nueva proteína se evaluó en una serie de tejidos de humano y de primate no humano y se observó que era altamente limitado. La expresión estaba presente solamente en macrófagos alveolares en el pulmón y en células Kupffer de los sinusoides hepáticos. La expresión en estas células aumentó significativamente cuando se activaron estas poblaciones celulares diferentes. Aunque estas dos subpoblaciones de macrófagos tisulares se localizan en diferentes órganos, tienen funciones biológicas similares. Ambos tipos de fagocitos actúan como filtros biológicos para eliminar el material del torrente sanguíneo o las vías respiratorias que incluyen patógenos, células senescentes y proteínas y ambos son capaces de secretar una amplia variedad de citoquinas proinflamatorias importantes. En el pulmón inflamado (muestras de 7 pacientes), la expresión era importante en poblaciones celulares de macrófagos alveolares reactivos definidas como células grandes, claras frecuentemente vacuoladas, presentes de manera individual o en agregados en los alvéolos y era de escasa a negativa en macrófagos normales no reactivos (células dispersadas individuales de tamaño normal). La expresión en macrófagos alveolares aumentó durante la inflamación cuando estas células aumentaron tanto de número como tamaño (activadas). A pesar de la presencia de histiocitos en las áreas de inflamación intersticial y de hiperplasia linfoide peribronquial en estos tejidos, la expresión se limitó a macrófagos alveolares. Muchos de los pulmones inflamados también tenían cierto grado de inflamación supurativa; la expresión no estaba presente en granulocitos neutrofílicos. En el hígado, hubo una importante expresión en células Kupffer reactivas/activadas en hígados con necrosis centrilobular aguda (toxicidad por acetonminofeno) o una inflamación periportal bastante destacada. Sin embargo, hubo poca o nula expresión en células Kupffer en hígado normal o en hígado con sólo una inflamación suave o una hiperplasia/hipertrofia lobular de suave a moderada. De este modo, como en el pulmón, hubo una mayor expresión en células activadas/reactivas. No hubo expresión de esta molécula en histocitos/macrófagos presentes en intestino inflamado, amígdalas hiperplásicas/reactivas o nódulos linfáticos normales. La falta de expresión en estos tejidos que contenían todos inflamación histiocítica o poblaciones de macrófagos residentes refuerza firmemente la expresión limitada a las poblaciones del subgrupo de macrófagos únicos definidos como células de macrófagos alveolares y células Kupffer hepáticas. El bazo y la médula espinal no estaban disponibles para la evaluación. Los tejidos humanos evaluados que no presentaban una expresión detectable incluían: enfermedad inflamatoria del intestino (muestras de 7 pacientes con enfermedad de moderada a grave), amígdalas con hiperplasia reactiva, nódulos linfáticos periféricos, piel psoriática (muestras de 2 pacientes con enfermedad de suave a moderada), corazón, nervio periférico. Los tejidos de chimpancé evaluados que no presentaban expresión detectable incluían: lengua, estómago, timo.

Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado en el American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):

Material	Número Dep. ATCC	Fecha del depósito
DNA45416-1251	ATCC 209620	5 de febrero de 1998

Este depósito se realizó de acuerdo con la normativa del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patentes y de la Regulación que se contempla (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. Los depósitos estarán disponibles por el ATCC bajo los términos del tratado de Budapest y sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. Y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la emisión de la patente americana pertinente o tras que sea accesible al público cualquier patente americana o europea, que la preceda, y asegure la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el de acuerdo con el 35\NAK122 y las normas del Comisionado de Patentes y Marcas (incluyendo 37 CFR\NAK1,14 con la referencia especial a 886 OG 638).

El beneficiario de la presente solicitud está de acuerdo que si el cultivo de los materiales en depósito perece, se pierde o se destruye cuando se cultiva en las condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán en la mayor prontitud posible con otro similar. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

La memoria escrita anteriormente se considera suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no está limitada en su alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada pretende ser una sola ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea equivalente funcionalmente se halla dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones. El depósito de material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción aquí descrita sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de realización, ni debe considerarse como limitante del alcance de las reivindicaciones con las ilustraciones específicas que se representan.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet US 5536637 A [0003]

\bullet EP 404097 A [0041]

\bullet WO 9311161 A [0041]

\bullet US 4275149 A [0044]

\bullet WO 8905859 A [0055]

\bullet US 4399216 A [0055]

\bullet DD 266710 [0056]

\bullet US 4946783 A [0056]

\bullet EP 139383 A [0057]

\bullet US 4943529 A [0057]

\bullet EP 402226 A [0057]

\bullet EP 183070 A [0057]

\bullet EP 244234 A [0057]

\bullet EP 394538 A [0057]

\bullet WO 9100357 A [0057]

\bullet US 5010182 A [0060]

\bullet EP 362179 A [0060]

\bullet WO 9013646 A [0060]

\bullet EP 36776 A [0064]

\bullet EP 73657 A [0066]

\bullet GB 2211504 A [0067]

\bullet EP 117060 A [0070]

\bullet EP 117058 A [0070]

\bullet US 4816567 A [0088] [0088] [0092]

\bullet WO 9308829 A [0095]

\bullet US 4676980 A [0097] [0097]

\bullet WO 9100360 A [0097]

\bullet WO 92200373 A [0097]

\bullet EP 03089 A [0097]

\bullet EP 99912321 A [0119]

\bullet EP 307247 A [0124]

\bullet US 5122469 A [0133]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

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\bulletWELT et al. J. Clin. Oncol., 1990, vol. 8, 1894-1906 [0008]

\bulletWELT et al. J. Clin. Oncol., 1994, vol. 12, 1561-1571 [0008]

\bulletAUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience Publishers, 1995 [0022]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0025] [0050]

\bulletBRADE. Scientific American, August 1992, 54-61 [0028]

\bulletBONE. Ann. Intern Med., 1991, vol. 114, 332-333 [0029]

\bulletKABAT et al. NIH Publ., 1991, vol. I, 647-669 [0033]

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Claims (4)

1. Procedimiento para detectar la amplificación y/o la sobreexpresión de un gen, comprendiendo el procedimiento el análisis de una muestra de tejido para la amplificación de un gen que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2 y/o la sobreexpresión de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2, en el que la amplificación y/o sobreexpresión es indicativa de que la muestra deriva de un tejido canceroso.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra es de pulmón o colon.

3. Procedimiento para determinar la activación de los macrófagos de tejido, comprendiendo el procedimiento la detección en una muestra de tejido del nivel de expresión en macrófagos de tejido de un gen que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2, en el que un nivel de expresión elevado indica la activación de los macrófagos de tejido.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el nivel de expresión se determina en macrófagos alveolares o células Kupffer hepáticas.