ES2310554T3 - Procedimientos de tratamiento que usan 17906 y usos para el mismo. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario, que comprende: a) poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 1; b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que se hibride con la sonda, c) poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 1; d) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que se hibride con la sonda; y e) comparar el nivel de moléculas de ácido nucleico en la primera muestra que se hibridan con la sonda con el nivel de ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra, en el que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que se hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

Description

Procedimientos de tratamiento que usan 17906 y usos para el mismo.

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos que usan polipéptidos y polinucleótidos de carboxipeptidasa previamente caracterizados como dianas para el diagnóstico y el tratamiento de trastornos relacionados con la proliferación y diferenciación celular.

Antecedentes de la invención Carboxipeptidasas

Las enzimas proteolíticas están implicadas en muchos procesos celulares. La familia de enzimas carboxipeptidasas cataliza la escisión de aminoácidos C-terminales de péptidos y proteínas, alterando su actividad biológica. Las enzimas carboxipeptidasas lisosómicas están muy concentradas en lisosomas, pero pueden ser también activas extracelularmente después de su liberación desde los lisosomas en forma soluble o unida a proteínas transmembrana u otras asociadas a membrana. Las carboxipeptidasas pueden escindir péptidos de manera específica de secuencia. Por ejemplo, las prolilcarboxipeptidasas escinden sólo péptidos ligados a restos de prolina (por ejemplo, des-Arg9-bradicinina, angiotensina II). Hay también evidencias de que estas enzimas están implicadas en la terminación de la transducción de señal mediante la inactivación de ligandos peptídicos después de endocitosis de receptor.

En contraposición con las endoproteasas, que escinden enlaces peptídicos internos de proteínas y polipéptidos, las carboxipeptidasas (CP) catalizan la escisión sólo del enlace peptídico C-terminal, liberando un aminoácido cada vez. Los dos grupos principales de CP incluyen CP de tipo serina y metalo-CP, conteniendo las CP de tipo serina un trío característico Ser, Asp, His en el sitio activo. Este trío está también contenido en las proteasas de tipo serina prolilendopeptidasas. Las CP de tipo serina incluyen policarboxipeptidasa (PRCP), también designada como angiotensinasa C, y desamidasa, también designada como catepsina A y proteína protectora lisosómica. Véase Skidgel y col. (1998) Immunological Reviews 161: 129-141.

Las metalo-CP contienen un ácido glutámico característico como residuo catalítico primario y requieren unión a cinc para actividad. Las metalo-CP pueden agruparse por especificidad de sustrato en los tipos CPA y CPB; escindiendo preferiblemente el tipo CPA restos C-terminales hidrófobos y escindiendo el tipo CPS sólo los péptidos con los restos básicos C-terminales Arg o Lys. Véase R.A. Skidgel (1993) en: Hooper NM, ed. "Zinc Metalloproteases in Health and Disease", Londres: Taylor & Francis, Ltd., pág. 241-283.

La CPM es una carboxipeptidasa de tipo B que está anclada a membranas celulares mediante asociación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) con su tramo ligeramente hidrófobo de 15 aminoácidos C-terminales. Como en muchas otras proteínas que comparten este mecanismo de anclaje, la CPM se libera de la membrana mediante fosfolipasa C bacteriana específica de fosfatidilinositol. La CPM humana es una glicoproteína de 426 restos aminoacídicos con un 43% de identidad con la CP granular secretora intracelular humana (CPE), un 41% con la subunidad activa de 50 kDa de CPN plasmática humana y un 15% con CPA o CPB pancreática bovina. Los sitios activos de estas CP contienen restos aminoacídicos conservados que corresponden a los restos de unión a cinc His66Glu69 e His173, los restos de unión a sustrato Arg137 y Tyr242, y el Glu264 catalítico, como se designa para CPM. Las homologías de secuencia alrededor de estos restos conservados son altas, con una identidad entre las CP M, E y N de aproximadamente un 70-90%. Véanse Tan y col. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13165-13170; Deddish y col. (1990) J. Biol. Chem. 265: 15083-15089; R.A. Skidgel (1993) en: Hooper NM, ed. "Zinc Metalloproteases in Health and Disease", Londres: Taylor & Francis, Ltd., pág. 241-283. La CPM se ha cartografiado en la localización cromosómica 12q13-q15, que está asociada a una variedad de tumores sólidos.

El intervalo de pH óptimo de la CPM es el intervalo neutro de 6,5-7,5. Ya que no se conocen inhibidores endógenos de la CPM, se considera que la enzima es constitutivamente activa. Los inhibidores sintéticos, incluyendo los análogos de Arg ácido DL-2 mercaptometil-3-guanidinoetiltiopropanoico (MGTA) y ácido guanidinoetilmercaptosuccínico (GEMSA), inhiben la CPM. Véase R. A. Skidgel (1991) en: Conn PM, ed. "Methods in Neurosciences: Peptide Technology" vol. 6, Orlando: Academic Press, pág. 373-385; Plummer y col. (1981) Biochem. Biophys. Res. Comm. 98: 448-254.

Como con otras CP reguladoras de tipo B, la CPM escinde sólo los restos Arg o Lys C-terminales; sin embargo, la CPM tiene preferencia por Arg C-terminal. El penúltimo aminoácido afecta también a la velocidad de hidrólisis. Los sustratos peptídicos de origen natural de CPM incluyen bradicinina, encefalinas Arg6 y Lys6, dinorfina A1-13 y factor de crecimiento epidérmico (EGF). Véanse Sidgel y col. (1989) J. Biol. Chem. 264: 2236-2241; McGwire y col. (1995) J. Biol. Chem. 270: 17154-17158.

La CPM se encuentra principalmente en la membrana plasmática, encontrándose los niveles más altos en pulmón y placenta. Está también presente en riñón, vasos sanguíneos, intestino, cerebro y nervios periféricos. Véanse R.A. Skidgel (1988) Trends Pharm. Sci. 9: 299-304; Skidgel y col. (1984) Biochem. Pharmacol. 33: 3471-3478; Skidgel y col. (1991) FASEB J. 5: 1578; Nagae y col. (1992) J. Neurochem. 59: 2201-2212; Nagae y col. (1993) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9: 221-229. La expresión de CPM es sensible a la diferenciación de monocitos y linfocitos. Véanse de Saint-Vis y col. (1995) Blood 86: 1098-1105; Rehli y col. (1995) J. Biol. Chem. 270: 15644-15649.

La CPM participa en el control de la actividad hormonal peptídica en la superficie celular y en la degradación de proteínas y péptidos extracelulares. Cataliza la segunda etapa del procesamiento prohormonal y retira los restos Arg o Lys C-terminales liberados de prohormonas. La CPM funciona como enzima soluble después de su liberación de la membrana plasmática y puede funcionar en la forma de membrana plasmática controlando las actividades de receptor de péptido. La CPM puede regular la especificidad de receptor de cininas al escindir el Arg9 C-terminal, por ejemplo, de bradicinina. La bradicinina intacta se une al receptor B2. La bradicinina escindida (des-Arg9-bradicinina) se une también a receptores B1 y estimula la liberación de IL-1 y factor de necrosis tumoral de macrófagos. La regulación del receptor B1 está asociada a lesión o inflamación. La CPM puede estar también implicada con otros mediadores inflamatorios tales como anafilatoxina C5a, que media la liberación de histamina. Además, la CPM puede metabolizar factores de crecimiento que contienen Arg o Lys terminales tales como EGF, péptidos similares a EGF, factor de crecimiento nervioso (NGF), anfirregulina, factor de crecimiento de hepatocitos, eritropoyetina y proteína estimulante de macrófagos. En el pulmón, los niveles variables de CPM están asociados a neumonía neumoquística o bacteriana o cáncer de pulmón, y en la placenta, la CPM puede proteger al feto de péptidos derivados de la madre. Véanse R.A. Skidgel (1992) J. Cardiovasc. Pharmacol. 20 (Supl. 9): S4-S9; Bhoola y col. (1992) Pharmacol. Rev. 44: 1-80; R.A. Skidgel (1993) en: Hooper NM, ed. "Zinc Metalloproteases in Health and Disease", Londres: Taylor & Francis, Ltd., pág. 241-283; Dragovic y col. (1995) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 760-764; Nagae y col. (1992) J. Neurochem. 59: 2201-2212; MacFadden y col. (1988) FASEB J. 2: 1179 (resumen).

Otra metalo-CP reguladora de tipo B es la CPD, una glicoproteína unida a membrana. La CPD humana es una proteína de 1.377 aminoácidos con un 75% de identidad con el GP180 de pato y un 90% de identidad con el CPD de rata. La CPD humana contiene dos regiones hidrófobas localizadas en los extremos C y N. Está muy conservado un dominio citoplasmático de 55-60 restos entre las secuencias de pato, ser humano y rata, y puede ser significativo en la distribución intracelular, interacciones proteína-proteína o endocitosis. La CPD contiene tres dominios de homología con CP en serie numerados secuencialmente del extremo N al C, y puede contener así más de un sitio activo. Véanse Tan y col. (1997) Biochem. J. 327: 81-87; Skidgel y col. (1993) en: Robertson JLS, Nicholls MG, eds. "The Renin Angiotensin System", vol. 1, Londres: Gower Medical Publishing, pág. 10.1-10.10. La CPD está localizada en el cromosoma humano 17, 17P, 11.1-17q, 11.2.

La CPD se encuentra primariamente en membranas intracelulares, principalmente en el aparato de Golgi, encontrándose algo de CPD en la membrana plasmática. La distribución en tejido de la CPD es amplia e incluye la mayoría de los tejidos de pato y tejidos de mamífero también, incluyendo cerebro, pituitaria, placenta, páncreas, glándula suprarrenal, riñón, pulmón, corazón, bazo, intestino, ovario y testículos. Véanse McGwire y col. (1997) Life Sci. 60: 715-724; Song y col. (1995) J. Biol. Chem. 270: 25007-25013; Xin y col. (1997) DNA Cell Biol. 16: 897-909; Tan y col. (1997) Biochem. J. 327: 81-87; Song y col. (1996) J. Biol. Chem. 271: 28884-28889.

Se especula que la función de la CPD incluye el procesamiento peptídico y proteico en la ruta secretora constitutiva tras la escisión de proteínas precursoras por endoproteasa. La enzima tiene un pH óptimo ácido. La CPD de mamífero puede actuar como proteína de unión al virus de la hepatitis B, de forma similar a CPD de pato. Véase R.A. Skidgel (1998) Immunological Reviews 161: 129-141.

Las CP de tipo serina incluyen PRCP y desamidasa. La PRCP clonada a partir de una colección de células de riñón humanas indica una glicoproteína de 51 kDa3 y que contiene 496 aminoácidos, incluyendo un péptido señal de 30 restos y un propéptido de 15 restos. Véase Tan y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 16631-16638. Se encuentra una repetición de serina en la mitad C-terminal, similar a la repetición de serina de CP de levadura codificada por el gen KEX1.

La PRCP tiene un pH óptimo ácido para sustratos peptídicos sintéticos, pero retiene actividad a intervalos neutros con péptidos más largos de origen natural. La PRCP escinde péptidos sólo si el penúltimo residuo es prolina. La enzima no escinde el enlace Pro-Pro-COOH ni (OH)-Pro-Pro-COOH. Véase Odya y col. (1978) J. Biol. Chem. 253: 5927-5931. Los sustratos de PRCP incluyen des-Arg9-bradicinina y angiotensina II.

La PRCP puede estar implicada en la terminación de la transducción de señal mediante la inactivación de ligandos peptídicos después de endocitosis de receptor. La PRCP está contenida en lisosomas y se libera en respuesta a la estimulación. La enzima está ampliamente distribuida y se encuentra en placenta, pulmón, hígado y riñón
humanos.

Otra CP de tipo serina, la desamidasa, es probablemente un homodímero de 94 kDa de subunidades de 52 kDa. La desamidasa de plaquetas humanas se activa mediante la escisión de un fragmento de 14 aminoácidos del extremo C. La enzima se une a y mantiene la actividad y estabilidad de \beta-galactosidasa y neuraminidasa en lisosomas, estando asociado su defecto a galactosialidosis grave. Véanse Bonten y col. (1995) J. Biol. Chem. 270: 26441-26445; Galjart y col. (1988) Cell 54: 755-764; D'Azzo y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4535-4539. El gen de desamidasa humana está cartografiado en el cromosoma 20 en q13.1.

La desamidasa escinde diversos péptidos que contienen restos hidrófobos C-terminales o penúltimos incluyendo sustancia P, angiotensina I, bradicinina, endotelina y fMet-Leu-Phe. Como la PRCP, la desamidasa se encuentra también en lisosomas y está distribuida en placenta, pulmón, hígado y riñón humanos. Como la PRCP, la desamidasa está implicada en el bloqueo de parte de la ruta de transducción de señal estimulada por péptidos. La bradicinina, que contiene un Arg9 C-terminal y un aminoácido Phe8 hidrófobo penúltimo, se escinde por la desamidasa. De forma similar, la angiotensina, que contiene una His C-terminal y una Phe penúltima, se escinde por la desamidasa. En consecuencia, la desamidasa está implicada en la terminación de la actividad de bradicinina sobre el receptor B2 para generar un agonista de receptor B1. La desamidasa puede tener también un papel en el quimiotactismo y en el metabolismo del antagonista de factor de crecimiento anticanceroso. Véanse Skidgel y col. (1998) Immunological Reviews 161: 129-141; Jackman y col. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11265-11272; Jackman y col. (1995) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 13: 196-204; Hinek y col. (1996) Biol. Chem. 377: 471-480; Jones y col. (1995) Peptides 16: 777-783; Cummings y col. (1995) Biochem. Pharmacol. 49: 1709-1712.

Dada la amplia distribución y los diversos papeles fisiológicos y patológicos de las carboxipeptidasas, son útiles procedimientos y composiciones dirigidos a regular los niveles de estas enzimas para regular la actividad hormonal peptídica, modular el metabolismo de sustancia P, angiotensina I, angiotensina II, bradicinina y endotelina, y la regulación de la transducción de señal mediante la inactivación de ligandos peptídicos posterior a la endocitosis de receptor.

En consecuencia, las carboxipeptidasas son una diana importante para la acción y el desarrollo de medicamentos.

Se ha dado a entender que el gen de carboxipeptidasa usado en los procedimientos de la invención (acceso a GenBank AF095719) está implicado en la ruta de señalización de la hiperacetilación de histona con respecto a la diferenciación de cáncer de próstata (Huang H. y col. Cancer Res. (1999) "Carboxypeptidase A3 (CPA3): a novel gene highly induced by histone deacetylase inhibitors during differentiation of prostate epithelial cancer cells" 15; 59 (12): 2981-8). Se ha sugerido que el gen CPA3 está implicado en la ruta de señalización de hiperacetilación de histona activada durante la diferenciación mediada por NaBu de la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógeno, las células PC-3.

Resumen de la invención

Las moléculas de ácido nucleico y proteína 17906 son útiles como agentes de modulación en la regulación de una variedad de procesos celulares, por ejemplo, incluyendo proliferación, diferenciación, crecimiento y división celular. En particular, las moléculas de ácido nucleico y proteína 17906 serán ventajosas en la regulación de cualquier función celular implicada con la proliferación y diferenciación incontroladas, tal como en casos de cáncer. Como tales, las moléculas de ácido nucleico y proteína 17906 proporcionan procedimientos para el diagnóstico y el tratamiento de cáncer, preferiblemente tumores y metástasis de mama y ovario, y lo más preferiblemente cáncer de mama. La presente invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de que el gen 17906 está regulado positivamente en células tumorales y, por tanto, puede asociarse al cáncer.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario que comprende:

a)

poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 1;

b)

detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que hibride con la sonda,

c)

poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 1;

d)

detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que hibride con la sonda; y

e)

comparar el nivel de moléculas de ácido nucleico en la primera muestra que hibridan con la sonda con el nivel de ácidos nucleicos que hibridan con la sonda en la segunda muestra,

en el que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario, que comprende

a)

poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y segundo cebadores de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 1 y comprendiendo el segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos del complemento de la SEC ID Nº 1;

b)

incubar la primera muestra en condiciones que permitan la amplificación de ácido nucleico;

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c)

poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y un segundo cebadores de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 1 y comprendiendo el segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos del complemento de la SEC ID Nº 1;

d)

incubar la segunda muestra en condiciones que permitan la amplificación de ácido nucleico; y

e)

comparar el nivel de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra con respecto al nivel de amplificación de ácido nucleico en la segunda muestra,

en el que un nivel aumentado de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra con respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario, o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario, que comprende:

a)

poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido de SEC ID Nº 2;

b)

detectar la presencia de un polipéptido en la primera muestra que se una al anticuerpo;

c)

poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido de SEC ID Nº 2;

d)

detectar la presencia de un polipéptido en la segunda muestra que se una al anticuerpo; y

e)

comparar el nivel de unión de anticuerpo en la primera muestra respecto al nivel de unión de anticuerpo en la segunda muestra,

en el que un nivel aumentado de unión de anticuerpo en la primera muestra con respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto capaz de tratar cáncer de mama u ovario caracterizado por la expresión aumentada de una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 o la actividad aumentada de un polipéptido de SEC ID Nº 2, que comprende ensayar la capacidad del compuesto de reducir la expresión de una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 o de regular negativamente la actividad de un polipéptido de SEC ID Nº 2, identificando así un compuesto capaz de tratar cáncer de mama u ovario caracterizado por la expresión aumentada de una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 o la actividad aumentada de un polipéptido de SEC ID Nº 2.

En otra realización, el trastorno es cáncer. En una realización adicional, se determina la capacidad del compuesto de modular la actividad de la proteína 17906 detectando la inducción de un segundo mensajero intracelular.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la evaluación de la eficacia de un tratamiento de cáncer de mama u ovario en una muestra aislada de un sujeto, que se está tratando con un protocolo bajo evaluación, que comprende:

valorar el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

a)

una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos un 80% idéntica a la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1;

b)

una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 2; y

c)

una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1; y/o

de actividad de un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico,

en el que una reducción del nivel de expresión del ácido nucleico o del polipéptido después del tratamiento, con respecto al nivel antes del tratamiento, es indicativa de la eficacia del tratamiento de cáncer de mama u ovario.

Otros rasgos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1a y b representan la secuencia de ADNc y secuencia aminoacídica predicha de 17906 humano (acceso a GenBank AF095719). La secuencia nucleotídica corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2795 de la SEC Nº ID 1. La región de codificación corresponde a los ácidos nucleicos 8 a 1273 de la SEC ID Nº 1. La secuencia aminoacídica se identifica como SEC ID Nº 2.

La Figura 2 es una gráfica que representa los resultados de un análisis de PCR-TI cuantitativo a tiempo real de la expresión de 17906 humano en células relacionadas con la diferenciación de osteoblastos.

La Figura 3 es una gráfica que representa los resultados de un análisis de PCR-TI cuantitativo a tiempo real de la expresión de 17906 humano en diversas líneas celulares.

La Figura 4 es una gráfica que representa la regulación negativa de la expresión de ARNm de 17906 humano en osteoblastos tratados con diversos compuestos.

La Figura 5 es una gráfica que representa la regulación negativa de la expresión de ARNm de 17906 humano en osteoblastos primarios (suministrados por Clonectics) que se inducen a diferenciar con B-fosfoglicerato.

La Figura 6 es un gráfico de barras de un panel modelo de mama que representa la expresión relativa de ARNm de 17906 respecto a un control sin molde en un panel de líneas celulares, detectada usando un análisis de PCR-TI Taq Man cuantitativo a tiempo real.

La Figura 7 es un gráfico de barras de fase II de oncología que representa la expresión de ARNm de 17906 respecto a un control sin molde, que muestra una expresión aumentada en 4/6 tumores mamarios en comparación con tejidos de mama normales, 5/5 tumores ováricos en comparación con tejidos ováricos normales, 3/7 tumores de pulmón en comparación con tejidos pulmonares normales, y 3/4 tumores de colon y 2/2 metástasis de colon en comparación con tejidos de colon normales, cuya expresión se detectó usando un análisis Taq Man.

La Figura 8 es un gráfico de barras de panel que representa la expresión relativa de ARN de 17906 respecto a un control sin molde en un panel de tejidos o células humanas incluyendo, pero sin limitación, células de arteria, vena, músculo liso aórtico (SMC) (tempranas), SMC coronarias, células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC) cizalladas y estáticas, de corazón, riñón, músculo esquelético, adiposas, de páncreas, osteoclastos, de piel, médula espinal, corteza cerebral, hipotálamo cerebral, ganglios nerviosos de la raíz dorsal (DRS), glioblastoma, de mama normal, tumor de mama, ovario normal, tumor de ovario, próstata normal y tumor de próstata, epiteliales, de colon, hígado, fibroblastos, de amígdala, médula ósea, PBMC activados, entre otros, detectada usando análisis de PCR-TI Taq Man cuantitativo en tiempo real. La gráfica indica expresión significativa en células epiteliales prostáticas.

La Figura 9 representa la expresión variable de 17906 en un panel xenográfico.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona también procedimientos y composiciones para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades proliferativas o diferenciativas asociadas tales como cáncer, particularmente cáncer de mama y ovario. La presente memoria está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de que los genes de carboxipeptidasa, denominados en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico y proteína de "carboxipeptidasa 17906" o "17906" están regulados positivamente en algunos tumores, y por tanto pueden estar asociados a un trastorno proliferativo o diferenciativo tal como cáncer.

Por tanto, las moléculas 17906 pueden actuar como dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para controlar uno o más trastornos proliferativos y/o diferenciativos, particularmente cáncer de mama y ovario. Como se usa en la presente memoria, el término "cáncer" (también usado intercambiablemente con los términos "hiperproliferativo" y "neoplásico") designa células que tienen la capacidad de crecimiento autónomo, concretamente, un estado o condición de crecimiento anormal caracterizado por un crecimiento celular de proliferación rápida. Los estados morbosos cancerosos pueden clasificarse como patológicos, concretamente, que caracterizan o constituyen un estado morboso, por ejemplo, crecimiento de tumor maligno, o pueden clasificarse como no patológicos, concretamente, una desviación de lo normal pero no asociada a un estado morboso, por ejemplo, proliferación celular asociada a la reparación de heridas. El término se pretende que incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados malignamente independientemente del tipo histopatológico o la etapa de la invasión. El término "cáncer" incluye malignidades de los diversos sistemas orgánicos tales como las que afectan a pulmón, mama, tiroides, linfoide, gastrointestinal y de tracto genitourinario, así como adenocarcinomas que incluyen malignidades tales como la mayoría de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de células no pequeñas del pulmón, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago. El término "carcinoma" está reconocido en la técnica y designa malignidades de tejidos epiteliales o endocrinos incluyendo carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. Los carcinomas ilustrativos incluyen aquellos que se forman a partir de tejido de cuello uterino, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término "carcinoma" incluye también carcinosarcomas, por ejemplo, que incluyen tumores malignos compuestos por tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un "adenocarcinoma" designa un carcinoma derivado de tejido glandular o en el que las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles. El término "sarcoma" está reconocido en la técnica y designa tumores malignos de derivación mesenquimática.

Como se usa en la presente memoria, "expresión diferencial" incluye diferencias tanto cuantitativas como cualitativas en el patrón de expresión temporal y/o de tejido de un gen. Por tanto, un gen expresado diferencialmente puede tener su expresión activada o inactivada en condiciones normales frente a condiciones morbosas proliferativas o diferenciativas celulares. El grado en que la expresión difiere del estado normal frente a los estados morbosos proliferativo o diferenciativo celular o del control frente al experimental sólo tiene que ser suficientemente grande para ser visualizado mediante técnicas de caracterización estándar, por ejemplo, PCR cuantitativa, análisis Northerm o hibridación sustractiva. El patrón de expresión de un gen expresado diferencialmente puede usarse como parte de una evaluación del pronóstico o diagnóstico de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular, o puede usarse en procedimientos para identificar compuestos útiles para el tratamiento de una enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. Además, un gen expresado diferencialmente implicado en enfermedades proliferativas o diferenciativas celulares puede representar un gen diana, de tal modo que la modulación del nivel de expresión del gen diana o de la actividad del producto del gen diana puede actuar mejorando un estado morboso proliferativo o diferenciativo celular. Pueden usarse compuestos que modulan la expresión o actividad del gen diana en el tratamiento de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular asociada. Aunque los genes 17906 descritos en la presente memoria pueden expresarse diferencialmente con respecto a enfermedad proliferativa o diferenciativa celular asociada, y/o sus productos pueden interaccionar con productos génicos importantes para la enfermedad proliferativa o diferenciativa celular, los genes pueden estar también implicados en mecanismos importantes de procesos proliferativos o diferenciativos celulares asociados adicionales.

Las moléculas 17906 pueden estar implicadas en la transducción de señal y, por tanto, pueden funcionar modulando la proliferación, diferenciación y motilidad celular. Por tanto, las moléculas 17906 pueden desempeñar un papel en mecanismos de señalización del crecimiento celular. Como se usa en la presente memoria, el término "mecanismos de señalización del crecimiento celular" incluye la transmisión de señal desde los receptores celulares, por ejemplo, receptores acoplados a proteína G, que regula 1) la transversalidad celular a través del ciclo celular, 2) la diferenciación celular, 3) la supervivencia celular, y/o 4) la migración y formación de patrones celulares.

En consecuencia, las moléculas 17906 pueden estar implicadas en rutas de transducción de la señal celular que modulan la proliferación o diferenciación celular. Las moléculas 17906 pueden desempeñar también un papel o función en la transducción de señales para proliferación, diferenciación y apoptosis celular. En una realización, las moléculas 17906 modulan la actividad de una o más proteínas implicadas en el crecimiento o diferenciación celular, por ejemplo, crecimiento o diferenciación de células de mama u ovario.

Por tanto, las moléculas 17906, al participar en mecanismos de señalización del crecimiento celular, pueden modular el comportamiento celular y actuar como dianas y agentes terapéuticos para controlar la proliferación y diferenciación celular de células de mama u ovario.

Las moléculas 17906 pueden actuar también como dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos novedosos para enfermedades o trastornos proliferativos o diferenciativos celulares.

Como se usa en la presente memoria, "un trastorno celular proliferativo o diferenciativo" o un "trastorno relacionado con el crecimiento celular" incluye un trastorno, enfermedad o afección caracterizado por una desregulación, por ejemplo una regulación positiva o una regulación negativa, del crecimiento celular. La desregulación del crecimiento celular puede ser debida a una desregulación de la proliferación celular, la progresión del ciclo celular, la diferenciación celular y/o hipertrofia celular.

La presente invención proporciona procedimientos para identificar la presencia de una molécula de ácido nucleico o polipéptido 17906 asociada a un trastorno celular proliferativo o diferenciativo. Además, la invención proporciona procedimientos para identificar un sujeto con riesgo de trastorno celular proliferativo o diferenciativo mediante la detección de la presencia de una molécula de ácido nucleico o polipéptido 17906.

La invención proporciona también un procedimiento para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno celular proliferativo o diferenciativo caracterizado por la expresión de ácido nucleico 17906 aberrante o la actividad de proteína 17906 aberrante mediante el ensayo de la capacidad del compuesto de modular la expresión de un ácido nucleico 17906 o la actividad de una proteína 17906. Además, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar un sujeto que tiene un trastorno óseo o proliferativo o diferenciativo celular asociado caracterizado por una actividad de proteína 17906 aberrante o una expresión de ácido nucleico 17906 aberrante mediante la administración a un sujeto de un modulador de 17906 que es capaz de modular la actividad de la proteína 17906 o la expresión del ácido nucleico 17906.

Se describen diversos aspectos de la invención con más detalle en las siguientes susbsecciones.

1. Ensayos de cribado

La invención proporciona un procedimiento (denominado también en la presente memoria como "ensayo de cribado") para identificar moduladores, concretamente, candidatos o compuestos de ensayo o agentes (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas u otros medicamentos) que se unen a proteínas 17906, que tengan un efecto estimulante o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión o actividad de 17906, o que tengan un efecto estimulante o inhibidor, por ejemplo, sobre la expresión o actividad de un sustrato de 17906.

Estos ensayos se diseñan para identificar compuestos que se unen a una proteína 17906, se unen a otras proteínas celulares o extracelulares que interaccionen con una proteína 17906, e interfieren con la interacción de la proteína 17906 con otras proteínas celulares o extracelulares. Por ejemplo, en el caso de la proteína 17906, que es una proteína de tipo receptor transmembrana, dichas técnicas pueden identificar ligandos para dicho receptor. Un ligando de proteína 17906 puede actuar, por ejemplo, como base para la mejora de enfermedades proliferativas y diferenciativas celulares tales como, por ejemplo, cáncer. Dichos compuestos pueden incluir, pero sin limitación, péptidos, anticuerpos o compuestos orgánicos o inorgánicos pequeños. Dichos compuestos pueden incluir también otras proteínas celulares.

Los compuestos identificados mediante ensayos tales como los descritos en la presente memoria pueden ser útiles, por ejemplo, para mejorar una enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. En casos en los que una enfermedad proliferativa o diferenciativa celular resulta de un nivel global menor de expresión del gen 17906 y/o proteína 17906 en una célula o tejido, los compuestos que interaccionan con la proteína 17906 pueden incluir compuestos que acentúen o amplifiquen la actividad de la proteína 17906 unida. Dichos compuestos causarían un aumento eficaz del nivel de actividad de proteína 17906, mejorando así los síntomas.

En otros casos, las mutaciones en el gen 17906 pueden causar la formación de tipos aberrantes o cantidades excesivas de proteínas 17906 que tienen un efecto nocivo que conduce a una enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. De forma similar, las condiciones fisiológicas pueden causar un aumento excesivo de la expresión del gen 17906, conduciendo a una enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. En dichos casos, pueden identificarse compuestos que se unen a una proteína 17906 que inhiben la actividad de la proteína 17906. Se discuten en la presente memoria ensayos para ensayar la eficacia de los compuestos identificados mediante técnicas tales como las descritas en esta sección.

En una realización, la invención proporciona ensayos para cribar candidatos o compuestos de ensayo que sean sustratos de una proteína o polipéptido 17906 o porción biológicamente activa del mismo. En otra realización, la invención proporciona ensayos para cribar candidatos o compuestos de ensayo que se unan a o modulen la actividad de una proteína o polipéptido 17906 o porción biológicamente activa del mismo. Los compuestos de ensayo de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques de procedimientos de colección combinatoria conocidos en la técnica incluyendo: biotecas, colecciones en fase sólida o fase de disolución paralelas referenciables espacialmente, procedimientos de colección sintética que requieren desconvolución, el procedimiento de colección de "una perla-un compuesto" y procedimientos de colección sintética que usan selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de bioteca está limitado a peptidotecas, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a colecciones de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).

Pueden encontrarse en la técnica ejemplos de procedimientos para la síntesis de colecciones moleculares, por ejemplo, en: DeWitt y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann y col. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho y col. (1993) Science 261: 1303; Carrell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell y col. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop y col. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.

Las colecciones de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), o sobre perlas (Lam (1991) Nature 354: 82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner USP 5.223.409), esporas (Ladner USP 5.223.409), plásmidos (Cull y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) o sobre fago (Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla y col. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner supra).

En una realización, el ensayo es un ensayo basado en células en el que se pone en contacto una célula que expresa una proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de ensayo, y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de 17906. Puede conseguirse determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de 17906 controlando, por ejemplo, la concentración de calcio intracelular, IP3, AMPc o diacilglicerol, el perfil de fosforilación de las proteínas intracelulares, la proliferación y/o migración celular, la expresión de moléculas de adhesión a la superficie celular o la actividad de un factor de transcripción regulado por 17906. La célula puede ser de origen mamífero, por ejemplo, una célula de mama u ovario. En una realización, los compuestos que interaccionan con un dominio receptor de 17906 pueden cribarse según su capacidad de funcionar como ligandos, concretamente, para unirse al receptor 17906 y modular una ruta de transducción de señal. La identificación de ligandos de 17906 y la medida de la actividad del complejo ligando-receptor conduce a la identificación de moduladores (por ejemplo, antagonistas) de esta interacción. Dichos moduladores pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades proliferativas o diferenciativas celulares.

Puede determinarse también la capacidad del compuesto de ensayo de modular la unión de 17906 a un sustrato o para unirse a 17906. Puede conseguirse determinar la capacidad del compuesto de ensayo de modular la unión de 17906 a un sustrato, por ejemplo, acoplando el sustrato de 17906 a un radioisótopo o marcador enzimático de tal modo que pueda determinarse la unión del sustrato de 17906 a 17906 detectando el sustrato 17906 marcado en un complejo. También podría acoplarse 17906 con un radioisótopo o marcador enzimático para controlar la capacidad de un compuesto de ensayo de modular la unión de 17906 a un sustrato de 17906 en un complejo. Puede conseguirse determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a 17906, por ejemplo, acoplando el compuesto con un radioisótopo o marcador enzimático de tal modo que pueda determinarse la unión del compuesto a 17906 detectando el compuesto 17906 marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ejemplo, ligandos o sustratos de 17906) pueden marcarse con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{3}H, directa o indirectamente, y detectarse el radioisótopo mediante recuento directo de la radioemisión o mediante recuento de centelleo. Adicionalmente, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y detectarse el marcaje enzimático mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.

Puede determinarse la presencia de 17906 en el suero de animales de tipo transgénico y silvestre, por ejemplo, en un ensayo de carboxipeptidasa. Brevemente, pueden combinarse 5 \mul de suero de ratón, por ejemplo, con 45 \mul de un sustrato de 17906 apropiado 55 \muM incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo angiotensina I, una cinina o cinetensina, en tampón de 17906. Entonces, puede medirse la velocidad de degradación proteolítica del sustrato midiendo la producción de fluorescencia (en unidades de fluorescencia) por segundo durante 30 minutos a temperatura ambiente a un ajuste de ganancia de 10. La tasa media de fluorescencia en unidades por segundo (UF/s) se correlaciona directamente con la cantidad de 17906 en el suero. Como control de la especificidad de 17906, puede realizarse un ensayo de carboxipeptidasa estándar (Holmquist y Riordan, "Carboxypeptidase A", pág. 44-60, "Peptidase and their Inhibitors in Method of Enzymatic Analysis" (1984)). Adicionalmente, puede realizarse un ensayo de carboxipeptidasa adicional según lo descrito en Ostrowska, H. y col. (1998) Rocz Akad. Med. Bialymst., 43: 39-55, que se incorpora a la presente memoria como referencia.

Está también dentro del alcance de esta invención determinar la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un ligando o sustrato de 17906) de interaccionar con 17906 sin el marcaje de ninguno de los intervinientes. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con 17906 sin el marcaje de ninguno del compuesto ni 17906 (McConnell, H. M. y col. (1992) Science 257: 1906-1912). Como se usa en la presente memoria, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico fotoreferenciable (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden usarse como indicador de la interacción entre un compuesto y 17906.

En otra realización, el ensayo es un ensayo basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de 17906 (por ejemplo, un sustrato de 17906) con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la molécula diana de 17906. Puede conseguirse determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una molécula diana de 17906, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína 17906 para unirse o interaccionar con la molécula diana de 17906.

Puede conseguirse determinar la capacidad de la proteína 17906 o un fragmento biológicamente activo de la misma para unirse a o interaccionar con una molécula diana de 17906 mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una realización preferida, puede conseguirse determinar la capacidad de la proteína 17906 para unirse o interaccionar con una molécula diana de 17906 determinando la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana puede determinarse detectando la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (concretamente, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP3, AMPc), detectando la actividad catalítica/enzimática de la diana en un sustrato apropiado, detectando la inducción de un gen informador (que comprende un elemento regulador sensible a la diana ligado operativamente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa) o detectando una respuesta celular regulada por la diana (por ejemplo, una proliferación o migración celular).

En otra realización adicional, es un ensayo de la presente invención un ensayo exento de célula en el que se pone en contacto una proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a la proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma. Las porciones biológicamente activas de las proteínas 17906 para usar en ensayos de la presente invención incluyen fragmentos que participan en interacciones con moléculas no 17906, por ejemplo, fragmentos con altas puntuaciones de probabilidad de superficie. Puede determinarse la unión del compuesto de ensayo a la proteína 17906 directa o indirectamente como se describe anteriormente. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto la proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a 17906 formando una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 17906, en el que determinar la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 17906 comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferiblemente a 17906 o una porción biológicamente activa de la misma en comparación con el compuesto conocido. Los compuestos que modulan la interacción de 17906 con una proteína diana conocida pueden ser útiles en la regulación de la actividad de la proteína 17906, especialmente una proteína 17906 mutante.

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En otra realización, el ensayo es un ensayo exento de células en el que se pone en contacto una proteína 17906 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo de modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma. Puede conseguirse determinar la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de una proteína 17906, por ejemplo, determinando la capacidad de una proteína 17906 para unirse a una molécula diana de 17906 mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente para determinar la unión directa. Puede conseguirse también determinar la capacidad de la proteína 17906 para unirse a una molécula diana de 17906 usando una tecnología tal como análisis de interacción biomolecular a tiempo real (BIA) (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 y Szabo y col. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705). Como se usa en la presente memoria, "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real sin marcaje de ninguno de los intervinientes (por ejemplo, BIAcore). Pueden usarse los cambios en el fenómeno óptico de resonancia de plasmón de superficie (SPR) como indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

En otra realización, puede conseguirse determinar la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de una proteína 17906 determinando la capacidad de la proteína 17906 de modular adicionalmente la actividad de un efector cadena abajo de una molécula diana de 17906. Por ejemplo, puede determinarse la actividad de la molécula efectora sobre una diana apropiada o puede determinarse la unión del efecto a una diana apropiada como se describe anteriormente.

En aún otra realización, el ensayo exento de célula implica poner en contacto una proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a la proteína 17906 formando una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con la proteína 17906, en el que determinar la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con la proteína 17906 comprende determinar la capacidad de la proteína 17906 para unirse preferiblemente a o modular la actividad de una molécula diana de 17906.

En más de una realización de los procedimientos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar 17906 o su molécula diana para facilitar la separación de formas complejadas de formas no complejadas de una o ambas proteínas, así como para adaptar la automatización del ensayo. Puede conseguirse la unión de un compuesto de ensayo a una proteína 17906, o la interacción de una proteína 17906 con una molécula diana, en presencia y ausencia de un compuesto candidato en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite a una o ambas proteínas unirse a una matriz. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/17906 o proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/diana sobre perlas de Sepharose con glutatión (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microvaloración derivatizadas con glutatión, que se combinan entonces con el compuesto de ensayo o cualquiera del compuesto de ensayo y la proteína diana o proteína 17906 no adsorbida, y se incuba la mezcla en condiciones tendentes a la formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de salinidad y pH). Después de la incubación, se lavan las perlas o pocillos de placa de microvaloración para retirar cualquier componente no unido, y la matriz inmovilizada en el caso de perlas, se determina el complejo directa o indirectamente, por ejemplo como se describe anteriormente. Como alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz y determinarse el nivel de unión o actividad de 17906 usando técnicas estándar.

Pueden usarse también otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los ensayos de cribado de la invención. Por ejemplo, puede inmovilizarse cualquiera de una proteína 17906 o una molécula diana de 17906 utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. Pueden prepararse moléculas de proteína 17906 o diana biotinilada a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, pueden derivatizarse a los pocillos de la placa anticuerpos reactivos con moléculas de proteína 17906 o diana pero que no interfieren con la unión de la proteína 17906 a su molécula diana, y atraparse la diana o proteína 17906 no unida en los pocillos mediante conjugación de anticuerpo. Los procedimientos para detectar dichos complejos, además de los descritos para complejos inmovilizados en GST, incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteína 17906 o molécula diana, así como ensayos ligados a enzima que se basan en detectar una actividad enzimática asociada a la proteína 17906 o molécula diana.

En otra realización, se identifican moduladores de la expresión de 17906 en un procedimiento en el que se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906 en la célula. Se compara el nivel de expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906 en presencia del compuesto candidato con el nivel de expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906 en ausencia del compuesto candidato. Puede entonces identificarse el compuesto candidato como modulador de la expresión de 17906 basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906 es mayor (mayor de forma estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un estimulante de la expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906. Como alternativa, cuando la expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906 es menor (menor de forma estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un inhibidor de la expresión de ARNm de 17906 o proteína 17906. Puede determinarse el nivel de ARNm de 17906 o proteína 1706 en las células mediante los procedimientos descritos en la presente memoria para detectar ARNm de 17906 o proteína 17906.

En otro aspecto adicional de la invención, las proteínas 17906 pueden usarse como "proteínas cebo" en un ensayo de doble híbrido o un ensayo de triple híbrido (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.283.317; Zervos y col. (1993) Cell 72: 223-232; Madura y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 2046-12054; Bartel y col. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi y col. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; y Brent WO94/10300), para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con 17906 ("proteínas de unión a 17906" o "pu-17906") y están implicadas en la actividad de 17906. Dichas proteínas de unión a 17906 están también probablemente implicadas en la propagación de señales por las proteínas 17906 o dianas de 17906 como, por ejemplo, elementos cadena abajo de una ruta de señalización mediada por 17906. Como alternativa, es probable que dichas proteínas de unión a 17906 sean inhibidores
de 17906.

El sistema de doble híbrido está basado en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten en dominios separables de unión a ADN y activación. Brevemente, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, se fusiona el gen que codifica una proteína 17906 con un gen que codifica el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, se fusiona una secuencia de ADN, de una colección de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") con un gen que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interaccionar in vivo, formando un complejo dependiente de 17906, los dominios de unión a ADN y de activación del factor de transcripción se ponen en estrecha proximidad. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que está ligado operativamente a un sitio regulador transcripcional sensible al factor de transcripción. Puede detectarse la expresión del gen indicador y pueden aislarse las colonias celulares que contienen el factor de transcripción funcional y usarse para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interacciona con la proteína 17906.

En otro aspecto, la invención se refiere a una combinación de dos o más de los ensayos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, puede identificarse un agente de modulación usando un ensayo basado en células o un ensayo exento de células, y puede confirmarse in vivo la capacidad del agente de modular la actividad de una proteína 17906 in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para enfermedad proliferativa o diferenciativa celular, como se describe en la presente memoria.

Esta divulgación se refiere adicionalmente a agentes novedosos identificados mediante los ensayos de cribado descritos anteriormente. En consecuencia, está dentro del alcance de esta divulgación usar adicionalmente un agente identificado como se describe en la presente memoria en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, puede usarse un agente identificado como se describe en la presente memoria (por ejemplo, un agente modulador de 17906, una molécula de ácido nucleico 17906 antisentido, un anticuerpo específico de 17906 o una pareja de unión a 17906) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Como alternativa, puede usarse un agente identificado como se describe en la presente memoria en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Además, esta divulgación se refiere a usos de los agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección anteriormente descritos para tratamientos como se describen en la presente memoria.

Puede ensayarse en cualquiera de los compuestos incluyendo, pero sin limitación, compuestos tales como los identificados en los sistemas de ensayo anteriores, la capacidad de mejorar síntomas de enfermedad ósea o proliferativa o diferenciativa celular asociada. Se describen en la presente memoria ensayos basados en células y basados en modelos animales para la identificación de compuestos que exhiben dicha capacidad de mejorar sistemas morbosos óseos o proliferativos o diferenciativos celulares.

En un aspecto, pueden usarse sistemas basados en células, como se describen en la presente memoria, para identificar compuestos que pueden actuar mejorando los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. Por ejemplo, dichos sistemas celulares pueden exponerse a un compuesto sospechoso de exhibir la capacidad de mejorar los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para desencadenar dicha mejora de los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular en las células expuestas. Después de la exposición se examinan las células para determinar si se han alterado uno o más de los fenotipos celulares de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular para parecerse a un fenotipo de tipo más normal o más silvestre. Los fenotipos celulares que están asociados a estados morbosos proliferativos o diferenciativos celulares incluyen proliferación y migración aberrante, deposición de componentes de matriz extracelular y expresión de factores de crecimiento, citocinas y otros mediadores inflamatorios.

Además, pueden usarse sistemas morbosos proliferativos o diferenciativos celulares de origen animal, tales como los descritos en la presente memoria, para identificar compuestos capaces de mejorar los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. Dichos modelos animales pueden usarse como sustratos de ensayo para la identificación de medicamentos, sustancias farmacéuticas, terapias e intervenciones que pueden ser eficaces en el tratamiento de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. Por ejemplo, pueden exponerse modelos animales a un compuesto sospechoso de exhibir la capacidad de mejorar síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para desencadenar dicha mejora de los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición puede controlarse valorando la reversión de los trastornos asociados a enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. Con respecto a la intervención, cualquier tratamiento que revierta cualquier aspecto de los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular debe ser considerado como candidato para intervención terapéutica de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular humana. Las dosificaciones de agentes de ensayo pueden determinarse derivando curvas de dosis-respuesta.

Adicionalmente, pueden utilizarse los patrones de expresión génica para valorar la capacidad de un compuesto de mejorar los síntomas de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular. Por ejemplo, el patrón de expresión de uno o más genes puede formar parte de un "perfil de expresión génica" o "perfil transcripcional", que puede usarse entonces en dicha valoración. "Perfil de expresión génica" o "perfil transcripcional", como se usan en la presente memoria, incluyen el patrón de expresión de ARNm obtenido para un tejido o tipo celular dado en un conjunto dado de afecciones. Dichas afecciones pueden incluir, pero sin limitación, aterosclerosis, isquemia/reperfusión, hipertensión, reestenosis e inflamación arterial, incluyendo cualquiera de las afecciones de control o experimentales descritas en la presente memoria. Los perfiles de expresión génica pueden generarse, por ejemplo, utilizando un procedimiento de presentación diferencial, análisis Northern y/o PCR-TI cuantitativa a tiempo real. En una realización, pueden usarse secuencias del gen 17906 como sondas y/o cebadores de PCR para la generación y corroboración de dichos perfiles de expresión génica.

Los perfiles de expresión génica pueden caracterizarse para estados conocidos, tanto morbosos proliferativos o diferenciativos celulares como normales, en los sistemas modelo basados en células y/o animal. Posteriormente, pueden compararse estos perfiles de expresión génica conocidos para comprobar el efecto que tiene un compuesto de ensayo de modificar dichos perfiles de expresión génica, y de causar que el perfil se parezca más estrechamente al de un perfil más deseable.

Por ejemplo, la administración de un compuesto puede hacer que el perfil de expresión génica de un sistema modelo de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular se parezca más estrechamente al sistema de control. La administración de un compuesto puede causar, como alternativa, que el perfil de expresión génica de un sistema de control empiece a imitar un estado morboso proliferativo o diferenciativo celular. Dicho compuesto puede usarse, por ejemplo, en la caracterización adicional del compuesto de interés, o puede usarse en la generación de modelos animales adicionales.

2. Medicina predictiva

La presente invención se refiere también al campo de la medicina predictiva en la que se usan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico y ensayos clínicos de control con fines de pronóstico (predictivos) para tratar así profilácticamente un individuo. En consecuencia, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de proteína y/o ácidos nucleicos 17906, así como la actividad de 17906, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar así si un individuo está aquejado de una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno celular proliferativo o diferenciativo asociado a una expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseada. La invención proporciona también ensayos de pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado a proteína 17906, expresión de ácido nucleico 17906 o actividad de 17906. Por ejemplo, pueden ensayarse en una muestra biológica las mutaciones en un gen 17906. Dichos ensayos pueden usarse con fines de pronóstico o predictivos para tratar así profilácticamente un individuo antes del inicio de un trastorno caracterizado por o asociado a proteína 17906, expresión de ácido nucleico 17906 o actividad de 17906.

Otro aspecto de la invención se refiere a controlar la influencia de agentes (por ejemplo, medicamentos, compuestos) sobre la expresión o actividad de 17906 en ensayos clínicos.

Se describen estos y otros agentes con mayor detalle en las siguientes secciones.

A. Ensayos de diagnóstico

La presente invención comprende procedimientos para la evaluación de diagnóstico y pronóstico de afecciones morbosas proliferativas o diferenciativas celulares, y para la identificación de sujetos que exhiben una predisposición a dichas afecciones.

Un procedimiento ilustrativo para detectar la presencia o ausencia de proteína o ácido nucleico 17906 en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de ensayo y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o agente capaz de detectar proteína o ácido nucleico 17906 (por ejemplo, ARNm o ADN genómico) que codifica proteína 17906 de tal modo que se detecte la presencia de proteína o ácido nucleico 17906 en la muestra biológica. Es un agente preferido para detectar ARNm o ADN genómico de 17906 una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar con ARNm o ADN genómico de 17906. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el ácido nucleico 17906 expuesto en la SEC ID Nº 1 o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones rigurosas con ARNm o ADN genómico de 17906. Se describen en la presente memoria otras sondas adecuadas para uso en los ensayos de diagnóstico de la invención.

Un agente preferido para detectar proteína 17906 es un anticuerpo capaz de unirse a proteína 17906, preferiblemente un anticuerpo con un marcaje detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, más preferiblemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')2). El término "marcado" con respecto a la sonda o anticuerpo se pretende que comprenda marcaje directo de la sonda o anticuerpo mediante acoplamiento (concretamente, ligadura físico) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y marcaje terminal de una sonda de ADN con biotina, de tal modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada fluorescentemente. El término "muestra biológica" se pretende que incluya tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Es decir, el procedimiento de detección de la invención puede usarse para detectar ARNm, proteína o ADN genómico de 17906 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm de 17906 incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de proteína 17906 incluyen ensayos de inmunosorción ligados a enzima (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para detección de ADN genómico de 17906 incluyen hibridaciones Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de proteína 17906 incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti-17906 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto pueden detectarse mediante técnicas de formación de imagen estándar.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto de ensayo. Como alternativa, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del sujeto de ensayo. Es una muestra biológica preferida una muestra de suero aislada por medios convencionales de un sujeto.

En otra realización, los procedimientos implican adicionalmente obtener una muestra biológica de control de un sujeto de control, poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar proteína, ARNm o ADN genómico de 17906, de tal modo que se detecte la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de 17906 en la muestra biológica, y comparar la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de 17906 en la muestra de control con la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de 17906 en la muestra de ensayo.

La divulgación comprende también kits para detectar la presencia de 17906 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar proteína o ARNm de 17906 en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de 17906 en la muestra y medios para comparar la cantidad de 17906 en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede estar envasado en un envase adecuado. El kit puede comprender adicionalmente instrucciones para usar el kit para detectar proteína o ácido nucleico 17906.

B. Ensayos de pronóstico

Los procedimientos de diagnóstico descritos en la presente memoria pueden utilizarse además para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno celular proliferativo o diferenciativo asociado a una expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseada. Como se usa en la presente memoria, el término "aberrante" incluye una expresión o actividad de 17906 que se desvía de la expresión o actividad de 17906 de tipo silvestre. La expresión o actividad aberrante incluye la expresión o actividad aumentada o reducida, así como la expresión o actividad que no sigue el patrón de desarrollo de tipo silvestre de expresión o el patrón subcelular de expresión. Por ejemplo, se pretende que la expresión o actividad de 17906 aberrante incluya los casos en que una mutación del gen 17906 causa que el gen 17906 esté subexpresado o sobreexpresado y situaciones en las que dichas mutaciones dan como resultado una proteína 17906 no funcional o una proteína que no funciona de modo de tipo silvestre, por ejemplo, una proteína que no interacciona con un ligando o sustrato de 17906, o una que interacciona con un ligando o sustrato no de 17906. Como se usa en la presente memoria, el término "indeseado" incluye un fenómeno indeseado implicado en una respuesta biológica tal como proliferación celular. Por ejemplo, el término indeseado incluye un patrón de expresión de 17906 o una actividad de proteína 17906 que es indeseable en un sujeto.

Los ensayos descritos en la presente memoria, tales como los ensayos de diagnóstico precedentes o los ensayos siguientes, pueden utilizarse para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado a una desregulación de la actividad de proteína o de la expresión de ácido nucleico 17906, tal como un trastorno celular proliferativo o diferenciativo. Como alternativa, pueden utilizarse ensayos de pronóstico para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno celular proliferativo o diferenciativo asociado a una desregulación de la actividad de proteína 17906 o de la expresión de ácido nucleico 17906. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar una enfermedad o trastorno asociado a la expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseada, en el que se obtiene una muestra de ensayo de un sujeto y se detecta proteína o ácido nucleico 17906 (por ejemplo, ARNm o ADN genómico), en el que la presencia de proteína o ácido nucleico 17906 es un indicador diagnóstico de que un sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado a la expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseado. Como se usa en la presente memoria, una "muestra de ensayo" designa una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra de ensayo puede ser un fluido biológico (por ejemplo, suero), muestra de célula o tejido.

Además, los ensayos de pronóstico descritos en la presente memoria pueden usarse para determinar si puede administrarse a un sujeto un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro candidato a medicamento) para tratar una enfermedad o trastorno asociado a una expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseada. Por ejemplo, dichos procedimientos pueden usarse para determinar si un sujeto puede tratarse eficazmente con un agente para un trastorno celular proliferativo o diferenciativo. Por tanto, la presente invención proporciona procedimientos para determinar si un sujeto puede tratarse eficazmente con un agente para trastorno celular proliferativo o diferenciativo asociado a una expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseada, en los que se obtiene una muestra de ensayo y se detecta la expresión o actividad de proteína o ácido nucleico 17906 (por ejemplo, en los que la abundancia de expresión o actividad de proteína o ácido nucleico 17906 es un indicador diagnóstico para un sujeto al que puede administrarse el agente para tratar un trastorno asociado a una expresión o actividad de 17906 aberrante o indeseada).

Los procedimientos de la divulgación pueden usarse también para detectar alteraciones genéticas en un gen 17906, determinando así si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de un trastorno caracterizado por la desregulación de la actividad de proteína o la expresión de ácido nucleico 17906, tal como un trastorno proliferativo. En realizaciones preferidas, los procedimientos incluyen detectar en una muestra de células del sujeto la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos una entre una alteración que afecta a la integridad del gen que codifica la proteína 17906, o la expresión defectuosa del gen 17906. Por ejemplo, dichas alteraciones genéticas pueden detectarse comprobando la existencia de al menos una de 1) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen 17906, 2) una adición de uno o más nucleótidos a un gen 17906, 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen 17906, 4) una redistribución cromosómica de un gen 17906, 5) una alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajero de un gen 17906, 6) una modificación aberrante de un gen 17906 tal como del patrón de metilación del ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no silvestre de un transcrito de ARN mensajero de un gen 17906, 8) un nivel de proteína 17906 de tipo no silvestre, 9) una pérdida alélica de un gen 17906 y 10) una modificación post-traduccional inapropiada de una proteína 17906. Como se describe en la presente memoria, hay un gran número de ensayos conocidos en la técnica que pueden usarse para detectar alteraciones en un gen 17906. Es una muestra biológica preferida una muestra de tejido o suero aislada por medios convencionales de un sujeto.

En ciertas realizaciones, la detección de la alteración implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR de anclaje o PCR RACE o, como alternativa, en una reacción de cadena de la ligasa (LCR) (véanse, por ejemplo, Landegran y col (1988) Science 241:1077-1080 y Nakazawa y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364), pudiendo ser la última particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen 17906 (véase Abravaya y col. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682). Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un sujeto, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan específicamente con un gen 17906 en condiciones tales que se produzca la hibridación y amplificación del gen 17906 (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se prevé que la PCR y/o LCR pueden ser deseables para usar como etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas usadas para detectar mutaciones descritas en la presente memoria.

Otros procedimientos de amplificación incluyen: replicación de secuencia autosostenida (Guatelli, J.C. y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D.Y. y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), replicasa Q-Beta (Lizardi, P.M. y col. (1988) Bio-Technology 6: 1197) o cualquier otro procedimiento de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy bajas.

En una realización alternativa, pueden identificarse mutaciones en un gen 17906 de una célula muestra mediante alteraciones en los patrones de escisión de enzima de restricción. Por ejemplo, se aísla ADN de muestra y control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, se determinan los tamaños de longitud de fragmento mediante electroforesis en gel y se comparan. Las diferencias entre tamaños de longitud de fragmento entre ADN de muestra y de control indican mutaciones en el ADN de la muestra. Además, puede usarse el uso de ribozimas específicas de secuencias (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.498.531) para señalar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o pérdida de un sitio de escisión de ribozima.

En otras realizaciones, las mutaciones genéticas en 17906 pueden identificarse hibridando ácidos nucleicos de muestra y control, por ejemplo, ADN o ARN, con matrices de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin, M.T. y col. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M.J. y col. (1996) Nature Medicine 2: 753-759). Por ejemplo, las mutaciones genéticas en 17906 pueden identificarse en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas por la luz como se describe en Cronin, M.T. y col. supra. Brevemente, puede usarse una primera matriz de hibridación de sondas para examinar tramos largos de ADN en una muestra y control para identificar los cambios de bases entre las secuencias preparando matrices lineales de sondas superpuestas secuenciales. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa va seguida de una segunda matriz de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando matrices de sondas especializadas menores complementarias de todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutación está compuesta por conjuntos de sondas paralelas, una complementaria del gen de tipo silvestre y otra complementaria del gen mutante.

En otra realización adicional, puede usarse cualquiera entre una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen 17906 y detectar mutaciones comparando la secuencia de la muestra de 17906 con la correspondiente secuencia de tipo silvestre (control). Los ejemplos de reacciones de secuenciación incluyen aquellas basadas en técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74: 560) o Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). Se contempla también que pueda utilizarse cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciación automatizada cuando se realizan los ensayos de diagnóstico ((1995) Biotechniques 19: 448), incluyendo secuenciación por espectrometría de masas (véanse, por ejemplo, la publicación internacional PCT nº WO 94/16101; Cohen y col. (1996) Adv. Chromatogr. 36: 127-162; y Griffin y col. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159).

Otros procedimientos para detectar mutaciones en el gen 17906 incluyen procedimientos en los que se usa la protección de los agentes de escisión para detectar bases desapareadas en heterodúplex de ARN/ARN o ARN/ADN (Myers y col. (1985) Science 230: 1242). En general, la técnica de "escisión de desapareamiento" empieza proporcionando heterodúplex formados hibridando ARN o ADN (marcados) que contienen la secuencia de 17906 de tipo silvestre con ARN o ADN potencialmente mutante obtenido a partir de una muestra de tejido. Se tratan los dúplex bicatenarios con un agente que escinde las regiones monocatenarias del dúplex tales como las que existan debido a desapareamientos de par de bases entre las cadenas de control y muestra. Por ejemplo, los dúplex de ARN/ADN pueden tratarse con ARNasa y los híbridos de ADN/ADN tratarse con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones desapareadas. En otras realizaciones, pueden tratarse dúplex de ADN/ADN o ARN/ADN con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piridina para digerir las regiones desapareadas. Después de la digestión de las regiones desapareadas, se separa entonces el material resultante en geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de mutación. Véanse, por ejemplo, Cotton y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba y col. (1992) Methods Enzymol. 217: 286-295. En una realización preferida, el ADN o ARN de control puede estar marcado para detección.

En otra realización adicional, la reacción de escisión de desapareamiento emplea una o más proteínas que reconocen los pares de bases desapareados en el ADN bicatenario (denominadas enzimas de "reparación de desapareamiento de ADN") en sistemas definidos para detectar y cartografiar mutaciones puntuales en ADNc 17906 obtenidos a partir de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde los desapareamientos de A en G/A y la timidina ADN glicosilasa de células HeLA escinde los desapareamientos de T en G/T (Hsu y col. (1994) Carcinogenesis 15: 1657-1662). Según una realización ilustrativa, hibrida una sonda basada en una secuencia de 17906, por ejemplo, una secuencia de 17906 de tipo silvestre, con un ADNc u otro producto ADN de una(s) célula(s) de ensayo. Se trata el dúplex con una enzima de reparación de desapareamiento de ADN y los productos de escisión, si los hubiera, pueden detectarse a partir de protocolos de electroforesis o similares (descritos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.459.039).

En otras realizaciones, se usarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar mutaciones en genes 17906. Por ejemplo, puede usarse el polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos de tipo mutante y silvestre (Orita y col. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86: 2766, véase también Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144 y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79). Se desnaturalizarán fragmentos de ADN monocatenarios de ácidos nucleicos 17906 de muestra y control y se dejarán renaturalizar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía según la secuencia, la alteración resultante de la movilidad electroforética posibilita la detección incluso de un único cambio de bases. Los fragmentos de ADN pueden estar marcados o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede potenciarse usando ARN (en lugar de ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible al cambio de secuencia. En una realización preferida, el procedimiento en cuestión utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodú-
plex bicatenarias basándose en cambios en la movilidad electroforética (Keen y col. (1991) Trends Genet. 7: 5).

En otra realización adicional, se ensaya el movimiento de fragmentos de tipo mutante o silvestre en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente desnaturalizante usando electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers y col. (1985) Nature 313: 495). Cuando se usa DGGE como procedimientos de análisis, se modificará el ADN para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo, añadiendo una cola de GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en CG de alto punto de fusión mediante PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad de ADN de control y muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem. 265: 12753).

Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, pero sin limitación, hibridación oligonucleotídica selectiva, amplificación selectiva o extensión de cebador selectiva. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores oligonucleotídicos en los que la mutación conocida está dispuesta centradamente, y entonces hibrida con ADN diana en condiciones que permitan la hibridación sólo si se encuentra una coincidencia perfecta (Saiki y col. (1986) Nature 324: 163); Saiki y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230). Dichos oligonucleótidos específicos de alelo hibridan con ADN diana amplificado por PCR o una serie de mutaciones diferentes cuando se unen los oligonucleótidos a la membrana de hibridación e hibridan con ADN diana marcado.

Como alternativa, puede usarse tecnología de amplificación específica de alelo que depende de la amplificación por PCR selectiva junto con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para amplificación específica pueden portar la mutación de interés en el centro de la molécula (de modo que la amplificación dependa de hibridación diferencial) (Gibbs y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448) o en el extremo 3' de un primer cebador donde, en condiciones apropiadas, el desapareamiento puede prevenir, o reducir, la extensión de la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11: 238). Además, puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en la región de mutación para crear una detección basada en la escisión (Gasparini y col. (1992) Mol. Cell Probes 6: 1). Se prevé que, en ciertas realizaciones, la amplificación pueda realizarse también usando Taq ligasa para amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189). En dichos casos, ocurrirá ligadura sólo si hay una coincidencia perfecta en el extremo 3' de la secuencia 5', haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación.

Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden realizarse, por ejemplo, utilizando kits de diagnóstico preenvasados que comprenden al menos una sonda de ácido nucleico o reactivo anticuerpo descrito en la presente memoria, que puede usarse convenientemente, por ejemplo en instalaciones clínicas, para diagnosticar pacientes que exhiben síntomas o historial familiar de una enfermedad o afección que implica un gen 17906.

Además, en los ensayos de pronóstico descritos en la presente memoria puede utilizarse cualquier tipo celular o tejido en el que se exprese 17906.

C. Control de los efectos durante los ensayos clínicos

La presente invención proporciona procedimientos para evaluar la eficacia de medicamentos y controlar la progresión de pacientes implicados en ensayos clínicos para el tratamiento de enfermedad proliferativa o diferenciativa celular.

Controlar la influencia de agentes (por ejemplo, medicamentos) sobre la expresión o actividad de una proteína 17906 (por ejemplo, la modulación de la proliferación y/o migración celular) puede aplicarse no sólo al cribado básico de medicamentos, sino también a ensayos clínicos. Por ejemplo, puede controlarse la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de cribado como se describe en la presente memoria para aumentar la expresión génica de 17906 o los niveles de proteína 17906 o regular positivamente la actividad de 17906 en ensayos clínicos de sujetos que exhiben una expresión génica de 17906 o niveles de proteína 17906 reducidos, o una actividad de 17906 regulada negativamente. Como alternativa, puede controlarse la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de cribado de reducir la expresión génica de 17906 o niveles de proteína 17906, o regular negativamente la actividad de 17906 en ensayos clínicos de sujetos que exhiben una expresión génica de 17906 o niveles de proteína 17906 aumentados, o una actividad de 17906 regulada positivamente. En dichos ensayos clínicos, puede usarse la expresión o actividad de un gen 17906, y preferiblemente de otros genes que hayan estado implicados, por ejemplo, en un trastorno asociado a 17906, como "visualización" o marcadores del fenotipo de una célula particular, por ejemplo, célula de mama u ovario. Además, puede usarse la expresión de un gen 17906, o el nivel de proteína 17906, como visualización del efecto de un medicamento o agente particular sobre un estado morboso proliferativo o diferenciativo.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, pueden identificarse genes, incluyendo 17906, que se modulan en células mediante el tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, medicamento o molécula pequeña) que modula la actividad de 17906 (por ejemplo, identificado en un ensayo de cribado como se describe en la presente memoria). Por tanto, para estudiar el efecto de agentes sobre trastornos asociados a 17906 (por ejemplo, trastornos proliferativos o diferenciativos celulares caracterizados por una actividad desregulada de una célula de mama u ovario), por ejemplo en un ensayo clínico, pueden aislarse células, prepararse ARN y analizar los niveles de expresión de 17906 y otros genes implicados en el trastorno asociado a 17906, respectivamente. Pueden cuantificarse los niveles de expresión génica (por ejemplo, un patrón de expresión génica) mediante análisis de transferencia Northern o PCR-TI cuantitativa en tiempo real, como se describe en la presente memoria, o como alternativa midiendo la cantidad de proteína producida, mediante uno de los procedimientos descritos en la presente memoria, o midiendo los niveles de actividad de 17906 u otros genes. De este modo, el patrón de expresión génica puede servir como marcador indicativo de la respuesta fisiológica de las células ante el agente. En consecuencia, este estado de respuesta puede determinarse antes, y en diversos puntos durante el tratamiento del individuo con el agente.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para controlar la eficacia de tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro candidato a medicamento identificado mediante los ensayos de cribado descritos en la presente memoria) que incluye las etapas de (i) obtener una muestra preadministración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión de una proteína, ARNm o ADN genómico 17906 en la muestra preadministración; (iii) obtener una o más muestras postadministración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico 17906 en las muestras postadministración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico 17906 en la muestra preadministración con la proteína, ARNm o ADN genómico 17906 en la muestra o muestras postadministración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto en consecuencia. Por ejemplo, puede ser deseable una administración aumentada del agente para aumentar la expresión o actividad de 17906 a niveles mayores que los detectados, concretamente, para aumentar la eficacia del agente. Como alternativa, puede ser deseable una administración reducida del agente para reducir la expresión o actividad de 17906 a niveles menores que los detectados, concretamente, para reducir la eficacia del agente. Según dicha realización, puede usarse la expresión o actividad de 17906 como indicador de la eficacia de un agente, incluso en ausencia de una respuesta fenotípica observable.

Moléculas de ácido nucleico aisladas

Se muestran la secuencia nucleotídica del ADNc de 17906 humano aislado y la secuencia aminoacídica predicha del polipéptido 17906 humano en la Figura 1 y las SEC ID Nº 1 y 2, respectivamente. La secuencia nucleotídica que codifica 17906 humano es idéntica a la molécula de ácido nucleico con número de acceso GenBank AF095719 (Huang, H. y col. Cancer Res. (1999) 59 (12): 2981-2988).

El gen 17906 humano, que tiene aproximadamente 2795 nucleótidos de longitud, codifica una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 46,4 kDa y que tiene aproximadamente 422 restos aminoacídicos de longitud.

Los procedimientos de la invención incluyen el uso de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas 17906 o porciones biológicamente activas de la misma, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican 17906 (por ejemplo, ARNm de 17906) y fragmentos para uso como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico 17906. Como se usa en la presente memoria, el término "molécula de ácido nucleico" se pretende que incluya moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos de ADN o ARN generados usando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es preferiblemente ADN bicatenario.

El término "molécula de ácido nucleico aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma al que el ADN genómico está asociado naturalmente. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está exento de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (concretamente, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico 17906 aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias nucleotídicas que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente exenta de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Puede aislarse una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1, o una porción de la misma, usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia proporcionada en la presente memoria. Usando toda o una porción de la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1 como sonda de hibridación, pueden aislarse moléculas de ácido nucleico 17906 usando técnicas de hibridación y clonación estándar (por ejemplo, como se describen en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, puede aislarse una molécula de ácido nucleico que comprende toda o una porción de la SEC ID Nº 1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados basándose en la secuencia SEC ID Nº 1.

Puede amplificarse un ácido nucleico de la divulgación usando ADNc, ARNm o, como alternativa, ADN genómico, como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados según técnicas de amplificación por PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y se caracteriza mediante análisis de secuencia de ADN. Además, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a las secuencias nucleotídicas de 17906 mediante técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación comprende la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1. La secuencia de SEC ID Nº 1 corresponde al ADNc de 17906 humano. Este ADNc comprende secuencias que codifican la proteína 17906 humana (concretamente, "la región de codificación de SEC ID Nº 1").

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación comprende una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1, o una porción cualquiera de esta secuencia nucleotídica. Una molécula de ácido nucleico complementaria de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1 es aquella que es suficientemente complementaria con la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1, de tal modo que puede hibridar con la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1, formando así un dúplex estable.

En otra realización preferida adicional, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente divulgación comprende una secuencia nucleotídica que es al menos aproximadamente un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más idéntica a la longitud completa de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1, o una porción cualquiera de esta secuencia nucleotídica.

Además, la molécula de ácido nucleico de la divulgación puede comprender sólo una porción de la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 1, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de una proteína 17906, por ejemplo, una porción biológicamente activa de una proteína 17906. La secuencia nucleotídica determinada a partir de la clonación del gen 17906 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de 17906, así como homólogos de 17906 de otras especies. La sonda/cebador comprende típicamente oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12 ó 15, preferiblemente aproximadamente 20 ó 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido de SEC ID Nº 1, de una secuencia antisentido de SEC ID Nº 1 o de una variante alélica o mutante de origen natural de SEC ID Nº 1. En una realización, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación comprende una secuencia nucleotídica que es mayor de 100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, o más nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones rigurosas de hibridación con una molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº 1.

Pueden usarse sondas basadas en la secuencia nucleotídica de 17906 para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas u homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Dichas sondas pueden usarse como parte de un kit de ensayo de diagnóstico para identificar células o tejido que expresan defectuosamente una proteína 17906, tal como midiendo el nivel de un ácido nucleico que codifica 17906 en una muestra de células de un sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de 17906 o determinado si un gen 17906 genómico se ha mutado o eliminado.

Puede prepararse un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de una proteína 17906" aislando una porción de la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1 que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de 17906 (las actividades biológicas de la proteína 17906 se describen en la presente memoria), expresando la porción codificada de la proteína 17906 (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y valorando la actividad de la porción codificada de la proteína 17906.

Los procedimientos de la invención comprenden adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1 debido a la degeneración del código genético, y por tanto codifican la misma proteína 17906 que aquellos codificados por la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC ID Nº 1. En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación tiene una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que tiene una secuencia aminoacídica mostrada en la SEC ID Nº 2.

Además de la secuencia nucleotídica de 17906 mostrada en la SEC ID Nº 1, los expertos en la técnica apreciarán que pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias aminoacídicas de la proteína 17906 en una población (por ejemplo, la población humana). Dicho polimorfismo genético en el gen 17906 puede aparecer entre individuos en una población debido a la variación alélica natural. Como se usa en la presente memoria, los términos "gen" y "gen recombinante" designan moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco abierto de lectura que codifica una proteína 17906, preferiblemente una proteína 17906 de mamífero, y pueden incluir secuencias reguladoras de no codificación e intrones.

Las variaciones alélicas de 17906 humano incluyen tanto proteínas 17906 funcionales como no funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de la secuencia aminoacídica de origen natural de la proteína 17906 humana que mantienen la capacidad de unirse a un ligando o sustrato de 17906 y/o de modular los mecanismos de proliferación y/o migración celular. Las variantes alélicas funcionales contendrán típicamente sólo sustituciones conservativas de uno o más aminoácidos de SEC ID Nº 2, o sustituciones, deleciones o inserciones de restos no críticos en regiones no críticas de la proteína.

Las variantes alélicas no funcionales son variantes de secuencia aminoacídica de origen natural de la proteína 17906 humana que no tienen la capacidad de unirse a un ligando o sustrato de 17906 y/o de modular los mecanismos de proliferación y/o migración celular. Las variantes alélicas no funcionales contendrán típicamente una sustitución no conservativa, una deleción o inserción o truncamiento prematuro de la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 2, o una sustitución, inserción o deleción en restos críticos o regiones críticas.

Los procedimientos de la presente invención pueden usar adicionalmente ortólogos no humanos de la proteína 17906 humana. Los ortólogos de la proteína 17906 humana que se aíslan a partir de organismos no humanos poseen la misma unión a ligando de 17906 y/o modulación de los mecanismos de proliferación y/o migración celular que la proteína 17906 humana. Los ortólogos de la proteína 17906 humana pueden identificarse fácilmente por comprender una secuencia aminoacídica que es sustancialmente idéntica a la SEC ID Nº 2.

Además, se pretende que las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de 17906 y, por tanto, que tienen una secuencia nucleotídica que difiere de la secuencia de 17906 de SEC ID Nº 1, estén dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, puede identificarse otro ADNc de 17906 basándose en la secuencia nucleotídica de 17906 humano. Además, se pretende que las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas 17906 de diferentes especies y que, por tanto, tienen una secuencia nucleotídica que difiere de la secuencia de 17906 de SEC ID Nº 1, estén dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, puede identificarse un ADNc de 17906 de ratón basándose en la secuencia nucleotídica de 17906 humano.

Pueden aislarse moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y homólogos de ADNc de 17906 de la divulgación basándose en su homología con el ácido nucleico 17906 dado a conocer en la presente memoria usando los ADNc dados a conocer en la presente memoria, o una porción de los mismos, como sonda de hibridación según técnicas de hibridación estándar en condiciones rigurosas de hibridación. Pueden aislarse adicionalmente moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas y homólogos de ADNc de 17906 cartografiando en el mismo cromosoma o locus que el gen 17906.

En consecuencia, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación tiene al menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleótidica de SEC ID Nº 1. En otra realización, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 1000, 1200 o más nucleótidos de longitud. Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término "se hibrida en condiciones rigurosas" describa las condiciones de hibridación y lavado bajo las cuales secuencias nucleotídicas al menos un 60% idénticas entre sí permanecen típicamente hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias de al menos aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, aún más preferiblemente al menos un 85% o 90% idénticas entre sí permanecen hibridadas entre sí. Dichas condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Son un ejemplo preferido no limitante de condiciones rigurosas de hibridación la hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% de SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 60ºC, y aún más preferiblemente a 65ºC. Se pretende también que estén comprendidos por la presente divulgación los intervalos intermedios de los valores anteriormente indicados, por ejemplo a 60-65ºC o a 55-60ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la divulgación que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de SEC ID Nº 1 corresponde con una molécula de ácido nucleido de origen natural. Como se usa en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico "de origen natural" designa una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia nucleotídica que aparece en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

Además de las variantes alélicas de origen natural de la secuencia 17906 que pueden existir en la población, el experto apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios mediante mutación en la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1, conduciendo así a cambios en la secuencia aminoacídica de la proteína 17906 codificada, sin alterar la capacidad funcional de la proteína 17906. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones nucleotídicas que conducen a sustituciones aminoacídicas en restos aminoacídicos "no esenciales" de la secuencia de SEC ID Nº 1. Un residuo aminoacídico "no esencial" es un residuo que puede alterarse en la secuencia de tipo silvestre de 17906 (por ejemplo, la secuencia de SEC ID Nº 2) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo aminoacídico "esencial" es necesario para la actividad biológica. Por ejemplo, se predice que los restos aminoacídicos que están conservados entre las proteínas 17906 de la presente divulgación son particularmente no susceptibles a la alteración. Además, no es probable que los restos aminoacídicos adicionales que están conservados entre las proteínas 17906 de la presente divulgación y otros miembros de la familia de receptor acoplado a proteína G sean susceptibles a la alteración.

En consecuencia, los procedimientos de la invención pueden incluir el uso de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas 17906 que contienen cambios en restos aminoacídicos que no son esenciales para actividad. Dichas proteínas 17906 difieren en la secuencia aminoacídica de la SEC ID Nº 2, aunque retienen actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia nucleotídica que codifica una proteína, en la que la proteína comprende una secuencia aminoacídica al menos aproximadamente un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más idéntica a la SEC ID Nº 2.

Puede crearse una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína 17906 idéntica a la proteína de SEC ID Nº 2 introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones nucleotídicas en la secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1, de tal modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones aminoacídicas en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en la SEC ID Nº 1 mediante técnicas estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones aminoacídicas conservativas en uno o más restos aminoacídicos no esenciales predichos. Una "sustitución aminoacídica conservativa" es aquella en que el residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, se reemplaza preferiblemente un residuo aminoacídico no esencial predicho en una proteína 17906 por otro residuo aminoacídico de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, en otra realización pueden introducirse aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación de 17906, y los mutantes resultantes pueden cribarse por la actividad biológica de 17906 para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis de SEC ID Nº 1, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante y puede determinarse la actividad de la proteína.

En una realización preferida, puede ensayarse en una proteína 17906 mutante la capacidad de (1) interaccionar con una molécula de proteína no 17906, por ejemplo, un ligando o sustrato de 17906; (2) activar una ruta de transducción de señal dependiente de 17906; o (3) modular los mecanismos de proliferación y/o migración celular, o modular la expresión de moléculas de adhesión a la superficie celular.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas 17906 descritas en la presente memoria, otro aspecto de la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido de las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia nucleotídica que es complementaria del ácido nucleico "con sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria de la cadena de codificación de una molécula de ADNc bicatenaria o complementaria de una secuencia de ARNm. En consecuencia, un ácido nucleico antisentido puede unirse por puentes de hidrógeno a un ácido nucleico con sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario de una cadena de codificación de 17906 completa, o sólo de una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido de una "región de codificación" de la cadena de codificación de una secuencia nucleotídica que codifica 17906. El término "región de codificación" designa la región de la secuencia nucleotídica que comprende codones que se traducen en restos aminoacídicos (por ejemplo, la región de codificación de 17906 humano corresponde a los nucleótidos 8-1273 de SEC ID Nº 1). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido de una "región de no codificación" de la cadena de codificación de una secuencia nucleotídica que codifica 17906. El término "región de no codificación" designa secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación que no se traducen en aminoácidos (concretamente, designadas también como regiones 5' y 3' no traducidas).

Dadas las secuencias de cadena codificante que codifican 17906 dadas a conocer en la presente memoria (por ejemplo, los nucleótidos 8-1273 de SEC ID Nº 1), los ácidos nucleicos antisentido de la divulgación pueden diseñarse según las normas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria de la región de codificación completa de ARNm de 17906, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido de sólo una porción de la región de codificación o de no codificación de ARNm de 17906. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario de la región que rodea al sitio de inicio de la traducción de ARNm de 17906. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Puede construirse un ácido nucleico antisentido de la divulgación usando reacciones de síntesis química y ligadura enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados diversamente diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y con sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en orientación antisentido (concretamente, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación antisentido respecto a un ácido nucleico diana de interés).

En otra realización adicional, las moléculas de ácido nucleico 17906 de la presente divulgación pueden modificarse en el resto básico, resto de azúcar o cadena principal fosfatada para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la cadena principal fosfatada de desoxirribosa de las moléculas de ácido nucleico puede modificarse para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup B. y col. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1): 5-23). Como se usan en la presente memoria, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" designan imitaciones de ácido nucleico, por ejemplo, imitaciones de ADN, en las que se reemplaza la cadena principal fosfatada de desoxirribosa por una cadena principal seudopeptídica, y se retienen sólo las cuatro bases nucleicas naturales. Se ha mostrado que la cadena principal neutra de los PNA permite la hibridación específica de ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. Puede realizarse la síntesis de oligómeros de PNA usando protocolos de síntesis peptídica en fase sólida estándar como se describen en Hyrup B. y col. (1996) supra; Perry-O'Keefe y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675.

Los PNA de moléculas de ácido nucleico 17906 pueden usarse en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, pueden usarse los PNA como agentes antisentido o antigénicos para la modulación específica de secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la detención de la transcripción o traducción o inhibiendo la replicación. Los PNA de moléculas de ácido nucleico de 17906 pueden usarse también en el análisis de mutaciones de par de bases único en un gen (por ejemplo, mediante pinzamiento de PCR dirigido por PNA); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se usan en combinación con otras enzimas (por ejemplo, nucleasas S1 (Hyrup B. (1996) supra)); o como sondas o cebadores para secuenciación o hibridación de ADN (Hyrup B. y col. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra).

En otra realización, pueden modificarse PNA de 17906 (por ejemplo, para potenciar su estabilidad o captación celular) uniendo grupos lipófilos u otros auxiliares a PNA, mediante la formación de quimeras de PNA-ADN o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de medicamento conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse quimeras de PNA-ADN de moléculas de ácido nucleico 17906 que pueden combinar las propiedades ventajosas de PNA y ADN. Dichas quimeras permiten que interaccionen enzimas de reconocimiento de ADN (por ejemplo, ARNasa H y ADN polimerasas) con la porción de ADN, mientras que la porción de PNA proporcionaría una alta afinidad de unión y especificidad. Las quimeras de PNA-ADN pueden ligarse usando ligaduras de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de bases, número de enlaces entre las bases nucleicas y orientación (Hyrup B. (1996) supra). La síntesis de quimeras de PNA-ADN puede realizarse como se describe en Hyrup B. (1996) supra y Finn P.J. y col. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63. Por ejemplo, puede sintetizarse una cadena de ADN sobre un soporte sólido usando química de acoplamiento de fosforamidita estándar y pueden usarse análogos nucleosídicos modificados, por ejemplo, 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxitimidinfosforamidita, como entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag, M. y col. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 5973-88). Se acoplan entonces los monómeros de PNA por etapas produciendo una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3' (Finn P.J. y col. (1996) supra). Como alternativa, pueden sintetizarse moléculas quiméricas con un segmento de ADN 5' y un segmento de PNA 3' (Peterser, K.H. y col. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).

En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (por ejemplo, para orientar a receptores de célula hospedadora in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (véanse, por ejemplo, Letsinger y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; publicación PCT Nº W088/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT nº W089/10134). Además, los oligonucleótidos pueden modificarse con agentes de escisión desencadenados por la hibridación (véase, por ejemplo, Krol y col. (1988) Bio-Techniques 6: 958-976) o agentes intercalantes (véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539-549). Con este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula (por ejemplo, un péptido, agente de reticulación desencadenado por la hibridación, agente de transporte o agente de escisión desencadenado por la hibridación).

Proteínas 17906 aisladas y anticuerpos anti-17906

Los procedimientos de la invención incluyen el uso de proteínas 17906 aisladas y porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos polipeptídicos, adecuados para uso como inmunógenos para crear anticuerpos anti-17906.

Las proteínas aisladas de la presente divulgación, preferiblemente proteínas 17906, tienen una secuencia aminoacídica suficientemente idéntica a la secuencia aminoacídica de SEC ID Nº 2, o están codificadas por una secuencia nucleotídica suficientemente idéntica a la SEC ID Nº 1. Como se usa en la presente memoria, el término "suficientemente idéntico" designa una primera secuencia aminoacídica o nucleotídica que contiene un número suficiente o mínimo de restos aminoacídicos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar) que una segunda secuencia aminoacídica o nucleotídica, de tal modo que las primera y segunda secuencias aminoacídicas o nucleotídicas comparten dominios estructurales o motivos comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos un 30%, 40% o 50% de homología, preferiblemente un 60% de homología, más preferiblemente un 70%-80%, y aún más preferiblemente un 90-95% de homología a lo largo de las secuencias aminoacídicas de los dominios, y contienen al menos uno, y preferiblemente dos dominios estructurales o motivos, se definen en la presente memoria como suficientemente idénticas. Además, las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas que comparten al menos un 30%, 40%, o 50%, preferiblemente un 60%, más preferiblemente un 70-80%, o un 90-95% de homología y que comparten una actividad funcional común, se definen en la presente memoria como suficientemente idénticas.

Como se usa intercambiablemente en la presente memoria, una "actividad de 17906", "actividad biológica de 17906" o "actividad funcional de 17906" designa una actividad ejercida por una molécula de proteína, polipéptido o ácido nucleico 17906 en una célula sensible a 17906 (por ejemplo, una célula de mama u ovario) o tejido, o sobre un sustrato de proteína 17906, como se determina in vivo, o in vitro, según técnicas estándar. En una realización, una actividad de 17906 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de 17906. Como se usa en la presente memoria, una "molécula diana" o "pareja de unión" es una molécula con la que una proteína 17906 se une o interacciona en la naturaleza, de tal modo que se consigue la función mediada por 17906. Una molécula diana de 17906 puede ser una molécula no 17906 o una proteína o polipéptido 17906 de la presente divulgación. En una realización ilustrativa, es una molécula diana de 17906 un ligando de 17906. Como alternativa, la actividad de 17906 es una actividad indirecta, tal como una actividad señalizadora celular mediada por la interacción de la proteína 17906 con un ligando de 17906. Preferiblemente, es una actividad de 17906 la capacidad de actuar como molécula de transducción de señal y de modular la proliferación, diferenciación y/o migración celular en mama u ovario. En consecuencia, otra realización de la divulgación presenta proteínas y polipéptidos 17906 aislados que tienen actividad de 17906.

En una realización, pueden aislarse proteínas 17906 nativas de fuentes celulares o de tejido mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteína estándar. En otra realización, se producen proteínas 17906 mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, puede sintetizarse químicamente una proteína o polipéptido 17906 usando técnicas de síntesis peptídica estándar.

Una proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente exenta de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o de tejido de la que deriva la proteína 17906, o sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La frase "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de proteína 17906 en las que la proteína está separada de los componentes celulares de las células a partir de las que se aísla o produce de forma recombinante. En una realización, la frase "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de proteína 17906 que tienen menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de proteína no 17906 (también designada en la presente memoria como "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente un 20% de proteína no 17906, aún más preferiblemente menos de aproximadamente un 10% de proteína no 17906, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% de proteína no 17906. Cuando la proteína 17906 o porción biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, también está preferiblemente sustancialmente exenta de medio de cultivo, concretamente, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente un 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente un 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% del volumen de preparación de proteína.

La frase "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de la proteína 17906 en las que la proteína está separada de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la frase "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de proteína 17906 que tienen menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no 17906, más preferiblemente menos de aproximadamente un 20% de precursores químicos o productos químicos no 17906, aún más preferiblemente menos de aproximadamente un 10% de precursores químicos o productos químicos no 17906, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente un 5% de precursores químicos o productos químicos no 17906.

Como se usa en la presente memoria, una "porción biológicamente activa" de una proteína 17906 incluye un fragmento de una proteína 17906 que participa en una interacción entre una molécula 17906 y una molécula no 17906. Las porciones biológicamente activas de una proteína 17906 incluyen péptidos que comprenden secuencias aminoacídicas suficientemente idénticas o derivadas de la secuencia aminoacídica de la proteína 17906, por ejemplo, la secuencia aminoacídica mostrada en la SEC ID Nº 2, que incluyen menos aminoácidos que la proteína 17906 entera, y exhiben al menos una actividad de una proteína 17906. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de proteína 17906, por ejemplo, modular los mecanismos de proliferación celular. Una porción biológicamente activa de una proteína 17906 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, 200 o más aminoácidos de longitud. Pueden usarse las porciones biológicamente activas de una proteína 17906 como dianas para desarrollar agentes que modulen una actividad mediada por 17906, por ejemplo, un mecanismo de proliferación celular. Puede prepararse mediante técnicas recombinantes una porción biológicamente activa de una proteína 17906 que comprende una proteína en la que se han eliminado regiones de la proteína, y evaluarse una o más de las actividades funcionales de una proteína 17906 nativa.

En una realización preferida, la proteína 17906 tiene una secuencia aminoacídica mostrada en la SEC ID Nº 2. En otras realizaciones, la proteína 17906 es sustancialmente idéntica a la SEC ID Nº 2, y retiene la actividad funcional de la proteína de SEC ID Nº 2, aunque difiere en la secuencia aminoacídica debido a la variación alélica natural o mutagénesis, como se describe con detalle en la subsección I anterior. En consecuencia, en otra realización, la proteína 17906 es una proteína que comprende una secuencia aminoacídica al menos aproximadamente un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más idéntica a la SEC ID Nº 2.

Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias aminoacídicas o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de la primera y segunda secuencia aminoacídica o de ácido nucleico para alineamiento óptimo y pueden desecharse las secuencias no idénticas con fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de la secuencia de referencia alineada con fines de comparación es de aproximadamente un 30%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 50%, aún más preferiblemente al menos un 60%, y aún más preferiblemente al menos un 70%, 80% o 90% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia aminoacídica 17906 de SEC ID Nº 2 que tiene 516 restos aminoacídicos, están alineados al menos 136, preferiblemente al menos 181, más preferiblemente al menos 227, aún más preferiblemente al menos 272, y aún más preferiblemente al menos 317, 362 ó 408 restos aminoacídicos). Se comparan entonces los restos aminoacídicos o nucleótidos en las correspondientes posiciones aminoacídicas. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada con el mismo residuo aminoacídico o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente memoria, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que tiene que introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, se determina la identidad porcentual entre las dos secuencias aminoacídicas usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y una puntuación de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y una puntuación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización preferida adicional, se determina la identidad porcentual entre dos secuencias nucleotídicas usando el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y una puntuación de hueco de 40, 50, 60, 70 ó 80 y una puntuación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización, se determina la identidad porcentual entre dos secuencias aminoacídicas o nucleotídicas usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Myers y Miller, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17 (1988)), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de puntuación de restos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteína de la presente divulgación pueden usarse adicionalmente como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación= 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias nucleotídicas homólogas de las moléculas de ácido nucleico 17906 de la divulgación. Las búsquedas de proteína BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación= 100, longitud de palabra= 3 para obtener secuencias aminoacídicas homólogas de las moléculas de proteína 17906 de la divulgación. Para obtener alineamientos con hueco con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Los procedimientos de la invención pueden usar también proteínas quiméricas o de fusión de 17906. Como se usa en la presente memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de 17906 comprende un polipéptido 17906 ligado operativamente a un polipéptido no 17906. Un "polipéptido 17906" designa un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica correspondiente a 17906, mientras que un "polipéptido no 17906" designa un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína 17906, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína 17906 y que deriva del mismo o un organismo diferente. En una proteína de fusión de 17906, el polipéptido 17906 puede corresponder a toda o una porción de una proteína 17906. En una realización preferida, una proteína de fusión de 17906 comprende al menos una porción biológicamente activa de una proteína 17906. En otra realización preferida, una proteína de fusión de 17906 comprende al menos dos porciones biológicamente activas de una proteína 17906. En la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" se pretende que indique que el polipéptido 17906 y el polipéptido no 17906 están fusionados en fase entre sí. El polipéptido no 17906 puede estar fusionado con el extremo N o el extremo C del polipéptido 17906.

Además, las proteínas de fusión de 17906 de la divulgación pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos anti-17906 en un sujeto, para purificar ligandos de 17906 y en ensayos de cribado para identificar moléculas que inhiben la interacción de 17906 con un sustrato de 17906.

Puede usarse una proteína 17906 aislada, o una porción o fragmento de la misma, como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a 17906 usando técnicas estándar para la preparación de anticuerpo policlonal y monoclonal. Puede usarse una proteína 17906 completa o, como alternativa, la divulgación proporciona fragmentos peptídicos antigénicos de 17906 para uso como inmunógenos. El péptido antigénico de 17906 comprende al menos 8 restos aminoacídicos de la secuencia aminoacídica mostrada en la SEC ID Nº 2 y comprende un epítopo de 17906, de tal modo que un anticuerpo creado contra el péptido forma un complejo inmune específico con 17906. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 15 restos aminoacídicos, aún más preferiblemente al menos 20 restos aminoacídicos, y lo más preferiblemente al menos 30 restos aminoacídicos. Los epítopos preferidos comprendidos por el péptido antigénico son regiones de 17906 que están localizadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas, así como regiones con alta antigenicidad (véase la Figura 2).

Se usa típicamente un inmunógeno de 17906 para preparar anticuerpos mediante inmunización de un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína 17906 expresada de forma recombinante o un polipéptido 17906 sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un coadyuvante, tal como coadyuvante completo o incompleto de Freund, o agente inmunoestimulante similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de 17906 inmunogénica induce una respuesta de anticuerpo anti-17906 policlonal.

En consecuencia, otro aspecto de la divulgación se refiere a anticuerpos anti-17906. El término "anticuerpo" como se usa en la presente memoria designa moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, concretamente, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno tal como 17906. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La divulgación proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a 17906. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente memoria designa una población de moléculas de anticuerpo que contiene sólo una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreacionar con un epítopo particular de 17906. Por tanto, una composición de anticuerpo monoclonal exhibe típicamente una afinidad de unión única por una proteína 17906 particular con la que inmunorreacciona.

Los anticuerpos anti-17906 policlonales pueden prepararse como se describe anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un inmunógeno de 17906. El título de anticuerpo anti-17906 puede controlarse con el tiempo mediante técnicas estándar tales como con ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) usando 17906 inmovilizado. Si se desea, pueden aislarse las moléculas de anticuerpo dirigido contra 17906 procedentes del mamífero (por ejemplo, procedentes de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas tales como cromatografía en proteína A, obteniendo la fracción de IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo anti-17906 son máximos, pueden obtenerse del sujeto células productoras de anticuerpos y usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándar tales como la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497) (véanse también Brown y col. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown y col. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh y col. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2927-31; y Yeh y col. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75), la técnica de hibridoma de células B humanas más reciente (Kozbor y col. (1983) Immunol. Today 4: 72), la técnica de hibridoma de EBV (Cole y col. (1985), "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpo monoclonal es bien conocida (véanse, en general, R. H. Kenneth, en "Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses", Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402; M. L. Gefter y col. (1977) Somatic Cell Genet. 3: 231-36). Brevemente, se fusiona una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de 17906 como se describe anteriormente, y se criban los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultante para identificar un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal que se una a 17906.

Puede aplicarse cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas con el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-17906 (véanse, por ejemplo, G. Galfre y col. (1977) Nature 266: 55052; Gefter y col. Somatic Cell Genet., citado supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado supra). Además, el experto apreciará que hay muchas variaciones de dichos procedimientos que serían también útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas de murino fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente divulgación con una línea celular de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Puede usarse cualquiera de una serie de líneas celulares de mieloma como pareja de fusión según técnicas estándar, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en la ATCC. Típicamente, se fusionan células de mieloma de ratón sensibles a HAT con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan entonces usando medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas improductivamente (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma productoras de un anticuerpo monoclonal de la divulgación se detectan mediante cribado en los sobrenadantes de cultivo de hibridoma de anticuerpos que se unen a 17906, por ejemplo, usando un ensayo ELISA estándar.

Como alternativa para preparar hibridomas secretores de anticuerpo monoclonal, puede identificarse un anticuerpo anti-17906 monoclonal y aislarse por cribado de una colección combinatoria de inmunoglobulinas (por ejemplo, una colección de exposición en fago de anticuerpo) de 17906, para aislar así los miembros de la colección de inmunoglobulina que se unen a 17906. Están comercialmente disponibles kits para generar y seleccionar colecciones de exhibición en fago (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nº de catálogo 27-9400-01; y el kit Stratagene SurfZ4P^{TM} Phage Display, nº de catálogo 240612). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de procedimientos y reactivos particularmente susceptibles para uso en la generación y cribado de colección de exhibición en fago, por ejemplo, en Ladner y col. patente de EE.UU nº 5.223.409; Kang y col., publicación internacional PCT nº WO 92/18619; Dower y col. publicación internacional PCT nº WO 91/17271; Winter y col. publicación internacional PCT WO 92/20791; Markland y col. publicación internacional PCT nº WO 92/15679; Breitling y col. publicación internacional PCT WO 93/01288; McCafferty y col. publicación internacional PCT nº WO 92/01047; Garrard y col. publicación internacional PCT nº WO 92/09690; Ladner y col. publicación internacional PCT nº WO 90/02809; Fuchs y col. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay y col. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse y col. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths y col. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins y col. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson y col. (1991) Nature 352: 624-628; Gram y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad y col. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom y col. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; y McCafferty y col. Nature (1990) 348: 552-554.

Adicionalmente, pueden usarse también en los procedimientos de la presente invención anticuerpos anti-17906 recombinantes tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, usando procedimientos descritos en Robinson y col. solicitud internacional PCT nº PCT/US86/02269; Akira, y col. solicitud de patente europea 184,187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171.496; Morrison y col. solicitud de patente europea 173.494; Neuberger y col. solicitud de patente PCT nº WO 86/01533; Cabilly y col. patente de EE.UU. nº 4.816.567; Cabilly y col. solicitud de patente europea 125.023; Better y col. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu y col. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura y col. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood y col. (1985) Nature 314: 446-449 y Shaw y col. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi y col. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter patente de EE.UU. nº 5.225.539; Jones y col. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col. (1988) Science 239: 1534 y Beidler y col. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.

Puede usarse un anticuerpo anti-17906 (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar 17906 mediante técnicas estándar tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-17906 puede facilitar la purificación de 17906 natural a partir de células y de 17906 producido de forma recombinante expresado en células hospedadoras. Además, puede usarse un anticuerpo anti-17906 para detectar proteína 17906 (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína 17906. Los anticuerpos anti-17906 pueden usarse en diagnóstico para controlar los niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse mediante el acoplamiento (concretamente, ligadura física) del anticuerpo con una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina, y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Esta invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos, que no deben considerarse como limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y caracterización de ADNc de 17906 humanos

La secuencia de 17906 humano (Figura 1A, SEC ID Nº 1), que tiene aproximadamente 2795 nucleótidos de longitud, incluyendo regiones no traducidas, contiene una secuencia de codificación iniciada por metionina predicha (SEC ID Nº 3; Figura 1B) de aproximadamente 1266 nucleótidos (nucleótidos 8 a 1273 de la SEC ID Nº 1). La secuencia de codificación codifica una proteína de 422 aminoácidos (SEC ID Nº 2; figura 1B).

Ejemplo 2 Expresión y distribución en tejido de ARNm de 17906

Pueden realizarse hibridaciones Northern con diversas muestras de ARN en condiciones estándar y lavarse en condiciones rigurosas, concretamente, 0,2xSSC a 65ºC. Puede usarse una sonda de ADN correspondiente a todo o una porción del ADNc de 17906 (SEC ID N^{os} 1 ó 3). El ADN está marcado radiactivamente con ^{32}P-dCTP usando el kit Prime-It (Stratagene, La Jolla, CA) según las instrucciones del suministrador. Pueden sondearse filtros que contienen ARNm de tejidos hematopoyéticos y endocrinos de ratón y líneas celulares cancerosas (Clontech, Palo Alto, CA) en disolución de hibridación (Clontech) y lavarse a alto rigor según las recomendaciones del fabricante.

Se usó PCR-TI TaqMan cuantitativa en tiempo real para detectar la presencia del transcrito de ARN correspondiente a 17906 humano en varios tejidos. Se encontró que los correspondientes ortólogos de 17906 se expresan en una variedad de tejidos. Se muestran en las Figuras 2-9 los resultados de este cribado.

Se usó PCR por transcriptasa inversa (PCR-TI) para detectar la presencia de transcrito de ARN correspondiente a 17906 humano en ARN preparado a partir de células y tejidos relacionados con osteoblastos. Se valoró la expresión de 17906 en varios tejidos. Se encontró una expresión relativamente baja del transcrito en osteoblastos diferenciados, y se encontró una expresión relativamente alta del transcrito en osteoblastos cultivados primarios.

Se evaluaron los niveles de expresión relativa de 17906 en células osteogénicas y células adipogénicas usando PCR TaqMan. Se muestran los resultados de esta comparación en la Figura 3.

Las Figuras 2 y 3 representan también los resultados de PCR TaqMan usados para valorar la expresión de 17906 en varios modelos celulares de osteoporosis.

Se valoraron también los niveles de expresión relativa de ARNm del gen 17906 en osteoblastos estimulados con hormona paratiroide (PTH), interleucina-1\alpha (IL-1\alpha) y dexametasona (DEX) como se muestra en la Figura 4.

Se usó PCR por transcriptasa inversa (PCR-TI) para detectar la presencia de transcrito de ARN correspondiente a 17906 humano en ARN preparado a partir de tejidos tumorales y normales. Las Figuras 6-9 ilustran los niveles de expresión relativos y la distribución en tejido de los genes 17906 usando PCR Taq Man. Si un sujeto tiene una enfermedad caracterizada por la subexpresión o sobreexpresión de un gen 17906, pueden administrarse moduladores que tengan un efecto estimulante o inhibidor sobre la actividad carboxipeptidasa (por ejemplo, la expresión génica de carboxipeptidasa) a individuos para tratar (profiláctica o terapéuticamente) trastornos asociados a carboxipeptidasa.

La Figura 8 ilustra los niveles de expresión relativa de 17906 en diversos tejidos usando PCR TaqMan, y una expresión significativa en células epiteliales de próstata. Se encontró una expresión variable en xenógrafos de líneas celulares ensayados como se muestra en la Figura 9 para 17906; se encontró la máxima expresión para 17906 en la línea celular de tumor de mama MDA-435.

La Figura 6 muestra una expresión significativa del modelo de mama MCF10A (m25 Plastic). La Figura 7 muestra cierta expresión de 17906 en ARNm de 17906 respecto a un control sin molde, que muestra una expresión aumentada en 4/6 tumores de mama en comparación con tejidos de mama normales, 5/5 tumores de ovario en comparación con tejidos de ovario normales, 3/7 tumores de pulmón en comparación con tejidos de pulmón normales y 3/4 tumores de colon y 2/2 metástasis de colon en comparación con tejidos de colon normales. De nuevo, se detectó la expresión usando análisis Taq Man.

Como se observa por estos resultados, se ha encontrado que las moléculas 17906 se sobreexpresan en algunos tumores o células, en los que las moléculas pueden estar propagando inapropiadamente señales de proliferación celular o supervivencia celular o tener actividad proteína quinasa aberrante. Como tales, las moléculas 17906 pueden servir como identificadores específicos y novedosos de dichas células tumorales o trastornos.

Adicionalmente, los moduladores de moléculas 17906 son útiles para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, las moléculas 17906 son útiles para el tratamiento del cáncer cuando 17906 está regulado positivamente en células tumorales tales como de cáncer de ovario, colon, mana y pulmón y metástasis de colon, y son útiles como diagnóstico.

Ejemplo 3 Expresión de proteína 17906 recombinante en células bacterianas

En este ejemplo, se expresa 17906 como un polipéptido de fusión con glutatión-S-transferasa (GST) recombinante en E. coli y se aísla y caracteriza el polipéptido de fusión. Específicamente, se fusiona 17906 con GST y se expresa este polipéptido de fusión en E. coli, por ejemplo, la cepa PEB199. Se induce la expresión de la proteína de fusión GST-17906 en PEB199 con IPTG. Se purifica el polipéptido de fusión recombinante procedente de lisados bacterianos brutos de la cepa PEB199 inducida mediante cromatografía de afinidad sobre perlas de glutatión. Usando análisis electroforético en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado a partir de lisados celulares, se determina el peso molecular del polipéptido de fusión resultante.

Ejemplos 4

Expresión de proteína 17906 recombinante en células COS

Se usa el vector pcDNA/Amp deInvitrogen Corporation (San Diego, CA) para expresar el gen 17906 en células COS. Este vector contiene un origen de replicación SV40, un gen de resistencia a ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor CMV seguido de una región de polienlazante, y un intrón y sitio de poliadenilación de SV40. Se clona un fragmento de ADN que codifica la proteína 17906 entera y un marcador HA (Wilson y col. (1984) Cell 37: 767) o un marcador FLAG fusionado en fase con el extremo 3' del fragmento en la región de polienlazante del vector, disponiendo así la expresión de la proteína recombinante bajo el control del promotor CMV.

Para construir el plásmido, se amplifica la secuencia de ADN de 17906 mediante PCR usando dos cebadores. El cebador 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido de aproximadamente 20 nucleótidos de la secuencia de codificación de 17906 partiendo del codón de iniciación; la secuencia del extremo 3' contiene secuencias complementarias del otro sitio de restricción de interés, un codón de terminación de la traducción, el marcador HA o un marcador FLAG y los 20 últimos nucleótidos de la secuencia de codificación de 17906. Se digieren el fragmento amplificado de PCR y el vector pCDNA/Amp con las enzimas de restricción apropiadas y se desfosforila el vector usando la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente, los dos sitios de restricción elegidos son diferentes, de modo que el gen 17906 se inserte en la orientación correcta. Se transforma la mezcla de ligadura en células E. coli (pueden usarse cepas HB101, DH5a, SURE, disponibles en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), se siembra el cultivo transformado en placas de medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. Se aísla el ADN plasmídico de transformantes y se examina mediante análisis de restricción la presencia del fragmento correcto.

Se transfectan posteriormente células COS con ADN del plásmido 17906-pcDNA/Amp usando los procedimientos de coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden encontrarse otros procedimientos adecuados para transfectar células hospedadoras en Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se detecta la expresión del polipéptido 17906 mediante radiomarcaje (puede usarse ^{35}S-metionina o ^{35}S-cisteína disponibles en NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D. "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) usando un anticuerpo monoclonal específico de HA. Brevemente, se marcan las células durante 8 horas con ^{35}S-metionina (o ^{35}S-cisteína). Se recogen entonces los medios de cultivo y se lisan las células usando detergentes (tampón RIPA, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 0,5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7,5). Se precipitan tanto el lisado celular como los medios de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Se analizan entonces los polipéptidos precipitados por PAGE-SDS.

Como alternativa, se clona directamente el ADN que contiene la secuencia de codificación de 17906 en el polienlazante del vector pCDNA/Amp usando los sitios de restricción apropiados. Se transfecta el plásmido resultante en células COS de la manera descrita anteriormente, y se detecta la expresión de polipéptido 17906 mediante radiomarcaje e inmunoprecipitación usando un anticuerpo monoclonal específico de 17906.

<110> Millennium Pharmaceuticals, Inc.

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<120> PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO QUE USAN 17906 Y USOS PARA EL MISMO

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<130> 38155-20012.40

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<140> PCT/US 01/15835

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<141> 16-05-2001

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<150> US 09/571.689

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<151> 16-05-2000

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<160> 3

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 2795

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (8)...(1273)

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 421

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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4

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<210> 3

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<211> 1266

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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6

Claims (13)

1. Un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario, que comprende:

a)

poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 1;

b)

detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la primera muestra que se hibride con la sonda,

c)

poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 1;

d)

detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la segunda muestra que se hibride con la sonda; y

e)

comparar el nivel de moléculas de ácido nucleico en la primera muestra que se hibridan con la sonda con el nivel de ácidos nucleicos que se hibridan con la sonda en la segunda muestra,

en el que un nivel aumentado de ácidos nucleicos que se hibridan en la primera muestra respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha sonda de hibridación está marcada detectablemente.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha muestra que comprende moléculas de ácido nucleico se somete a electroforesis en gel de agarosa y transferencia Southern antes de poner en contacto con dicha sonda de hibridación.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha muestra que comprende moléculas de ácido nucleico se somete a electroforesis en gel de agarosa y transferencia Northern antes de ponerse en contacto con dicha sonda de hibridación.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha detección es mediante hibridación in situ.

6. Un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario, o en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario, que comprende:

a)

poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y segundo cebadores de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 1 y comprendiendo el segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos del complemento de la SEC ID Nº 1;

b)

incubar la primera muestra en condiciones que permitan la amplificación de ácido nucleico;

c)

poner en contacto una segunda muestra obtenida de un sujeto de control que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y un segundo cebadores de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 1 y comprendiendo el segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos del complemento de la SEC ID Nº 1; e

d)

incubar la segunda muestra en condiciones que permitan la amplificación de ácido nucleico; y

e)

comparar el nivel de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra con respecto al nivel de amplificación de ácido nucleico en la segunda muestra,

en el que un nivel aumentado de amplificación de ácido nucleico en la primera muestra con respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha muestra que comprende moléculas de ácido nucleico se somete a electroforesis en gel de agarosa después de dicha etapa de incubación.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 6, en el que dicho procedimiento se usa para detectar ARNm en dicha muestra.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 6, en el que dicho procedimiento se usa para detectar ADN genómico en dicha muestra.

10. Un procedimiento de identificación de un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario, que comprende:

a)

poner en contacto una primera muestra obtenida del sujeto que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido de la SEC ID Nº 2;

b)

detectar la presencia de un polipéptido en la primera muestra que se una al anticuerpo;

c)

poner en contacto una segunda muestra de un sujeto de control que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se una específicamente a un polipéptido de la SEC ID Nº 2;

d)

detectar la presencia de un polipéptido en la segunda muestra que se una al anticuerpo; y

e)

comparar el nivel de unión de anticuerpo en la primera muestra respecto al nivel de unión de anticuerpo en la segunda muestra,

en el que un nivel aumentado de unión de anticuerpo en la primera muestra con respecto a la segunda muestra identifica un sujeto que tiene cáncer de mama u ovario o con riesgo de desarrollar cáncer de mama u ovario.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo está marcado detectablemente.

12. Un procedimiento para identificar un compuesto capaz de tratar cáncer de mama u ovario, que comprende ensayar la capacidad del compuesto para reducir la expresión de una molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº 1, o de regular negativamente la expresión de una molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº 2, identificando así un compuesto capaz de tratar cáncer de mama u ovario.

13. Un procedimiento para evaluar la eficacia de un tratamiento de cáncer de mama u ovario en una muestra aislada de un sujeto que se está tratando con un protocolo bajo evaluación, que comprende:

valorar el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

a)

una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que es al menos un 80% idéntica a la secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº 1;

b)

una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEC ID Nº 2; y

c)

una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica de la SEC ID Nº 1;

o valorar la actividad de un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico,

en el que una reducción del nivel de expresión del ácido nucleico o del polipéptido después del tratamiento, con respecto al nivel antes del tratamiento, es indicativa de la eficacia del tratamiento de cáncer de mama u ovario.