ES2310240T3 - Uso de un enzima de restriccion de tipo iii para aislar etiquetas de secuencia que comprenden mas de 25 nucleotidos. - Google Patents
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Abstract
Uso de un enzima de restricción de tipo III para aislar, con respecto a ADNc de un gen expresado, una etiqueta que comprende más de 25 nucleótidos y capaz de identificar el gen expresado, en la que el extremo 3'''' de la etiqueta queda definido por un sitio de escisión del enzima de restricción de tipo III, y el extremo 5'''' de la etiqueta queda definido por el sitio de escisión de otro enzima de restricción que está más próximo al extremo 3'''' del ADNc del gen expresado.
Description
Uso de un enzima de restricción de tipo III para
aislar etiquetas de secuencia que comprenden más de 25
nucleótidos.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y el análisis de la expresión génica. En este
contexto, trata sobre el uso de un enzima de restricción de tipo III
para aislar una región definida de un transcrito.
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La modificación de la estructura y la expresión
de genes mediante ingeniería genética proporciona un potencial
enorme para varias aplicaciones médicas, farmacéuticas y agrícolas.
Con el fin de detectar y seleccionar genes diana para ingeniería,
se aplica extensamente el cribado de células, tejidos, órganos u
organismos en diferentes fases de desarrollo y bajo una variedad de
condiciones de entorno (tales como estrés) mediante perfiles de
expresión. Una de las técnicas más poderosas para el análisis de la
expresión génica es el SAGE^{TM} (Análisis en Serie de la
Expresión Génica) según lo ha desarrollado Velculescu et al.,
Science 270: 484-487, 1995.
En el protocolo SAGE^{TM} original (Fig. 1),
una reserva (pool) de ARN mensajero (ARNm) de células,
tejidos u órganos definidos se usa como material de partida, a
partir del cual se transcribe inversamente ADN complementario
(ADNc) por transcriptasa inversa usando un cebador
oligo-dT biotinilado. El ADNc monocatenario
generado se convierte en ADN bicatenario, y es digerido con un
enzima de restricción NIaIII, que reconoce el motivo de
secuencia 5'-CATG-3'. Para recuperar
los fragmentos de los extremos 3' del ADNc bicatenario se usan
perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. El ADNc se divide
en dos partes. A continuación, se ligan dos enlazadores (Enlazador
1 y Enlazador 2) a cada una de las partes del ADNc. Los enlazadores
contienen el motivo de secuencia
5'-GGGAC-3'. Este es el sitio de
reconocimiento del enzima de restricción de tipo II BsmFI,
que escinde a 13 bp con respecto al sitio de reconocimiento en la
dirección 3'. De este modo, el tratamiento de los ADNc enlazados
con BsmF1 libera un fragmento de 13 bp del ADNc, denominado
secuencia de "etiqueta", junto con el fragmento del enlazador
(fragmento "enlazador-etiqueta"). A
continuación, dos de los fragmentos
enlazador-etiqueta generados a partir de dos partes
de ADNc se ligan entre sí de tal manera que las dos etiquetas se
encuentran en posición adyacente para formar una etiqueta doble
(ditag), seguido por una PCR con cebadores específicos de la
secuencia de los enlazadores. Después de eliminar el fragmento de
enlazador mediante digestión con NIaIII, las etiquetas dobles
se concatenan, y se clonan en un plásmido apropiado. La
secuenciación del inserto del plásmido muestra una serie de
etiquetas de 9 bp flanqueadas por la secuencia
5'-CATG-3' de 4 bp. Con el uso de la
secuencia de etiqueta de 13 bp, es posible en muchos casos
identificar el gen a partir del cual se originó una secuencia de
etiqueta, consultando bases de datos disponibles de etiquetas de
secuencias expresadas (EST). De este modo, después de la
secuenciación de miles de etiquetas, es posible contar el número de
cada etiqueta en la muestra, y adicionalmente identificar los genes
correspondientes a la
misma.
misma.
Por lo tanto, el protocolo SAGE^{TM} antes
descrito es un método eficaz para estudiar la expresión génica
global. No obstante, el tamaño limitado de la secuencia de etiqueta
(únicamente 13 bp) no es suficiente para identificar de forma
inequívoca el gen a partir del cual se obtuvo la etiqueta. Una única
secuencia de etiqueta se puede corresponder con varias secuencias
EST diferentes, y puede tergiversar análisis adicionales.
Para mejorar la situación, recientemente se
desarrolló un protocolo denominado "LongSAGE^{TM}", que
involucra a la endonucleasa de restricción de tipo II Mmel.
Con el uso del Mmel (en lugar del BsmFl como en el
protocolo SAGE^{TM} original), es posible recuperar etiquetas de
una longitud de entre 19 y 21 bp (Saha et al. Nature
Biotechnology 20: 508-512, 2002).
La digestión con Mmel produce extremos 3'
protuberantes (protuberancias de 2 bases). Para elaborar extremos
romos después de la digestión con Mmel antes de la ligación
de la etiqueta doble, se debe eliminar la protuberancia 3'. En la
actualidad, no hay un solo enzima disponible para el relleno en la
protuberancia 3'. La eliminación de la protuberancia 3' necesaria
para el enromado da como resultado la reducción de la longitud de
la secuencia de etiqueta a entre 17 y 19 bp, provocando una
reducción en la información contenida en la secuencia de
etiqueta.
Por lo tanto, en el protocolo LongSAGE^{TM}
publicado (Saha et al., Nature Biotechnology 20:
508-512, 2002), los extremos después de la digestión
con Mmel no están pulidos, y la ligación se realiza entre
los fragmentos con protuberancias 3'. Esto significa que un
fragmento enlazador-etiqueta se liga únicamente con
otro fragmento enlazador-etiqueta que albergue el
extremo 3' compatible. Esto conlleva que las etiquetas dobles
formadas después de la ligación no sean los resultados de una
asociación aleatoria de etiquetas. Este procedimiento sesga
teóricamente la representación de cada etiqueta en las etiquetas
dobles resultantes, y el resultado final del LongSAGE^{TM} no
puede reflejar fielmente la abundancia de expresión de cada gen.
Por lo tanto, el LongSAGE^{TM} no es aplicable para un análisis
cuantitativo preciso de la expresión génica. Esto representa un
serio inconveniente del LongSAGE^{TM}. Por esta razón, el
LongSAGE^{TM} actual se usa únicamente para ayudar a anotar las
secuencias de etiqueta de 13 bp obtenidas por el protocolo
SAGE^{TM} convencional.
El protocolo LongSAGE^{TM} es un paso
adelante, ya que aumenta la posibilidad de identificación
satisfactoria de los genes correspondientes a las etiquetas,
siempre que haya disponible información de secuencias EST y/o de
ADN genómico. No obstante, para una aplicación del protocolo
SAGE^{TM} a organismos, para los que no haya disponible ninguna
base de datos de EST ó ADN genómico, es imprescindible usar la
secuencia de etiqueta como cebador para recuperar el ADNc más largo
mediante PCR, o como sonda de oligonucleótidos para cribar una
genoteca de ADNc pertinente mediante técnicas basadas en la
hibridación. Para estas finalidades, las longitudes de etiqueta de
entre 19 y 21 bp siguen siendo demasiado cortas para identificar de
forma inequívoca el gen a partir del cual se originó una secuencia
de etiqueta.
Por esta razón, existe una necesidad acuciante
de un método para aislar etiquetas perceptiblemente más largas de
una longitud de por lo menos 25 bp, con las que se pueda realizar un
análisis cuantitativo preciso de la expresión. No obstante, hasta
la fecha no ha habido disponible ningún método de este tipo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un método para
aislar secuencias de "etiqueta" de una longitud mayor que 25
bp, preferentemente de una longitud de entre 26 y 50 bp, y de la
forma más preferente una longitud de entre 26 y 28 bp, de
posiciones definidas de ADN, aumentando de este modo la eficacia
para identificar de forma fiable los genes correspondientes
mediante análisis SAGE^{TM} convencional. Por otra parte, los
perfiles de expresión génica obtenidos por este método son
teóricamente más precisos que los obtenidos a partir del análisis
LongSAGE, ya que las etiquetas dobles se realizan por la asociación
aleatoria de etiquetas. En lo sucesivo se denomina como
"SuperSAGE" a este procedimiento SAGE^{TM} mejorado con
fragmentos de etiqueta nuevos de más de 25 bp.
El método descrito en el presente documento se
basa en el uso de un enzima de restricción de tipo III, para el
aislamiento de secuencias de etiqueta de una longitud mayor que 25
bp de una posición definida de un ADNc. En la presente invención,
el término etiqueta hace referencia a una secuencia de nucleótidos
específica capaz de identificar un gen expresado. El extremo 3' de
la etiqueta queda definido por el sitio de escisión del enzima de
restricción de tipo III, y el extremo 5' de la etiqueta queda
definido por el sitio de escisión de otro enzima de restricción que
está más próximo al extremo 3' del ADNc.
"Enzima de restricción" es una expresión
general para endonucleasa capaz de reconocer una secuencia
específica de 4 a 8 nucleótidos en ADN bicatenario y escindirla. Los
enzimas de restricción se clasifican actualmente en cuatro grupos
diferentes, denominados tipo I, II, III, y IV (Roberts et al.
2003, Nucleic Acids Res. 31: 1805-1812). Los
enzimas de restricción de tipo III son proteínas complejas que
constan de subunidades de metilasa y endonucleasa y que reconocen
secuencias de nucleótidos no palindrómicas en el ADN diana. Para
que se produzca una actividad endonucleolítica, requieren la
cooperación funcional con dos copias de la secuencia de
reconocimiento y, además, es necesario que estas dos copias estén
orientadas inversamente dentro de la cadena doble de ADN (Muecke
et al. 2001, J. Molec. Biol. 312:
687-689).
En la presente invención, los anteriores enzimas
de restricción de tipo III se usan para el aislamiento de
secuencias de etiqueta de una longitud mayor que 25 bp. Se dan a
conocer ejemplos de dichos enzimas de tipo III en
http://rebase.neb.com/cgi-bin/azlist?re3. Los
enzimas de tipo III preferidos usados en la invención incluyen
EcoPI, EcoP15I, y similares.
En la realización más preferida de la invención,
el enzima de restricción de tipo III es EcoP15I. El enzima
de restricción de tipo III EcoP15I reconoce dos sitios
5'-CAGCAG-3' orientados
inversamente, no metilados, en la molécula de ADN diana, y digiere
desde 25 a 28 bp con respecto al extremo 3' de uno de los sitios de
reconocimiento. De este modo, el EcoP15I proporciona
fragmentos que tienen un extremo 5' sobresaliente que se transforma
fácilmente en extremo romo usando una reacción de relleno de
extremos 3' convencional.
El ejemplo preferido del otro enzima es un
enzima capaz de escindir ADNc en fragmentos con una longitud media
de entre 200 bp y 300 bp cada uno de ellos, tal como:
El enzima más preferido es el NIaIII.
Se da a conocer también una etiqueta que
comprende más de 25 nucleótidos y capaz de identificar un gen
expresado, en donde el extremo 3' de la etiqueta queda definido por
un sitio de escisión del enzima de restricción de tipo III y el
extremo 5' de la etiqueta queda definido por el sitio de escisión de
otro enzima de restricción que está más próximo al extremo 3' del
ADNc del gen expresado.
Preferentemente, el enzima de tipo III es
EcoP15I y el otro enzima de restricción es un enzima capaz
de escindir ADNc en fragmentos con una longitud media de entre 200
bp y 300 bp cada uno de ellos, tal como se ha descrito
anteriormente. El enzima más preferido es el NIaIII.
Los ejemplos de la etiqueta de la invención se
muestran en la Tabla 1 a continuación. Estas etiquetas son más
largas que las etiquetas SAGE ó las etiquetas LongSAGE
convencionales, y permiten una identificación más precisa de los
genes correspondientes.
La presente invención proporciona además un
oligonucleótido de etiqueta doble que comprende dos etiquetas,
obteniéndose cada una de ellas a partir de un gen expresado
diferente. El oligonucleótido de etiqueta doble se produce con el
método que comprende las siguientes etapas:
- 1)
- se sintetiza una reserva de ADNc a partir de ARNm de genes expresados usando un cebador que comprende oligo-dT y una secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III, seguido por la digestión de la reserva de ADNc con otro enzima de restricción;
- 2)
- se purifican fragmentos que comprenden secuencia poli A de la reserva de ADNc anterior, y se ligan los fragmentos bien con el Enlazador A ó bien con el Enlazador B, comprendiendo ambos la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III;
- 3)
- se digieren los fragmentos anteriores con el enzima de restricción de tipo III, y se liga el fragmento resultante que comprende el Enlazador A con el fragmento resultante que comprende el Enlazador B después de realizar una reacción de relleno de extremos 3'; y
- 4)
- se digieren los fragmentos ligados anteriores con el otro enzima de restricción de la etapa 1) para escindir la secuencia de enlazadores, y obtener de este modo el oligonucleótido de etiqueta doble.
Tal como se muestra en las etapas anteriores, el
cebador de RT usado para la transcripción inversa de ADNc a partir
de ARNm incorpora en el ADNc diana un primer sitio de reconocimiento
del enzima de restricción de tipo III, y la secuencia Enlazadora
incorpora en el ADNc diana un segundo sitio de reconocimiento del
enzima de restricción de tipo III.
El cebador de RT queda definido por la secuencia
5'-N_{18-25}-CAGCAG-T_{15-25}-3',
en la que N_{18-25} es una secuencia de
nucleótidos arbitraria de 18 a 25 que no comprende una secuencia
5'-CAGCAG-3' y una secuencia
5'-CATG-3'. El extremo 5' del
cebador de RT de se puede modificar, por ejemplo, con biotina.
El enzima de restricción de tipo III de la
invención proporciona fragmentos que tienen un extremo 5'
sobresaliente, que se puede transformar fácilmente en extremo romo
usando una reacción convencional de relleno de extremos 3'. A
saber, en la anterior etapa 3), el fragmento que comprende el
Enlazador A y el fragmento que comprende el Enlazador B se pueden
transformar fácilmente en extremos romos y por lo tanto permitir una
asociación aleatoria de los fragmentos sin ninguna reducción en el
tamaño de las etiquetas.
En la realización preferida de la invención, el
enzima de tipo III es EcoP15I y el otro enzima de
restricción es un enzima capaz de escindir ADNc en fragmentos con
una longitud media de entre 200 bp y 300 bp cada uno de ellos, tal
como el NIaIII.
En el método de producción del oligonucleótido
de etiqueta doble de la invención, se usan dos enlazadores
(Enlazador A y Enlazador B). El Enlazador A y el Enlazador B son ADN
bicatenarios diferentes entre sí. Un extremo del fragmento
enlazador bicatenario que participa en la ligación comprende la
secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III
adyacente a la secuencia para la ligación.
Por ejemplo, cuando el enzima de restricción de
tipo III es EcoP15I y el otro enzima de restricción es
NIaIII, ambos enlazadores comprenden la secuencia
5'-CAGCAGCAGT-3' en los extremos 3' de sus
primeras cadenas. La secuencia subrayada 5'-CAGCAG-3'
constituye uno de los sitios de reconocimiento del EcoP15I,
y la secuencia 5'-CATG-3' constituye
una región monocatenaria sobresaliente 3' para ligarse al fragmento
generado por la digestión del NIaIII.
El otro extremo del fragmento enlazador
bicatenario que no participa en la ligación se puede modificar
mediante un reactivo marcador tal como FITC (Isotiocianato de
Fluoresceína; el extremo 5' de la primera cadena) y mediante una
fracción amino (el extremo 3' de la segunda cadena).
De este modo, los enlazadores se realizan
alineando (annealing) las siguientes primera cadena de
ADN(1) y segunda cadena de ADN(2);
\vskip1.000000\baselineskip
ADN(1):
5'-N_{30-40}-CAGCAGCATG-3'
ADN(2):
3'-N_{30-40}-GTCGTC-5'
\vskip1.000000\baselineskip
en las que,
N_{30-40} de ADN(1) y
N_{30-40} de ADN(2) son secuencias de
nucleótidos arbitrarias de entre 30 y 40 bases, que son
complementarias entre sí, y en las que el extremo 5' de
ADN(1) puede estar marcado y el extremo 3' de ADN(2)
puede haberse
amino-modificado.
La presente invención proporciona además un
polinucleótido obtenido mediante la ligación de los anteriores
oligonucleótidos de etiqueta doble. Cada oligonucleótido de etiqueta
doble se puede clonar y amplificar por PCR. El polinucleótido
comprende por lo menos dos oligonucleótidos de etiqueta doble, y
preferentemente comprende entre 2 y 200 oligonucleótidos de
etiqueta doble. Los oligonucleótidos de etiqueta doble de la
invención se realizan mediante una asociación aleatoria de las dos
etiquetas, y por lo tanto el polinucleótido es también una
concatenación aleatoria de la etiqueta.
La presente invención proporciona además un
método de análisis de la expresión génica que comprende el análisis
de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido, y la
cuantificación del nivel de expresión de un gen expresado basándose
en el número de etiquetas correspondientes al gen expresado
incluidas en el polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de la invención comprende las
siguientes etapas:
- 1)
- se sintetiza una reserva de ADNc a partir de ARNm de genes expresados usando un cebador de RT que comprende oligo-dT y una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción de tipo III, seguido por la digestión de la reserva de ADNc con otro enzima de restricción;
- 2)
- se purifican fragmentos que comprenden secuencia poli A de la reserva de ADNc anterior, y se ligan los fragmentos bien con el Enlazador A ó bien con el Enlazador B, comprendiendo ambos la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III;
- 3)
- se digieren los fragmentos anteriores con el enzima de restricción de tipo III, y se liga el fragmento resultante que comprende el Enlazador A con el fragmento resultante que comprende el Enlazador B después de realizar una reacción de relleno de extremos 3';
- 4)
- se digieren los fragmentos ligados anteriores con el otro enzima de restricción de la etapa 1) para escindir la secuencia de enlazadores, y obtener de este modo un oligonucleótido de etiqueta doble que comprende dos etiquetas de más de 25 nucleótidos y capaces de identificar el gen expresado;
- 5)
- se ligan los oligonucleótidos de etiqueta doble para producir un polinucleótido; y
- 6)
- se analiza la secuencia de nucleótidos del polinucleótido anterior, y se cuantifica el nivel de expresión de un gen expresado basándose en el número de etiquetas correspondientes al gen expresado incluidas en el polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
En la realización preferida del método, el
enzima de tipo III es EcoP15I y el otro enzima de restricción
es un enzima capaz de escindir ADNc en fragmentos con una longitud
media de entre 200 bp y 300 bp cada uno de ellos, tal como el
NIaIII. En relación con los enlazadores, se puede usar
preferentemente el ADN bicatenario según se ha descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además un kit
para aislar una etiqueta que comprende más de 25 nucleótidos y
capaz de identificar un gen expresado, que comprende los siguientes
elementos:
- a)
- Un cebador de RT definido por la secuencia 5'-N_{18-25} que no comprende una secuencia 5'-CAGCAG-3' y una secuencia 5'-CATG-3', y en la que el extremo 5' del cebador de RT puede estar biotinilado.
- b)
- El Enlazador A y el Enlazador B, que son ADN bicatenarios diferentes entre sí y se realizan alineando las siguientes primera cadena de ADN(1) y segunda cadena de ADN(2):
\vskip1.000000\baselineskip
- ADN(1): 5'-N_{30-40}-CAGCAGCATG-3'
- ADN(2): 3'-N_{30-40}-GTCGTC-5'
\vskip1.000000\baselineskip
- en las que, N_{30-40} de (1) y N_{30-40} de (2) son secuencias de nucleótidos arbitrarias de entre 30 y 40, que son complementarias entre sí, y el extremo 5' de ADN(1) puede estar marcado y el extremo 3' de ADN(2) puede haberse amino-modificado.
- c)
- cebadores capaces de hibridarse con el anterior Enlazador A ó Enlazador B.
\vskip1.000000\baselineskip
El kit también puede comprender un enzima de
restricción de tipo III tal como el enzima EcoP15I y/u otro
enzima de restricción tal como el NIaIII. El kit puede
comprender también, además de los elementos antes mencionados,
otros elementos necesarios para llevar a cabo el análisis de
expresión génica de la presente invención. Entre los ejemplos se
incluyen un reactivo marcador, un tampón, perlas magnéticas, o
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra un esquema del protocolo
SAGE^{TM} convencional (Velculescu, et al., Science
270: 484-487, 1995).
La Fig. 2 muestra un procedimiento esquemático
para el aislamiento de etiquetas SuperSAGE de ADNc de 26 bp usando
EcoP15I.
La Fig. 3 resume la aplicación del análisis
SuperSAGE usando etiquetas de 26 bp obtenidas con
EcoP15I.
La Fig. 4 muestra un ejemplo de una
electrofóresis de productos después de la digestión con
EcoP15I (etapa 6, Fig. 2), visualizada por fluorescencia de
FITC. La estructura de cada fragmento se representa en el lado
derecho del panel. En este ejemplo, como molde para la síntesis del
ADNc se usaron moléculas de ARNm obtenidas a partir de hojas de
arroz.
La Fig. 5 muestra un ejemplo de una
electrofóresis (PAGE) de productos PCR de la etapa 9 de la Fig. 2.
El tamaño del producto PCR esperado es aproximadamente 97 bp.
La Fig. 6 muestra un ejemplo de una
electrofóresis (PAGE) de fragmentos resultantes de la digestión con
NIaIII de los productos PCR (etapa 10). El tamaño de la
etiqueta doble es aproximadamente 52 bp.
La Fig. 7 muestra un ejemplo de una
electrofóresis de fragmentos concatenados de etiquetas dobles (etapa
11).
La Fig. 8 muestra un ejemplo de una
electrofóresis de productos PCR de colonias (etapa 14).
La Fig. 9 muestra un ejemplo de la secuencia de
ADN contenida en el concatémero clonado (etapa 15).
La Fig. 10 muestra los resultados de la
RT-PCR usando ARN aislados a partir de hojas de
arroz infectadas por Magnaporthe grisea y usando secuencias
de etiqueta de 26 bp como cebador de PCR.
La Fig. 11 muestra los resultados de la
RT-PCR en Nicotiana benthamiana que se
trataron bien con una proteína elicitora INF1 de Phytophtora
infestans o bien con agua como control.
La Fig. 12 muestra el estudio cinético mediante
RT-PCR de la expresión génica de cuatro genes que se
identificaron mediante el SuperSAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Haciendo referencia a la Fig. 2, se describe a
continuación en el presente documento la realización preferida de
la presente invención usando EcoP15I como enzima de
restricción de tipo III.
El enzima de
restricción-modificación de tipo III EcoP15I
reconoce dos sitios 5'-CAGCAG-3' orientados inversamente, no
metilados, en la molécula de ADN diana, y digiere entre 25 y 28 bp
con respecto al extremo 3' de uno de los sitios de reconocimiento.
La invención se refiere a todas las aplicaciones posibles del enzima
EcoP15I para el aislamiento de secuencias de etiqueta de
entre 25 y 28 bp con respecto a una posición definida de ADNc.
Se sintetiza ADNc bicatenario a partir de ARNm
usando un cebador de anclaje oligo-dT biotinilado
(al que en lo sucesivo se hará referencia como "cebador de RT"
o cebador de transcripción inversa). Este cebador de RT comprende
una secuencia de nucleótidos arbitraria de entre 18 y 25 bases y la
secuencia 5'-CAGCAG-3' seguida por una secuencia
oligo-dT de entre 15 y 25 bases. La secuencia
5'-CAGCAG-3' incluida en el cebador de RT constituye uno de
los sitios de reconocimiento del EcoP15I (Fig. 2, etapa 1).
Por ejemplo, el cebador de RT que comprende una secuencia de 22
nucleótidos y la secuencia 5'-CAGCAG-3' seguida por una
secuencia de 19 dT es:
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC CAGCAG TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' | (ID SEC n.º: 1). |
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc sintetizado es digerido por la
endonucleasa de restricción NIaIII, que reconoce el motivo
de secuencia 5'-CATG-3'. Unas perlas
magnéticas recubiertas con estreptavidina capturan únicamente los
fragmentos digeridos que comprenden secuencias de cebadores de RT
(marcadas con biotina) (Fig. 2, etapas 2 y 3).
Un fragmento enlazador bicatenario (46 bp) se
liga a los extremos del fragmento de ADNc (que comprende una
secuencia poli A) capturado por perlas magnéticas. Un extremo de
este fragmento enlazador que participa en la ligación comprende la
secuencia 5'-CAGCAG-3' adyacente a la secuencia
5'-CATG-3' en la primera cadena
(Fig. 2, etapa 4). La secuencia 5'-CAGCAG-3' constituye uno
de los sitios de reconocimiento del EcoP15I, y la secuencia
5'-CATG-3' constituye una región
monocatenaria sobresaliente 3' que se ligará con el extremo
cohesivo de los fragmentos generados por la digestión con
NIaIII. El otro extremo del fragmento enlazador bicatenario
que no participa en la ligación se modifica mediante FITC
(Isotiocianato de Fluoresceína; el extremo 5' de la primera cadena)
y una fracción amino (el extremo 3' de la segunda cadena).
En la presente invención, se usan dos
enlazadores. Por ejemplo, el Enlazador A se realiza alineando los
dos siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| FITC-5'-TTTGGATTTGCTGGTGCAGTACAACTAGGCTTAATACAGCAGCATG-3' | (ID SEC n.º: 2) y |
| 5'-CTGCTGTATTAAGCCTAGTTGTACTGCACCAGCAAATCCAAA-3'-NH_{2} | (ID SEC n.º: 3). |
\vskip1.000000\baselineskip
El Enlazador B se realiza alineando los dos
siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
| FITC5'-TTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCTAACGATGTACGCAGCAGCATG-3' | (ID SEC n.º: 4) y |
| 5'-CTGCTGCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAA-3'-NH_{2} | (ID SEC n.º: 5). |
\vskip1.000000\baselineskip
La reserva de ADNc se divide en dos mitades, con
una mitad ligada al Enlazador A y la otra mitad al Enlazador B,
dando como resultado los "ADNc ligados con Enlazador A" y
"ADNc ligados con Enlazador B".
Tanto para los ADNc ligados con Enlazador A como
para los ADNc ligados con Enlazador B, los fragmentos de ADN unidos
a las perlas se digieren con EcoP15I (Fig. 2, etapa 5). El
EcoP15I reconoce un par de motivos orientados inversamente
de la secuencia 5'-CAGCAG-3', y
escinde entre 25 y 28 bp con respecto al extremo 3' de uno de los
sitios de reconocimiento. Después de la digestión, se liberan dos
fragmentos de las perlas. Uno es el fragmento que comprende el
enlazador y el fragmento de etiqueta de 27 ó 28 bp (con un tamaño
total de 69 ó 70 bp), y el otro es un fragmento de tamaño variable
situado entre los fragmentos de ADNc bicatenarios. Los fragmentos
que comprenden la secuencia poli A permanecen unidos a las perlas
magnéticas, y no participan en el siguiente procedimiento.
El fragmento de 69 ó 70 bp que comprende el
enlazador y la secuencia de etiqueta de 27 ó 28 bp se visualizan
mediante fluorescencia de FITC bajo radiación UV, y son fácilmente
aislados a partir de un gel de poliacrilamida mediante excisión de
gel.
El EcoP15I proporciona fragmentos que
tienen un extremo 5' sobresaliente, cuyos extremos se transforman
fácilmente en romos mediante la reacción de relleno de extremos 3'
convencional, permitiendo de este modo la asociación aleatoria de
los fragmentos. Por lo tanto, los fragmentos de 69 ó 70 bp
(fragmentos de enlazador-etiqueta) que se originan
respectivamente a partir de ADNc ligados con Enlazador A y ADNc
ligados con Enlazador B, son transformados cada uno de ellos en
fragmentos con extremos romos mediante una reacción de relleno de
extremos 3' y se ligan entre sí para formar etiquetas dobles
mediante asociación aleatoria de dos etiquetas. Los extremos 3' de
fragmentos enlazadores son bloqueados por una
amino-modificación, de manera que la ligación se
produce únicamente entre lados de secuencias de etiqueta ADNc que
tienen extremos romos (Fig. 2, etapas 6, 7).
Las moléculas de etiquetas dobles resultantes se
amplifican mediante PCR (Fig. 2, etapa 9). A continuación se
muestran ejemplos de cebadores de PCR diseñados a partir de las
secuencias de enlazadores:
\vskip1.000000\baselineskip
| Cebador de etiqueta doble 1E: biotina-5'-CAACTAGGCTTAATACAGCAGCA-3' | (ID SEC n.º: 6) |
| Cebador de etiqueta doble 2E: biotina-5'-CTAACGATGTACGCAGCAGCA-3' | (ID SEC n.º: 7) |
\vskip1.000000\baselineskip
El tamaño esperado del producto PCR obtenido por
PCR usando los cebadores anteriores es aproximadamente 97 bp.
El producto PCR de aproximadamente 97 bp es
digerido con NIaIII (Fig. 2, etapa 10), liberando de este modo
fragmentos de etiqueta doble de aproximadamente 52 bp. Estos
fragmentos son recuperados a partir del gel, y son purificados.
Mediante una reacción de ligación se concatenan
fragmentos de cadenas dobles (Fig. 2, etapa 11). Mediante
electrofóresis en gel de agarosa se separan concatémeros. A partir
del gel se eluyen fragmentos de un tamaño mayor que 500 bp y los
mismos son recuperados.
Los fragmentos de concatémeros separados según
el tamaño se ligan a un plásmido vector apropiado que se predigiere
con SphI y se trata con fosfatasa de intestino de ternera
(FIG. 2, etapa 12), y los plásmidos se transforman en E.
coli (Fig. 2; etapa 13).
Los fragmentos de inserto de los plásmidos se
amplifican por PCR (Fig. 2; etapa 14).
Los productos de PCR se secuencian directamente
(Fig. 2; etapa 15). Una serie de secuencias de etiqueta doble de
aproximadamente 44 bp están flanqueadas por la secuencia de
reconocimiento CATG del NIaIII. Esta información de
secuencia de aproximadamente 52 (44+8) bp proporciona dos secuencias
de etiqueta de entre 26 y 28 bp aisladas con respecto a una
posición definida de cada ADNc.
Después de contar el número de etiquetas de 26
bp en una muestra, es posible obtener los perfiles de expresión
génica tal como se describe en el protocolo SAGE^{TM} original.
Como las etiquetas dobles de la invención se forman mediante la
asociación aleatoria de etiquetas de extremos romos, el resultado
refleja fielmente la expresión de cada gen.
La secuencia de etiqueta de 26 bp contiene
información suficiente para identificar de forma exclusiva el gen a
partir del cual se obtuvo la etiqueta. Con el contenido de la
información en la secuencia de ADN de 26 bp, se facilita la
identificación in silico del gen correspondiente. Incluso una
búsqueda de una secuencia de etiqueta de 26 bp en el BLAST con
respecto al conjunto completo de secuencias del Genbank presentará
la coincidencia correcta para el gen a partir del cual se originó la
etiqueta (Fig. 3).
En caso de que el método descrito se aplique
para organismos para los que no hay disponibles datos de secuencia
ADN, la secuencia de etiqueta de 26 bp se puede usar directamente
como el cebador de PCR para que la 3'-RACE recupere
la región 3' del ADNc. Dicha secuencia de ADNc se puede usar para
una búsqueda en el BLAST con el fin de identificar el gen (Fig.
3).
\newpage
El 3'-RACE con una secuencia de
etiqueta de 26 bp se puede realizar directamente como una
RT-PCR para cuantificar la cantidad de mensajes en
relación con la verificación de la diferencia de la expresión génica
entre las muestras según dé a conocer el SuperSAGE (Fig. 3).
La secuencia de etiqueta de 26 bp es más larga
que el tamaño mínimo (21 bp) de secuencia de ADN necesaria para
activar la "interferencia de ARN" (ARNi) (Elbashir et
al. Nature 411: 494-498, 2001). Por lo
tanto, se podría usar inmediatamente ARN bicatenario que comprenda
la secuencia de etiqueta para el análisis funcional con el fin de
eliminar el gen correspondiente a la etiqueta. Esto significa que el
análisis de expresión génica tal como se realiza mediante el
SuperSAGE se podría relacionar directamente con el análisis de la
función genética con el aislamiento de la etiqueta de 26 bp.
Para su aplicación en una especie vegetal, el
fragmento de 3'-RACE tal como se ha descrito
anteriormente se podría clonar en un virus vector vegetal, y se
podría usar para un "silenciamiento génico inducido por virus
(VIGS)" (Baulcombe, Curr. Opin. Plant. Biol. 2:
109-113, 1999), y de este modo el método SuperSAGE
descrito relaciona el análisis de la expresión génica con el
análisis de la función genética también en los vegetales.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describe de forma más
detallada en referencia a los siguientes ejemplos, aunque el
alcance de la presente invención no se limita a estos ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Como prueba de principio, se aislaron secuencias
de etiqueta de 26 y 27 bp a partir de hojas de un mutante simulador
de lesiones IB2020 del arroz (cv. Oryza sativa Kakehashi)
mediante el método antes descrito.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN total a partir de briznas de arroz
mediante un método convencional de aislamiento de ARN. A partir de
este ARN, se aislaron 5 \mug de ARNm usando un "Kit de
Purificación de ARNm" (Amersham Pharmacia). El ARNm se disolvió
en 29 \mul de agua DEPC, y se usó como material de partida.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ARNm se transcribió inversamente usando un
"Sistema de Síntesis de ADNc" (Invitrogen) para generar ADNc
monocatenario usando el siguiente cebador de transcripción inversa
que comprende el motivo 5'-CAGCAG-3' que es una secuencia de
reconocimiento del enzima EcoP15I. Cebador de transcripción
inversa:
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCCAGCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' | (ID SEC n.º: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
El producto se convirtió en ADNc bicatenario
usando el mismo kit, se precipitó con etanol, y se disolvió en 20
\muL de tampón de LoTE (Tris-HCl 3 mM pH 7,5, EDTA
0,2 mM).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc bicatenario resultante (20 \muL) se
digirió en 200 \muL de solución de reacción que comprendía 50
unidades de NIaIII (New England BioLabs; NEB) en 1 x Tampón
NEB 4 (NEB) que contenía 0,1 mg/ml de BSA a 37ºC durante 90
minutos. Después de la digestión, se extrajo ADNc con
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico equilibrados con TE
(25-24:1; pH 8,0), el mismo se precipitó con etanol,
y se disolvió en 20 \muL de tampón de LoTE.
En cada uno de dos tubos de Eppendorf, se
transfirió 1 ml de una suspensión de perlas magnéticas de
estreptavidina (Partículas Paramagnéticas de Estreptavidina
Magnesphere, Promega). Las perlas magnéticas se lavaron una vez con
200 \mul de 1 x solución de B&M (Tris-HCl 5 mM
pH 7,5, EDTA 0,5 mM, NaCl 1M) usando un soporte de separación
magnética (Soporte de Separación Magnética de Tecnología
Magnesphere). Después del lavado, en cada tubo se adicionaron 100
\mul de 1 x tampón de B&W y 10 \mul de ADNc obtenidos de la
etapa anterior y 90 \mul de agua, los mismos se mezclaron, y se
incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. El ADNc unido
por perlas magnéticas se lavó tres veces con 1 x tampón de B&W y
tres veces con tampón de LoTE.
\newpage
Los siguientes oligonucleótidos se sintetizaron
comercialmente (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Enlazador A1:
| FITC-5'-TTTGGATTTGCTGGTGCAGTACAACTAGGCTTAATACAGCAGCATG-3' | (ID SEC n.º: 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
Enlazador A2:
| 5'-CTGCTGTATTAAGCCTAGTTGTACTGCACCAGCAAATCCAAA-3'-NH_{2} | (ID SEC n.º: 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Enlazador B1:
| FITC5'-TTTCTGCTCGAATTCAAGCTTCTAACGATGTACGCAGCAGCATG-3' | (ID SEC n.º: 4) |
\vskip1.000000\baselineskip
Enlazador B2:
| 5'-CTGCTGCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAA-3'-NH_{2} | (ID SEC n.º: 5) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los terminales 5' del Enlazador A2 y el
Enlazador B2 se fosforilaron mediante polinucleótido quinasa de T4
(NEB). El Enlazador A se preparó alineando el Enlazador A1 y el
Enlazador A2 fosforilado, y el Enlazador B alineando el Enlazador
B1 y el Enlazador B2 fosforilado. Tanto el Enlazador A como el
Enlazador B albergan la secuencia de reconocimiento del
EcoP15I (5'-CAGACAG-3').
A cada uno de los dos tubos que contenían ADNc
unido a perlas magnéticas, se les adicionaron 17 \mul de LoTE, 3
\mul de 5 X tampón ligasa (Invitrogen) y un 1 \mug bien del
Enlazador A ó bien del Enlazador B. Después de mezclarlos, los
tubos se incubaron a 50ºC durante 2 minutos y se dejaron a
temperatura ambiente durante 15 minutos. Subsiguientemente, al tubo
se le adicionaron 2 \mul de ADN ligasa de T4 (5 unidades/\mul,
Invitrogen) y los mismos se incubaron a 16ºC durante 90 minutos.
Después de la ligación del enlazador, las perlas se lavaron 4 veces
con 1 X B&W, 3 veces con tampón de LoTE y una vez con agua
destilada estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc ligado con enlazador en las perlas
magnéticas se dirigió con 10 unidades de EcoP15I en 100
\mul de mezcla de reacción (Tris-HCl 10 mM pH 8,0,
KCl 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 0,1 mM, 5 \mug/ml
de BSA, ATP 2 mM). Los tubos se incubaron a 37ºC durante 90
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la digestión con EcoP15I, los
tubos se situaron en un soporte magnético. Después de la
eliminación del fragmento terminal 3' más exterior biotinilado
mediante perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina, la
fracción no unida que contenía los fragmentos
enlazador-etiqueta se recogió, y se transfirió a un
tubo nuevo. La solución recogida se extrajo con
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1; pH 8,0), se precipitó
con etanol, se disolvió en 10 \mul de tampón de LoTE, y se separó
por electrofóresis en gel de poliacrilamida 8%. En calles
adyacentes, se cargó marcador de tamaño (escalera de 20 bp, TAKARA)
teñido previamente con verde SYBR (FMC). Después de la
electrofóresis, el gel se situó en un iluminador de UV, y el
fragmento enlazador-etiqueta de un tamaño de
aproximadamente 69 bp se visualizó mediante su fluorescencia
mediada con FITC (Fig. 4). Se visualizaron también dos fragmentos
adicionales que se habían originado supuestamente a partir de la
ligación enlazador-enlazador (aproximadamente 90 bp)
y fragmentos enlazador individuales (46 bp). En el caso de que la
fluorescencia por FITC proporcionara una señal demasiado débil, el
gel se podría teñir con verde SYBR (FMC) para visualizar el
fragmento enlazador-etiqueta. El fragmento
enlazador-etiqueta de aproximadamente 69 bp se
recortó del gel y se situó en un tubo de 0,5 ml con un pequeño
agujero en el fondo realizado mediante una aguja de jeringa. El
tubo de 0,5 ml se situó dentro de un tubo de 2 ml, y se centrifugó
a 15.000 rpm durante 2 minutos. A los pequeños trozos de gel
recogidos en el fondo del tubo de 2 ml se les adicionó tampón de
LoTE (300 \mul), y los mismos se incubaron a 37ºC durante 2 horas,
seguido por una incubación a 65ºC durante 15 minutos. La suspensión
de gel se transfirió a una columna SpinX (Coaster) y se centrifugó
a 15.000 rpm durante 2 minutos. La solución recuperada se extrajo
una vez por Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1; pH 8,0),
se precipitó con etanol y se disolvió en 8 \mul de tampón
de
LoTE.
LoTE.
La protuberancia 5' de los fragmentos
enlazador-etiqueta se rellenó por ADN polimerasa
usando un kit (Blunting High; TOYOBO). A la solución que contenía
el fragmento enlazador-etiqueta (8 \mul), se le
adicionaron 1 \mul de tampón de reacción (tampón de KOD; TOYOBO)
y 1 \mul de polimerasa KOD (TOYOBO), y la misma se incubó a 72ºC
durante 2 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmentos de enlazador-etiqueta
que se habían originado a partir del Enlazador A y el Enlazador B
se ligaron para formar los fragmentos de etiqueta doble. Se
mezclaron volúmenes iguales (2 \mul) de soluciones de
Enlazador-A-etiqueta y
Enlazador-B-etiqueta de extremos
romos, y se adicionaron 6 \mul de LoTE y 10 \mul de mezcla de
ligación (Ligation High, TOYOBO). La solución de ligación se incubó
a 16ºC entre 4 horas y toda una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de etiquetas dobles resultante se
diluyó cinco y diez veces, y se usó como molde para la PCR de las
etiquetas dobles. La reacción PCR se realizó en 288 (=96 x 3) tubos
de 0,2 ml que contenían cada uno de ellos 50 \mul de solución que
contenía 1 \mul de molde de etiqueta doble diluido, 3 unidades de
Taq polimerasa (AmpliTaq Gold; Applied Biosystems), 1 x tampón de
AmpliTaq Gold y los cebadores de PCR. Los extremos 5' de los
cebadores de PCR se biotinilaron de la manera siguiente
(sintetizados comercialmente por Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
| Cebador de etiqueta doble 1E: biotina-5'-CAACTAGGCTTAATACAGCAGCA-3' | (ID SEC n.º: 6) |
| Cebador de etiqueta doble 2E: biotina-5'-CTAACGATGTACGCAGCAGCA-3' | (ID SEC n.º: 7) |
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR consistió en una desnaturalización
inicial a 95ºC durante 12 minutos seguida por entre 27 y 29 ciclos
de 94ºC durante 40 segundos y 60ºC durante 40 segundos. El tamaño
esperado de los fragmentos de etiqueta doble amplificados fue
aproximadamente 97 bp (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la PCR de etiquetas dobles
(aproximadamente 300 tubos) se agrupó en tubos de plástico de 10
ml. Después de una extracción con Fenol/Cloroformo/Alcohol
isoamílico (25:24:1; pH 8,0) y una precipitación con etanol, se
disolvió en 100 \mul de tampón de LoTE. Este producto de la PCR se
extendió sobre un gel de Agarosa (SeaPlaque, FMC) de bajo punto de
fusión 1,5%, y el fragmento de aproximadamente 97 bp se recortó del
gel, que se purificó mediante un kit de extracción Qiagen Gel
(Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de aproximadamente 97 bp
purificado, eluído en 121 \mul de tampón de LoTE se digirió con
120 unidades de NIaIII (NEB) en 1 x tampón de NEB 4 que
contenía 0,1 mg/ml de BSA (NEB). Después de la confirmación de la
digestión mediante electrofóresis en gel (se visualizaron tres
fragmentos de un tamaño de 52 bp, 22 bp y 23 bp, Fig. 6), la
solución de la digestión se trató con perlas magnéticas de
estreptavidina a temperatura ambiente durante 30 minutos para la
eliminación de fragmentos enlazadores. Después de que las perlas
magnéticas en el tubo fueran captadas por el soporte magnético, el
sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, y el ADN se extrajo con
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1; pH 8,0), se precipitó
con etanol y se disolvió en 10 \mul de tampón de LoTE.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN recuperado se sometió a electrofóresis en
gel de poliacrilamida al 12%. Para visualizar el fragmento, el gel
se tiñó con verde SYBR (FMC). Del gel se recortó un fragmento de un
tamaño de aproximadamente 52 bp en un transiluminador de UV. El ADN
se eluyó del gel tal como se ha descrito anteriormente. La solución
de ADN eluído del gel se trató con perlas magnéticas de
estreptavidina a temperatura ambiente durante 30 minutos. El
sobrenadante se recogió, y se extrajo con Fenol/Cloroformo/Alcohol
isoamílico (25:24:1; pH 8,0), se precipitó con etanol y se disolvió
en 7 \mul de tampón de LoTE.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la concatenación de fragmentos de etiqueta
doble, 7 \mul de la solución de etiquetas dobles, 2 \mul de 5 X
tampón de ligasa, y 5 unidades de ligasa del T4 (Invitrogen) se
mezclaron e incubaron a 16ºC durante entre 1 y 4 horas. La solución
de ligación se incubó a 65ºC durante 10 minutos, y se cargó sobre
gel de agarosa al 1% (Fig. 7). Del gel se recortaron fragmentos de
ADN de un tamaño mayor de 500 bp y los mismos se eluyeron. Los
concatémeros purificados se disolvieron en 6 \mul de tampón de
LoTE.
\vskip1.000000\baselineskip
Cinco microgramos de vector de clonación
(pGEM3Z, Promega) se digirieron con SphI, y se trataron con
fosfatos alcalinos de intestino de ternera (CIAP). Para clonar los
concatémeros, este vector pGEM3Z digerido y los concatémeros de
etiqueta doble se ligaron usando ligasa del T4 (Invitrogen). Después
de 4 horas de ligación, la solución de la reacción se extrajo con
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1), y se precipitó con
etanol. El pellet se lavó 4 veces con etanol al 70% para eliminar
completamente la sal, y se disolvió en 10 \mul de agua destilada
estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron células electrocompetentes de E.
coli (DH 10B, Invitrogen) para la clonación de plásmidos que
contenían los concatémeros de etiqueta doble. En un tubo, se
mezclaron en hielo 40 \mul de una suspensión de células
competentes y 1 \mul de ADN ligado purificado, y los mismos se
transfirieron hacia una cubeta de electroporación (separación 0,1
cm; BioRad). Las condiciones para la electroporación fueron las
recomendadas por el fabricante de las células competentes (2,5 kV,
25 \muFD, 100 \Omega). Después de la electroporación, se
adicionó un 1 ml de medio SOC (Invitrogen), y la solución se incubó
a 37ºC durante 1 hora. La suspensión resultante de E. coli
se colocó en placas sobre un medio LB que contenía 100 \mug/ml de
Ampicilina, 20 \mug/ml de X-gal e IPTG 0,1 mM.
Las placas se incubaron a 37ºC durante 14 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando palillos se recogieron colonias blancas
desarrolladas sobre las placas, y las mismas se resuspendieron en
la mezcla de PCR que contenía 1 X tampón de PCR, dNTP 0,4 mM, 0,05
unidad/\mul de Taq polimerasa (TAKARA), 2 pmoles/\mul de
cebador M13-20 y 2 pmoles/\mul de cebador M13RV.
Los fragmentos clonados en el plásmido se amplificaron por PCR y el
tamaño de los fragmentos se verificó por electrofóresis en gel de
agarosa (Fig. 8). Los fragmentos de la PCR amplificados se
purificaron usando un kit de purificación de PCR (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de PCR purificados (concatémeros)
se secuenciaron con el BigDye terminator (Applied
Biosystems) y el cebador M13-20. Después de la
reacción de secuenciación, el ADN se purificó con el "Montage
SEQ96 Sequencing Reaction Cleanup Kit" (Millipore). Las
secuencias ADN se analizaron mediante el secuenciador capilar de
ADN RISA384 (Shimadzu). En la Fig. 9 se muestra un ejemplo de las
secuencias de ADN de fragmentos clonados. Una serie de etiquetas
dobles de entre 52 y 54 bp que comprenden dos fragmentos de 26 ó 27
bp están delimitadas por sitios CATG NIaIII.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las secuencias de ADN de
concatémeros, se extrajeron secuencias de etiqueta de 26 bp y se
contó el número de cada etiqueta usando un software SAGE^{TM}
2000, suministrado por la Johns Hopkins University. Después de
secuenciar varios clones, se realizó un perfilado de expresión
génica según se muestra en la Tabla 1.
De este modo, las secuencias de 26 ó 27 bp
adyacentes a los sitios NIaIII de los ADNc se aislaron
satisfactoriamente de las hojas de arroz. Las etiquetas de
identificación que comprenden secuencias de 26 ó 27 bp se pueden
obtener a partir de cualquier ADNc aplicando el procedimiento
experimental que se describe en el presente documento. Este
protocolo basado en el aislamiento de etiquetas que comprenden
secuencias de 26 ó 27 bp representa una mejora cualitativa
sustancial con respecto al procedimiento SAGE^{TM} más avanzado
(conocido como "LongSAGE^{TM}") que usa etiquetas que
comprenden secuencias de entre 18 y 21 bp.
En el método SuperSAGE, el enzima EcoP15I
genera extremos sobresalientes 5' en las etiquetas cuyos extremos
son convertidos fácilmente en romos por ADN polimerasa. Por lo
tanto, la formación de etiquetas dobles se realiza mediante
asociación aleatoria de las etiquetas de extremos romos,
garantizando de este modo que el número de etiquetas representa
fielmente la expresión de los genes correspondientes a las
etiquetas. Esta propiedad no está disponible cuando se forman
etiquetas dobles únicamente entre las etiquetas de 21 bp que
comprenden extremos sobresalientes 3' de 2 bp compatibles en el
protocolo LongSAGE^{TM}. Para garantizar la asociación aleatoria
de etiquetas en el LongSAGE^{TM}, los extremos de las etiquetas se
deberían convertir en romos eliminando la región sobresaliente 3'.
Esto da como resultado una reducción de 2 bp del tamaño de la
etiqueta y por lo tanto reduce el contenido de información de las
etiquetas. De este modo, el método SuperSAGE descrito en el
presente documento resulta ventajoso con respecto al método
LongSAGE^{TM} desde el punto de vista del mayor contenido de
información de las etiquetas y la representación más fiel de los
perfiles de expresión génica.
Para demostrar que el tamaño de 26 bp de la
etiqueta del SuperSAGE permite una anotación altamente fiable de la
etiqueta con respecto al gen, se efectuó el siguiente
experimento.
Se seleccionaron aleatoriamente treinta
etiquetas de 26 bp de la Tabla 1. Estas secuencias de ADN se
truncaron desde los extremos 3' de manera que los tamaños de las
etiquetas se convirtieron respectivamente en 20, 18 y 15 bp. El
tamaño de etiqueta de 15 bp se corresponde con el usado en el
SAGE^{TM} convencional. Las etiquetas de 18 bp ó 20 bp se
extrajeron de la etiqueta del LongSAGE^{TM}, cuando los fragmentos
enlazador-etiqueta se ligaron entre sí con y sin,
respectivamente, el enromado de extremos. Usando cada una de las
etiquetas de tamaños diferentes, se efectuó una búsqueda en el
BLAST en el conjunto completo de secuencias de ADN depositadas en
el Genbank que representan secuencias de ADN de más de 130.000
especies. Se contó el número de especies que contenían secuencias
de ADN que mostraban una coincidencia perfecta con una etiqueta de
un tamaño determinado, y se obtuvieron los números medio y
máximo de especies recorriendo las 30 secuencias de etiqueta. El resultado de la búsqueda se resume en la Tabla 2.
máximo de especies recorriendo las 30 secuencias de etiqueta. El resultado de la búsqueda se resume en la Tabla 2.
Una serie de secuencias de ADN presentó una
coincidencia perfecta con una secuencia de etiqueta, y un aumento
en el tamaño de la etiqueta redujo la ambigüedad de anotación de una
etiqueta con respecto a un gen.
La etiqueta SAGE^{TM} convencional (15 bp)
coincidió con secuencias de ADN de más de 4 especies por término
medio, y con un máximo de 9 especies. La totalidad de las 30
etiquetas estaba en correlación con dos o más especies (Tabla 2).
Las etiquetas de 18 bp coinciden con 1,8 especies por término medio,
con un máximo de 7 especies. Diez etiquetas de entre 30 presentaban
correlación con dos o más especies. Las etiquetas de 20 bp
coincidían con 1,16 especies por término medio, con un máximo de 4
especies. Únicamente 3 etiquetas de entre 30 presentaban
correlación con más de dos especies, indicando una gran mejora con
respecto a la longitud de etiqueta SAGE^{TM} original (15 bp). No
obstante, obsérvese que la etiqueta de 20 bp se pudo extraer
únicamente cuando las etiquetas-enlazadores estaban
ligados sin enromado de los extremos, de manera que los resultados
finales de este método no representa necesariamente una expresión
génica precisa. Las etiquetas de 26 bp del método SuperSAGE
coincidían con 1,06 especies por término medio, con un máximo de
solamente 2 especies. Tan solo 2 etiquetas de entre 30 presentaban
correlación con las secuencias de ADN de más de 2 especies. Estos
resultados muestran claramente que el contenido de
información
en la secuencia de ADN de 26 bp proporciona una gran mejora en la eficacia de la anotación génica de las etiquetas.
en la secuencia de ADN de 26 bp proporciona una gran mejora en la eficacia de la anotación génica de las etiquetas.
Las etiquetas de 26 bp coincidían con secuencias
de ADN de solamente una especie por término medio, y en la mayoría
de los casos coincidían con un único gen de la especie particular.
De este modo, la anotación de la secuencia de etiquetas se puede
llevar a cabo de forma casi perfecta. La anotación de la etiqueta en
el SuperSAGE se puede realizar en relación con la base de datos de
secuencias EST así como en relación con secuencias del genoma
completo.
El alto contenido de información de la etiqueta
de 26 bp en el SuperSAGE permite el análisis de expresión génica
simultáneo de dos organismos. Como ejemplo, se aplicó el método
descrito para estudiar los perfiles de expresión génica de plantas
de arroz infectadas con la enfermedad del añublo provocada por el
hongo Magnaporthe grisea. Después de aislar un total de
12.119 etiquetas de hojas de arroz infectadas por añublo, se anotó
cada etiqueta mediante búsqueda en BLAST para todas las secuencias
del genoma de arroz y M. grisea. Tal como se esperaba, la
mayoría de las etiquetas se anotaron para genes de arroz (Tabla 3),
mientras 74 etiquetas no coincidieron con secuencias de arroz sino
que coincidieron con secuencias de añublo (Tabla 4).
Para verificar los resultados obtenidos mediante
el SuperSAGE, se sintetizó ADNc mediante transcripción inversa a
partir del mismo ARN que anteriormente usando el siguiente cebador
Oligo-dT anclado:
5'-GGCCACGCGTC
GACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (ID SEC n.º: 8). Con este ADNc como molde, las etiquetas de 26 bp correspondientes a los genes de la hidrofobina, la nucleósido-difosfato quinasa y la proteína ribosomal 60S (Tabla 4) se usaron para la 3'-RACE junto con el siguiente cebador: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (ID SEC n.º 9). Se obtuvieron productos de la PCR específicos para la totalidad de los tres genes (Fig. 10, izquierda). Se usaron los mismos conjuntos de cebadores para la RT-PCR en cultivar susceptible al añublo con inoculación simulada (Kakehashi), cultivar susceptible inoculado con añublo (Kakehashi), cultivar resistente al añublo, con inoculación simulada (Himenomochi) y cultivar resistente inoculado con añublo (Himenomochi). Tal como se esperaba, los productos de PCR correspondientes a los tres genes de añublo se amplificaron únicamente a partir de cultivar susceptible inoculado con hongo del añublo (Fig. 10, derecha), demostrando la autenticidad de la anotación SuperSAGE.
GACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (ID SEC n.º: 8). Con este ADNc como molde, las etiquetas de 26 bp correspondientes a los genes de la hidrofobina, la nucleósido-difosfato quinasa y la proteína ribosomal 60S (Tabla 4) se usaron para la 3'-RACE junto con el siguiente cebador: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (ID SEC n.º 9). Se obtuvieron productos de la PCR específicos para la totalidad de los tres genes (Fig. 10, izquierda). Se usaron los mismos conjuntos de cebadores para la RT-PCR en cultivar susceptible al añublo con inoculación simulada (Kakehashi), cultivar susceptible inoculado con añublo (Kakehashi), cultivar resistente al añublo, con inoculación simulada (Himenomochi) y cultivar resistente inoculado con añublo (Himenomochi). Tal como se esperaba, los productos de PCR correspondientes a los tres genes de añublo se amplificaron únicamente a partir de cultivar susceptible inoculado con hongo del añublo (Fig. 10, derecha), demostrando la autenticidad de la anotación SuperSAGE.
El análisis cuantitativo de la expresión génica
de dos especies en una muestra tal como se ha ejemplificado en este
caso no se pudo realizar mediante las técnicas anteriores. El uso de
etiquetas de 26 bp para el análisis de la expresión génica
("SuperSAGE") facilitará enormemente el análisis de la
expresión génica de dos o más organismos en interacción tales como
huéspedes y patógenos simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar que el SuperSAGE con etiquetas de
26 bp se puede usar para el análisis de la expresión génica de
organismos para los que no hay disponibles datos de secuencias de
ADN, se efectuó el siguiente experimento. Se aplicó el SuperSAGE
para el análisis de la expresión génica de una especie vegetal,
Nicotiana benthamiana, que se trató bien con un elicitor
proteínico INF1 de Phytophtora infestans (Kamoun et
al. Mol. Plant-Microbe Interact.
10:13-20, 1997) o bien con agua. Las hojas se
recogieron una hora después de la infiltración del elicitor o de
agua (inundación), y de las mismas se aisló ARN.
Se aislaron satisfactoriamente más de 5.000
etiquetas de cada una de las muestras (Tabla 5). Las diez etiquetas
observadas de forma más abundante, enumeradas en la Tabla 5, se
usaron directamente para la 3'-RACE, y se secuenció
el ADNc resultante. Las búsquedas en el BLAST de los ADNc
identificaron los genes correspondientes a las etiquetas según se
ofrece en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la corporación de la frecuencia de cada
etiqueta en muestras tratadas con INF1 y con inundación, se
identificaron etiquetas que estaban representadas de forma
significativa diferencialmente, en términos estadísticos, en las
dos muestras (Tabla 6). Estas etiquetas se usaron directamente para
el 3'-RACE, y el ADNc recuperado se usó para
búsquedas en el BLAST. Esto permitió la anotación de la mayoría de
las etiquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las secuencias de etiqueta de 26 bp se usaron
para la RT-PCR junto con el cebador de anclaje para
verificar los resultados de SuperSAGE mostrados en la Tabla 6. Los
resultados de la RT-PCR (Fig. 11) demuestran
claramente que los resultados del SuperSAGE reflejan fielmente las
diferencias de expresión génica entre las muestras tratadas con
INF1 y con inundación.
El mismo cebador de etiqueta de 26 bp se puede
usar fácilmente para la RT-PCR en relación con el
estudio cinético de cada expresión génica (Fig. 12). Se puso de
manifiesto que la expresión de cuatro genes sometidos a prueba
(genes correspondientes a la proteína de unión a clorofila a/b, la
proteína del fotosistema II, la fosfoglicerato quinasa, y la ATP
sintasa) se interrumpió 15 minutos después del tratamiento con
INF1.
Este ejemplo demuestra el gran potencial del
SuperSAGE para el análisis de expresión génica en los organismos
para los que no hay disponibles datos de secuencias de ADN. Este
potencial tiene su origen en el tamaño suficiente de las etiquetas
para el cebador de PCR específico y en el hecho de que el perfil de
expresión génica obtenido por el SuperSAGE representa fielmente la
expresión génica real.
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC n.º: 1: cebador de RT
ID SEC n.º: 2: Primera cadena del Enlazador
A
ID SEC n.º: 3: Segunda cadena del Enlazador
A
ID SEC n.º: 4: Primera cadena del Enlazador
B
ID SEC n.º: 5: Segunda cadena del Enlazador
B
ID SEC n.º: 6: Cebador de etiqueta doble
(directo)
ID SEC n.º: 7: Cebador de etiqueta doble
(inverso)
ID SEC n.º: 8: Cebador de RT
ID SEC n.º: 9: Cebador para
3'-RACE
<110> Iwate Prefectural Government
\hskip1cm KAHL, Guenter
\hskip1cm WINTER, Peter
\hskip1cm KRUEGER, Detlev
\hskip1cm REICH, Stefanie
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE UN ENZIMA DE RESTRICCIÓN DE
TIPO III PARA AISLAR ETIQUETAS DE IDENTIFICACIÓN QUE COMPRENDEN MÁS
DE 25 NUCLEÓTIDOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
PH-1719-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inventor: KAHL, Guenter; WINTER,
Peter; KRUEGER, Detlev; REICH, Stefanie; MATSUMURA, Hideo;
\hskip1cm TERAUCHI, Ryohei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador de RT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgatctaga ggtaccggat cccagcagtt tttttttttt ttttttt
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
primera cadena del Enlazador A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttggatttg ctggtgcagt acaactaggc ttaatacagc agcatg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
segunda cadena del Enlazador A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctgtatt aagcctagtt gtactgcacc agcaaatcca aa
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
primera cadena del Enlazador B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttctgctcg aattcaagct tctaacgatg tacgcagcag catg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
segunda cadena del Enlazador B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctgcgta catcgttaga agcttgaatt cgagcagaaa
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador de etiqueta doble (directo)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactaggct taatacagca gca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador de etiqueta doble (inverso)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaacgatgt acgcagcagc a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador de RT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador para 3'-RACE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacgcgt cgactagtac
\hfill20
Claims (18)
1. Uso de un enzima de restricción de tipo III
para aislar, con respecto a ADNc de un gen expresado, una etiqueta
que comprende más de 25 nucleótidos y capaz de identificar el gen
expresado, en la que el extremo 3' de la etiqueta queda definido
por un sitio de escisión del enzima de restricción de tipo III, y el
extremo 5' de la etiqueta queda definido por el sitio de escisión
de otro enzima de restricción que está más próximo al extremo 3'
del ADNc del gen expresado.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
enzima de restricción de tipo III es EcoP15I.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el
otro enzima de restricción es NIaIII.
4. Oligonucleótido de etiqueta doble que
comprende dos etiquetas que se obtienen cada una de ellas a partir
de un gen expresado diferente, en donde cada etiqueta comprende más
de 25 nucleótidos y es capaz de identificar un gen expresado, y el
extremo 3' de la etiqueta queda definido por un sitio de escisión de
un enzima de restricción de tipo III, y el extremo 5' de la
etiqueta queda definido por un sitio de escisión de otro enzima de
restricción que está más próximo al extremo 3' del ADNc del gen
expresado, en donde las dos etiquetas están ligadas por sus
extremos 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Oligonucleótido de etiqueta doble según la
reivindicación 4, producido por un método que comprende las
siguientes etapas:
- 1)
- se sintetiza una reserva (pool) de ADNc a partir de ARNm de genes expresados usando un cebador que comprende oligo-dT y una secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III, seguido por la digestión de la reserva de ADNc con otro enzima de restricción;
- 2)
- se purifican fragmentos que comprenden secuencia poli A de la reserva de ADNc anterior, y se ligan los fragmentos bien con el Enlazador A ó bien con el Enlazador B, comprendiendo ambos la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III;
- 3)
- se digieren los fragmentos anteriores con el enzima de restricción de tipo III, y se liga el fragmento resultante que comprende el Enlazador A con el fragmento resultante que comprende el Enlazador B después de realizar una reacción de relleno de extremos 3'; y
- 4)
- se digieren los fragmentos ligados anteriores con el otro enzima de restricción de la etapa 1) para escindir la secuencia de enlazadores, y obtener de este modo el oligonucleótido de etiqueta doble.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Oligonucleótido de etiqueta doble según la
reivindicación 4 ó 5, en el que el oligonucleótido de etiqueta
doble se realiza mediante una asociación aleatoria de dos etiquetas
obtenidas a partir de los diferentes genes expresados.
7. Oligonucleótido de etiqueta doble según la
reivindicación 4, 5 ó 6, en el que el enzima de restricción de tipo
III es EcoP 15I.
8. Oligonucleótido de etiqueta doble según la
reivindicación 7, en el que el otro enzima de restricción es
NIaIII.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Oligonucleótido de etiqueta doble según la
reivindicación 8, en el que el enlazador A y el enlazador B son ADN
bicatenarios que difieren entre sí y se realizan alineando
(annealing) las siguientes primera cadena de
\vskip1.000000\baselineskip
- ADN(1) y segunda cadena de ADN(2);
- ADN(1): 5'-N_{30-40}-CAGCAGCATG-3'
- ADN(2): 3'-N_{30-40}-GTCGTC-5'
\vskip1.000000\baselineskip
- en las que N_{30-40} de ADN(1) y N_{30-40} de ADN(2) son secuencias de nucleótidos arbitrarias de entre 30 y 40 que son complementarias entre sí, y en las que el extremo 5' de ADN(1) puede estar marcado y el extremo 3' de ADN(2) puede haberse amino-modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Polinucleótido que comprende por lo menos
dos oligonucleótidos de etiqueta doble según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 9.
\newpage
11. Polinucleótido según la reivindicación 10,
en el que el polinucleótido comprende entre 2 y 200 oligonucleótidos
de etiqueta doble.
12. Método de análisis de expresión génica que
comprende las siguientes etapas
- 1)
- se sintetiza una reserva de ADNc a partir de ARNm de genes expresados usando un cebador que comprende oligo-dT y una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción de tipo III, seguido por la digestión de la reserva de ADNc con otro enzima de restricción;
- 2)
- se purifican fragmentos que comprenden secuencia poliA de la reserva de ADNc anterior, y se ligan los fragmentos bien con el Enlazador A ó bien con el Enlazador B, comprendiendo ambos la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III;
- 3)
- se digieren los fragmentos anteriores con el enzima de restricción de tipo III, y se liga el fragmento resultante que comprende el Enlazador A con el fragmento resultante que comprende el Enlazador B después de realizar una reacción de relleno de extremos 3';
- 4)
- se digieren los fragmentos ligados anteriores con el otro enzima de restricción de la etapa 1) para escindir la secuencia de enlazadores;
- 5)
- se ligan los oligonucleótidos de etiqueta doble para producir un polinucleótido; y
- 6)
- se analiza la secuencia de nucleótidos del polinucleótido y se cuantifica el nivel de expresión de un gen expresado basándose en el número de etiquetas correspondientes al gen expresado incluidas en el polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Método de análisis de expresión génica que
comprende las siguientes etapas:
- 1)
- se sintetiza una reserva de ADNc a partir de ARNm de genes expresados usando un cebador que comprende oligo-dT y una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción de tipo III, seguido por la digestión de la reserva de ADNc con otro enzima de restricción;
- 2)
- se purifican fragmentos que comprenden secuencia poli A de la reserva de ADNc anterior, y se ligan los fragmentos bien con el Enlazador A ó bien con el Enlazador B, comprendiendo ambos la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción de tipo III;
- 3)
- se digieren los fragmentos anteriores con el enzima de restricción de tipo III, y se liga el fragmento resultante que comprende el Enlazador A con el fragmento resultante que comprende el Enlazador B después de realizar una reacción de relleno de extremos 3', y
- 4)
- se digieren los fragmentos ligados anteriores con el otro enzima de restricción de la etapa 1) para escindir la secuencia de enlazadores, y obtener de este modo un oligonucleótido de etiqueta doble que comprende dos etiquetas de más de 25 nucleótidos y capaces de identificar el gen expresado;
- 5)
- se ligan los oligonucleótidos de etiqueta doble para producir un polinucleótido;
- 6)
- se analiza la secuencia de nucleótidos del polinucleótido anterior, y se cuantifica el nivel de expresión de un gen expresado basándose en el número de etiquetas correspondientes al gen expresado incluidas en el polinucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Método según la reivindicación 13, en el que
el enzima de restricción de tipo III es EcoP15I.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el otro enzima de restricción es NIaIII.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
el enlazador A y el enlazador B son ADN bicatenarios que difieren
entre sí y se realizan alineando las siguientes primera cadena de
ADN(1) y segunda cadena de ADN(2);
\vskip1.000000\baselineskip
- ADN(1): 5'-N_{30-40}-CAGCAGCATG-3'
- ADN(2): 3'-N_{30-40}-GTCGTC-5'
\vskip1.000000\baselineskip
en las que
N_{30-40} de ADN(1) y
N_{30-40} de ADN(2) son secuencias de
nucleótidos arbitrarias de entre 30 y 40 que son complementarias
entre sí, y en las que el extremo 5' de ADN(1) puede estar
marcado y el extremo 3' de ADN(2) puede haberse
amino-modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Kit para aislar una etiqueta que comprende
más de 25 nucleótidos y capaz de identificar un gen expresado, que
comprende los siguientes elementos:
- a)
- un cebador de RT definido por las secuencias 5'-N_{18-25}-CAGCAG-T_{15-25}-3', en las que N_{18-25} es una secuencia de nucleótidos arbitraria de entre 18 y 25 que no comprende una secuencia 5'-CAGCAG-3' y una secuencia 5'-CATG-3', y en las que el extremo 5' del cebador de RT puede estar biotinilado;
- b)
- el Enlazador A y el Enlazador B, que son ADN bicatenarios diferentes entre sí y se realizan alineando las siguientes primera cadena de ADN(1) y segunda cadena de ADN(2):
\vskip1.000000\baselineskip
- ADN(1): 5'-N_{30-40}-CAGCAGCATG-3'
- ADN(2): 3'-N_{30-40}-GTCGTC-5'
\vskip1.000000\baselineskip
- en las que N_{30-40} de (1) y N_{30-40} de (2) son secuencias de nucleótidos arbitrarias de entre 30 y 40 que son complementarias entre sí, y el extremo 5' de ADN(1) puede estar marcado y el extremo 3' de ADN(2) puede haberse amino-modificado;
- c)
- cebadores capaces de hibridarse con los anteriores Enlazador A ó Enlazador B.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Kit según la reivindicación 17, que
comprende además EcoP15I y/ó NIaIII.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2003/005840 WO2004099445A1 (en) | 2003-05-09 | 2003-05-09 | Use of a type iii restriction enzyme to isolate identification tags comprising more than 25 nucleotides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2310240T3 true ES2310240T3 (es) | 2009-01-01 |
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ID=33428601
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03723302T Expired - Lifetime ES2310240T3 (es) | 2003-05-09 | 2003-05-09 | Uso de un enzima de restriccion de tipo iii para aislar etiquetas de secuencia que comprenden mas de 25 nucleotidos. |
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Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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