ES2308861T3 - Metodo para determinar la susceptibilidad a desarrollar sepsis y compuestos terapeuticos para el tratamiento e la sepsis. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar si un sujeto es o no es susceptible a desarrollar sepsis y/o a progresar rápidamente hasta sepsis, método que comprende las operaciones de: a) obtener una muestra de ácido nucleico del sujeto; y b) detectar un alelo del patrón 2 de IL-1 en dicha muestra, en que el alelo del patrón 2 de IL-1 es seleccionado del grupo que consiste en el alelo 1 de IL-1A (+4845) y el alelo 2 de IL-1B (-511), en que la detección de un alelo del patrón 2 indica que el paciente presenta una susceptibilidad aumentada a desarrollar sepsis.

Description

Método para determinar la susceptibilidad a desarrollar sepsis y compuestos terapéuticos para el tratamiento de la sepsis.

1. Antecedentes del invento Sepsis

La infección clínica es el resultado biológico final de un número de factores que incluyen la naturaleza del organismo invasor, su virulencia intrínseca, el microambiente del tejido u órgano invadido, y la sensibilidad del huésped. Cualquier medio por el que se pueden introducir bacterias en los tejidos puede dar lugar a una infección. Sin embargo, la naturaleza de la introducción puede influir en la gravedad de la infección y puede alterar la capacidad de respuesta del huésped. En cuanto a los daños, por ejemplo, una laceración cutánea difiere de una disección quirúrgica extensa, la cual, a su vez, difiere de una víscera gastrointestinal perforada. Similarmente, una infección pulmonar (una neumonía) que se produce en una zona de atelectasia es diferente de una infección pulmonar que tiene lugar como resultado de un proceso de aspiración. La mera presencia de patógenos en zonas intactas o dañadas no comprende una infección. Es necesaria una cierta masa crítica de organismos para superar suficientemente las defensas del huésped y causar una infección invasiva. Se afirma normalmente que este nivel de bacterias es 10^{5} organismos por gramo de tratamiento. Diversos factores pueden influir suficientemente en el equilibrio entre el invasor microbiano y las defensas del huésped para que se desarrollen infecciones con niveles menores de exposición bacteriana. Un tejido necrótico o cuerpos extraños en una herida son denominados factores adyuvantes, conocidos por hacer probable que se desarrollen infecciones con menores concentraciones. Factores fisiológicos locales, tal como una circulación alterada, aumentan también la susceptibilidad local a la infección. Se sabe que afecciones sistémicas tales como diabetes, uremia y sida reducen la resistencia del huésped a la infección, lo que hace de nuevo más fácil que los microbios establezcan una infección en los tejidos.

La gravedad de una infección se refiere, en parte, a la extensión del daño que la acompaña o precede. Un daño más grave (por ejemplo, un amplio trauma accidental o quirúrgico) interfiere más sustancialmente en la integridad del huésped, lo que permite un acceso más libre a los tejidos del huésped y compromete a las defensas intrínsecas del huésped. La gravedad de una infección depende del número y la clase de los microorganismos responsables de la infección. Si se diagnostica o sospecha una infección polimicrobiana, queda comúnmente justificada una intervención antibiótica precoz y agresiva, a menudo con agentes de amplio espectro con actividad sobre un número de posibles invasores.

Ciertos factores de virulencia han sido asociados con microorganismos específicos, factores que hacen más destructiva la invasión llevada a cabo por estas células. Los factores de virulencia son de tres tipos generales: 1) productos biológicos producidos y secretados por el agente infeccioso, que atacan a células del huésped o que afectan a mecanismos homeostáticos del huésped para producir una enfermedad clínica; 2) componentes estructurales de la célula bacteriana normal que, cuando se desprenden en el ambiente interno del huésped o cuando se liberan después de la muerte y la lisis de la célula bacteriana, producen efectos tóxicos sobre el huésped; y 3) respuestas del microorganismo a los antibióticos que le hacen resistente a estos agentes quimioterapéuticos. Los microorganismos particulares manifiestan característicamente factores de virulencia específicos. Por ejemplo, el Staphylococcus aureus produce coagulasa, que actúa como un potente factor de virulencia. Las especies estafilocócicas y estreptocócicas también producen leucocidinas. Como un ejemplo más, cepas de B. fragilis producen superóxido dismutasa, que convierte aniones superóxido en peróxido de hidrógeno, y cepas de E. coli producen catalasa, que reduce el peróxido de hidrógeno hasta agua, lo que hace posible una sinergia entre estos dos organismos. Se ha identificado una gran variedad de otros factores de virulencia.

El factor estructural de virulencia más importante es la endotoxina bacteriana. La endotoxina procede de la membrana exterior lipopolisacárida que se halla en casi todas las bacterias Gram negativas. La endotoxina provoca una amplia red de efectos biológicos. Se entiende que directamente estimula la cascada del complemento, provoca la agregación de plaquetas, provoca fiebre, activa la fagocitosis y el sistema inmune y estimula la síntesis de numerosas citocinas [Kremer et al., "Interleukin-1, -6 and tumor necrosis factor-alpha release is down-regulated in whole blood from septic patients", Acta Haemmatol. 95 (3-4): 268-273, 1996].

Factores relevantes para la susceptibilidad del huésped incluyen la facilidad de entrada por la que un microorganismo accede primero al huésped, los impedimentos dispuestos en el camino del microorganismo conforme se propaga dentro del huésped, y la capacidad del huésped para contener finalmente la invasión antes de sufrir un daño sustancial. Se sabe que ciertos huéspedes son más vulnerables que otros. Por ejemplo, los recién nacidos son particularmente propensos a sepsis e infecciones graves. Similarmente, los pacientes pediátricos pueden desarrollar sepsis en respuesta a infecciones bacterianas que son mucho más benignas en la población adulta. Es también más probable que las infecciones de la gente mayor progresen hasta sepsis que infecciones similares en pacientes más jóvenes. Se entiende también que ciertos estados patológicos aumentan la susceptibilidad del huésped a infecciones y sepsis. Un trauma grave, tal como el que se caracteriza por quemaduras importantes, predispone al paciente a sepsis e infecciones microbianas hasta tal punto que estos pacientes son considerados huéspedes inmunocomprometidos.

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Sería deseable identificar esos miembros de poblaciones vulnerables con un riesgo aun mayor de una infección abrumadora y sus consecuencias sistémicas. Por ejemplo, el recién nacido con una temperatura elevada debe ser evaluado en cuanto a focos de infección grave. Esta evaluación puede incluir medidas invasivas, tal como una punción lumbar con el fin de descartar una meningitis. A menudo, el recién nacido febril requiere hospitalización y tratamiento con antibióticos de amplio espectro hasta que se haya determinado una fuente de la fiebre. Si se pudiera identificar un subgrupo de la población de recién nacidos como poseedor de un riesgo mayor o un riesgo menor de infección abrumadora, se podrían adaptar medidas diagnósticas y terapéuticas al grado de riesgo. La punción lumbar podría ser restringida al infante de alto riesgo; véase, por ejemplo, Brik et al., "Evaluation of febrile infants under 3 months of age: is routine lumbar puncture warranted", Isr. J. Med. Sci. 33 (2): 93-97, 1997. O, por ejemplo, los infantes de bajo riesgo podrían ser tratados como pacientes ambulantes o ser rápidamente despedidos del hospital, lo que ofrecería un importe ahorro de costes en esta época de asistencia gestionada. [Durongpisitkul et al., "The appropriateness of early discharge of hospitalizad children with suspected sepsis", J. Fam. Pract. 44 (1) 91-96, 1997]. Los infantes o niños con un riesgo concreto de ciertas infecciones sistémicas graves podrían ser tratados con agentes específicos para la infección o podrían ser tratados más pronto o más agresivamente.

Las defensas del huésped representan una variable importante a la hora de determinar la gravedad de una infección clínica. Las defensas inespecíficas del huésped sirven para limitar el grado inicial de la invasión microbiana. Los ejemplos incluyen el mecanismo epiglótico de la tráquea, los pelos de las vías aéreas nasales, el sistema de macrófagos alveolares y el ambiente ácido del estómago. Una vez que tiene lugar el daño tisular o la contaminación microbiana, se ponen en marcha respuestas más específicas a nivel celular. Como parte de esta respuesta específica, los componentes fagocíticos-inflamatorios de la defensa del huésped se movilizan inicialmente con el trauma o con la invasión de los agentes infectivos. La fagocitosis y la inflamación están destinadas a contener y destruir los organismos antes de que alcancen el suficiente acceso sistémico para causar una infección clínicamente significativa. Cuando se localiza una infección a pequeña escala mediante estos mecanismos, se producen los fenómenos clínicos de celulitis o formación de abscesos. Con una contaminación microbiana más extensa, puede que no sea posible una contención local eficaz. No obstante, dicha contención es el objetivo del sistema fagocítico-inflamatorio de la defensa del huésped.

Una multitud de funciones celulares contribuyen a la fase de defensa específica del huésped. Antes que nada, en respuesta a la invasión microbiana, el huésped pone en marcha los componentes de la inflamación. Sólo cuando el estímulo de los microorganismos invasores llega a ser suficientemente acusado, estas respuestas inflamatorias ascienden al nivel de infección clínica. La infección clínica llega entonces a ser reconocible a través de la constelación de respuestas inflamatorias que son sensibles a la presencia de los microorganismos. En lugar de una respuesta específica a un invasor concreto, la infección clínica representa un conjunto de respuestas inflamatorias inespecíficas desencadenadas por todo daño y toda contaminación microbiana. En la presencia continua de bacterias, la agresión es activa y progresiva, lo que proporciona un daño ininterrumpido que impulsa la respuesta inflamatoria hasta que los agentes dañinos resultan erradicados.

Un componente precoz de esta respuesta inflamatoria es la cascada del complemento. Se entiende que este sistema es activado por diversos mecanismos de daño tisular local o trauma y alteración microvasculares, lo que conduce a la liberación de opsoninas y señales quimiotácticas que son productos de escisión del complemento que producen el efecto de atraer fagocitos y facilitar su actuación. Los mastocitos liberan proteínas inflamatorias, tales como quininas e histaminas, que aumentan la permeabilidad vascular y facilitan de ese modo el acceso de células y proteínas intravasculares a la zona afectada. Los neutrófilos son las primeras células fagocíticas que llegan a la escena. Aproximadamente 24 horas más tarde, llegan macrófagos activados.

Los macrófagos proceden de monocitos que entran en los tejidos desde la corriente sanguínea. Los monocitos reclutados a los tejidos se diferencian hasta macrófagos y se activan. En el estado activado, los macrófagos producen un gran número de proteínas inflamatorias y citocínicas. Una citocina importante liberada por el macrófago activado es el factor de necrosis tumoral (TNF; del inglés, tumor necrosis factor), que produce efectos autocrinos y paracrinos. EL TNF proporciona autoestimulación a monocitos y macrófagos para mantener una activación completa. El TNF estimula además a neutrófilos hasta una activación completa. En la inflamación aguda, tal como la hallada con una infección aguda, el neutrófilo activado actúa como fagocito primario, responsable de ingerir y matar los organismos invasores. Éstas células pueden liberar además radicales oxigenados libres y enzimas lisosómicas al fluido tisular, causando la muerte extracelular de patógenos. Los efectos secundarios de la liberación de estos productos citotóxicos celulares incluyen necrosis tisular, inflamación adicional y activación de la cascada de la coagulación. Además, los propios neutrófilos resultan muertos conforme progresan estos procesos. El resultado final de esta respuesta localizada a la invasión microbiana, con tejido necrótico y células necróticas licuadas, es clínicamente conocido como
pus.

En el perímetro de la herida, rodeando el núcleo central de material necrótico y fragmentos celulares, tienen lugar procesos biológicos adicionales destinados a detener o restringir la penetración de microorganismos viables en tejidos no afectados. Mediante la liberación de TNF y productos de escisión del complemento, se atraen más neutrófilos procedentes de microvasos adyacentes. También se activan plaquetas y proteínas de coagulación en la microcirculación adyacente, lo que conduce a una trombosis localizada. Las plaquetas activadas durante el proceso de trombosis producen tromboxano A2 por medio de la vía de ciclooxigenasa-tromboxano sintetasa de la biosíntesis de prostaglandinas. El tromboxano A2 es un potente vasoconstrictor. La combinación de obstrucción y vasoconstricción disminuye la afluencia de circulación en el área localizada de la infección pero también bloquea el acceso de patógenos a la circulación general. Los neutrófilos activados atraídos a la periferia del margen de la herida dentro de la microvasculatura, lo que conduce a un daño endotelial, aumentan la permeabilidad vascular y la subsiguiente exudación de células y proteínas séricas al espacio tisular.

Estos componentes del suero que escapan de los microvasos hasta los tejidos contribuyen a la función adicional de llevar los bloques de construcción de la cicatrización de heridas a la zona infectada: primero fibrina, albúmina y globulina, y más tarde fibroblastos. Los fibroblastos circulantes son atraídos a los tejidos por los factores de crecimiento secretados por los macrófagos activados presentes en la zona infectada. A su vez, los fibroblastos producen colágeno, una proteína que es la base del tejido cicatrizado. Si una infección llega a ser crónica, con el huésped completamente incapaz de eliminar el patógeno, la zona infectada llega finalmente a rodearse de una pared de tejido cicatrizado formada por los procesos de cicatrización de heridas. En el contexto de una infección aguda o crónica, los mecanismos de cicatrización de heridas ayudan a evitar la fuga del patógeno desde la zona local hasta el sistema más general.

Los macrófagos proporcionan la conexión entre el aspecto de contención local de la defensa del huésped y la respuesta sistémica. Los macrófagos activados liberan numerosos productos de secreción, incluyendo citocinas que ejercen efectos sistémicos y también locales (Nathan, "Secretory products of macrophages", J. Clin. Invest. 79: 319-326, 1987). La gravedad del proceso inflamatorio local puede ser extrema a causa de la magnitud de la inoculación microbiana o la virulencia microbiana, por lo que los mediadores autocrinos o paracrinos normales de la inflamación llegan a tener un efecto sistémico. La diseminación sistémica de patógenos o de mediadores de la inflamación da lugar a la respuesta del huésped denominada "sepsis".

La interleucina 1 (IL-1) es una citocina liberada por el macrófago, que puede resultar sistémicamente diseminada y provocar una respuesta sistémica al daño o la infección locales. La IL-1, cuando es localmente liberada, se difunde por la circulación, desde donde es finalmente llevada al hipotálamo. Allí, actúa para estimular la producción de prostaglandina E, que actúa como un mediador inflamatorio y un pirógeno endógeno. Se sabe que IL-1 provoca una diversidad de otras respuestas sistémicas: moviliza neutrófilos, estimula la producción de complementos y proteínas de fase aguda en el hígado, e interacciona con el factor de necrosis tumoral (TNF) para amplificar los efectos de éste (Dinarello, "Interleukin-1", Rev. Infec. Disease 6: 51-94, 1984). La IL-1 interacciona además con otras citocinas y factores de crecimiento mediando, por ejemplo, en los cambios en IGF provocados por la sepsis y en los cambios concomitantes en la síntesis de proteínas musculares [Lang et al., "IL-1 receptor antagonist attenuates sepsis-induced alterations in the IGF system and protein synthesis", Am. J. Physiol. 270 (3 Pt 1): E430-437, 1996; Lang et al., "Role of central IL-1 in regulating peripheral IGF-I during endotoxemia and sepsis", Am. J. Physiol. 272 (4 Pt 2): R956-962, 1998]. La IL-1 es también responsable de los aumentos en los niveles de TNF, niveles de IL-6 y niveles de eicosanoides circulantes [Slotman et al., "Interleukin-1 mediates increased plasma levels of eicosanoids and cytokines in patients with sepsis syndrome", SOC 4 (5): 318-323, 1995; Slotman et al., "Unopposed interleukin-1 is necessary for increased plasma cytokine and eicosanid levels to develop in severe sepsis", Ann. Surg. 226 (1): 77-84, 1997].

En la técnica anterior se describe además un vínculo entre el polimorfismo de TaqI en IL-1beta y un polimorfismo de repetición en tándem en el exón 2 de IL-1RA y la susceptibilidad a la sepsis [Fang et al., "Genomic polymorphisms of the interleukin-1 gene family in patients suffering from severe sepsis", Anesthesiology (Hagerstown) 87 (S3): A264, 1997; Fang et al., "IL-1RA genomic polymorphism associated with susceptibility to and outcome of severe sepsis", Acta Anaesthesiologica Scandinavica 40 (S109): 236, 1996].

En los Documentos EP 0769560, WO 98/15653 y WO 98/40517 se describen cebadores y sondas adecuados para detectar polimorfismos de la familia génica de la interleucina 1. Sin embargo, no se describe un vínculo de estos polimorfismos con la sepsis grave.

Cuando los efectos sistémicos de la respuesta de defensa del huésped acompañan a una invasión microbiana, el estado es denominado "sepsis". No existen definiciones estándares para términos tales como sepsis, septicemia, síndrome séptico y respuesta séptica. La mayoría de las connotaciones de estos términos les asocian con una infección sistémica grave. Tradicionalmente, se pensó que los agentes dañinos más comunes eran bacterias Gram negativas; se ha observado más recientemente que los pacientes pueden tener respuestas características de sepsis sin un microbio provocador claramente identificable. De este modo, el término sepsis ha venido a asociarse con cualquier respuesta sistémica a una infección abrumadora u otro daño grave [Kelly et al., "Is circulating endotoxin the trigger for the systemic inflammatory response syndrome seen after injury?", Ann. Surg. 225 (5): 530-541; discusión: 542-543, 1997].

La expresión "síndrome de respuesta inflamatoria sistémica" (SIRS; del inglés, systemic inflammatory response sindrome) ha sido aplicada a un conjunto de respuestas coherentes con lo que se entiende habitualmente como sepsis (American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference, "Definition for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis", Crit. Care Med. 20: 864, 1992). Los elementos de este síndrome giran alrededor de ciertos hallazgos clínicos, incluyendo la temperatura, la frecuencia cardíaca, el índice respiratorio o PaCO2 y la cuenta de glóbulos blancos. Se han aplicado criterios de SIRS a estudios futuros considerando el pronóstico de pacientes con diagnósticos relacionados con sepsis.

Ciertos autores piensan que los criterios de SIRS son demasiado amplios para que tengan valor clínico. En un estudio se siguió a 1101 pacientes admitidos en unidades de cuidados intensivos, y se halló que aproximadamente la mitad de las admisiones presentaban manifestaciones de SIRS, el 16% presentaba resultados coherentes con una sepsis establecida, el 5% presentaba resultados consistentes con una sepsis grave y el 6% estaba en un estado de choque séptico. Salvo et al., "The Italian SEPSIS study: preliminary results on the incidence and evolution of SIRS, sepsis, severe sepsis, and septic shock", Intensive Care Med. 21 (Supl. 2): S244-249, 1995. Los índices de mortalidad aumentan con la gravedad de los elementos sépticos: aproximadamente la cuarta parte de los pacientes con SIRS murieron, 36% con sepsis, 52% con sepsis grave y 81% con choque séptico. La mortalidad tardía después de la sepsis y el choque séptico es igualmente mala, sobreviviendo sólo el 30% durante el primer año después de la admisión hospitalaria [Schoenberg et al., "Outcome of patients with sepsis and shock after ICU treatment", Langenbecks Arch. Surg. 383 (1): 44-48, 1998].

El estudio de Salvo introdujo un conjunto de gradaciones en la gravedad inflamatoria que era comparable con el sistema de graduación propuesto por Siegel et al. en la bibliografía quirúrgica previa (Siegel et al., "Physiologic and metabolic correlations in human sepsis", Surg. 86: 163-193, 1979). De acuerdo con el sistema de Siegel, el grado de la respuesta séptica se evalúa de acuerdo con cuatro criterios: parámetros cardíacos hiperdinámicos, resistencia vascular periférica reducida, diferencia arteriovenosa de oxígeno reducida y niveles séricos de ácido láctico anormales. En este sistema de graduación, la Fase A se caracteriza por una respuesta de estrés fisiológica, la Fase B representa una respuesta de estrés exagerada, la Fase C es el inicio del choque séptico, y la Fase D es una insuficiencia de bajo rendimiento y un choque establecido. Los pacientes concretos no necesariamente progresan secuencialmente de una fase a otra. Un paciente puede descompensarse de la Fase A a la Fase C sin intervalo a la Fase B. Alternativamente, con la tecnología moderna, un paciente puede ser mantenido en la Fase B durante un periodo prolongado, ajustando la fase para un número de secuelas relacionadas con la sepsis, tal como una insuficiencia orgánica múltiple, aun cuando no haya sobrevenido un choque claro. Sería deseable identificar aquellos pacientes que tuvieran mayor probabilidad de que su curso séptico fuera progresivo. Esto permitiría que se dirigieran terapias precoces y agresivas a aquellos pacientes que se enfrentan a los pronósticos más terribles [K.D. Horn, "Evolving strategies in the tretament of sepsis and systemic inflammatory response syndrome (SIRS)", QJM 91 (4): 265-277, 1998]. Similarmente, si es probable que un paciente permanezca en una Fase B prolongada, se pueden instaurar medidas de soporte en las fases tempranas para anticiparse a las consecuencias de la insuficiencia orgánica múltiple.

Se han propuesto hipótesis alternativas para explicar el progreso de la sepsis y la aparición de secuelas relacionadas con la sepsis que pueden ser tan letales como el choque séptico de la Fase D. Una hipótesis sugiere que el defecto primario en la sepsis es un daño mitocondrial por el que las mitocondrias son incapaces de metabolizar el oxígeno y sustratos relacionados (Mela et al., "Defective oxidative metabolism of rat liver mitochondria in hemorrhagic and endotoxin shock", Am. J. Physiol. 220: 571-580, 1971). Una segunda hipótesis se centra en el paralelismo entre la respuesta séptica sistémica y la respuesta local a una infección y un daño tisulares. Esta hipótesis viene apoyada por una amplia recopilación de bibliografía experimental y clínica. De acuerdo con este punto de vista, la activación sistémica del complemento y la activación sistémica de macrófagos conducen a la activación sistémica de neutrófilos, en analogía con los comportamientos locales interrelacionados del complemento, los macrófagos y los neutrófilos (Schirmer et al., "Complement activation produces hemodynamic changes characteristic of sepsis", Arch. Surg. 123: 316-321, 1989; Schirmer et al., "Recombinant human TNF produces hemodynamic changes characteristic of sepsis and endotoxemia", Arch. Surg. 124: 445-448, 1989).

Cuando los neutrófilos son sistémicamente activados, sus acciones son difusas y sin encauzar. La activación sistémica de neutrófilos también acarrea una marginación difusa de neutrófilos. En esta situación, los neutrófilos atacan al endotelio de los vasos por todo el cuerpo y ejercen sus efectos en todos los tejidos con que se encuentran. El resultado de la secreción de productos de neutrófilos es un daño endotelial, lo que conduce a una permeabilidad vascular aumentada. Conforme los neutrófilos atacan al endotelio y entran en los tejidos, también liberan radicales oxigenados libres y enzimas lisozimales que contribuyen a una respuesta inflamatoria sistémica. La liberación de estos productos en la corriente sanguínea cataliza más respuestas sistémicas. La entrada de neutrófilos en tejidos locales previamente no afectados por la infección permite que tenga lugar un daño tisular diseminado.

El daño endotelial procedente de los productos secretados de neutrófilos activados da además lugar a la activación de plaquetas y a la inducción de la cascada de coagulación [Sutton et al., "Endothelial structural integrity is maintained during endotoxic shock in an interleukin-1 type 1 receptor knockout mouse", Shock 7 (2): 105-110, 1997]. Inmediatamente después, se libera tromboxano A2. Como resultado de estos procesos, se forman tapones en el sistema microvascular a partir de la combinación de neutrófilos, plaquetas y fibrina. Estos tapones, combinados con los efectos vasoconstrictores del tromboxano, causan una isquemia tisular focal [Chang et al., "Interleukin-1 in ischemia-reperfusion acute lung injury", Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (4 Pt 1): 1230-1234, 1997]. La isquemia focal en los tejidos conduce a una necrosis focal [L. B. Hinshaw, "Sepsis/septic shock: participation of the microcirculation: an abbreviated review", Crit. Care Med. 24 (6): 1072-1078, 1996]. Aquí se presenta una paradoja fisiológica, y es que existe isquemia microcirculatoria a pesar de la presencia de una circulación hiperdinámica.

A su vez, la necrosis tisular proporciona, tanto local como distantemente, un estímulo para más inflamación. La rápida evolución de estos procesos puede conducir al progreso de la sepsis de Fase C a la sepsis de Fase D, con una consecuencia fatal común. Alternativamente, si se prolonga la sepsis de Fase B en presencia de estos procesos microcirculatorios, la necrosis tisular focal pero diseminada puede extenderse hasta culminar en una insuficiencia orgánica múltiple.

Se entiende que la respuesta inflamatoria sistémica tiene efectos beneficiosos como parte del sistema inmune del huésped [Ertel et al., "Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic patients", Blood 85 (5): 1341-1347, 1995]. Se ha identificado la liberación de citocinas después de procedimientos quirúrgicos: el trauma operativo más grave ocasiona la liberación más extensa [Pruitt et al., "Interleukin-1 and interleukin-1 antagonist (IL-1RN) in sepsis, systemic inflammatory response syndrome and septic shock", Shock 3: 235-251, 1995]. Por el contrario, una respuesta defectuosa en cuanto a la producción de citocinas puede conducir a una respuesta inmune inadecuada frente al estrés o el daño infeccioso [Samson et al., "Elevated interleukin-1 receptor antagonist levels in pediatric sepsis syndrome", J. Pediatr. 131 (4): 587-591, 1997]. Se ha hallado que, por ejemplo, los neonatos con sepsis presentan niveles menores de IL-1 sérica y niveles mayores de IL-1RN con respecto a los testigos normales. [Atici et al., "Serum interleukin-1 beta in neonatal sepsis", Acta Pediatr. 85 (3): 371-374, 1996; de Bont et al., "Increased plasma concentrations of interleukin-1 receptor antagonist in neonatal sepsis", Pediatr. Res. 37 (5): 626-629, 1995].

Por lo tanto, es deseable identificar a aquellas personas cuyos sistemas de retroalimentación inmune de interleucinas les hacen más vulnerables a una sepsis abrumadora, inicialmente oculta. Sin embargo, se reconoce además que una respuesta inflamatoria sistémica excesivamente enérgica comprende los patrones de sepsis que culminan en procesos desastrosos tales como coagulación intravascular diseminada (DIC; del inglés, disseminated intravascular coagulation), insuficiencia orgánica múltiple y colapso cardiovascular. Aikawa ha denominado "tormenta de citocinas" a la excesiva producción de citocinas que culmina en esta reacción autoinflamatoria generalizada [N. Aikawa, "Cytokine storm in the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome associated with surgical insults", Nippon Geka Gakkai Zasshi 97 (9): 771-777, 1996]. Sería clínicamente útil identificar a los pacientes con un riesgo elevado de respuesta inflamatoria exagerada, quienes, por lo tanto, pueden ser propensos a sus indeseables secuelas.

El conocimiento actual ha destacado el papel desempeñado por diversas citocinas en la inflamación sistémica [Blackwell y Christman, "Sepsis and cytokines: current status", Br. J. Anaesth. 77 (1): 110-117, 1996]. Por ejemplo, se ha vinculado la producción excesiva de IL-1 con el desarrollo de hipotensión, choque, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (ARDS; del inglés, adult respiratory distress syndrome), insuficiencia orgánica múltiple, anormalidades hematológicas y muerte en pacientes y animales experimentales con sepsis (Pruitt et al., supra). La IL-1 y el TNF han sido implicados en la producción de las alteraciones metabólicas halladas en la sepsis y el daño [Ling et al., "Differential effects on interleukin-1 receptor antagonist in cytokine- and endotoxin-treated rats", Am. J. Physiol. 268 (2 Pt 1): E255-261, 1995]. Similarmente, se ha hallado que los pacientes traumatizados presentan niveles elevados de mediadores inflamatorios, consistentes con las características clínicas de la inflamación en estos estados [Endo et al. "Plasma levels of interleukin-1 receptor antagonist (IL-lra) and severity of illness in patients with burns", J. Med. 27 (1-2): 57-71, 1996]. Las citocinas, particularmente IL-1 y TNF, son identificadas como coordinando la cascada de interacciones entre leucocitos y células endoteliales que da lugar a los tipos de daño tisular anteriormente discutidos como característicos de la sepsis [Shanley et al., "The role of cytokines and adhesion molecules in the development of inflammatory injury", Mol. Med. Today 1 (1): 40-45, 1995]. Se entiende que la presencia de trombina estimula la producción adicional de IL-1 y TNF, perpetuándose de este modo los ciclos de trombosis y DIC que pueden acompañar a la sepsis. [Hoffman y Cooper, "Thrombin enhances monocyte secretion of tumor necrosis factor and interleukin-1 beta by two distinct mechanisms", Blood Cells Mol. Dis. 21 (2): 156-167, 1995; Gando et al., "Cytokines, soluble thrombomodulin and disseminated intravascular coagulation in patients with systemic inflammatory response syndrome" Thromb. Res. 80(6): 519-526, 1995].

En muchos planteamientos actuales para tratar la sepsis y sus secuelas se intenta modular las interacciones citocínicas dentro de la cascada inflamatoria. Puesto que IL-1 y TNF han sido identificados como factores circulantes que integran y perpetúan estos efectos, se pueden diseñar terapias destinadas a antagonizar los efectos de estos agentes, para que tengan utilidad clínica en la mejora de las secuencias implicadas en la sepsis. Por ejemplo, la IL-1 ha sido identificada por desempeñar un papel importante en el choque séptico y la sepsis estreptocócica del Grupo B en el recién nacido; se sugiere que el tratamiento con IL-1-RN puede mejorar las alteraciones cardiovasculares asociadas con esta enfermedad en la población de recién nacidos [Vallette et al., "Effect of an interleukin-1 receptor antagonist on the hemodynamic manifestations of group B streptococcal sepsis", Pediatr. Res. 38 (5): 704-708, 1995]. Sin embargo, otros datos sugieren que puede que los inhibidores específicos de citocinas no sean eficaces a la hora de modular la inflamación provocada por productos bacterianos Gram negativos [Paris et al, "Effect of interleukin-1 receptor antagonist and soluble tumor necrosis factor receptor in animal models of infection", J. Infect. Dis. 171 (1): 161-169, 1995]. Por lo tanto, sería útil identificar a aquellas enfermedades en que es probable que funcione una modificación citocínica y aquéllas en que es probable que ésta resulte ineficaz o peligrosa.

Además, sería clínicamente ventajoso identificar aquellos pacientes con sepsis en quienes con estrategias de intervención tempranas se pudieran prever complicaciones potencialmente devastadoras. Por ejemplo, se han identificado niveles elevados de IL-1 como marcadores de mal pronóstico en pacientes con ARDS, un proceso concomitante común de la sepsis [Meduri et al., "Persistent elevation of inflammatory cytokines predicts a poor outcome in ARDS. Plasma IL-1 beta and IL-6 levels are consistent and efficient predictors of outcome over time", Chest 107 (4): 1062-1073, 1995]. La determinación de si un paciente cae en el subgrupo destinado a un mal resultado puede motivar al clínico a emprender terapias precoces y quizás más ambiciosas para el ARDS, tal como, por ejemplo, un tratamiento precoz con glucocorticoides o el empleo precoz de un oxigenador extracorpóreo de membrana [Headley et al, "Infections and the inflammatory response in acute respiratory distress syndrome", Chest 111 (5): 1306-1321, 1997; Bonten et al, "The systemic inflammatory response in the development of ventilator-associated pneumonia", Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (4 Pt 1): 1105-1113, 1997]. Similarmente, un paciente con riesgo elevado de malos resultados puede ser digno de un tratamiento precoz, agresivo, continuo y/o múltiple con antibióticos [Mercer-Jones et al., "Continuous antibiotic treatment for experimental abdominal sepsis: effects on organ inflammatory cytokine expression and neutrophil sequestration", Br. J. Surg. 85 (3): 385-389, 1998]. Se pueden prescribir esteroides para tratar la respuesta inflamatoria global en aquellos pacientes que son identificados como superreactores de la inflamación [Jones y Lowes, "The systemic inflammatory response syndrome as a predictor of bacteraemia and outcome from sepsis", QJM 89 (7): 515-522, 1996; Lefering y Neugebauer, "Steroid controversy in sepsis and septic shock: a meta-analysis", Crit. Care Med. 23 (7): 1294-1303, 1995]. La plasmaféresis puede ser apropiada para separar los elementos inflamatorios de la corriente sanguínea de pacientes sépticos que son propensos a una respuesta inflamatoria exagerada [Haupt et al, "Selective cytokine release induced by serum and separated plasma from septic patients", Eur. J. Surg. 162 (10): 769-776, 1996; B. G. Stegmayr, "Plasmapheresis in severe sepsis or septic shock", Blood Purif. 14 (1): 94-101,1996]. La manipulación del sistema del complemento puede proporcionar una estrategia adicional para tratar al paciente con una respuesta inflamatoria grave en la sepsis [M. Kirschfink, "Controlling the complement system in inflammation", Immunopharmacology 38 (1-2): 51-62, 1997], o la toma de conciencia de la carga inflamatoria adicional impuesta por la cirugía en ciertos pacientes sépticos puede proporcionar además al clínico información acerca del espaciamiento temporal de las intervenciones quirúrgicas en caso de sepsis y orientará al clínico en las posibles formas de terapia adyuvante.

El reconocimiento de estas posibles implicaciones de la liberación de citocinas en cuanto al pronóstico y la terapia ha conducido a investigadores y clínicos a medir los niveles de citocinas e intentar correlacionar estos con situaciones clínicas [van der Poll et al, "Anti-inflammatory cytokine responses during clinical sepsis and experimental endotoxemia: sequential measurements of plasma soluble interleukin (IL)-1 receptor type II, IL-10, and IL-13", J. Infect. Dis. 175 (1): 118-122, 1997]. Por ejemplo, se ha medido e nivel de IL-1ra en neonatos de alto riesgo y se ha advertido que está elevado uno o más días antes del inicio de la sepsis clínica [H. Kuester et al. (1998), The Lancet 352: 1271-1277]. Desafortunadamente, bajo circunstancias clínicas variables, ha habido una acusada variabilidad en los datos. Por ejemplo, durante el desarrollo de una insuficiencia orgánica y muerte como resultado de una sepsis intraabdominal, los niveles de mediadores proinflamatorios y de sus antagonistas endógenos varían considerablemente [Wakefield et al., "Proinflammatory mediator activity, endogenous antagonists and the systemic inflammatory response in intra-abdominal sepsis. Scottish Sepsis Intervention Group", Br. J. Surg. 85 (6): 818-825, 1998]. Algunos autores hallan que los niveles de IL-1 se correlacionan positivamente con un mal pronóstico en la sepsis [Thijs y Hack, "Time course of cytokine levels in sepsis", Intensive Care Med. 21 (Supl. 2): S258-263, 1995], mientras que otros no encuentran esta correlación [Goldie et al., "Natural cytokine antagonists and endogenous antiendotoxin core antibodies in sepsis syndrome", JAMA 274 (2): 172-177, 1995].

Genética del grupo génico de IL-1

El grupo génico de IL-1 se encuentra en el brazo largo del cromosoma 2 (2q13) y contiene al menos tres genes para IL-1\alpha (IL-1A), IL-l\beta (IL-1B) y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RN) dentro de una región de 430 Kb [Nicklin et al. (1994), Genomics 19: 382-4]. Las moléculas agonistas, IL-1\alpha e IL-l\beta, presentan una potente actividad proinflamatoria y están a la cabeza de muchas cascadas inflamatorias. Sus acciones, a menudo a través de la inducción de otras citocinas, tales como IL-6 e IL-8, conducen a la activación y el reclutamiento de leucocitos en el tejido dañado, producción local de agentes vasoactivos, respuesta febril en el cerebro y respuesta hepática de fase aguda. Las tres moléculas de IL-1 se unen a receptores de tipo I y tipo II de IL-1, pero sólo el receptor de tipo I transduce una señal al interior de la célula. Por contraste, el receptor de tipo II se desprende de la membrana celular y actúa como un receptor señuelo. Por lo tanto, tanto el antagonista del receptor como el receptor de tipo II presentan acciones antiinflamatorias.

La producción inapropiada de IL-1 desempeña un papel central en la patología de muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluyendo la artritis reumatoide, el trastorno inflamatorio intestinal, la psoriasis y similares. Además, entre los individuos, hay diferencias estables en las velocidades de producción de IL-1, y parte de esta variación puede ser explicada mediante diferencias genéticas en los loci de los genes de IL-1. De este modo, los genes de IL-1 son unos candidatos razonables para determinar parte de la susceptibilidad genética a las enfermedades inflamatorias, la mayoría de las cuales tienen una etiología multifactorial con un componente poligénico.

Se sabe que ciertos alelos del grupo génico de IL-1 están asociados con estados morbosos concretos. Por ejemplo, se ha mostrado que el alelo 2 de IL-1RN [número variable de repeticiones en tándem (VNTR; del inglés, variable number of tandem repeats)] está asociado con la osteoporosis (Patente de EE.UU. nº 5.698.399), la nefropatía en la diabetes mellitus [Blakemore et al. (1996) Hum. Genet. 97 (3): 369-74], la alopecia areata [Cork et al. (1995), J. Invest. Dermatol. 104 (5 Supl.): 15S-16S; Cork et al. (1996), Dermatol. Clin. 14: 671-8], la enfermedad de Graves [Blakemore et al. (1995), J. Clin. Endocrinol. 80 (1): 111-5], el lupus eritematoso sistémico [Blakemore et al. (1994), Arthritis Rheum. 37: 1380-85], el liquen escleroso [Clay et al. (1994), Hum. Genet. 94: 407-10] y la colitis ulcerosa [Mansfield et al. (1994), Gastroenterol. 106 (3): 637-42].

Además, se ha hallado que el alelo 2 del marcador -889 de IL-1A y el alelo 2 del marcador +3954 de IL-1B (TaqI) están asociados con la enfermedad periodontal [Patente de EE.UU. nº 5.686.246; Kornman y di Giovine (1998), Ann. Periodont. 3: 327-38; Hart y Kornman (1997), Periodontol. 2000 14: 202-15; Newman (1997), Compend. Contin. Educ. Dent. 18: 881-4; Kornman et al. (1997), J. Clin. Periodontol. 24: 72-77]. También se ha hallado que el alelo 2 del marcador -889 de IL-1A está asociado con la artritis juvenil crónica, particularmente con la iridociclitis crónica [McDowell, et al. (1995), Arthritis Rheum. 38: 221-28]. También se ha hallado que el alelo 2 del marcador +3954 de IL-1B (TaqI) está asociado con la psoriasis y la diabetes dependiente de insulina en pacientes DR3/4 [di Giovine et al. (1995), Cytokine 7: 606; Pociot et al. (1992), Eur. J. Clin. Invest. 22: 396-402]. Además, se ha hallado que el alelo 1 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la retinopatía diabética (véanse los Documentos USSN 09/037472 y PCT/GB97/02790). Además, se ha hallado que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la colitis ulcerosa en poblaciones caucásicas de América del Norte y Europa [J. Mansfield et al. (1994), Gastroenterology 106: 637-42]. Es interesante advertir que esta asociación es particularmente acusada dentro de las poblaciones de judíos asquenacíes étnicamente relacionados (Documento PCT WO97/25445).

Exploración de genotipos

Los métodos tradicionales para la exploración de enfermedades heredables han dependido de la identificación de productos génicos anormales (por ejemplo, la anemia de células falciformes) o de un fenotipo anormal (por ejemplo, el retraso mental). Estos métodos tienen una utilidad limitada para enfermedades heredables de inicio tardío y para fenotipos no fácilmente identificables, tal como, por ejemplo, la enfermedad vascular. Con el desarrollo de una metodología de exploración genética sencilla y barata, ahora es posible identificar polimorfismos que señalan una propensión a desarrollar una enfermedad, incluso cuando la enfermedad es de origen poligénico. El número de enfermedades que pueden ser exploradas mediante métodos biológicos moleculares continúa creciendo al aumentar la comprensión de la base genética de los trastornos multifactoriales.

La exploración genética (también llamada genotipaje o exploración molecular) puede ser definida en términos generales como un ensayo para determinar si un paciente tiene mutaciones (o alelos o polimorfismos) que causan un estado morboso o que están "ligadas" a la mutación que causa un estado morboso. El ligamiento se refiere al fenómeno por el que secuencias de DNA que están muy próximas en el genoma presentan una tendencia a ser conjuntamente heredadas. Dos secuencias pueden estar ligadas a causa de cierta ventaja selectiva de la herencia conjunta. Sin embargo, más típicamente, dos secuencias polimórficas son conjuntamente heredadas a causa de la relativa infrecuencia con que tienen lugar procesos de recombinación meiótica dentro de la región situada entre los dos polimorfismos. Se dice que los alelos polimórficos conjuntamente heredados están en desequilibrio de ligamiento entre sí porque, en una población humana dada, tienden a presentarse juntos o no se presentan en absoluto en ningún miembro concreto de la población. En realidad, cuando se halla que múltiples polimorfismos están en desequilibrio de ligamiento entre sí en una región cromosómica dada, aquellos definen un "haplotipo" genético cuasiestable. Por contraste, los procesos de recombinación que tienen lugar entre dos loci polimórficos causan la separación de estos en cromosomas homólogos distintos. Si tiene lugar bastante frecuentemente una recombinación meiótica entre dos polimorfismos físicamente ligados, parecerá que los dos polimorfismos se segregan independientemente y de ellos se dice que están en equilibrio de ligamiento.

Aunque la frecuencia de recombinación meiótica entre dos marcadores es generalmente proporcional a la distancia física entre ellos en el cromosoma, la aparición de "puntos calientes" así como de regiones de recombinación cromosómica reprimida puede dar lugar a discrepancias entre las distancias física y recombinacional entre los dos marcadores. De este modo, en ciertas regiones cromosómicas, múltiples loci polimórficos que abarcan un amplio dominio cromosómico pueden estar en desequilibrio de ligamiento entre sí y definir por ello un haplotipo genético de amplia abarcadura. Además, cuando una mutación causativa de enfermedad se halla dentro de este haplotipo o en ligamiento con él, se pueden utilizar uno o más alelos polimórficos del haplotipo como un indicador de diagnóstico o pronóstico de la probabilidad de que se desarrolle la enfermedad. Esta asociación entre polimorfismos por lo demás benignos y un polimorfismo causativo de enfermedad tiene lugar si la mutación morbosa surgió en el pasado reciente, por lo que no ha transcurrido el tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio a través de procesos de recombinación. Por lo tanto, la identificación de un haplotipo humano que abarca, o está ligado a, un cambio mutacional causativo de enfermedad sirve como una medida pronosticadora de la probabilidad de que un individuo haya heredado esa mutación causativa de enfermedad. Es importante reseñar que dichos procedimientos de pronóstico o diagnóstico pueden ser utilizados sin que se necesite la identificación ni el aislamiento de la lesión real causativa de la enfermedad. Esto es significativo porque la determinación precisa del defecto molecular implicado en un proceso morboso puede ser difícil y laboriosa, especialmente en el caso de enfermedades multifactoriales tales como los trastornos
inflamatorios.

En realidad, la correlación estadística entre un trastorno inflamatorio y un polimorfismo de IL-1 no indica necesariamente que el polimorfismo causa directamente el trastorno. En vez de ello, el polimorfismo correlacionado puede ser una variante alélica benigna que esté ligada a (es decir, esté en desequilibrio de ligamiento con) una mutación causativa de trastorno que haya tenido lugar en el pasado evolutivo humano reciente, por lo que no ha transcurrido el tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio a través de procesos de recombinación en el segmento cromosómico comprometido. De esta manera, para los fines de ensayos de diagnóstico y pronóstico para una enfermedad concreta, se puede utilizar la detección de un alelo polimórfico asociado con esa enfermedad sin tener en cuenta si el polimorfismo está directamente implicado en la etiología de la enfermedad. Además, cuando un locus polimórfico benigno dado está en desequilibrio de ligamiento con un evidente locus polimórfico causativo de enfermedad, también es probable que aún otros loci polimórficos que están en desequilibrio de ligamiento con el locus polimórfico benigno estén en desequilibrio de ligamiento con el locus polimórfico causativo de enfermedad. De este modo, estos otros loci polimórficos servirán de pronóstico o diagnóstico de la probabilidad de que se haya heredado el locus polimórfico causativo de enfermedad. En realidad, se puede focalizar un haplotipo humano de amplia abarcadura (que describa el patrón típico de herencia conjunta de alelos de un conjunto de marcadores polimórficos ligados) con fines diagnósticos una vez que se haya trazado una asociación entre una enfermedad o estado particular y un correspondiente haplotipo humano. De esta manera, se puede realizar la determinación de la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad o estado particular, al caracterizar uno o más alelos polimórficos asociados con la enfermedad (o incluso uno o más haplotipos asociados con la enfermedad) sin determinar ni caracterizar necesariamente la variación genética causativa.

Se necesita un medio para medir la propensión de un paciente a una respuesta inflamatoria exagerada como un indicador de su respuesta a estímulos sépticos.

2. Sumario del invento

En un aspecto, el invento presenta ensayos para determinar la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar sepsis o para pronosticar la rapidez y/o la progresión última de la sepsis en ese sujeto. En una realización, el método comprende la operación de genotipar una muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto para determinar si el DNA del sujeto contiene al menos un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada. En una realización preferida, el patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada es un patrón 2 de IL-1. En otra realización preferida, se detecta el alelo de un patrón genético de IL-1 mediante uno de los métodos siguientes: 1) llevar a cabo una reacción de hibridación entre la muestra de ácido nucleico y una sonda o sondas que son capaces de hibridarse con un alelo particular del sujeto; 2) secuenciar al menos una porción de al menos un alelo; y 3) determinar la movilidad electroforética de al menos un alelo. En otra realización preferida, un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada es sometido a una operación de multiplicación antes de la realización de la operación de detección. Las operaciones de multiplicación preferidas son seleccionadas del grupo que consiste en: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), la reacción en cadena de la ligasa (LCR; del inglés, ligase chain reaction), la multiplicación por desplazamiento de cadenas (SDA; del inglés, strand displacement amplification), la clonación, y variaciones de las operaciones anteriores [por ejemplo, transcripción inversa (RT; del inglés, reverse transcription)-PCR y multiplicación específica de alelos]. En una realización particularmente preferida, la muestra es hibridada con un conjunto de cebadores que se hibridan en 5' y 3' con una secuencia sentido o antisentido de un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada, y es sometida a una multiplicación por PCR.

En otro aspecto, el invento presenta sistemas para llevar a cabo los ensayos anteriormente descritos. El sistema puede incluir medios para la recogida de muestras de DNA y un medio para determinar al menos un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada del sujeto. El sistema puede también comprender muestras testigo o patrones.

La información obtenida al utilizar los ensayos y sistemas aquí descritos (sola o junto con información de otro defecto genético o factor ambiental que contribuye a la sepsis) es útil para pronosticar si es probable que un sujeto desarrolle sepsis. Además, la información sola o junto con información de otro defecto genético que contribuye a la sepsis (el perfil genético de la sepsis) permite la adaptación de la terapia para la sepsis al perfil genético del individuo. Por ejemplo, esta información puede permitir que un doctor: 1) prescriba más eficazmente un fármaco que se dirigirá a la base molecular de la cascada que da lugar a la sepsis, y 2) determine mejor la dosificación apropiada de un fármaco particular para la sepsis, para un paciente particular.

La capacidad para centrarse en poblaciones de pacientes en las que se espera obtener el mayor beneficio clínico puede permitir: 1) la redisposición de fármacos comercializados con resultados comerciales decepcionantes; 2) el rescate de candidatos farmacológicos cuyo desarrollo clínico ha sido interrumpido como resultado de limitaciones de seguridad o eficacia, que son específicos de un subgrupo de pacientes; y 3) un desarrollo acelerado y menos costoso de candidatos farmacológicos y una marcación de fármacos más óptima.

En un aspecto más, el invento presenta métodos para tratar o prevenir el desarrollo de sepsis en un sujeto al administrar un producto terapéutico apropiado del invento al sujeto. En aún otro aspecto, el invento proporciona ensayos in vitro o in vivo para explorar compuestos de prueba, para identificar productos terapéuticos para la sepsis.

Otras características y ventajas del invento resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y las reivindicaciones.

3. Descripción detallada del invento 3.1 Definiciones

Por conveniencia, se proporcionan a continuación los significados de ciertos términos y frases empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas.

La expresión "actividad aberrante", según se aplica a una actividad de un polipéptido tal como IL-1, se refiere a una actividad que difiere de la actividad de un polipéptido nativo o que difiere de la actividad del polipéptido en un sujeto sano. Una actividad de un polipéptido puede ser aberrante porque es más intensa que la actividad de su pareja nativa. Alternativamente, una actividad puede ser aberrante porque es más débil o está ausente con respecto a la actividad de su pareja nativa. Una actividad aberrante puede ser también un cambio en una actividad. Por ejemplo, un polipéptido aberrante puede interaccionar con un péptido diana diferente. Una célula puede tener una actividad IL-1 aberrante a causa de una sobreexpresión o una infraexpresión de un gen del locus de IL-1 que codifica un polipéptido del locus de IL-1.

El término "alelo" se refiere a las diferentes variantes secuenciales halladas en diferentes regiones polimórficas. Por ejemplo, IL-1RN (VNTR) tiene al menos cinco alelos diferentes. Las variantes secuenciales pueden ser cambios de una sola base o de múltiples bases, incluyendo, sin limitación, inserciones, deleciones o sustituciones, o pueden ser un número variable de repeticiones secuenciales.

La expresión "patrón alélico" se refiere a la identidad de un alelo o unos alelos en una o más regiones polimórficas. Por ejemplo, un patrón alélico puede consistir en un único alelo en un sitio polimórfico, como es el caso del alelo 1 de IL-1RN (VNTR), que es un patrón alélico que tiene al menos una copia del alelo 1 de IL-1RN en el VNTR de los loci génicos de IL-1RN. Alternativamente, un patrón alélico puede consistir en un estado homocigótico o heterocigótico en un único sitio polimórfico. Por ejemplo, el alelo 2,2 de IL-1RN (VNTR) es un patrón alélico en que hay dos copias del segundo alelo en el marcador VNTR de IL-1RN y que corresponde al estado homocigótico del alelo 2 de IL-1RN (VNTR). Alternativamente, un patrón alélico puede consistir en la identidad de alelos en más de un sitio
polimórfico.

Como se utiliza aquí, con el término "anticuerpo" se pretende referir a un agente ligante que incluye un anticuerpo completo o un fragmento ligante del mismo, que es específicamente reactivo con un polipéptido IL-1B. Los anticuerpos pueden ser fragmentados usando técnicas convencionales, y los fragmentos pueden ser explorados en cuanto a su utilidad de la misma manera que se describió anteriormente para anticuerpos completos. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab)_{2} al tratar un anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)_{2} resultante puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro con objeto de producir fragmentos Fab. Con el anticuerpo del presente invento se pretende además incluir moléculas biespecíficas, de cadena sencilla, y quiméricas y humanizadas que tengan afinidad por un polipéptido IL-1B, conferida por al menos una región determinante de la complementariedad (CDR; del inglés, complementarity determining region) del anticuerpo.

Para los fines presentes, cuando se aplican a IL-1, "actividad biológica" o "bioactividad" o "actividad" o "función biológica", que se usan indistintamente, significan una función efectora o antigénica que es directa o indirectamente llevada a cabo por un polipéptido IL-1 (esté en su conformación nativa o en la desnaturalizada) o por cualquier subsecuencia (fragmento) del mismo. Una actividad biológica puede incluir unión, realización de transducción de señales desde un receptor, modulación de la expresión génica o una función efectora antigénica.

Como se utiliza aquí, la expresión "fragmento bioactivo de un polipéptido IL-1" se refiere a un fragmento de un polipéptido IL-1 de longitud completa, fragmento que reproduce o antagoniza específicamente la actividad de un polipéptido IL-1 de tipo silvestre. El fragmento bioactivo es preferiblemente un fragmento capaz de interaccionar con un receptor interleucínico.

"Células", "células huésped" y "células huésped recombinantes" son expresiones usadas aquí indistintamente para referirse no sólo a la célula objetivo particular sino a la progenie o posible progenie de dicha célula. Puesto que, en generaciones sucesivas, pueden tener lugar ciertas modificaciones debidas a una mutación o a influencias ambientales, puede que dicha progenie no sea idéntica en realidad a la célula originaria, pero aún está incluida dentro del alcance de la expresión como aquí se utiliza.

Una "quimera", un "mosaico", un "mamífero quimérico" y similares se refieren a un mamífero transgénico con una construcción inoperante u operativa en al menos alguna de sus células que contienen genoma.

Las expresiones "testigo" y "muestra testigo" se refieren a cualquier muestra apropiada para la técnica de detección empleada. La muestra testigo puede contener los productos de la técnica empleada para detección de alelos, o el material que se va a analizar. Además, los testigos pueden ser testigos positivos o negativos. A modo de ejemplo, cuando la técnica para detección de alelos es una multiplicación por PCR seguida de fraccionamiento por tamaños, la muestra testigo puede comprender fragmentos de DNA de un tamaño apropiado. Asimismo, cuando la técnica para detección de alelos implica la detección de una proteína mutada, la muestra testigo puede comprender una muestra de una proteína mutante. Sin embargo, se prefiere que la muestra testigo comprenda el material que se va a analizar. Por ejemplo, los testigos pueden ser una muestra de DNA genómico o una porción clonada del grupo génico de IL-1. Sin embargo, cuando la muestra que se va analizar es DNA genómico, la muestra testigo es preferiblemente una muestra muy purificada de DNA genómico.

Las frases "alteración del gen" y "alteración dirigida", o cualquier frase similar, se refieren a la interrupción, específica del sitio, de una secuencia de DNA nativa para evitar la expresión de ese gen en la célula en comparación con la copia de tipo silvestre del gen. La interrupción puede ser causada mediante deleciones, inserciones o modificaciones del gen, o mediante cualquier combinación de las mismas.

Mediante el término "haplotipo", como aquí se utiliza, se quiere referir a un conjunto de alelos que son heredados juntos como un grupo (están en desequilibrio de ligamiento) con niveles estadísticamente significativos (p_{corr} < 0,05). Como aquí se utiliza, la frase "un haplotipo de IL-1" se refiere a un haplotipo en el loci de IL-1.

Como aquí se utiliza, un "agonista de IL-1" se refiere a un agente que reproduce, suprarregula (potencia o complementa) o si no aumenta una bioactividad de IL-1 o una bioactividad de un gen en una ruta biológica de IL-1. Los agonistas de IL-1 pueden actuar sobre cualquiera de una diversidad de niveles diferentes, incluyendo la regulación de la expresión génica de IL-1 en la región promotora, la regulación de mecanismos de corte y empalme de mRNA, la estabilización del mRNA, la fosforilación de proteínas para traslado, la conversión de proIL-1 en IL-1 madura y la secreción de IL-1. Los agonistas que aumentan la síntesis de IL-1 incluyen: lipopolisacáridos, IL-1B, agentes inductores de cAMP, agentes activadores de NF\kappaB, agentes activadores de AP-1, TNF-\alpha, LDL oxidada, productos finales de glicosilación avanzada (AGE; del inglés, advanced glycosilation endproducts), estrés absoluto, hipoxia, hiperoxia, daño por isquemia y reperfusión, histamina, prostaglandina E2 (PGE2), IL-2, IL-3, IL-12, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF; del inglés, granulocyte macrophage-colony stimulating factor), factor estimulador de colonias de monocitos (M-CSF; del inglés, monocyte colony stimulating factor), factor de células madre, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF; del inglés, platelet derived growth factor), complemento C5A, complemento C5b9, productos de la degradación de fibrina, plasmina, trombina, ácido 9-hidroxioctadecanoico, ácido 13-hidroxioctadecanoico, factor activador de plaquetas (PAF; del inglés, platelet activating factor), factor H, ácido retinoico, ácido úrico, pirofosfato de calcio, polinucleósidos, proteína C reactiva, \alpha-antitripsina, antígeno de tabaco, colágeno, integrinas \beta-1, LFA-3, anti-HLA-DR, anti-IgM, anti-CD3, fitohemaglutinina (CD2), sCD23, radiación ultravioleta B, radiación gamma, sustancia P, isoproterenol, metanfetamina y melatonina. Los agonistas que estabilizan el mRNA de IL-1 incluyen la endotoxina bacteriana e IL-1. Otros agonistas que actúan aumentando el número de receptores de tipo 1 de IL-1 disponibles incluyen IL-1, activadores de PKC, dexametasona, IL-2, IL-4 y PGE2. Otros antagonistas preferidos interfieren en, o inhiben, los factores de transducción de señales activados por IL-1 o usados en una ruta de transducción de señales de IL-1 [por ejemplo, NF\kappaB y AP-1, PI3 quinasa, fosfolipasa A2, proteína quinasa C, JNK-1, 5-lipoxigenasa, ciclooxigenasa 2, fosforilación de tirosina, ruta de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS; del inglés, inducible nitric oxide synthase), Rac, Ras y TRAF]. Aún otros agonistas aumentan la bioactividad de genes cuya expresión es inducida por IL-1, e incluyen: IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF-\beta, fibrinógeno, inhibidor del plasminógeno de tipo uroquinasa, inhibidores de tipo 1 y tipo 2 del activador de plasminógeno, selectina P (CD62), receptor de fibrinógeno, CD11/CD18, proteasa nexina 1, CD44, metaloproteinasa 1 de matriz (MMP-1; del inglés, matrix metalloproteinase-1), MMP-3, elastasa, colagenasas, inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 (TIMP-1; del inglés, tissue inhibitor of metalloproteinase-1), colágeno, apolipoproteína CIII que aumenta los niveles de triglicéridos, apolipoproteína, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, selectina L, decorina, factor de células madre, factor inhibidor de la leucemia, IFNa,b,g, L-8, receptor de IL-2, receptor de IL-3, receptor de IL-5, receptor de c-kit, receptor de GM-CSF, ciclooxigenasa 2 (COX-2), fosfolipasa A2 de tipo 2, óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), endotelina-1,3, gamma-glutamil transferasa, Mn-superóxido dismutasa, proteína C reactiva, fibrinógeno, amiloide A sérico, metalotioneínas, ceruloplasmina, lisozima, xantina deshidrogenasa, xantina oxidasa, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), actividad estimuladora del crecimiento de melanomas (gro-a,b,g), factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF-1; del inglés, insulin-like growth factor-1), activina A, pro-opiomelanocorticotropina, factor liberador de corticotropina, precursor del amiloide B, proteína 40 de membrana basal, lamininas B1 y B2, proteína constitutiva p70 de choque térmico, mitógeno P42, proteína quinasa activante, ornitina descarboxilasa, hemo oxigenasa y una subunidad de la proteína
G.

Como aquí se utiliza, un "antagonista de IL-1" se refiere a un agente que infrarregula o si no disminuye una bioactividad de IL-1. Los antagonistas de IL-1 pueden actuar sobre cualquiera de una diversidad de niveles diferentes, incluyendo la regulación de la expresión génica de IL-1 en la región promotora, la regulación de mecanismos de corte y empalme de mRNA, la estabilización del mRNA, la fosforilación de proteínas para traslado, la conversión de proIL-1 en IL-1 madura y la secreción de IL-1. Los antagonistas de la producción de IL-1 incluyen: corticosteroides, inhibidores de lipoxigenasa, inhibidores de ciclooxigenasa, interferón \gamma, IL-4, IL-10, IL-13, factor \beta de crecimiento transformante (TGF-\beta; del inglés, transforming growth factor \beta), inhibidores de ACE, ácidos grasos poliinsaturados n-3, antioxidantes y agentes reductores del nivel lipídico. Los antagonistas que desestabilizan el mRNA de IL-1 incluyen agentes que activan la desadenilación. Los antagonistas que inhiben o evitan la fosforilación de proteínas IL-1 para traslado incluyen compuestos de piridinil-imidazol, tal como tebufelona, y compuestos que inhiben la formación de microtúbulos (por ejemplo, colchicina, vinblastina y vincristina). Los antagonistas que inhiben o evitan la conversión de proIL-1 en IL-1 madura incluyen inhibidores de la enzima conversiva de interleucinas (ICE; del inglés, interleukin converting enzyme), tales como isoformas \varepsilonICE, anticuerpos contra las isoformas \alpha, \beta y \gamma de ICE, CXrm-A, transcrito X, inhibidor competitivo, tetrapeptídico y endógeno de sustratos, tripsina, elastasa, quimotripsina, quimasa y otras proteasas inespecíficas. Los antagonistas que evitan o inhiben la secreción de IL-1 incluyen agentes que bloquean el transporte aniónico. Los antagonistas que interfieren en las interacciones del receptor de IL-1 incluyen: agentes que inhiben la glicosilación del receptor de tipo I de IL-1, oligonucleótidos antisentido contra IL-1RI, anticuerpos contra IL-1RI y oligonucleótidos antisentido contra IL-1RacP. Otros antagonistas, que actúan disminuyendo el número de receptores de tipo 1 de IL-1 disponibles, incluyen TGF-\beta, inhibidores de COX, factores que aumentan los receptores de tipo II de IL-1, dexametasona, PGE2, IL-1 e IL-4. Otros antagonistas preferidos interfieren en, o inhiben, los factores de transducción de señales activados por IL-1 o utilizados en una ruta de transducción de señales de IL-1 (por ejemplo, NF\kappaB y AP-1, PI3 quinasa, fosfolipasa A2, proteína quinasa C, JNK-1, 5-lipoxigenasa, ciclooxigenasa 2, fosforilación de tirosina, ruta de la iNOS, Rac, Ras y TRAF). Aún otros antagonistas interfieren en la bioactividad de genes cuya expresión es inducida por IL-1, e incluyen: IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF-\beta, fibrinógeno, inhibidor del plasminógeno de tipo uroquinasa, inhibidores de tipo 1 y tipo 2 del activador de plasminógeno, selectina P (CD62), receptor de fibrinógeno, CD11/CD18, proteasa nexina 1, CD44, metaloproteinasa 1 de matriz (MMP-1), MMP-3, elastasa, colagenasas, inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 (TIMP-1), colágeno, apolipoproteína CIII que aumenta los niveles de triglicéridos, apolipoproteína, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, selectina L, decorina, factor de células madre, factor inhibidor de la leucemia, IFNa,b,g, L-8, receptor de IL-2, receptor de IL-3, receptor de IL-5, receptor de c-kit, receptor de GM-CSF, ciclooxigenasa 2 (COX-2), fosfolipasa A2 de tipo 2, óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), endotelina-1,3, gamma-glutamil transferasa, Mn-superóxido dismutasa, proteína C reactiva, fibrinógeno, amiloide A sérico, metalotioneínas, ceruloplasmina, lisozima, xantina deshidrogenasa, xantina oxidasa, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), actividad estimuladora del crecimiento de melanomas (gro-a,b,g), factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF-1), activina A, pro-opiomelanocorticotropina, factor liberador de corticotropina, precursor del amiloide B, proteína 40 de membrana basal, lamininas B1 y B2, proteína constitutiva p70 de choque térmico, mitógeno P42, proteína quinasa activante, ornitina descarboxilasa, hemo oxigenasa y una subunidad de la proteína G. Otros antagonistas preferidos incluyen himenialdisina, herbimicinas (por ejemplo, herbimicina A), CK-103A y sus derivados {por ejemplo, 4,6-dihidropiridazino[4,5-c]piridazin-5(1H)-ona}, CK-119, CK-122, indometacina, aflatoxina B1, leptina, heparina, imidazoles bicíclicos (por ejemplo, SB203580), PD15306 HCl, derivados del ácido podocárpico, M-20, péptido 2 humano de tipo glucagón (Gly2), FR167653, derivados esteroides, glucocorticoides, quercetina, teofilina, inhibidores de NO sintetasa, RWJ 68354, eucaliptol (1,8-cineol), magnosalina, N-acetilcisteína, hormona alfa estimuladora de melanocitos (\alpha-MSH; del inglés, \alpha-melanocyte-stimulating hormone), triclosán (éter 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenílico), prostaglandina E2 y 4-aminopiridina, ácido etacrínico y ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico (DIDS), glucosa, lipofosfoglicano, aspirina, agentes bloqueadores del catabolismo, diacereína, agentes moduladores de tioles, zinc, morfina, inhibidores de la biosíntesis de leucotrienos (por ejemplo, MK886), antagonistas del receptor del factor activador de plaquetas (por ejemplo, WEB 2086), amiodarona, tranilast, S-metil-L-tiocitrulina, agonistas de receptores beta-adrenérgicos (por ejemplo, procaterol, clenbuterol, fenoterol y terbutalina), ácido hialurónico, anticuerpos anti-TNF-\alpha, autoanticuerpos anti-IL-1a, antagonistas del receptor de IL-1, quinasa asociada con IL-1R, receptores de TNF solubles y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-13, IL-10, IL-6 y TGF-\beta), angiotensina II, receptor soluble de tipo II de IL-1, receptor soluble de tipo I de IL-1, activador tisular de plasminógeno, proteína A20 con dedos de zinc, péptidos de IL-1 [por ejemplo, Thr-Lys-Pro-Arg (tuftsina), Ile-Thr-Gly-Ser-Glu (de IL-1-alfa), Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Phe y Val-Thr-Asp-Phe-Tyr-Phe], interferón alfa-2b, interferón beta, compuestos análogos a IL-1-beta (por ejemplo, el tripéptido de IL-1-beta: Lys-D-Pro-Thr), IL-1-alfa glicosilada y péptidos de
IL-1ra.

Las expresiones "grupo génico de IL-1" y "loci de IL-1", como se utilizan aquí, incluyen todo el ácido nucleico de, o próximo a, la región 2q13 del cromosoma 2, incluyendo al menos los genes IL-1A, IL-1B e IL-1RN y cualesquier otras secuencias ligadas (Nicklin et al., Genomics 19: 382-84, 1994). Los términos "IL-1A", "IL-1B" e "IL-1RN", como se utilizan aquí, se refieren a los genes que codifican IL-1\alpha, IL-1\beta y el antagonista del receptor de IL-1, respectivamente. Los números de acceso génicos para IL-1A, IL-1B e IL-1RN son X03833, X04500 y X64532, respectivamente.

"Mutación funcional de IL-1" se refiere a una mutación en el grupo génico de IL-1 que da lugar a un fenotipo alterado (es decir, afecta a la función de un gen o proteína IL-1). Los ejemplos incluyen el alelo 2 de IL-1A (+4845), el alelo 2 de IL-1B (+3954), el alelo 1 de IL-1B (-511) y el alelo 1 de IL-1RN (+2018).

"Alelo Y de IL-1X (Z)" se refiere a una forma alélica particular, denominada Y, que se encuentra en un sitio polimórfico del locus de IL-1 en el gen X, en que X es IL-1A, IL-1B o IL-1RN, o algún otro gen de los loci génicos de IL-1, y situada en, o cerca de, el nucleótido Z, en que el nucleótido Z es numerado con respecto al sitio principal de inicio de la transcripción, que es el nucleótido +1, del gen X particular de IL-1. Como adicionalmente se utiliza aquí, la expresión "alelo (Z) de IL-1X" se refiere a todos los alelos de un sitio polimórfico de IL-1 en el gen X, situados en, o cerca de, el nucleótido Z. Por ejemplo, la expresión "alelo de IL-1RN (+2018)" se refiere a formas alternativas del gen IL-1RN en el marcador +2018. "Alelo 1 de IL-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen IL-1RN que contiene una citosina (C) en la posición +2018 de la cadena sentido (Clay et al., Hum. Genet. 97: 723-26, 1996). "Alelo 2 de IL-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen IL-1RN que contiene una timina (T) en la posición +2018 de la cadena positiva. Cuando un sujeto tiene dos alelos de IL-1RN idénticos, se dice que es homocigótico o que tiene el estado homocigótico. Cuando un sujeto tiene dos alelos de IL-1RN diferentes, se dice que es heterocigótico o que tiene el estado heterocigótico. La expresión "alelo 2,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado homocigótico del alelo 2 de IL-1RN (+2018). Por el contrario, la expresión "alelo 1,1 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado homocigótico del alelo 1 de IL-1RN (+2018). La expresión "alelo 1,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado heterocigótico de los alelos 1 y 2.

Con "relacionado con IL-1", como se utiliza aquí, se quiere incluir todos los genes relacionados con los genes humanos del locus de IL-1 situados en el cromosoma 2 humano (2q 12-14). Estos incluyen genes IL-1 del grupo génico humano de IL-1 situado en el cromosoma 2 (2q 13-14), que incluyen: el gen IL-1A que codifica la interleucina 1\alpha, el gen IL-1B que codifica la interleucina 1\beta, y el gen IL-1RN (o IL-1ra) que codifica el antagonista del receptor de la interleucina 1. Además, estos genes relacionados con IL-1 incluyen los genes de los receptores humanos de tipo I y tipo II de IL-1, situados en el cromosoma 2 humano (2q12), y sus compuestos homólogos de ratón, situados en la posición 19,5 cM del cromosoma 1 de ratón. La interleucina 1\alpha, la interleucina 1\beta y la interleucina 1RN están relacionadas en cuanto a que todas se unen a receptores de tipo I de IL-1; sin embargo, sólo la interleucina 1\alpha y la interleucina 1\beta son ligandos agonistas que activan receptores de tipo I de IL-1, mientras que la interleucina 1RN es un ligando antagonista presente en la naturaleza. Cuando el término "IL-1" se usa en referencia a un producto génico o un polipéptido, se quiere referir a todos los productos génicos codificados por el locus de la interleucina 1 situado en el cromosoma 2 humano (2q 12-14) y a sus correspondientes compuestos homólogos de otras especies o sus variantes funcionales. De esta manera, el término "IL-1" incluye polipéptidos secretados que provocan una respuesta inflamatoria, tales como IL-1\alpha e IL-1\beta, así como polipéptidos secretados que antagonizan respuestas inflamatorias, tales como el antagonista del receptor de IL-1 y el receptor de tipo II (señuelo) de
IL-1.

Un "receptor de IL-1" o "IL-1R" se refiere a diversos receptores proteicos unidos a la membrana celular, capaces de unirse a, y/o transducir una señal de, un ligando codificado por el locus de IL-1. La expresión se aplica a cualquiera de las proteínas que son capaces de unirse a moléculas de interleucina 1 (IL-1), y, en su configuración nativa como proteínas de membrana plasmática de mamífero, probablemente desempeñan un papel en la transducción de la señal proporcionada por IL-1 a una célula. Como aquí se utiliza, la expresión incluye compuestos análogos de proteínas nativas con actividad ligante o transductora de señales de IL-1. Los ejemplos incluyen los receptores humanos y murinos de IL-1 descritos en la Patente de EE.UU. número 4.968.607. La expresión "ácido nucleico de IL-1" se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína IL-1.

Con "un polipéptido IL-1" y "una proteína IL-1" se quiere abarcar polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de DNA genómico de IL-1 mostradas en las Figuras 1, 2 y 3, o fragmentos de las mismas, y compuestos homólogos de los mismos, e incluir polipéptidos agonistas y antagonistas.

"Riesgo aumentado" se refiere a una frecuencia estadísticamente mayor de aparición de la enfermedad o el trastorno en un individuo en comparación con la frecuencia de aparición de la enfermedad o el trastorno en una población. Un factor identificado por estar asociado con un riesgo aumentado es denominado "factor de riesgo". Llevar un alelo polimórfico particular es un factor de riesgo para una enfermedad cardiovascular particular, y se asocia con un riesgo aumentado de la enfermedad particular.

Con el término "interaccionar", como se utiliza aquí, se pretende incluir relaciones o asociaciones (por ejemplo, interacciones bioquímicas) detectables entre moléculas, tales como las interacciones entre proteína y proteína, proteína y ácido nucleico, ácido nucleico y ácido nucleico, y proteína y molécula pequeña o ácido nucleico y molécula pequeña en la naturaleza.

El término "aislado", como se utiliza aquí con respecto a ácidos nucleicos tales como DNA y RNA, se refiere a moléculas separadas de otros DNAs o RNAs, respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos IL-1 objetivo incluye preferiblemente no más de 10 kilobases (kb) de la secuencia de ácido nucleico que flanquea natural e inmediatamente el gen IL-1 en el DNA genómico, más preferiblemente no más de 5 kb de dicha secuencia flanqueadora presente en la naturaleza, y muy preferiblemente menos de 1,5 kb de dicha secuencia flanqueadora presente en la naturaleza. El término "aislado", como se utiliza aquí, también se refiere a un ácido nucleico o un péptido que carece sustancialmente de material celular, material vírico o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de DNA recombinante, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Además, con "un ácido nucleico aislado" se quiere incluir fragmentos de ácido nucleico que no están presentes en la naturaleza como fragmentos y no se hallarían en el estado natural. El término "aislado" también se utiliza aquí para referirse a polipéptidos que son aislados de otras proteínas celulares, y con él se pretende abarcar polipéptidos tanto purificados como
recombinantes.

Un animal transgénico "operativo" se refiere a un animal que ha tenido un gen modificado introducido en su genoma, y el gen modificado puede ser de origen exógeno o endógeno.

Un animal transgénico "inoperante" se refiere a un animal en que hay una supresión parcial o completa de la expresión de un gen endógeno (basada, por ejemplo, en la deleción de al menos una porción del gen, la sustitución de al menos una porción del gen por una segunda secuencia, la introducción de codones de parada, la mutación de bases que codifican aminoácidos críticos, la eliminación de un empalme intrónico, etc).

Una "construcción inoperante" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que puede ser utilizada para disminuir o suprimir la expresión de una proteína codificada por secuencias de DNA endógenas en una célula. En un ejemplo sencillo, la construcción inoperante está compuesta de un gen, tal como el gen IL-1RN, con una deleción en una porción crítica del gen de modo que no se puede expresar la proteína activa a partir de él. Alternativamente, se pueden añadir diversos codones de terminación al gen nativo para causar la terminación precoz de la proteína o se puede inactivar un empalme intrónico. En una construcción inoperante típica, cierta porción del gen es sustituida por un marcador seleccionable (tal como el gen neo) de modo que el gen puede ser representado del modo siguiente: IL-1RN 5'/neo/IL-1RN 3', en que IL-1RN 5' e IL-1RN 3' se refieren a secuencias genómicas o de cDNA que están respectivamente situadas cadena arriba y cadena abajo con respecto a una porción del gen IL-1RN y en que neo se refiere a un gen de resistencia a la neomicina. En otra construcción inoperante, se añade un segundo marcador seleccionable a una posición flanqueadora de modo que el gen puede ser representado como: IL-1RN/neo/IL-1RN/TK, en que TK es un gen de timidina quinasa que puede ser añadido a la secuencia de IL-1RN 5' o IL-1RN 3' de la construcción precedente y frente al cual se puede además seleccionar (es decir, es un marcador seleccionable negativo) en medios apropiados. Esta construcción de dos marcadores permite la selección de procesos de recombinación homóloga, que eliminan el marcador TK flanqueador, frente a los procesos de recombinación no homóloga que conservan típicamente las secuencias de TK. La deleción y/o sustitución génicas pueden ser de los exones, los intrones, especialmente los empalmes intrónicos, y/o las regiones reguladoras, tales como los
promotores.

"Desequilibrio de ligamiento" se refiere a la herencia conjunta de dos alelos con frecuencias superiores a las que se esperarían de las frecuencias de aparición separadas de cada alelo en una población testigo dada. La frecuencia de aparición esperada de dos alelos que se heredan independientemente es la frecuencia del primer alelo multiplicada por la frecuencia del segundo alelo. Se dice que los alelos que se encuentran conjuntamente con las frecuencias esperadas están en "desequilibrio de ligamiento". A menudo no está clara la causa del desequilibrio de ligamiento. Se puede deber a la selección de ciertas combinaciones de alelos o a la mezcla reciente de poblaciones genéticamente heterogéneas. Además en el caso de marcadores que están muy estrechamente ligados a un gen morboso, se espera una asociación de un alelo (o un grupo de alelos ligados) con el gen morboso si la mutación morbosa se produjo en el pasado reciente, por lo que no ha transcurrido el tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio a través de procesos de recombinación en la región cromosómica específica. Cuando se hace referencia a patrones alélicos que están compuestos de más de un alelo, un primer patrón alélico está en desequilibrio de ligamiento con un segundo patrón alélico si todos los alelos que comprenden el primer patrón alélico están en desequilibrio de ligamiento con al menos uno de los alelos del segundo patrón alélico. Un ejemplo de desequilibrio de ligamiento es el que se produce entre los alelos en los sitios polimórficos de IL-1RN (+2018) e IL-1RN (VNTR). Los dos alelos de IL-1RN (+2018) están en desequilibrio de ligamiento al 100% con los dos alelos más frecuentes de IL-1RN (VNTR), que son el alelo 1 y el alelo 2.

El término "marcador" se refiere a una secuencia del genoma de la que se sabe que varía entre individuos. Por ejemplo, el gen IL-1RN tiene un marcador que consiste en un número variable de repeticiones en tándem (VNTR).

"Modular" se refiere a la capacidad de una sustancia para regular la bioactividad. Cuando se aplica a una bioactividad de IL-1, un agonista o antagonista puede modular la bioactividad, por ejemplo, por agonismo o antagonismo de una síntesis de IL-1, una interacción del receptor, o un mecanismo de transducción de señales mediado por IL-1.

Un "gen mutado" o "mutación" o "mutación funcional" se refiere a una forma alélica de un gen, que es capaz de alterar el fenotipo de un sujeto que tiene el gen mutado con respecto al de un sujeto que no tiene el gen mutado. El fenotipo alterado causado por una mutación puede ser corregido o compensado por ciertos agentes. Si un sujeto debe ser homocigótico para esta mutación para que tenga un fenotipo alterado, se dice que la mutación es recesiva. Si basta una copia del gen mutado para alterar el fenotipo del sujeto, se dice que la mutación es dominante. Si un sujeto tiene una copia del gen mutado y tiene un fenotipo que es intermedio entre el de un sujeto homocigótico y el de un sujeto heterocigótico (para ese gen), se dice que la mutación es codominante.

Un "animal no humano" del invento incluye mamíferos tales como roedores, primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, etc., anfibios tales como miembros del género Xenopus, y aves transgénicas (por ejemplo, gallinas, pájaros, etc.). La expresión "animal quimérico" se usa aquí para referirse a animales en que se encuentra el gen recombinante, o en que el gen recombinante se expresa en algunas células del animal pero no en todas. La expresión "animal quimérico tisularmente específico" indica que uno de los genes IL-1 recombinantes está presente y/o expresado o alterado en algunos tejidos pero no en otros. La expresión "mamífero no humano" se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia salvo los seres humanos.

Como se utiliza aquí, la expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos u oligonucleótidos tales como el ácido desoxirribonucleico (DNA) y, cuando es apropiado, el ácido ribonucleico (RNA). Debería entenderse además que la expresión incluye, como equivalentes, compuestos análogos de RNA o DNA hechos de compuestos nucleotídicamente análogos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos) y, según sea aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos de cadenas sencilla (sentido o antisentido) y doble.

El término "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de más de una forma de un gen o una porción (por ejemplo, una variante alélica) del mismo. A una porción de un gen del que hay al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias nucleotídicas diferentes, se hace referencia como "región polimórfica de un gen". Una secuencia genética específica en una región polimórfica de un gen es un alelo. Una región polimórfica puede ser un único nucleótido cuya identidad difiere en los diferentes alelos. Una región polimórfica puede ser también un tramo de varios
nucleótidos.

La expresión "propensión a la enfermedad", también "predisposición" o "susceptibilidad" a la enfermedad, o cualquier frase similar, significa que se ha descubierto aquí que ciertos alelos están asociados con, o permiten pronosticar la probabilidad de que un sujeto desarrolle, una enfermedad particular (aquí, una enfermedad cardiovascular). Los alelos están así representados con una frecuencia excesiva en los individuos enfermos en comparación con los individuos sanos. Por lo tanto, estos alelos pueden ser utilizados para pronosticar la enfermedad incluso en individuos presintomáticos o preenfermos. Se entiende que estos alelos están relacionados con el trastorno que subyace tras la enfermedad.

Un "factor de riesgo" es un factor identificado por estar asociado con un riesgo aumentado de desarrollar sepsis, o para pronosticar la rapidez y/o la progresión última de la sepsis en un sujeto.

"Sepsis", "septicemia", "síndrome séptico" y "respuesta séptica" se refieren a aquellas respuestas bioquímicas y fisiológicas que han sido identificadas como manifestaciones sistémicas de una infección incontrolada. La sepsis es una respuesta inespecífica del huésped a cualquiera de diversos factores que incluyen: 1) microorganismos diseminados o sus productos bioquímicos procedentes de un foco de infección, 2) microorganismos o sus productos bioquímicos sin una fuente primaria de infección, y 3) mediadores inflamatorios locales procedentes de una fuente infecciosa o de un sitio estéril sin la participación de microorganismos ni de sus productos bioquímicos. Los organismos comúnmente implicados en la provocación de sepsis incluyen bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas y hongos. Como ejemplos, especies estreptocócicas y estafilocócicas pueden producir sepsis desde un foco local de infección (una neumonía o una meningitis, por ejemplo) o desde una agresión sistémica (como en un síndrome de choque tóxico). Como un ejemplo más, la sepsis es un proceso concomitante bien conocido de una infección genitourinaria, llamada urosepsis, en que el agente infeccioso es normalmente un organismo Gram negativo. La Neisseria meningitidis puede ocasionar una sepsis fulminante y rápidamente progresiva que acompaña a una meningitis. Los organismos Gram negativos producen habitualmente endotoxina, de la que se sabe que es lipopolisacáridos de la pared bacteriana que pueden mediar en las respuestas de la sepsis. Cuando la endotoxina está implicada en la sepsis, un suceso clave en la evolución del síndrome es la activación del sistema de fagocitos mononucleares, con la consiguiente liberación de IL-1 y TNF-alfa. Se entiende también que a procesos no infecciosos tales como la pancreatitis aguda siguen respuestas sépticas. Se entiende que procesos biológicos similares pueden conducir a la respuesta séptica después de una agresión infecciosa o no infecciosa.

Las respuestas fisiológicas y bioquímicas que caracterizan a la sepsis incluyen: 1) parámetros cardíacos hiperdinámicos, 2) una resistencia vascular periférica reducida, 3) una diferencia arteriovenosa de oxígeno reducida y 4) niveles séricos de lactato elevados. Se piensa que hay un proceso continuo de sepsis que, si no es corregido, puede conducir a la muerte. Se entiende que las etapas de la sepsis son similares a las etapas de otros tipos de choque. El choque puede ser el resultado de cualquier ataque grave a los mecanismos homeostáticos del organismo, sea una hemorragia, un trauma, un daño por quemadura, un infarto de miocardio o una sepsis. El choque consiste en una hipoperfusión generalizada a nivel tisular, debida a una reducción del volumen sanguíneo, una reducción del rendimiento cardíaco o una redistribución de la circulación eficaz. Esto da lugar a una distribución insuficiente de oxígeno y metabolitos a las células y a un inadecuado aclaramiento de los subproductos metabólicos. El cambio resultante de metabolismo celular aeróbico a anaeróbico conduce a la acumulación de ácido láctico en los tejidos. Los trastornos que acompañan al choque son normalmente corregibles al comienzo, pero progresan hasta daño irreversible y muerte
celular.

Las etapas de la sepsis tienen similarmente cambios reversibles al principio y cambios irreversibles más tarde. Se ha establecido un sistema de graduación para evaluar el grado del deterioro séptico del paciente. Durante la fase inicial, no progresiva, la Fase A de Siegel, se activan mecanismos compensatorios y se mantiene la perfusión a los órganos vitales. Con la agresión prolongada, este conjunto de respuestas llega a ser exagerado, con síntomas clínicos de vasodilatación periférica combinada con una perfusión disminuida a órganos vitales; ésta es la Fase B de Siegel. La hipotensión puede ser una consecuencia de esta perfusión disminuida. La perfusión disminuida a los órganos conduce a un daño irreversible a sistemas vitales, incluyendo el hígado y el riñón, y a insuficiencias respiratorias características de una insuficiencia orgánica múltiple. El pulmón presenta una vulnerabilidad particular a los cambios vistos en la sepsis. Un patrón de insuficiencia respiratoria conocido como síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (ARDS; del inglés, acute respiratory distress syndrome) puede acompañar a la sepsis así como a otros tipos de choque. Conforme progresa la sepsis, hay un ciclo creciente de anormalidades metabólicas y circulatorias hasta que se establece un choque evidente, como aquí se define. El choque séptico corresponde a la Fase C de Siegel. La progresión del choque combinada con la progresión de la sepsis conducen al estado preterminal de insuficiencia de bajo rendimiento sépticamente relacionada, la Fase D de Siegel. Se considera que un paciente que ha entrado en este estado presenta un daño irreversible sostenido; no se prevé supervivencia. La "sepsis del neonato" se refiere al conjunto de respuestas sépticas, como aquí se definen, que se manifiestan en el niño recién nacido o en el feto. Las infecciones neonatales pueden ser caracterizadas de acuerdo con su progreso temporal: tienden a producirse infecciones neonatales precoces en los primeros días tras el nacimiento, mientras que la sepsis neonatal de inicio tardío llega a manifestarse después de un periodo de latencia. Las infecciones con estreptococos del Grupo B o con Escherichia coli tienden a desarrollar síntomas, que incluyen sepsis, neumonía y/o meningitis, en los cuatro o cinco días tras el nacimiento. Por contraste, las infecciones con Listeria o Candida son de inicio posterior. En los infantes, las infecciones son denominadas infecciones neonatales durante los primeros pocos meses de vida. Las infecciones posteriores, en infantes de menos de dos años de edad, pueden también dar lugar a sepsis. La evaluación de una fiebre elevada en esta población requiere típicamente intervenciones diagnósticas enérgicas para identificar una fuente. Una fiebre de origen desconocido (en la que no se puede encontrar fuente alguna) puede ser tratada agresivamente con antibióticos hasta que, con cultivos de sangre, se pueda descartar concluyentemente la posibilidad de
bacteremia.

Con "molécula pequeña", como aquí se utiliza, se quiere referir a una composición que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 5 kDa y, muy preferiblemente, inferior a aproximadamente 4 kDa. Las moléculas pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, peptidomiméticos, hidratos de carbono, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas.

Como se utilizan aquí, las expresiones "se hibrida específicamente" y "detecta específicamente" se refieren a la capacidad de una molécula de ácido nucleico para hibridarse con al menos aproximadamente 6 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de muestra.

"Secuencia reguladora transcripcional" es una expresión genérica utilizada por toda la memoria descriptiva para referirse a secuencias de DNA, tales como señales de iniciación, potenciadores y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias de codificación proteica con las que están operativamente ligadas.

Como se utiliza aquí, el término "transgén" significa una secuencia de ácido nucleico (que codifica, por ejemplo, uno de los polipéptidos IL-1; o un transcrito antisentido relativo a la misma) que ha sido introducida en una célula. Un transgén podría ser parcial o totalmente heterólogo, es decir, extraño, con respecto a la célula o animal transgénico en que se introduce, u homólogo con respecto a un gen endógeno de la célula o animal transgénico en que se introduce, pero se diseña para ser insertado, o se inserta, en el genoma del animal de tal modo que altera el genoma de la célula en que se inserta (por ejemplo, se inserta en una posición que difiere de la del gen natural, o su inserción da lugar a un elemento inoperante). Un transgén puede estar también presente en una célula en forma de episoma. Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras transcripcionales y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones, que pueda ser necesario para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado.

Un "animal transgénico" se refiere a cualquier animal, preferiblemente un mamífero no humano, un ave o un anfibio, en que una o más de las células del animal contienen ácido nucleico heterólogo introducido por medio de una intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas bien conocidas en este campo técnico. El ácido nucleico es directa o indirectamente introducido en la célula por introducción en un precursor de la célula, por medio de una manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. La expresión "manipulación genética" no incluye el clásico cruce ni la fertilización in vitro, sino que se dirige a la introducción de una molécula de DNA recombinante. Esta molécula se puede integrar en un cromosoma o puede ser DNA extracromosómicamente replicante. En los típicos animales transgénicos aquí descritos, el transgén causa que las células expresen una forma recombinante de un polipéptido IL-1, por ejemplo, formas agonistas o antagónicas. Sin embargo, también se contemplan animales transgénicos en que el gen recombinante está silencioso, tales como, por ejemplo, las construcciones dependientes de FLP o CRE recombinasa descritas más adelante. Además, "animal transgénico" también incluye aquellos animales recombinantes en que la alteración génica de uno o más genes es causada por intervención humana, incluyendo técnicas tanto de recombinación como antisentido. Con esta expresión se pretende incluir todas las generaciones de la progenie. Por lo tanto, se incluyen el animal fundador y toda la progenie F1, F2, F3, etc. del mismo.

Con el término "tratamiento", como se utiliza aquí, se pretende abarcar la curación así como la mejoría de al menos un síntoma de la sepsis o de al menos una anormalidad asociada con la sepsis.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al que ha sido ligada. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica. Son vectores preferidos aquellos capaces de la replicación y/o expresión autónomas de los ácidos nucleicos a los que están ligados. A los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados se hace aquí referencia como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de DNA recombinante están a menudo en forma de "plásmidos", los cuales se refieren generalmente a bucles circulares de DNA de doble cadena que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, en el invento se pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión que desempeñan funciones equivalentes y que resultan conocidas en la técnica posteriormente adjunta.

La expresión "alelo de tipo silvestre" se refiere a un alelo de un gen que, cuando está presente en dos copias en un sujeto, da lugar a un fenotipo de tipo silvestre. Puede haber varios alelos de tipo silvestre diferentes de un gen específico, ya que puede que ciertos cambios nucleotídicos en un gen no afecten al fenotipo de un sujeto que tiene dos copias del gen con los cambios nucleotídicos.

3.2 Medicina de Predicción 3.2.1 Ensayos y sistemas pronosticadores

Basándose en parte en los hallazgos descritos con detalle en los ejemplos siguientes, que muestran que los pacientes que tienen el alelo 2 de IL-1B (-511) presentan mayor probabilidad de morir de sepsis, y en los hallazgos de que ciertos marcadores de los individuos comprenden patrones haplotípicos, el presente invento proporciona métodos y sistemas para determinar si un sujeto va a desarrollar, o es probable que desarrolle, sepsis y/o la velocidad o el grado probables de progresión de la septicemia.

Específicamente, como se muestra a continuación, los solicitantes han determinado e identificado los siguientes tres patrones haplotípicos, definidos por cuatro loci polimórficos en el grupo génico de IL-1.

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1

\newpage

El "haplotipo del patrón 2 (44112332)" comprende al menos los marcadores siguientes:

2

Además de los marcadores anteriormente señalados, el patrón 2 incluye marcadores que están en desequilibrio de ligamiento con los marcadores anteriormente expuestos. Por ejemplo, se sabe que el alelo 2 del polimorfismo de IL-1RN (+2018) [Clay et al. (1996), Hum. Genet. 97: 723-26], al que también se hace referencia como exón 2 (8006) (GenBank: X64532 en 8006), está en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus polimórfico de IL-1RN (VNTR), el cual, a su vez, es una parte del haplotipo humano 44112332. De este modo, el alelo 2 del locus de IL-1RN (+2018) (es decir, C en +2018) es una variante alélica asociada con el haplotipo 44112332 y, por lo tanto, proporciona una diana alternativa al análisis de pronóstico para determinar, por genotipaje, la probabilidad de que un individuo desarrolle un trastorno vascular. Similarmente, otros tres polimorfismos en un exón alternativo de IL-1RN (exón 1ic, que produce una forma intracelular del producto génico) están también en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) (Clay et al., 1996, Hum. Genet. 97: 723-26). Estos incluyen: el polimorfismo del exón 1ic (1812) de IL-1RN (GenBank: X77090 en 1812), el polimorfismo del exón 1ic (1868) de IL-1RN (GenBank: X77090 en 1868), y el polimorfismo del exón 1ic (1887) de IL-1RN (GenBank: X77090 en 1887). Además, aún otro polimorfismo en el promotor para la forma intracelular alternativamente cortada y empalmada del gen, el polimorfismo Pic (1731) (GenBank: X77090 en 1731), está también en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus polimórfico de IL-1RN (VNTR) (Clay et al., 1996, Hum. Genet. 97: 723-26). A continuación se muestran las correspondientes alteraciones secuenciales para cada uno de estos loci polimórficos de IL-1RN.

3

Para cada uno de estos loci polimórficos, se ha determinado que la variante secuencial del alelo 2 está en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus de IL-1RN (VNTR) (Clay et al., 1996, Hum. Genet. 97: 723-26). Parece que el haplotipo del patrón 2 está asociado con niveles disminuidos de antagonista del receptor de IL-1.

Además de los patrones alélicos anteriormente descritos, como aquí se describen, un experto en la técnica puede identificar fácilmente otros alelos (incluyendo polimorfismos y mutaciones) que estén en desequilibrio de ligamiento con un marcador del patrón 2. Por ejemplo, se podría genotipar una población grande y llevar a cabo un análisis estadístico para determinar qué alelos aparecen juntos más habitualmente de lo esperado. Preferiblemente, el grupo es elegido de modo que comprenda individuos genéticamente relacionados. Los individuos genéticamente relacionados incluyen individuos de la misma raza, el mismo grupo étnico o incluso la misma familia. Conforme aumenta el grado de relación genética entre un grupo testigo y un grupo de ensayo, aumenta el valor pronosticador de alelos polimórficos que están cada vez más distantemente ligados a un alelo causativo de enfermedad. Esto es así porque ha transcurrido menos tiempo evolutivo que permita que los polimorfismos que están ligados a lo largo de un cromosoma en una población fundadora se redistribuyan a través de procesos de sobrecruzamiento genético. De esta manera, se pueden desarrollar ensayos de genotipaje diagnóstico específicos de la raza, específicos de la etnia e incluso específicos de la familia, que permitan la detección de alelos morbosos que surgieron en tiempos cada vez más recientes de la evolución humana, por ejemplo, después de la divergencia de las principales razas humanas, después de la separación de poblaciones humanas en distintos grupos étnicos e incluso dentro de la historia reciente de una línea familiar concreta.

El desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores polimórficos o entre un marcador polimórfico y una mutación causativa de enfermedad es un estado metaestable. En ausencia de presión selectiva o de la reaparición esporádicamente ligada de los procesos mutacionales subyacentes, los polimorfismos llegarán finalmente a disociarse por procesos de recombinación cromosómica y alcanzarán por ello el equilibrio de ligamiento en el transcurso de la evolución humana. De esta manera, la probabilidad de encontrar un alelo polimórfico en desequilibrio de ligamiento con una enfermedad o un estado puede aumentar con los cambios en al menos dos factores: disminución de la distancia física entre el marcador polimórfico y la mutación causativa de enfermedad, y disminución del número de generaciones meióticas disponibles para la disociación de la pareja ligada. La consideración del último factor sugiere que, cuanto más íntimamente relacionados estén dos individuos, mayor será la probabilidad de que compartan un cromosoma o región cromosómica parental común que contenga los polimorfismos ligados, y menor será la probabilidad de que esta pareja ligada llegue a desligarse a través de los procesos de sobrecruzamiento meiótico que ocurren en cada generación. Como resultado, cuanto más íntimamente relacionados estén dos individuos, mayor será la probabilidad de que se puedan heredar conjuntamente polimorfismos muy espaciados. De este modo, para individuos relacionados por una raza, etnia o familia comunes, se puede contar con la fiabilidad de loci polimórficos cada vez más distantemente espaciados como un indicador de la herencia de una mutación ligada causativa de enfermedad.

Los oligonucleótidos presentes en una realización de un sistema de acuerdo con el presente invento pueden ser usados para la multiplicación de la región de interés o para dirigir la hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO; del inglés, allele specific oligonucleotide) a los marcadores en cuestión. De este modo, los oligonucleótidos pueden flanquear el marcador de interés (como se requiere para la multiplicación por PCR) o solapar directamente con el marcador (como en la hibridación de ASO). Los ejemplos de cebadores apropiados para uso en los métodos de detección anteriormente descritos incluyen:

5'-CTCAGCAACACTCCTAT-3'

(ID. SEC. nº 1);

5'-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3'

(ID. SEC. nº 2);

que se pueden utilizar para multiplicar y tipar el locus polimórfico de IL-1RN (VNTR) humano;

5'-CTA TCT GAG GAA CAA CCA ACT AGT AGC-3'

(ID. SEC. nº 3);

5'-TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT -3'

(ID. SEC. nº 4);

que se pueden utilizar para multiplicar y tipar el locus polimórfico de IL-1RN (+2018) humano;

5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3'

(ID. SEC. nº 5);

5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3'

(ID. SEC. nº 6);

que se pueden usar para multiplicar y tipar el locus polimórfico de IL-1B (-511) humano;

5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3'

(ID. SEC. nº 7);

5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3'

(ID. SEC. nº 8);

que se pueden utilizar para multiplicar y tipar el locus polimórfico de IL-1B (+3954) humano; y

5' ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA 3'

(ID. SEC. nº 9);

3' AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT 3'

(ID. SEC. nº 10);

que se pueden utilizar para multiplicar y tipar el locus polimórfico de IL-1A (+4845) humano.

Se pueden diseñar sondas apropiadas para que se hibriden con un gen específico del locus de IL-1, tal como IL-1A, IL-1B o IL-1RN, o un gen relacionado. Alternativamente, estas sondas pueden llevar incorporadas otras regiones del correspondiente locus genómico, incluyendo secuencias intergénicas. En realidad, la región de IL-1 del cromosoma 2 humano abarca unos 400.000 pares de bases y, suponiendo una media de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP; del inglés, single nucleotide polymorphism) cada 1000 pares de bases, incluye sólo unos 400 loci de SNPs. Aún otros polimorfismos disponibles para utilización con el invento inmediato son obtenibles de diversas fuentes públicas. Por ejemplo, la base de datos del genoma humano reúne SNPs intragénicos y actualmente contiene aproximadamente 2700 entradas, y en ella se puede buscar por secuencia (http://hgbase.interactiva.de). También se dispone de una base de datos de polimorfismos humanos mantenida por el Massachusetts Institute of Technology [base de datos de SNPs del MIT (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html)]. En dichas fuentes se pueden hallar SNPs así como otros polimorfismos humanos.

Por ejemplo, el examen de la región de IL-1 del genoma humano en cualquiera de estas bases de datos revela que los genes del locus de IL-1 están flanqueados por un marcador polimórfico proximal al centrómero, denominado marcador microsatélite AFM220ze3, a 127,4 cM (centimorgans) (véase el número de acceso Z17008 de GenBank), y un marcador polimórfico distal, denominado marcador microsatélite ancla AFM087xa1, a 127,9 cM (véase el número de acceso Z16545 de GenBank). Estos dos loci polimórficos humanos son polimorfismos microsatélites de repetición del dinucleótido CA y, como tales, presentan un grado elevado de heterocigosidad en las poblaciones humanas. Por ejemplo, un alelo de AFM220ze3 genera un producto de multiplicación por PCR, de 211 bp, con un cebador 5' de secuencia TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC (ID. SEC. nº 11) y un cebador 3' de secuencia TGGCCTCCAGAAACCTCCAA (ID. SEC. nº 12). Además, un alelo de AFM087xa1 genera un producto de multiplicación por PCR, de 177 bp, con un cebador 5' de secuencia GCTGATATTCTGGTGGGAAA (ID. SEC. nº 13) y un cebador 3' de secuencia GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (ID. SEC. nº 14). Cebadores equivalentes que corresponden a secuencias únicas que se encuentran en 5' y 3' con respecto a estos polimorfismos de repetición del dinucleótido CA del cromosoma 2 humano resultarán evidentes para un experto la técnica. Los cebadores equivalentes razonables incluyen aquellos que se hibridan dentro de aproximadamente 1 kb del cebador designado y que además tienen una longitud comprendida en el intervalo de aproximadamente 17 bp a aproximadamente 27 bp. Una directriz general para diseñar cebadores para la multiplicación de secuencias genómicas cromosómicas humanas únicas es que posean una temperatura de fusión de al menos aproximadamente 50ºC, pudiendo estimarse una temperatura de fusión aproximada al utilizar la fórmula

T_{fusión} = [2\ x\ (n^{o}\ de\ A\ o\ T)\ +\ 4\ x\ (n^{o}\ de\ G\ o\ C)].

Otros diversos loci polimórficos humanos se encuentran entre estos dos polimorfismos de repetición del dinucleótido CA y proporcionan objetivos adicionales para la determinación de un alelo pronosticador de trastorno cardiovascular en una familia o en otro grupo de individuos genéticamente relacionados. Por ejemplo, el sitio del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/) en la web enumera diversos marcadores de polimorfismo en la región del locus de IL-1 y proporciona una orientación para diseñar cebadores apropiados para la multiplicación y el análisis de estos marcadores.

En consecuencia, los segmentos nucleotídicos del invento pueden ser utilizados por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de q 12-13 del cromosoma 2 humano o cDNAs de esa región, o para proporcionar cebadores para la multiplicación del DNA o cDNA de esta región. El diseño de sondas apropiadas para este fin requiere la consideración de diversos factores. Por ejemplo, serán particularmente útiles los fragmentos que tengan una longitud de entre 10, 15 ó 18 nucleótidos y aproximadamente 20 o aproximadamente 30 nucleótidos. Para ciertas realizaciones, son aún más preferidas las secuencias más largas, tales como, por ejemplo, de 40, 50, 80, 90 ó 100 nucleótidos, o incluso hasta la longitud completa. Las longitudes de oligonucleótidos de al menos aproximadamente 18 a 20 nucleótidos son bien aceptadas por los expertos en la técnica como suficientes para permitir una hibridación suficientemente específica para que aquellos sean útiles como sonda molecular. Además, dependiendo de la aplicación concebida, se deseará emplear condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren una elevada selectividad, se deseará típicamente emplear condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos; por ejemplo, unas condiciones de concentración de sal relativamente baja y/o temperatura relativamente elevada, tales como las proporcionadas por NaCl 0,02 M-0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Dichas condiciones selectivas pueden tolerar poco apareamiento erróneo, si acaso alguno, entre la sonda y la cadena molde o diana.

En una realización, el método comprende genotipar una muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto para determinar al menos un alelo de un gen IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada. Dicho alelo puede ser detectado, por ejemplo, determinando la velocidad de transcripción o el nivel de mRNA y/o proteína de un gen o proteína IL-1, tal como mediante análisis por transferencia Northern, transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), hibridación in situ, inmunoprecipitación, hibridación con transferencia Western, o inmunohistoquímica. De acuerdo con un método, se obtienen células de un sujeto, se determina el nivel de proteína o mRNA de IL-1 y se compara este nivel con el nivel de proteína o mRNA de IL-1 de un sujeto que no es susceptible al desarrollo de sepsis o que presenta poca probabilidad de progresar rápidamente hasta un choque séptico.

En otra realización, el método comprende medir al menos una actividad de una proteína IL-1. Por ejemplo, se puede determinar la constante de afinidad de una proteína IL-1 \alpha o \beta de un sujeto con un receptor. Los resultados obtenidos pueden ser luego comparados con resultados del mismo análisis llevado a cabo sobre un sujeto conocido por ser susceptible a la sepsis o conocido por no ser susceptible al desarrollo de sepsis.

En realizaciones preferidas, el método se caracteriza por comprender genotipar una muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto, para determinar al menos un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada. En una realización ejemplar, se proporciona una composición de ácido nucleico que comprende una sonda de ácido nucleico que incluye una región de secuencia nucleotídica que es capaz de hibridarse con una secuencia sentido o antisentido de al menos un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada. Por ejemplo, se puede hacer accesible el ácido nucleico a la hibridación, poner la sonda en contacto con el ácido nucleico de la muestra, y detectar la hibridación de la sonda con el ácido nucleico de la muestra. Dicha técnica puede ser utilizada para detectar alteraciones o variantes alélicas a nivel genómico o de mRNA, así como para determinar los niveles de transcritos de mRNA.

Un método de detección preferido es la hibridación específica de alelos utilizando sondas que solapan con una región de al menos un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada y que tiene aproximadamente 5, 10, 20, 25 ó 30 nucleótidos cerca de la mutación o la región polimórfica. En una realización preferida del invento, varias sondas capaces de hibridarse específicamente con otras variantes alélicas implicadas en la sepsis son fijadas a un soporte en fase sólida, tal como, por ejemplo, un "chip" (que puede contener hasta aproximadamente 250.000 oligonucleótidos). Se pueden unir oligonucleótidos a un soporte sólido mediante diversos procedimientos, incluyendo la litografía. Por ejemplo, Cronin et al. (1996), Human Mutation 7: 244, describen un análisis para detección de mutaciones utilizando estos chips que comprenden oligonucleótidos, también denominados "matrices de sondas de DNA". En una realización, un chip comprende todas las variantes alélicas de al menos una región polimórfica de un gen. Luego se pone en contacto el soporte en fase sólida con un ácido nucleico de prueba y se detecta la hibridación con las sondas específicas. En consecuencia, se puede determinar la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o más genes mediante un sencillo experimento de hibridación.

Estas técnicas también pueden comprender la operación de multiplicar el ácido nucleico antes del análisis. Las técnicas de multiplicación son conocidas por los expertos en este campo técnico e incluyen, pero no se limitan a, clonación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa de alelos específicos (ASA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción en cadena de la polimerasa anidada, replicación de secuencias automantenida (J. C. Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de multiplicación transcripcional (D. Y. Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177) y replicasa Q-Beta (P. M. Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197).

Los productos de la multiplicación pueden ser analizados de diversos modos, incluyendo el análisis de tamaños, la digestión con enzimas de restricción seguida del análisis de tamaños, la detección de cebadores oligonucleotídicos etiquetados específicos en los productos de reacción, la hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), la detección de exonucleasas 5' específicas de alelo, la secuenciación, la hibridación y similares.

Los medios de detección basados en PCR pueden incluir la multiplicación múltiple y simultánea de una pluralidad de marcadores. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica cómo seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR cuyos tamaños no solapen y que puedan ser simultáneamente analizados. Alternativamente, es posible multiplicar diferentes marcadores con cebadores que están diferencialmente marcados, y, por lo tanto, cada uno puede ser diferencialmente detectado. Por supuesto, los medios de detección basados en hibridación permiten la detección diferencial de múltiples productos de PCR en una muestra. En este campo técnico se conocen otras técnicas que permiten análisis múltiples de una pluralidad de marcadores.

En una realización meramente ilustrativa, el método incluye las operaciones de (i) recoger una muestra de células de un paciente, (ii) aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, mRNA o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner la muestra de ácido nucleico en contacto con uno o más cebadores que se hibridan en 5' y 3' específicamente con al menos un alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada, bajo unas condiciones tales que se producen la hibridación y la multiplicación del alelo, y (iv) detectar el producto de multiplicación. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy pequeñas.

En una realización preferida del ensayo objetivo, el alelo de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada es identificado por alteraciones en los patrones de escisión con enzimas de restricción. Por ejemplo, se aíslan DNAs de muestra y testigo, se multiplican (opcionalmente), se someten a digestión con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños de los fragmentos mediante electroforesis en un gel.

En aún otra realización, para secuenciar directamente el alelo, se puede utilizar cualquiera de una diversidad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica. La reacciones de secuenciación ejemplares incluyen las basadas en técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 560] o Sanger [Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463]. También se contempla que se pueda usar cualquiera de una diversidad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se llevan a cabo los ensayos objetivo [Biotechniques (1995) 19: 448], incluyendo la secuenciación mediante espectrometría de masas [véanse, por ejemplo, la publicación PCT WO 94/16101; Cohen et al. (1996), Adv. Chromatogr. 36: 127-162; y Griffin et al. (1993), Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159]. Resultará evidente a un experto en la técnica que, para ciertas realizaciones, sólo se necesitará determinar la existencia de una, dos o tres de las bases de ácido nucleico en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un rastreo de A o similar cuando, por ejemplo, sólo se detecta un ácido nucleico.

En una realización más, se puede usar la protección de agentes de escisión (tal como una nucleasa, hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina) para detectar bases mal apareadas en heterodúplex de RNA/RNA o RNA/DNA o DNA/DNA [Myers et al. (1985), Science 230: 1242]. En general, la técnica actual de "escisión de apareamientos erróneos" comienza al proporcionar heterodúplex formados al hibridar RNA o DNA (marcado) que contiene el alelo de tipo silvestre con la muestra. Los dúplex de cadena doble son tratados con un agente que escinde regiones de cadena sencilla del dúplex, tales como las que existirán a causa de apareamientos erróneos de pares de bases entre las cadenas testigo y de muestra. Por ejemplo, se pueden tratar dúplex de RNA/DNA con RNasa y se pueden tratar los híbridos de DNA/DNA con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones mal apareadas. En otras realizaciones, se pueden tratar los dúplex de DNA/DNA o RNA/DNA con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina con objeto de digerir las regiones mal apareadas. Después de la digestión de las regiones mal apareadas, el material resultante es sometido a una separación por tamaños en geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de la mutación. Véanse, por ejemplo, Cotton et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; y Saleeba et al. (1992), Methods Enzymol. 217: 286-295. En una realización preferida, el DNA o RNA testigo puede ser marcado para detección.

En aún otra realización, en la reacción de escisión de apareamientos erróneos se emplean una o más proteínas que reconocen pares de bases mal apareadas en el DNA de doble cadena (llamadas enzimas para la "reparación de apareamientos erróneos en DNA"). Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en apareamientos erróneos G/A, y la timidina DNA glicosilasa de células HeLa escinde T en apareamientos erróneos G/T [Hsu et al. (1994), Carcinogenesis 15: 1657-1662]. De acuerdo con una realización ejemplar, una sonda basada en el alelo 1 (+6912) de IL-1\beta es hibridada con un cDNA o con otro producto de DNA procedente de una(s) célula(s) testigo. El dúplex es tratado con una enzima para la reparación de apareamientos erróneos en DNA, y los productos de escisión, si los hubiera, pueden ser detectados mediante protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.459.039.

En otras realizaciones, se usarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar el alelo. Por ejemplo, se puede utilizar el polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP; del inglés, single strand conformation polymorphism) para detectar diferencias de movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo silvestre [Orita et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766; véanse también Cotton (1993), Mutat. Res. 285: 125-144, y Hayashi (1992), Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79]. Se desnaturalizan fragmentos de DNA de cadena sencilla del alelo de muestra y del alelo testigo y se deja que se vuelvan a naturalizar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos de cadena sencilla varía de acuerdo con la secuencia, y la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección del cambio de incluso una sola base. Los fragmentos de DNA pueden ser marcados o ser detectados con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede ser potenciada al usar RNA (en lugar de DNA), ya que su estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, en el método objetivo se utiliza un análisis de heterodúplex para separar moléculas heterodúplex de doble cadena basándose en cambios en la movilidad electroforética [Keen et al. (1991), Trends Genet. 7: 5].

En aún otra realización, se analiza el movimiento de los alelos en geles de poliacrilamida que contienen agente desnaturalizante en gradiente, utilizando la electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante (DGGE; del inglés, denaturing gradient gel electrophoresis) [Myers et al. (1985), Nature 313: 495]. Cuando se usa la DGGE como método de análisis, se modificará el DNA para asegurar que no se desnaturaliza completamente añadiendo, por ejemplo, una abrazadera de GC de aproximadamente 40 bp de un DNA de alto punto de fusión y rico en GC por PCR. En otra realización, se utiliza un gradiente de temperaturas en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad de los DNAs testigo y de muestra [Rosenbaum y Reissner (1987), Biophys. Chem. 265: 12753].

Los ejemplos de otras técnicas para detectar alelos incluyen, pero no se limitan a, hibridación oligonucleotídica selectiva, multiplicación selectiva y extensión selectiva de cebadores. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos en que la mutación o diferencia de nucleótidos conocida (por ejemplo, en variantes alélicas) esté situada centralmente y se pueden hibridar luego con el DNA diana bajo condiciones que sólo permitan la hibridación si se encuentra un apareamiento perfecto [Saiki et al. (1986), Nature 324: 163; Saiki et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230]. Dichas técnicas de hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo pueden ser utilizadas para ensayar una mutación o región polimórfica por reacción cuando los oligonucleótidos se hibridan con DNA diana multiplicado por PCR, o un número de mutaciones o regiones polimórficas diferentes cuando los oligonucleótidos son fijados a la membrana de hibridación y son hibridados con DNA diana marcado.

Alternativamente, la tecnología de multiplicación específica de alelo, que depende de una multiplicación selectiva por PCR, puede ser utilizada junto con el presente invento. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la multiplicación específica pueden llevar la mutación o región polimórfica de interés en el centro de la molécula (para que la multiplicación dependa de la hibridación diferencial) [Gibss et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448] o en el término 3' extremo de un cebador, donde, bajo condiciones apropiadas, se puede evitar el apareamiento erróneo o reducir la extensión de la polimerasa [Prossner (1993), Tibtech. 11: 238]. Además, puede resultar deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear una detección basada en escisión [Gasparini et al. (1992), Mol. Cell Probes 6: 1]. Se prevé que, en ciertas realizaciones, la multiplicación pueda ser llevada también a cabo usando ligasa Taq para multiplicación [Barany (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189]. En tales casos, sólo se producirá ligación si hay un apareamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia 5', lo que haría posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de multiplicación.

En otra realización, la identificación de la variante alélica es llevada a cabo utilizando un ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA; del inglés, oligonucleotide ligation assay), como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 4.998.617 y describen U. Landegren et al., Science 241: 1077-1080 (1988). En el protocolo de OLA se utilizan dos oligonucleótidos que son diseñados para que puedan hibridarse con secuencias lindantes de una cadena sencilla de una diana. Uno de los oligonucleótidos es unido a un marcador de separación, por ejemplo, es biotinilado, y el otro es detectablemente marcado. Si se encuentra la secuencia complementaria precisa en una molécula diana, los oligonucleótidos se hibridarán de modo que sus extremos linden y crearán un sustrato de ligación. La ligación permite entonces que el oligonucleótido marcado sea recuperado usando avidina u otro ligando de la biotina. D. A. Nickerson et al. han descrito un ensayo para detección de ácido nucleico que combina características de la PCR y el OLA [D. A. Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 8923-8927 (1990)]. En este método, se utiliza la PCR para alcanzar la multiplicación exponencial del DNA diana, el cual es luego detectado usando el OLA.

Se han desarrollado diversas técnicas basadas en este método OLA, técnicas que pueden ser utilizadas para detectar alelos de un patrón genético de IL-1 que conduce a una respuesta inflamatoria mal regulada. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 5.593.826 se describe un OLA en que se utilizan un oligonucleótido que tiene un grupo 3'-amino y un oligonucleótido 5'-fosforilado para formar un producto de conjugación que tiene un enlace fosforamidato. En otra variación de OLA descrita por Tobe et al. (1996, Nucleic Acids Res. 24: 3728), un OLA combinado con PCR permite el tipaje de dos alelos en un solo pocillo de placa para microtitulación. Al marcar cada uno de los cebadores específicos de alelo con un hapteno único, es decir, digoxigenina y fluoresceína, se puede detectar cada reacción de OLA utilizando anticuerpos específicos de hapteno que están marcados con diferentes informadores enzimáticos, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Este sistema permite la detección de los dos alelos utilizando un formato de alto rendimiento que conduce a la producción de dos colores diferentes.

Se han desarrollado diversos métodos para facilitar el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido. En una realización, el polimorfismo de una sola base puede ser detectado utilizando un nucleótido resistente a exonucleasas especializadas, tal como describe, por ejemplo, C. R. Mundy (Patente de EE.UU. nº 4.656.127). De acuerdo con el método, se permite que un cebador complementario de la secuencia alélica situada inmediatamente en 3' con respecto al sitio polimórfico se hibride con una molécula diana obtenida de un animal o ser humano particular. Si el sitio polimórfico de la molécula diana contiene un nucleótido que es complementario del derivado nucleotídico resistente a exonucleasas particulares presente, ese derivado se incorporará entonces al final del cebador hibridado. Dicha incorporación hace al cebador resistente a la exonucleasa y permite por ello su detección. Puesto que se conoce la identidad del derivado resistente a exonucleasas de la muestra, el hallazgo de que el cebador se ha vuelto resistente a exonucleasas revela que el nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana era complementario del derivado nucleotídico utilizado en la reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de grandes cantidades de datos de secuencias extrañas.

En otra realización del invento, se utiliza un método basado en disoluciones para determinar la identidad del nucleótido de un sitio polimórfico (D. Cohen et al., Patente Francesa nº 2.650.840; Solicitud PCT nº WO91/02087). Como en el método de Mundy de la Patente de EE.UU. nº 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario de secuencias alélicas situadas inmediatamente en 3' con respecto un sitio polimórfico. El método permite determinar la identidad del nucleótido de ese sitio utilizando derivados didesoxinucleotídicos marcados que, si son complementarios del nucleótido del sitio polimórfico, llegarán a incorporarse al extremo del cebador.

P. Goelet et al. (Solicitud PCT nº 92/15712) describen un método alternativo, conocido como Análisis de Bits Genéticos o GBA^{TM}. En el método de P. Goelet et al. se utiliza una mezcla de terminadores marcados y un cebador que es complementario de la secuencia 3' con respecto a un sitio polimórfico. El terminador marcado que se incorpora es así determinado por, y es complementario de, el nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana que se evalúa. Por contraste con el método de Cohen et al. (Patente Francesa 2.650.840; Solicitud PCT nº WO91/02087), el método de P. Goelet et al. es preferiblemente un ensayo en fase heterogénea en que se inmoviliza el cebador o la molécula diana en una fase sólida.

Se han descrito recientemente diversos procedimientos para la incorporación de nucleótidos dirigida por cebador, para analizar sitios polimórficos en DNA [J. S. Komher et al., Nucl. Acids Res. 17: 7779-7784 (1989); B. P. Sokolov, Nucl. Acids Res. 18: 3671 (1990); A.-C. Syvanen et al., Genomics 8: 684-692 (1990); M. N. Kuppuswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 1143-1147 (1991); T. R. Prezant et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992); L. Ugozzoli et al., GATA 9: 107-112 (1992); P. Nyren et al., Anal. Biochem. 208: 171-175 (1993)]. Estos métodos difieren del GBA^{TM} en que todos se basan en la incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre bases en un sitio polimórfico. En dicho formato, puesto que la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los polimorfismos que aparecen en ciclos del mismo nucleótido pueden dar lugar a señales que sean proporcionales a la longitud del ciclo [A.-C. Syvanen et al., Amer. J. Hum. Genet. 52: 46-59 (1993)].

Para mutaciones que producen la terminación prematura de la traducción proteica, el ensayo de truncamiento de proteínas (PTT; del inglés, protein truncation test) ofrece una aproximación diagnóstica eficaz [Roest et al. (1993), Hum. Mol. Genet. 2: 1719-21; van der Luijt et al. (1994), Genomics 20: 1-4]. Para el PTT, se aísla inicialmente RNA de un tejido disponible y se somete a transcripción inversa, y se multiplica el segmento de interés por PCR. Los productos de la transcripción inversa-PCR son luego utilizados como molde para la multiplicación por PCR anidada con un cebador que contiene un promotor de RNA polimerasa y una secuencia para iniciar la traducción eucariótica. Después de la multiplicación de la región de interés, los motivos únicos incorporados al cebador permiten la transcripción y traducción secuenciales in vitro de los productos de PCR. Tras someter los productos de traducción a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE; del inglés, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), la aparición de polipéptidos truncados señala la presencia de una mutación que causa la terminación prematura de la traducción. En una variación de esta técnica, se utiliza DNA (en vez de RNA) como molde de PCR cuando la región diana de interés procede de un solo exón.

Para obtener muestras de ácido nucleico para uso en los diagnósticos aquí descritos, se puede utilizar cualquier tejido o tipo celular. En una realización preferida, la muestra de DNA se obtiene de un fluido corporal, tal como, por ejemplo, sangre, obtenida mediante cualquier técnica conocida (por ejemplo, venipunción), o saliva. Alternativamente, se pueden llevar a cabo ensayos de ácido nucleico sobre muestras secas (por ejemplo, pelo o piel). Cuando se utiliza RNA o una proteína, las células o tejidos que se pueden utilizar deben expresar el gen IL-1.

También se pueden llevar directamente a cabo procedimientos diagnósticos in situ sobre cortes tisulares (fijados y/o congelados) de tejido del paciente obtenido de biopsias o resecciones, por lo que no es necesaria la purificación del ácido nucleico. Para dichos procedimientos in situ, se pueden utilizar reactivos de ácido nucleico como sondas y/o cebadores (véase, por ejemplo, G. J. Nuovo, 1992, "PCR in situ hybridization: protocols and applications", Raven Press, New York, EE.UU.).

Además de los métodos que se centran esencialmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico, también se pueden evaluar perfiles mediante dichos esquemas de detección. Por ejemplo, se pueden generar perfiles de huellas dactilares utilizando un procedimiento de presentación diferencial, análisis Northern y/o RT-PCR.

Otra realización del invento se dirige a sistemas para detectar una predisposición para desarrollar sepsis y/o a que ésta progrese más rápida o gravemente. Este sistema puede contener uno o más oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos 5' y 3' que se hibridan en 5' y 3' con al menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1. Los oligonucleótidos para la multiplicación por PCR deberían hibridarse separados por entre 25 y 2500 pares de bases, preferiblemente separados por entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 bases, con objeto de producir un producto de PCR de tamaño conveniente para un subsiguiente análisis.

Para uso en un sistema, los oligonucleótidos pueden ser cualesquiera de una diversidad de composiciones naturales y/o sintéticas tales como oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de restricción, cDNAs, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs; del inglés, peptide nucleic acids) sintéticos, y similares. En el sistema y el método de ensayo se pueden emplear también oligonucleótidos marcados para facilitar la identificación en los ensayos. Los ejemplos de marcadores que se pueden emplear incluyen radiomarcadores, enzimas, compuestos fluorescentes, estreptavidina, avidina, biotina, restos magnéticos, restos ligantes de metales, restos de antígenos o anticuerpos, y similares.

El sistema puede también incluir opcionalmente medios para el muestreo de DNA tales como AmpliCard^{TM} [University of Sheffield, Sheffield, England S10 2JF; J. W. Tarlow et al., J. of Invest. Dermatol. 103: 387-389 (1994)] y similares; reactivos para la purificación de DNA tales como sistemas Nucleon^{TM}, tampones para lisis, disoluciones de proteinasas, y similares; reactivos para PCR tales como tampones 10x para reacción, polimerasas termoestables, dNTPs y similares; y medios para la detección de alelos tales como la enzima de restricción HinfI, oligonucleótidos específicos de alelo, y cebadores oligonucleotídicos degenerados para PCR anidada a partir de sangre seca.

3.2.2 Farmacogenómica

El conocimiento de los polimorfismos particulares de IL-1 que son pronosticadores de sepsis, solo o junto con información sobre otros defectos genéticos que contribuyen a la sepsis (el perfil genético de la sepsis), permite una adecuación de la terapia para una enfermedad particular al perfil genético del individuo, la finalidad de la "farmacogenómica". Por ejemplo, los sujetos que llevan un alelo del patrón 2 pueden estar predispuestos a desarrollar sepsis o a progresar más rápida o gravemente hasta secuelas relacionadas con la sepsis. Por lo tanto, la comparación del perfil genético de IL-1 de un individuo con el perfil de la población para la sepsis permite la selección o el diseño de fármacos de los que se espera que sean seguros y eficaces para un paciente particular o una población de pacientes particulares (es decir, un grupo de pacientes que tienen la misma alteración genética).

La capacidad para, basándose en el perfil genético de IL-1, dirigirse a poblaciones de las que se espera que muestren el mayor beneficio clínico puede permitir: 1) la redisposición de fármacos comercializados para la sepsis con resultados comerciales decepcionantes; 2) el rescate de candidatos farmacológicos para la sepsis cuyo desarrollo clínico ha sido interrumpido como resultado de limitaciones de seguridad o eficacia, que son específicos de un subgrupo de pacientes; y 3) un desarrollo acelerado y menos costoso de candidatos farmacológicos para la sepsis y una marcación de fármacos más óptima.

Además, las células de un sujeto se pueden obtener antes y después de la administración de un producto terapéutico para detectar el nivel de expresión de genes distintos de IL-1, para verificar que el producto terapéutico no aumenta ni disminuye la expresión de genes que podrían ser deletéreos. Esto puede realizarse, por ejemplo, utilizando el método de la perfiladura transcripcional. Por lo tanto, el mRNA de células expuestas in vivo a un producto terapéutico y el mRNA del mismo tipo de células que no fueron expuestas al producto terapéutico podrían ser sometidos a transcripción inversa e hibridados con un chip que contuviera DNA de numerosos genes, para de este modo comparar la expresión de genes en células tratadas y no tratadas con el producto terapéutico.

4.1 Productos terapéuticos para la sepsis

Los moduladores de IL-1 (por ejemplo, IL-1\alpha, IL-1\beta o el antagonista del receptor de IL-1) o una proteína codificada por un gen que está en desequilibrio de ligamiento con un gen IL-1 pueden comprender cualquier tipo de compuesto, incluyendo una proteína, un péptido, un peptidomimético, una molécula pequeña o un ácido nucleico. Los agonistas de IL-1 preferidos incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, que codifican una proteína IL-1 o un gen que está suprarregulado o infrarregulado por una proteína IL-1), proteínas (por ejemplo, proteínas IL-1 o una proteína que está suprarregulada o infrarregulada por las mismas) o una molécula pequeña (por ejemplo, que regula la expresión o unión de una proteína IL-1). Los antagonistas de IL-1 preferidos incluyen ácidos nucleicos [por ejemplo, DNA o PNA de cadena sencilla (antisentido) o doble (tríplex) y ribozimas], proteínas (por ejemplo, anticuerpos) y moléculas pequeñas que actúan para suprimir o inhibir la transcripción de IL-1 y/o la actividad de proteínas IL-1.

4.1.1 Dosis eficaz

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales determinando, por ejemplo, la dosis letal mediana (DL_{50}; dosis letal para el 50% de la población) y la dosis eficaz mediana (DE_{50}; dosis terapéuticamente eficaz para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico, y se puede expresar en forma de la relación DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos elevados. Aunque se pueden utilizar compuestos que presenten efectos secundarios tóxicos, se debería tener cuidado a la hora de diseñar un sistema de distribución que dirija dichos compuestos al sitio de los tejidos afectados, con objeto de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, de este modo, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos en cultivo celular y los estudios con animales pueden ser utilizados para formular una diversidad de dosificaciones para uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos se extiende preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método del invento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser inicialmente estimada a partir de ensayos en cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar un intervalo de concentraciones plasmáticas circulantes que incluya la concentración inhibitoria del 50% (CI_{50}; es decir, la concentración de compuesto de ensayo con la que se alcanza una inhibición semimáxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular. Dicha información puede ser utilizada para determinar más exactamente las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en el plasma pueden ser medidos, por ejemplo, mediante cromatografía de alta eficacia en fase líquida.

4.1.2 Formulación y uso

Las composiciones para uso de acuerdo con el presente invento pueden ser formuladas de un modo convencional utilizando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. De esta manera, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables se pueden formular para administración mediante, por ejemplo, inyección, inhalación o insuflación (sea a través de la boca o de la nariz), o para administración oral, bucal, parenteral o rectal.

Para dicha terapia, los compuestos del invento pueden ser formulados para una diversidad de cargas de administración, incluyendo las administraciones sistémica y tópica o localizada. En Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Company, Easton, Pennsylvania, EE.UU. se pueden encontrar generalmente técnicas y formulaciones. Para administración sistémica, se prefiere la inyección, incluyendo las inyecciones intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los compuestos del invento pueden ser formulados en disoluciones líquidas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como disolución de Hank y disolución de Ringer. Además, los compuestos pueden ser formulados en forma sólida y ser redisueltos o suspendidos inmediatamente antes de su uso. También se incluyen las formas liofilizadas.

Para administración oral, las composiciones pueden tomar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón pregelatinizado de maíz, polivinilpirrolidona e hidroxipropil-metilcelulosa), cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina e hidrogenofosfato de calcio), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco y sílice), agentes disgregantes (por ejemplo, almidón de patata y almidón-glicolato sódico) y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sódico). Las tabletas pueden ser revestidas mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, disoluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes suspendedores (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa y grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsivos (por ejemplo, lecitina y goma arábiga), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico y aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo y propilo y ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales tampón, agentes saboreadores, colorantes y agentes edulcorantes, según sea apropiado.

Las preparaciones para administración oral pueden ser adecuadamente formuladas para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de un modo convencional. Para administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con el presente invento son convenientemente distribuidos en forma de una presentación para pulverización de aerosoles desde envases presurizados o desde un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado tal como, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada al proporcionar una válvula que suministra una cantidad calibrada. Para uso en un inhalador o insuflador, se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina que contengan una mezcla pulverulenta del compuesto y una base pulverulenta adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden ser formulados para administración parenteral por inyección; por ejemplo, por inyección en bolo o por infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones y emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes suspendedores, estabilizadores y/o dispersivos. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma pulverulenta para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril y exenta de pirógenos, antes de su uso. Los compuestos pueden ser también formulados en composiciones rectales tales como supositorios, que contienen, por ejemplo, bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao y otros glicéridos, y enemas de retención.

Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos pueden ser también formulados como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de actuación prolongada pueden ser administradas mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con materiales polímeros o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Otros sistemas de distribución adecuados incluyen las microesferas, que ofrecen la posibilidad de una distribución local no invasiva de fármacos a lo largo de un periodo prolongado de tiempo. En esta tecnología se utilizan microesferas de tamaño precapilar que pueden ser inyectadas a través de un catéter coronario en cualquier parte seleccionada de, por ejemplo, el corazón u otros órganos, sin causar inflamación ni isquemia. El producto terapéutico administrado se libera lentamente de estas microesferas y es absorbido por las células tisulares circundantes (por ejemplo, células endoteliales).

La administración sistémica puede ser también por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera por la que hay que permear. Dichos agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, derivados del ácido fusídico y sales biliares para administración transmucosa. Además, se pueden utilizar detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosa puede ser mediante pulverizaciones nasales o utilizando supositorios. Para administración tópica, los oligómeros del invento son formulados en forma de ungüentos, pomadas, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Se puede utilizar localmente una disolución de lavado para tratar una lesión o inflamación, para acelerar la cicatrización.

Si se desea, las composiciones pueden ser presentadas en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. Por ejemplo, el envase puede comprender una lámina de metal o plástico, tal como un envase blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración.

4.2 Ensayos para identificar compuestos terapéuticos para la sepsis

Basándose en la identificación de mutaciones que causan, o contribuyen a, el desarrollo de un trastorno vascular, el invento presenta además ensayos basados en células o exentos de células para, por ejemplo, identificar compuestos terapéuticos para la sepsis. En una realización, una célula que expresa un receptor de IL-1 o un receptor de una proteína que es codificada por un gen que está en desequilibrio de ligamiento con un gen IL-1, presente en la superficie externa de su membrana celular, es incubada en presencia de un compuesto de ensayo solo o en presencia de un compuesto de ensayo y otra proteína, y se detecta la interacción entre el compuesto de ensayo y el receptor o entre la proteína (preferiblemente una proteína marcada) y el receptor utilizando, por ejemplo, un microfisiómetro [McConnell et al. (1992), Science 257: 1906]. La interacción entre el receptor y el compuesto de ensayo o la proteína es detectada por el microfisiómetro como un cambio en la acidificación del medio. Por lo tanto, este sistema de ensayo proporciona un medio para identificar antagonistas moleculares que, por ejemplo, actúan interfiriendo en interacciones proteína-receptor, así como agonistas moleculares que, por ejemplo, actúan activando un receptor.

También se pueden utilizar ensayos celulares o exentos de células para identificar compuestos que modulan la expresión de un gen IL-1 o un gen en desequilibrio de ligamiento con él, modulan la traducción de un mRNA o modulan la estabilidad de un mRNA o una proteína. En consecuencia, en una realización, una célula que es capaz de producir una IL-1 u otra proteína es incubada con un compuesto de ensayo, y la cantidad de proteína producida en el medio celular es medida y es comparada con la producida por una célula que no ha sido puesta en contacto con el compuesto de ensayo. La especificidad del compuesto con respecto a la proteína puede ser confirmada mediante diversos análisis testigo, tal como, por ejemplo, midiendo la expresión de uno o más genes testigo. En particular, este ensayo puede ser utilizado para determinar la eficacia de compuestos antisentido, ribozímicos y tríplex.

También se pueden utilizar ensayos exentos de células para identificar compuestos que son capaces de interaccionar con una proteína para modificar por ello la actividad de la proteína. Dicho compuesto puede, por ejemplo, modificar la estructura de una proteína afectando por ello a su capacidad para unirse a un receptor. En una realización preferida, los ensayos exentos de células para identificar dichos compuestos consisten esencialmente en una mezcla de reacción que contiene una proteína y un compuesto de ensayo o un banco de compuestos de ensayo, en presencia o ausencia de una pareja ligante. El compuesto de ensayo puede ser, por ejemplo, un derivado de una pareja ligante, por ejemplo, un péptido diana biológicamente inactivo, o una molécula pequeña.

En consecuencia, un ensayo de exploración ejemplar del presente invento incluye las operaciones de poner una proteína o un fragmento funcional de la misma en contacto con un compuesto de ensayo o un banco de compuestos de ensayo, y detectar la formación de complejos. Con fines de detección, la molécula se puede marcar con un marcador específico, y el compuesto de ensayo o el banco de compuestos de ensayo se pueden marcar con un marcador diferente. La interacción de un compuesto de ensayo con una proteína o un fragmento de la misma puede ser luego detectada determinando el nivel de los dos marcadores después de una operación de incubación y una operación de lavado. La presencia de dos marcadores después de la operación de lavado es indicativa de una interacción.

También se puede identificar una interacción entre moléculas utilizando un Análisis de Interacciones Biomoleculares [BIA; del inglés, Biomolecular Interaction Analysis (Pharmacia Biosensor AB) en tiempo real, que detecta la resonancia de plasmones superficiales (SPR; del inglés, surface plasmon resonance), un fenómeno óptico. La detección depende de cambios en la concentración másica de macromoléculas en la interfase bioespecífica, y no requiere la marcación de las sustancias interactivas. En una realización, se puede inmovilizar un banco de compuestos de ensayo en la superficie de un sensor que, por ejemplo, forma una pared de una célula de microflujo. Luego se hace fluir continuamente una disolución que contiene la proteína o un fragmento funcional de la misma sobre la superficie del sensor. Un cambio en el ángulo de resonancia, como se muestra en un registro de señales, indica que ha tenido lugar una interacción. Esta técnica se describe además en, por ejemplo, BIAtechnology Handbook de Pharmacia.

Otro ensayo de exploración ejemplar del presente invento incluye las operaciones de (a) formar una mezcla de reacción que incluye: (i) una IL-1 u otra proteína, (ii) un receptor apropiado y (iii) un compuesto de ensayo; y (b) detectar la interacción de la proteína y el receptor. Un cambio (potenciación o inhibición) estadísticamente significativo en la interacción de la proteína y el receptor en presencia del compuesto de ensayo con respecto a la interacción en ausencia del compuesto de ensayo indica un posible antagonista (inhibidor). Los compuestos de este ensayo pueden ser puestos simultáneamente en contacto. Alternativamente, se puede poner primero una proteína en contacto con un compuesto de ensayo durante un periodo apropiado de tiempo y añadir después el receptor a la mezcla de reacción. La eficacia del compuesto puede ser evaluada generando curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos al utilizar el compuesto de ensayo en diversas concentraciones. Además, se puede llevar también a cabo un ensayo testigo para proporcionar una línea de base para comparación.

La formación de complejos entre una proteína y un receptor puede ser detectada mediante diversas técnicas. La modulación de la formación de complejos puede ser cuantificada utilizando, por ejemplo, proteínas detectablemente marcadas tales como proteínas o receptores radiomarcados, fluorescentemente marcados o enzimáticamente marcados, mediante inmunoensayos o mediante detección cromatográfica.

Típicamente, será deseable inmovilizar la proteína o el receptor para facilitar la separación de los complejos de las formas no complejadas de una proteína o ambas proteínas, así como para facilitar la automatización del ensayo. La unión de la proteína y el receptor puede ser llevada a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener las sustancias reaccionantes. Los ejemplos incluyen placas para microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añada un dominio que permita que la proteína se una a una matriz. Por ejemplo, se puede hacer que glóbulos de glutatión-Sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, EE.UU.) o placas para microtitulación derivatizadas con glutatión adsorban proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa, las cuales se combinan luego con el receptor, por ejemplo, un receptor marcado con ^{35}S, y el compuesto de ensayo, y se puede incubar la mezcla bajo unas condiciones que conduzcan a la formación de complejos, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas en cuanto a sal y pH, aunque se pueden desear condiciones ligeramente más rigurosas. Después de la incubación, se lavan los glóbulos para eliminar todo marcador no unido, y se determinan directamente la matriz inmovilizada y el radiomarcador (por ejemplo, se ponen los glóbulos en líquido de centelleo) o en el sobrenadante una vez que se han disociado posteriormente los complejos. Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz y ser separados por SDS-PAGE, y el nivel de proteína o receptor hallado en la fracción globular puede ser cuantificado del gel utilizando técnicas electroforéticas estándares tales como las descritas en los ejemplos adjuntos. También se dispone de otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices, para uso en el ensayo objetivo. Por ejemplo, se puede inmovilizar la proteína o el receptor utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. También se pueden preparar animales transgénicos para identificar agonistas y antagonistas o para confirmar la seguridad y eficacia de un candidato terapéutico. Los animales transgénicos del invento pueden incluir animales no humanos que contengan una mutación causativa de sepsis bajo el control de un promotor endógeno apropiado o bajo el control de un promotor heterólogo.

Los animales transgénicos también pueden ser animales que contienen un transgén, tal como un gen informador, bajo el control de un promotor apropiado o un fragmento del mismo. Estos animales son útiles, por ejemplo, para identificar fármacos que modulan la actividad de una proteína IL-1, tal como modulando la expresión génica. Los métodos para obtener animales transgénicos no humanos son bien conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, la expresión de la mutación causativa de sepsis es restringida a subgrupos específicos de células, tejidos o fases de desarrollo utilizando, por ejemplo, secuencias de actuación en cis que controlan la expresión en el patrón deseado. En el presente invento, dicha expresión en mosaico de una proteína puede ser esencial para muchas formas de análisis de linajes y puede proporcionar además un medio para, por ejemplo, evaluar los efectos del nivel de expresión que podrían alterar en gran medida el desarrollo en pequeñas porciones de tejido de un embrión por lo demás normal. Con este fin, se pueden utilizar secuencias reguladoras tisularmente específicas y secuencias reguladoras condicionales para controlar la expresión de la mutación en ciertos patrones espaciales. Además, se pueden proporcionar patrones temporales de expresión mediante, por ejemplo, sistemas de recombinación condicionales o secuencias reguladoras transcripcionales procarióticas. Las técnicas genéticas que permiten que la expresión de una mutación pueda ser regulada a través de una manipulación genética in vivo específica del sitio son conocidas por los expertos en la técnica.

Todos los animales transgénicos del presente invento incluyen, en una pluralidad de sus células, un transgén causativo de sepsis por mutación del presente invento, transgén que altera el fenotipo de la "célula huésped". En una realización ilustrativa, se puede utilizar el sistema de recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1 [Lakso et al. (1992), PNAS 89: 6232-6236; Orban et al. (1992), PNAS 89: 6861-6865] o el sistema de recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae [O'Gorman et al. (1991), Science 251: 1351-1355; Publicación PCT WO 92/15694] para generar in vivo sistemas de recombinación genética específicos del sitio. La recombinasa Cre cataliza la recombinación, específica del sitio, de una secuencia diana intermedia situada entre secuencias loxP. Las secuencias loxP son secuencias de repetición nucleotídica de 34 pares de bases a las que se une la recombinasa Cre, y son necesarias para la recombinación genética mediada por la recombinasa Cre. La orientación de las secuencias loxP determina si la secuencia diana intermedia es escindida o invertida cuando está presente la recombinasa Cre [Abremski et al. (1984), J. Biol. Chem. 259: 1509-1514], catalizando la escisión de la secuencia diana cuando las secuencias loxP están orientadas como repeticiones directas y catalizando la inversión de la secuencia diana cuando las secuencias loxP están orientadas como repeticiones invertidas.

En consecuencia, la recombinación genética de la secuencia diana depende de la expresión de la recombinasa Cre. La expresión de la recombinasa puede ser regulada por elementos promotores que están sometidos a un control regulador, por ejemplo, específico del tejido, específico de la fase de desarrollo, inducible o reprimible por agentes externamente añadidos. Este control regulado dará lugar a la recombinación genética de la secuencia diana solamente en células en que la expresión de la recombinasa es mediada por el elemento promotor. De esta manera, la activación de la expresión del transgén causativo por mutación puede ser regulada a través del control de la expresión de la recombinasa.

El uso del sistema de recombinasa cre/loxP para regular la expresión de un transgén causativo por mutación requiere la construcción de un animal transgénico que contenga transgenes que codifiquen tanto la recombinasa Cre como la proteína objetivo. Se pueden obtener animales que contengan tanto la recombinasa Cre como el transgén causativo de sepsis por mutación mediante la construcción de animales transgénicos "dobles". Un método conveniente para obtener dichos animales es aparear dos animales transgénicos, cada uno de los cuales contiene un transgén.

Se pueden proporcionar transgenes condicionales similares utilizando secuencias promotoras procarióticas que requieran que se expresen simultáneamente proteínas procarióticas, con objeto de facilitar la expresión del transgén. En la Patente de EE.UU. nº 4.833.080 se proporcionan promotores ejemplares y las correspondientes proteínas procarióticas de activación en trans.

Además, la expresión de los transgenes condicionales puede ser inducida por métodos de tipo terapia génica mediante los cuales se distribuye un gen que codifica la proteína transactivadora, por ejemplo, una recombinasa o una proteína procariótica, al tejido y se causa su expresión, tal como de un modo específico del tipo celular. Mediante este método, el transgén podría permanecer silencioso en la adultez hasta que la introducción del transactivador lo "pusiera en marcha".

En una realización ejemplar, los "animales transgénicos no humanos" del invento son producidos al introducir transgenes en la línea germinal del animal no humano. Para introducir transgenes, se pueden utilizar células diana embrionarias en diversas fases de desarrollo. Se usan métodos diferentes dependiendo de la fase de desarrollo de la célula embrionaria diana. La(s) línea(s) específica(s) de cualquier animal utilizado para llevar este invento a la práctica es(son) seleccionada(s) en cuanto a buena salud general, buena producción de embriones, buena visibilidad pronuclear en el embrión y buena aptitud reproductora. Además, el haplotipo es un factor significativo. Por ejemplo, cuando se van a producir ratones transgénicos, se utilizan a menudo cepas tales como las líneas C57BL/6 y FVB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EE.UU.). Son cepas preferidas aquéllas con haplotipos H-2^{b}, H-2^{d} o H-2^{q}, tales como C57BL/6 y DBA/1. La(s) propia(s) línea(s) utilizada(s) para llevar este invento a la práctica puede(n) ser transgénica(s) y/o puede(n) ser inoperante(s) [es decir, obtenida(s) de animales que tienen uno o más genes parcial o completamente suprimidos].

En una realización, la construcción transgénica es introducida en un embrión en fase única. El cigoto es la mejor diana para microinyección. En el ratón, el diámetro del pronúcleo masculino alcanza un tamaño de aproximadamente 20 micrómetros, lo que permite la inyección reproducible de 1-2 pl de disolución de DNA. El uso de cigotos como diana para transferencia génica presenta una ventaja esencial ya que, en la mayoría de los casos, el DNA inyectado se incorporará al gen del huésped antes de la primera escisión [Brinster et al. (1985), PNAS 82: 4438-4442]. Como consecuencia, todas las células del animal transgénico llevarán el transgén incorporado. En general, esto también se reflejará en la transmisión eficaz del transgén a la descendencia del fundador ya que el 50% de las células germinales contendrán el transgén.

Normalmente, los embriones fertilizados son incubados en medios adecuados hasta que aparecen los pronúcleos. Aproximadamente en este momento, la secuencia nucleotídica que comprende el transgén es introducida en el pronúcleo femenino o masculino del modo descrito más adelante. En algunas especies, tales como los ratones, se prefiere el pronúcleo masculino. Es muy preferido que el material genético exógeno sea añadido al complemento masculino de DNA del cigoto antes de que sea procesado por el núcleo del óvulo o el pronúcleo femenino del cigoto. Se piensa que el núcleo del óvulo o el pronúcleo femenino liberan moléculas que afectan al complemento masculino de DNA, quizás al sustituir las protaminas del DNA masculino por histonas, lo que facilita la combinación de los complementos de DNA femenino y masculino para formar el cigoto diploide. De esta manera, se prefiere que el material genético exógeno sea añadido al complemento masculino de DNA o a cualquier otro complemento de DNA antes de que resulte afectado por el pronúcleo femenino. Por ejemplo, el material genético exógeno se añade al pronúcleo masculino precoz, lo más pronto posible después de la formación del pronúcleo masculino, que es cuando los pronúcleos masculino y femenino están bien separados y ambos están situados próximos a la membrana celular. Alternativamente, el material genético exógeno podría añadirse al núcleo del espermatozoide una vez que ha sido inducido a experimentar descondensación. Luego se puede añadir el espermatozoide que contiene el material genético exógeno al óvulo, o se podría añadir el espermatozoide descondensado al óvulo y añadir más tarde, lo más pronto posible, las construcciones
transgénicas.

La introducción de la secuencia nucleotídica transgénica en el embrión puede ser llevada a cabo mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, microinyección, electroporación o lipofección. Después de la introducción de la secuencia nucleotídica transgénica en el embrión, el embrión puede ser incubado in vitro durante periodos variables de tiempo o ser reimplantado en el huésped de alquiler, o ambas cosas. La incubación in vitro hasta la madurez está dentro del alcance de este invento. Un método habitual es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de la especie, y reimplantarlos luego en el huésped de alquiler.

Para los fines de este invento, un cigoto es esencialmente la formación de una célula diploide que es capaz de desarrollarse hasta un organismo completo. Generalmente, el cigoto estará compuesto de un huevo que contiene un núcleo formado, natural o artificialmente, mediante la fusión de dos núcleos haploides procedentes de un gameto o unos gametos. De esta manera, los núcleos de los gametos deben ser unos que sean naturalmente compatibles, es decir, unos que den lugar a un cigoto viable capaz de experimentar diferenciación y desarrollarse hasta un organismo funcional. Se prefiere generalmente un cigoto euploide. Si se obtiene un cigoto aneuploide, el número de cromosomas no debería variar entonces en más de uno con respecto al número euploide del organismo a partir del cual se origina cualquier gameto.

Además de consideraciones biológicas similares, las físicas también regulan la cantidad (por ejemplo el volumen) de material genético exógeno que puede ser añadido al núcleo del cigoto o al material genético que forma una parte del núcleo del cigoto. Si no se elimina material genético, la cantidad de material genético exógeno que se puede añadir viene entonces limitada por la cantidad que será absorbida sin que resulte físicamente alterada. En general, el volumen de material genético exógeno insertado no excederá de aproximadamente 10 picolitros. Los efectos físicos de la adición no han de ser tan grandes como para destruir físicamente la viabilidad del cigoto. El límite biológico del número y la variedad de secuencias de DNA variará dependiendo del cigoto particular y de las funciones del material genético exógeno, y resultará evidente para un experto en la técnica porque el material genético, incluyendo el material genético exógeno, del cigoto resultante debe ser biológicamente capaz de iniciar y mantener la diferenciación y el desarrollo del cigoto hasta un organismo funcional.

El número de copias de las construcciones transgénicas que se añaden al cigoto depende de la cantidad total de material genético exógeno añadido y será la cantidad que permita que se produzca la transformación genética. Teóricamente, sólo se necesita una copia; sin embargo, se utilizan generalmente numerosas copias de la construcción transgénica, por ejemplo, 1000-20.000 copias, con objeto de asegurar que una copia sea funcional. En cuanto al presente invento, a menudo será una ventaja el tener más de una copia en funcionamiento de cada una de las secuencias de DNA exógenas insertadas, para potenciar la expresión fenotípica de las secuencias de DNA exógenas.

Se puede utilizar cualquier técnica que permita la adición del material genético exógeno al material genético nucleico con tal de que no sea destructiva para la célula, la membrana nuclear ni otras estructuras celulares o genéticas existentes. El material genético exógeno es preferentemente insertado en el material genético nucleico por microinyección. La microinyección de células y estructuras celulares es conocida y se usa en la técnica.

La reimplantación es llevada a cabo utilizando métodos estándares. Normalmente, se anestesia al huésped de alquiler y se insertan los embriones en el oviducto. El número de embriones implantados en un huésped concreto variará con la especie, pero normalmente será comparable al número de descendientes que la especie produce naturalmente.

La descendencia transgénica del huésped de alquiler puede ser explorada en cuanto a la presencia y/o la expresión del transgén por cualquier método adecuado. La exploración se realiza a menudo mediante análisis por transferencia Southern o transferencia Northern utilizando una sonda que es complementaria de al menos una porción del transgén. El análisis por transferencia Western utilizando un anticuerpo contra la proteína codificada por el transgén puede ser empleado como un método alternativo o adicional para explorar la presencia del producto del transgén. Típicamente, se prepara DNA de tejido de la cola y se analiza por análisis Southern o PCR en cuanto al transgén. Alternativamente, los tejidos o células de los que se cree que expresan el transgén con los mayores niveles son examinados en cuanto a la presencia y la expresión del transgén utilizando análisis Southern o PCR, aunque se pueden utilizar cualesquier tejidos o tipos celulares para este análisis.

Los métodos alternativos o adicionales para evaluar la presencia del transgén incluyen, sin limitación, ensayos bioquímicos adecuados tales como ensayos enzimáticos y/o inmunológicos, tinciones histológicas para actividades de marcadores o enzimas particulares, análisis citométrico de flujo, y similares. El análisis de la sangre puede ser también útil para detectar la presencia del producto transgénico en la sangre así como para evaluar el efecto del transgén sobre los niveles de diversos tipos de células sanguíneas y otros componentes sanguíneos.

Se puede obtener progenie de los animales transgénicos al aparear el animal transgénico con una pareja adecuada o mediante la fertilización in vitro de huevos y/o espermatozoides obtenidos del animal transgénico. Cuando se va a llevar a cabo el apareamiento, la pareja puede ser transgénica y/o inoperante o no serlo; cuando es transgénica, puede contener el mismo transgén o un transgén diferente, o ambos. Alternativamente, la pareja puede ser una línea parental. Cuando se utiliza la fertilización in vitro, el embrión fertilizado puede ser implantado en un huésped de alquiler o ser incubado in vitro, o ambas cosas. Sea cual sea el método, la progenie puede ser evaluada en cuanto a la presencia del transgén usando métodos anteriormente descritos u otros métodos apropiados.

Los animales transgénicos producidos de acuerdo con el presente invento incluirán material genético exógeno. Además, en dichas realizaciones, la secuencia será fijada a un elemento de control transcripcional, tal como, por ejemplo, un promotor, que permita preferiblemente la expresión del producto transgénico en un tipo específico de célula.

También se puede usar la infección retrovírica para introducir el transgén en un animal no humano. El embrión no humano en desarrollo puede ser cultivado in vitro hasta la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para la infección retrovírica [R. Jaenich (1976), PNAS 73: 1260-1264]. Se obtiene la infección eficaz de los blastómeros por tratamiento enzimático para eliminar la zona pelúcida (Manipulating the Mouse Embryo, compilado por Hogan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). El sistema vectorial vírico utilizado para introducir el transgén es típicamente un retrovirus que lleva el transgén, defectuoso en cuanto a la replicación [Jahner et al. (1985), PNAS 82: 6927-6931; Van der Putten et al. (1985), PNAS 82: 6148-6152]. Se obtiene fácil y eficazmente la transfección cultivando los blastómeros en una monocapa de células productoras de virus [Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987), EMBO J. 6: 383-388]. Alternativamente, la infección se puede llevar a cabo en una fase posterior. Se pueden inyectar virus o células productoras de virus en el blastocele [Jahner et al. (1982), Nature 298: 623-628]. La mayoría de los fundadores serán mosaicos para el transgén ya que sólo tiene lugar la incorporación en un subgrupo de las células que formaron el animal transgénico no humano. Además, el fundador puede contener diversas inserciones retrovíricas del transgén en diferentes posiciones del genoma, que generalmente se segregarán en la descendencia. Además, también es posible introducir transgenes en la línea germinal por infección retrovírica intrauterina del embrión a media gestación [Jahner et al. (1982), supra].

Un tercer tipo de célula diana para la introducción de transgenes es la célula madre embrionaria (ES; del inglés, embryonal stem). Se obtienen células ES a partir de embriones de preimplantación cultivados in vitro y se fusionan con embriones [Evans et al. (1981), Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984), Nature 309: 255-258; Gossler et al. (1986), PNAS 83: 9065-9069; y Robertson et al. (1986), Nature 322: 445-448]. Se pueden introducir eficazmente transgenes en las células ES por transfección de DNA o por transducción mediada por retrovirus. Más adelante, dichas células ES transformadas pueden ser combinadas con blastocistos de un animal no humano. Más adelante, las células ES colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante. Para una revisión, véase R. Jaenisch (1988), Science 240: 1468-1474.

El presente invento es adicionalmente ilustrado mediante los ejemplos siguientes, que no deben ser considerados limitantes en modo alguno. En la práctica del presente invento se emplearán, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales que están dentro de la experiencia de este campo técnico. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (2ª edición, compilado por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); "DNA Cloning", Volúmenes I y II (compilado por D. N. Glover, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (compilado por M. J. Gait, 1984); Patente de EE.UU. nº 4.683.195; Patente de EE.UU. nº 4.683.202; y "Nucleic Acid Hybridization" (compilado por B. D. Hames y S. J. Higgins, 1984).

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Ejemplo 1

Un polimorfismo del gen de la interleucina 1 y muerte en la enfermedad meningocócica

Se llevó a cabo un estudio sobre control de casos en pacientes caucásicos de 40-70 años de edad con enfermedad meningocócica documentada, de los que 31 murieron y 97 sobrevivieron. Se genotipó el DNA de estos pacientes para polimorfismos conocidos en el gen IL-1A (en la posición -889), en el gen IL-1B (en las posiciones -511 y + 3954), y en el intrón 2 (+2018) del gen IL-1RN y el gen de TNF \alpha (en la posición -308).

Como se muestra en la Tabla 1 siguiente, los pacientes que eran homocigóticos para el alelo 2 de IL-1B (-511) presentaron mayor probabilidad de morir [relación de probabilidades ("odds ratio"): 5,10; intervalo de confianza de 95%: 1,61-16,17; P = 0,001]. El hecho de portar una sola copia del alelo -511 no resultó significativamente asociado con la muerte. Los polimorfismos con cualquiera de los otros genes estudiados no resultaron significativamente asociados con la muerte.

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Ejemplo 2

Identificación de IL-1B (-511)

Esta variación de una sola base C/T en el promotor de IL-1 beta fue descrita por F. S. di Giovine et al. (1992), Hum. Mol. Genet. 1: 450. El número de acceso del gen es X04500.

Se utilizan MgCl_{2} en una concentración final de 2,5 mM y cebadores de PCR [5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3' (ID. SEC. nº 15) y 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3' (ID. SEC. nº 16) en una concentración de 1 \muM. Se llevan a cabo los ciclos del modo siguiente: [95º, 1 min] x1; [95º, 1 min; 53º, 1 min; 72º, 1 min] x35; [72º, 5 min] x1; 4ºC. Cada mezcla de reacción PCR es dividida en dos partes alícuotas de 25 \mul; a una se añaden 3 unidades de Ava I, a la otra 3,7 unidades de Bsu 361, además de 3 \mul del tampón de restricción 10X específico. La incubación es a 37ºC durante la noche. La electroforesis es por PAGE al 9%.

Interpretación. Las dos enzimas cortan respectivamente los dos alelos diferentes. Ava I producirá 190 + 144 para el alelo 1, aunque no corta el alelo 2 (304 bp). El patrón de restricción obtenido debería ser el inverso en las dos partes alícuotas (identificación de homocigotos) o idéntico (heterocigotos). Las frecuencias en la Población Caucásica Británica del Norte son 0,61 y 0,39. En una colección genética similar, para una potencia de 90% con un nivel de significación de 0,05 se deberían estudiar 133 casos para detectar un aumento de frecuencia de 1,5 veces, o 505 para un aumento absoluto de frecuencia de 0,1.

Claims (16)

1. Un método para determinar si un sujeto es o no es susceptible a desarrollar sepsis y/o a progresar rápidamente hasta sepsis, método que comprende las operaciones de:

a) obtener una muestra de ácido nucleico del sujeto; y

b) detectar un alelo del patrón 2 de IL-1 en dicha muestra, en que el alelo del patrón 2 de IL-1 es seleccionado del grupo que consiste en el alelo 1 de IL-1A (+4845) y el alelo 2 de IL-1B (-511),

en que la detección de un alelo del patrón 2 indica que el paciente presenta una susceptibilidad aumentada a desarrollar sepsis.

2. El método de la Reivindicación 1, en que el alelo del patrón 2 de IL-1 es el alelo 1 de IL-1A (+4845).

3. El método de la Reivindicación 1, en que dicha operación de detección es seleccionada del grupo que consiste en:

a) hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo;

b) análisis de tamaños:

c) secuenciación;

d) hibridación;

e) digestión con nucleasas 5';

f) polimorfismo de conformación de cadena sencilla;

g) hibridación específica de alelos;

h) extensión específica de cebadores; y

j) ensayo de ligación de oligonucleótidos.

4. El método de la Reivindicación 1, que comprende además multiplicar la muestra de ácido nucleico.

5. El método de la Reivindicación 3, en que dicho análisis de tamaños va precedido de una digestión con enzimas de restricción.

6. El método de la Reivindicación 1, en que el alelo del patrón 2 de IL-1 es el alelo 2 de IL-1B (-511).

7. Un método para seleccionar un compuesto terapéutico para el tratamiento o la prevención de la sepsis en un sujeto, que comprende:

a) determinar si el sujeto tiene un alelo del patrón 2 de IL-1, en que el alelo del patrón 2 de IL-1 es seleccionado del grupo que consiste en el alelo 1 de IL-1A (+4845) y el alelo 2 de IL-1B (-511); y

b) seleccionar un compuesto terapéutico apropiado para la sepsis.

8. El método de la Reivindicación 7, en que dicha detección es llevada a cabo utilizando una técnica seleccionada del grupo que consiste en:

a) hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo;

b) análisis de tamaños:

c) secuenciación;

d) hibridación;

e) digestión con nucleasas 5';

f) polimorfismo de conformación de cadena sencilla;

g) hibridación específica de alelos;

h) extensión específica de cebadores; y

j) ensayo de ligación de oligonucleótidos.

9. El método de la Reivindicación 8, en que la muestra de ácido nucleico es sometida a una operación de multiplicación.

10. El método de la Reivindicación 8, en que dicho análisis de tamaños va precedido de una digestión con enzimas de restricción.

11. El método de la Reivindicación 7, en que el compuesto terapéutico para la sepsis es un modulador de una actividad de IL-1.

12. El método de la Reivindicación 11, en que la actividad de IL-1 es IL-1\alpha.

13. El método de la Reivindicación 11, en que la actividad de IL-1 es IL-1\beta.

14. El método de la Reivindicación 11, en que la actividad de IL-1 es IL-1RN.

15. El método de la Reivindicación 11, en que el modulador es un agonista de IL-1.

16. El método de la Reivindicación 11, en que el modulador es un antagonista de IL-1.