ES2307566T3

ES2307566T3 - Composiciones estables para el cuidado de la piel que contienen un retinoide y un sistema reforzador del retinoide.

Info

Publication number: ES2307566T3
Application number: ES01272638T
Authority: ES
Inventors: Stewart Paton Unilever Research Colworth GRANGER; Prem Unilever Research U.S. Inc. CHANDAR; Ian Richard Unilever Research U.S. Inc. SCOTT
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2021-12-06
Also published as: KR20030074689A; MXPA03005931A; DE60135020D1; KR100865421B1; ATE401855T1; AU2002216090B2; US6949247B2; EP1349536A2; JP2004526690A; US20030049286A1; WO2002053124B1; WO2002053124A2; CN1575161A; CA2431540C; CA2431540A1; WO2002053124A3; EP1349536B1; ZA200304440B; CN1330291C

Abstract

Una composición estable de cuidado de la piel conteniendo: entre aproximadamente el 0,0001% y aproximadamente el 50% de al menos dos reforzadores de retinoide en el que al menos un reforzador se selecciona del grupo constituido por citral, damascenona, 1,3-dimetil 2 imidazolidinona, geraniol, N-lauroil sarcosina, linoleamida DEA, alfa ionona; y al menos un reforzador de retinoide seleccionado del grupo constituido por, cetoconazol, miconazol, climbazol, amino benzotriazol, 3,4-dihidroquinolina, y 2-hidroxiquinolina; entre aproximadamente el 0,001% y aproximadamente el 10% de un retinoide seleccionado del grupo constituido por retinil ésteres, retinol, retinal y mezclas de los mismos; y un vehículo cosméticamente aceptable, en el que la composición estable para el cuidado de la piel está contenida en un envase para que la composición no esté en contacto con el oxígeno; en el que el envase está hecho de aluminio.

Description

Composiciones estables para el cuidado de la piel que contienen un retinoide y un sistema reforzador del retinoide.

La invención se refiere a composiciones estables para el cuidado de la piel que incluyen retinoide y un sistema reforzador del retinoide contenidos en envases de manera que los composiciones no estén en contacto con el oxígeno.

Los retinoides (p.e. retinol y retinil ésteres) son ingredientes comunes en productos cosméticos. El retinol (vitamina A) es un compuesto endógeno que se encuentra naturalmente en el cuerpo humano y es esencial para la diferenciación normal de la célula epitelial. Los derivados naturales y sintéticos de vitamina A se han usado extensamente en el tratamiento de distintos trastornos dérmicos y se han usado como agentes reparadores dérmicos ó renovadores El ácido retinoico se ha empleado para tratar una variedad de condiciones dérmicas, e.g..., acné, arrugas, psoriasis, manchas de la edad y decoloración. Ver p.e. Vahlquist, A. et. al., J. Invest. Dermatol., Vol. 94, Holland D.B. and Cunliffe, W.J. (1990), PP. 496-498; Ellis, C.N. et. Al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Basel, Karger, Vol. 3,(1989), pp. 249-252; y PCT Patent Aplication Nº. WO 93/19743.

El retinol, sin embargo, es particularmente inestable en las formulaciones cosméticas ya que puede sufrir degradación química como consecuencia de muchos factores los que incluyen oxidación, inestabilidad térmica y degradación inducida por UV. Los retinil ésteres también están sujetos a estas inestabilidades aunque en menor grado que el retinol. Los beneficios de los retinoides en la piel pueden ser mejorados con la aplicación conjunta de moléculas reforzadoras de retinoides. Sin embargo, muchas si no todas las moléculas reforzadoras de retinoides también incrementan la inestabilidad del retinol. Por lo tanto es necesario proteger en mayor grado las formulaciones que contienen reforzadores, que las que contienen solo retinol.

Varias referencias buscan crear composiciones estables que contengan retinol. Por ejemplo, U.S. Patent
Nº 5,976,555 asignada a Johnson & Johnson, describe composiciones para el cuidado de la piel que constan de emulsiones de aceite en agua que contienen retinoides, un sistema emulsionante, y un co - emulsionante. La patente describe el uso de un recipiente para almacenar la composición de manera que la composición no este en contacto con oxígeno. El recipiente se describe para el uso de la composición retinoide y un sistema emulsionante y co - emulsionante solo y no protege al retinoide de la degradación debida al contacto con reforzadores de retinoides.

La U.S.Patent Nº 5, 800,596, asignada a L'Oreal, desvela una emulsión de agua en aceite que contiene retinol en un dispositivo de administración que tiene paredes impermeables al oxígeno o a la luz UV, y un dispositivo de retención de oxigeno. La patente no enseña o sugiere el uso de reforzadores y los problemas asociados con la estabilidad del retinoide en la presencia de reforzadores.

Ninguna de las referencias antes citadas enseña o sugieren sistemas para la estabilización de composiciones retinoides en presencia de reforzadores de retinoides. Por consiguiente, continúa existiendo la necesidad de tales composiciones cosméticas estables que contengan retinoides y reforzadores de retinoides.

La presente invención proporciona una composición estable para el cuidado de la piel que contiene:

Entre el 0,0001% y el 50% de al menos dos reforzadores de retinoides en los que por lo menos un reforzador se selecciona del grupo constituido por citral, damascenona, 1,3-dimetil 2 imidazolidinona, geraniol, N-lauroil sarcosina, linoleamida DEA, alfa ionona; y

Por lo menos un reforzador de retinoide seleccionado del grupo constituido por cetoconazol, miconazol, climbazol, amino benzotriazol, 3,4-di-hidroxiquinolina, y 2-hidroxiquinolina;

Entre el 0,001% y el 10% de un retinoide seleccionado del grupo constituido por retinil ésteres, retinol, retinal, y mezclas del mismo; y

Un vehículo cosméticamente aceptable, en el que la composición estable para el cuidado de la piel esta contenida en un envase para que la composición no esté en contacto con el oxígeno.

En el que el envase está hecho de aluminio.

Las composiciones de la invención contienen como ingrediente preferido retinol o retinil éster. El término "retinol" incluye los siguientes isómeros de retinol: todos los trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retino, 9-cis-retinol, 3,4-didehidroretinol, 3,4-didehidro-13-cis-retinol; 3,4-didehidro-11-cis-retinol; 3,4-didehidro-9-cis-retinol. Los isómeros preferidos son todos los trans-retinol, 13-cis-retinol, 3,4-didehidro-retinol, 9-cis-retinol. Los más preferidos son todos los trans-retinol, debido a su disponibilidad comercial.

El retinil éster es un éster de retinol. El término "retinol" se ha definido arriba. Los retinil ésteres adecuados para el uso en la presente invención son los ésteres C_{1}-C_{30} de retinol, preferiblemente ésteres C_{2}-C_{20}, y más preferiblemente ésteres C_{2}, C_{3}, y C_{16} porque están comúnmente más disponibles. Ejemplos de retinil esteres incluyen, aunque no se limitan a: palmitato de retinilo, formato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo, butirato de retinilo, valerato de retinilo, isovalerato de retinilo, hexanoato de retinilo, heptanoato de retinilo, octanoato de retinilo, nonanoato de retinilo, decanoato de retinilo, undecanoato de retinilo, laurato de retinilo, tridecanoato de retinilo, miristato de retinilo, pentadecanoato de retinilo, heptadecanoato de retinilo, estearato de retinilo, isoestearato de retinilo, nonadecanoato de retinilo, araquidonato de retinilo, behenato de retinilo, linoleato de retinilo, oleato de retinilo.

El éster preferido para su uso en la presente invención se selecciona del palmitato de retinilo, del acetato de retinilo, y del propionato de retinilo, ya que son los más comercialmente disponibles y por lo tanto los más baratos. El linoleato de retinilo y el oleato de retinilo también son preferidos por su eficacia.

El retinol o éster de retinol se emplea en la composición de la invención en una cantidad de entre el 0,001% y el 10% preferiblemente en cantidades de entre el 0,01% y el 1%, preferiblemente n cantidades de entre el 0,01% a y el 0,5%.

Se cree que los retinoides se convierten enzimáticamente en la piel en ácido retinoico de acuerdo con el mecanismo descrito en el Gráfico 1.

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Metabolismo del retinol en la epidermis: nombres de enzimas

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Se ha descubierto, sorprendentemente, que ciertos compuestos inhiben la ARAT/LRAT, la retinal reductasa,la CRABPII y la oxidación del ácido retinoico (el ultimo catalizado por los sistemas citocromo P450), mientras que algunos otros compuestos refuerzan la retinol deshidrogenasa. Los compuestos son colectivamente denominados en esta invención como "reforzadores" y están codificados como grupos B1 a B5, como puede verse arriba en el Grafico 1 Los reforzadores, solos o en combinación unos con otros, potencian la acción de un retinoide incrementando las cantidades de retinol disponibles para la conversión a ácido retinoico e inhibiendo la degradación de ácido retinoico. Los reforzadores actúan en conjunción con los retinoides, p.e. Retinol, retinil éster, retinal, ácido retinoico), el último presente en forma endógena en la piel. La composición preferida, sin embargo, incluye un retinoide en la composición, junto con por lo menos dos reforzadores, para optimizar el rendimiento.

La presente invención incluye, en parte, una segunda composición conteniendo entre e 0,0001% y el 50% preferiblemente entre el 0,001% y el 10%, mas preferiblemente entre el 0,001% y el 5% del peso de la composición de al menos dos componentes reforzadores en el que el componente, tanto solo como en una concentración combinada de 10 mM, inhiba transglutaminasa en un análisis de transglutaminasa in vivo de mas del 50%, y un vehículo cosméticamente aceptable.

Los reforzadores incluidos en la composición de la invención se seleccionan del grupo compuesto por:

(a): Dos reforzadores, en los que ambos son seleccionados del mismo grupo compuesto por

: B2; B3; B4;

(b): Combinaciones binarias de reforzadores seleccionados de grupos constituidos por:

: B1/B2; B1/B3; B1/B4; B1/B5; B2/B3; B2/B4; B2/B5, B3/B4; B3/B5; B4/B5

(c): Combinaciones ternarias de reforzadores seleccionados de grupos constituidos por

: B1/B2/B3; B1/B2/B4; B1/B2/B5; B1-B3/B4; B1/B3/B5; B1/B4/B5; B2/B3/B4; B2/B3/B5; B2/B4/B5; B3/B4/B5

(d): Combinaciones cuaternarias de reforzadores seleccionados del grupo constituido por

: B1/B2/B3/B4; B1/B2/B3/B5; B1/B2/B4/B5; B1/B3/B4/B5; B2/B3/B4/B5; y

(e): Una combinación de cinco grupos de reforzadores:

: B1/B2/B3/B4/B5.

La composición preferida incluye al menos un reforzador de grupos diferentes (p.e., grupos (b) a través de grupos(e) mencionados arriba). Sin embargo, cualquier combinación de reforzadores elegidos de los diferentes grupos pueden emplearse también en las composiciones de la invención para los efectos reforzadores deseados.

Los compuestos incluidos en la presente invención como reforzadores son seleccionados basándose en primer lugar en la capacidad de los mismos para pasar, a una cierta concentración listada en la Tabla A, un Ensayo Microsomal in-vitro para una encima específica como se describe mas abajo en las secciones 2.1 a 2.7. El componente (solo o en combinación con otro reforzador) se somete entonces a un ensayo in vitro con transglutaminasa descrito abajo, a una concentración individual o combinada de 10 mM. Si tal combinación inhibe la transglutaminasa a más del 50%, entonces es adecuada para su uso en la presente invención. Si un reforzador fue examinado individualmente, y pasó el ensayo transglutaminasa, entonces puede ser combinado con otro reforzador o combinación que haya pasado el ensayo transglutaminasa.

Las composiciones preferidas de acuerdo con la presente invención contienen combinaciones de reforzadores que a una concentración individual de 10 mM inhiben la transglutaminasa a más del 50%.

El término "acondicionamiento" tal como se usa en esta invención significa prevención y tratamiento de piel seca, acné, piel dañada por el sol, aparición de arrugas, manchas de la edad, piel envejecida, incremento de la flexibilidad del estrato córneo, aclaramiento del color de la piel, control de la excreción de sebo y en general aumento de la calidad de la piel. La composición puede usarse para mejorar la descamación de la piel y la diferenciación epidérmica.

Un reforzador es un componente que supera un Ensayo Microsomal in vitro descrito mas adelante en las secciones 2.1 a 2.7. Un compuesto adecuado para el uso en la presente invención inhibe o mejora a una concentración listada en la Tabla A, una enzima, a por lo menos un amplio % listado en la Tabla A.

TABLA A Evaluación de Concentraciones y % Inhibición/Incremento de reforzadores

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Los Ensayos Microsomales empleados para determinar la idoneidad de la inclusión del compuesto en la composición de la invención son los siguientes:

1. Materiales

Todos los trans-retinol, todos los trans-ácido retinóico, palmitoil CoA, dilauroil fosfatidil colina, NAD y NADPH se adquirieron de Sigma Chemical Company. El stock de soluciones de retinoides para los ensayos microsomales se realizaron en HPCL de acetonitrilo en gradiente. Todas las soluciones estándar de retinoides para el análisis de HPCL se prepararon en etanol, se almacenaron bajo una atmósfera de N2 a - 70ºC y se mantuvieron en hielo bajo luz ámbar mientras no estaban almacenadas. Se dispuso comercialmente de otros químicos e inhibidores a partir de proveedores o compañías químicas tales como Aldrich o International Flavors and Fragances

2. Procedimiento 2.1. Aislamiento de microsomas RPE (a partir de. C. Saari & D. L. Bredberg, "CoA and non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium", J. Hill. Chem. 263, 8084-8090 (1988))

Se obtuvieron 50 globos oculares de vaca seccionados a la mitad, con la retina y el humor acuoso removidos, de W. L. Lawson Co., Lincoln, NE, USA. Los ojos fueron descongelados durante la noche y la membrana iridiscente coloreada fue removida despegándola con fórceps. Cada globo ocular fue lavada con 2 x 0,5 mL de tampón frío (PO4 0,1M/DTT 1 mM/sacarosa 0,25M, pH 7) frotando as células pigmentadas oscuras con un pincel artístico o un caucho policía Se agregó la suspensión celular a las membranas iridiscentes y la suspensión se agitó durante varios minutos en un vaso precipitador con un agitador de Teflón. Se filtró la suspensión a través de un filtro grueso (malla de polietileno Spectra/Por con un tamaño de poro 925 \mu) para extraer grandes partículas, y la suspensión de color oscuro resultante se homogeneizó usando un Glas - Col con un homogeinizador de Teflón motorizado. El homogeneizado celular se centrifugó durante 30 min. a 20.000 g (Centrifugadora Sorvaal modelo RC - 5B) con un rotor SS34 en tubos de 2,5 x 10 cm a 14.000 RPM). El sobrenadante resultante se sometió a una centrifugación adicional durante 10 min. a 150.000 g Ultracentrífuga modelo Beckman L80 con un rotor SW50.1 en tubos de 13 x 51 mm a 40.000 RPM). Los sedimentos resultantes se dispersaron en \sim5 mL de tampón 0,1 M P040,1M/5 mM DTT 5 mM pH 7 usando un Sistemas Ultrasónicos de Calor, Inc modelo W185D Disruptor Celular Ultrasónico y la dispersión microsomal resultante se dividió en alícuotas en pequeños tubos y se almacenó a -70ºC. Las concentraciones de proteínas de los microsomas se determinaron usando el ensayo de unión BioRad Dye, utilizando BSA como el estándar.

2.2 Aislamiento de microsomas de hígado de rata (R. Martini & M. Murray, "Participation of P450 3ª Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-Hydroxylation", Archives Biochem. Biophys. 303, 57-66 (1993))

Se homogeneizaron aproximadamente 6 gramos de hígado de rata congelado (obtenidos de ratas Harlan Sprague de Achúrate Chemical and Scientific Corp.) en 3 volúmenes de tampón tris 0,1M/KCl 0,1M/EDTA 1 mM/sacarosa 0,25M, pH 7,4 usando un Brinkmann Polytron. La suspensión de tejido resultante se homogeneizó en el homogeneizador de Teflón motorizado descrito arriba. El homogeneizado resultante se centrifugó sucesivamente durante 30 min. a 10.000 g, 30 min. a 20.000 g, y 15 min. a 30.000 g, y el sobrenadante resultante se ultracentrifugó durante 80 min a 105.000 g. El sedimento se sometió a ultrasonido en \sim5 mL de tampón PO_{4} 0,1M/EDTA 0,1 mM/MgCl_{2} 5 mM, pH 7,4 tal como se describe antes y almacenado como alícuotas a -70ºC. Las concentraciones de proteínas se determinaron como se describe arriba.

2.3 Ensayo para actividad ARAT y LRAT. (Para identificar B1)

El procedimiento descrito a continuación es una modificación de el método descrito en J. C. Saari & D. L. Bredberg, "ARAT & LRAT Activities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomas", Methods Enzymol. 190, 156-163 (1990). El siguiente tampón se preparó y almacenó a 4ºC: PO_{4} 0,1M/ditrioteitol 5 mM, pH 7,0 (PO_{4}/DTT). En el día del ensayo, se agregaron 2 mg de BSA por mL para dar un tampón PO_{4}/DTT/BSA de trabajo. El sustrato de retinol 1 mM se preparó en acetonitrilo y se almacenó en botellas ambarinas en gas nitrógeno a - 20ºC. Las soluciones de palmitoil-CoA 4 mM en tampón de trabajo (almacenados en alícuotas) y la dilauroil fosfatidil colina 4 mM en etanol se prepararon y almacenaron a -20ºC. Los inhibidores se prepararon como stock de soluciones 10 mM en H_{2}O, etanol, acetonitrilo o DMSO. La solución amortiguadora se preparó usando etanol puro que contenía de hidroxitolueno butilado (BHT) 50 \muM/mL, y se usó una solución de hexano conteniendo de BHT 50 \muM/mL para las extracciones.

Para un vial de vidrio de dos dram, se añaden en el siguiente orden: tampón PO_{4}/DTT/BSA para darle un volumen total de 500 \muL, 5 \muL de donante acilo (palmitoil-CoA 4 mM y/ó dilauroil fosfatidil colina), 5 \muL de inhibidor o solvente blanco (stock 10 mM o diluciones adicionales) seguido de aproximadamente 15 \mug de proteína microsomal RPE (aproximadamente 15 \muL de una alícuota de proteína microsomal \sim1 mg/mL). Incubar durante 5 min. a 37ºC para equilibrar la temperatura de reacción y entonces agregar 5 \muL de retinol 1 mM. Tapar los viales, mezclar en el vortex durante 5 segundos e incubar durante 30-90 minutos a 37ºC. Amortiguar la reacción agregando 0,5 mL de etanol/BHT. Extraer los retinoides añadiendo 3 mL de hexano/BHT, mezclar en el vortex durante varios segundos varias veces y centrifugar los tubos a baja velocidad por 5 min. para separar rápidamente las capas. Extraer la capa superior de hexano en un vial limpio, y volver a extraer la capa acuosa con otros 3 mL de hexano/BHT, como se describió arriba. Combinar las capas de hexano y evaporar el hexano por secado a 37ºC bajo un chorro de gas nitrógeno sobre un bloque de aluminio caliente. Almacenar el residuo seco hasta el análisis HPCL a -20ºC. Medir la cantidad de palmitato de retinilo y laurato de retinilo para la actividad ARAT y LRAT, respectivamente, por integración de la señal HPCL como se describe mas abajo.

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Advertir que las soluciones de incubación contienen donante acilo 40 \muM, inhibidor 100 \muM o menos, retinol 10 \muM, aproximadamente 30 \mug/mL de proteína microsomal, y aproximadamente PO_{4} 0,1M, pH 7/DTT 5 mM/BSA 2 mg/mL. Todos los pasos posteriores al agregado de retinol se realizaron en la oscuridad o bajo luces ámbar.

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2.4 Ensayo para Actividad Retinol Deshidrogenasa. (Para identificar B2)

Se prepararon las siguientes soluciones de stock.

\quad: Tampón KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7.4, filtrado estéril.

\quad: Todos los trans-retinol 10 mM (Sigma R7632) en DMSO.

\quad: Fosfato dinucleótido de nicotinamida adenina 200 mM, sal sódica (NADP) (Sigma N0505) en agua estéril.

\quad: Compuesto de ensayo 40 mM en solvente apropiado (agua, tampón, etanol, cloroformo o DMSO).

\quad: Dilución 1:10 de microsomas de hígado de rata en tampón KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7.4 (4 ug/ul).

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En un vial de dos dram con tapa a rosca, se añaden los siguientes en orden:

\quad: Tampón para dar un volumen final de 400 \mul

\quad: 25 \mul de Microsomas diluidos (final = 100 \mug) - usar microsomas hervidos para los controles y microsomas regulares para las muestras de ensayo.

\quad: 4 \mul de NADP 200 mM (final = 2 mM)

\quad: 1 \mul del compuesto en ensayo 40 mM (final = 100 \muM)

\quad: 8 \mul de retinol 10 mM (final = 200 \muM)

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Se incuban los viales agitando en un baño de agua durante 45 minutos. Se añaden 500 \mul de etanol enfriado en hielo a cada vial para amortiguar la reacción. Se extraen los retinoides dos veces con hexano enfriado en hielo (2,7 ml por extracción). Se agrega acetato de retinilo (5 \mul de un stock 900 mM) a cada vial durante la primera extracción como una forma de monitorear la eficacia de la extracción en cada muestra. Las muestras fueron agitadas en vortex durante 10 segundos antes de centrifugar suavemente durante cinco minutos a 1000 rpm, a 5ºC en una centrífuga BECKMAN GS - 6R. La capa superior de hexano que contiene los retinoides es removida de la capa acuosa después de cada extracción a un vial limpio de dos dram. Se evapora el hexano bajo un suave chorro de gas nitrógeno. Se almacena el residuo seco a -20ºC hasta el análisis HPCL.

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2.5 Ensayo para Actividad Retinal Reductasa. (Para identificar B3)

Todas las soluciones de stock se prepararon como se muestra arriba con las siguientes sustituciones:

\quad: Todos los trans-retinaldehido 10 mM (Sigma R2500) en DMSO - en lugar de retinol.

\quad: Fosfato dinucleótido de nicotinamida adenina 200 mM, en forma reducida, sal tetrasódica (NADPH) (Sigma N7505) en agua estéril - en lugar de NADP.

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En un vial de dos dram con tapa a rosca, se agregan los siguientes en orden:

\quad: Tampón para dar un volumen final de 400 \mul.

\quad: 25 \mul de Microsomas diluidos (final = 100 \mug) - usar Microsomas hervidos para los controles y Microsomas regulares para las muestras en ensayo.

\quad: 4 \mul de NADPH 200 mM (final = 2 mM).

\quad: 1 \mul del compuesto de ensayo 40 mM (final = 100 \muM)

\quad: 3 \mul de retinaldehído 10 mM (final = 75 \muM)

Se siguen los mismos procedimientos de incubación y extracción detallados mas arriba.

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2.6 Ensayo para antagonistas CRABPII (Para identificar B4) 2.6.1. Síntesis de CRABPII a. Sistema de Expresión

Se clonó el gen CRABPII en plásmido pET 29a-c(+) (Novagen). El gen clonado estaba bajo control de fuertes señales de transcripción y translación del bacteriófago T7. La fuente de polimerasa T7 fue provista por la célula huésped E. Coli BLR(DE3)pLysS(Novagen). Esta última tiene una copia cromosómica de T7 polimerasa bajo control lacUV5, inducida por la presencia de IPTG. Se transfirió el plásmido en las células E. Coli BLR (DE3) pLysS por transformación de acuerdo al protocolo del fabricante (Novagen).

b. Inducción

Se diluyó un cultivo de las células transformadas durante la noche 1:100 en 2xYT conteniendo Kanamicina 50 \mug/mL y cloramfenicol 25 \mug/mL. Las células crecieron mientras eran agitadas a 37ºC hasta que el OD de 600 nm alcanzó 0,6 - 0,8. Entonces se agregó IPTG a una concentración final de 1 mM y el cultivo fue incubado durante dos horas adicionales. Las células se recolectaron por centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El residuo se almacenó a -20ºC.

2.6.2. Purificación

La purificación se realizó por el método descrito en Norris y Li, 1997.

a. Lisis

El residuo congelado fue descongelado a temperatura ambiente y suspendido nuevamente en 1-2- volúmenes de residuo de tampón preparado fresco (Tris-ClH 50 mM, pH 8, sacarosa al 10% (p/v), EDTA 1 mM, azida sódica 0,05% (p/v), DTT 0,5 mM, MnCl_{2} 10 mM, fenil metil sulfonil fluoruro 2,5 mM, benzamidina 2,5 mM, DNasa 6 \mug/mL). El lisado se incubó durante 30 min. a temperatura ambiente. Se realizaron lisis adicionales mediante aplicación de ultrasonido (6 ráfagas de 30 segundos a 10.000 psi alternadas con 5 retardos de 30 segundos en hielo). La fracción insoluble del lisado se removió por centrifugación a 15.000 rpm 1 hora a 4ºC y el sobrenadante se almacenó a -20ºC.

b. Filtración de gel en Sephacryl S300

El sobrenadante del paso a. se cargó en una columna de 2,5x100 cm. de sephacryl S-300 (Pharmacia) a temperatura ambiente. El tampón de elusión fue Tris-ClH 20 mM, pH 8, DTT 0,5 mM, azida sódica 0,05% (tampón A). El caudal fue de 2 mL/min. Se recogieron fracciones de 2 mL y se comprobaron para absorbancia ultravioleta a 280 nm. Las fracciones que representaban los picos se examinaron mediante SDS-page para la presencia de CRABPII.

c. Cromatografía de intercambio de aniones

Se cargaron 2 mL de fracciones filtradas de gel conteniendo CRABPII en una columna de intercambio de aniones de aminas cuaternarias FPLC (Cromatografía Rápida de Proteína Liquida) tipo monoQ (Pharmacia). Se eluyó CRABPII usando un tampón en gradiente de tampón A al 100% a tampón B al 30% (100% del tampón B = tampón A + NaCl 250 mM) durante un período de 20 minutos a temperatura ambiente. Se recogieron fracciones de 1 mL cada minuto. Nuevamente se comprobó la presencia de CRABPII por SDS page. Se almacenó el CRABPII a 4ºC previamente congelado y secado usando un Micromodulyo 1.5K con una plataforma vial adjunta (Edwards High Vaccum Internacional). Las muestras desecadas se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso en el ensayo de unión.

d. Detección de la presencia de CRABPII

La expresión y purificación de CRABPII se validó usando electroforesis en gel de poliacrilamida con desnaturalización por SDS (SDS-PAGE) en un gel de poliacrilamida al 7-15% (Biorad). Se mezclaron muestras de 10 \muL con 10 \muL de 2x de tampón de carga (Tris HCl 100 mM pH 6,8, SDS al 4%, BPB 0,2%, glicerol al 20%, DTT 1 mM) y desnaturalizadas por calor (2 minutos a 80ºC). Las muestras fueron cargadas en el gel que se sumergió en un tampón 1x tris - glicina (Biorad) y se aplicó corriente constante (25 mA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de teñir con azul de Coomassie, se identificó la proteína de acuerdo a su peso molecular como se determina con la escala de referencia Benchmark (Gibco BRL) de proteína pre-teñida.

Se usó western blot para confirmar la presencia de CRABPII. Las proteínas separadas en el SDS_PAGE se transfirieron a una membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore) usando un casete Biorad. La transferencia tuvo lugar en un tampón 1x Tris-glicina (Biorad) + metanol al 10%. Se aplicó una corriente eléctrica (60 mA) durante 3 horas para permitir que la proteína migrara a través de la membrana. Después, la membrana fue bloqueada con leche seca al 5% en 1x TBS durante 1 hora a temperatura ambiente y fue sondeada (con anticuerpos primarios a CRABPII (dilución 1/1.000 de anticlonal de ratón 5-CRA-B\cdot) en el mismo tampón a 4ºC durante la noche. Al día siguiente, se lavó la con PBS (3 x 5 minutos) y luego se incubó con una dilución 1:2.000 del anticuerpo secundario, anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa (ECLTM, Amersham), durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavó la membrana con 1x PBS (3 x 5 minutos) y la proteína se detectó usando el kit de detección ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham).

Las concentraciones de CRABPII purificado se determinaron usando kit BSA (Pierce).

2.6.3. Ensayo Radioactivo de Unión

Se incubaron 220 pmol de CRABPII en de tampón Tris-HCl 20 mM pH 7,4 con 15 pmol de ácido retinoico todo trans radioactivo (NEN) en un volumen total de 70 \muL. Para el ensayo competitivo se agregó otro ligando a la mezcla (6670:1, 670:1, o 70:1). La reacción tuvo lugar durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. A fin de separar el ácido retinoico todo-trans no unido del ácido retinoico todo-trans unido, se usó una columna minicromatográfica de límite 6kD (Biorad). El tampón acumulado fue descartado usando un colector Microplex de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Las muestras se cargaron en la columna y la separación tuvo lugar por gravedad en un período de 30 minutos. El ácido retinoico ("AR") unido a CRABPII apareció en el filtrado mientras el AR libre permaneció en la columna. La radioactividad del filtrado fue medida con un contador de centelleo.

2.7 Ensayo de Oxidación de Ácido Retinoico Dependiente de NADPH. (Para identificar B5)

El procedimiento descrito a continuación es una modificación del método descrito por R. Martini & M. Murray, "Participation of P450 3ª Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4-Hydroxylation", Archives Biochem. Biophys. 303, 57-66 (1993). Se prepara el siguiente tampón de ensayo y se guarda a 4ºC: PO_{4} 0,1M/EDTA 0,1 mM/MgCl_{2} 5 mM, pH 7.4. En el día del ensayo, se prepara una solución en tampón de NADPH a 60 mM. Se preparan los stocks de inhibidor, etanol acidificado/solución amortiguada BHT/ y hexano/BHT como se describió antes. Se preparó una solución de trabajo de ácido retinoico 1 mM por dilución de un stock 15 mM (en DMSO) con etanol.

Para un vial de 2 dram, se añaden en el siguiente orden: tampón de ensayo para dar un volumen final de 500 \muL, 20 \muL de NADPH 60 mM, 5 \muL de inhibidor o solvente blanco, seguido por aproximadamente 2 mg de proteína microsomal de hígado de rata. Se incuba durante 5 min. a 37 ºC y después se añaden (5 \muL de solución de trabajo de ácido retinoico 1 mM. Se continúa la incubación durante 60 min. a 37 ºC sin tapar los viales, ya que el proceso de oxidación requiere O_{2} molecular agregado a NADPH. Se amortigua con etanol acidificado/BHT y se extrae con hexano/BHT como se describe antes. Se valoran los metabolitos de ácido retinoico polares eluídos rápidamente (presumiendo que son 4-oxo ácido retinoico) por integración de la señal HPCL, como se describe antes.

Observar que todos los pasos consiguientes al añadido del ácido retinoico se realizaron en la oscuridad o bajo luces ámbar. La incubación final de la solución contiene NADPH 2,4 mM, 100 \muM o menos de inhibidor, ácido retinoico 10 \muM, proteína microsomal de hígado de rata de aproximadamente 4 mg/mL, y cerca de PO_{4} 0,1M/EDTA 0,1 mM/MgCl_{2} 5 mM.

Análisis HPCL de Retinoides Individuales

Las muestras para la cuantificación de retinoide por HPCL se prepararon por disolución del residuo en cada vial con 100 \muL de metanol. La solución se transfirió a un tubo cónico de vidrio de 150 \muL en una vaina vial de 1 mL, tapada fuertemente, y colocada en un Autosampler Waters 715. Inmediatamente se inyectaron alícuotas de 60 \muL y se analizó el contenido de retinoide.

Los instrumentos de cromatografía consistieron en un controlador de gradiente con bomba Waters 600, un detector de Ensayo Fotodiodo Waters 996 y un detector de Exploración de Fluorescencia Waters 474. Se usaron dos protocolos HPCL para el análisis de retinoide. Para el ensayo ARAT y LRAT, la separación de retinol y ésteres de retinol se realizó con una columna analítica de fase reversa Waters 3,9 x 300 mm C18 de Novapak y una columna de protección Waters Sentry C18 de Novapak con una fase móvil isocrática 80:20 (v/v) metanol/THF ajustada a una velocidad de flujo de 1 mL/min. El eluido se monitorizó para absorbancia a 325 nm y fluorescencia a 325ex/480em. Se usaron columnas mas cortas analíticas de fase reversa Waters 3,9x150 mm C18 de Novapak y de protección Waters Sentry C18 de Novapak para separar los ácidos retinoicos y alcoholes para los ensayos de oxidación del retinol y del ácido retinoico utilizando una modificación de un sistema de gradiente descrito por A. B. Barua, "Análisis of Water-Soluble Compounds: Glucuronides", Methods Enzymol. 189, 136-145 (1990). Este sistema estaba constituido por un gradiente lineal durante 20 min. de 68:32 (v/v) metanol/agua conteniendo acetato de amonio 10 mM para 4:1 (v/v) metanol : diclorometano seguido de 5 min. a velocidad de flujo mantenida a 1 mL/min. La columna eluida se monitorizó para 300 nm a 400 nm.

Estos protocolos se seleccionaron en base a su habilidad para resolver claramente ácidos retinoides pertinentes, alcoholes, aldehídos, y/ó ésteres para cada ensayo, y una relativa rapidez en la separación. La identificación de retinoides individuales mediante HPCL se basó en un emparejamiento exacto del tiempo de retención de picos desconocidos con aquellos auténticos retinoides estándar disponibles y análisis para espectro UV (300 - 400 nm) de picos desconocidos contra los retinoides auténticos disponibles.

Los reforzadores apropiados para posterior testeo en el ensayo de transglutaminasa incluyen pero no están limitados a los reforzadores listados en las Tablas B1 hasta la B5, a continuación.

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Activadores de Retinol Deshidrogenasa (B2)

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Inhibidores de Retinilaldehido Reductasa (B3)

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Antagonistas de CRABPII (B4)

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Inhibidores de Oxidación de Ácido Retinoico (B5)

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Los reforzadores o combinaciones de los mismos inhiben la transglutaminasa (denominada en lo sucesivo "Tgasa") en un ensayo de transglutaminasa descrito más abajo, al menos en un 50% a una concentración 10 mM.

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Ensayo TGasa

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Ensayo Transglutaminasa y Diferenciación de Queratinocitos

Durante el proceso de diferenciación terminal en la epidermis, se forma una gruesa capa de 15 nm de proteína, conocida como envoltura córnea (EC), en la superficie interior de la periferia celular. La EC está compuesta de numerosas proteínas distintas que se encuentran entrecruzadas por la formación de enlaces N^{\varepsilon}-(Y-glutamil) lisina isodipéptidos catalizados por la acción de por lo menos dos transglutaminasas (TGasas) diferentes expresadas en la epidermis. La TGasa I se expresa en abundancia en las capas diferenciadas de la epidermis, especialmente en la capa granular, pero está ausente en la epidermis basal indiferenciada. Por consiguiente la TGasa I es un marcador útil de la diferenciación de los queratinocitos epidérmicos con altos niveles de TGasa I indicando un estado más diferenciado. Se usó un ensayo ELISA basado en TGasa I, usando un anticuerpo TGasa I, para determinar el estado de diferenciación de los queratinocitos cultivados en los ejemplos que siguen.

Los queratinocitos (cultivados como se describe más adelante) se sembraron en 96 placas de cultivo a una densidad de 4.000-5.000 células por placa en 200 \mul de medio. Después de la incubación durante dos o tres días, o hasta que las células confluyeran \sim50%, se cambió el medio por otro conteniendo los compuestos analizados (cinco replicaciones por examen). Las células se cultivaron por otras 96 horas después de las cuales se aspiró el medio y las placas se almacenaron a -70ºC. Las placas se sacaron del congelador, y las células se lavaron dos veces con 200 \mul de 1x PBS. Se incubaron durante una hora a temperatura ambiente (T/A) con TBS/BSA al 5% (tampón de lavado, albúmina sérica bovina). Luego se agregó el anticuerpo primario TGasa: 50 \mul de anti-TGasa I Ab monoclonal B:C: diluido 1:2.000 en tampón de lavado. Se incubó durante 2 horas el anticuerpo primario a 37ºC y luego se lavó 6x con tampón de lavado. Las células se incubaron entonces con 50 \mul del anticuerpo secundario (Fragmento Fab, IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa obtenido de Amersham) diluido 1:4.000 en tampón de lavado durante dos horas a 37ºC, luego se lavó tres veces con tampón de lavado. Después del lavado con tampón, se lavaron las células 3x con PBS. Para realizar la colorimetría, se incubaron las células con 100 \mul de la solución sustrato (4 mg de o-fenilendiamina y 3,3 \mul de H_{2}O_{2} al 30% en 10 ml de tampón citrato 0,1 M pH 5,0) durante cinco minutos exactos, T/A, en la oscuridad (bajo papel de aluminio). Se detuvo la reacción por el agregado de 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4N. La absorbancia de las muestras se leyó a 492 nm en un espectrofotómetro de 96 pocillos. De las cinco replicaciones, se trataron cuatro con ambos anticuerpos, el quinto se usó como control de TGasa. Los niveles de TGasa se determinaron y expresaron como porcentajes de control.

Los niveles de Transglutaminasa se determinaron y expresaron en las Tablas B1 a B5 indicadas más arriba, en cualquiera de las dos formas:

(i) % (reforzador + inhibición de retinol/inhibición control) - % (inhibición ROH/inhibición control), lo que mide el efecto de agregar el reforzador + inhibición de retinol inducida por TGasa sobre retinol solo, ó

(ii) como un valor IC50 cuando se examinó el efecto inhibitorio de concentraciones múltiples de reforzador -esto provee la concentración de reforzador que, en combinación con una concentración constante de retinol de 10 ^{-7} M, inhibe a la TGasa un 50%.

Este es el valor IC50 que se usó como referencia en la presente invención.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Mejores Grupos de Reforzadores para examinar en el Ensayo de Transglutaminasa

Compuestos B1

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Compuestos B2

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Compuestos B3

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Compuestos B4

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Compuestos B5

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Envase de mínima permeabilidad al oxígeno

Como se ha tratado aquí antes, las composiciones que incluyen retinoides son generalmente inestables y pueden sufrir degradación química. Además, ha sido sorprendente encontrar que los reforzadores, si bien son provechosos para potenciar los beneficios del retinoide, también contribuyen a la inestabilidad química de los retinoides. La desestabilización del reforzador inducida por retinol reduce dramáticamente la eficacia general del sistema de retinoide reforzado cuando ambos ingredientes están contenidos en una formula única. Por consiguiente, se necesita proteger las composiciones retinoides en las formulaciones que contienen reforzadores en un mayor grado que el que se necesita para las composiciones que contienen retinoides solos. Es necesario crear, de manera específica, composiciones estables con retinoides y reforzadores de retinoides que proporcionen el efecto reforzador benéfico así como prevenir la degradación del retinoide antes que pueda aparecer el efecto reforzador. La presente invención, por lo tanto, proporciona un envase que es de mínima permeabilidad al oxígeno para estabilizar las composiciones retinoides y reforzadores, y con ello minimizar la degradación inducida de los retinoides.

El envase de mínima permeabilidad al oxígeno puede ser realizado por varios métodos por personas con conocimientos básicos en la materia. En forma específica, las composiciones de la invención no deben estar en contacto directo con oxígeno o aire, y se debe prevenir el filtrado del oxígeno a través de las paredes externas del envase. Se deben usar envases opacos a la luz e impermeables al oxígeno. Se puede, por ejemplo, usar aluminio en las paredes del envase, o como revestimiento interno.

Vehículo Cosméticamente Aceptable

El producto de acuerdo con la presente también consta de un vehículo aceptable para actuar como diluyente, dispersante o transportador para los componentes activos en las composiciones, tanto la primera como la segunda ó en ambas, y así facilitar su distribución cuando son aplicadas en la piel.

Otros vehículos con o sin el añadido de agua, pueden incluir emolientes líquidos o sólidos, solventes, humectantes, espesantes y polvos. Un vehículo no acuoso especialmente preferido es un polidimetil siloxano y/ó polidimetil fenil siloxano.

Las siliconas de esta invención pueden ser aquellas cuyas viscosidades oscilen entre cerca de 10 a 10.000.000 centiestoquios a 25ºC. Es especialmente deseable que sean mezclas de siliconas de alta y baja densidad. Esta siliconas están disponibles por la General Electric Company con marca registrada Vicasil, SE y SF y por Dow Corning Company como Series 200 y 550. Las cantidades de silicona que pueden ser utilizadas en la composición de la invención oscilan entre el 5 y el 95%, preferiblemente del 25 al 90% del peso de la composición.

Materiales Opcionales Beneficiosos para la Piel y Agregados Cosméticos

Puede estar presente un aceite o material oleoso, junto con un emulsionante para proporcionar tanto una emulsión agua-en-aceite como aceite-en-agua, dependiendo ampliamente del promedio del balance hidrofílico-lipofílico (BHL) del emulsionante empleado.

Pueden estar presentes varios tipos de ingredientes activos en la composición cosmética de la presente invención y se describen a continuación. Los activos son definidos como agentes beneficiosos para la piel o el cabello aparte de emolientes y aquellos ingredientes que simplemente mejoren las características físicas de la composición. Los ejemplos generales, aunque no están limitados a esta categoría, incluyen protectores solares, agentes aclaradores de la piel, agentes bronceadores.

Los protectores solares incluyen aquellos materiales empleados comúnmente para bloquear la luz ultravioleta. Los compuestos ilustrativos son derivados del PABA, cinamato y salicilato. Por ejemplo, pueden ser usados el octal metoxicinamato y la 2-hidroxi-4-metoxi benzofenona (también conocida como oxibenzona), y están disponibles comercialmente con marca registrada, Parsols MCX y Benzofenona-3, respectivamente.

La cantidad exacta de protector solar empleado en las emulsiones puede variar dependiendo del grado de protección para la radiación UV solar deseada.

Otros ingredientes opcionales preferentes se seleccionan de ácidos grasos esenciales (AGEs), es decir, aquellos ácidos grasos que son esenciales para la formación de la membrana plasmática de todas las células, en los queratinocitos la deficiencia de AGEs hace a las células hiperproliferativas. El suplemento de AGE lo corrige. Los AGEs además mejoran la biosíntesis epidérmica de lípidos y proporcionan lípidos para la formación de la barrera de la epidermis. Los ácidos grasos esenciales se escogen preferiblemente de ácido linoleico, ácido Y-linolénico, ácido homo-Y-linolénico, ácido columbínico, ácido eicosa-(n-6,9,13)-trienoico, ácido araquidónico, ácido timnodónico, ácido hexaenoico y mezclas de ellos.

También se incorporan emolientes en las composiciones cosméticas de la presente invención. Los niveles de dichos emolientes pueden abarcar desde aproximadamente el 0,5% hasta el 50%, preferiblemente 5% al 3% del peso de la composición total. Los emolientes pueden ser clasificados en categorías químicas generales tales como ésteres, ácidos grasos, alcoholes, polioles e hidrocarburos.

Los ésteres pueden ser mono- o di- ésteres. Los ejemplos aceptables de di-ésteres grasos incluyen dibutil adipato, dietil sebacato, diisopropil dimerato, y dioctil succinato. Los ésteres grasos aceptables de cadena ramificada incluyen 2-etil-hexil-miristato, isopropil estearato e isoestearil palmitato. Los ésteres ácido tribásicos aceptables incluyen triisopropil trilinoleato y trilauril citrato. Los ésteres grasos de cadenas rectas aceptables incluyen laurel palmitato, miristil lactato, oleil leurcato, y estearil oleato. Los ésteres preferidos incluyen cococaprilato-caprato (una mezcla de coco-caprilato y coco-caprato), propilen glicol miristil éter acetato, diisopropil adipato y cetil octanoato.

Los alcoholes y ácidos grasos disponibles incluyen aquellos compuestos que tengan de 10 a 20 carbonos. Con especial preferencia por compuestos tales como cetilo, miristilo, ácidos y alcoholes palmítico y estearilo.

Entre los polioles que pueden ser usados como emolientes están los compuestos alquil polihidroxilo de cadena lineal y ramificada. Por ejemplo, se prefieren propilen glicol, sorbitol y glicerina. También pueden ser de utilidad los polioles poliéricos tales como propilen glicol y polietilen glicol. Como potenciadores de penetración tienen especial preferencia butileno y propilen glicol.

Los hidrocarburos ejemplares que pueden servir como emolientes son aquellos que poseen cadena hidrocarbonada en cualquier parte entre los átomos carbono 12 a 30. Los ejemplos específicos incluyen aceite mineral, vaselina, escualeno, e isoparafinas.

Los espesantes son otra categoría de ingredientes funcionales dentro de las composiciones cosméticas de esta invención. Un espesante deberá usualmente estar presente en cantidades de aproximadamente el 0,1% al 20% del peso, preferiblemente entre el 0,5% y el 10% del peso de la composición. Los espesantes ejemplares son poliacrilatos de enlace cruzado, este material está disponible con la marca Carbopol de B.F. Goodrich Company. Se pueden emplear gomas tales como xantana, carragenano, gelatina, karaya, pectina y goma de algarrobo. Bajo ciertas circunstancias la función espesante se puede obtener con un material que también sirva como silicona o emoliente. Por ejemplo, la goma silicona en exceso de 10 centiestoquios y ésteres como el glicerol estearato poseen funcionalidad dual.

Se pueden incorporar polvos en la composición cosmética de la presente invención. Estos polvos incluyen tiza, talco, tierra de Fuller, kaolín, almidón, arcilla smectite, aluminio silicato de magnesio químicamente modificado arcilla montmorillonite orgánicamente modificada, silicato de aluminio hidratado, sílice pirógena, almidón octenil succinato de aluminio y mezclas de los mismos.

Pueden ser incorporados en la composición de la presente invención otros adyuvantes menores. Estos ingredientes pueden incluir agentes colorantes, agentes para producir opacidad, y perfumes. Las cantidades de estos materiales pueden estar entre el 0,001% y el 20% del peso de la composición.

La intención primaria de las composiciones de esta invención es un producto de aplicación tópica en la piel humana, especialmente como agente de acondicionamiento y suavizante de la piel, y previniendo o reduciendo la aparición de arrugas o envejecimiento de la piel.

En uso, una pequeña cantidad de la composición, por ejemplo de 1 a 5 ml, se aplica en áreas expuestas de la piel, desde un envase adecuado o con aplicador y, si es necesario, se extiende y/o frota en la piel usando la mano, los dedos o un dispositivo apropiado.

Formas del Producto y Embalaje

La composición para tratamiento tópico de la piel de la invención puede ser formulada como una loción, crema fluida, crema ó gel.

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Ejemplo 1

Procedimientos

Se disolvió retinol (al 50% en tween 80) en etanol acuoso aproximadamente al 50% para proporcionar una solución con un OD a 360 nm de aproximadamente 0,6 cuando se midió en un volumen de 200 \mul en una placa de 96 pocillos usando un espectrofotómetro estándar de 96 pocillos.

Se agregaron las moléculas reforzadoras en una concentración aproximada del 0,1% y el OD 360 se midió como se ha descrito antes inmediatamente, y después de 60 horas a temperatura ambiente y en la oscuridad. Se aplicó una corrección al OD después de 60 horas (se divide por 0,85) para contar el incremento del retinol debido a la evaporación del solvente desde la placa.

Resultados

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Los Reforzadores examinados causaron un marcado incremento en la inestabilidad del retinol.

Esto hará necesario usar opciones de formulación/embalaje que proporcionen una estabilidad considerablemente mayor al retinol cuando se usan reforzadores, en comparación con aquellas necesarias para el retinol solo.

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Ejemplo 2

Para establecer si la inhibición sinérgica de la expresión de la transglutaminasa ocurrió por combinaciones de los compuestos activos B1 y B5 con el retinol, es esencial determinar los perfiles de dosis-respuesta (incluyendo los valores IC50) de los compuestos activos cuando se examinan individualmente en presencia de retinol. Estos datos se usaron para determinar una apropiada concentración inhibitoria sub- máxima de cada compuesto activo, para hacer posible la identificación de efectos sinérgicos de la mezcla de los compuestos activos en presencia de retinol. Para demostrar sinergia de dos compuestos, es esencial seleccionar concentraciones para testear que sean como mucho, en otras palabras, una concentración del compuesto que refuerce individualmente la inhibición del retinol de la expresión de la transglutaminasa un 20%. Dos de estos compuestos tendrían una inhibición aditiva del 40%. Usando esta estrategia para determinar concentraciones deja una ventana de 40-100% para mayores inhibiciones de transglutaminasa en la detección de sinergias de los dos compuestos bajo examen. Un criterio de concentración más exigente podría ser seleccionar concentraciones de compuestos que solos no mostraran inhibición de la transglutaminasa por retinol reforzado. En este estudio, sin embargo, se eligieron criterios más exigentes todavía. Se seleccionaron concentraciones de compuestos que fueran 10 a 100 veces menores que la concentración mínima efectiva de inhibición de transglutaminasa. La identificación de combinaciones sinérgicas usando tan bajas concentraciones llevó a que se identificaran las combinaciones sinérgicas más efectivas.

Los datos de la siguiente tabla representan las concentraciones de compuesto que son dos logs menores que la concentración de compuesto mínimamente inhibitoria. Estas fueron las concentraciones usadas en los estudios de combinación B1/B5.

TABLA 1

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Para investigar la inhibición sinérgica de la expresión de la transglutaminasa mediante combinaciones de los compuestos activos B1 y B5 con retinol, se testearon combinaciones seleccionadas de los compuestos a concentraciones dadas en las tablas superiores. Se obtuvieron los siguientes datos:

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TABLA 2

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La eficacia de las combinaciones B1/B5 se dividió en dos clases - combinaciones particularmente efectivas (destacadas en la tabla anterior, es decir, las primeras 14 combinaciones) y combinaciones apenas efectivas (no destacadas, es decir, las últimas seis combinaciones). Fue inesperado que algunas combinaciones B1/B5 resultaran mejores que otras. Aquellas combinaciones apenas efectivas fueron (i) amidas de ácidos grasos + azoles (ii) amidas de hidroxi ácidos grasos + azoles y (iii) y naringenina/quercetina + azoles. Las combinaciones efectivas contenían reforzadores B1 con reforzadores B5 de las clases siguientes: tensioactivos grasos de hidroxietil imidazolina, compuestos insaturados alifáticos cíclicos, triterpenos poli cíclicos, amidas de ácido graso n-sustituidas.

Si bien la presente invención se ha descrito aquí con alguna especificidad, y con referencia a ciertas formas preferidas de realización de las mismas, aquellos que posean conocimientos básicos en la materia, reconocerán numerosas variaciones, modificaciones y sustituciones de las que se ha descrito que pueden realizarse, y que están dentro del ámbito y espíritu de la invención. Se intenta que todas esas modificaciones y variaciones se hallen en el ámbito de la presente invención, tal como se describe y reivindica aquí, y que las invenciones solo se limiten por el alcance de las reivindicaciones siguientes, y que tales reivindicaciones se interpreten tan ampliamente como sea razonable. A lo largo de esta solicitud, han sido citadas varias publicaciones y libros. La totalidad de cada una de estas publicaciones y libros ha sido incorporadas en esta invención como referencia.

Claims

1. Una composición estable de cuidado de la piel conteniendo:

entre aproximadamente el 0,0001% y aproximadamente el 50% de al menos dos reforzadores de retinoide en el que al menos un reforzador se selecciona del grupo constituido por citral, damascenona, 1,3-dimetil 2 imidazolidinona, geraniol, N-lauroil sarcosina, linoleamida DEA, alfa ionona; y

al menos un reforzador de retinoide seleccionado del grupo constituido por, cetoconazol, miconazol, climbazol, amino benzotriazol, 3,4-dihidroquinolina, y 2-hidroxiquinolina;

entre aproximadamente el 0,001% y aproximadamente el 10% de un retinoide seleccionado del grupo constituido por retinil ésteres, retinol, retinal y mezclas de los mismos; y

un vehículo cosméticamente aceptable, en el que la composición estable para el cuidado de la piel está contenida en un envase para que la composición no esté en contacto con el oxígeno;

en el que el envase está hecho de aluminio.

2. La composición estable de cuidado de la piel de la reivindicación 1, en la que dicho retinoide está presente en una cantidad de entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 1%.

3. La composición estable de cuidado de la piel de la reivindicación 1, se compone además de entre aproximadamente el 0,5% y el aproximadamente el 50% de un emoliente seleccionado del grupo consistente en ésteres, ácidos grasos, alcoholes, polioles, e hidrocarburos.

4. El uso de una composición estable para el cuidado de la piel según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para acondicionamiento de la piel.

5. Una composición estable para el cuidado de la piel según la reivindicación 1 para acondicionamiento de la piel.