ES2306163T3

ES2306163T3 - Tratamiento de esteatohepatitis no alcoholica (nash).

Info

Publication number: ES2306163T3
Application number: ES05753069T
Authority: ES
Inventors: Sander Jan Hendrik Van Deventer
Original assignee: Amsterdam Molecular Therapeutics AMT BV
Current assignee: Amsterdam Molecular Therapeutics AMT BV
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2005-06-20
Publication date: 2008-11-01
Anticipated expiration: 2025-06-20
Also published as: US20110081332A1; US20080280823A1; EP1761273A1; DE602005006809D1; WO2005123117A1; KR20070057712A; CA2568643A1; PL1761273T3; CN1972709A; AU2005253897B2; AU2005253897A1; SI1761273T1; DK1761273T3; PT1761273E; EP1761273B1; JP2008503569A; ATE395073T1; CY1108552T1

Abstract

Uso de una lipoproteína ipasa (LPL) terapéutica para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esteatohepatitis no alcohólica en un sujeto.

Description

Tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de las proteínas y ácidos nucleicos terapéuticos para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica.

Antecedentes de la invención

La esteatohepatitis no alcohólica (NASH) es parte de un espectro de la enfermedad de esteatosis hepática no alcohólica (NAFL) y se refiere al desarrollo de cambios histológicos en el hígado que son comparables a aquellos inducidos por la ingesta excesiva de alcohol. No obstante NASH ocurre en pacientes que no abusan del alcohol. NASH está caracterizado por aminotransferasas elevadas en el suero, indicando daños en las células hepáticas. La esteatosis macrovesicular (es decir, vacuolas intracitoplásmicas que desplazan excéntricamente el núcleo del hepatocito), inflamación, y ocasionalmente fibrosis que puede progresar a cirrosis, caracterizan la enfermedad. Hay cada vez más evidencias de que NASH es un componente del síndrome de resistencia a la insulina metabólica. Se trata de una acumulación de trastornos, que incluyen la obesidad, dislipidemia, arteriosclerosis y diabetes mellitis, que tienen resistencia a la insulina como una característica común (de Sligte et al (2004) Eur J Int Med 15:
10).

Aunque se han probado muchos fármacos para mejorar NASH y prevenir un deterioro adicional, no hay ningún tratamiento establecido para esta enfermedad potencialmente seria. Uno de los fármacos evaluados por su eficacia en NASH es la rosiglitazona (Muurling et al (2003) Metabolism 52: 1078). Una pérdida de masa corporal puede también producir mejoras en NASH. No obstante, a pesar de estas intervenciones, en un número significante de pacientes NASH progresa a cirrosis y puede en última instancia requerir un transplante de hígado, después del cual la enfermedad puede reaparecer.

Dada la tendencia de aumento de la obesidad y de la diabetes en los EEUU y en las poblaciones europeas, hay una necesidad urgente de nuevos tratamientos de NASH.

Descripción detallada

La presente invención proporciona un método de tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica en un sujeto. El método comprende la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una lipoproteína lipasa (LPL) terapéutica. Como se utiliza en este caso, LPL terapéutica se refiere a una proteína con actividad LPL (EC 3.1.1.34) o a un ácido nucleico que codifica tal proteína.

Forma proteica de la LPL terapéutica

En una forma de realización, la LPL terapéutica es una proteína LPL con una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO. 1, haciéndose referencia a ellas en la presente como proteínas o péptidos LPL S447X. En general, estas proteínas LPL S447X son más cortas que aquellas LPL de tipo salvaje bien conocidas, que tienen 448 aminoácidos (véase por ejemplo, Wion et al Science (1987) 235: 1638 o WO 01/00220). Pueden incluir compuestos tales como fragmentos de péptidos, fragmentos de péptidos modificados, análogos o sales farmacológicamente aceptables de LPL con los aminoácidos 447-448 truncados del terminal carboxi de una LPL tipo salvaje. Tales compuestos son colectivamente denominados en este caso como péptidos LPL S447X. Los péptidos LPL S447X pueden incluir homólogos de la secuencia de LPL de tipo salvaje madura desde los aminoácidos 1 a 446, incluyendo homólogos de especies distintas de los homo sapiens (que tienen aplicaciones veterinarias). Los péptidos LPL S447X pueden incluir derivados e isoformas de origen natural o variantes genéticas de LPL de tipo salvaje. El uso de derivados y variantes de la proteína LPL S447X está también comprendido en la invención.

Derivados de la proteína S447X

Los derivados incluyen, en particular, proteínas con actividad LPL que tienen la misma secuencia de aminoácidos que la proteína LPL S447X pero donde algunos sitios de N- o O-glicosilación han sido modificados o eliminados. Los derivados también incluyen derivados hidroximetílicos C-terminales, derivados O-modificados (p. ej., hidroximetil éter bencílico C-terminal), y derivados modificados N-terminalmente incluyendo amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas.

Dentro de una LPL terapéutica de la invención, una estructura peptídica puede ser acoplada directa o indirectamente a un grupo modificador. El término "grupo modificador" se destina a incluir estructuras que son directamente fijadas a la estructura peptídica (p. ej., por acoplamiento covalente), al igual que aquellos que son indirectamente fijados a la estructura peptídica (p. ej., por una asociación estable no covalente o por acoplamiento covalente a residuos de aminoácidos adicionales, o miméticos, análogos o derivados de los mismos, que pueden flanquear la estructura peptidica con núcleo MCP-3). Por ejemplo, el grupo modificador puede ser acoplado al término amino o al término carboxi de una estructura de LPL terapéutica, o a una región peptidica o peptidomimética flanqueadora del dominio del núcleo. De forma alternativa, el grupo modificador puede ser acoplado a una cadena lateral de un residuo de aminoácido de la LPL terapéutica, o a una región peptidica o peptido-mimética flanqueadora del dominio del núcleo (p. ej., a través del grupo epsilon amino de un(os) residuo(s) de lisilo, a través del grupo carboxilo de un(os) residuo(s) de ácido aspártico o un(os) residuo(s) de ácido glutámico, a través de un grupo hidroxi de un(os) residuo(s) de tirosilo, un(os) residuo(s) de serina o un(os) residuo(s) de treonina u otro grupo adecuado reactivo en una cadena lateral del aminoácido). Los grupos modificadores acoplados de manera covalente a la estructura peptídica pueden ser unidos mediante métodos bien conocidos en la técnica para conectar estructuras químicas, incluyendo, por ejemplo, amida, alquilamino, carbamato o enlaces de úrea.

En algunas formas de realización, el grupo modificador puede comprender un grupo cíclico, heterocíclico o policíclico. El término "grupo cíclico", como se utiliza en este caso, incluye un grupo cíclico saturado o insaturado (es decir, aromático) que tiene de 3 a 10, 4 a 8, o 5 a 7 átomos de carbono. Grupos ejemplares cíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, y ciclooctilo. Grupos cíclicos pueden ser sustituidos no sustituidos o en una o más posiciones del anillo. Un grupo cíclico puede por ejemplo ser sustituido con halógenos, alquilenos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, heterociclos, hidroxilos, aminos, nitros, tioles, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, sulfonatos, selenoéteres, acetonas, aldehídos, ésteres, -CF_{3}, -CN.

El término "grupo heterocíclico" incluye grupos cíclicos saturados, insaturados y aromáticos que tienen de 3 a 10, 4 a 8, o 5 a 7 átomos de carbono, donde la estructura del anillo incluye aproximadamente uno o más heteroátomos. Grupos heterocíclicos incluyen pirrolidina, oxolano, tiolano, imidazol, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina. El anillo heterocíclico puede ser sustituido en una o más posiciones con sustituyentes tales como, por ejemplo, halógenos, alquilenos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, otros heterociclos, hidroxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, acetonas, aldehidos, ésteres, -CF_{3}, -CN. Los heterociclos pueden también ser unidos por un puente o fusionados a otros grupos cíclicos como se describe abajo.

El término "grupo policíclico" como se utiliza en este caso se destina hacer referencia a dos o más anillos cíclicos saturados, insaturado o aromáticos, donde dos o más carbonos son comunes para dos anillos adyacentes, de modo que los anillos son "anillos fusionados". Los anillos que son unidos a través de átomos no adyacentes son denominados anillos "puenteados". Cada uno de los anillos del grupo policíclico pueden ser sustituidos con los sustituyentes según se ha descrito anteriormente, como por ejemplo, halógenos, alquilenos, cicloalquilos, alquenilos, alquinilos, hidroxilo, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, sililos, éteres, tioéteres, sulfonilos, selenoéteres, cetonas, aldehidos, ésteres, -CF_{3}, o -CN.

El término "alquilo" se refiere al radical de grupos saturados alifáticos, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo alquilo sustituidos, y grupos alquilo cicloalquilo sustituidos. En algunas formas de realización, un alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada tiene 20 átomos de carbono o menos en su esqueleto (C_{1}-C_{20} para la cadena lineal, C_{3} -C_{20} para la cadena ramificada), o 10 átomos de carbono o menos. En algunas formas de realización, los cicloalquilos pueden tener de 4 a 10 átomos de carbono en su estructura anular, como por ejemplo 5, 6 o 7 anillos de carbono. A menos que el número de carbonos sea especificado de otra manera, "alquilo inferior" como se utiliza en este caso significa un grupo alquilo, tal como se ha definido anteriormente, que tiene de uno a diez átomos de carbono en su estructura esqueletal. Asimismo, "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tiene longitudes de cadena de diez carbonos o menos.

El término "alquilo" (o "alquilo inferior") como se usa en toda esta especificación y reivindicaciones se destina a incluir tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", este último se refiere a fracciones de alquilo que tienen sustituyentes que sustituyen a un hidrógeno en uno o más carbonos del esqueleto de hidrocarburo. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, halógeno, hidroxilo, carbonilo (tales como carboxilo, acetonas (incluyendo grupos alquilcarbonilo y arilcarbonilo), y ésteres (incluyendo grupos alquiloxicarbonilo y ariloxicarbonilo), tiocarbonilo, aciloxi, alcoxilo, fosforilo, fosfonato, fosfinato, amino, acilamino, amido, amidina, imino, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, alquiltio, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, heterociclilo, aralquilo, o una fracción aromática o heteroaromática. Las fracciones sustituidas en la cadena de hidrocarburos pueden ellas mismas ser sustituidas, si fuera apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de aminos, azidos, iminos, amidos, fosforilos (incluyendo fosfonatos y fosfinatos), sulfonilos (incluyendo sulfatos, sulfonamidos, sulfamoilos y sulfonatos), y grupos de sililo, al igual que éteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo acetonas, aldehídos, carboxilatos, y ésteres), -CF_{3}, -CN y similares. Alquilos sustituidos ejemplares están descritos abajo. Cicloalquilos pueden ser adicionalmente sustituidos con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos carbonilo sustituidos, -CF_{3}, -CN, y similares.

Los términos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y a la posible sustitución a los alquilos anteriormente descritos, pero que contienen al menos un enlace doble o triple respectivamente.

El término "aralquilo", como se utiliza en este caso, se refiere a un grupo alquilo o alquilenilo sustituido con al menos un grupo arilo. Aralquilos ejemplares incluyen bencilo (es decir, fenilmetilo), 2-naftiletilo, 2-(2-piridil)propilo, 5-dibenzosuberilo, y similares.

El término "alquilcarbonilo", como se utiliza en este caso, se refiere a - C(O)-alquilo. De forma similar, el término "arilcarbonilo" se refiere a -C(O)-arilo. El término "alquiloxicarbonilo", como se utiliza en este caso, se refiere al grupo -C(O)-O-alquilo, y el término "ariloxicarbonilo" se refiere a =C(O)-O-arito. El término "aciloxi" se refiere a -O-C(O)-R_{7}, donde R_{7} es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo o heterociclilo.

El término "amino", como se utiliza en este caso, se refiere a -N(R_{\alpha})(R_{\beta}), donde R_{\alpha} y R_{\beta} son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, alquienilo, alquinilo, aralquilo, arilo, o donde R_{\alpha} y R_{\beta} con el átomo de nitrógeno al que están fijados forman un anillo que tiene de 4 a 8 átomos. Así, el término "amino", como se utiliza en este caso, incluye grupos amino no sustituidos, monosustituidos (p. ej., monoalquilamino o monoarilamino), y disustituidos (p. ej., dialquilamino o alquilarilamino). El término "amido" se refiere a -C(O)-N(R_{8})(R_{9}), donde R_{8} y R_{9} son tal y como se ha definido anteriormente. El término "acilamino" se refiere a -N(R'_{8})C(O)-R_{7}, donde R_{7} es tal y como se ha definido anteriormente y R'_{8} es alquilo.

Como se utiliza en este caso, el término "nitro" significa -NO_{2}; el término "halógneo" designa -F, -Cl, -Br o -I; el término "sulfhidrilo" significa -SH; y el término "hidroxilo" significa -OH.

El término "arilo" como se utiliza en este caso incluye grupos aromáticos de 5, 6 y 7 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos en el anillo, por ejemplo, fenilo, pirrolilo, furilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazol, tiazolilo, triazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, piridazinilo y pirimidinilo, y similares. Aquellos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura anular pueden también denominarse "heterociclos de arilo" o "heteroaromáticos". El anillo aromático puede ser sustituido en una o más posiciones del anillo con tales sustituyentes según se ha descrito anteriormente, como por ejemplo, halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamida, acetona, aldehído, éster, un heterociclilo, una fracción aromática o heteroaromática, -CF_{3}, -CN, o similar. Los grupos arilo pueden también formar parte de un grupo policíclico. Por ejemplo, los grupos arilo incluyen fracciones fusionadas aromáticas tales como naftilo, antracenilo, quinolilo, indolilo, y similares.

Los grupos modificadores pueden incluir grupos comprendiendo estructuras de biotinilo, grupos con fluoresceína, un grupo dietileno-triaminapentaacetilo, un grupo (-)-mentoxiacetilo, un grupo N-acetilneuraminilo, una estructura de colilo o un grupo iminiobiotinilo. Una LPL terapéutica puede ser modificada en su término carboxi con un grupo colilo según métodos conocidos en la técnica (por ejemplo véase: Wess, G. et al. (1993) Tetrahedron Letters, 34:817-822); Los derivados y análogos de colilo pueden también ser usados como grupos modificadores, tal como Aic (3-(O-aminoetil-iso)-colilo), que tiene un grupo amino libre que puede utilizarse para modificar aún más la LPL terapéutica. Un grupo modificador puede ser una "estructura de biotinilo", que incluye grupos biotinilo y análogos y derivados de los mismos (tales como un grupo 2-iminobiotinilo). En otra forma de realización, el grupo modificador puede comprender un "grupo con fluoresceína", tal como un grupo derivado de la reacción de un péptido de LPL terapéutica con 5-(y 6-)-carboxifluoresceína, éster succinimidílico o isotiocianato de fluoresceína. En varias otras formas de realización, el(los) grupo(s) modificador(es) puede(n) comprender un grupo N-acetilneuraminilo, un grupo trans-4-cotininacarboxilo, un grupo 2-imino-1-imidazolidineacetilo, un grupo (S)-(-)-indolina-2-carboxilo, un grupo (-)-mentoxiacetilo, un grupo 2-norbornaneacetilo, un gamma-oxo-5-acenaftenobutirilo, un grupo (-)-2-oxo-4-tiazolidinacarboxilo, un grupo tetrahidro-3-furoilo, un grupo 2-iminobiotinilo, un grupo dietilentriaminopentaacetilo, un grupo 4-morfolinacarbonilo, un grupo 2-tiofenacetilo o un grupo 2-tiofensulfonilo.

Variantes de la proteína LPL S447X

Variantes de polipéptidos de LPL incluyen polipéptidos que tienen similitud sustancial de secuencias a la proteína LPL S447X, como por ejemplo un 90%, un 95% o un 99% de identidad de secuencia con una parte correspondiente de la SEC ID NO. 1, la parte correspondiente siendo cualquier secuencia contigua de cualquier longitud, como por ejemplo 10, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos. Tales proteínas normalmente tienen actividad LPL, u otra propiedad similar a la LPL, igual o mayor que la proteína LPL S447X. En algunas formas de realización, los aminoácidos químicamente similares pueden ser sustituidos por aminoácidos en la secuencia de la proteína LPL S447X (para proporcionar sustituciones de aminoácidos conservadoras). Las sustituciones de aminoácidos reductoras de la actividad LPL, de las cuales más de 50 han sido descritas, como por ejemplo la sustitución de un residuo Ser por Asn en la posición 291 (Asn291 Ser), la sustitución de Asn por Asp en la posición 9 (Asp9Asn), la sustitución de Glu por Gly en la posición 188 (Gly188Glu, véase Monsalve et al,. J. Clin. Invest. 1990, 86(3):728-734) o Asp250Asn (Ma et al., Genomics. 1992, 13:649-653) debería ser evitada en las formas de realización preferidas.

Forma del ácido nucleico de la LPL terapéutica

En otra forma de realización adicional, la LPL terapéutica es un ácido nucleico que codifica la proteína LPL de tipo salvaje o que codifica una proteína LPL S447X. En una forma de realización alternativa, el ácido nucleico puede comprender una secuencia codificadora de ADN que codifica un ARN con al menos el 90% de identidad de secuencia con los nucleótidos 256 hasta 1599 de la SEC ID NO:2, cuya extensión de nucleótidos codifica el péptido LPL maduro de tipo salvaje.

Aún de forma alternativa, la LPL terapéutica puede comprender un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora de ADN que hibrida bajo condiciones astringentes desde los nucleótidos 256 hasta 1599 de la SEC ID NO:2.

Identidad de secuencias

Dos secuencias de ácidos nucleicos o proteicas son consideradas sustancialmente idénticas si, cuando son alineadas óptimamente, éstas proporcionan al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia. En formas de realización alternativas, la identidad de secuencia puede por ejemplo ser al menos del 75%, al menos del 90% o al menos del 95%. El alineamiento de secuencias óptimo para comparaciones de identidad puede ser realizada usando una variedad de algoritmos, tal como el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineamiento por homología Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, la investigación del método de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85: 2444, y las aplicaciones computarizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.). El alineamiento de secuencias puede también efectuarse usando el algoritmo BLAST, descrito en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (usando los ajustes por defecto publicados). El software para realizar el análisis BLAST puede estar disponible a través del Centro para la Información Biotecnológica o Center for Biotechnology Information (en Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El algoritmo BLAST implica en primer lugar identificar los pares de secuencias de altas puntuaciones (HSPs) identificando palabras de corta longitud W en la secuencia en cuestión que cumplen o satisfacen el umbral de puntuación T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es denominado como el umbral de puntuación de la palabra vecina. Las palabras comunes (word hits) iniciales próximas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas. Las palabras comunes son extendidas en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como la puntuación de alineamiento acumulativa pueda ser aumentada. La extensión de las palabras comunes en cada dirección es detenida cuando se cumplen los siguientes parámetros: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye por la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa es cero o inferior, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o bien el final de cada secuencia es alcanzado. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST, determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. Los programas BLAST pueden usar por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89: 10915-10919) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10 (que puede ser cambiada en formas de realización alternativas a 1 o 0,1 o 0,01 o 0,001 o 0,0001. Aunque los valores E muy superiores a 0,1 no pueden identificar secuencias funcionalmente similares, es útil examinar hits con importancia inferior, los valores E entre 0,1 y 10, para regiones de similitud cortas), M=5, N=4, para ácidos nucleicos se hace una comparación de ambas cadenas. Para comparaciones de proteínas, se puede usar BLASTP con los valores por defecto siguientes: G=11 (coste para abrir un espacio); E=1 (coste para extender un espacio); E=10 (valor expectativo, a este ajuste, 10 hits con puntuaciones iguales o mejores que la puntuación de alineamiento definida, S, están previstas que ocurran por casualidad en una base de datos del mismo tamaño que aquella que se está buscando; el valor E puede ser aumentado o disminuido para alterar la astringencia de la búsqueda.); y W=3 (tamaño de palabra, por defecto es 11 para BLASTN, 3 para otros programas blast).

La matriz BLOSUM asigna una puntuación de probabilidad para cada posición en un alineamiento que está basado en la frecuencia con la cual se sabe que esta sustitución ocurre entre bloques de consenso dentro de proteínas relacionadas. La matriz sustitutiva BLOSUM62 (coste de existencia de espacio = 11; coste por espacio de residuo = 1; proporción de lambda = 0,85) se usa por defecto en BLAST 2.0. Una variedad de otras matrices pueden ser usadas como alternativas a BLOSUM62, incluyendo: PAM30 (9, 1, 0,87); PAM70 (10, 1, 0,87) BLOSUM80 (10, 1, 0,87); BLOSUM62 (11, 1, 0,82) y BLOSUM45 (14, 2, 0,87). Una medición de la similitud estadística entre dos secuencias usando el algoritmo BLAST es la probabilidad más pequeña de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede ocurrir. En formas de realización alternativas de la invención, las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se consideran sustancialmente idénticas si la probabilidad más pequeña de suma en una comparación de las secuencias de prueba es inferior a aproximadamente 1, preferiblemente inferior a aproximadamente 0,1, más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,01, y de la forma más preferible inferior a aproximadamente 0,001.

Modificaciones

Es bien conocido en la técnica que algunas modificaciones y cambios pueden hacerse en la estructura de un polipéptido sin alterar sustancialmente la función biológica de este péptido, para obtener un polipéptido biológicamente equivalente. En un aspecto de la invención, LPL terapéutica puede incluir péptidos que difieren de una parte de la secuencia de LPL de tipo salvaje por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Como se utiliza en este caso, el término "sustituciones conservadas de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro en una ubicación dada en el péptido, donde la sustitución puede hacerse sin pérdida de función. Haciendo tales cambios, se pueden hacer sustituciones de residuos de aminoácidos similares, por ejemplo, basándose en la similitud relativa de sustituyentes de la cadena lateral, por ejemplo, su tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y similares, y tales sustituciones pueden ser evaluadas por su efecto en la función del péptido por una prueba rutinaria.

En algunas formas de realización, las sustituciones conservadas de aminoácidos pueden hacerse allí donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar (p. ej., dentro de un valor de más o menos 2,0), donde los valores de hidrofilicidad siguientes son asignados a los residuos de aminoácidos (como se detalla en la patente estadounidense No. 4.554.101, incorporada aquí por referencia): Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (0); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (-0,5); His (-0,5); Cys (-1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8); Ile (-1,8); Tyr (-2,3); Phe (-2,5); y Trp (-3,4).

En formas de realización alternativas, las sustituciones conservadas de aminoácidos pueden hacerse allí donde un residuo de aminoácido es sustituido por otro que tiene un índice hidropático similar (p. ej., dentro de un valor de más o menos 2,0). En tales formas de realización, se puede asignar a cada residuo de aminoácido un indice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga, como sigue: Ile (+4,5); Val (+4,2); Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly (- 0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8); Trp (-0,9); Tyr (-1,3); Pro (-1,6); His (-3,2); Glu (-3,5); Gln (-3,5); Asp (-3,5); Asn (-3,5); Lys (-3,9); y Arg (-4,5).

En formas de realización alternativas, las sustituciones de aminoácidos conservados pueden hacerse cuando un residuo de aminoácido es sustituido por otro en la misma clase, donde los aminoácidos son divididos en clases no polares, acídicas, básicas y neutras, como sigue: no polares: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; acídicas: Asp, Glu; basic: Lys, Arg, His; neutras: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.

Terapia genética

En una forma de realización de la invención, la LPL terapéutica es administrada a un sujeto en un vector de terapia genética. Los vectores pueden ser obtenidos a partir de distintos tipos de virus, incluyendo adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), herpes virus (HSV), lentivirus y retrovirus. En una forma de realización, se usa un serotipo AAV seleccionado del grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 y AAV8.

Dentro de los conocimientos técnicos del experto en la materia debe incluirse la selección del virus más apropiado o subtipo de virus. Algunos subtipos pueden ser más apropiados que otros para un tipo determinado de tejido. Por ejemplo, la sobreexpresión muscular de LPL puede ventajosamente ser inducida por transducción mediada por virus adeno-asociados (AAV) de células musculares. El músculo es capaz de realizar la transducción mediada por AAV, y diferentes serotipos pueden ser usados (AAV1, AAV6, AAV7, AAV8). La transducción del músculo es realizada por inyección intramuscular de AAV-LPL en sitios múltiples. Los sitios múltiples, teniendo la dosis vírica local baja, ayudarán a prevenir la miopatía inducida por LPL o respuestas inmunológicas inducidas por vectores. Este ha sido un método eficaz para la transducción a largo plazo del músculo usando el serotipo 1, no obstante la administración intravenosa usando otros serotipos puede también ser aplicable (AAV6, AAV8).

Los métodos generales para la terapia genética son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5.399.346 por Anderson et Al. (incorporada aquí por referencia). Una cápsula biocompatible para entregar material genético está descrita en la publicación PCT WO 95/05452 por Baetge et Al. Métodos de transferencia de genes en células hematopoyéticas también han sido proporcionados previamente (véase Clapp, D. W., et al., Blood 78: 1132-1139 (1991); Anderson, Science 288:627-9 (2000); y, Cavazzana-Calvo et al., Science 288:669-72 (2000).

Cantidades eficaces

En el tratamiento según la invención, la esteatohepatitis no alcohólica es tratada mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una LPL terapéutica. Como se utiliza en este caso, la esteatohepatitis no alcohólica se refiere al desarrollo de cambios histológicos en el hígado que son comparables a aquellos inducidos por la ingesta excesiva de alcohol, pero en ausencia de abuso de alcohol.

La LPL terapéutica normalmente será incluida en una composición farmacéutica, opcionalmente en combinación con un portador farmacéutico, diluyente y/o adyuvante. Tales composiciones incluyen la LPL terapéutica en una cantidad eficaz, suficiente para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico deseado, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad eficaz" incluye una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad profilácticamente eficaz.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en unas dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado, tal como la alteración de parámetros en el metabolismo lipídico, tal como el incremento de la actividad LPL, el incremento del colesterol HDL o la reducción de los niveles de triglicéridos. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una LPL terapéutica puede variar dependiendo de factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de la LPL terapéutica para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también normalmente aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la LPL terapéutica son superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y a períodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado, tal como prevención o inhibición de varias enfermedades, incluso de enfermedades sensibles a la LPL, tales como la cardiopatía coronaria, enfermedad cardiovascular, enfermedad de la arteria coronaria, triglicéridos altos y/o HDL bajo. Una dosis profiláctica puede ser usada en sujetos antes de o en una fase anterior de la enfermedad, y una cantidad profilácticamente eficaz puede ser mayor o menor que una cantidad terapéuticamente eficaz en algunos casos.

En formas de realización particulares, una gama para cantidades terapéuticamente o profilácticamente eficaces de LPL terapéutica puede ser 0,01 nM-0,1 M, 0,1 nM-0,1 M, 0,1 nM-0,05 M, 0,05 nM-15 \muM o 0,01 nM-10 \muM. Debe ser notado que los valores de dosificación pueden variar con la gravedad de la enfermedad que debe ser aliviada. Para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ser ajustados con el tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que gestione o supervise la administración de las composiciones. Las gamas de dosificación expuestas aquí son sólo a modo de ejemplo y no limitan las gamas de dosificación que pueden ser elegidas por los profesionales médicos.

Para los vectores de la terapia genética, la dosificación para ser administrada puede depender en gran medida de la enfermedad y tamaño del sujeto que es tratado al igual que de la formulación terapéutica, de la frecuencia del tratamiento y de la forma de administración. Los regímenes para la terapia de continuación, incluyendo las dosis, formulación, y frecuencia pueden ser dirigidos por la respuesta inicial y el juicio clínico. La vía parenteral de inyección tisular en el espacio intersticial puede ser preferida, aunque otras vías parenterales, tales como la inhalación de una formulación en aerosol, puede ser requerida en una administración específica. En algunos protocolos, una formulación que comprende el gen y sistema de entrega de genes en un portador acuoso es inyectada en el tejido en cantidades apropiadas. El tejido diana puede ser específico, por ejemplo el tejido muscular o hepático, o puede ser una combinación de diferentes tejidos, por ejemplo los tejidos musculares y hepáticos. Los tejidos diana ejemplares pueden incluir hígado, músculo esquelético, músculo del corazón, depósitos adiposos, riñón, pulmón, endotelio vascular, células epiteliales y/o hematopoyéticas.

En una forma de realización, la gama de dosis efectiva para animales pequeños (ratones), después de la inyección intramuscular, está entre 1x10^{12} y 1x10^{13} copia de genoma (gc)/kg, y para animales más grandes (gatos) y posiblemente sujetos humanos, entre 1x10^{11} y 1x10^{12} gc/kg. Nuevamente en ratones, los niveles de expresión de transgenes, según es medido por LPL en el plasma de post-heparina, alcanzan hasta 300 ng/ml (medido usando una ELISA comercial de DaiNippon), y la expresión se hace a largo plazo (>1 año) después de una administración de una sola vez.

La cantidad de compuesto activo en las composiciones de la invención pueden variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, un único bolus puede ser administrado, diferentes dosis divididas pueden ser administradas en el transcurso del tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o aumentada según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. "Forma de dosificación unitaria" según se utiliza en este caso se refiere a unidades físicamente específicas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos que deben ser tratados; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención puede ser dictada por las únicas características del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que debe ser conseguido, y por las limitaciones inherentes en la técnica

\hbox{de la composición de tal compuesto activo para el 
tratamiento de una enfermedad en individuos.}

Según se utiliza en este caso "portador farmacéutiamente aceptable" o "excipiente" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. En una forma de realización, el portador es conveniente para la administración parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. De forma alternativa, el portador puede ser adecuado para la administración sublingual u oral. Los portadores aceptables farmacéuticamente incluyen soluciones o dispersiones estériles acuosas y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención está contemplado.

Compuestos suplementarios activos pueden también ser incorporados en las composiciones farmacéuticas de la invención. Una guía sobre la coadministración de sustancias terapéuticas adicionales puede por ejemplo encontrarse en el Compendium of Pharmaceutical and Specialties (Compendio de Farmacia y Especialidades, CPS) de la Canadian Pharmacists Association (Asociación Canadiense de Farmacéuticos).

Las composiciones farmacéuticas son normalmente estériles y estables bajo las condiciones de producción y almacenamiento. Composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para recibir una concentración de fármaco elevada. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión conteniendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenoglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas derivadas adecuadas. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada incluyendo en la composición un agente retardante de la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. La LPL terapéutica puede ser administrada en un tiempo o formulación de liberación controlada, por ejemplo en una composición que incluye un polímero de liberación lenta u otros soportes que protegerán el compuesto contra una liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de entrega microencapsulados. Se pueden usar, por ejemplo, polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato de vinilo y etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y, copolímeros polilácticos poliglicólicos (PLG). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentadas o son generalmente conocidas por los expertos en la técnica.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Secuencia de proteínas de una forma de realización de una LPL terapéutica según la invención, es decir una proteína S447X.

Figura 2: Secuencia de ARNm de LPL. Los nucleótidos 256 a 1599 codifican el péptido de LPL maduro de tipo salvaje.

Ejemplo

Ejemplo 1

La terapia genética de LPL provoca la redistribución de triglicéridos

Este ejemplo investiga los efectos de AAV1 con LPL S447X como transgen en la hiperlipidemia inducida por la dieta en ratones transgénicos machos de APOE3-Leiden. Para este propósito inyectamos 6 ratones con 1x10^{13} gc's/kg AAV1- LPL S447X y 6 ratones con PBS (intramuscular; 4 sitios). Una semana más tarde los ratones comenzaron una dieta de tipo occidental. 28 semanas después del inicio de la dieta, los ratones fueron sacrificados.

Los resultados muestran que los ratones que recibieron una terapia genética de LPL mostraron un aumento gradual en concentraciones de LPL post-heparina hasta 300 ng/ml en las 25 semanas después de la inyección, pero la actividad lipasa post-heparina total no cambió significativamente. Además, ningún efecto en plasma TG, HDL-c y TC después de 4 hrs de ayuno pudo ser detectado. A pesar de esta ausencia de efecto en la circulación de concentraciones lipoproteínicas, la terapia genética de LPL demostró eficacia porque los ratones tratados presentaron un aclaramiento más rápido de TG y FFA después de que un bolus de intralípido administrado por vía intravenosa (p<0,05). Otras conclusiones significantes incluyen un aumento de peso significativamente reducido de los animales tratados con AAV1- LPL S447X en comparación con los controles (p<0,05), un efecto que no podría ser atribuido a una diferencia en masa de grasa abdominal. Homogeneizados musculares de los ratones tratados con AAV1- S447X indicaron un contenido de triglicéridos significativamente aumentado (p<0,05) mientras que los homogeneizados hepáticos indicaron significativamente un contenido de triglicéridos disminuido (p<0,05) en comparación con los controles.

Este ejemplo demuestra que en ausencia de efecto en lípidos en ayunas, la expresión de LPL humana en el músculo esquelético del ratón induce una redistribución de triglicéridos y un aumento reducido de masa corporal.

TABLA 1 Concentración de LPL humana post-heparina en el plasma después de la inyección de AAV1-LPLS447X

1

TABLA 2 Prueba de tolerancia de grasa de triglicéridos de valor máximo, % de valor después de inyección de intralípido

2

TABLA 3 Prueba de tolerancia de grasa de ácidos grasos sin valor máximo, % de valor después de la inyección de intralípido

3

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Patentes citadas en la descripción

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<110> Amsterdams Medisch Centrum y Amsterdam Molecular Therapeutics

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<120> Compuestos nuevos para el tratamiento de esteatohepatitis no alcohólica

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<130> P215797

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<160> 2

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<170> versión de PatentIn 3.3

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<210> 1

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<211> 446

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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<400> 1

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4

5

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<210> 2

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<211> 3549

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<212> ADN

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<213> homo sapiens

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<400> 2

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6

7

Claims

1. Uso de una lipoproteína ipasa (LPL) terapéutica para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esteatohepatitis no alcohólica en un sujeto.

2. Uso según la reivindicación 1 donde la LPL terapéutica es un elemento seleccionado del grupo que consiste en:

a) una proteína S447X con una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO. 1, o un derivado de la misma;

b) una proteína LPL con una secuencia de aminoácidos que comprende un segmento contiguo que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1 cuando está óptimamente alineado, teniendo una actividad LPL igual o superior a aquella de la proteína del párrafo a), o un derivado de la misma; o

c) un ácido nucleico que codifica a) o b), o un derivado del mismo.

3. Uso según la reivindicación 1 o 2, donde la LPL terapéutica comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora de ADN que codifica un ARN que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO: 2.

4. Uso según las reivindicaciones 1-3, donde la LPL terapéutica es un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora de ADN que se hibrida bajo condiciones astringentes con los nucleótidos 256 a 1599 de la SEC ID NO:2.

5. Uso según la reivindicación 1 o 2, donde la LPL terapéutica es una proteína LPL S447X con un segmento contiguo de al menos el 95% de identidad de secuencia con la SEC ID NO:1.

6. Uso según las reivindicaciones 1-5, donde la LPL terapéutica debe ser administrada al sujeto en un vector de terapia genética.

7. Uso según la reivindicación 6, donde el vector de terapia genética comprende un vector vírico.

8. Uso según la reivindicación 7, donde el vector vírico comprende el virus adeno-asociado (AAV).

9. Uso según las reivindicaciones 1-8, donde el sujeto es un humano.

10. Uso según las reivindicaciones 1-9, donde la LPL terapéutica debe ser administrada por vía parenteral.