ES2304359T3 - Procedimiento de formacion ex vivo de hueso de mamiferos y usos del mismo. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para producir hueso ex vivo, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) cultivar una célula osteogénica o célula precursora de hueso en medios que contienen suero; b) recoger la célula; c) cultivar dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos y calcio, en el que el cultivo según la etapa c) se inicia inmediatamente tras la etapa b); en el que el procedimiento de cultivo celular se inicia a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas, oscilando dichas densidades entre aproximadamente 1,0 x 10 3 y aproximadamente 1,0 x 10 6 células por cm 2 , mediante lo cual se forma hueso por células dentro de dicho esferoide de células óseas.

Description

Procedimiento de formación ex vivo de hueso de mamíferos y usos del mismo.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a los campos de la biología y la medicina. Más particularmente, se refiere a un procedimiento de formación ex vivo de hueso y usos del mismo.
2. Descripción de la técnica relacionada
El desarrollo de un tejido funcional tal como hueso requiere la acción concertada de varias señales de microentorno: citocinas/factores de crecimiento, moléculas de matriz extracelular (ECM) e interacciones célula:célula. Además, estas señales reguladoras deben ordenarse en el orden temporal y espacial apropiado, dando como resultado un microentorno de desarrollo que facilita el crecimiento tridimensional. El sistema esquelético no es una excepción a tales requisitos. Se entiende bien que varias citocinas/factores de crecimiento, tales como miembros de la familia de TGF-\beta1, modulan la formación ósea, y que moléculas de ECM tales como osteonectina, osteocalcina y colágeno de tipo I y II, etc., son importantes ambos en la osteogénesis y en la condrogénesis. Al contrario que los sistemas in vitro que son predominantemente planos, la necesidad de un desarrollo tridimensional similar a tejido está implícita ambos en la naturaleza estructural del esqueleto y en su desarrollo embrionario. Sin embargo, la ampliación de estos requisitos espaciales in vivo a sistemas in vitro ha sido difícil y en gran medida pasada por alto.
La condensación celular, un procedimiento de agregación celular mediado por interacciones de células mesenquimatosas: epiteliales, desempeña un papel crucial durante la esqueletogénesis (Hall y Miyake, 1992; 1995; Stringa et al., 1997). En el embrión de pollo en desarrollo, la condensación celular precede a la diferenciación en precondrocitos (Hall y Miyake, 1995). En cambio, durante la osteogénesis, las células se diferencian para dar preosteoblastos y después se someten a condensación (Hall y Miyake, 1995; Centrella, 1987). No obstante, esta condensación precede a la diferenciación de osteoblastos y mineralización de matriz (Dunlop y Hall, 1995). Los estudios de precondrocitos demuestran que la condensación celular está mediada por citocinas, e induce cambios en la expresión de varios genes importantes para el desarrollo. Por ejemplo, ambos TGF-\beta1 y BMP2 estimulan la condensación condrocítica y regulan por incremento la fibronectina, N-CAM y tenascina (Hall y Miyake, 1995). La etapa requerida de condensación celular durante la condrogénesis mesenquimatosa se imita in vitro en cultivos de micromasa de condrocitos (Denker et al, 1995). Tuan y colaboradores han demostrado que el tratamiento con TGF-\beta1 de las células C3H10T1/2 multipotentes en pequeños volúmenes de medios a altas densidades celulares (es decir, cultivos de micromasa) da como resultado la formación de estructuras tridimensionales que son de naturaleza cartilaginosa (Denker et al., 1995). Estas condensaciones celulares están asociadas con la regulación por incremento de componentes de matriz celular de cartílago tales como colágeno de tipo II y proteína de unión de cartílago (Denker et al., 1995). Igualmente, los estudios de células de pollo embrionarias (calváricas o de excrecencia celómica) confirman la inducción de condrogénesis mediada por la densidad celular (Wong y Tuan, 1995; Woodward y Tuan, 1999), y demuestran un requisito obligatorio para la interacción célula:célula en este procedimiento, lo más posiblemente mediado por N-cadherina (Woodward y Tuan, 1999), o N-CAM (Oberlender y Tuan, 1994; Miyake et al., 1996). El documento WO 96/05290 da a conocer composiciones de células precursoras de hueso y procedimientos para su preparación y uso. En particular, el documento WO 96/05290 da a conocer un procedimiento para preparar una población enriquecida de células precursoras de hueso usando técnicas de inmunoseparación. Además, el documento WO 96/05290 da a conocer un procedimiento de diferenciación de una célula precursora de hueso para dar un osteoblasto exponiendo la célula precursora de hueso a un factor de crecimiento y posteriormente cultivando la célula en condiciones libres de suero. Dicho hallazgo confirma la importancia de factores de crecimiento en procedimientos de diferenciación celular. El osteoblasto resultante puede usarse en terapias de trasplante para osteopenias.
Hasta la fecha, no existe ningún modelo in vitro de crecimiento de células osteogénicas similar a tejido o condensación celular. Las células osteogénicas calváricas o derivadas de médula ósea se hacen crecer a menudo sobre superficies bidimensionales (es decir, planas). La proliferación celular conduce finalmente a un apilamiento localizado de células confluentes para dar "nódulos óseos". Esto sugiere que la densidad celular desempeña un papel en el procedimiento de formación ósea; sin embargo, faltan estudios que demuestren directamente una relación entre la densidad celular y la formación ósea, al igual que estudios que demuestren la formación de hueso tridimensional, cristalino (al contrario que informes que se refieren a la mineralización de la matriz extracelular que rodea al
hueso).
Los procedimientos actuales para la reparación de defectos óseos incluyen injertos de construcción orgánica y sintética. Habitualmente se usan tres tipos de injertos orgánicos: autoinjertos, aloinjertos y xenoinjertos. Un autoinjerto es tejido trasplantado de un sitio a otro en el paciente. Los beneficios de usar el tejido del propio paciente es que el injerto no provocará una respuesta inmunitaria. Sin embargo, usar un autoinjerto requiere un segundo sitio de cirugía, lo que aumenta el riesgo de infección y puede introducir complicaciones adicionales. Además, el hueso disponible para injertar proviene de un número limitado de sitios, por ejemplo, el peroné, las costillas y la cresta ilíaca. Un aloinjerto es tejido tomado de un organismo diferente de la misma especie, y un xenoinjerto de un organismo de una especie diferente. Los últimos tipos de tejido están fácilmente disponibles en cantidades mayores que los autoinjertos, pero las diferencias genéticas entre el donante y el receptor pueden conducir a un rechazo del injerto. Todos tienen ventajas y desventajas, aunque ninguno proporciona una sustitución perfecta del hueso que falta.
Existe una necesidad de una manera mejor para reparar y/o sustituir hueso en sujetos que padecen enfermedades óseas o traumatismos óseos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para la formación ex vivo de hueso de mamífero y posteriores usos de ese. Una característica crítica y distintiva de la presente invención es las condiciones de cultivo tisular definidas y factores que dan como resultado la formación de esferoides de células óseas. Los "esferoides de células óseas" se definen como un crecimiento tridimensional similar a tejido de células osteogénicas o células precursoras osteogénicas. La formación de esferoides de células óseas permite la formación de hueso dentro del esferoide. También se describen procedimientos de implantación del hueso formado ex vivo en sujetos. También se describen procedimientos para alterar genéticamente esferoides/células óseas para realizar la formación ósea, identificación de moduladores candidatos de formación ósea, e identificación de genes implicados en la formación ósea.
Específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir hueso de mamífero ex vivo mediante obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos; y establecer los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas que contiene hueso, mediante lo cual se forma hueso dentro de células del esferoide de células óseas. La célula osteogénica o precursora de hueso de la presente invención puede aislarse de fuentes primarias tales como médula ósea o explantes óseos. Los protocolos para aislar tales células se describen en el presente documento. En otras realizaciones, pueden utilizarse líneas celulares de derivación de célula ósea. Las células osteogénicas o precursoras de hueso pueden ser de varias especies de mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a, origen humano, bovino, equino, canino, felino, de pollo, de rata o murino.
La presente invención describe el cultivo de la célula osteogénica en medios definidos, libres de suero. Los medios definidos se describen en el presente documento así como aditivos que se encuentran habitualmente en estos medios definidos, incluyendo albúmina, insulina, una fuente de hierro, una fuente de ácidos grasos y otros componentes esenciales. Los medios libres de suero definidos de la presente invención también se complementan con factores de crecimiento que son importantes para la formación de esferoides de células óseas. Los factores de crecimiento principales se definen ampliamente como miembros de la superfamilia de genes del factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta). Los miembros de esta familia incluyen TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta1.2 y proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2), BMP-4 y BMP-7. Pueden usarse otros factores de crecimiento tales como hormona paratiroidea (PTH), calcitonina, 1,25-dihidroxivitamina D3, interleucina-6, factores de crecimiento similares a insulina (IGF) I y II, VEGF e interleucina-11 como factores solitarios o coestimulantes.
La célula osteogénica o precursora de hueso de la presente invención puede purificarse mediante técnicas de separación fisicoquímicas, tales como separación por densidad en equilibrio. En otras realizaciones, la célula osteogénica o precursora de hueso puede purificarse mediante aislamiento por inmunoafinidad, tal como las que utilizan adhesión inmunitaria, cromatografía en columna inmunitaria o clasificación de células activadas por fluorescencia. En realizaciones preferidas, el aislamiento por inmunoafinidad utiliza anticuerpos frente a osteocalcina, osteonectina o fosfatasa alcalina, o combinaciones de los mismos.
Los cultivos de células osteogénicas o precursoras de hueso de la presente invención se inician a densidades celulares que son desde aproximadamente 1,0 x 10^{3} células por cm^{2} hasta aproximadamente 1 x 10^{6} células por cm^{2}.
Realizaciones adicionales de la invención describen el uso de un esferoide de células óseas para la fabricación de un producto farmacéutico para tratar enfermedades óseas en un mamífero. El producto farmacéutico puede formularse en un gel, incluyendo geles de alginato, geles de colágeno o geles de fibrina. En otras realizaciones el producto farmacéutico se formula en poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) o PGLA. El producto farmacéutico también puede formularse para su administración en o sobre compuestos hidroxiapatita u otros compuestos de apatita, hueso de animal desvitalizado, hueso humano desvitalizado o estructuras cerámicas porosas.
El producto farmacéutico también puede formularse para su administración junto con cirugía ortopédica y/o dispositivos ortopédicos, tales como implantes de cadera, implantes de rodilla y fusiones vertebrales. Como alternativa, la administración es junto con cirugía oral y/o implantes dentales, cirugía plástica o reparaciones periodontales. La implantación de un esferoide de células óseas puede realizarse dentro de tejido de formación de hueso o dentro de una herida. La implantación de un esferoide de células óseas también puede realizarse dentro de un mamífero que tiene una enfermedad ósea tal como osteoporosis, deficiencia de vitamina D, osteítis deformante, enfermedad de Von Recklinghausen.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para producir hueso de mamífero ex vivo mediante obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento de la superfamilia de genes del TGF-\beta; mantener los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas, y hueso dentro del mismo; y eliminar los elementos celulares permitiendo el uso del hueso resultante in vivo.
Otras realizaciones de la invención se refieren a un procedimiento para producir hueso de mamífero ex vivo mediante obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos; poner en contacto dicha célula con un vector que contiene ADNc recombinante que dirige la expresión de una proteína que potencia la formación de hueso y/o de esferoides de células óseas; y mantener los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas. El vector puede ser un plásmido o un vector viral. También se describen procedimientos para producir y administrar el vector a la célula osteogénica o precursora de hueso. Las proteínas que potencian la formación de esferoides de células óseas que pueden expresarse por los ADNc incluyen, pero no se limitan a, miembros de la superfamilia de genes del TGF-\beta, incluyendo TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta1.2, BMP-2, BMP-4 y BMP-7, así como ADNc que codifican para proteínas de matriz extracelular tales como osteonectina, osteopontina, osteocalcina, sialoproteína ósea, colágeno, fibronectina, trombospondina, factores de crecimiento similares a insulina I o II o VEGF. También se contemplan ADNc que dirigen la expresión de moléculas de citoadhesion tales como integrinas, selectinas y cadherinas, o factores de crecimiento tales como PTH, calcitonina, interleucina-6 o interleucina-11.
Las realizaciones adicionales de la invención describen un procedimiento para usar hueso de mamífero para la reparación ósea en un sujeto mediante obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos; poner en contacto dicha célula con un vector que contiene ADNc recombinante que dirige la expresión de una proteína que potencia la formación de esferoides de células óseas; e iniciar los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas; eliminar los elementos celulares del hueso formado ex vivo; y usar el hueso formado para realizar la reparación.
Otra realización de la presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un gen implicado en la formación ósea, reparación ósea y/o enfermedad ósea en mamíferos mediante obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos; iniciar los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas; e identificar genes que se expresan durante o tras la formación de un esferoide de células óseas y no se expresan en células osteogénicas o precursoras de hueso cultivadas en condiciones de cultivo control. Los procedimientos para identificar genes incluyen ensayos de presentación de mensajes diferenciales, ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa, ensayos de tipo Northern y redes de expresión génica (por ejemplo, placas génicas basadas en ADNc o basadas en oligonucleótidos).
También se describe un procedimiento para producir un modulador de formación ósea, reparación ósea y/o enfermedad ósea en mamíferos mediante las etapas de obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de un modulador candidato, pero en ausencia de otros factores de crecimiento osteogénicos; medir la formación de esferoides de células óseas; y comparar la formación de hueso y/o esferoide de células óseas con la observada en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos. En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un modulador de formación ósea, reparación ósea o enfermedad ósea en mamíferos mediante obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de un modulador candidato más presencia de uno o más factores de crecimiento de la superfamilia de genes del TGF-\beta; medir la formación de esferoides de células óseas; comparar la formación de esferoide de células óseas con la observada en ausencia del modulador, y producir un modulador así identificado. Se esperará que los moduladores identificados de esta manera potencien, inhiban o actúen de manera sinérgica con factores de crecimiento de la superfamilia de genes del TGF-\beta. Actualmente, el mejor ejemplo de este último concepto se muestra mediante co-estimulación de la formación de esferoides con TGFB1 y PTH que aumenta el tamaño de las microespículas resultantes.
La presente invención también describe un esferoide de células óseas realizado mediante el procedimiento de obtener una célula osteogénica o célula precursora de hueso; cultivar dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos; y mantener los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
Figura 1. Formación de esferoides celulares y microespículas y el análisis inmunocitoquímico. Las células cultivadas en presencia de TGF-\beta1 (200 pM) formaron esferoides (fila 1) y estructuras óseas cristalinas denominadas microespículas (fila 2). Los esferoides de células óseas expresan osteonectina (fila 3) y colágeno (tinción de Masson, fila 4). También se determinó colágeno tipo I mediante análisis inmunocitoquímico (fila 5). Los esferoides de células óseas también muestran actividad de fosfatasa alcalina (fila 6) y experimentan mineralización tal como se determina mediante citoquímica de rojo de alizarina positiva (fila 7). MG63, una línea celular de osteosarcoma humano; HBPC, células precursoras de hueso humanas; osteoblastos, osteoblastos humanos primarios de esquirlas óseas tratadas con colagenasa.
Figura 2. La formación de microespículas depende del fenotipo de célula ósea. Número total de microespículas formadas por cada uno de los tres tipos de células estudiados. Los valores son la media \pm DE.
Figura 3. Análisis TEM de esferoides de células óseas y microespículas. Se cultivaron osteoblastos primarios en condiciones de formación de esferoides de células. El panel superior muestra una sección a través de la microespícula (MSp) recubriendo los osteoblastos cuboidales la MSp. Estas células muestran un núcleo prominente (N), y largas prolongaciones celulares que recubren la MSp (aumento de 3.000). Un aumento superior (panel central) de una microespícula demuestra la estrecha aposición de los osteoblastos con respecto a la MSp. Las flechas apuntan hacia las prolongaciones celulares que rodean la MSp (aumento de 15.900). Núcleo (N), mitocondria (M). El panel inferior muestra el frente de mineralización (MF) de las microespículas (MSp) y las bandas transversales a 640-670 \ring{A} de colágeno (aumento de 15.200).
Figura 4A, figura 4B, figura 4C y figura 4D. Análisis de Raman de microespículas. Microespículas derivadas de esferoides de células óseas analizadas mediante espectrografía de Raman tal como en los procedimientos. Se muestra una microespícula ósea representativa en la figura 4A. Después se tritura la espícula entre el cubreobjetos/portaobjetos de cuarzo y se adquieren espectros a 150-300 de transecciones de Raman (figura 4B línea sombreada en blanco). En la figura 4C se muestra una muestra representativa de tres espectros de Raman. Indican claramente la banda de \nu_{1} (PO_{4}) indicativa de hueso (959 cm^{-1}). El análisis de factores (véase el texto) de estos espectros (figura 4D) indica una señal clara de \nu_{1} (PO_{4}) presente en microespículas ambos en el día 3 (espectro superior) y el día 7 (espectro inferior).
Figura 5A y figura 5B. Expresión de proteínas óseas y actividad de fosfatasa alcalina de esferoides de células óseas. Se cultivaron tipos de células óseas libres de suero (esferoide menos) así como en presencia de TGF\beta (esferoide positivo) tras 1 semana de cultivo. Figura 5A. Se analizaron lisados celulares mediante análisis de tipo Western para detectar osteonectina y fosfatasa alcalina. Se determinó la síntesis de colágeno tipo I marcando esferoides con ^{3}H-prolina y cadenas de colágeno \alpha1 (I) y \alpha1 (III) distinguidas mediante electroforesis de reducción retrasada. Figura 5B. Actividad de fosfatasa alcalina enzimática. Se cultivaron células tal como en A y se determinó colorimétricamente la actividad enzimática. Los resultados se expresan como \mumol de para-nitrofenol/h/mg de proteína. Los valores son la media \pm DE (n = 4).
Figura 6A y figura 6B. Inducción de expresión de proteína ósea dependiente de la densidad. Figura 6A. Se formaron esferoides de células óseas a las densidades celulares indicadas. (Se sembraron en placas MG63 y osteoblastos a 1, 2, 4 x 10^{5} células/pocillo, las HBPC a 1, 2, 4 x 10^{6} células por pocillo). Se determinó la expresión de osteonectina mediante análisis de tipo Western. Figura 6B. La expresión de proteína ósea aumenta con el tamaño creciente de esferoide. Se separaron los esferoides en población de tamaño pequeño, medio y grande basándose en su tamaño (aproximadamente 3.000, 30.000 y 100.000 células/esferoide, respectivamente).
Figura 7A y figura 7B. Cinética de la expresión de proteína ósea. Figura 7A. Se examinó la formación de esferoides de células óseas en los puntos de tiempo indicados. Se determinó la expresión de osteonectina y fosfatasa alcalina mediante análisis de tipo Western. Figura 7B. Se normalizó la abundancia relativa de proteína, expresada en unidades de D.O. arbitrarias, para la carga de proteína, determinada mediante densitometría (MG63 y HBPC). Para los osteoblastos primarios, se determinó la fosfatasa alcalina enzimática tal como se describe en los procedimientos.
Figura 8. La formación de esferoides de células óseas induce expresión de cadena de \alpha-integrina. Se indujo la formación de esferoides de células óseas tal como se describe en los procedimientos, y se evaluó para determinar la expresión de integrina (histogramas gruesos) mediante citometría de flujo tras la desagregación usando tratamiento con colagenasa/tripsina. Los controles (histogramas claros) consistieron en células óseas adherentes que se hicieron crecer como una lámina plana bidimensional. No se observan cambios en la expresión de integrina en las células control en presencia o ausencia de TGF-\beta1.
Figura 9. Inhibición de formación de esferoides de células óseas y microespículas óseas. Se hicieron crecer células óseas en condiciones de formación de esferoides de células en presencia o ausencia de anticuerpos anti-\alpha2, anti-\alpha3 (para HBPC) y/o anti-\beta1 integrina, cada uno sólo y en combinación. Los controles consisten en anticuerpos inapropiados específicos de isotipo. También se cultivaron las células en presencia de EGTA (0,5 mM) o puromicina (5 \muM). Se determina la inhibición en porcentaje en comparación con controles de anticuerpos inapropiados control, o carencia de EGTA o puromicina. Los anticuerpos inapropiados no inhiben la formación de esferoides/microespículas.
Figura 10. TGF-\beta e IGF actúan de manera sinérgica durante la osteogénesis. Usando un sistema de cultivo murino, se cuantificaron microespículas positivas de von Kossa en presencia de citocinas activas óseas. TGF-\beta, factor de crecimiento transformante \beta1; IGF, factor de crecimiento similar a la insulina.
Descripción de realizaciones ilustrativas
Se estima que la tasa de fracturas de hueso en los Estados Unidos es de 6.000.000 individuos al año. Cuando se fractura completamente un hueso, un número significativo de fracturas requieren intervención médica más allá de la simple inmovilización (escayolar), particularmente las que implican traumatismo. Un problema principal en tales casos es la falta de proximidad de los dos extremos del hueso (denominado como sin unión). Esto da como resultado un procedimiento de reparación prolongado e inapropiado, que puede evitar la recuperación. La duración de tiempo promedio para que el cuerpo repare una fractura es de 25-100 días, para un soporte de carga moderado, y un año para una reparación completa. Por tanto, tanto las fracturas sencillas como las roturas médicamente complicadas se beneficiarán de las modalidades terapéuticas novedosas que aceleran y/o completan el procedimiento de reparación. Lo mismo es cierto para aquellas enfermedades óseas (denominadas osteopenias) que dan como resultado un adelgazamiento del hueso cuyo primer síntoma es una fractura a menudo debilitante, y otras enfermedades en las que se ve comprometida la resistencia o elasticidad del hueso.
No hay ningún tratamiento curativo para la pérdida de masa ósea, incluyendo diversas proteínas que promueven el crecimiento y vitamina D3. Igualmente, no hay ninguna sustitución eficaz ni implante para las fracturas sin unión o lesiones aplastadas del hueso. Actualmente, estos últimos tipos de lesiones utilizan hueso bovino (de vaca) o de cadáver humano que se trata químicamente (para eliminar proteínas) con el fin de evitar el rechazo. Sin embargo, tales implantes de hueso, aunque son mecánicamente importantes, están biológicamente muertos (no contienen células formadoras de hueso, factores de crecimiento ni otras proteínas reguladoras). Por tanto, no modulan en gran medida el procedimiento de reparación.
La presente invención se refiere a procedimientos para la formación ex vivo de hueso de mamífero y posteriores usos del hueso. Una característica crítica y distintiva de la presente invención es las condiciones de cultivo tisular definidas y factores que dan como resultado la formación de esferoides de células óseas. También se describen fuentes de células osteogénicas o precursoras de hueso y procedimientos de aislamiento de estas células precursoras. También se describen procedimientos de implantación en sujetos del hueso formado ex vivo para el tratamiento de diversas enfermedades óseas o fracturas de hueso, roturas u otros traumatismos. También se describen procedimientos para alterar genéticamente los esferoides de células óseas para realizar la formación ósea, identificación de moduladores candidatos de formación ósea e identificación de genes implicados en la formación ósea.
I. Esferoides de células óseas
En condiciones de cultivo normales, se hacen crecer células osteogénicas en presencia de diversas cantidades de suero, y permanecen adherentes a la placa de cultivo, creciendo esencialmente como una lámina plana, bidimensional de células. La expansión in vitro de estas células requiere su liberación del plástico mediante tratamiento con tripsina y nuevo cultivo. Tras de 4 semanas a 6 semanas, se colocan las células en medios que contienen suero y altos niveles de calcio y fosfato. Estas células alcanzan densidades confluentes, y después se "apilan" formando estructuras celulares de múltiples capas denominadas nódulos óseos que mineralizan su matriz extracelular circundante.
En contraste marcado, las células osteogénicas que se hacen crecer en condiciones libres de suero experimentan un patrón de desarrollo distinguidamente diferente que da como resultado la creación de una nueva composición de materia. Este procedimiento requiere la presencia de TGF-\beta, u otros factores de crecimiento osteogénicos, añadidos en el plazo de las primeras 0 horas a 48 horas de cultivo. En estas condiciones, las células se vuelven adherentes al plástico durante un periodo adicional de 24 horas a 36 horas; se liberan espontáneamente de la superficie de plástico de la placa de cultivo tisular; forman agregados de células con forma de esferoide tridimensional de diversos tamaños no adherentes, denominados "esferoides de células óseas". Las células óseas dentro de los esferoides, debido a su desarrollo tridimensional similar a tejidos, experimentan diferenciación celular que da como resultado cambios bioquímicos que conducen a una rápida (de 3 días a 7 días) mineralización del esferoide, y la formación de estructuras cristalinas similares a hueso (denominadas microespículas). La composición de materia descrita en el presente documento (de esferoides de células que contienen microespículas) se diferencia de manera distintiva de los cultivos de células óseas normales. En primer lugar y lo más importante, este procedimiento da como resultado el desarrollo esferoideo, tridimensional, similar a tejido de células óseas. En segundo lugar, estos agregados similares a tejido no son adherentes, desarrollándose en suspensión con las células adherentes sólo entre sí y no con el plástico de la placa de cultivo subyacente. Por último, el desarrollo similar a tejido de células óseas requiere condiciones libres de suero y da como resultado la formación ex vivo de hueso cristalino tridimensional dentro del agregado tisular, un procedimiento no observado ni descrito en ningún otro sistema de cultivo.
II. Células precursoras osteogénicas
La presente invención describe la formación ex vivo de hueso a partir de células osteogénicas, células precursoras de hueso, así como líneas de células óseas. La siguiente sección describe diversas fuentes de estas células precursoras, su aislamiento y caracterización. Las células osteogénicas o precursoras se derivan de fuentes primarias tales como médula ósea o hueso. Además, las células pueden derivarse de varias especies diferentes, incluyendo células de origen humano, bovino, equino, canino, felino y murino.
A. Células precursoras de hueso
Las células precursoras de hueso humanas se caracterizan como células de pequeño tamaño que expresan pequeñas cantidades de proteínas óseas (osteocalcina, osteonectina y fosfatasa alcalina) y tienen un grado bajo de complejidad interna (Long et al., 1995). Cuando se estimulan para diferenciarse, estas células similares a preosteoblastos se vuelven similares a osteoblastos en cuanto a su aspecto, tamaño, expresión antigénica y estructura interna. Aunque estas células están normalmente presentes a frecuencias muy bajas en la médula ósea, se ha descrito un procedimiento para aislar estas células (Long et al., 1995). La patente estadounidense 5.972.703, titulada "Bone Precursor Cells: Compositions and Methods", Michael W. Long y Kenneth G. Mann, describe además procedimientos de aislamiento y uso de células precursoras de hueso.
Un ejemplo de una técnica para aislar células precursoras de hueso implica las siguientes etapas. Se preparan células mononucleares a partir de médula ósea mediante separación sobre ficoll u otras técnicas de separación mediante densidad en equilibrio adecuadas conocidas por los expertos en la técnica. Después se cultivan células mononucleares de baja densidad durante la noche para eliminar células adherentes a plástico. Una etapa de enriquecimiento utilizando el aislamiento por inmunoafinidad implica la recogida de células de baja densidad no adherentes usando anticuerpos anti-osteonectina (ON) y anti-osteocalcina (OC) inmovilizados sobre plástico tal como se describe (Long et al., 1995). Se recogieron las células adherentes inmunitarias mediante tripsinización. Las etapas de enriquecimiento alternativas pueden implicar cromatografía en columna inmunitaria o clasificación de células activadas por fluorescencia. Además de los anticuerpos frente a osteonectina y osteocalcina, pueden utilizarse anticuerpos frente a fosfatasa alcalina u otros marcadores de superficie celular expresados sobre células precursoras de hueso. Éstos se describen con mayor detalle en la siguiente sección.
Tal como se usa en el presente documento, una célula precursora de hueso es cualquier célula que puede diferenciarse o expandirse para dar una célula osteoblasto. Una célula precursora de hueso de la presente invención no es hematopoyética y por tanto no expresa el antígeno pan-hematopoyético CD34. Las células precursoras de hueso preferidas incluyen células osteoprogenitoras y células preosteoblastos.
Pueden enriquecerse adicionalmente las células precursoras de hueso mediante centrifugación por densidad en equilibrio de células de médula ósea. La centrifugación por densidad en equilibrio de células de médula ósea proporciona células de médula ósea de baja densidad enriquecidas en células precursoras de hueso. En una realización, puede realizarse la centrifugación por densidad en equilibrio antes de la purificación mediante anticuerpos. En una segunda realización, puede realizarse la centrifugación por densidad en equilibrio tras la purificación mediante anticuerpo. Como alternativa, la etapa de purificación mediante centrifugación por densidad en equilibrio puede realizarse dos veces antes y después de la etapa de purificación mediante anticuerpos.
En otro aspecto, la población de células precursoras de hueso puede enriquecerse eliminando células del estroma presentes en las células de médula ósea. La eliminación de células del estroma puede lograrse exponiendo las células de médula ósea a una superficie adherente, normalmente vidrio o plástico de cultivo tisular. Las células del estroma se adhieren al vidrio o plástico de cultivo tisular mientras que las células precursoras de hueso no. Las células del estroma pueden eliminarse antes o después de la etapa de purificación inmunitaria. Preferiblemente, las células del estroma se eliminan antes de la etapa de purificación inmunitaria. El uso de superficies sólidas tales como vidrio o plástico de cultivo tisular se conoce bien en la técnica. El vidrio y plástico de cultivo tisular pueden tratarse (por ejemplo, con silicona, nitrocelulosa, níquel, etc.) para promover o inhibir la adhesión celular. Hay superficies tratadas y sin tratar comercialmente disponibles.
En otro aspecto, se fracciona adicionalmente según su tamaño una población enriquecida de células precursoras de hueso. En una realización preferida, puede lograrse el fraccionamiento por tamaño logrado mediante citometría de flujo activada por fluorescencia. Las células precursoras de hueso de la presente invención tienen diámetros promedio entre aproximadamente 8 micrómetros y aproximadamente 70 micrómetros. Preferiblemente, las células precursoras de hueso tienen diámetros promedio de entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 20 micrómetros.
B. Osteoblastos humanos primarios
Otras fuentes de células óseas para su uso en la presente invención son osteoblastos primarios. Un ejemplo de un procedimiento de aislamiento para estas células puede encontrarse en Robey y Termaine (1985). En resumen, se obtienen esquirlas óseas durante cirugía ortopédica. Éstas se tratan con colagenasa D durante 2 h a 37ºC, se eliminan mediante lavado las células no adherentes, se desmenuzan las partes de hueso y se cultivan en medios libres de Ca^{2+} que contienen FCS al 10% y pen/estrep. Después de que los cultivos sean confluentes, se recogen las células mediante tripsinización y se cultivan en DMEM que contiene Ca^{2+} durante 2-3 semanas. Se recuperan osteoblastos derivados de hueso mediante tripsinización.
En la técnica se conocen procedimientos alternativos para aislar osteoblastos a partir de hueso (véase, por ejemplo, Aubin et al., 1982). Tal como se notifica, se escinde la calvaria, se aclara en un medio y se desmenuza con tijeras. Se digiere el hueso desmenuzado con colagenasa durante un corto periodo de tiempo en medio. Se eliminan las células mediante centrifugación y se decanta el sobrenadante, dejando las partes de hueso. Se añade suero de ternero fetal para inhibir la digestión con colagenasa. Se siembran las células en placas a baja densidad en un medio de crecimiento apropiado, y se cultivan colonias de células clonales por duplicado para su cultivo continuo y caracterización.
C. Líneas celulares
Además de osteoblastos primarios y células precursoras de hueso tal como se describió anteriormente, pueden usarse diversas líneas celulares como punto de partida para la formación de esferoides óseos ex vivo tal como se describe por los procedimientos en la presente invención. Pueden formarse líneas célula a partir de varias especies, incluyendo origen humano, bovino, equino, canino, felino y murino. Las líneas celulares a modo de ejemplo tal como se describen en los ejemplos incluidos en esta invención son células MG-63 (ATCC nº CRL-1427), células C3/H10T1/2 (ATCC nº CCL-226) y células SAOS-2 (ATCC nº HTB-85). Otras líneas celulares, también disponibles mediante la Colección Americana de Cultivos Tipo, incluyen células HOS (ATCC nº CRL-1543) y diversos derivados de las mismas, G-292 (ATCC nº CRL-1423), células SJSA-1 (ATCC nº CRL-2098), células Hs 3.T (ATCC nº CRL-7005), células TE 415.T (ATCC nº CRL-7764), células TE 418.T (ATCC nº CRL-7766), células Hs 755 (A).T (ATCC nº CRL-7877), células 143B (ATCC nº CRL-8303), células U-2 OS (ATCC nº HTB-96) y células T1-73 (ATCC nº CRL-7943). Estas líneas celulares se derivan todas a partir de osteosarcomas humanos. También hay líneas celulares de osteosarcoma similares de varias otras especies disponibles en la ATCC.
III. Marcadores celulares
Se usan diversos marcadores celulares para definir y/o purificar células precursoras osteogénicas de la presente invención. La siguiente sección define estos marcadores y sus usos.
Las células precursoras de hueso, tales como las descritas en la patente estadounidense 5.972.703, son inmunorreactivas con anticuerpos frente a células precursoras de hueso. Se usa un anticuerpo frente a células precursoras de hueso para enriquecer la población de células precursoras de hueso. Los anticuerpos frente a células precursoras de hueso incluyen anti-osteocalcina, anti-osteonectina y anti-fosfatasa alcalina ósea. Los anticuerpos anti-osteocalcina, antiosteonectina y anti-fosfatasa alcalina ósea se describieron en Shull et al., 1984. A medida que se caracterizan adicionalmente las células precursoras de hueso, pueden generarse otros anticuerpos que inmunorreaccionan con una célula precursora de hueso por un experto en la técnica. También se contempla el uso de estos otros anticuerpos inmunorreactivos con una célula precursora de hueso. En una realización preferida, se conjuga un anticuerpo frente a células precursoras de hueso a un sustrato sólido. El sustrato sólido es preferiblemente una placa petri o de cultivo tisular. El uso de superficies sólidas tales como vidrio o plástico de cultivo tisular se conoce bien en la técnica. Puede tratarse el vidrio y plástico de cultivo tisular (por ejemplo, con silicona, nitrocelulosa, níquel, etc.) para promover o inhibir la adhesión de proteínas. Hay superficies tratadas y sin tratar comercialmente disponibles. Pueden utilizarse placas de cultivo tisular revestidas con anticuerpos para "cribar" células precursoras de hueso. En resumen, se incuban células precursoras de hueso que contienen células de médula ósea sobre placas recubiertas con anticuerpos. Las células precursoras de hueso se adhieren a los anticuerpos mientras que todas las demás células no se adhieren a la placa. Tras la incubación, se eliminan las células que no se adhieren a la placa lavando suavemente la placa con medios. Se separaron las células precursoras de hueso de la placa y se analizaron adicionalmente, se purificaron o se diferenciaron para dar osteoblastos.
En otra realización, puede usarse un segundo anticuerpo inmunorreactivo con un anticuerpo frente a células precursoras de hueso para enriquecer la población de células precursoras de hueso. El uso de un anticuerpo secundario se conoce generalmente en la técnica. Normalmente, los anticuerpos secundarios son anticuerpos inmunorreactivos con las regiones constantes del primer anticuerpo. Los anticuerpos secundarios preferidos incluyen anti-conejo, anti-ratón, anti-rata, anti-cabra y anti-caballo y están comercialmente disponibles. En una realización preferida, se conjugan anticuerpos secundarios a un sustrato sólido incluyendo placa de cultivo tisular, agarosa, poliacrilamida y partículas magnéticas. En esta realización, se hace inmunorreacionar en primer lugar un anticuerpo frente a células precursoras de hueso con una célula precursora de hueso. A continuación la célula precursora de hueso con el anticuerpo unido se expone al anticuerpo secundario que está conjugado a un sustrato sólido. El enriquecimiento de células precursoras se logra porque sólo las células que presentan un anticuerpo frente a células precursoras de hueso inmunorreaccionan con el anticuerpo secundario. Un kit comercialmente disponible proporciona anticuerpos secundarios conjugados a partículas magnéticas. En este sistema, las células precursoras de hueso que presentan un anticuerpo frente a células precursoras de hueso se purifican mediante exposición a un campo magnético.
La preparación de anticuerpos óseos (es decir, frente a osteonectina, osteocalcina y fosfatasa alcalina) se notificó en Shull et al., 1989. En la presente invención se contemplan anticuerpos ambos policlonales y monoclonales. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, E. Harlow y D. Lane, 1988).
Se han notificado antígenos de superficie celular sobre células normales del linaje osteogénico para especies aviares y de roedores (Bruder y Caplan, 1989; 1990; Turksen et al., 1992). Algunos de estos anticuerpos notificados también reaccionan con células distintas de las encontradas en el hueso. Se han preparado anticuerpos monoclonales frente a antígenos intracelulares en osteoblastos humanos normales y frente a la superficie de líneas de células osteogénicas humanas transformadas (Embleton et al., 1981; Hosoi et al., 1982; Heiner et al., 1987; Bruland et al., 1988; Tsai et al., 1990; Walsh et al., 1994). Los ejemplos de marcadores de células osteogénicas, producción de anticuerpos e hibridomas, así como procedimientos de uso de estos marcadores se describen en la patente estadounidense 5.643.736. Un ejemplo de un anticuerpo monoclonal frente a un epítopo de superficie celular que puede identificar células osteogénicas humanas es uno dirigido frente a la fosfatasa alcalina (Lawson et al., 1985). Esta enzima de superficie celular bien caracterizada ha servido como patrón histórico para identificar una gran familia de células osteogénicas, y se demuestra fácilmente mediante una sencilla tinción histoquímica.
Otros antígenos preferidos incluyen osteocalcina y osteonectina. La isteocalcina es una proteína ósea de unión a calcio dependiente de vitamina K también denominada proteína gla ósea (BGP). Particularmente, la osteocalcina humana es una proteína relativamente pequeña compuesta por 49 aminoácidos y que tiene un peso molecular de 5800. Esta proteína se produce a partir de osteoblasto, y ocupa aproximadamente el 20% de los componentes constituyentes de la proteína distinta de colágeno de los huesos. Esta proteína contiene residuos de ácido gamma-carboxiglutámico y tiene una fuerte afinidad por la hidroxiapatita, y por tanto se supone que tiene un papel importante en la formación de las matrices óseas. La osteonectina, también denominada BM40 o SPARC (proteína secretada, ácida y rica en cisteína) es una glicoproteína multifuncional implicada en la mineralización tisular, interacciones célula-matriz extracelular así como angiogénesis. Glicoproteína de unión a calcio, no colagenasa de hueso en desarrollo. Conecta colágeno a mineral en la matriz ósea.
Los anticuerpos monoclonales frente a células precursoras pueden marcarse con marcadores adecuados radiactivos, enzimáticos, fluorescentes u otros mediante procedimientos convencionales y/o unirse a soportes sólidos adecuados, que resultarán evidentes a los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales en combinación con, o acoplados a, un compuesto inmunoquímico tal como isotiocianato de fluoresceína, peroxidasa, biotina y sus análogos (por ejemplo, iminobiotina), avidina y sus análogos (estreptavidina) u otros marcadores de este tipo. Además, pueden unirse o fijarse anticuerpos monoclonales a ciertos sustratos y utilizarse para capturar células osteogénicas cuando se ponen muestras tisulares tales como aislados de células óseas, biopsias periósticas o células cultivadas en contacto con anticuerpos monoclonales fijados. Después pueden separarse las células unidas de la fase sólida mediante procedimientos conocidos dependiendo esencialmente de la naturaleza de la fase sólida y el anticuerpo. Las células unidas pueden recuperarse y usarse para diversos fines terapéuticos, tales como para la regeneración de hueso, etc., dependiendo de los diversos factores externos e internos.
Como resultado, la presente invención contempla cualquier procedimiento de empleo de anticuerpos monoclonales para separar subconjuntos de células osteogénicas normales de otras células tales como células fibroblásticas o hematopoyéticas. Por ejemplo, se contempla adicionalmente un procedimiento de producción de una población de subconjuntos de células osteogénicas humanas normales que comprende las etapas de proporcionar una suspensión celular de tejido que contiene tales células; poner en contacto la suspensión celular con anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo sobre las células osteogénicas pero no reconoce un epítopo sobre las células fibroblásticas o hematopoyéticas; y separar y recuperar de la suspensión celular las células unidas a los anticuerpos monoclonales.
IV. Superfamilia de genes del TGF-P
El uso de factores de crecimiento de la superfamilia de genes del TGF-\beta para producir hueso ex vivo es un aspecto importante de la presente invención. La siguiente sección detalla los atributos de la superfamilia de genes del TGF-\beta. Son de uso particular los factores de crecimiento que inducen la formación de un esferoide de células óseas, tal como se definió en la sección anterior.
La superfamilia de factor de crecimiento transformante \beta es una familia de proteínas bien caracterizada implicada en la proliferación y diferenciación celular de células en diversos tejidos. Los miembros de la superfamilia de TGF-\beta son generalmente de estructura dimérica, comprendiendo dos unidades momoméricas que se producen mediante rotura proteolítica de una proteína precursora mayor, de la que el monómero procesado representa la parte carboxilo terminal. Las proteínas de TGF-\beta diméricas tienen generalmente pesos moleculares de aproximadamente 20.000 a 35.000 y comparten un patrón de cisteína común en la región de la proteína madura. Véase, por ejemplo, Sporn et al. (1986) y los artículos citados en el mismo. La superfamilia de TGF-\beta incluye varios subgrupos aparte de TGF-\beta1 a \beta5. Éstos son las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDF), las inhibinas, así como GDNF y sustancia inhibidora de Muller y otras proteínas estructuralmente relacionadas. La superfamilia de TGF-\beta también incluye proteínas de otras especies, que se han caracterizado y están sumamente conservadas en comparación con los TGF-\beta de mamíferos, incluyendo Vg1 (Xenopus), (Weeks y Melton, 1987); Dpp, Screw y 60A (Drosophila), (Padgett et al., 1987; Doctor et al., 1992); y proteínas identificadas más recientemente incluyendo univina (erizo de mar), dorsalina-1 (pollo) y Radar (pez cebra). Otros factores que pueden usarse eficazmente en la composición incluyen moléculas sintéticas o fragmentos de un miembro de la superfamilia de TGF-\beta que puede unirse a una molécula receptora del TGF-\beta.
La familia de proteínas del factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) consiste en varias proteínas relacionadas, pero funcionalmente diferenciadas (Barnard, 1990; Roberts y Sporn, 1990). Un miembro de la familia de proteínas del TGF-\beta, TGF-\beta1, es una citocina multifuncional con actividades ambas de promoción y de inhibición del crecimiento. Recientemente, se ha encontrado que TGF-\beta1 desempeña un papel en la modulación de reparación de lesiones vasculares tales como lesiones por restenosis (Nikol et al., 1992) y placas ateroscleróticas (Kojima et al., 1991).
Los miembros de la familia de proteínas de TGF-\beta inician la señalización celular uniéndose a complejos de receptor heteroméricos de receptores de serina/treonina quinasa de tipo I (T\betaRI) y tipo II (T\betaRII) (revisado por Massague et al., 1994; Miyazono et al., 1994). La activación de este complejo de receptor heteromérico se produce cuando TGF-\beta se une a T\betaRII, que después recluta y fosforila T\betaRI. Después el T\betaRI activado propaga la señal a las dianas aguas abajo (Chen y Weinberg, 1995; Wrana et al., 1994).
Hasta ahora, se han clonado y caracterizado mediante análisis de secuencia tres tipos distintos de TGF-\beta denominados TGF-\beta1, TGF-\beta2 y TGF-\beta3 que están estrechamente relacionados de manera funcional y comparten un alto grado de reactividad cruzada de receptores. Todos los TGF-\beta se sintetizan como precursores de 390 aminoácidos a 412 aminoácidos que experimentan rotura proteolítica para producir las formas monoméricas, que consisten en los 112 aminoácidos C terminales. En sus formas maduras, biológicamente activas, los TGF-\beta son homodimeros unidos por disulfuro estables en medio ácido y al calor de dos cadenas polipeptídicas de 112 aminoácidos cada una. Las secuencias de aminoácidos completas de TGF-\beta1 humano (Derynck et al., 1985), murino (Derynck et al., 1986) y de simio (Sharples et al., 1987) muestran una notable conservación de secuencia, que sólo se diferencia en un único residuo de aminoácido. La comparación de la secuencia de aminoácidos de TGF-\beta1 humano, TGF-\beta2 humano (de Martin et al., 1987; Marquardt et al., 1987) y TGF-\beta3 humano (Ten Dijke et al. 1988) ha demostrado que las tres proteínas muestran en sus formas maduras una identidad de secuencia de aproximadamente el 70-80%. Se ha aislado un TGF-\beta1.2 heterodimérico a partir de plaquetas porcinas y consiste en una subunidad de TGF-\beta1 unida mediante disulfuro a una subunidad de TGF-\beta2 (Cheifetz et al., 1987).
La búsqueda de la molécula o moléculas responsable(s) de la formación de hueso, cartílago, tendón y otros tejidos presentes en el hueso y otros extractos tisulares ha conducido al descubrimiento de un conjunto novedoso de moléculas denominadas las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), que también son miembros de la familia de genes del TGF-\beta. Previamente se han esclarecido las estructuras de varias proteínas, denominadas de BMP-1 a BMP-15. Las actividades inductivas únicas de estas proteínas, junto con su presencia en el hueso, el cartílago y/u otros tejidos vitales, sugiere que son reguladores importantes del hueso y otros procedimientos de reparación de tejidos, y pueden estar implicadas en la formación, mantenimiento y reparación de tejidos. Hay una necesidad de identificar procedimientos mejorados y composiciones para la formación, mantenimiento y reparación de tales tejidos.
Se ha mostrado que miembros de la familia de proteínas morfogenéticas óseas son útiles para la inducción de formación ósea y de cartílago. Por ejemplo, se ha mostrado que BMP-2 puede inducir la formación de nuevo tejido de cartílago y/u óseo in vivo en un modelo de implante ectópico de rata, véase la patente estadounidense número 5.013.649; en defectos de mandíbulas en perros (Toriumi et al., 1991); en defectos de segmentos femorales en ovejas (Gerhart et al., 1991). También se ha mostrado que otros miembros de la familia de BMP tienen actividad osteogénica, incluyendo BMP-4, 6 y 7 (Wozney, 1993). También se ha mostrado que las proteínas BMP demuestran actividad de estimulación inductiva y/o de diferenciación sobre una variedad de otros tejidos, incluyendo cartílago, tendón, ligamento, tejido neuronal.
Otros factores que son útiles de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes: BMP-3 (Vukicevic et al., 1989); factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF); glucocorticoides, tales como dexametasona (Cheng et al., 1994); y prostaglandinas, tales como prostaglandina E1 (Chen et al., 1991). Además, el ácido ascórbico y sus análogos, tales como 2-fosfato de ácido ascórbico (Tennenbaum et al., 1982) y fosfatos de glicerol, tales como \beta-glicerofosfato (Bruder et al., 1991) son factores adyuvantes eficaces para la diferenciación avanzada, aunque solos no inducen diferenciación osteogénica. Otros factores incluyen inhibina A (Chen et al., 1993), factor de actividad estimulante condrogénica (CSA) (Syftestad et al., 1985), moléculas de matriz extracelular colagenasas, incluyendo colágeno de tipo I, particularmente como gel (Kimura et al., 1984), y análogos de vitamina A, tales como ácido retinoico (Langille et al., 1989).
También son de interés en la presente invención los factores de crecimiento similares a insulina. IGF-I e IGF-II tienen cada uno un peso molecular de aproximadamente 7.500 Dalton. Cada uno de IGF-I y IGF-II tiene dominios A y B que son sumamente homólogos con los dominios correspondientes de la proinsulina. Los dominios A y B están conectados entre sí mediante un dominio C. Hay una extensión carboxi terminal, el domino D, presente en IGF, pero no se encuentra en la proinsulina. Ambos IGF-I y IGF-II son polipéptidos de cadena sencilla cada uno con 3 puentes disulfuro y tienen una identidad de secuencia del 49% y del 47%, respectivamente, con respecto a la cadena A y la cadena B de insulina humana. Al igual que la insulina, los IGF estimulan la fosforilación de residuos de tirosina específicos dentro del dominio citoplasmático de los receptores a los que se unen, tal como se describe en el documento WO 93/98826. La denominación "factor de crecimiento similar a la insulina" se eligió para expresar los efectos similares a la insulina y la estructura similar a la insulina de estos polipéptidos que actúan como mitógenos sobre varias células, tal como se describe en el documento EP 128 733. IGF-I es un péptido de 70 aminoácidos, mientras que IGF-II es un péptido de 67 aminoácidos, tal como se describe en Rinderknecht (1978a) y (1978b). IGF-I y IGF-II tienen una homología estructural del 62% entre sí. Ambos se han aislado de suero humano.
Los factores de crecimiento similares a insulina también se conocen con el nombre de clase somatomedinas, y se han identificado en diversas especies animales como polipéptidos que actúan para estimular el crecimiento de células en una variedad de tipos de tejidos y células, particularmente durante el desarrollo. Los efectos promoción del crecimiento de las somatomedinas incluyen potenciación de la multiplicación celular y estimulación de la proliferación de cartílago, estimulación del transporte de aminoácidos, estimulación de la síntesis de ARN, ADN y proteína, y estimulación de la incorporación de sulfato en proteoglucano y de prolina en colágeno. Gran parte del crecimiento postnatal en mamíferos se debe a la estimulación del crecimiento de cartílago por las somatomedinas y el crecimiento en el útero también puede depender de somatomedinas.
Aún otro factor de crecimiento importante que puede utilizarse según la presente invención es factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF). Esta proteína es un mitógeno específico de células endoteliales que se ha mostrado que se estimula por la hipoxia y se requiere para la angiogénesis tumoral. Sanger et al. (1986); Kim et al. (1993); Schweiki et al. (1992); Plate et al. (1992). Es una glicoporteína de 34-43 kDa (siendo la especie predominante de aproximadamente 45 kDa) dimérica, unida por disulfuro sintetizada y secretada por una variedad de células tumorales y normales. VEGF parece desempeñar un papel principal en muchos estados patológicos y procesos relacionados con la neovascularización
V. Medios libres de suero
La presente invención recurre al uso de medios libres de suero para el crecimiento y diferenciación de las células osteogénicas para dar esferoides de células óseas. La siguiente sección describe atributos y condiciones para usar medios libres de suero.
El uso de cultivo libre de suero para la fabricación de productos biofarmacéuticos recombinantes a partir de células de mamíferos se ha revisado extensamente (Barnes, 1987; Barnes y Sam, 1980; Broad et al., 1991; Jayme, 1991). La lista de los principales aditivos que se usan como complementos para los medios libres de suero se resume por Barnes (1987) y Barnes y Sam (1980). La mayor parte de los medios libres de suero comercialmente disponibles contienen una proteína vehículo tal como albúmina. La presencia de proteína vehículo puede requerirse para la protección de la viabilidad celular.
Un ejemplo de medio de cultivo libre de suero puede encontrarse en la patente estadounidense 5.063.157. Los medios descritos son para células de mamífero no adherentes y comprenden, además del medio de base, transferrina, insulina, una peptona, un derivado de beta-D-xilopiranosa, selenita y una poliamina biológica. Otro medio de crecimiento celular libre de suero para células de mamíferos se da a conocer en la patente estadounidense 4.443.546. Este medio de crecimiento, además del medio básico, contiene siete ingredientes. La memoria descriptiva de patente europea número 481.791 da a conocer un medio de cultivo para células CHO que comprende agua, un regulador de la osmolalidad, un tampón, una fuente de energía, aminoácidos, una fuente de hierro, un factor de crecimiento y otros componentes opcionales. Los dos medios mostrados a modo de ejemplo contienen 19 y 17 componentes, respectivamente.
Los ejemplos de posibles aditivos a medios libres de suero incluyen los siguientes:
A. Albúmina
La albúmina se suministra preferiblemente en forma de albúmina sérica bovina (BSA) o humana (HSA) en una cantidad eficaz para el crecimiento de células. La albúmina proporciona una fuente de proteína en los medios. Se piensa que la albúmina actúa como vehículo para oligoelementos y ácidos grasos esenciales. Preferiblemente, la albúmina usada en las presentes formulaciones está libre de pirógenos y virus, y cuando es necesario está aprobada por agencias reguladoras para su infusión a pacientes humanos. La HSA puede desionizarse usando perlas de resina antes de su uso. La concentración de albúmina sérica humana es de 1-8 mg/ml, preferiblemente de 3-5 mg/ml, lo más preferiblemente de 4 mg/ml.
B. Complejo de vehículo soluble/ácido graso
La albúmina mencionada anteriormente puede sustituirse por un complejo de vehículo soluble/ácido graso esencial y un complejo de colesterol y vehículo soluble que puede administrar eficazmente el ácido graso y colesterol a las células. Un ejemplo de un complejo de este tipo es un complejo de ciclodextrina/ácido linoleico, colesterol y ácido oleico. Esto es ventajoso ya que permitirá la sustitución de la albúmina mal caracterizada por una molécula bien definida. El uso de ciclodextrina elimina la necesidad de añadir albúmina sérica humana/animal, eliminando así cualquier traza de materiales no deseados que introducirá la albúmina en los medios. El uso de ciclodextrina simplifica la adición de nutrientes lipófilos específicos a un cultivo libre de suero.
Las sustancias lipófilas que pueden complejarse con ciclodextrina incluyen ácidos grasos insaturados tales como ácido linoleico, colesterol y ácido oleico. El ácido linoleico, colesterol y ácido oleico están presentes en cantidades eficaces y pueden estar presentes en iguales proporciones tales que la cantidad total es de 0,001 \mug/ml a 100 \mug/ml, preferiblemente de 0,1 \mug/ml a 10 \mug/ml. La preparación de tales complejos se conoce en la técnica y se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 4.533.637.
C. Fuente de hierro
Puede añadirse a los medios una fuente de hierro en una cantidad eficaz y en una forma que puede utilizarse por las células. El hierro puede suministrarse saturando la transferrina, su molécula vehículo, en una cantidad eficaz. La transferrina puede derivarse de varios sueros animales o sintetizarse de manera recombinante. Se entiende que cuando la transferrina se deriva de una fuente animal, se purifica para eliminar otras proteínas animales, y por tanto es habitualmente pura en al menos el 99%. La concentración de transferrina es habitualmente entre 80 \mug/ml y 500 \mug/ml, preferiblemente entre 120 \mug/ml y 500 \mug/ml, más preferiblemente entre 130 \mug/ml y 500 \mug/ml, incluso más preferiblemente entre \mug/ml 275 y 400 \mug/ml y lo más preferiblemente 300 \mug/ml. Se usa una sal de hierro, preferiblemente una sal de hierro soluble en agua, tal como cloruro de hierro (por ejemplo, FeCl_{3}\cdot6H_{2}O) disuelta en una disolución acuosa tal como una disolución de ácido orgánico (por ejemplo, ácido cítrico) para suministrar el hierro a la transferrina. Habitualmente se usa un mol de cloruro de hierro por cada molécula de ácido cítrico. La concentración de cloruro de hierro es de 0,0008 \mug/ml 8 \mug/ml, preferiblemente de 0,08 \mug/ml a 0,8 \mug/ml, lo más preferiblemente 0,08 \mug/ml.
D. Factor de crecimiento de insulina
También puede añadirse insulina a los medios de la presente invención en una cantidad eficaz. La concentración de insulina es entre 0,25 U/ml y 2,5 U/ml, más preferiblemente 0,4-2,1 U/ml, lo más preferiblemente 0,48 U/ml. En la conversión de unidades a masa, 27 U = 1 mg. Por tanto, incorporando la conversión, la concentración de insulina es aproximadamente entre 9,26 \mug/ml y 92,6 \mug/ml, más preferiblemente 14,8 \mug/ml-77,8 \mug/ml, lo más preferiblemente 17,7 \mug/ml. De nuevo se entiende que la insulina humana es más preferible que la insulina animal. Lo más preferido es la insulina recombinante sumamente purificada. Puede usarse un factor de crecimiento similar a la insulina tal como factor de crecimiento similar a la insulina 1 y factor de crecimiento similar a la insulina 2 en lugar de, o además de, la insulina en una cantidad que proporciona sustancialmente el mismo resultado que una cantidad correspondiente de insulina. Por tanto, la expresión "factor de crecimiento de insulina" incluye ambos insulina y factores de crecimiento similares a la insulina.
E. Componentes adicionales
La adición de otros lípidos a los reactivos esenciales anteriores puede potenciar el potencial proliferativo de las células precursoras. Sin embargo, preferiblemente no se añaden estos componentes a menos que sean necesarios para un experimento particular o para hacer crecer un tipo particular de célula. Opcionalmente, pueden incluirse triglicéridos y/o fosfolípidos como fuentes adicionales de lípidos. Una fuente preferible de lípidos contiene una mezcla de triglicéridos neutros de ácidos grasos predominantemente insaturados tales como ácido linoleico, oleico, palmítico, linolénico y esteárico. Una preparación de este tipo también puede contener fosfatidiletanolamina y fosfatidilcolina. Otra fuente de lípidos es una fracción de plasma humano precipitado en etanol y que se vuelve preferiblemente libre de virus mediante pasteurización.
Otros ingredientes que pueden añadirse opcionalmente a los medios se mencionan en las siguientes referencias: documento WO 95/06112, patente estadounidense 4.533.637, patente estadounidense 5.405.772.
F. Componentes no deseados
Cuando deben usarse los medios para hacer crecer células para su introducción en un paciente humano, preferiblemente los medios no contienen ingredientes tales como albúmina sérica bovina, suero de mamíferos y/o cualquier proteína natural de origen humano o de mamíferos (tal como se explicó anteriormente). Es preferible que se usen proteínas recombinantes o sintéticas, si están disponibles y de alta calidad. Lo más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos de las proteínas recombinantes o sintéticas son idénticas o sumamente homólogas a las humanas. Por tanto, las formulaciones de medios libres de suero más preferibles en el presente documento no contienen proteínas derivadas de animales y no tienen presencia ni siquiera indetectable de proteína animal.
En el sistema más ideal, preferiblemente no se añaden al medio componentes adicionales que no son necesarios. Tales componentes opcionales se describen en la técnica anterior citada anteriormente y pueden seleccionarse del grupo constituido por extracto de carne, peptona, fosfatidilcolina, etanolamina, antioxidantes, desoxiribonucleósidos, ribonucleósidos, lecitina de semilla de soja, corticosteroides, mioinositol, monotioglicerol y albúmina sérica bovina o de otro animal.
VI. Enfermedades y afecciones que requieren reparación ósea
Lo siguiente es un breve análisis de cuatro afecciones humanas para mostrar a modo de ejemplo la variedad de enfermedades y trastornos que se beneficiarán del desarrollo de nueva tecnología para mejorar procedimiento de reparación y consolidación ósea. Además de lo siguiente, varias otras afecciones, tales como, por ejemplo, deficiencia de vitamina D.
El primer ejemplo es el individuo, por lo demás sano, que padece una fractura. A menudo, la fractura de hueso clínica se trata escayolando para aliviar el dolor y permitir que mecanismos de reparación naturales reparen la herida. Ha habido progresos en el tratamiento de fracturas en los últimos tiempos, sin embargo, incluso sin considerar las diversas complicaciones que pueden surgir tratando huesos fracturados, cualquier nuevo procedimiento para aumentar la consolidación ósea en circunstancias normales representará un gran avance.
Un segundo ejemplo que puede beneficiarse de nuevos procedimientos de tratamiento es la osteogénesis imperfecta (OI). La OI abarca diversas enfermedades del tejido conjuntivo heredadas que implican fragilidad de tejido óseo y conjuntivo blando en seres humanos (Byers y Steiner, 1992; Prockop, 1990). Aproximadamente un niño de cada 5.000-14.000 nacidos está afectado por OI y la enfermedad está asociada con una morbididad significativa a lo largo de la vida. También se produce un cierto número de muertes, que resultan de la elevada propensión a la fractura de hueso y la deformación de hueso anómalo tras la reparación de la fractura (OI tipos II-IV; Bonadio y Goldstein, 1993). El problema relevante aquí es la calidad de vida; claramente, las vidas de individuos afectados se verían mejoradas por el desarrollo de nuevas terapias para estimular y reforzar el procedimiento de reparación de fractura.
La OI tipo I es un trastorno leve caracterizado por fractura de hueso sin deformidad, escleróticas azules, estatura normal o casi normal y herencia dominante autosómica (Bonadio y Goldstein, 1993). La osteopenia está asociada con un aumento de la tasa de fractura de un único hueso al andar (la frecuencia de fracturas se reduce drásticamente en la pubertad y durante la vida del adulto joven, pero vuelve a aumentar en la edad media tardía). La pérdida de audición, que a menudo comienza en la segunda o tercera década, es una característica de esta enfermedad en aproximadamente la mitad de las familias y puede avanzar a pesar de la disminución general en la frecuencia de fracturas. Se observa dentinogénesis imperfecta en un subconjunto de individuos.
En cambio, la OI tipos II-VI representa un espectro de trastornos más graves asociados con una vida acortada. La OI tipo II, la forma letal perinatal, se caracteriza por una estatura corta, una calvaria blanda, escleróticas azules, piel frágil, tórax pequeño, extremidades inferiores de aspecto flácido (debido a la rotación externa y abducción de los fémures), tendones y ligamentos frágiles, fractura de hueso con deformidad grave, y muerte en el periodo perinatal debido a insuficiencia respiratoria. Los signos radiográficos de debilidad ósea incluyen compresión de los fémures, arqueamiento de las tibias, costillas anchas y en forma de rosario y adelgazamiento de la calvaria.
La OI tipo III se caracteriza por una estatura corta, una cara triangular, escoliosis grave y fractura de hueso con deformidad moderada. La escoliosis puede conducir a enfisema y una vida acortada debido a insuficiencia respiratoria. La OI tipo IV se caracteriza por escleróticas normales, fractura de hueso con deformidad de leve a moderada, defectos dentales y una historia natural que es esencialmente intermedia entre la OI tipo II y la OI tipo I.
Se han caracterizado más de 150 mutaciones de OI desde 1989 (revisado en Byers y Steiner, 1992; Prockop, 1990). La gran mayoría se producen en los genes COL1A1 y COL1A2 de colágeno tipo I. La mayor parte de los casos de OI tipo I parecen ser resultado de mutaciones heterocigóticas en el gen COL1A1 que reducen la producción de colágeno pero no alteran la estructura primaria, es decir, las mutaciones nulas heterocigóticas afectan a la expresión de COL1A1.
Un tercer ejemplo importante es la osteoporosis. El término osteoporosis se refiere a un grupo heterogéneo de trastornos caracterizado por una reducción de la masa ósea y fracturas. Se estima que 20-25 millones de personas tienen riesgo aumentado de fracturas debido a pérdida de masa ósea específica del sitio. Los factores de riesgo para la osteoporosis incluyen aumento de la edad, sexo (más en mujeres), poca masa ósea, menopausia temprana, raza (blanca), poca ingesta de calcio, actividad física reducida, factores genéticos, factores del entorno (incluyendo fumar tabaco y consumo abusivo de alcohol o cafeína), y deficiencias en el control neuromuscular que crean una propensión a las caídas.
Más de un millón de fracturas en los EE.UU. cada año pueden atribuirse a la osteoporosis, y se estima que solo en 1986 el tratamiento de la osteoporosis costó 7-10 billones de dólares en atención sanitaria. Las tendencias demográficas (es decir, la edad gradualmente creciente de la población estadounidense) sugieren que estos costes pueden aumentar hasta 62 billones de dólares para el año 2020. Claramente, la osteoporosis es un problema significativo de atención sanitaria.
Clínicamente, la osteoporosis se divide en tipo I y tipo II. La osteoporosis tipo I se produce predominantemente en mujeres de mediana edad y está asociada con la pérdida de estrógenos en la menopausia, mientras que la osteoporosis tipo II está asociada con el envejecimiento. Gran parte de la morbimortalidad asociada con la osteoporosis resulta de la inmovilización de pacientes ancianos tras una fractura.
Las terapias actuales para pacientes con osteoporosis se centran en la prevención de fracturas, no en la reparación de fracturas. Esto sigue siendo una consideración importante debido a la bibliografía, que menciona claramente que la morbimortalidad significativa está asociada con un reposo en cama prolongado de personas ancianas, particularmente aquellas que han padecido fracturas de cadera. Las complicaciones del reposo en cama incluyen coágulos sanguíneos y neumonía. Estas complicaciones se reconocen y habitualmente se toman medidas para evitarlas, pero esto no es el mejor enfoque a la terapia, por tanto, la población de pacientes con osteoporosis se beneficiaría de nuevas terapias diseñadas para reforzar el hueso y acelerar el proceso de reparación de fracturas, haciendo así que estas personas se levanten antes de que surjan complicaciones.
Un cuarto ejemplo está relacionado con la reconstrucción ósea y, específicamente, la capacidad de reconstruir defectos en tejido óseo que resultan de lesión por traumatismo; como consecuencia de cáncer o cirugía para el cáncer; como resultado de un defecto de nacimiento; o como resultado del envejecimiento. Hay una necesidad significativa de implantes ortopédicos más frecuentes, y los huesos craneales y faciales son dianas particulares para este tipo de necesidad reconstructiva. La disponibilidad de nuevos materiales de implante, por ejemplo, titanio, ha permitido la reparación de defectos relativamente grandes. Los implantes de titanio proporcionan una estabilidad temporal excelente a través de defectos óseos. Sin embargo, la experiencia ha mostrado que una falta de hueso viable que se una con el puente puede dar como resultado la exposición del aparato, infección, inestabilidad estructural y, finalmente, fallo en la reparación del defecto.
Los injertos óseos autólogos son otra posibilidad, pero tienen varias desventajas demostradas ya que deben recogerse de un sitio de donante tal como la cresta ilíaca o la costilla, a menudo proporcionan hueso insuficiente para llenar completamente el defecto, y el hueso que se forma es a veces propenso a infecciones y resorción. Las preparaciones xenógenas parcialmente purificadas no son prácticas para su uso clínico porque se purifican cantidades de microgramos a partir de kilogramos de hueso bovino, haciendo la producción comercial a gran escala ambas costosa e impráctica. Por tanto, a menudo se emplean aloinjertos y preparaciones de hueso desmineralizado.
Las transferencias microquirúrgicas de injertos de hueso libre con vasos sanguíneos y tejido blando fijados pueden cerrar defectos óseos con una fuente inmediata de riego sanguíneo al injerto. Sin embargo, estas técnicas requieren tiempo, se ha mostrado que producen una gran cantidad de morbididad, y sólo pueden usarse por individuos especialmente entrenados. Además, la cantidad del implante de hueso está a menudo limitada y no se moldea fácilmente. En la mandíbula, por ejemplo, la mayoría de los pacientes no puede llevar aparatos dentales usando las técnicas actualmente aceptadas (incluso tras establecerse la continuidad), y por tanto obtienen poca mejora en la capacidad para masticar. Toriumi et al. han escrito que "los cirujanos reconstructivos deberían tener a su disposición un sustituto de hueso que fuese fiable, biocompatible, fácil de usar y de larga duración y que restaurase la continuidad mandibular con poca morbididad asociada".
En relación con la reconstrucción ósea, las áreas de problema específicas para la mejora son las relacionadas con el tratamiento de defectos grandes, tales como los creados por traumatismo, defectos de nacimiento o particularmente, tras la resección de tumores; y también el área de las articulaciones artificiales. Puede concebirse la mejora del éxito de implantes ortopédicos, superficies de contacto y articulaciones artificiales si la superficie del implante, o una parte funcional de un implante, se reviste con un agente estimulante del hueso. Puede revestirse la superficie de implantes con uno o más materiales apropiados con el fin de promover una interacción más eficaz con el sitio biológico que rodea el implante y, de manera ideal, promover la reparación tisular.
VII. Polímeros para implantar esferoides de células óseas
A lo largo de la última década ha habido un tremendo aumento en las aplicaciones para materiales poliméricos. Estos materiales están bien adecuados para su implantación ya que sirven como estructura temporal para sustituirse por tejido huésped, degradarse mediante hidrólisis para dar productos no tóxicos y excretarse, tal como se describe por Kulkarni et al. (1971) y Hollinger y Battistone (1986).
Pueden usarse polímeros naturales o bien sintéticos para formar la matriz, aunque se prefieren polímeros sintéticos por su reproductibilidad y cinética de liberación controlada. Los polímeros sintéticos que pueden usarse incluyen polímeros bioerosionables tales como polilactida (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), y otros poli(alfa-hidroxiácidos), poli(caprolactona), policarbonatos, poliamidas, polianhídridos, poliaminoácidos, poliortoésteres, poliacetales, policianoacrilatos y poliuretanos degradables, y polímeros no erosionables tales como poliacrilatos, polímeros de etileno-acetato de vinilo y otros acetatos de celulosa sustituida con acilo y derivados de los mismos, poliuretanos no erosionables, poliestirenos, poli(cloruro de vinilo), poli(fluoruro de vinilo), polivinilimidazol, poliolefinas clorosulfonadas, poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico) y nailon. Aunque pueden usarse materiales no degradables para formar la matriz o una parte de la matriz, no se prefiere. Los ejemplos de polímeros naturales incluyen proteínas tales como albúmina, fibrina o fibrinógeno, colágeno, poliaminoácidos sintéticos, y prolaminas, y polisacáridos tales como alginato, heparina y otros polímeros de unidades de azúcar biodegradables que se producen de manera natural.
Cuatro polímeros ampliamente usados en aplicaciones médicas son poli(paradioxanona) (PDS), poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y copolímeros de PLAGA. La copolimerización permite la modulación del tiempo de degradación del material. Cambiando las proporciones de polímeros cristalino a amorfo durante la polimerización, pueden alterarse las propiedades del material resultante para ajustarse a las necesidades de la aplicación. Estos polímeros, incluyendo poli(lactida-co-ácido glicólico) (PLGA), se han usado como materiales compuestos poliméricos para la sustitución ósea tal como se notifica por Elgendy et al. (1993). Se ha mostrado que los polifosfacenos sustituidos soportan el crecimiento de células osteogénicas, tal como se notifica por Laurencin et al. (1993). Los poliorganofosfacenos son polímeros de alto peso molecular que contienen un esqueleto de átomos alternados de fósforo y nitrógeno. Hay una amplia variedad de polifosfacenos, cada uno derivado del mismo polímero precursor, polidiclorofosfaceno. Las especies sustituidas con cloro pueden modificarse mediante sustitución de los átomos de cloro por diferentes nucleófilos orgánicos tales como o-metilfenóxido junto con aminoácidos. Las propiedades físicas y químicas del polímero pueden alterarse añadiendo diversas proporciones de cadenas laterales sensibles hidrolíticas tales como glicinato de etilo, tal como se describe por Wade et al. (1978) y Allcock y Fuller (1981). Esto afectará a la degradación del polímero como un material implantable y biodegradable así como variará el soporte de células osteogénicas para implantes de hueso y tejido, tal como se muestra por Laruencin et al. (1993).
PLA, PGA y copolímeros de PLA/PGA son particularmente útiles para formar las matrices biodegradables. Los polímeros de PLA se preparan habitualmente a partir de los ésteres cíclicos de ácidos lácticos. Pueden usarse ambas formas L (+) y D (-) de ácido láctico para preparar los polímeros de PLA, así como la mezcla ópticamente inactiva DL-ácido láctico de ácidos lácticos D (-) y L (+). Los procedimientos de preparación de polilactidas están bien documentados en la bibliografía de patentes. Las siguientes patentes estadounidenses describen en detalle polilactidas adecuadas, sus propiedades y su preparación: patentes estadounidenses 1.995.970; 2.703.316; 2.758.987; 2.951.828; 2.676.945; 2.683.136; y 3.531.561. PGA es el homopolímero de ácido glicólico (ácido hidroxiacético). En la conversión de ácido glicólico en poli(ácido glicólico), se hace reaccionar inicialmente ácido glicólico consigo mismo para formar el éster cíclico glicolida, que en presencia de calor y un catalizador se convierte en un polímero de cadena lineal de alto peso molecular. Los polímeros de PGA y sus propiedades se describen en más detalle en "Cyanamid Research Develops World's First Synthetic Absorbable Suture", Chemistry and Industry, 905 (1970).
La erosión de la matriz está relacionada con los pesos moleculares de PLA, PGA o PLA/PGA. Los pesos moleculares superiores, pesos moleculares promedio en peso de 90.000 o superiores, dan como resultado matrices de polímero que conservan su integridad estructural durante periodos de tiempo superiores; mientras que los pesos moleculares inferiores, pesos moleculares promedio en peso de 30.000 o inferiores, dan como resultado ambos liberación más lenta y vidas de matriz más cortas. El poli(lactida-co-glicolida) (50:50), se degrada en aproximadamente seis semanas tras la implantación.
Todos los polímeros para su uso en la matriz deben cumplir los parámetros mecánicos y bioquímicos necesarios para proporcionar un soporte adecuado para las células con posterior crecimiento y proliferación. Los polímeros pueden caracterizarse con respecto a propiedades mecánicas tales como resistencia a la tracción usando un medidor Instron, para el peso molecular del polímero mediante cromatografía de permeación en gel (GPC), temperatura de transición vítrea mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) y estructura unida mediante espectroscopía de infrarrojos (IR), con respecto a la toxicología mediante pruebas de selección iniciales que implican ensayos de Ames y ensayos de teratogenicidad in vitro, y estudios de implantación en animales para estudios de inmunogenicidad, inflamación, liberación y degradación.
Estos polímeros son particularmente útiles en la formación de matrices de tipo fibroso o de esponja para su implantación. También pueden usarse polímeros para formar hidrogeles en los que las células se suspenden y después se implantan.
A. Otros materiales de matriz
Otra clase de materiales para preparar la matriz es hidroxiapatita, o una cerámica similar formada por fosfato de tricalcio (TCP) o fosfato de calcio (CaPO_{4}). Las hidroxiapatitas de calcio se producen de manera natural como depósitos geológicos y en tejidos biológicos normales, principalmente hueso, cartílago, esmalte, dentina y cemento de vertebrados y en muchos sitios de calcificaciones patológicas tales como vasos sanguíneos y piel. Se forma hidroxiapatita de calcio sintética en el laboratorio como pura Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2} o bien hidroxiapatita que es impura, que contiene otros iones tales como carbonato, fluoruro, cloruro por ejemplo, o cristales deficientes en calcio o cristales en los que el calcio está parcial o completamente sustituido por otros iones tales como bario, estroncio y plomo. Esencialmente, ninguna de las apatitas geológicas y biológicas son hidroxiapatita "pura" ya que contienen una variedad de otros iones y cationes y pueden tener proporciones de calcio a fósforo diferentes de las apatitas sintéticas
puras.
En general, los cristales de apatitas sintéticas puras, apatitas geológicas y muchas apatitas impuras producidas sintéticamente son mayores y más cristalinos que los cristales biológicos de hueso, dentina, cemento y cartílago. Los cristales de hueso, dentina y cemento son muy pequeños, de forma irregular, placas muy finas cuyas dimensiones promedio aproximadas son de aproximadamente 10 angstroms a 50 angstroms de espesor, de 30 angstroms a 150 angstroms de ancho, y de 200 angstroms a 600 angstroms de longitud. Los materiales sintéticos son sumamente diversos, tal como se notifica en la bibliografía. Por ejemplo, se notificó la caracterización de cuatro apatitas comerciales por Pinholt et al. (1992); Marden et al. (1990) notifica sobre una proteína, material biodegradable; Pinholt et al. (1991) notifica sobre el uso de un material óseo bovino denominado Bio-Oss^{TM}; Friedman et al. (1991) y Costantino et al. (1991) notifican sobre un cemento de hidroxiapatita; Roesgen (1990) notifica sobre el uso de cerámicas de fosfato de calcio en combinación con hueso autogénico; Ono et al. (1990) notifica sobre el uso de gránulos cerámicos de vidrio que contienen apatita-wolastonita, gránulos de hidroxiapatita, y gránulos de alúmina; Passuti et al. (1989) notifica sobre el rendimiento de cerámica de fosfato de calcio macroporosa; Harada (1989) notifica sobre el uso de una mezcla de partículas de hidroxiapatita y polvo de fosfato de tricalcio para la implantación de hueso; Ohgushi et al. (1989) notifica sobre el uso de cerámicas de fosfato de calcio porosas solas y en combinación con células de médula ósea; Pochon et al. (1986) notifica sobre el uso de fosfato de beta-tricalcio para su implantación; y Glowacki et al. (1985), notifica sobre el uso de implantes de hueso desmineralizado.
Tal como se usa en el presente documento, todos estos materiales se denominan generalmente "hidroxiapatita". En la forma preferida, la hidroxiapatita son partículas que tienen un diámetro entre aproximadamente diez micrómetros y 100 micrómetros de diámetro, lo más preferiblemente aproximadamente 50 micrómetros de diámetro.
Pueden usarse cerámicas de fosfato de calcio como implantes en la reparación de defectos óseos dado que estos materiales no son tóxicos, no son inmunogénicos y están compuestos por iones de calcio y fosfato, los principales constituyentes del hueso (Frame, 1987; Parsons et al., 1988). Se ha usado ampliamente ambos fosfato de tricalcio (TCP) Ca_{3}(PO_{4})_{2} y hidroxiapatita (HA) Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH_{2}). Los implantes de fosfato de calcio son osteoinductivos, y tienen la capacidad aparente de unirse directamente al hueso. Como resultado, se crea una fuerte superficie de contacto hueso-implante.
Las cerámicas de fosfato de calcio tienen un grado de capacidad de biorreabsorción que está gobernado por su estructura química y de material. Los implantes de HA y TCP de alta densidad muestran poca reabsorción, mientras que los porosos se rompen más fácilmente mediante disolución en fluidos corporales y se reabsorben mediante fagocitosis. Sin embargo, el TCP se degrada más rápidamente que las estructuras de HA de la misma porosidad in vitro. El HA es relativamente insoluble en entornos acuosos. Sin embargo, las propiedades mecánicas de cerámicas de fosfato de calcio hacen que estén mal adaptadas para funcionar como elemento estructural en circunstancias de soporte de carga. No se prefieren las cerámicas ya que son quebradizas y tienen mala resistencia a la carga de impacto.
B. Polímeros para formar hidrogeles
También pueden usarse polímeros que pueden formar hidrogeles iónicos que son maleables para soportar las células. Puede realizarse la inyección de una suspensión de células en una disolución de polímero para mejorar la reproductibilidad de la siembra de células a lo largo de un dispositivo, para proteger las células frente a fuerzas de cizalladura o necrosis inducida por presión, o para ayudar a definir la ubicación espacial de la administración celular. El polímero inyectable también puede utilizarse para administrar células y promover la formación de nuevo tejido sin el uso de ninguna otra matriz. En una realización preferida, el hidrogel se produce mediante reticulación de la sal iónica de un polímero con iones, cuya concentración aumenta con las concentraciones crecientes de iones o bien de polímero. Se mezcla la disolución de polímero con las células que van a implantarse para formar una suspensión, que después se inyecta directamente a un paciente antes de la polimerización de la suspensión. Posteriormente la suspensión polimeriza a lo largo de un corto periodo de tiempo debido a la presencia in vivo de concentraciones fisiológicas de iones tales como calcio en el caso en el que el polímero es un polisacárido tal como alginato.
Un hidrogel se define como una sustancia formada cuando un polímero orgánico (natural o sintético) se reticula mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura de red abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato, polifosfacenos y poliacrilatos tales como metacrilato de hidroxietilo (HEMA), que se reticulan de manera iónica, o copolímeros de bloque tales como Pluronics^{TM} o Tetronics^{TM}, copolímeros de bloque de poli(óxido de etileno)-polipropilenglicol que se reticulan mediante temperatura o pH, respectivamente. Otros materiales incluyen proteínas tales como fibrinógeno, colágeno, polímeros tales como polivinilpirrolidona, ácido hialurónico y colágeno.
En general, estos polímeros son al menos parcialmente solubles en disoluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas o disoluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos. Los ejemplos de polímeros con grupos laterales ácidos que pueden hacerse reaccionar con cationes son polifosfacenos, poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo) y polímeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. También pueden usarse copolímeros que tienen grupos laterales ácidos formados mediante reacción de monómeros o polímeros de vinil éter y ácido acrílico o metacrílico. Los ejemplos de grupos ácidos son grupos de ácido carboxílico, grupos de ácido sulfónico, grupos de alcohol halogenado (preferiblemente fluorado), grupos de OH fenólico y grupos de OH ácido. Los ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que pueden hacerse reaccionar con aniones son polivinilaminas, polivinilpiridina, polivinilimidazol y algunos polifosfacenos sustituidos con imino. La sal de amonio o cuaternaria de los polímeros también puede formarse a partir de los nitrógenos del esqueleto o grupos imino colgantes. Los ejemplos de grupos laterales básicos son grupos amino e imino.
Puede reticularse iónicamente el alginato con cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, para formar una matriz de hidrogel. Debido a estas condiciones leves, el alginato ha sido el polímero más comúnmente usado para la encapsulación de células de hibridoma, tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 4.352.883. En la misma se describe una disolución acuosa que contiene los materiales biológicos que van a encapsularse que se suspende en una disolución de un polímero soluble en agua, se conforma la suspensión para dar gotitas que se configuran en microcápsulas diferenciadas mediante contacto con cationes multivalentes, después se reticulan las microcápsulas con poliaminoácidos para formar una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.
Los polifosfacenos adecuados para la reticulación tienen una mayor parte de grupos de cadena laterales que son ácidos y que pueden formar puentes de sal con cationes di o trivalentes. Los ejemplos de grupos laterales ácidos preferidos son grupos de ácido carboxílico y grupos de ácido sulfónico. Se forman polifosfacenos hidrólicamente estables a partir de monómeros que tienen grupos laterales de ácido carboxílico que se reticulan mediante cationes divalentes o trivalentes tales como Ca^{2+} o Al^{3+}. Pueden sintetizarse polímeros que se degradan mediante hidrólisis incorporando monómeros que tienen grupos laterales de imidazol, éster de aminoácido o glicerol. Los polifosfacenos bioerosionables tienen al menos dos tipos diferentes de cadenas laterales, grupos laterales ácidos que pueden formar puentes de sal con cationes multivalentes, y grupos laterales que hidrolizan en condiciones in vivo, por ejemplo, grupos imidazol, ésteres de aminoácido, glicerol y glucosilo.
El polímero soluble en agua con grupos laterales cargados se reticula haciendo reaccionar el polímero con una disolución acuosa que contiene iones multivalentes de carga opuesta, o bien cationes multivalentes si el polímero tiene grupos laterales ácidos o bien aniones multivalentes si el polímero tiene grupos laterales básicos. Los cationes preferidos para la reticulación de los polímeros con grupos laterales ácidos para formar un hidrogel son cationes divalentes y trivalentes tales como cobre, calcio, aluminio, magnesio, estroncio, bario y estaño, aunque también pueden usarse cationes orgánicos di, tri o tetrafuncionales tales como sales de alquilamonio. Se añaden disoluciones acuosas de las sales de estos cationes a los polímeros para formar membranas e hidrogeles blandos, sumamente hinchados. Cuanto mayor es la concentración de catión, o cuanto mayor es la valencia, mayor es el grado de reticulación del polímero. Se ha demostrado que concentraciones desde tan sólo 0,005 M reticulan el polímero. Las concentraciones superiores están limitadas por la solubilidad de la sal. Los aniones preferidos para la reticulación de los polímeros para formar un hidrogel son aniones divalentes y trivalentes tales como ácidos dicarboxílicos de bajo peso molecular, por ejemplo, ácido tereftálico, iones sulfato e iones carbonato. Se añaden disoluciones acuosas de las sales de estos aniones a los polímeros para formar membranas e hidrogeles blandos, sumamente hinchados, tal como se describió con respecto a cationes.
Puede usarse una variedad de policationes para complejar y de ese modo estabilizar el hidrogel de polímero para dar una membrana de superficie semipermeable. Los ejemplos de materiales que pueden usarse incluyen polímeros que tienen grupos reactivos básicos tales como grupos amina o imina, que tienen un peso molecular preferido entre 3.000 y 100.000, tales como polietilenimina y polilisina. Éstos están comercialmente disponibles. Un policatión es poli(L-lisina), los ejemplos de poliaminas sintéticas son: polietilenimina, polivinilamina, y polialilamina. También hay policationes naturales tales como polisacárido, quitosano. Los polianiones que pueden usarse para formar una membrana semipermeable mediante reacción con grupos superficiales básicos sobre el hidrogel de polímero incluyen polímeros y copolímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico y otros derivados de ácido acrílico, polímeros con grupos SO_{3}H tales como poliestireno sulfonado y poliestireno con grupos de ácido carboxílico.
VIII. Vectores de ADN
Los vectores de ADN forman aspectos adicionales importantes de la presente invención. El uso de estos vectores para expresar ARN y/o proteínas para potenciar la formación de esferoides de células óseas ex vivo se contempla específicamente por la presente invención. Las proteínas preferidas para su expresión incluyen miembros de la superfamilia de genes del TGF-\beta, incluyendo TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta1.2, BMP-2, BMP-4 y BMP-7, otros factores de crecimiento tales como PTH, moléculas de matriz extracelular o moléculas de citoadhesión. La expresión "constructo o vector de expresión" significa cualquier tipo de constructo genético que contiene un ácido nucleico que codifica un producto génico en el que parte o toda la secuencia codificante de ácido nucleico puede transcribirse en ARNm. El transcrito puede traducirse en una proteína, pero no es necesario. Por tanto, en ciertas realizaciones, la expresión incluye ambas transcripción de un gen y traducción de su ARN en un producto génico (proteína). En otras realizaciones, la expresión sólo incluye la transcripción del ácido nucleico, por ejemplo, para generar constructos antisentido.
Se contempla que los vectores particularmente útiles son aquellos vectores en los que la parte codificante del segmento de ADN, tanto si codifica una proteína de longitud completa como un péptido menor, está colocado bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen. Las frases "operativamente colocado", "bajo control" o "bajo control transcripcional" significan que el promotor está en la ubicación y orientación correctas con respecto al ácido nucleico para controlar el inicio de la ARN polimerasa y la expresión del gen.
El promotor puede estar en forma del promotor que está asociado de manera natural con un gen que codifica una proteína que potencia un esferoide de células óseas, tal como puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes en 5' situadas en sentido 5' del segmento codificante o exón, por ejemplo, usando tecnología de clonación recombinante y/o PCR, en conexión con las composiciones dadas a conocer en el presente documento.
Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirige de manera eficaz la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, organismo o incluso animal, elegido para la expresión. El uso de combinaciones de promotor y tipo de célula para la expresión de proteínas se conoce generalmente por los expertos en la técnica de la biología molecular, por ejemplo, véase Sambrook et al. (1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden usarse en las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de péptidos o proteínas recombinantes.
Son de uso particular los promotores y potenciadores que dirigen la transcripción de genes que son específicos para, o se expresan sumamente en, tejido óseo, osteoblastos y células precursoras de hueso. Por ejemplo, el promotor y elementos potenciadores de colágeno tipo I, fosfatasa alcalina, otras proteínas de matriz ósea tales como osteopontina, osteonectina y osteocalcina, así como c-Fos, que se expresan en grades cantidades en tejidos óseos y cartilaginosos en el proceso de generación, serán todos útiles para la expresión de constructos de la presente invención que potencian esferoides de células óseas.
En varias otras realizaciones, pueden usarse el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous para obtener expresión de alto nivel de ácidos nucleicos. También se contempla el uso de otros promotores de fagos bacterianos o células de mamífero o virus que se conocen bien en la técnica para lograr la expresión, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado.
Originalmente se detectaron potenciadores como elementos genéticos que aumentan la transcripción de un promotor situado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Esta capacidad para actuar a lo largo de una gran distancia tenía pocos precedentes en estudios clásicos de la regulación transcripcional procariota. El trabajo posterior mostró que las regiones de ADN con actividad potenciadora se organizan de manera muy parecida a los promotores. Es decir, están compuestas por muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas tanscripcionales.
Adicionalmente, puede usarse cualquier combinación de promotor/potenciador (según la "Eukaryotic Promotor Data Base" ("base de datos de promotores eucariotas" EPDB) para conducir la expresión. El uso de un sistema de expresión citoplasmático de T3, T7 o SP6 es otra realización posible. Las células eucariotas pueden apoyar la transcripción citoplasmática de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, como parte del complejo de administración o bien como un constructo de expresión genética adicional.
Las secuencias ambas ADNc y genómicas son adecuadas para la expresión eucariota, ya que la célula huésped procesará generalmente los transcritos genómicos para dar ARNm funcional para su traducción en una proteína. Hablando de manera general, puede ser más conveniente emplear como gen recombinante una versión de ADNc del gen. Se cree que el uso de una versión de ADNc proporcionará ventajas porque el tamaño del gen será generalmente mucho menor y se empleará más fácilmente para transfectar la célula diana que un gen genómico, que normalmente será de hasta un orden de magnitud o más superior al gen de ADNc. Sin embargo, se contempla que puede emplearse cuando se desee una versión genómica de un gen particular.
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Se pretende que la expresión "ácido nucleico antisentido" se refiera a oligonucleótidos complementarios a las secuencias de bases de ADN y ARN. Los oligonucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula diana, se unen específicamente a su ácido nucleico diana e interfieren con la transcripción, procesamiento del ARN, transporte y/o traducción. El dirigirse a ADN de cadena doble (cd) con oligonucleótido conduce a la formación de una triple hélice; el dirigirse a ARN conducirá a la formación de una doble hélice.
Pueden diseñarse constructos antisentido para unirse al promotor y otras regiones de control, exones, intrones o incluso límites exón-intrón de un gen. Pueden emplearse constructos de ARN antisentido, o ADN que codifica tales ARN antisentido, para inhibir la transcripción o la traducción génica o ambas dentro de una célula huésped, in vitro o bien in vivo, tal como dentro de un animal huésped, incluyendo un sujeto humano. Secuencias de ácido nucleico que comprenden "nucleótidos complementarios" son aquellas que pueden experimentar un apareamiento de bases según las reglas complementarias de Watson-Crick. Es decir, que las purinas largas experimentarán apareamiento de bases con pirimidinas menores para formar sólo combinaciones de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con timina (A:T), en el caso del ADN, o bien adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso del ARN.
Como alternativa a la administración antisentido dirigida, pueden usarse ribozimas dirigidas. El término "ribozima" se refiere a una enzima basada en ARN que puede dirigirse a y romper secuencias de bases particulares en ADN y ARN de oncogenes. Las ribozimas pueden dirigirse directamente a células, en forma de secuencias de ribozima que incorporan oligonucleótidos de ARN, o bien introducirse en la célula como un constructo de expresión que codifica el ARN ribozómico deseado. Pueden usarse ribozimas y aplicarse prácticamente de la misma manera a como se describe para los ácidos nucleicos antisentido.
Se propone que pueden coexpresarse proteínas, polipéptidos o péptidos con otras proteínas seleccionadas, en las que las proteínas pueden coexpresarse en la misma célula o puede proporcionarse un gen a la célula que ya tiene otra proteína seleccionada. La coexpresión puede lograrse cotransfectando la célula con dos vectores recombinantes distintos, llevando cada uno una copia de cada uno de los ADN respectivos. Como alternativa, puede construirse un único vector recombinante para incluir las regiones codificantes para ambas proteínas, que entonces pueden expresarse en células transfectadas con el vector único. En cualquier caso, el término "coexpresión" en el presente documento se refiere a la expresión tanto de un gen que potencia esferoides de células óseas como de la otra proteína seleccionada en la misma célula recombinante.
IX. Procedimientos de transferencia génica
Con el fin de mediar la realización de la expresión transgénica en una célula, será necesario transferir los vectores de expresión de la presente invención en una célula. Tal transferencia puede emplear procedimientos de transferencia génica virales o no virales. Esta sección proporciona un análisis de procedimientos y composiciones de transferencia génica.
A. Transferencia mediada por vectores virales
Pueden incorporarse los constructos que potencian esferoides óseos en una partícula infecciosa para mediar la transferencia génica a una célula. También pueden transferirse constructos de expresión adicionales tal como se describe en el presente documento mediante transducción viral usando partículas virales infecciosas, por ejemplo, mediante transformación con un vector de adenovirus de la presente invención tal como se describe a continuación en el presente documento. Como alternativa, pueden emplearse virus del papiloma bovino, lentiviral o retrovirales, todos los cuales permiten la transformación permanente de una célula huésped con un/unos gen(es) de interés. Por tanto, en un ejemplo, se usa la infección viral de células con el fin de administrar genes terapéuticamente significativos a una célula. Normalmente, se expondrá sencillamente el virus a la célula huésped apropiada en condiciones fisiológicas, permitiendo la captación del virus. Aunque se muestra el adenovirus a modo de ejemplo, los presentes procedimientos pueden emplearse ventajosamente con otros vectores virales, tal como se analiza a continuación.
Adenovirus. El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como un vector de transferencia génica debido a su genoma de ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, alto título, amplio intervalo de células diana y alta eficacia. El genoma viral de aproximadamente 36 kB está limitado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases (pb), en las que están contenidos elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y empaquetamiento de ADN viral. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma que contienen diferentes unidades de transcripción están divididas por el comienzo de la replicación de ADN viral.
La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y algunos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para la replicación de ADN viral. Estas proteínas están implicadas en la replicación del ADN, la expresión de genes tardíos e inhibición de la célula huésped (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos (L1, L2, L3, L4 y L5), incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápsida viral, sólo se expresan tras un procesamiento significativo de un único transcrito primario procedente del promotor tardío principal (MLP). El MLP (situado a 16,8 unidades de mapa) es particularmente eficaz durante la fase tardía de infección, y todos los ARNm procedentes de este promotor presentan una secuencia líder tripartita (TL) en 5' que los convierte en ARNm preferidos para su traducción.
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Con el fin de optimizar el adenovirus para la terapia génica, es necesario maximizar la capacidad de transporte de manera que puedan incluirse segmentos grandes de ADN. También es muy deseable reducir la toxicidad y reacción inmunológica asociadas con ciertos productos adenovirales. Los dos objetivos son, en cierto grado, colindantes ya que la eliminación de genes adenovirales sirve para ambos fines. Mediante la práctica de la presente invención, pueden lograrse ambos objetivos mientras se conserva la capacidad de manipular los constructos terapéuticos con relativa facilidad.
El gran desplazamiento de ADN es posible debido a que los elementos en cis requeridos para la replicación de ADN viral están todos situados en las repeticiones terminales invertidas (ITR) (100-200 pb) en ambos extremos del genoma viral lineal. Los plásmidos que contienen ITR pueden replicarse en presencia de un adenovirus no defectuoso (Hay et al., 1984). Por tanto, la inclusión de estos elementos en un vector adenoviral debe permitir la replicación.
Además, la señal de empaquetamiento para la encapsidación viral está situada entre 194-385 pb (0,5-1,1 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma viral (Hearing et al., 1987). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de proteínas en ADN \lambda de bacteriófago en el que una secuencia específica cerca del extremo izquierdo, pero fuera de la secuencia de extremo cohesiva, media la unión a proteínas que se requieren para la inserción del ADN en la estructura de cabeza. Los vectores de sustitución E1 de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25 unidades de mapa) en el extremo izquierdo del genoma viral podrá dirigir el empaquetamiento en células 293 (Levrero et al., 1991).
Previamente se mostró que ciertas regiones del genoma adenoviral pueden incorporarse en el genoma de células de mamíferos y expresarse los genes codificados por el mismo. Estas líneas celulares pueden apoyar la replicación de un vector adenoviral que es deficiente en la función adenoviral codificada por la línea celular. También ha habido informes de complementación de vectores adenovirales deficientes en la replicación por vectores "cooperadores", por ejemplo, virus de tipo natural o mutantes defectuosos de manera condicional.
Los vectores adenovirales defectuosos en la replicación pueden complementarse, en trans, por virus cooperador. Sin embargo, esta observación sola no permite el aislamiento de los vectores deficientes en la replicación, ya que la presencia de virus cooperador, necesario para proporcionar funciones de replicación, contaminará cualquier preparación. Por tanto, se necesitó un elemento adicional que añadirá especificidad a la replicación y/o empaquetamiento del vector deficiente en la replicación. Ese elemento, según se proporciona en la presente invención, se deriva de la función de empaquetamiento del adenovirus.
Se ha mostrado que existe una señal de empaquetamiento para adenovirus en el extremo izquierdo del mapa de adenovirus convencional (Tibbetts, 1977). Los estudios posteriores mostraron que un mutante con una deleción en la región E1A (194-358 pb) del genoma creció mal incluso en una línea celular que complementaba la función temprana (E1A) (Hearing y Shenk, 1983). Cuando se recombinó un ADN adenoviral de compensación (0-353 pb) en el extremo derecho del mutante, el virus se empaquetó de manera normal. Un análisis mutacional adicional identificó un elemento corto, repetido, dependiente de la posición en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se encontró que una copia de la repetición era suficiente para el empaquetamiento eficaz si estaba presente en cualquier extremo del genoma, pero no cuando se movía hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5 (Hearing et al., 1987).
Usando versiones mutadas de la señal de empaquetamiento, es posible crear virus cooperadores que se empaquetan con diferentes eficacias. Normalmente, las mutaciones son deleciones o mutaciones puntuales. Cuando se hacen crecer virus cooperadores con empaquetamiento de baja eficacia en células cooperadoras, se empaqueta el virus, aunque a tasas reducidas en comparación con virus de tipo natural, permitiendo así la propagación del cooperador. Sin embargo, cuando se hacen crecer estos virus cooperadores en células junto con virus que contienen señales de empaquetamiento de tipo natural, las señales de empaquetamiento de tipo natural se reconocen preferiblemente por encima de las versiones mutadas. Dada una cantidad limitante de factor de empaquetamiento, el virus que contiene las señales de tipo natural se empaqueta de manera selectiva en comparación con los cooperadores. Si la preferencia es lo bastante grande, deben lograrse reservas que se aproximan a la homogeneidad.
Retrovirus. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN de cadena sencilla caracterizados por una capacidad para convertir su ARN en ADN de cadena doble en células infectadas mediante un procedimiento de transcripción inversa (Coffin, 1990). Después el ADN resultante se integra en cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la retención de las secuencias génicas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes (gag, pol y env) que codifican proteínas de la cápsida, enzima polimerasa y componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia encontrada en sentido 5' desde el gen gag, denominada \Psi, funciona como una señal para el empaquetamiento del genoma en viriones. Hay dos secuencias de repeticiones terminales largas (LTR) presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Contienen secuencias de potenciador y promotor fuerte y también se requieren para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990).
Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica un promotor en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso en la replicación. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes de LTR y \Psi (Mann et al., 1983). Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene un ADNc humano, junto con las secuencias retrovirales de LTR y \Psi en esta línea celular (mediante precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de \Psi permite empaquetar el transcrito de ARN del plásmido recombinante en partículas virales, que después se secretan en los medios de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, opcionalmente se concentran, y se usan para la transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable de muchos tipos de retrovirus requiere la división de las células huésped (Paskind et al., 1975).
Recientemente se desarrolló un enfoque diseñado para permitir la dirección específica de vectores de retrovirus basándose en la modificación química de un retrovirus mediante adición química de residuos de galactosa a la envuelta viral. Esta modificación permitirá la infección específica de células tales como hepatocitos mediante receptores de asialoglicoproteína, si se desea.
Se diseñó un enfoque diferente para dirigir retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos biotinilados frente a proteína de envuelta retroviral y frente a receptor celular específico. Se acoplaron los anticuerpos mediante los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux et al., 1989). Usando anticuerpos frente a antígenos de la clase I y clase II del complejo mayor de histocompatibilidad, se demostró la infección de una variedad de células humanas que llevan esos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).
Virus adenoasociado. El VAA utiliza un ADN de cadena sencilla, lineal, de aproximadamente 4700 pares de bases. Las repeticiones terminales invertidas flanquean el genoma. Hay dos genes presentes dentro del genoma, que dan lugar a varios productos génicos distintos. El primero, el gen cap, produce tres proteínas de virión (VP) diferentes, denominadas VP-1, VP-2 y VP-3. El segundo, el gen rep, codifica cuatro proteínas no estructurales (NS). Uno o más de estos productos génicos de rep es/son responsable(s) de la transcripción de VAA de activación en trans.
Los tres promotores en VAA se denominan por su ubicación, en unidades de mapa, en el genoma. Son, de izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis transcritos, dos iniciados en cada uno de los tres promotores, sometiéndose a corte y empalme uno de cada par. El sitio de corte y empalme, derivado de las unidades de mapa 42-46, es el mismo para cada transcrito. Las cuatro proteínas no estructurales se derivan aparentemente del mayor de los transcritos, y tres proteínas de virión surgen todas del menor transcrito.
El VAA no está asociado con ningún estado patológico en seres humanos. De manera interesante, para una replicación eficaz, el VAA requiere funciones "cooperadoras" de virus tales como virus del herpes simple I y II, citomegalovirus, virus de la seudorrabia y, por supuesto, adenovirus. El mejor caracterizado de los cooperadores es el adenovirus, y se ha mostrado que muchas funciones "tempranas" de este virus ayudan a la replicación de VAA. Se cree que la expresión de bajo nivel de proteínas rep de VAA contiene la expresión estructural de VAA, y se piensa que la infección por virus cooperador elimina este bloqueo.
Las repeticiones terminales del vector de VAA pueden obtenerse mediante digestión con endonucleasa de restricción de VAA o un plásmido tal como p201, que contiene un genoma de VAA modificado (Samulski et al. 1987), o mediante otros procedimientos conocidos por el experto en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, síntesis química o enzimática de las repeticiones terminales basándose en la secuencia publicada de VAA. El experto en la técnica puede determinar, mediante procedimientos bien conocidos tales como análisis de deleción, la secuencia mínima o parte de las ITR de VAA que se requieren para permitir la función, es decir, integración estable y específica del sitio. El experto en la técnica también puede determinar qué modificaciones menores de la secuencia pueden tolerarse mientras se mantiene la capacidad de las repeticiones terminales para dirigir la integración estable, específica del sitio.
Los vectores basados en VAA han demostrado ser vehículos seguros y eficaces para la administración génica in vitro, y estos vectores están desarrollándose y sometiéndose a prueba en fases preclínicas y clínicas para una amplia variedad de aplicaciones en posible terapia génica, tanto ex vivo como in vivo (Carter y Flotte, 1995 ; Chatterjee et al., 1995; Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Goodman et al., 1994; Kaplitt et al., 1994; 1996, Kessler et al., 1996; Koeberl et al., 1997; Mizukami et al., 1996; Xiao et al., 1996).
La expresión y transferencia génica mediada por VAA en el pulmón ha conducido a ensayos clínicos para el tratamiento de la fibrosis cística (Carter y Flotte, 1995; Flotte et al., 1993). De manera similar, las perspectivas de tratamiento de la distrofia muscular mediante administración génica mediada por VAA del gen de la distrofina al músculo esquelético, de la enfermedad de Parkinson mediante la administración del gen de la tirosina hidroxilasa al cerebro, de la hemofilia B mediante administración del gen del factor IX al hígado, y posiblemente del infarto de miocardio mediante la administración del gen de factor de crecimiento endotelial vascular al corazón, parecen prometedoras ya que se ha mostrado recientemente que la expresión transgénica mediada por VAA en estos órganos es sumamente eficaz (Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., 1996; Ping et al., 1996; Xiao et al., 1996).
Lentivirus. Los vectores de lentivirus basados en el virus de inmunodeficiencia humano (VIH) tipo I (VIH-1) constituyen un desarrollo reciente en el campo de la terapia génica. Una propiedad clave de vectores derivados de VIH-1 es su capacidad para infectar las células que no están dividiéndose. Se han producido vectores derivados de VIH-1 de altos títulos. Los ejemplos de vectores lentivirales incluyen White et al. (1999), que describe un vector de lentivirus que se basa en VIH, virus de inmunodeficiencia del simio (VIS), y virus de estomatitis vesicular (VEV) y a los que se hace referencia como HIV/SIVpack/G. La posible patogenicidad con este sistema de vector es mínima. La capacidad de transducción de HIV/SIVpack/G se demostró con linfocitos humanos inmortalizados, macrófagos primarios humanos, células CD34 (+) derivadas de médula ósea humana y neuronas primarias de ratón. Gasmi et al. (1999) describen un sistema para producir de manera transitoria vectores basados en VIH-1 usando plásmidos de expresión que codifican gag, pol, y tat de VIH-1 bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus.
Otros vectores virales. Pueden emplearse otros vectores virales como constructos de expresión en la presente invención. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), virus de la viruela del canario y virus del herpes. Estos virus ofrecen varias características para su uso en la transferencia génica en diversas células de mamíferos.
B. Transferencia no viral
Generalmente los constructos de ADN de la presente invención se administran a una célula, en ciertas situaciones, el ácido nucleico que va a transferirse no es infeccioso, y puede transferirse usando procedimientos no virales.
En la presente invención se contemplan varios procedimientos no virales para la transferencia de constructos de expresión en células de mamífero cultivadas. Éstos incluyen precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección dirigida (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979), sonicación celular (Fechheimer et al., 1987), bombardeo génico usando microproyectiles a alta velocidad (Yang et al., 1990), y transfección mediada por el receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988).
Una vez administrado el constructo en la célula puede colocarse el ácido nucleico que codifica el constructo de potenciación de esferoides de células óseas y expresarse en diferentes sitios. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el gen terapéutico puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula. Esta integración puede ser en la ubicación y orientación relacionadas mediante recombinación homóloga (sustitución génica) o puede integrarse en una ubicación aleatoria, no específica (aumento génico). Aún en realizaciones adicionales, el ácido nucleico puede mantenerse de manera estable en la célula como un segmento separado, episomal de ADN. Tales segmentos o "episomas" de ácido nucleico codifican secuencias de manera suficiente para permitir el mantenimiento y replicación independiente de, o en sincronización con, el ciclo de la célula huésped. Cómo se administra el constructo de expresión a una célula y en qué parte de la célula permanece el ácido nucleico dependen del tipo de constructo de expresión empleado.
En una realización particular de la invención, el constructo de expresión puede atraparse en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas de lípidos separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de disolución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan una auto-reorganización antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas de lípidos (Ghosh y Bachhawat, 1991). La adición de ADN a liposomas catiónicos provoca una transición topológica de liposomas a glóbulos condensados cristalinos líquidos ópticamente birrefringentes (Radler et al., 1997). Estos complejos de ADN-lípido son posibles vectores no virales para su uso en la terapia génica.
La administración de ácido nucleico mediada por liposomas y expresión de ADN foráneo in vitro ha sido muy satisfactoria. Usando el gen de la \beta-lactamasa, Wong et al. (1980) demostraron la viabilidad de la administración mediada por liposomas y expresión de ADN foráneo en células en cultivo de embrión de pollo, HeLa y de hepatoma. Nicolau et al. (1987) lograron la transferencia génica mediada por liposomas satisfactoria en ratas tras la inyección intravenosa. También se incluyen diversos enfoques comerciales que implican la tecnología de "lipofección".
En ciertas realizaciones de la invención, puede complejarse el liposoma con un virus hemaglutinante (VHJ). Se ha mostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada celular de ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, puede complejarse o emplearse el liposoma junto con proteínas cromosómicas distintas de histona nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). Aún en realizaciones adicionales, puede complejarse el liposoma o emplearse tanto junto VHJ como con HMG-1. Ya que tales constructos de expresión se han empleado satisfactoriamente en la transferencia y expresión de ácido nucleico in vitro e in vivo, entonces pueden aplicarse para la presente invención.
Otros sistemas de administración de vectores que pueden emplearse para administrar un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico en células son vehículos de administración mediados por receptores. Aprovechan la captación selectiva de macromoléculas mediante endocitosis mediada por receptor en casi todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica del tipo de célula de diversos receptores, la administración puede ser sumamente específica (Wu y Wu, 1993).
Los vehículos de transporte dirigido de genes mediados por receptores consisten generalmente en dos componentes: un ligando específico de receptor celular y un agente de unión a ADN. Se han usado varios ligandos para la transferencia génica mediada por receptores. Los ligandos más ampliamente caracterizados son asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner et al., 1990). Recientemente, se ha usado una neoglicoproteína sintética, que reconoce el mismo receptor que ASOR, como vehículo de administración génica (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) y también se ha usado el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para administrar genes a células de carcinoma escamoso (Myers, documento EPO 0 273 085).
En otras realizaciones, el vehículo de administración puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al. (1987) emplearon lactosil-ceramida, un asialogangliósido con galactosa terminal, incorporado en liposomas y observaron un aumento en la captación del gen de la insulina por hepatocitos. Por tanto, resulta viable que también puede administrarse específicamente un ácido nucleico que codifica un gen terapéutico en un tipo de célula tal como células de próstata, epiteliales o tumorales, mediante cualquier número de sistemas de receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo, puede usarse el antígeno humano específico de próstata (Watt et al., 1986) como el receptor para la administración mediada de un ácido nucleico en tejido de la próstata.
En otra realización de la invención, el constructo de expresión puede consistir sencillamente en ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia del constructo puede realizarse mediante cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente que permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, sin embargo, también puede aplicarse para su uso in vivo. Dubensky et al. (1984) inyectaron satisfactoriamente ADN de poliomavirus en forma de precipitados de CaPO_{4} en el hígado y el bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando una replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO_{4} da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica una CAM también puede transferirse de una manera similar in vivo y expresar CAM.
Otra realización de la invención para transferir un constructo de expresión de ADN desnudo en células puede implicar el bombardeo de partículas. Este procedimiento depende de la capacidad para acelerar microproyectiles revestidos de ADN hasta una alta velocidad permitiendo que perforen membranas celulares y entren en las células sin destruirlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de tales dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como perlas de oro o tungsteno.
X. Ensayos de selección y moduladores
Todavía en realizaciones adicionales, la presente invención proporciona procedimientos para identificar nuevos compuestos que modulan la formación de esferoides de células óseas. Se pretende que los "compuestos moduladores" o "compuestos que modulan la formación de esferoides de células óseas" se refieran a sustancias que potencian, inhiben o alteran la formación ex vivo de esferoides de células óseas o posterior formación de microespículas (hueso). Tales actividades alteradas incluyen, pero no se limitan a, cambios en el momento o grado de formación de esferoides de células óseas que pueden producirse. Los compuestos moduladores también pueden sustituir las actividades suministradas por factores de crecimiento osteogénicos.
Los moduladores identificados tendrán utilidad en procedimientos implicados en la formación ósea, y también se contemplan para usos terapéuticos. Los moduladores que afectan a la formación ósea ex vivo en los ensayos descritos en la presente invención también se contemplan para afectar a la formación ósea in vivo. Por ejemplo, la capacidad para modular específicamente la formación ósea será beneficiosa para diversas enfermedades y defectos óseos, tal como se describe en otra parte en la presente invención. Además, el impacto de cualquier posible efecto adverso por un modulador puede limitarse o controlarse de otro modo mediante la administración más específica del modulador a una ubicación específica.
Adicionalmente se contempla que los compuestos útiles con respecto a esto no estarán limitados de ninguna manera a compuestos proteicos o peptidílicos. De hecho, puede resultar ser el caso que los compuestos farmacológicos más útiles para la identificación mediante la aplicación de los ensayos de selección no sean de naturaleza peptidílica y, por ejemplo, servirán para modular la formación de esferoides de células óseas o microespículas (hueso) mediante una estrecha unión u otra interacción química. Pueden obtenerse sustancias candidato a partir de bibliotecas de productos químicos sintéticos, o de muestras naturales, tales como muestras de selva tropical o marinas.
A. Modulación de la formación de esferoides de células óseas
La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar un modulador de formación ósea en mamíferos mediante las etapas de obtener una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivar la célula en condiciones libres de suero en presencia de un modulador candidato en ausencia de factores de crecimiento osteogénicos; medir la formación de esferoides de células óseas; y comparar la formación de esferoides de células óseas con la observada en ausencia del modulador. La formación de esferoides de células óseas y microespículas en este ensayo se comparará con la de una célula osteogénica o precursora de hueso cultivada en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos. En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un modulador de formación ósea obteniendo una célula osteogénica o precursora de hueso; cultivando dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de un modulador candidato en presencia de uno o más factores de crecimiento de la superfamilia de genes del TGF-\beta; medir la formación de esferoides de células óseas; y comparar la formación de esferoides de células óseas con la observada en ausencia del modulador. Se esperará que los moduladores identificados mediante este ensayo potencien, inhiban o actúen de manera sinérgica con factores de crecimiento tales como los de la superfamilia de genes del TGF-\beta.
B. Moduladores de segunda generación
Además de los compuestos moduladores identificados inicialmente, los inventores también contemplan que pueden formularse otros compuestos estéricamente similares para imitar las partes clave de la estructura de los moduladores. Tales compuestos, que pueden incluir compuestos peptidomiméticos de moduladores peptídicos, pueden usarse de la misma manera que los moduladores iniciales.
Ciertos compuestos que imitan los elementos de estructura secundaria de proteínas se diseñan usando el fundamento de que el esqueleto peptídico de proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de tal manera que facilite las interacciones moleculares. Un compuesto mimético peptídico se diseña de ese modo para permitir interacciones moleculares similares a la molécula natural.
Algunas aplicaciones satisfactorias del concepto de compuesto mimético peptídico se han centrado en compuestos miméticos de giros \beta dentro de proteínas, que se sabe que son sumamente antigénicas. Probablemente la estructura de giro \beta dentro de un polipéptido puede predecirse mediante algoritmos informáticos. Una vez determinados los aminoácidos componentes del giro, pueden construirse compuestos miméticos para lograr una orientación espacial similar de los elementos esenciales de las cadenas laterales de aminoácidos.
La generación de compuestos miméticos o equivalentes estructurales adicionales puede lograrse mediante las técnicas de modelización y diseño químico conocidas por los expertos en la técnica. Ahora se conoce bien la técnica de modelización química informática. Usando tales procedimientos, puede diseñarse un compuesto químico que modula específicamente la formación de esferoides de células óseas, y después sintetizarse, tras la identificación inicial de un compuesto que modula la formación de esferoides de células óseas, pero que no es específico o no lo suficientemente específico para otras propiedades de formación ósea en seres humanos o animales. Se entenderá que todos de tales constructos estéricamente similares y moléculas de segunda generación entran dentro del alcance de la presente invención.
XI. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos que siguen representan técnicas que el inventor descubrió que funcionan bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán, en vista de la presente divulgación, que pueden realizarse muchos cambios en realizaciones específicas que se dan a conocer y todavía obtener un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
Ejemplo 1 Materiales y procedimientos
Cultivo de células osteogénicas y líneas celulares. Se cultivaron líneas de células osteogénicas tales como células de osteosarcoma humanas (MG63) en RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) que contenía L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio y suero de ternero fetal al 10% (FCS) (Hyclone Labs Inc., Logan, Utah). Para la formación de esferoides de células óseas, se hicieron crecer células hasta la confluencia, se trataron con tripsina, se lavaron dos veces en RPMI, y se cultivaron inmediatamente en medios libres de suero que contenían ITS^{+} al 1% (Collaborative Research Inc.) y TGF-\beta1 200 pM (Collaborative). A menos que se observe lo contrario, se siembran en placas las células a una densidad de aproximadamente 10^{3} células/cm^{2} a 10^{6} células/cm^{2} en placas de cultivo tisular. Se dejaron adherirse las células control al plástico durante 3-4 horas en medio que contenía suero tras la tripsinización. Después se lavó dos veces esta capa de células adherentes con medio libre de suero y se cultivó tal como anteriormente con o sin TGF-\beta1.
Células precursoras de hueso humanas (HBPC). Se aislaron poblaciones purificadas de HBPC a partir de médula ósea humana tal como se describió anteriormente (Long et al., 1995). Se obtuvo médula ósea humana a partir de voluntarios normales. En resumen, se prepararon células mononucleares a partir de médula ósea humana mediante separación sobre ficoll (Sigma, St Louis, MO), y se cultivaron células a baja densidad en cultivo durante la noche para eliminar células adherentes a plástico. Se recogieron células a baja densidad no adherentes y se dejaron experimentar adhesión inmunitaria a anticuerpos anti-osteonectina (ON) y anti-osteocalcina (OC) inmovilizados sobre plástico tal como se describe (Long et al., 1995). Se recogieron las células adherentes inmunitarias mediante tripsinización.
Osteoblastos primarios humanos. El procedimiento de aislamiento fue esencialmente el de Robey y Termaine (1985). En resumen, se obtuvieron esquirlas óseas humanas (tras el consentimiento informado y aprobación por la IRB) durante cirugía ortopédica. Se trataron con colagenasa D (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) durante 2 h a 37ºC, se eliminaron mediante lavado las células no adherentes, se desmenuzaron las partes de hueso y se cultivaron en DMEM libre de Ca^{2+} (Gibco, Grand Island, NY) que contenía FCS al 10% y pen/estrep. Después de que los cultivos fueran confluentes, se recogieron las células mediante tripsinización y se cultivaron en DMEM que contenía Ca^{2+} durante 2-3 semanas. Se recuperaron osteoblastos derivados de hueso mediante tripsinización y centrifugación.
Formación de esferoides de células óseas. Con el fin de inducir el desarrollo tridimensional de células (es decir, esferoides de células óseas), se trataron células con tripsina tal como se realiza de manera rutinaria para pasos, se inactivó la tripsina mediante adición de suero, se lavaron tres veces las células, y se cultivaron inmediatamente en RPMI/ITS^{+} (véase anteriormente) que contenía TGF-\beta1 200 pM. Se dejaron adherirse las células control al plástico durante 3-4 horas en medio que contiene suero tras la tripsinización. Después se lavó dos veces esta capa de células adherentes con medio libre de suero y se cultivó tal como anteriormente con o sin TGF-\beta1.
Síntesis de colágeno. En los tiempos indicados, se lavaron esferoides de células óseas con DMEM libre de Prolene que contenía ITS al 1%, y se incubaron durante 12 horas en presencia de ITS^{+} y (^{3}H)prolina 100 \muCi/ml (Amersham). Se recogieron las células y el medio, y se prepararon lisados celulares. Se estimó el contenido en proteínas mediante el procedimiento BCA (Smith, 1985), usando un kit de Pierce (Rockford, Illinois). Se liofilizaron los lisados celulares y se extrajeron durante la noche a 4ºC con ácido acético 0,5 M que contenía pepsina 100 \mug/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se secaron las muestras, se disolvieron en tampón de SDS-gel no reductor y se analizaron sobre 5% de SDS-gel. Se resolvieron los componentes \alpha_{1'} (I) y \alpha_{1} (III) mediante electroforesis de reducción retrasada (Sykes, 1976). Se trataron los geles con Amplify (Amersham, Inglaterra), y se visualizó el colágeno radiomarcado mediante autorradiografía. Se determinó el porcentaje de colágeno tipo I usando la siguiente fórmula (Franceschi, 1988).
% de tipo I = \frac{(\alpha_{1}(I)/2) \ x \ 100}{\alpha_{1}(I)/2 \ + \ \alpha_{1}(III)/3}
Análisis de tipo Western. El procedimiento usado fue esencialmente el de Towbin (1979). Se hicieron pasar muestras sobre un 10% de SDS-PAGE. Se transfirieron las proteínas resueltas de manera electroforética a nitrocelulosa (Schleicher y Schuell; Keene, NH) y se bloquearon los sitios de unión no específica usando leche desnatada al 5% en TBST (Tris 10 mM, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, pH 7,5). Se incubó la membrana de nitrocelulosa con anticuerpos primarios: anti-osteonectina (ON), anti-fosfatasa alcalina (ambos generosas aportaciones del Dr. Kenneth Mann, University of Vermont) o anti-colágeno tipo I (Collaborative); cada uno a 10 \mug/ml en TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron con TBST y se trataron con el anticuerpo secundario (anti-conjugado de IgG de ratón-HRP; Amersham) a una dilución de 1:1000 en el mismo tampón. Se visualizaron las proteínas marcadas con HRP/anticuerpo mediante quimioluminiscencia potenciada (Pierce).
Ensayos de fosfatasa alcalina (Elias. 1982). En los puntos de tiempo indicados, se recogieron esferoides de células óseas, se lavaron dos veces con PBS y se centrifugaron a 400 durante 6 minutos. Se lisaron las células (Tris HCl 1,5 M, ZnCl_{2} 1 mM, MgCl_{2}, 6H_{2}O 1 mM, pH 9,2, Triton X100 al 1%) a 4ºC durante 30 minutos. Se determinó la actividad de fosfatasa alcalina mediante el procedimiento colorimétrico usando un kit (Sigma). Se expresó la actividad como \mumol de para-nitrofenol formado/hora/mg de proteína.
Procedimientos de tinción inmunocitoquímica e histoquímica. Se realizaron preparaciones de citocentrífuga a partir de esferoides de células inducidos por TGF-\beta1, y se detectaron las proteínas osteonectina (anti-ON, 10 \mug/ml), fosfatasa alcalina y colágeno tipo I (anti-Coll I, Sigma) usando un kit de tinción inmunoquímica ABC de inmunocitoquímica basado en avidina-biotina (Pierce) tal como se describe en otra parte (Long, 1990). También se detectó el colágeno mediante el procedimiento de tinción de Masson (Gomori, 1950; Lillie, 1940, adquirido de Sigma, St. Louis). Se determinó la actividad de fosfatasa alcalina histoquímica según instrucciones del fabricante (Sigma). Finalmente, se determinó la mineralización de los cultivos mediante el procedimiento de tinción con rojo de alizarina S (Sigma) (pH 5) (McGee y Russell, 1958).
Análisis de citometría de flujo: esferoides de células óseas formados a partir de MG63, HBPC u osteoblastos primarios se desagregaron con tripsina seguido por tratamiento con colagenasa D 2 mg/ml (Boehringer Mannheim). Se detuvo la actividad enzimática de tripsina mediante la adición de FCS al 10%. Se visualizaron las células mediante inmunofluorescencia indirecta y se analizaron usando un citómetro de flujo FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los anticuerpos primarios fueron anticuerpos monoclonales anti-integrinas humanas \alpha2, \alpha3, \alpha4, \alpha5, \beta3 o \beta1 (de Becton y Dickinson, San Jose, CA, o bien de GIBCO). El anticuerpo secundario fue anti-IgG de ratón conjugado con FITC (Sigma). Los controles de anticuerpos fueron anticuerpos inapropiados específicos de isotipo.
Inhibición de condensación celular. Se cultivaron las células en medios libres de suero en condiciones que establecen esferoides de células óseas (tal como se describió anteriormente) en presencia de anticuerpos neutralizantes frente a integrinas \alpha2, \alpha3 y/o \beta1, a 10 \mug/ml. Anticuerpos inapropiados específicos de isotipo sirvieron como controles negativos. Se añadieron anticuerpos cada dos días a lo largo de un periodo de cultivo de siete días. También se usó EGTA (0,5 mM) para la inhibición de agregación celular, al igual que puromicina (5 \muM).
Espectroscopía de Raman. Se examinaron esferoides de células que contenían microespículas intactos o tratados con tripsina para eliminar las células. Se lavaron repetidamente en metanol las muestras tratadas con tripsina para eliminar compuestos orgánicos de superficie, se montaron las muestras con microespículas sobre portaobjetos de cuarzo, se dejó evaporar cualquier metanol restante, y después se cubrieron con un cubreobjetos de cuarzo. El espesor de la muestra varió entre muestras. Se adquirieron múltiples espectros de Raman (es decir, de 150 espectros a 350 espectros) a intervalos de 2 \mum a lo largo de una línea seleccionada aleatoriamente. Se usa un láser de 785 nm (SDL, Inc.) como fuente de excitación y se transfiere el punto láser a un microscopio de epifluorescencia (Olympus BH-2) equipado con un objetivo Fluar de 10x/0,5 NA o bien de 20x/0,75 NA (Zeiss). Se traduce la muestra mediante una fase de traducción X-Y (New England Affiliated Technologies, Inc.) que puede realizar etapas de 0,125 \mum. Se recogieron dispersiones de Raman y se transfirieron a un espectrógrafo de transmisión axial (Kaiser Optical systems, Inc. Holospec F/1.8i) para determinar la dispersión. El detector fue una cámara CCD de adelgazamiento posterior refrigerada por N_{2} líquido (Princeton Instruments, Inc.). Para las muestras intactas (no tratadas con tripsina), se transfirieron las dispersiones de Raman a un espectrógrafo de transmisión axial (Kaiser Optical systems, Inc. Holospec VPT series) y el detector fue una cámara CCD refrigerada por agua (-20ºC) (Andor, Inc.). Se calibró el espectrógrafo con una lámpara de emisión de argón o neón. La comparación de muestras intactas y tratadas con tripsina demostró que los esferoides de células/microespículas intactos ocultaron ciertos componentes de los espectros de Raman. Como resultado, los datos sólo están presentes para las muestras tratadas con tripsina. Se recogieron espectros puntuales de Raman cada 2 \mum con un tiempo de integración de 15 segundos a 30 segundos. Anchos de ranura de 25 \mum dieron una resolución de espectro del orden de 4 cm^{-1}. Se realizó un análisis de datos en Matlab (Mathworks, Inc.) usando funciones incorporadas y escritas localmente. Se almacenaron los datos en un ordenador Pentium.
Los múltiples espectros adquiridos a partir de microespículas consistieron en 150-350 espectros adquiridos aleatoriamente (conocidos como transecciones de Raman) medidos a lo largo de una línea a través de cada microespícula. Se analizaron estos espectros usando un análisis de factor, un análisis estadístico de múltiples variables en el que los datos se reducen a un número específico de (unas pocas) combinaciones lineales, o factores, que describen los datos. Este enfoque estadístico es un potente medio de "calcular el promedio" de espectros (es decir, extraer espectros componentes) ya que no requiere conocimiento previo de la naturaleza de los espectros constituyentes puros. En muchos casos, se necesitaron varios factores para representar completamente el conjunto de datos. Normalmente, se requirieron de 3 a 6 factores, incluyendo factores de fondo, para representar más del 99,9% de la varianza total del conjunto de datos. No se incluyeron más factores en el análisis ya que, en muchos casos, el resto consistió en descripciones de ruido en el conjunto de datos.
Microscopía electrónica de transmisión. Se trataron esferoides de células óseas formados a partir de osteoblastos primarios mediante TEM, usando procedimientos habituales (Hayat, 1989). En resumen, se fijaron las muestras en glutaraldehído al 2% y se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1%. Tras las etapas de deshidratación, se incrustaron las muestras en Epon, se seccionaron, se tiñeron y se observaron en el microscopio electrónico CM 100 de Phillips, Mahwah, NJ.
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Ejemplo 2 Formación de esferoides de células óseas y microespículas
Dado el papel de la condensación celular en la condro/osteogénesis tanto in vivo (Hall y Miyake, 1995; Dunlop y Hall, 1995) como in vitro (Denker, 1995), los inventores razonaron que hay procedimientos similares implicados en la formación ex vivo de hueso humano. Para examinar esta hipótesis, los inventores utilizaron tres poblaciones de células osteogénicas humanas: la línea celular de osteosarcoma preosteoblástico MG63 (Franceschi, 1985) y otras líneas celulares tales como 3T3, SAOS2 y C310T1/2, células precursoras de hueso humanas purificadas inmunológicamente (HBPC; una populación de células similares a preosteoblastos) (Long, 1995) y osteoblastos derivados de tratamiento con colagenasa de fragmentos óseos (Robey y Termine, 1985 y tabla 1). Los inventores observaron que el tratamiento libre de suero de estos tipos de células con TGF-\beta1 inmediatamente tras la tripsinización y posterior cultivo libre de suero dio como resultado la formación de condensados celulares esféricos, tridimensionales (esferoides de células) en el plazo de 24-48 horas (figura 1, fila superior). De manera coherente con la inducción de diferenciación, la formación de esferoides también induce un cese de proliferación en cada tipo de células. Como resultado, se desarrollan esferoides como consecuencia de interacciones célula-célula (véase a continuación) y no de la proliferación. Durante las primeras 24 horas de tratamiento con TGF-\beta, las células vuelven a adherirse, y entre 24-48 horas se desprenden del plástico de cultivo tisular para formar esferoides de células. No se forman esferoides de células óseas si las células se cultivan en ausencia de TGF-\beta1, si en primer lugar se dejan adherir las células al plástico en presencia de suero (es decir, tal como se hacen pasar normalmente), o si posteriormente se sustituye el medio que contiene suero usado para hacer pasar las células (es decir, tras 24 h) por medios libres de suero que contienen TGF-\beta1 (controles). La formación de esferoides depende de la síntesis de proteínas ya que se bloquea completamente mediante tratamiento con puromicina. También se inhibe mediante la presencia de EGTA, lo que sugiere un papel para las moléculas de adhesión dependientes de calcio en la formación de esferoides (datos de EGTA y puromicina a continuación).
TABLA 1 Puntuaciones tisulares y líneas celulares que producen hueso ex vivo
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En el plazo de tres-cinco días de formación de esferoides, los esferoides celulares comienzan a formar pequeñas estructuras cristalinas similares a hueso (denominadas microespículas; figura 1, fila 2). Las microespículas siguen desarrollándose hasta los días 7-10. La capacidad de formar esferoides y microespículas está limitada a aquellas células que tienen potencial osteogénico (tabla 1), y es proporcional tanto al estado de desarrollo aproximado de las células osteogénicas como a su densidad de siembra en placas celular (a continuación). Por tanto, las células MG63 similares a osteoprogenitores forman la menor cantidad de microespículas (figura 2). Las células precursoras de hueso humanas similares a preosteoblastos tempranos forman un número intermedio de microespículas. Los osteoblastos derivados de hueso muestran un aumento de siete veces en la formación de microespículas (en comparación con células MG63), produciendo cada esferoide de células una microespícula.
Ejemplo 3 Análisis de formación ex vivo de hueso humano
Con el fin de confirmar que las microespículas están compuestas por hueso humano, los inventores realizaron varios análisis citoquímicos, inmunológicos, bioquímicos y fisicoquímicos. Tanto los esferoides como las microespículas de los tres tipos de células expresan osteonectina (determinación inmunocitoquímica, figura 1, fila 3). Se detecta colágeno tanto mediante tinción de Masson (figura 1, fila 4) como detección inmunocitoquímica usando anticuerpo anti-colágeno tipo-I humano (figura 1, fila 5). Las células del esferoide también expresan fuertemente actividad enzimática de fosfatasa alcalina (figura 1, fila 6). Finalmente, el rojo de alizarina S demuestra la presencia de fosfatos de calcio dentro de las microespículas de los tres tipos de células (figura 1, fila 7). De manera similar, los esferoides de cada uno de los tipos de células óseas expresaron tenascina, sialoproteína ósea y osteocalcina (a continuación). A continuación los inventores evaluaron la relación estructural entre las microespículas y las células dentro de los esferoides. El análisis por micrografía electrónica de transmisión indica una estrecha aproximación de osteoblastos derivados de hueso a las microespículas en desarrollo (figura 3A). Se observan prolongaciones citoplasmáticas largas que recubren las microespículas (figura 3A y 3B). Finalmente, la TEM con alto aumento indica la proximidad del "frente de mineralización" y las superficies celulares (figura 3C). Además, puede observarse en la microespícula el patrón de bandas típico de 640-670 \ring{A} de colágeno.
Aunque los datos citoquímicos e inmunológicos son coherentes con el procedimiento de formación ósea, no demuestran la presencia de la apatita carbonatada observada en el hueso humano. Para determinar la presencia de hidroxiapatita sustituida, los inventores utilizaron determinaciones fisicoquímicas. El análisis mediante microsonda electrónica (EMA) de microespículas trituradas indica una proporción de calcio a fosfato de 1,67-1,7, lo que es coherente con lo observado en muestras control de hidroxiapatita purificada. Estos datos de EMA se confirmaron y extendieron mediante análisis espectrográfico de Raman. El análisis espectrográfico de Raman demuestra la presencia de especies de apatita sustituidas con fosfato y carbonato que son coherentes con la presencia de hueso organizado de manera suelta. El análisis de factor de espectros de microespículas obtenidas en los días 3, 5 y 7 de cultivo reveló varios dominios que dejaban identificar claramente los iones de monohidrogenofosfato y fosfato de calcio de apatita, típico del mineral óseo (figura 4C). Para los espectros de Raman típicos de muestras del día 7, la banda de fosfato \nu_{1} a 958 cm^{-1}, característica del fosfato de calcio de apatita, es el pico más fuerte (figura 4C y 4D). En análisis cinéticos, la presencia de fosfato de calcio de apatita se detecta a tan sólo el día 3, un periodo en el que las microespículas no se reconocen fácilmente dentro de los esferoides sin tripsinización. Estos estudios cinéticos también indican un estrechamiento de la banda de fosfato \nu_{1} desde aproximadamente 18 cm^{-1} en muestras del día 3 hasta aproximadamente 12 cm^{-1} en el día 7, lo que demuestra un aumento en el orden de la fase de fosfato de calcio. Tales datos de estrechamiento son coherentes con los análisis de transformada de Fourier con infrarrojos (FT-IR) de la placa de crecimiento en ratas que demuestran un aumento en la nitidez de la banda de fosfato \nu_{1} con una mineralización creciente de la zona hipertrófica (Mendelsohn, 1989; Kim et al., 1996; Paschalis et al., 1996). Debe observarse que no todos los esferoides del día 3 contienen regiones detectables de formación de microespículas, y que el espectro de fosfato de calcio del día 3 fue evidente sólo después del análisis de factor. Esto sugiere que la deposición de fosfato de calcio tiende a agruparse en ciertas regiones del esferoide durante las fases tempranas de formación ósea.
La concentración de iones carbonato (CO_{3}^{2-}) e iones monohidrogenofosfato (HPO_{4}^{2-}) en la red de apatita son marcadores de madurez del hueso. En varios de los espectros de hueso resueltos con factores, se observan bandas a 1065-1070 cm^{-1} (figura 4C y 4D). Estas bandas se asignan normalmente a estiramientos de carbonato \nu_{1} (C=O) que corresponden específicamente a carbonato tipo B (en las que el carbonato sustituye a los iones fosfato en la red de apatita). La intensidad de esta banda es generalmente más débil que la observada en espectros extraídos de hueso cortical maduro (Rey, 1995 y 1996) lo que indica un mineral óseo ligeramente menos sustituido (es decir, menos carbonatado). En unos pocos casos, también se observa carbonato como bandas a 1110 cm^{-1} y 1150 cm^{-1}, normalmente asociadas con carbonato sustituido tipo A (en las que el carbonato sustituye a iones hidroxilo monovalentes dentro de la matriz de apatita). Estas bandas son normalmente menos predominantes, lo que implica altas proporciones de bandas de carbonato tipo B a tipo A en estas microespículas. Adicionalmente, el análisis de transecciones de Raman indica regiones de cristal de apatita sustituido intercaladas con áreas de proteína amorfa no cristalina. Los inventores no detectaron una firma clara de colágeno dentro de los espectros de Raman. Sin embargo, la detección inmunológica, bioquímica y mediante microscopía electrónica de colágeno tipo I en todos los periodos de tiempo durante la formación de microespículas condujo a la interpretación de esto como un problema tecnológico (de detección), ya que el grado de mineralización aparentemente oculta la detección de colágeno mediante espectroscopía de Raman. Esto verifica que la condensación de células óseas impulsada por TGF-\beta1 conduce a la formación de hidroxiapatita carbonatada, microcristalina lo que es coherente con la presencia de hueso humano.
Ejemplo 4 La formación de esferoides regula la expresión de proteína relacionada con el hueso
Los análisis citoquímicos anteriores de la expresión de proteína ósea en esferoides de células se confirmaron mediante análisis de tipo Western y bioquímicos. Estos estudios indican que el procedimiento de formación de esferoides de células óseas dependiente de TGF-\beta1 da como resultado aumentos de la abundancia relativa de proteínas tanto colagenasas como no colagenasas. El análisis de tipo Western indica que la formación de esferoides en cada tipo de célula osteogénica aumenta de manera notable la expresión de osteonectina y fosfatasa alcalina (figura 5A, filas superior y del medio) en comparación con células control que se hicieron crecer en condiciones libres de suero en ausencia de TGF-\beta1 (que, por tanto, no forman esferoides). Se determinó la síntesis de colágeno mediante la incorporación de Prolene tritado utilizando electroforesis de reducción retrasada (Sykes, 1976) para distinguir entre colágenos tipo I y tipo III. En estas condiciones electroforéticas, el colágeno tipo-III aparece como una única banda de cadenas \alphaI (III), y el colágeno tipo I aparece como dos bandas de cadenas \alphaI (I) y \alphaII (I), respectivamente, en una proporción de 2,5 a 1 (Franceschi, 1988). Los estudios de incorporación de ^{3}H-Prolene indican que el colágeno producido por los tres tipos de células es colágeno tipo I en más del 95% (figura 5, fila del fondo). Ambas células MG63 y células HBPC regulan por incremento de manera notable la síntesis de colágeno tipo I tras la formación de esferoides. En cambio, los osteoblastos primarios aislados de hueso humano expresan de manera constitutiva colágeno tipo I. No obstante, la formación de esferoides de células óseas dependiente de TGF-\beta1 da como resultado un aumento de dos a tres veces en la síntesis de colágeno en estas células (proporciones de cadenas de colágeno y determinaciones cuantitativas mediante densitometría). La formación de esferoides de células óseas también induce un aumento temporal marcado en la actividad de fosfatasa alcalina para cada uno de los tres tipos de células osteogénicas (figura 5B). Finalmente, los inventores evaluaron la expresión de osteocalcina durante la formación de esferoides. Aunque se detectaron cantidades pequeñas, localizadas de esta proteína ósea mediante inmunocitoquímica, no pudo confirmarse su expresión mediante análisis de tipo Western. Esto indica que la osteocalcina se produce en pequeñas cantidades por estas células, pero su presencia puede no ser un requisito obligatorio para la formación de microespículas.
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Aumentar la densidad de células óseas dentro de los esferoides también induce un aumento de la expresión de proteínas no colagenasas. En primer lugar se observó que el número total de esferoides que se formaban por cultivos dependía de la densidad de siembra en placas de células inicial. Para MG63 y osteoblastos con colágeno liberado, la densidad de siembra en placas óptima fue 2-4 x 10^{5} células (es decir, 0,5-1,0 x 10^{5} por cm^{2}), mientras que las células precursoras de hueso humanas requirieron aproximadamente diez veces más células. Estas células purificadas de manera inmunitaria eran puras en aproximadamente el 70% (Long, 1995), pero seguían siendo una población celular heteróloga, que presuntamente contenía otras células derivadas de médula ósea que pueden modular la formación de microespículas. Estos estudios indicaron que la inducción óptima de proteína ósea durante la formación de esferoides (usando anti-osteonectina como sonda) se produjo a las mismas densidades de siembra en placas óptimas a las requeridas para la formación de esferoides (figura 6A). Por tanto los inventores aislaron y combinaron esferoides individuales, clasificándolos en agregados celulares pequeños, intermedios y grandes mediante inspección visual. La evaluación de la expresión de osteonectina en estos esferoides de células óseas aislados indica un aumento en la abundancia relativa con un aumento en el tamaño de los esferoides (figura 6B), coherente con un proceso mediado por la densidad celular.
Evaluación de la cinética de expresión de proteína ósea demuestra diferencias temporales distintas entre los tres tipos de células osteogénicas. Las células MG63 expresan de manera constitutiva niveles bajos de ambas osteonectina y fosfatasa alcalina (figura 7A y 7B, paneles de la izquierda). Tras la inducción de formación de esferoides, la expresión de osteonectina por células MG63 aumenta de manera notable a lo largo de las primeras 24 horas, alcanza una meseta en los días 3-5, y después se reduce moderadamente en cuanto a su abundancia relativa. La expresión de fosfatasa alcalina en células MG63 muestra un lento aumento a lo largo de los tres primeros días y sigue aumentando hasta el día 7. En células precursoras de hueso humanas, tanto osteonectina como fosfatasa alcalina aumentan durante cinco días, momento en el cual la osteonectina aumenta abruptamente en cuanto a su abundancia relativa (figura 7A y 7B, paneles del centro). Tal como se espera, los osteoblastos derivados de colagenasa expresan altos niveles de fosfatasa alcalina enzimática a lo largo del periodo de formación de microespículas, aunque la actividad disminuye ligeramente tras un día de cultivo. Igualmente, la osteonectina se expresa constitutivamente mediante osteoblastos primarios, pero reduce su abundancia relativa de tres a siete días tras la formación de esferoides de células óseas (figura 7A y 7B, paneles de la derecha).
Ejemplo 5 Las interacciones célula:célula median la formación de esferoides
Tal como se mencionó, la formación de esferoides se produce como consecuencia de interacciones célula:célula dependientes de calcio en vez de proliferación celular. Esto implica que los ligandos citoadhesivos de superficie celular y sus contrareceptores median este procedimiento. La evaluación de varias posibles dianas de moléculas de citoadhesión (por ejemplo, cadherinas, selectinas e integrinas) indicó que la formación de esferoides inducida por TGF-\beta1 está mediada por integrinas \beta_{1}\alpha_{3}, y \beta_{1}\beta_{2} (y que no se detectan selectinas ni cadherinas). Los análisis de citometría de flujo de cada uno de los tres tipos de células osteogénicas indicaron que expresaban de manera constitutiva integrina \beta_{1'} (figura 8, fila inferior). La formación de esferoides da como resultado el aumento de la expresión de integrina \alpha_{2} en células MG63 y osteoblastos primarios de colágeno liberado, y aumenta la expresión de cadena de integrina \alpha_{3} en células precursoras de hueso humanas (figura 8, fila superior). Con el fin de determinar si estas integrinas median interacciones célula:célula y la posterior formación de esferoides, los inventores utilizaron anticuerpos neutralizantes frente a cadenas de integrina individuales. Para cada tipo de célula, se observó la inhibición de formación de esferoides (y, por tanto, de desarrollo de microespículas) con anticuerpo anti-\beta_{1'} anticuerpo, o el anticuerpo anti-cadena \alpha apropiado (figura 9). Estos anticuerpos provocaron individualmente una inhibición del 40-60% en el número de esferoides, y diversas combinaciones de estos anticuerpos anti-integrina \alpha y anti-integrina \beta no inhibieron adicionalmente el número ni el tamaño de esferoides, lo que sugiere que los anticuerpos individuales saturaron completamente el componente de citoadhesión mediado por integrina. De manera importante, el tratamiento con anticuerpos anti-integrina redujo la celularidad de los esferoides. Como resultado, pocos, si alguno, de los esferoides restantes producen microespículas. Finalmente, esta formación de esferoides de células óseas se inhibe completamente mediante inclusión de EGTA o puromicina (figura 9).
Ejemplo 6 Regulación mediante citocina de la osteogénesis
De las múltiples citocinas implicadas en la osteogénesis, dos factores desempeñan un papel central en el desarrollo de células óseas: TGF-\beta y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF). El TGF-\beta está situado en centros activos de diferenciación ósea (canales de cartílago y osteocitos), y se encuentra en gran cantidad en el hueso, lo que sugiere que el hueso contiene la mayor cantidad total de TGF-\beta. (Massague, 1987). Durante la formación ósea, TGF-\beta promueve la condrogénesis (Massague, 1987), un efecto presuntamente relacionado con su capacidad para estimular la deposición de componentes de matriz. Ignotz y Massague (1986). Además de estimular la formación de cartílago, TGF-\beta se sintetiza y secreta en cultivos de células óseas, y estimula el crecimiento de capas subconfluentes de células óseas bovinas fetales, mostrando así que es un regulador autocrino (o paracrino) del desarrollo de células óseas. Sporn y Roberts (1985). Al igual que TGF-\beta, los IGF se encuentran en grandes concentraciones en el hueso. De hecho, los IGF son los factores de crecimiento más abundantes en el hueso (Mohan, 1993, y referencias en el mismo). Las proteínas tanto de TGF-\beta como de IGF están implicadas en el acoplamiento de reabsorción ósea a formación ósea. TGF-\beta está presente en el hueso como complejo latente en ECM ósea, y se piensa que se activa por el entorno ácido de los osteoclastos. Fawthrop et al. (1992); Bonewald y Mundy (1990). Por tanto, el aumento de la reabsorción ósea da como resultado un aumento de la liberación y activación de TGF-\beta que posteriormente estimula células osteogénicas. Igualmente, se encuentran IGF en el hueso, pero están complejados con proteínas de unión a IGF. Mohan (1993); Feyen et al. (1991). Estas proteínas de unión a IGF (IGFBP) inhiben las acciones biológicas (proliferación y síntesis de matriz) de IGF de una manera dependiente de la dosis. Feyen et al. (1991). Dentro del hueso, las proteínas de unión a IGF (en particular, IGFBP-5) se unen con alta afinidad tanto a hidroxiapatita como a IGF. Por tanto, la reabsorción ósea (tal como con TGF-\beta3) libera IGF activos que posteriormente estimulan células osteogénicas de una manera paracrina. Mohan (1993). Aunque se sabe mucho sobre ambos el almacenamiento de factores de crecimiento osteogénicos en el hueso y, en muchos casos, de su producción por los osteoblastos, se entiende poco con respecto a su papel relativo en la formación ósea.
Tal como se mencionó, IGF-II y TGF-\beta representan el primer y segundo mitógenos más abundantes en la matriz extracelular (ECM) ósea humana. De manera importante, los IGF se desregulan en la osteoporosis postmenopáusica (Komori et al., 1997), y se reducen durante la restricción calórica. Bourrin et al. (2000). Los IGF se sintetizan por osteoblastos y como tales pueden servir para funciones autocrinas o paracrinas. Farley et al. (2000). Además, los osteoblastos responden a señales hormonales tales como aumento de la hormona del crecimiento o calcitonina aumentando la síntesis de IGF. Farley et al. (2000); Conover (1996). De manera celular, los IGF funcionan para estimular la proliferación de osteoblastos (Farley, 2000; Thomas et al., 1999; Zambonin et al., 1999), activando MAP quinasas tales como ERK-1 y ERK-2 (Chaudhary y Avioli, 1998) y dirigiéndose a genes de respuesta temprana tales como c-myc (Conover Bale, 1998). Los papeles de los IGF en la formación ósea son complejos, y los informes son a menudo contradictorios. Se entiende bien que los IGF funcionan con respecto a sus proteínas de unión (IGFBP). Las 6 IGFBP se unen a IGF con alta afinidad y, por tanto, inhiben la función de IGF. De manera interesante, las IGFBP muestran diferencias en el esqueleto o dependientes del sitio en su distribución (Malpe et al., 1997), produciendo los osteoblastos trabeculares humanos IGFBP3, IGFBP4 y IGFBP5 (Conover, 1996). El TGF-\beta puede ser parte de este bucle regulador ya que se sabe que ambos estimula el desarrollo de osteoblastos (Sporn y Roberts, 1985) e inhibe la producción de IGFBP 4 y 5 (Conover, 1996). En cambio, también se notifica que las IGFBP las acciones de IGF sobre el desarrollo de osteoblastos. Por tanto, se notifica que la internalización y tratamiento de IGFBP3 potencia de manera notable la señalización de receptor de IGF, pero requiere el tratamiento previo con IGFBP3 que, sola, no tiene ningún efecto. Igualmente, la IGFBP5 estimula la proliferación de osteoblasto in vitro o in vivo, sola o bien en combinación con IGF. Richman et al. (1999).
Existe poca información sobre las influencias del microentorno que regulan la participación de células de médula ósea en el linaje óseo. Uno de los requisitos obligatorios para la formación de tejido es la ordenación apropiada de señales de desarrollo dentro de una arquitectura tisular tridimensional. Por ejemplo, la condensación regulada por el desarrollo de condrocitos embrionarios conduce a su diferenciación y eventual establecimiento del esqueleto. De manera coherente con esto, los presentes inventores demostraron recientemente que la condensación celular tridimensional es esencial para la formación ex vivo de hueso humano. Se produce un proceso similar en las fases tempranas del cultivo de médula ósea a largo plazo (LTBMC) murino en el que el establecimiento de focos hematopoyéticos representa una estructura celular tridimensional. Sin embargo, se entienden mal el potencial de estos focos para convertirse en osteogénicos, y los factores del microentorno que regulan un proceso de este tipo.
Por tanto, los inventores establecieron LTBMC murino y analizaron con sondas su capacidad para expresar marcadores de osteogénesis. Han ampliado estos estudios de osteogénesis para explorar el control por el microentorno de la formación ex vivo de hueso. Adicionalmente, han desarrollado un sistema de volumen de cultivo menor (reduciéndolo de placas de cultivo tisular de 100 mm a unas de 35 mm) para permitir un mejor uso de osteoblastos humanos. Usando esta modificación sobre células murinas (que responden de manera menos robusta al TGF-\beta que la citocina sola), los inventores examinaron el papel de IGF en la modulación de este proceso. Al contrario que el sistema de cultivo humano, se observó osteogénesis murina usando médula ósea sin fraccionar y condiciones que contenían suero. Estas condiciones, aunque son diferentes, generan microespículas de naturaleza muy similar a las observadas en el sistema humano. Ya que los medios libres de suero, químicamente definidos son un refinamiento de cultivos que contienen suero, y la médula ósea humana también genera células osteogénicas, los datos murinos pueden extrapolarse directamente al ser humano.
De manera individual, el TGF-b (25 pM) y el IGF (15 pM) tienen poca capacidad para impulsar la osteogénesis murina, mientras que juntos dan como resultado un aumento notable (8 veces) de focos de microespículas positivas de von-Kossa por cultivo (figura 10). Debe observarse que sólo IGF + TGF-\beta da como resultado la formación de microespículas; otras condiciones sólo generan mineralización positiva de von Kossa de la matriz, pero ninguna evidencia de formación ósea. En el plazo de una semana, los LTBMC normales (cultivos Dexter) muestran números notables de focos en desarrollo que expresan dos marcadores de osteogénesis: presencia de colágeno (tal como se detecta mediante la reacción de tinción de Masson), y una reacción de tinción de von Kossa positiva que detecta la presencia de fosfato de calcio. Estos cultivos también mostraron la presencia de estructuras cristalinas (denominadas microespículas) que consisten en hueso murino organizado, microcristalino. Las células endoteliales son fuentes importantes de citocinas para células tanto hematopoyéticas como de osteogénesis. Se sabe que un regulador importante de células endoteliales, VEGF, afecta tanto a células endoteliales como al desarrollo de células óseas (aunque no queda claro si esto último es un efecto directo). La adición de VEGF (10 ng/ml) a LTBMC da como resultado un aumento del 75-80% en el número de focos en desarrollo positivos para colágeno y positivos para von Kossa por cultivo. De manera importante, VEGF también estimula un aumento en el número de microespículas por cultivo, generando un aumento de aproximadamente 5 veces en el número de microespículas por cultivo a lo largo de las tres primeras semanas de cultivo. Además, el VEGF aumenta 2,5 veces el número de focos celulares de von Kossa lo que sugiere que VEGF está implicado en la mineralización. Los inventores concluyen que el LTBMC murino puede establecerse en condiciones que promueven la osteogénesis. El uso de estos cultivos para detallar las influencias reguladoras que regulan la participación de células madre en el linaje osteogénico será importante para entender las complejidades del desarrollo de células óseas.
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Claims (17)

1. Un procedimiento para producir hueso ex vivo, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) cultivar una célula osteogénica o célula precursora de hueso en medios que contienen suero;
b) recoger la célula;
c) cultivar dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos y calcio, en el que el cultivo según la etapa c) se inicia inmediatamente tras la etapa b);
en el que el procedimiento de cultivo celular se inicia a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas, oscilando dichas densidades entre aproximadamente 1,0 x 10^{3} y aproximadamente 1,0 x 10^{6} células por cm^{2}, mediante lo cual se forma hueso por células dentro de dicho esferoide de células óseas.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la célula osteogénica o célula precursora de hueso es de origen humano, bovino, equino, canino, felino, murino, de rata o de pollo.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el factor de crecimiento es TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta1.2, VEGF, factor de crecimiento similar a la insulina I o II, BMP2, BMP4, BMP7, hormona paratiroidea, calcitonina, interleucina-6, o interleucina-11.
4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo además el procedimiento la etapa de purificar la célula osteogénica o célula precursora de hueso mediante técnicas de separación fisicoquímicas, en particular mediante separación por densidad en el equilibrio o mediante aislamiento por inmunoafinidad, utilizando preferiblemente el aislamiento por inmunoafinidad la adhesión inmunitaria, cromatografía en columna inmunitaria o clasificación de células activadas por fluorescencia, o utilizando anticuerpos frente a osteocalcina, osteonectina o fosfatasa alcalina, o combinaciones de las mismas.
5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además el procedimiento la etapa de
d) eliminar los elementos celulares del esferoide de células óseas formado.
6. Uso de un esferoide de células óseas, que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la fabricación de un producto farmacéutico para tratar enfermedades óseas en un mamífero.
7. El uso según la reivindicación 6, en el que el producto farmacéutico se formula en un gel de alginato, en un gel de colágeno, en un gel de fibrina, en poli(ácido láctico), en poli(ácido glicólico) o en PGLA.
8. El uso según las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el producto farmacéutico se formula para su administración en o junto con hidroxiapatita, otros compuestos de apatita, hueso de animal desvitalizado, hueso humano desvitalizado o estructuras cerámicas porosas.
9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el producto farmacéutico se formula para su administración junto con cirugía ortopédica y/o dispositivos ortopédicos, tales como implantes de cadera, implantes de rodilla o fusiones vertebrales, junto con cirugía oral y/o implantes dentales, junto con cirugía plástica o junto con reparaciones periodontales.
10. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el producto farmacéutico se formula para su administración en tejido de formación de hueso o en una herida.
11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la enfermedad ósea es osteoporosis, deficiencia de vitamina D, osteítis deformante, o enfermedad de Von Recklinghausen.
12. El procedimiento según la reivindicación 1, comprendiendo además el procedimiento la etapa de:
b1) poner en contacto dicha célula con un vector recombinante que dirige la expresión de una proteína que modifica la formación de esferoides de células óseas, en el que dicha etapa b1) tiene lugar antes de la etapa c).
13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha proteína que potencia la formación de esferoides de células óseas es TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta1.2, PTH, calcitonina, interleucina-6, interleucina-11, BMP2, BMP4, BMP7, colágeno, osteonectina, osteopontina, sialoproteína ósea, osteocalcina, factores de crecimiento similares a insulina I o II, VEGF, cadenas \alpha de integrina, cadenas \beta de integrina, selectinas, fibronectina, trombospondina, o cadherina.
\newpage
14. El procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, comprendiendo además el procedimiento la etapa de
d) eliminar los elementos celulares del hueso formado ex vivo.
15. Un procedimiento para identificar un gen implicado en la formación ósea, reparación ósea y/o enfermedad ósea, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) cultivar una célula osteogénica o célula precursora de hueso en medios que contienen suero;
b) recoger la célula;
c) cultivar dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de uno o más factores de crecimiento de la superfamilia de genes de TGF-\beta, en el que el cultivo según la etapa c) se inicia inmediatamente tras la etapa b);
d) mantener los cultivos celulares a densidades celulares que permiten la formación de un esferoide de células óseas; y
e) identificar un gen que se sobreexpresa o se subexpresa durante la formación de un esferoide de células óseas y no se expresa de esa manera en la célula osteogénica o célula precursora de hueso sin tratar.
16. Un procedimiento para identificar un modulador de formación ósea, reparación ósea y/o enfermedad ósea, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) cultivar una célula osteogénica o célula precursora de hueso en medios que contienen suero;
b) recoger la célula;
c) cultivar dicha célula en condiciones libres de suero en presencia de un modulador candidato en ausencia o en presencia de uno o más factores de crecimiento osteogénicos, en el que el cultivo según la etapa c) se inicia inmediatamente tras la etapa b);
d) medir la formación de esferoides de células óseas; y
e) comparar la formación de esferoides de células óseas con la observada en ausencia del modulador.
17. Un esferoide de células óseas, que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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