ES2301788T3 - Detector desechable de volumenes submicrolitos con orificio de entrada de muestra mejorado. - Google Patents

Abstract

Una tira de electrodo de un solo uso para el análisis de una muestra de fluido comprendiendo: una tira laminada que tiene un primer extremo de tira (110), un segundo extremo de tira (120) y una abertura de ventilación (42) a una distancia de dicho primer extremo de tira, comprendiendo dicha tira laminada una capa base (20) que tiene una capa conductora (21) dispuesta sobre la misma, teniendo dicha capa conductora (21) líneas grabadas (27, 28) delineadas sobre la misma y formando por lo menos dos vías de electrodos (22, 23, 24), una capa formadora de un canal (100), dispuesta sobre dicha capa base, y una cubierta (40); un canal (112) cerrado entre dicho primer extremo de tira (110) y dicha abertura de ventilación (42), estando dimensionado dicho canal cerrado (112) para contener un volumen de dicha muestra de fluido inferior a un microlitro, dejando expuesta dicho canal cerrado una porción de cada una de las dos vías de electrodo mencionadas (22, 23, 24); una matriz de reactivo (50) que contiene por lo menos una enzima, un estabilizador, en la que dicho estabilizador es un polialquilenglicol, y un mediador redox dispuesto sobre dicha capa base en dicho canal cerrado; contactos conductores (122, 123, 124) en dicho segundo extremo de tira (120) y aislados de dicho canal cerrado, caracterizado porqué dicha cubierta (40) comprende una entalla semicircular (44) en dicho primer extremo de tira (110).

Description

Detector desechable de volúmenes submicrolitros con orificio de entrada de muestra mejorado.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a sensores electroquímicos que se pueden utilizar para la cuantificación de un componente específico o analito en una muestra líquida. En particular, esta invención se refiere a un nuevo y mejorado sensor electroquímico y a un nuevo y mejorado método para fabricar sensores electroquímicos. Más concretamente, la invención se refiere a un sensor electroquímico de un solo uso que es de fabricación económica. Todavía más concretamente, esta invención se refiere a un sensor electroquímico de un solo uso que proporciona lecturas precisas y requiere solamente unos 0,2 microlitros de muestra de fluido. De nuevo todavía más en concreto, esta invención se refiere a sensores electroquímicos de un solo uso que se utilizan para realizar ensayos electroquímicos para la determinación precisa de analitos en fluidos fisiológicos.

2. Descripción de la técnica anterior

Durante más de tres décadas se han utilizado biosensores para la determinación de concentraciones de varios analitos en fluidos. El análisis de glucosa en sangre es de especial interés. Se conoce bien que la concentración de glucosa en sangre es extremadamente importante para mantener la homeostasis. Los productos que miden las fluctuaciones de azúcar, o los niveles de glucosa, en la sangre de una persona se han convertido en necesidades diarias para muchos de los millones de diabéticos de la nación. Debido a que este trastorno puede causar peligrosas anomalías en la química de la sangre, y se cree que contribuye a la pérdida de visión y al fallo de los riñones, la mayoría de los diabéticos necesitan analizarse ellos mismos periódicamente y ajustar su nivel de glucosa de acuerdo con el resultado, normalmente mediante inyecciones de insulina. Si la concentración de glucosa está por debajo del intervalo normal, los pacientes pueden sufrir pérdida de conciencia y tensión arterial baja lo cual puede concluir incluso en muerte. Si la concentración de glucosa en ayunas es mayor que el intervalo normal, puede causar pérdida de visión, fallo renal y enfermedades vasculares. Por tanto, el análisis de los niveles de glucosa en la sangre se ha convertido en una necesidad diaria para los individuos diabéticos que controlan su nivel de glucosa en sangre mediante la terapia con insulina.

Los pacientes que dependen de la insulina son instruidos por los médicos para comprobar sus niveles de azúcar en sangre hasta cuatro veces al día. Para acomodar un estilo de vida normal a la necesidad de comprobar frecuentemente los niveles de glucosa, se hizo posible el análisis doméstico de glucosa en sangre mediante el desarrollo de tiras reactivas para el análisis de sangre completo.

Un tipo de biosensores para glucosa en sangre es un electrodo de enzima combinado con un compuesto mediador que transporta electrones entre la enzima y el electrodo, dando lugar a una señal de corriente medible cuando está presente la glucosa. Los mediadores usados más comúnmente son la ferriciandida potásico, el ferroceno y sus derivados, así como otros complejos metálicos. Se han dado a conocer muchos sensores basados en este segundo tipo de electrodo. El documento US 6287451 describe una tira de electrodo de este tipo para el análisis de una muestra fluida.

Sin embargo, muchos de los dispositivos de la técnica anterior precisan un volumen de muestra mayor de 2 microlitros. Este volumen de muestra solo se puede obtener de un paciente, por ejemplo utilizando una aguja o una jeringuilla, o pinchando una parte de la piel tal como la punta de un dedo y "ordeñando" el área para obtener un volumen útil. Estos procedimientos son molestos para el paciente y con frecuencia dolorosos, en particular cuando se precisan muestras con frecuencia. Se conocen otros métodos menos molestos para obtener una muestra, tales como pinchar el brazo o el muslo que tienen menor densidad de terminaciones nerviosas. Sin embargo el pinchazo del cuerpo en el brazo o en el muslo produce normalmente volúmenes de muestra por debajo del microlitro, debido a que estas áreas no están abundantemente provistas de vasos sanguíneos próximos a la superficie. Puesto que la presente invención precisa tan solo 0,2 microlitros de sangre, permite no solo la obtención de muestras de la punta del dedo con mucha menos molestia, sino que permite obtener muestras de sangre adecuadas en otros lugares alternativos.

Otras deficiencias de los dispositivos de la técnica anterior son que tienen un intervalo lineal más limitado, normalmente hasta 600 mg/dL. Además, requieren de un tiempo de espera relativamente largo antes de obtener una lectura. Otra deficiencia de los biosensores que tienen un extremo o una entrada lateral para la introducción directa de la muestra de sangre en la cámara de muestra desde la fuente de la gota de sangre, es la obstrucción inadvertida o la obstrucción parcial de la entrada por la fuente de sangre.

Los usuarios tienden a presionar fuertemente el biosensor contra el punto de toma de muestra de la sangre, tal como el dedo o el brazo. Debido a que la entrada al canal capilar del biosensor es pequeña, esta acción normalmente obstruye total o parcialmente la entrada. El resultado es que (1) la sangre no entra en absoluto en el canal capilar, o (2) la sangre entra parcialmente en el canal pero no lo llena suficientemente, o (3) la sangre llena el canal capilar muy lentamente. En el escenario (1), el medidor puede no inicializarse y no se obtiene lectura. En los escenarios (2) y (3), el medidor puede no inicializarse o puede inicializarse pero da una medición inexacta debido a la muestra insuficiente o a la lentitud de la acción de llenado capilar.

El documento US-A-5,997,817 da a conocer una tira electrodo para examinar una muestra fluida comprendiendo una entalla en la cubierta. La entalla tiene una forma triangular.

Es un objeto de la presente invención el proporcionar una tira electrodo de un solo uso para el análisis una muestra de fluido con una adquisición de muestra mejorada.

La tira electrodo de un solo uso de acuerdo con la presente invención está definida en la reivindicación 1.

Las realizaciones preferidas de este electrodo de un solo uso están descritas en las reivindicaciones dependientes de la 2 a la 19. La reivindicación 20 describe un método para fabricar dicha tira de electrodo de un solo uso.

Resumen de la invención

La tira de electrodo tiene un cuerpo laminado alargado con una canal de fluido de muestra conectado entre una abertura en un extremo del cuerpo laminado y un agujero de ventilación a una distancia de la abertura. El canal de fluido de muestra está dimensionado para optimizar el flujo rápido en el canal de una muestra tal como sangre completa. Dentro del canal de fluido se encuentra por lo menos un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, preferentemente un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un pseudo electrodo de trabajo. La disposición del electrodo de trabajo y del electro de referencia no es importante para los resultados obtenidos del sensor electroquímico. El electrodo de trabajo, el electrodo de referencia y el pseudo electrodo de trabajo están cada uno de ellos respectivamente en contacto con conductos conductores separados. Los conductos conductores separados terminan y están descubiertos por el extremo opuesto al extremo con el canal abierto del cuerpo laminado, para efectuar la conexión eléctrica con un dispositivo de lectura.

El cuerpo laminado tiene una capa aislante de base hecha de una material plástico. La capa aislante de base tiene una capa conductora por una cara, La capa conductora puede depositarse sobre la capa aislante mediante serigrafía, deposición de vapor o por cualquier otro método que proporcione una capa conductora que se adhiera a la capa aislante de base y cubra sustancialmente toda la capa aislante de base. La capa conductora obtenida por deposición de vapor se separa en conductos conductores mediante decapado/grabado de la capa conductora. El proceso de decapado puede realizarse químicamente, mediante el grabado mecánico de líneas en la capa conductora, mediante la utilización de un láser para trazar la capa conductora con conductos conductores separados, o por cualquier medio que provoque una separación intermedia y entre los conductos conductores separados requeridos por la presente invención. Los recubrimientos conductores preferidos son una película de oro o una capa/película compuesta de óxido de estaño/oro.

Debe mencionarse que la película de oro o la película de óxido de estaño/oro misma, no puede funcionar como electrodo de referencia. Para que funcione el electrodo de referencia, cuando se aplica un potencial eléctrico debe existir una reacción redox (por Ej., Fe(CN)_{6}^{3-} + e^{-} \Pi Fe(CN)_{6}^{4-}) en el material conductor eléctrico. Por lo tanto, en el material conductor utilizado para el electrodo de referencia debe estar presente un par redox o un mediador.

La característica única de la presente invención es su capacidad para medir tamaños de muestra de hasta 0,10 microlitros o menores, sin utilizar contra electrodos de trabajo, ni electrodos de referencia, ni una capa de malla/sorbente entre ellos para reducir el volumen de muestra necesario para la medición. Esto se consigue reduciendo el ancho y la longitud del recorte en forma de "U" y utilizando una capa intermedia más delgada.

El cuerpo laminado tiene también una capa aislante intermedia sobre la capa base. La capa intermedia está hecha también de material plástico aislante y crea el canal de fluido de muestra del cuerpo laminado. En un extremo tiene un recorte en forma de "U" que está situado encima de la porción de electrodo de los conductos conductores de la capa base y con el extremo abierto correspondiendo con el extremo abierto del cuerpo laminado descrito anteriormente.

La capa intermedia debe tener suficiente espesor para cargar una cantidad suficiente de reactivo químico para utilizar como sensor electroquímico, mientras que las dimensiones del canal de flujo se mantienen con las dimensiones óptimas para el flujo de la sangre. El recorte en forma de "U" contiene reactivo químico. El reactivo químico tiene un mediador redox con por lo menos un estabilizador, un ligante, un tensoactivo, un tampón y una enzima capaz de catalizar una reacción que implica un sustrato para una enzima. El mediador redox es capaz de transferir electrones entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo. También hace la función de electrodo de referencia.

El cuerpo laminado de la presente invención tiene una capa superior con una abertura de ventilación y una entalla de entrada. La abertura de ventilación está situada de modo que por lo menos una porción de la abertura de ventilación se encuentra sobre la parte inferior de la ranura en forma de "U" dejando expuesta una porción del reactivo químico de la capa intermedia aislante. La ventilación permite que el aire de dentro del canal de fluido de muestra escape a medida que el fluido de muestra entra por el extremo abierto del cuerpo laminado. La muesca de entrada facilita la introducción de la muestra a través de la entrada gracias a la creación de una abertura de entrada en la parte superior, que está en comunicación con el extremo de la entrada del sensor. En el caso de que inadvertidamente la admisión de sangre fuera obstruida por la fuente de la muestra de sangre, tal como el dedo, la muesca de entrada permanece abierta para recibir el fluido de muestra.

En general el fluido de muestra llena el canal de fluido de muestra por capilaridad. En situaciones de volúmenes pequeños, el alcance de la acción capilar depende de la naturaleza hidrófoba/hidrófila de las superficies en contacto con el fluido sujeto a la acción capilar. Esto se conoce también como la mojabilidad del material. Las fuerzas capilares se refuerzan bien mediante el uso de un material aislante hidrófilo para formar la capa superior, o bien recubriendo por lo menos una porción de una cara de un material aislante hidrófobo con una sustancia hidrófila en el área de la capa superior dirigida hacia el fluido de muestra, entre el extremo abierto del cuerpo laminado y la abertura de ventilación de la capa superior. Debe entenderse que se puede recubrir toda una cara de la capa superior con la sustancia hidrófila y a continuación pegarla sobre la segunda capa intermedia.

Las porciones de electrodo situadas dentro del canal de fluido de muestra contienen un material reactivo para el electrodo de trabajo (W), el electrodo de referencia (R) y el pseudo electrodo de trabajo (W_{0}). En el canal de fluido se dispone una mezcla reactiva cubriendo de este modo las porciones de electrodo de la capa aislante de base y los conductos conductores. En el recorte en forma de "U" de la capa aislante intermedia se deposita una cantidad suficiente de mezcla reactiva para cubrir sustancialmente toda la superficie conductora delineada por el recorte en forma de "U". La cantidad de mezcla reactiva utilizada es tal que la matriz reactiva creada después de su secado es suficiente para su uso como sensor electroquímico y además proporciona espacio libre sobre la matriz de reactivo para permitir un flujo rápido a través del canal de fluido. La matriz de reactivo tiene un mediador redox con por lo menos un estabilizador, un ligante, un tensoactivo, un tampón y una enzima capaz de catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima.

Las posibles disposiciones de electrodos en el canal de fluido pueden ser W-R-W_{0}, W-W_{0}-R, R-W-W_{0}, R-W_{0}-W, W_{0}-W-R, o W_{0}-R-W, estando listados los electrodos tal como la disposición de electrodos aparecería desde el extremo abierto del cuerpo laminado hacia la abertura de ventilación. Se encontró que la posición preferida era W-R-W_{0}, es decir a medida que el fluido de muestra entra por el extremo abierto del cuerpo laminado, el fluido cubre primero W, luego R y después W_{0}.

El pseudo electrodo de trabajo está en una posición de manera que el fluido de muestra lo alcanza el último. Así la corriente resultante en W_{0} inicializa el aparato de medida para empezar la medición y el proceso de determinación de la concentración de analito. Esta disposición evita problemas de fiabilidad y de precisión debidos a una cantidad de fluido de muestra insuficiente. Debe mencionarse que W_{0} puede utilizarse también como contra electrodo. El sistema de tres electrodos resultante (es decir, electrodo de trabajo, electrodo de referencia y contra electrodo) se utilizaría en el caso de un fluido de muestra con una gran caída de IR. También debe mencionarse que la impedancia entre cualquier par de electrodos puede utilizarse para estimar el hematocrito de una muestra de sangre y por lo tanto para corregir la interferencia del hematocrito.

Todas las ventajas de la presente invención quedarán más claras mediante la revisión de la descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones anexos.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es una vista en perspectiva de la presente invención mostrando el extremo abierto, la ventilación y los puntos de contacto eléctrico del cuerpo laminado.

La Fig. 2 es una vista explosionada en perspectiva de la presente invención mostrando las varias capas del cuerpo laminado.

La Fig. 3 es una vista en sección recta de la presente invención mostrada en la Fig. 1.

Las Figs. 4A, 4B, y 4C son vistas desde arriba de un segmento de una tira de cada capa de la presente invención, mostrando los patrones para obtener múltiples sensores de la presente invención.

La Fig. 4D es una vista desde arriba de un segmento de la tira laminada de la presente invención, mostrando los patrones para obtener múltiples sensores de la presente invención.

Descripción detallada de la realización preferida

La realización preferida de la presente invención está ilustrada en las Figs. 1-4. la Fig. 1 muestra un sensor 10 de la presente invención. El sensor 10 tiene un cuerpo laminado 100, un extremo de muestreo de fluido 110, un extremo de contactos eléctricos 120 y una abertura de ventilación 42. El extremo de muestreo de fluido 110 incluye un canal de fluido de muestra 112 entre una abertura de extremo de muestreo de fluido 114 y la abertura de ventilación 42. El extremo de muestreo 110 incluye también una entalla de entrada 44. El extremo de contactos eléctricos 120 tiene tres contactos conductores discretos 122, 123 y 124.

Refiriéndonos ahora a la Fig. 2, el cuerpo laminado 100 está compuesto de una capa aislante de base 20, una capa intermedia 30 y una capa superior 40. Todas las capas están hechas de material dieléctrico, preferentemente de plástico. Son ejemplos de material dieléctrico preferido: cloruro de polivinilo, policarbonato, polisulfona, nylon, poliuretano, nitrato de celulosa, propionato de celulosa, acetato de celulosa, acetato butirato de celulosa, poliéster, acrílico y poliestireno. La capa aislante de base 20 tiene una capa conductora 21 sobre la que se ha grabado un primer conducto conductor 22, un segundo conducto conductor 23 y un tercer conducto conductor 24. Los conductos conductores 22, 23 y 24 pueden formarse trazando o marcando la capa conductora 21 tal como se ilustra en la Fig. 2 y se muestra como la línea grabada 27 y 28, o bien serigrafiando los conductos conductores 22, 23 y 24 sobre la capa base 20. El grabado o marcado de la capa conductora 21 puede hacerse trazando mecánicamente la capa conductora 21 lo suficiente para crear los tres conductos independientes 22, 23, 24. El método preferido en la presente invención para trazar o marcar consiste en el uso de un láser de dióxido de carbono (CO_{2}), un láser YAG o un láser Excimer. Con el fin de evitar potenciales problemas de estática que podrían dar lugar a una señal con ruido, se puede hacer una línea de marcaje 29 adicional (aumentada y no a escala; solo para ilustración) pero que no es necesaria para la funcionalidad del sensor 10, a lo largo del borde exterior de la capa base 20. La capa conductora 21 puede hacerse con cualquier material eléctrico conductor, preferentemente oro u oro/óxido de estaño. Un material que se puede utilizar para la capa base 20 es una película de poliéster oro/óxido de estaño (nº cat. FM-1) o una película de poliéster oro (nº cat. FM-2) comercializado por Courtaulds Performance Films, Canoga Park, California.

La capa intermedia 30 tiene un recorte en canal en forma de "U" 32 situado en el extremo de sensor 31 de la capa intermedia. El recorte en forma de "U" puede hacerse utilizando un láser o un troquel. La longitud del recorte en canal 32 es tal que cuando la capa intermedia 30 se deposita sobre la parte superior de la capa base 20, las áreas de electrodo W, R y W_{0} se encuentran dentro del espacio definido por el recorte en canal 32. Se descubrió que el espesor de la capa intermedia 30 era crítico para el volumen del canal capilar y para la velocidad del fluido de muestra en el canal 112, que se llena por la acción capilar del fluido de muestra. El recorte en canal 32 soporta la matriz de reactivo 50, mostrada más claramente en la Fig. 3, formando el electrodo de trabajo, el electrodo de referencia y el pseudo electrodo de trabajo. Típicamente la matriz de reactivo 50 debe estar cargada con un mediador redox para hacer la función de electrodo de referencia. Si R no está cargado con un reactivo redox o mediador, los electrodos de trabajo W y W_{0} no funcionarán. Las áreas de electrodo W, W_{0} y_{ }R están cargadas preferentemente con el mismo reactivo químico. Los reactivos contienen preferentemente una forma oxidada de un mediador redox, un estabilizador, un ligante, un tensoactivo, un tampón, y una enzima. Típicamente el mediador redox puede ser por lo menos uno entre ferroceno, ferrocianuro potásico, otros derivados de ferroceno, u otros mediadores redox orgánicos e inorgánicos. El estabilizador preferido es polietilenglicol, el ligante preferido es metilcelulosa, el tensoactivo preferido es t-octilfenoxipolietoxietanol, y el tampón preferido es un tampón de citrato. La enzima es capaz de catalizar una reacción en la que participan un sustrato para la enzima o un sustrato reactivo catalíticamente con una enzima y un mediador capaz de transferir los electrones transferidos entre la reacción catalizada por la enzima y el electrodo de trabajo para crear una corriente representativa de la actividad de la enzima o sustrato y representativa del compuesto. La enzima puede ser glucosa oxidasa, lactato oxidasa, colesterol oxidasa y creatinina amidohidrolasa.

La capa superior 40 se coloca sobre la capa intermedia 30 teniendo la misma extensión que ésta, y está dotada de una abertura de ventilación 42 a una distancia del extremo de muestreo 110 del sensor 10, con el fin de asegurar que el fluido de muestra en el canal de fluido 112 cubrirá completamente la áreas de electrodo W, R y W_{0}. La abertura de ventilación 42 está situada en la capa superior 40 de modo que queda alineada aproximadamente con la parte inferior del recorte en canal 32 de la capa intermedia 30, siendo la parte inferior aquella parte del recorte en canal 32 que está más alejada del extremo del sensor 31. Preferentemente, la abertura de ventilación 42 dejará descubierta y cubrirá parcialmente una porción del recorte en forma de "U" 32 de la capa intermedia 30.

La capa superior 40 incluye también una entalla de entrada 44 en el extremo de muestreo 110 del sensor 10. La entalla de entrada 44 se incluye para facilitar la carga de la muestra en el canal de fluido 112 cuando la abertura del extremo de muestreo 114 pudiera bloquearse inadvertidamente, impidiendo si no estuviera presente la entalla de muestreo 44, que el fluido de muestra entrase en el canal de fluido 112. La entalla de muestreo 44 puede tener cualquier forma y no está limitada a la forma semicircular mostrada. La abertura de ventilación y la entalla de entrada pueden obtenerse utilizando un láser o por corte con troquel.

La Fig. 3 muestra una vista en sección recta ampliada de varias capas de la presente invención. Las capas no están a escala con el fin de que la relación de cada componente de la presente invención pueda ser entendida mejor por los expertos en la materia, especialmente las líneas grabadas 27 y 28.

Preparación de la Matriz de Reactivo Electrodo

La matriz de reactivo electrodo comprende la forma oxidada de un mediador redox, un estabilizador, un ligante, un tensoactivo, un tampón, y una enzima. Se encontró que la forma oxidada del mediador redox, ferrocianuro potásico, era estable en la matriz. La empresa Sigma Chemical, St. Louis, MO (No. cat. P3667) suministra un ferrocianuro potásico adecuado. La cantidad utilizada en la formulación debe ser suficiente para obtener un intervalo linear operativo. La enzima debe tener también actividad, pureza y estabilidad suficientes. La empresa Biozyme, san Diego, California suministra con el No. cat. G03A con unos 270 U/mg una glucosa oxidasa. El estabilizador deber ser suficientemente soluble en agua y capaz de estabilizar tanto el mediador como la enzima. El estabilizador preferido el polietilenglicol (Sigma Chemical, St. Louis, MO, No. cat. P4338). El ligante debe ser capaz de unir el resto de productos químicos en la matriz reactiva con la capa/superficie conductora 21 de la capa base 20 en las áreas de electrodo W, R y W_{0}. El ligante preferido es Methocel 60 HG (Fluka Chemical, Milwaukee, WI, No. cat. 64655). La solución tampón debe tener suficiente capacidad tampón y valor de pH para optimizar la reacción de la enzima. Se prefiere un tampón de citrato 0,05M. El ácido cítrico y el citrato sódico utilizados para obtener el tampón cítrico se pueden obtener en Sigma Chemical. El tensoactivo es necesario para facilitar el suministro de la matriz de reacción de electrodo al recorte en canal 32 así como para disolver rápidamente los reactivos químicos secos implicados en la composición de la matriz de reacción. La cantidad y el tipo de tensoactivo se seleccionan para asegurar las funciones previamente mencionadas y para evitar un efecto desnaturalizador sobre la enzima. El tensoactivo preferido es Triton X-100 suministrado por Fluka Chemical, Milwaukee, WI (No. cat. 94443). La matriz de reacción se obtiene preparando una matriz de reacción del siguiente modo:

Paso 1:

preparar un tampón de citrato 50 mM (pH 5,7) disolviendo 0,1512 gramos de ácido cítrico y 1,2580 gramos de citrato sódico en 100 ml de agua desionizada.

Paso 2:

preparar una solución del 1% de methocel 60 HG agitando 1 gramo de methocel en 100 ml de la solución tampón de citrato del paso 1, durante 12 horas.

Paso 3:

añadir 0,3 ml de Triton X-100 al 10% a la solución de methocel.

Paso 4:

añadir 2,5 gramos de polietilenglicol a la solución del paso 3.

Paso 5:

mientras se agita, añadir 6,5 gramos de ferrocianuro potásico a la solución del paso 4.

Paso 6:

añadir 1,0 gramos de glucosa oxidasa a la solución del paso 5 y agitar 10 minutos hasta que todos los materiales sólidos se han disuelto completamente.

Construcción del Electrodo

Se corta con la forma final una película de poliéster oro u óxido de estaño/oro suministrado por Courtaulds Performance Films, tal como muestra la Fig. 2, obteniendo la capa base 20 del sensor 10. Se utiliza un láser de CO_{2} para marcar la película de poliéster oro u óxido de estaño/oro (láser 25W suministrado por Synrad, Inc., San Diego, CA). Tal como se muestra en la Fig. 2, la película se marca con el láser creando la línea de marca 27 y 28 de modo que se forman dos electrodos en el extremo de muestreo de fluido 110 y tres puntos de contacto 122, 123 y 124 en el extremo de contacto eléctrico 120. La línea de marca es muy fina pero suficiente para crear dos conductores eléctricos separados. Se puede hacer una línea de marca adicional 29, pero que no es necesaria, a lo largo del borde exterior de la capa base 20 para evitar potenciales problemas estáticos que causarían una señal con ruido en el sensor final 10.

Se corta a medida y con la forma final un trozo de cinta de doble cara (Aracare® 7840) suministrada por Adhesive Research, Glen Rock, PA, formando la capa intermedia 30 con el canal en forma de "U" 32 de modo que cubrirá la mayor parte de la capa conductora 21 de la capa base 20 excepto para dejar expuesta una pequeña área de contacto eléctrico en el extremo de contacto eléctrico 120 ilustrado en la Fig. 1. El canal en forma de "U" 32 se corta utilizando el láser CO_{2}. Se coloca a continuación la capa intermedia 30 sobre la capa base 20. Como se mencionó anteriormente, esta capa intermedia 30 sirve como separador y define las dimensiones del canal de muestra de fluido 112. También define el área de electrodo 26 que soporta la matriz de reactivo de electrodo 50. Su ancho y su longitud están optimizados para proporcionar una muestra de fluido que se mueva relativamente rápida. Las dimensiones del canal en forma de "U" 32 son alrededor de 0,039 pulgadas (1,0 mm) de ancho por alrededor de 0,134 pulgadas (3,4 mm) de largo. Sin embargo el ancho y largo del canal se pueden reducir de modo que el volumen de muestra pueda ser tan pequeño como 0,1 microlitros.

Se proveen 1,0 microlitros de mezcla reactiva en el canal 32 para formar los electrodos W, R y W_{0}. La mezcla reactiva es una mezcla de un mediador redox, un estabilizador, un ligante, un tensoactivo, un tampón, y una enzima. La composición preferida de la mezcla reactiva se obtiene mezclando los siguientes porcentajes de los ingredientes siguientes: alrededor de 6,5% en peso de ferrocianida potásico, alrededor de 2,5% en peso de polietilenglicol, alrededor de 1% en peso de methocel 60 HG, alrededor de 0,03% en peso de Triton X-100, alrededor de 0,05 M de tampón de citrato (pH 5,7), y alrededor de 1% en peso de glucosa oxidasa. Después de la adición de la matriz de reactivo, se secó el dispositivo en un horno a 55ºC aproximadamente durante 2 minutos.

Después del secado se conforma un trozo de película transparente (nº cat. PP2200 ó PP2500 suministrada por 3M) como capa superior 40. Se practican un agujero de ventilación rectangular 42 y una entalla semicircular 44 utilizando el láser CO_{2} mencionado anteriormente. El tamaño preferido para el agujero de ventilación 42 es alrededor de 0,039 pulgadas (1,0 mm) por 0,051 pulgadas (1,30 mm). El agujero de ventilación 42 está situado alrededor de a 0,087 pulgadas (2,2 mm) del extremo de fluido 110 del sensor 10. La entalla semicircular 44 tiene un radio de alrededor de 0,030 pulgadas (0,75 mm) y está rebajada en el extremo de fluido 110 del sensor 10. Para completar el montaje del sensor 10, tal como muestra la Fig. 1, se alinea y se pega la capa superior 40 sobre la capa intermedia 30.

Aunque la anterior descripción de la construcción del electrodo describe la construcción de un electrodo individual, el diseño y los materiales utilizados son ideales para fabricar varios sensores a partir de un trozo de cada uno de los materiales de capa tal como se muestra en las Figs. 4A-4C. Esto se realiza partiendo de un trozo relativamente grande de capa base 20 que tiene sobre ella una capa conductora 21. Se realizan múltiples líneas de marca 27 y 28 sobre la capa conductora 21 de modo que se crea un patrón repetitivo, tal como se muestra en la Fig. 4A, utilizando el método de grabado preferido descrito anteriormente, definiendo eventualmente cada patrón tres vías conductoras 22, 23, y 24 para cada sensor. De forma similar, se deposita sobre la capa base 20 un trozo grande de capa intermedia 30 que tiene múltiples recortes alargados 32 con un patrón repetitivo, tal como muestra la Fig. 4B. El trozo grande de capa intermedia 30 se dimensiona para ajustar sobre la capa base 20 de manera que las múltiples ranuras alargadas 32 estén alineadas sobre las áreas donde se cortan las líneas de grabado 27 y 28 dejando expuestas tres áreas de electrodo distintas W, R y W_{0}, y dejando expuestos los múltiples contactos eléctricos 122, 123 y 124 situados en el borde opuesto de la tira. Las dimensiones de cada recorte y la cantidad de mezcla reactiva dispuesto en cada canal 32 son similares a los dados a conocer anteriormente. Después de proveer la mezcla reactiva en las ranuras respectivas, se seca la mezcla reactiva de manera que cada ranura alargada 32 de la capa intermedia 30 contiene una fina capa de matriz de reactivo. Sobre la capa intermedia 30 se deposita una capa superior 40 de tamaño comparable y de la misma extensión que la capa intermedia 30, teniendo una pluralidad de aberturas de ventilación 42 y aberturas en forma de entalla 44' siguiendo un patrón repetitivo, tal como muestra la Fig. 4C. La Fig. 4D es una vista desde arriba de las capas combinadas. La tira laminada creada por las tres capas 20, 30 y 40 tiene una pluralidad de sensores 10 que se pueden cortar de la tira laminada. Se corta la tira laminada longitudinalmente a lo largo de la línea A-A' por el extremo de muestreo de fluido 210 para formar una pluralidad de aberturas de muestreo 114, y longitudinalmente a lo largo de la línea B-B' por el extremo de contacto eléctrico 220 para formar una pluralidad de contactos conductores 122, 123, y 124. La tira laminada se corta a intervalos predeterminados a lo largo de las líneas C-C' formando una pluralidad de sensores individuales 10. Si se desea, se puede dar forma al extremo de muestreo 120 de cada sensor 10, tal como se muestra en la Fig. 1. Los expertos en la materia entenderán que el orden con el que se corta la tira laminada no tiene importancia. Por ejemplo, la tira laminada puede cortarse a intervalos predeterminados (C-C') y luego, para completar el proceso, se pueden hacer los cortes a lo largo de A-A' y B-B'.

La patente US 6,258,229 proporciona una descripción más completa de las características de amplio intervalo lineal, precisión y volumen mínimo de muestra de la presente invención junto con parámetros de prueba adicionales y ejemplos.

Aunque aquí se hayan descrito las realizaciones preferidas, la descripción anterior es meramente ilustrativa. A los expertos en las materias respectivas se les ocurrirán otras modificaciones de la invención dada a conocer aquí, y todas estas modificaciones deben considerarse dentro del objeto de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (20)

1. Una tira de electrodo de un solo uso para el análisis de una muestra de fluido comprendiendo:

una tira laminada que tiene un primer extremo de tira (110), un segundo extremo de tira (120) y una abertura de ventilación (42) a una distancia de dicho primer extremo de tira, comprendiendo dicha tira laminada una capa base (20) que tiene una capa conductora (21) dispuesta sobre la misma, teniendo dicha capa conductora (21) líneas grabadas (27, 28) delineadas sobre la misma y formando por lo menos dos vías de electrodos (22, 23, 24), una capa formadora de un canal (100), dispuesta sobre dicha capa base, y una cubierta (40);

un canal (112) cerrado entre dicho primer extremo de tira (110) y dicha abertura de ventilación (42), estando dimensionado dicho canal cerrado (112) para contener un volumen de dicha muestra de fluido inferior a un microlitro, dejando expuesta dicho canal cerrado una porción de cada una de las dos vías de electrodo mencionadas (22, 23, 24);

una matriz de reactivo (50) que contiene por lo menos una enzima, un estabilizador, en la que dicho estabilizador es un polialquilenglicol, y un mediador redox dispuesto sobe dicha capa base en dicho canal cerrado;

contactos conductores (122, 123, 124) en dicho segundo extremo de tira (120) y aislados de dicho canal cerrado, caracterizado porque dicha cubierta (40) comprende una entalla semicircular (44) en dicho primer extremo de tira (110).

2. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que se selecciona dicha enzima entre el grupo consistente en glucosa oxidasa, lactato oxidasa, colesterol oxidasa, y creatinina amidohidrolasa.

3. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicho mediador redox es ferrocianuro potásico u otro mediador redox inorgánico u orgánico.

4. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicho recubrimiento conductor comprende oro y óxido de estaño.

5. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicha capa base, dicha capa formadora de un canal y dicha cubierta están hechas de material plástico dieléctrico.

6. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicho canal cerrado tiene un volumen de unos 0,2 microlitros.

7. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicha cubierta tiene un recubrimiento hidrófilo sobre por lo menos una cara.

8. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicha matriz de reactivo contiene además por lo menos uno entre un estabilizador, un ligante, un tensoactivo y un tampón.

9. La tira de electrodo de la reivindicación 8 en la que dicho estabilizador es un polialquilenglicol, dicho ligante es un material celulósico, y dicho tensoactivo es polioxietilen-éter.

10. La tira de electrodo de la reivindicación 9 en la que dicho estabilizador es polietilenglicol, dicho ligante es metilcelulosa, dicho tensoactivo es t-octilfenoxipolietoxietanol, y dicho tampón es un tampón de citrato.

11. La tira de electrodo de la reivindicación 10 en la que dicha matriz de reactivo está hecha de una mezcla que tiene componentes iniciales que comprenden desde alrededor de 1% en peso hasta alrededor de 6,5% en peso de dicho mediador redox, alrededor de 2,5% en peso de dicho estabilizador, alrededor de 1% en peso de dicho ligante, alrededor de 0,03% en peso de dicho tensoactivo, y alrededor de 1% en peso de dicha enzima en dicho tampón de citrato.

12. La tira de electrodo de la reivindicación 10 en la que dicho tampón de citrato está alrededor de 0,05M.

13. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicha capa formadora del canal tiene un espesor suficiente para optimizar el flujo de dicha muestra de fluido a lo largo de dicha vía abierta.

14. La tira de electrodo de la reivindicación 3 en la que dicho ferrocianuro potásico está en el 6,5% en peso.

15. La tira de electrodo de la reivindicación 2 en la que dicha enzima es glucosa oxidasa.

16. La tira de electrodo de la reivindicación 1 en la que dicha capa conductora tiene una tercera vía de electrodo sobre la misma y en la que dicho canal cerrado contiene un electrodo de trabajo, un pseudo electrodo de trabajo y un electrodo de referencia.

17. La tira de electrodo de la reivindicación 16 en la que dicho pseudo electrodo de trabajo es un contra electrodo.

18. La tira de electrodo de la reivindicación 16 en la que dicho pseudo electrodo es un electrodo de inicialización.

19. La tira de electrodo de la reivindicación 16 en la que el par de dicho pseudo electrodo de trabajo y dicho electrodo de referencia es un par de electrodos para la medición de resistencia.

20. Un método para fabricar una tira de electrodo de un solo uso que comprende los pasos siguientes:

grabar una pluralidad de líneas grabadas (27, 28) sobre un recubrimiento conductor (21) dispuesto sobre una cara de una capa base alargada (20) que tiene un extremo de electrodo y un extremo de contacto eléctrico formando por lo menos dos conductos eléctricos alargados a lo largo de la longitud de dicha capa base alargada (20), en la que dicha pluralidad de líneas grabadas (27, 28) delinean un primer conducto de dichos al menos dos conductos eléctricos, que tiene forma de "L" y un segundo conducto adyacente a dicho primer conducto, en la que dicho extremo en forma de "L" de dicho primer conducto y el extremo de dicho segundo conducto están en alineación axial con el eje central de la longitud de dicha capa base y están situados cerca de dicho extremo de electrodo;

disponer una capa formadora de un canal (100) sobre dicho primer recubrimiento conductor de dicha capa base (20), teniendo dicha capa formadora de un canal (100) una porción de extremo en forma de "U" que define una canal alargado central (112) dimensionado para dejar al descubierto una porción de dicho extremo en forma de "L" de dicho primer conducto y una porción de dicho segundo conducto, siendo dicha capa formadora de un canal (100) más corta en longitud que dicha capa base (20) de modo que una porción de cada uno de los por lo menos dos conductos alargados quedan descubiertos en dicho extremo de contacto eléctrico;

añadir una mezcla reactiva a dicho canal central cubriendo dichas porciones descubiertas de dichos conductos primero y segundo, teniendo dicha mezcla reactiva una enzima capaz de catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima;

secar dicha mezcla reactiva formando una matriz reactiva (50); y

disponiendo una capa superior (40) sobre dicha capa formadora de un canal (100), teniendo dicha capa superior una abertura de ventilación (42) a una distancia de dicho extremo de electrodo y una muesca (44) en dicho extremo de electrodo, formando dicha capa superior una entrada y un espacio capilar con dicha porción de extremo en forma de "U", en la que dicha ventilación (42) deja descubierta una porción de dicho canal central en el extremo de dicho espacio capilar opuesto a dicha entrada y dicha entalla deja descubierta una porción de dicho canal central en dicha entrada, en la que dicha cubierta (40) comprende una entalla semicircular (44).