ES2298843T3 - Uso de osteopontina en formulaciones dentales. - Google Patents

Abstract

El uso de osteopontina de leche para reducir o prevenir la proliferación bacteriana de la placa sobre el esmalte dental.

Description

Uso de osteopontina en formulaciones dentales.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones dentales. En particular, la invención se refiere al uso de osteopontina (OPN) para reducir significativamente la proliferación bacteriana de la placa sobre el esmalte dental.

Antecedentes de la invención

Se producen muchos problemas en relación con el cuidado de los dientes, cosméticamente así como terapéuticamente, tales como la formación de la placa dental, proliferación bacteriana en la placa dental, caries dental, sarro, enfermedad periodontal, y desmineralización de los dientes.

La placa dental es una biopelícula compleja que se acumula sobre los tejidos duros (dientes) en la cavidad bucal. Aunque más de 500 especies bacterianas comprenden la placa, la colonización sigue un patrón organizado, con la adhesión de los colonizadores iniciales a la película salival del esmalte, seguido de una colonización secundaria a través de la adhesión bacteriana. Es bien conocido que una serie de especies de estreptococos pertenece a los primeros colonizadores. Por lo tanto, es importante detener la adhesión de estas bacterias. Diversas adhesinas e interacciones moleculares sirven de base a las interacciones adhesivas, y contribuyen al desarrollo de la placa, y por último, a enfermedades tales como caries y enfermedad periodontal.

El esmalte de los dientes está comprendido de hidroxiapatita. En la boca, existe un equilibrio natural entre, por una parte, la hidroxiapatita que se disuelve desde el esmalte de los dientes y, por la otra, la hidroxiapatita que se forma sobre, o en los dientes, a partir de sustancias que se producen de manera natural en la saliva. Cuando el equilibrio es tal que se disuelve la hidroxiapatita, surge un estado cariógeno, al que se hace referencia como desmineralización.

Se conoce desde hace tiempo que la incorporación de iones fluoruro en el esmalte lo protege de la desmineralización. Por lo tanto, se incorpora con frecuencia fluoruro en la pasta de dientes. Sin embargo, el fluoruro puede provocar fluorosis, especialmente si el paciente ingiere la pasta de dientes u otro dentífrico o producto de higiene bucal, que es a menudo el caso, por ejemplo, para niños pequeños. También puede ser un problema en áreas con cantidades bastante altas de fluoruro en el agua potable.

El propósito de esta solicitud de patente es proponer el uso de una proteína láctea endógena, la osteopontina, añadida a una formulación dental, para detener o inhibir la proliferación de bacterias sobre la superficie dental, e impidiendo o reduciendo de ese modo la formación de la placa y la caries.

Hay un par de patentes que describen el uso de fracciones de proteínas lácteas, es decir, hidrolizados de caseína, fosfopéptidos de Ca (CPP), y glucomacropéptido (GMP), a partir del cuajo de la leche, para reparar el daño del esmalte, con la hipótesis de que actúan como un suministro de fosfato cálcico amorfo para el esmalte.

- El documento de patente WO 03/059304 propone un composición para el cuidado bucal, que contiene una fuente de iones fluoruro y una fracción de CPP. Esta formulación estabiliza el fosfato cálcico añadido a la formulación bucal en forma amorfa, y al mismo tiempo estabiliza la cantidad de fluoruro en la formulación.

- El documento de patente WO 00/07454 describe GMP que, añadido a una formulación alimenticia especial basada en la leche, tiene un efecto anticariógeno en ratas.

A diferencia de los péptidos CPP y GMP, la OPN introduce una nueva dimensión en la cavidad bucal, debido a su potencial para influir de manera bioactiva en la unión de organismos bucales al esmalte, e influir de este modo en el desarrollo de la caries. Como el CPP y GMP, la OPN tiene también un efecto en las cantidades de fosfato cálcico amorfo en la saliva disponible para la reparación dental.

La OPN tiene de este modo varias funciones en el contexto del cuidado dental.

La gran ventaja de usar OPN en, por ejemplo, pasta de dientes y colutorios, es que es un componente proteínico natural de la leche de bovino, y de este modo hay una necesitad limitada de ensayos clínicos.

Sumario de la invención

Se ha mostrado ahora de manera sorprendente, que la osteopontina usada en formulaciones bucales reduce la adherencia y proliferación bacterianas sobre las superficies del esmalte.

La invención trata de composiciones bucales, que contienen osteopontina, que incluyen pasta de dientes, colutorios, y chicles, así como composiciones relacionadas.

Descripción detallada de la invención

Un estudio in vitro, que usa un análogo dental de un disco de hidroxiapatita (HA) finamente pulido bañado en una disolución diluida de OPN, proporciona una película de OPN sobre la superficie de HA, que no puede retirarse lavando con agua. Cuando tales discos tratados se pusieron en contacto con saliva humana, se encontró sorprendentemente que la película de OPN redujo significativamente la adherencia y proliferación de bacterias sobre las superficies de análogos dentales, dando como resultado una formación de placa significativamente inferior. Los ensayos se hicieron usando muestras de saliva de un grupo de pacientes de diferentes edades y flora bucal. Estos resultados implican el uso potencial de OPN en formulaciones bucales, tales como pasta de dientes y colutorios, pero también como un ingrediente en chicles.

Por lo tanto, la invención se refiere al uso de osteopontina para reducir la proliferación bacteriana de la placa sobre el esmalte dental, y a formulaciones dentales que contienen osteopontina.

Como se usa en la presente invención, la expresión "osteopontina" u "OPN", significa osteopontina obtenida a partir de la leche, que incluye fragmentos o péptidos naturales derivados de OPN, mediante escisión proteolítica en la leche, o variantes de corte y empalme, fosforilación, o glucosilación, como las obtenibles a partir del método propuesto en el documento de patente WO 01/49741. La leche puede ser leche de cualquier animal productor de leche, tal como vacas, camellos, cabras, ovejas, dromedarios y llamas. Sin embargo, se prefiere la OPN de leche de bovino, debido a la disponibilidad. Todas las cantidades están basadas en OPN de leche de bovino natural, pero pueden corregirse fácilmente a las cantidades correspondientes de una de sus fracciones activas u OPN de otra fuente. La OPN o sus derivados pueden prepararse también genéticamente.

Las formulaciones dentales pueden ser cualquier dentífrico o producto relacionado de relevancia en la higiene bucal, tales como por ejemplo polvos dentífricos, geles dentífricos, colutorios dentales, pulverizaciones bucales, o chicles. La osteopontina (OPN) es una proteína de unión de calcio ácida, altamente fosforilada, rica en ácido siálico. La OPN une 20 moles de fosfato y aproximadamente 50 moles de Ca por mol. El punto isoeléctrico es aproximadamente 3,0. La proteína existe en muchos tejidos del cuerpo, y juega un papel como proteína de señalización y regulación. Es una proteína activa en procesos de biomineralización. La OPN es expresada por diversos tipos de células, que incluyen osteocitos, células de músculos lisos, y células epiteliales.

La OPN está presente en leche de bovino. Una concentración típica es de 20 mg/l. La OPN puede aislarse de manera relativamente sencilla mediante cromatografía aniónica, a partir de, por ejemplo, suero ácido a pH de 4,5, como se describe en la patente WO 01/497741 A2, o WO 02/28413. Puede obtenerse fácilmente una pureza de hasta 90-95%.

La cantidad de osteopontina está normalmente entre 50 mg de OPN y 1500 mg de osteopontina por kg de formulación dental. Sin embargo, también puede tener efecto una cantidad inferior. Pueden usarse cantidades mayores, pero el efecto no aumentará esencialmente. Una cantidad útil es de 100-1000 mg de OPN por kg, preferiblemente de 200-500 mg, y lo más preferido de aproximadamente 350 mg. Cantidades mayores no darán presumiblemente mejores resultados, y no están por lo tanto recomendadas, porque la OPN es un ingrediente bastante caro.

Las composiciones preferidas de la presente invención están, como ya se ha mencionado, en forma de pastas de dientes, geles dentífricos, y polvos dentífricos. Los componentes de tales pasta de dientes y geles dentífricos incluyen uno o más de lo siguiente: un abrasivo dental (desde 10% hasta 50%), un tensioactivo (desde 0,5% hasta 10%), un agente espesante (desde 0,04% hasta 0,5%), un humectante (desde 0,1% hasta 3%), un agente aromatizante (desde 0,04% hasta 2%), un agente edulcorante (desde 0,1% hasta 3%), un colorante (desde 0,01% hasta 0,5%), y agua (desde 2% hasta 45%). Los agentes anticaries contienen desde 0,001% hasta 1% de OPN. Los agentes antisarro contienen desde aproximadamente 0,1% hasta 13% de OPN.

Los polvos dentífricos, naturalmente, no tienen sustancialmente componentes líquidos.

Otras composiciones preferidas de la presente invención son colutorios dentales, que incluyen pulverizaciones bucales. Los componentes de tales colutorios y pulverizaciones bucales incluyen típicamente uno o más de lo siguiente: agua (desde 45% hasta 95%), etanol (desde 0% hasta 25%), un humectante (desde 0% hasta 50%), un tensioactivo (desde 0,01% hasta 7%), un agente aromatizante (desde 0,04% hasta 2%), un agente edulcorante (desde 0,1% hasta 3%), y un agente colorante (desde 0,001% hasta 0,5%), agente anticaries que incluye OPN, desde 0,001% hasta 1%, y un agente antisarro (desde 0,1% hasta 13%).

Una tercera área de aplicación es en formulaciones de chicles de diversas composiciones en términos generales.

La invención se ilustra además con los siguientes ejemplos y experimentos.

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Ejemplos Antecedentes

El fin de este estudio fue comprobar dos cosas:

La OPN se une a superficies de hidroxiapatita de una manera estable. La película no puede retirarse enjuagando con agua o tampón.

La OPN influye en la adherencia de las bacterias sobre la superficie del análogo dental.

Se ha investigado en este estudio la capacidad de la OPN para impedir la acumulación de la placa in vitro, sobre discos de hidroxiapatita (HA) que actúan como modelo para el esmalte dental. Los discos se bañaron en una disolución de OPN, y se incubaron posteriormente con saliva. Se estudió la proliferación sobre los sustratos con recuento bacteriano de diferentes cepas bacterianas formadoras de placa, en la Facultad de Odontología de la Universidad de Malmö, Suecia.

Como referencia para superficies de HA revestidas con OPN, se usaron discos de HA sin revestir y tratados con BSA (seroalbúmina bovina).

El estudio se llevó a cabo sobre muestras de saliva bien caracterizadas, de 6 donantes, como se describe a continuación.

Materiales y métodos Productos químicos

Se preparó osteopontina (OPN) por Arla Foods amba, con una pureza cromatográfica de 95%. Se adquirió seroalbúmina bovina (BSA) de Sigma-Aldrich. Se obtuvo dodecilsulfato sódico (SDS) de Sigma (St. Louis, MO, USA,
L-6026). Todos los otros productos químicos fueron de calidad analítica, y el agua usada fue de calidad Milli-Q. Se llevaron a cabo pretratamientos de sustratos y experimentos de adsorción en tampón de fosfato que contenía fosfato 0,01 M, y cloruro sódico 0,05 M, a pH 7. Todo el material de vidrio y puntas de pipeta, etc., así como los tampones, se esterilizaron en autoclave. Las disoluciones de proteínas usadas en los experimentos se esterilizaron por filtración (umbral, 0,22 \mum).

Muestras de saliva

Se recogió saliva estimulada para los experimentos, después de mascar un trozo de parafina. En el apéndice 1 se muestra un sumario de los donantes de las muestras salivales estimuladas.

No se permitió tomar comida ni bebida dos horas antes de la recogida.

Sustratos

Se adquirieron discos de hidroxiapatita (HA), de 10 mm de diámetro, del Instituto Sueco de la Cerámica, Göteborg. Los discos usados para los estudios de SEM se pulieron sobre ambas caras, para que pudieran limpiarse usando ultrasonidos. Antes de comenzar los experimentos, los sustratos (discos) se trataron en una disolución de detergente suave, y se enjuagaron concienzudamente con agua. Finalmente, se enjuagaron en etanol y agua. Los sustratos se conservaron en etanol al 70% hasta su uso, cuando se enjuagaron con agua y se secaron con flujo de nitrógeno. Después de secar, los sustratos usados en las medidas de elipsometría se limpiaron con plasma en aire residual a baja presión (10-30 Pa), usando una unidad de descarga luminiscente de radiofrecuencia (Harrick PDC 3XG, Harrick Scientific Corp., Ossining, New York).

Formación de película bacteriana

Las superficies del sustrato se preincubaron durante 1 h en disolución de proteína a 37ºC. Los sustratos se enjuagaron luego con tampón, y se incubaron a 37ºC durante 40 h. Se aplicó agitación durante el pretratamiento e incubación en los experimentos. Después de la incubación, los discos de HA se enjuagaron con tampón.

Elipsometría

La interacción de OPN con proteínas salivares sobre sustratos de HA fue seguida por elipsometría, que es un método óptico para determinar los cambios de polarización de la luz tras reflejarse en una superficie (3). El instrumento usado fue un elipsómetro para películas finas Rudolph, de tipo 436 (Rudolph Research, Fairfield, N.J.), equipado con una lámpara de xenón filtrada a 4015 \ring{A}, y se operó con un ajuste como el descrito por Landgren y Jönsson (1993). Para determinar los ángulos elipsométricos, \Delta y \Psi, se estableció la posición del mínimo de intensidad del sustrato desnudo. De los cambios de \Delta y \Psi tras la adsorción, se calcularon el grosor y el índice de refracción para la película de proteína adsorbida, según McCrackin et al. (4), asumiendo una película homogénea en la superficie. La masa adsorbida, \Gamma (mg/m^{2}), se calculó según Cuypers et al. (5). Como se muestra por estos autores, la masa adsorbida puede, con una baja cobertura superficial, determinarse de manera más exacta que el grosor de la película y el índice de refracción, y se ha presentado por esta razón en la presente invención. Los valores de la razón entre la masa molar y la refractividad molar y del volumen específico parcial usados fueron 4,1 g/ml y 0,75 ml/g, respectivamente. Estos valores se usan comúnmente para proteínas, y se han aplicado previamente en varios estudios en cuanto a la adsorción de componentes salivares (véanse (6, 7)).

Las superficies preparadas como se describe en la sección de sustratos anterior se situaron en la cubeta del elipsómetro que contenía el tampón. La cubeta se termorreguló a 37ºC, a menos que se indicara de otra manera, y la disolución se agitó con un agitador magnético. Cuando los ángulos elipsométricos fueron estables, se añadió saliva hasta una concentración final de 10% (v/v). Se determinó la adsorción durante 1 h, seguido de enjuague de la cubeta con un caudal continuo de tampón de 12 ml/min durante 5 min. La desorción se siguió luego durante otros 25 min. Este fue el procedimiento normal para la formación de película. Para obtener una medida de las propiedades de cohesión de la película, los experimentos constaron de una adición final de SDS. En el experimento normal, se añadió una concentración 17 mM (dos veces la cmc en agua y aproximadamente nueve veces la cmc en tampón), y después de esto, se llevó a cabo un enjuague final con tampón 5 min después de la adición de SDS.

Métodos para análisis microbiológicos Medio de cultivo

Los medios de agar básicos empleados para el aislamiento de microorganismos fueron agar con sangre (8), agar Mitis Salivarius (MSA, Difco Lab.), agar Mitis Salivarius con bacitracina (MSB) (9), agar selectivo para Candida según Nickerson (Merck), agar de Mac Conkey (Difco Lab), y medio para estafilococos 110 (Difco Lab).

Procedimientos de cultivo para muestras de saliva

Se transportaron muestras de saliva en medio VMG II (que conserva la viabilidad) convencional, se mezclaron en vórtex dentro de las 24 h de la recogida, se diluyeron, y se inocularon en agar con sangre, MSA y MSB. El agar con sangre se incubó en una cámara anaeróbica (hidrógeno al 10%, dióxido de carbono al 10%, en nitrógeno) durante 4 días y, agar MSA en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 2 días. Se contó el número total de unidades formadoras de colonias (CFU) sobre las placas de agar, con la ayuda de un estereomicroscopio.

Retirada de microorganismos de los discos

Los microorganismos unidos a los discos se retiraron mediante ultrasonidos, en un sonicador Sonics Vibracell con una micropunta, usando 10 pulsos de 1 segundo. La retirada de las células mediante sonicación se confirmó que fue eficaz porque no se observó proliferación bacteriana.

Procedimientos de cultivo para las muestras desorbidas

Las muestras desorbidas se mezclaron en vórtex, se diluyeron, y se inocularon en los siguientes medios: agar con sangre, MSA, agar selectivo para Candida, agar de Mac Conkey, y medio para estafilococos 110. El agar con sangre se incubó en una cámara anaeróbica (hidrógeno al 10%, dióxido de carbono al 10%, en nitrógeno) durante 5 días, el MSA en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 2 días y, agar selectivo para Candida, agar de Mac Conkey y medio para estafilococos 110 en condiciones aeróbicas durante 2 días. El número total de CFU sobre los agar se contó con la ayuda de un estereomicroscopio. Las CFU sobre MSA se analizaron poniendo especial atención en la morfología, tamaño, y número de diferentes tipos de colonias. Las células de colonias representativas de cada tipo morfológico se tiñeron con la tinción de Gram, y se inocularon en agar con sangre para una identificación posterior. Para una futura caracterización, los aislados que proliferaron sobre el MSA se conservaron a -79ºC en leche desnatada (10% de leche desnatada en polvo en agua destilada, p/v; Oxoid Lab. L31, Hampshire, UK).

Identificación de aislados de estreptococos

Se consideró que cocos grampositivos, catalasa- negativos, en cadenas, eran estreptococos, y estos aislados se identificarán con especies y subespecies basándose en características descritas previamente (10).

Resultados y discusión Estudio de interacción con proteínas

Para investigar la interacción entre OPN y HA, y OPN y saliva, se llevó a cabo un estudio de elipsometría. En la figura 1 se muestra el efecto de la temperatura de adsorción. Puede verse en esta figura que la adsorción de OPN sobre las superficies de HA sucede casi instantáneamente. Se absorbió una cantidad mayor de OPN a una temperatura superior (37ºC), aunque, el enjuague dio como resultado algo de desorción a 37ºC hasta una carga superficial estable de 1 mg por m^{2}. Para simular el efecto químico del cepillado de los dientes, se añadió SDS a la cubeta durante cinco minutos, seguido de enjuague con tampón. Después de esta etapa de lavado, no hubo diferencias significativas en la cantidad adsorbida a las dos temperaturas.

Los resultados obtenidos indican que la OPN proporciona una cobertura superficial de los discos de HA que es estable, aunque se obtiene una reducción del grosor de la película después de enjuague con agua y tratamiento con SDS.

Formación de película bacteriana

Los recuentos de bacterias mostrados en las tablas 1 y 2, desorbidas mediante una sonicación suave muestran, para discos de HA tratados con disoluciones de OPN con concentraciones de 0,1 mg/ml y 1 mg/ml respectivamente, un efecto significativo sobre la adherencia de bacterias en el recuento total tanto de placas de agar con sangre como de MSA, para todos los donantes de saliva. Los discos de HA tratados con BSA o saliva, mostraron más bacterias sobre las superficies. El recuento total de microorganismos fue de 10 a 1000 veces inferior en discos revestidos con OPN que en los discos testigo (saliva o revestidos con BSA). Las muestras de saliva estimulada mostraron una composición microbiana altamente diversa, lo que se considera una característica común de la microflora salival. Fue de interés el descubrimiento de que significativamente menos estreptococos colonizaron los discos revestidos con OPN que los discos testigo.

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TABLA 1 Análisis bacteriano de los discos en su totalidad, pulidos sobre ambas caras, incubados en saliva estimulada después de diferentes pretratamientos. Recuento total (CFU) sobre placas de agar con sangre incubadas anaeróbicamente

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TABLA 2 Análisis bacteriano de los discos en su totalidad, pulidos sobre ambas caras, incubados en saliva estimulada después de diferentes pretratamientos. Recuento total sobre agar Mitis Salivarius (MSA) incubado anaeróbicamente de modo facultativo

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Sumario

Los resultados muestran un claro efecto del pretratamiento con OPN de discos de HA en la cantidad de bacterias, después de incubación en saliva estimulada. El efecto antiadhesivo parece ser casi independiente de la concentración en el intervalo investigado, 0,1-1 mg/ml de disolución de OPN para el baño de los análogos dentales. Se necesita una pequeña cantidad de OPN para una cobertura de monocapa.

Es interesante observar que significativamente menos estreptococos se adhieren a los discos revestidos con OPN en comparación con los discos testigo.

Referencias

1. Hanh Berg, C., et al.

2. Dawes, C., "Rhythms in Salivary flow Rate and Composition", International Journal of Chronobiology, 2 (1974) 253-279.

3. Azzam, R. M. A. and Bashara, N. M. Ellipsometry and Polarized Light, North-Holland Amsterdam, 1977.

4. McCrackin, F. L., Passaglia, E., Stromberg, R. R. and Steinberg, H. L., "Measurement of the Thickness and Refractive Index of very Thin Films and Optical Properties of Surfaces by Ellipsometry", J. Res. Nat. Bur. Stand., A67 (1963) 363-377.

5. Cuypers, P. A., Corsel, J. W., Janssen, M. P., Kop, J. M. M., Hermens, W. T. and Hemker, H. C., "The adsorption of Prothrombin to Phosphatidylserine Multilayers Quantitated by Ellipsometry", J. Biol. Chem., 258 (1983) 2426-2434.

6. Vassilakos, N., Arnebrant, T. and Glantz, P.-O., "Adsorption of Whole Saliva onto Hydrophilic and Hydrophobic Solid Surfaces. The Influence of Concentration, Ionic Strength and pH.", Scand. J. Dent. Res., 100 (1992) 346-353.

7. Vassilakos, N., Arnebrant, T., Rundegren, J. and Glantz, P.-O., "In vitro Interactions of Anionic and Cationic Surfactants with Salivary Fractions on Well Defined Solid Surfaces.", Acta Odontol. Scand, 50 (1992) 179-188.

8. Beighton D, Russell RRB, Whiley RA; A simple biochemical scheme for the differentiation of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus, Caries Res 1991; 25:174-178.

9. Gold OG, Jordan HV, van Houte J: A selective medium for Streptococcus mutans. Arch Oral Biol 1973; 18:1357-1364.

10. Holdeman LV, Cato EP, Moore WEC: Anaerobe Laboratory Manual, ed 4. Blackbury, Anaerobic Laboratory, Virginia Polytechnic Institute and State University, 1977.

Claims (6)

1. El uso de osteopontina de leche para reducir o prevenir la proliferación bacteriana de la placa sobre el esmalte dental.

2. Una formulación dental que contiene 5 mg de osteopontina de leche hasta 1500 mg de osteopontina por kg de formulación.

3. Una formulación dental conforme a la reivindicación 2, en forma de pasta de dientes, polvo dentífrico, gel dentífrico, colutorio dental, pulverización bucal, o chicle.

4. Una formulación dental conforme a la reivindicación 3, que comprende 100 mg de osteopontina de leche hasta 1000 mg de osteopontina de leche por kg de formulación.

5. Una formulación dental conforme a la reivindicación 4, que comprende 200 mg de osteopontina de leche hasta 500 mg de osteopontina de leche por kg de formulación.

6. Una formulación dental conforme a la reivindicación 5, que comprende 350 mg de osteopontina de leche por kg de formulación.