ES2294172T3 - Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. - Google Patents
Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2294172T3 ES2294172T3 ES02775378T ES02775378T ES2294172T3 ES 2294172 T3 ES2294172 T3 ES 2294172T3 ES 02775378 T ES02775378 T ES 02775378T ES 02775378 T ES02775378 T ES 02775378T ES 2294172 T3 ES2294172 T3 ES 2294172T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- cell wall
- agent
- indicator
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un procedimiento para cribar un agente que está dirigido hacia un sitio de acceso particular de agentes que actúan sobre la biosíntesis de la pared de células fúngicas, que comprende las etapas: (1) cultivar un microorganismo fúngico que presenta una proteína indicadora fijada sobre una pared celular como una proteína anclada vía GPI en presencia de un agente de ensayo que actúa sobre una pared celular; (2) analizar una cadena sacárida de una sustancia derivada de la proteína indicadora liberada en un fluido de cultivo del microorganismo; y (3) estimar un sitio de acceso del agente de ensayo sobre la pared celular, con fundamento en la información de la cadena sacárida de la sustancia derivada de la proteína indicadora obtenida en la etapa (2).
Description
Procedimiento para cribar un medicamento que
actúa sobre la pared celular.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para cribar un agente que actúa sobre una pared
celular utilizando un microorganismo que posee una proteína
indicadora, por ejemplo una proteína fluorescente, fijada sobre una
pared celular como una proteína anclada vía GPI.
La tendencia creciente de la incidencia de
infecciones fúngicas severas se ha interpretado como la cifra de
incremento de pacientes implicados, y por tanto, son deseables
agentes terapéuticos efectivos. Actualmente, sólo han aparecido en
el mercado japonés cinco agentes antifúngicos para infecciones
fúngicas severas. Entre ellos, tres son agentes tipo azol
(miconazol, fluconazol e itraconazol). El fluconazol, un agente muy
típico, posee solamente una acción fungiestática. Además, con el
incremento de la cantidad de agente utilizado, aparece implicada
una resistencia a los hongos. La anfotericina B, un antibiótico
polieno que posee un efecto fungicida potente, es elevadamente
tóxica, y el agente no puede ser siempre utilizado con seguridad.
Por estas razones, el tratamiento antifúngico de pacientes con
infecciones fúngicas severas resulta con frecuencia en un nivel
poco satisfactorio, y por tanto la demanda de nuevos agentes
fungicidas y fungiselectivos es urgente.
Una pared celular, que característicamente
existe en las células fúngicas, es un lugar atractivo desde el
punto de vista de la selectividad. En las levaduras, por ejemplo,
los polímeros de grandes sacáridos que constituyen la pared celular
incluyen (1,3)-\beta-glucano,
(1,6)-\beta-glucano, quitina y
manano. Entre las vías sintéticas de estos polímeros sacáridos, la
vía sintética del manano existe comúnmente en células animales y
células fúngicas, y cada vía biosintética presenta elevada
coincidencia, por lo que generalmente se considera difícil, aunque
no absolutamente imposible, hallar un objetivo específico para los
hongos. En las vías sintéticas del
(1,3)-\beta-glucano y de la
quitina, se ha determinado la existencia de enzimas específicos
para los hongos y esenciales para su crecimiento, tal como el grupo
de genes FKS y el grupo de genes CHS, y se está realizando
investigación y desarrollo de agentes antifúngicos de acceso a los
enzimas. Así, se han desarrollado en la práctica agentes
antifúngicos candina que presentan una acción inhibitoria de
(1,3)-\beta-glucano. La vía
sintética del (1,6)-\beta-glucano
es también considerada como específica para los hongos, y la
existencia de enzimas que se juzgan esenciales para el crecimiento
de hongos se ha determinado con base en los resultados de análisis
genéticos. Sin embargo, no se ha establecido sistema de ensayo
alguno a nivel enzimático, y por lo tanto, no se ha comunicado un
inhibidor de estos enzimas. Por esta razón, ningún agente
antifúngico que inhiba esta vía sintética es conocido hasta la
fecha.
En general, las proteínas denominadas
colectivamente como proteínas ancladas vía GPI existen
extensivamente en células eucarióticas. Estas se hallan fijadas
sobre membranas celulares vía anclajes GPI (Ferguson, M. A., et
al., Ann. Rev. Biochem., 57, pág. 285-320,
1988). Cada proteína anclada vía GPI presenta regiones
relativamente hidrofóbicas de señal péptidica en ambos extremos de
los N- y C-terminales. Estas señales son cortadas
mediante modificación post-traduccional, y con
adición de un anclaje GPI al C-terminal, la proteína
se fija sobre la membrana ER (retículo endoplásmico rugoso). Luego,
la proteína anclada vía GPI fijada sobre la membrana ER es
transportada sobre la membrana, y entonces se fija además sobre la
membrana celular (Ferguson, M. A., et al., Ann. Rev. Biochem.,
57, pág. 285-320, 1988; Lu, C. F., et al., .Mol.
Cell Biol., 14, pág. 4825-4833, 1994).
En la Saccharomyces cerevisiae, una parte
del anclaje GPI está además unido por algunas de las proteínas
ancladas vía GPI fijadas sobre la membrana celular, y entonces la
proteína se fija adicionalmente sobre la pared celular vía
(1,6)-\beta-glucano como un
anclaje (Lu, C. F., et al., Mol. Cell Biol., 14, pág.
4825-4833, 1994; Kollar, R., et al., J. Biol. Chem.,
272, pág. 17762-17775, 1997).
Esto significa que, en la Saccharomyces
cerevisiae, existen dos clases de proteínas ancladas vía GPI;
una fijada sobre la membrana celular y la otra en la pared celular.
Esta diferencia de localización se espera que sea regulada por la
diferencia en la señal peptídica en el C-terminal
(Hamada, K., et al., Mol. Gen. Genet., 258, pág.
53-59, 1998; Caro, L., Yeast, 13, pág.
1477-1489, 1997). Recientemente, se ha informado
de la creación de una levadura que presenta una proteína exógena
arbitraria fijada sobre la pared celular (levadura estructural)
utilizando el mecanismo de localización de proteínas sobre las
paredes celulares (Varrt, J. M. V. D., et al., Appl. Environ.
Microbiol., 63, pág. 615-620, 1997; Murai, T, et
al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pág. 1362-1366,
1997).
Como se ha descrito anteriormente, el
(1,6)-\beta-glucano presenta una
función de anclaje para fijar las proteínas ancladas vía GPI sobre
las paredes celulares, y los resultados analíticos obtenidos hasta
ahora revelan que, cuando la biosíntesis de
(1,6)-\beta-glucano está inhibida
mediante disrupción genética, estas proteínas son liberadas
extracelularmente (Lu, C. F., et al., Mol. Cell Biol., 14, pág.
4825-4833, 1994; Lu, C. F., et al., J. Cell. Biol.,
128, pág. 333-340, 1995).
Recientemente, Tsuchiya et al. informaron
de la construcción de un sistema de expresión de una proteína
indicadora ligada con péptido glicano de la pared celular de
staphylococcus (The Pharmaceutical Society of Japan, The 120th
Annual Meeting, Abstracts 2, pág.153, Lecture nº 30 [PB]
15-71). Este sistema comprende cefalosporinasa
como una proteína indicadora anclada sobre una pared celular de
bacteria gram-positiva. Sin embargo, la aplicación
de este sistema no ha sido clarificada, y la publicación ni sugiere
ni enseña como puede ser utilizado el sistema para cribar un agente
que actúa sobre una pared celular.
Además, ningún procedimiento ha sido conocido
hasta ahora como un procedimiento para estimar, conveniente y
precisamente, sitios de acceso de los agentes que actúan sobre
pared la celular, excepto un procedimiento para cribar agentes
referido a paredes celulares tales como
(1,3)-\beta-glucano y quitina. Un
procedimiento para cribar un agente que actúa sobre un sitio de
acceso particular no puede aplicarse para la criba de agentes que
actúan sobre el otro sitio de acceso.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para cribar un agente que actúa sobre
una pared celular. Más específicamente, el objetivo de la presente
invención es proporcionar un procedimiento para cribar un agente que
actúa sobre una pared celular. en el cual cada sitio de acceso de
agentes que presentan una acción inhibitoria sobre una pared
celular está conveniente y adecuadamente determinado, por lo cual
los agentes que actúan sobre un sitio de acceso particular son
cribados eficientemente.
Los inventores de la presente invención hallaron
previamente que un agente que presenta una acción inhibitoria
selectiva sobre una pared celular, por ejemplo, un agente que posee
una acción inhibitoria selectiva sobre un enzima para biosíntesis de
(1,6)-\beta-glucano que
constituye la pared celular, debe ser cribado con éxito mediante la
preparación de dos clases de levaduras, cada una con una proteína
fácilmente detectable (proteína indicadora) fijada sobre la
membrana celular o la pared celular (designadas como "levadura
estructural tipo membrana" y "levadura estructural tipo
pared", respectivamente), y utilizando el criterio de que una
liberación de la proteína indicadora se produce substancialmente
sólo desde la levadura estructural tipo pared (PCT/JP01/3630).
Los inventores de la presente invención
efectuaron además diversas investigaciones para alcanzar el
objetivo anterior. Como resultado, hallaron que el peso molecular de
cada cadena sacárida que constituye una pared celular, que se une a
una proteína indicadora liberada, es diferente de las otras
dependiendo del sitio de acceso de un agente que posee una acción
inhibitoria selectiva sobre una pared celular, y así el sitio de
acceso del agente puede ser estimado midiendo el peso molecular de
una proteína indicadora liberada. Es decir, hallaron el fenómeno de
que cada cadena sacárida de una proteína indicadora liberada es
diferente de las otras dependiendo del sitio de acceso de un agente
que posee una acción inhibitoria selectiva sobre una pared celular.
La presente invención se logró con fundamento en estos
hallazgos.
La presente invención proporciona así un
procedimiento para cribar un agente que es dirigido hacia un sitio
parti-
cular de acceso de agentes que actúan sobre la biosíntesis de una pared celular fúngica, que comprende las etapas de:
cular de acceso de agentes que actúan sobre la biosíntesis de una pared celular fúngica, que comprende las etapas de:
(1) Cultivar un microorganismo fúngico en
presencia de un agente de ensayo que actúa sobre una pared celular,
en el cual dicho microorganismo presenta una proteína indicadora
fijada sobre una pared celular como una proteína anclada vía
GPI;
(2) Analizar una cadena sacárida de una
sustancia derivada de la proteína indicadora liberada en un fluido
de cultivo del microorganismo; y
(3) Estimar un sitio de acceso del agente de
ensayo sobre la pared celular con fundamento en la información de
la cadena sacárida de la sustancia derivada de la proteína
indicadora obtenida en la etapa (2). Este procedimiento se utiliza
preferiblemente para la criba de agentes dirigidos hacia un sitio
de acceso deseable entre los agentes que actúan sobre una pared
celular.
Como realizaciones preferibles de la invención
antes mencionada, se proporciona: el anterior procedimiento, en el
cual el análisis de la cadena sacárida de la sustancia derivada de
la proteína indicadora se realiza midiendo el peso molecular de la
sustancia derivada de la proteína indicadora; el procedimiento
antes mencionado, que utiliza un microorganismo que posee una
proteína indicadora fijada a
(1,6)-\beta-glucano de la pared
celular; el procedimiento antes mencionado, en el cual el
microorganismo es una levadura; el procedimiento antes mencionado,
en el cual la proteína indicadora es una proteína fluorescente; el
procedimiento antes mencionado, en el cual la proteína fluorescente
es una proteína fluorescente verde; y el procedimiento antes
mencionado, en el cual la acción inhibitoria sobre la pared celular
es una acción inhibitoria contra un proceso biosintético de la
pared celular y/o un enzima biosintético de la cadena sacárida
(enzima implicado en la extensión de la cadena sacárida). El agente
que actúa sobre una pared celular es preferiblemente un agente
antifúngico.
Además, en una realización preferible de la
presente invención, el procedimiento comprende una etapa de criba
de un agente que actúa sobre una pared celular antes de las etapas
mencionadas. En esta realización, los agentes que actúan sobre una
pared celular son primeramente cribados mediante las siguientes
etapas:
(A1) Cultivar cada microorganismo que posee una
proteína indicadora fijada sobre una pared celular como una
proteína anclada vía GPI, y un microorganismo que presenta una
proteína indicadora fijada sobre una membrana celular como una
proteína anclada vía GPI en presencia de un agente de ensayo;
(A2) Determinar una sustancia derivada de la
proteína indicadora liberada en cada fluido de cultivo del
microorganismo cultivado; y
(A3) Ponderar que el agente de ensayo es un
agente que posee una acción inhibitoria selectiva sobre una pared
celular cuando la sustancia derivada de la proteína indicadora es
liberada por el microorganismo que presenta la proteína indicadora
fijada sobre la pared celular en el fluido de cultivo, y la
sustancia derivada de la proteína indicadora no es liberada
substancialmente por el microorganismo que posee la proteína
indicadora fijada sobre la membrana celular en el fluido de
cultivo;
y entonces las antes mencionadas etapas (1) a
(3) pueden ser realizadas por agentes para los que se ha
determinado que son agentes que presentan una acción inhibitoria
selectiva sobre una pared celular en la etapa (A3) para cribar un
agente dirigido a un sitio de acceso deseable desde los anteriores
agentes.
Desde otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para estimar un sitio de acceso de un
agente que actúa sobre la biosíntesis de una pared celular fúngica,
que comprende las etapas de:
(1) Cultivar un microorganismo fúngico que posee
una proteína indicadora fijada sobre una pared celular como una
proteína anclada vía GPI, en presencia de un agente de ensayo que
actúa sobre una pared celular;
(2) Analizar una cadena sacárida de una
sustancia derivada de la proteína indicadora liberada en un fluido
de cultivo del microorganismo; y
(3) Estimar un sitio de acceso del agente de
ensayo sobre la pared celular con fundamento en la información de
la cadena sacárida de la sustancia derivada de la proteína
indicadora obtenida en la etapa (2) (en particular, peso molecular,
patrón de peso molecular, o similares).
La Figura 1 representa las estructuras de los
plásmidos mayores (pEAC y pUAC) utilizados en el ejemplo.
La Figura 2 representa resultados de la medida a
lo largo del tiempo de la liberación de GFP basada en la intensidad
de la fluorescencia en el fluido de cultivo y los sobrenadantes del
cultivo de la cepa AY-5 y la cepa
AY-16, cultivadas en tubos de ensayo.
La Figura 3 representa los efectos de la
liberación de GFP por los reactivos antifúngicos disponibles. Cada
macromolécula principalmente inhibida se cita entre paréntesis. El
primer gráfico representa los resultados obtenidos por la
utilización de la cepa AY-2, y el segundo gráfico
representa los resultados obtenidos por la utilización de la cepa
AY-12. Los agentes representados desde la izquierda
son: aculeacina A (AC), tunicamicina (TM), nicomicina (NM), blanco
de calcofluor (CW), rojo Congo (CR), anfotericina B (AMPH),
salinomicina (SM), fluconazol (FCZ), aureobasidina (AB), cerulenina
(CE), 5-flucitosina (5-FC), zeocina
(ZE), netropsina (NE), cicloheximida (CH), azaserina (AS),
bromoconduritol (BC) y cafeína (CA).
La Figura 4 representa la secuencia nucleotídica
(número de nucleótidos: 1116) del gen introducido en la cepa
AY-15, sitios de reconocimiento de los enzimas de
restricción y secuencia aminoácida (código de una letra) codificada
por el gen. La figura representa los nucleótidos hasta el ácido
nucleico número 600.
La Figura 5 representa la secuencia nucleotídica
(número de nucleótidos: 1116) del gen introducido en la cepa
AY-15, sitios de reconocimiento de los enzimas de
restricción y secuencia aminoácida (código de una letra) codificada
por el gen. La figura representa los nucleótidos del ácido nucleico
número 601 a 1116.
La Figura 6 representa la secuencia nucleotídica
(número de nucleótidos: 1236) del gen introducido en la cepa
AY-14, sitios de reconocimiento de los enzimas de
restricción y secuencia aminoácida (código de una letra) codificada
por el gen. La figura representa los nucleótidos hasta el ácido
nucleico número 660.
La Figura 7 representa la secuencia nucleotídica
(número de nucleótidos: 1236) del gen introducido en la cepa
AY-14, sitios de reconocimiento de los enzimas de
restricción y secuencia aminoácida (código de una letra) codificada
por el gen. La figura representa los nucleótidos del ácido nucleico
número 661 a 1236.
La Figura 8 representa las estructuras de los
plásmidos pAUC19a, pUAC29b, pUAC20a, pUAC30b, pUAC21a y pUAC31b,
utilizados en los ejemplos.
La Figura 9 representa las cantidades de GFP
liberadas por una cepa derivada de la cepa AY-12
(levadura estructural tipo membrana) como una cepa madre en la cual
un gen de síntesis de la pared celular está fragmentado, y una cepa
derivada de la cepa AY-10 (levadura estructural
tipo pared) como una cepa madre en la cual un gen de síntesis de la
pared celular está fragmentado.
La Figura 10 representa los resultados del
análisis de los pesos moleculares de GFP liberada por las cepas de
gen fragmentado mediante detección "Western blotting".
La Figura 11 representa los resultados de la
comparación de los pesos moleculares de GFP liberada por la cepa
AY-14 después de tratamiento con cada uno de SP
(PKC1 inhibidor de proteína quinasa C), AC (inhibidor de síntesis
(1,3)-\beta-glucano) y TM
(inhibidor de síntesis cadena sacárida N-tipo)
aisladamente.
El procedimiento de cribado de la presente
invención puede ser utilizado preferiblemente para cribar un agente
que es dirigido hacia un sitio de acceso particular entre los
agentes que actúan sobre la biosíntesis de una pared celular
fúngica. En general, los agentes que actúan sobre una pared
celular, preferiblemente agentes que presentan una acción
inhibitoria selectiva sobre una pared celular, están seleccionados a
partir de una biblioteca que incluye numerosos compuestos o
similares como una criba primaria, y entonces el procedimiento
puede ser utilizado para fines tales como identificación de cada
sitio de acceso de los agentes o para una criba adicional de un
agente dirigido hacia un sitio de acceso particular. Sin embargo,
las utilizaciones del procedimiento de la presente invención no se
limitan a las anteriormente mencionadas, y el procedimiento de la
presente invención puede ser aplicado directamente a un agente de
ensayo con la finalidad de confirmar el sitio de acceso del agente
sin realizar la criba primaria antes mencionada. Debe entenderse que
dicha realización también se incluye dentro del objetivo de la
presente invención.
En la presente descripción, la expresión "que
actúa sobre una pared celular" significa, por ejemplo, actuar
sobre uno o más de los siguientes enzimas e interferir con acciones
o funciones de los enzimas.
(a) enzimas para síntesis de componentes que
constituyen la pared celular (polímeros sacáridos) de
microorganismos;
(b) enzimas auxiliares de las acciones de
enzimas para síntesis de componentes que constituyen las paredes
celulares (polímeros sacáridos) de microorganismos;
(c) enzimas que inhiben las funciones de enzimas
para síntesis de componentes que constituyen paredes celulares
(polímeros sacáridos) de microorganismos;
(d) procesos requeridos por los enzimas
pertenecientes a las clases (b) y (c) antes mencionadas para ayudar
o inhibir las acciones del enzima para síntesis de los (a) antes
mencionados, y enzimas implicados en los procesos;
(e) procesos que actúan en el entrelazado entre
diferentes polímeros sacáridos y enzimas implicados en los
procesos;
(f) procesos para anclar componentes que
constituyen paredes celulares sobre las paredes celulares (por
ejemplo, proteínas GPI presentes en paredes celulares) además de los
polímeros sacáridos, y enzimas implicados en los procesos;
(g) procesos de construcción normal de polímeros
sacáridos en paredes celulares y enzimas implicados en los
procesos;
(h) procesos y vías para regular la síntesis de
paredes celulares y enzimas implicados en los procesos;
(i) procesos que actúan en la división celular
de células microbianas y enzimas implicados en los procesos;
(j) procesos de cambio de la forma de células
microbianas y enzimas implicados en los procesos;
(k) procesos de digestión de paredes celulares
construidas de células microbianas y enzimas implicados en los
procesos;
(l) procesos en los cuales los microorganismos
cambian significativamente las composiciones de la pared celular en
respuesta a los cambios en el ambiente externo y enzimas implicados
en los procesos; y
(m) otros procesos de construcción y síntesis de
paredes celulares microbianas y cambio de estructuras de la pared
celular, además de los ejemplos antes mencionados, y enzimas
implicados en los procesos.
Además, en esta descripción, la expresión "que
posee una acción inhibitoria selectiva sobre una pared celular"
significa poseer una acción inhibitoria específica en los casos
descritos en los apartados (a) a (m) antes mencionados que incluyen
síntesis, descomposición y similares de paredes celulares. En esta
descripción, el término "agente" se utiliza en el sentido de
abarcar cualesquiera substancias que presentan una acción biológica
incluyendo compuestos moleculares bajos hasta compuestos
macromoleculares, así como substancias naturales, proteínas o una
parte de ellas, polipéptidos, ácidos nucleicos tales como
oligonucleótidos y similares. El término "agente" no debe
entenderse en sentido limitativo, sino en su más amplio
sentido.
Antes de realizar el procedimiento de la
presente invención, los agentes que actúan sobre una pared celular
son cribados preferiblemente a partir de una biblioteca de
compuestos (en esta descripción, la criba realizada con el fin
antes mencionado también se denomina "criba primaria"). Esta
criba puede realizarse usualmente según el procedimiento descrito en
PCT/JP01/3630. Más específicamente, los agentes que actúan sobre
una pared celular pueden ser seleccionados mediante un
procedimiento de cribado que comprende las siguientes etapas:
(A1) Cultivar cada uno de un microorganismo que
posee una proteína indicadora fijada sobre una pared celular como
una proteína anclada vía GPI y un microorganismo que presenta una
proteína indicadora fijada sobre una membrana celular como una
proteína anclada vía GPI, en presencia de un agente de ensayo;
(A2) Determinar una sustancia derivada de la
proteína indicadora liberada en cada fluido de cultivo del
microorganismo cultivado; y
(A3) Ponderar que el agente de ensayo es un
agente que posee una acción inhibitoria selectiva sobre una pared
celular, cuando la sustancia derivada de la proteína indicadora es
liberada por el microorganismo que presenta la proteína indicadora
fijada sobre la pared celular en el fluido de cultivo, y la
sustancia derivada de la proteína indicadora no es substancialmente
liberada por el microorganismo que posee la proteína indicadora
fijada sobre la membrana celular en el fluido de cultivo.
En la criba primaria antes mencionada, un
microorganismo que presenta una proteína indicadora fijada sobre
una pared celular como una proteína anclada vía GPI y un
microorganismo que posee una proteína indicadora fijada sobre una
membrana celular como una proteína anclada vía GPI son cada uno
cultivados en presencia de un agente de ensayo, y entonces se
determinan las substancias derivadas de las proteínas indicadoras
liberadas en el fluido de cultivo. Las condiciones, que incluyen
tipo de medio, temperatura, periodo de tiempo de cultivo y
similares, pueden ser elegidas apropiadamente dependiendo de los
tipos de microorganismos utilizados. Un procedimiento de cultivo
específico en el cual una levadura se utiliza como microorganismo
está descrito específicamente en PCT/JP01/3630. La expresión
"proteína anclada vía GPI" utilizada en esta descripción no
significa una proteína en particular, y debe entenderse sin
carácter limitativo.
Las proteínas indicadoras no están limitadas en
particular, siempre que sus propiedades estén ya aclaradas, y sus
tipos no están limitados en particular, siempre que sean proteínas
que pueden ser detectadas por medios ordinarios, por ejemplo, medios
espectroscópicos tales como fluorometría, cromatografía líquida de
elevado rendimiento, espectrometría de masas o medios bioquímicos
tales como reacciones enzimáticas. Por ejemplo, puede ser utilizada
preferiblemente una proteína fluorescente y similar. Por ejemplo, se
utiliza preferiblemente una proteína fluorescente verde (GFP) o un
mutante de ella (EGFP: Dormack, B. P., et al., Gene, 173, pág.
33-38, etc.). En esta descripción, la expresión
"proteína fluorescente verde" se utiliza en el sentido de
abarcar GFP y sus mutantes. Los tipos de microorganismos no están
particularmente limitados siempre que sean microorganismos celulares
eucarióticos que presentan una proteína anclada vía GPI. Por
ejemplo, son utilizadas preferiblemente levaduras tales como S.
cerevisiae.
En las levaduras, es conocido que una parte de
algunas de las proteínas ancladas vía GPI fijadas sobre la membrana
celular está además fijada sobre la pared celular vía
(1,6)-\beta-glucano como un ancla
(Lu, C. F., et al., Mol. Cell Biol., 14, pág.
4825-4833, 1994; Kollar, R., et al., J. Biol.
Chem., 272, pág. 17762-17775, 1997). Además, es
conocido un procedimiento para fijar un enzima sobre una pared
celular de microorganismo mediante producción de una proteína de
fusión (Chris et. al, Publicación en japonés de la patente
internacional sin examinar (KOHYO) nº
7-508652). Con fundamento en estos hallazgos, se
han desarrollado procedimientos para fijar una proteína exógena
sobre una pared celular de una levadura (Varrt, J. M. V. D., et
al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pág. 615-620,
1997; Murai, T., et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, pág.
1362-1366, 1997). La proteína anclada vía GPI
también es denominada proteína tipo ancla GPI, y también puede
algunas veces denominarse proteína tipo anclaje
glicosilfosfatidilinositol, proteína tipo anclaje
fosfatidilinositol, proteína tipo anclaje PI, o similares.
Por tanto, las levaduras son preferiblemente
utilizadas como microorganismo. Cuando se utilizan levaduras, una
levadura en la cual una proteína indicadora está fijada sobre una
pared celular o membrana celular como la proteína anclada vía GPI,
puede ser preparada según los procedimientos descritos en las
publicaciones antes mencionadas. Sus procedimientos específicos
están descritos en el ejemplo de PCT/JP01/3630, y los expertos en
la materia pueden producir microorganismos deseables según los
procedimientos descritos en la publicación antes mencionada.
En el procedimiento de cribado descrito en esta
descripción, una sustancia derivada de una proteína indicadora es
un cúmulo de una sola proteína, o dos o más clases de proteínas, la
cual es liberada por las paredes celulares mediante la acción de un
agente y contiene la proteína indicadora total o una mayor parte de
ella (en esta descripción, la expresión "sustancia derivada de
una proteína indicadora" significa tanto una sola clase de
sustancia como una mezcla de múltiples clases de substancias, a no
ser que se indique específicamente). Según se describirá más
adelante, cuando la proteína indicadora está fijada sobre una pared
celular, se produce una sustancia derivada de una proteína
indicadora que posee una cadena sacárida característica dependiendo
de un sitio de acceso de un agente que actúa sobre una pared
celular.
En la etapa de cultivo de la criba primaria
antes mencionada (en la criba primaria, la sustancia derivada de
una proteína indicadora incluye una sustancia liberada por una pared
celular, así como una(s) proteína(s)
liberada(s) por una membrana celular correspondiente a la
sustancia derivada de la proteína indicadora liberada por una pared
celular), cuando se observa la liberación de la sustancia derivada
de una proteína indicadora en el fluido de cultivo, puede
interpretarse que la pared celular o la membrana celular del
microorganismo ha sido dañada por una acción del agente de ensayo,
lo que resulta en la liberación de la sustancia derivada de una
proteína indicadora (Lu, C. F., et al., Mol. Cell Biol., 14, pág.
4825-4833, 1994; Lu, C. F., et al., J. Cell. Biol.,
128, pág. 333-340, 1995). Por ejemplo, cuando un
agente que daña selectivamente una pared celular es cribado como un
agente que presenta toxicidad selectiva para los hongos, un
criterio de que la sustancia derivada de una proteína indicadora es
liberada por el microorganismo que posee la proteína indicadora
fijada sobre la pared celular en el fluido de cultivo, mientras que
la sustancia derivada de una proteína indicadora no es
substancialmente liberada por el microorganismo que presenta la
proteína indicadora fijada sobre la membrana celular en el fluido
de cultivo, y puede ser elegido un agente que satisface el
criterio. Un agente determinado como positivo para el criterio puede
ser estimado como un agente que posee una acción inhibitoria
selectiva sobre la biosíntesis de la pared celular.
En la criba primaria, para la medida de la
sustancia derivada de una proteína indicadora, un procedimiento
apropiado puede ser elegido dependiendo del tipo y propiedades de la
proteína indicadora. Por ejemplo, cuando una proteína fluorescente
verde se utiliza como la proteína indicadora, la liberación de la
sustancia derivada de una proteína indicadora puede ser determinada
midiendo el espectro fluorescente en el fluido de cultivo.
El procedimiento de la presente invención se
utiliza preferiblemente para cribar un agente dirigido hacia un
sitio de acceso particular entre los agentes que actúan sobre la
biosíntesis de una pared celular fúngica seleccionado por la criba
primaria antes mencionada, y se caracteriza por comprender las
etapas siguientes:
(1) Cultivar un microorganismo que presenta una
proteína indicadora fijada sobre una pared celular como una
proteína anclada vía GPI en presencia de un agente de ensayo que
actúa sobre una pared celular;
(2) Analizar una cadena sacárida de una
sustancia derivada de la proteína indicadora liberada en un fluido
de cultivo del microorganismo; y
(3) Estimar un sitio de acceso del agente de
ensayo sobre la pared celular con fundamento en la información de
la cadena sacárida de la sustancia derivada de la proteína
indicadora obtenida en la etapa (2).
El microorganismo utilizado en el procedimiento
de la presente invención es un microorganismo, entre aquellos
referidos en la explicación sobre la criba primaria antes
mencionada, en el cual una proteína indicadora está fijada sobre una
pared celular como una proteína anclada vía GPI. De acuerdo con una
realización preferible, puede ser utilizado un microorganismo en el
cual una proteína indicadora está fijada al
(1,6)-\beta-glucano de las paredes
celulares, o similar. Según se indicó en la explicación sobre la
criba primaria, las levaduras son utilizadas preferiblemente como
microorganismo. En el microorganismo utilizado en el procedimiento
de la presente invención, una proteína fluorescente se utiliza
preferiblemente como la proteína indicadora, y más preferiblemente
se utiliza una proteína fluorescente
verde.
verde.
El procedimiento de la presente invención
utiliza el hecho de que la cadena sacárida que se enlaza con una
sustancia derivada de una proteína indicadora varía dependiendo de
la diferencia de sitio de acceso de un agente que actúa sobre una
pared celular, y el procedimiento se caracteriza por estimar un
sitio de acceso de un agente de ensayo mediante análisis de la
cadena sacárida, preferiblemente la determinación del peso molecular
de la sustancia derivada de la proteína indicadora (en particular,
el peso molecular o el patrón de peso molecular).
En general, múltiples clases de cadenas
sacáridas, tales como cadena N-glicosil y cadena
O-glicosil, así como
(1,6)-\beta-glucano y/o
(1,3)-\beta-glucano implicados en
el anclaje, se enlazan a la proteína indicadora fijada a una pared
celular como una proteína anclada vía GPI. Los agentes que actúan
sobre una pared celular, tales como inhibidor de síntesis de
(1,6)-13- glucano, inhibidor de síntesis de
(1,3)-\beta-glucano, inhibidor de
síntesis de manano (cadena sacárida N-tipo o cadena
sacárida O-tipo), inhibidor de entrelazado de cadena
sacárida hetérica, inhibidor de regulación de síntesis de cadena
sacárida e inhibidor de síntesis del anclaje GPI, poseen cada uno
capacidad para actuar sobre el microorganismo antes mencionado para
permitir la liberación de una sustancia derivada de una proteína
indicadora. Ya que estos agentes actúan sobre las cadenas sacáridas
en diferentes sitios de acceso, las cadenas sacáridas que se
enlazan a la sustancia antes mencionada derivada de una proteína
indicadora cambian característicamente dependiendo de la diferencia
de los sitios de acceso de los agentes. Como resultado, las
substancias antes mencionadas derivadas de una proteína indicadora
presentarán un fragmento característico de cadena sacárida (o
incluyen supresión de una cadena sacárida particular) dependiendo
de los sitios de acceso de los agentes.
En el procedimiento de la presente invención, el
proceso para analizar la cadena sacárida de una sustancia derivada
de una proteína indicadora no está particularmente limitado. La
expresión "análisis de cadena sacárida" utilizada en esta
descripción debe ser entendida en su más amplio sentido, incluyendo
determinación del peso molecular de la sustancia total derivada de
la proteína indicadora, así como determinación del peso molecular o
estructura de la porción de cadena sacárida. Puede ser utilizado
cualquier procedimiento que permita la verificación de diferencias
en la cadena sacárida. Muy convenientemente, el sacárido puede ser
analizado mediante determinación del peso molecular de la sustancia
total derivada de una proteína indicadora por electroforesis,
utilizando gel poliacrilamida, o similares. La distribución de peso
molecular en la sustancia derivada de la proteína indicadora que
refleja la diferencia en la cadena sacárida puede ser examinada
visualmente utilizando una técnica bien conocida y comúnmente
utilizada por los expertos en la materia, tal como detección
"Western blotting". La expresión "determinación del peso
molecular" utilizada en esta descripción puede ser entendida
como comprensiva de cualquier medio que proporcione información
suficiente para la comparación de los pesos moleculares, y la
expresión no debe entenderse como limitativa.
El procedimiento de la presente invención puede
ser utilizado muy preferiblemente para una criba de, por ejemplo,
un agente que posee una acción inhibitoria sobre la biosíntesis de
(1,6)-\beta-glucano, o un agente
que presenta un acción inhibitoria sobre uno o más enzimas
implicados en la biosíntesis de
(1,6)-\beta-glucano, entre los
agentes que actúan sobre una pared celular. Además, el
procedimiento de la presente invención también permite el cribado de
un inhibidor de biosíntesis de
(1,3)-\beta-glucano, o un agente
que inhibe la síntesis o construcción de paredes celulares mediante
otra acción (cuyo sitio de acceso puede ser desconocido). Los
ejemplos específicos del agente que actúa sobre una pared celular
incluyen agentes antifúngicos y similares. Sin embargo, los agentes
que pueden ser cribados por el procedimiento de la presente
invención no se limitan a los agentes antifúngicos.
La presente invención se explicará más
específicamente con referencia a los ejemplos siguientes. Sin
embargo, el objeto de la presente invención no queda limitado por
estos ejemplos.
(Ejemplo de
referencia)
Se utilizaron cepas Escherichia coli
JM109, TOP10F' y DH5\alpha, y cepas S. cerevisiae YPHSO0
(MAT\alpha ade2, his3, leu2, lis2, trp1, ura3), IFO 0565, IFO 1226
y cepa KRE6-fragmentada. La transformación se
realizó según un procedimiento conocido o utilizando un kit de
transformación de levadura (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) de
acuerdo con el manual del envase.
Se utilizaron los agentes que siguen.
Los siguientes oligonucleótidos fueron
utilizados en el experimento. M13 iniciador universal y M13
iniciador inverso se compraron a Pharmacia, y los otros
oligonucleótidos fueron sintetizados para su utilización. Estos
oligonucleótidos pueden ser utilizados como genes útiles para fijar
una proteína indicadora sobre una pared celular o una membrana
celular de un microorganismo como una proteína anclada vía GPI.
GFP-SM2
(5'-GGCATGGATGAGATCTACAAATAATG-3')
GFP-SM3
(5'-CATGATTACGCCGAGCTCGCATGCCTG-3')
GFP-SM4
(5'-CAACACTTGTCACTACGTTAACTTATGGTGTTCAATG-3')
YEX-SM2
(5'-CCTGTGATTTCTCCAGCTCGAATTC-3')
YEX-SM3
(5'-GATTCATTAATGCATGCTGGCACGACAGG-3')
YEX-SM4
(5'-GATTCATTAATGCAGCTGGCACGAC-3')
YEX-SM5
(5'-CTCACGGTATCGCCCTCGAGATCTCTGAATCC-3')
YEX-SM6
(5'-GAGACCCTCTTCTGAGCTCTCTGAATCC-3')
YEX-SM7
(5'-AAACCAAAAGATCGACTAGTATAAAATGAATATA-3')
YEX-SM8
(5'-CATTAATGCATGCTGGCACGAC-3')
YEX-SM9
(5'-CTTTAACGAGTCCGCGGATTTCTCCAGCTCG-3')
SUC2-sen1
(5'-GCACTAGTATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTC-3')
SUC2-anti2
(5'-GCGAGCTCTTTGATGCAGATATTTTGGCTGCAA-3')
GAS1-sen1
(5'-GCAGATCTGTAGTGTTGATTTGGGTTCCGG-3')
GAS1-anti3
(5'-GCCCGCGGCTTATCGAGTTATTATGTATGTGTCGAAGC-3')
CWP2-sen1
(5'-GCAGATCTACTTTGTTGCCGCTGAATCCG-3')
CWP2-anti1
(5'-GCGAATTCGAGAAATCACAGGACTCGTTAAAG-3')
MEL1-sen1
(5'-GCGAATTCGAGAGCAACGGTAATAAAAGCAACGACG-3')
MEL1-sen3
(5'-CGGAGCTCGGTGTCTCCGAGTTACAATGGC-3')
MEL1-anti1
(5'-GCAGATCTAGAAGGCGATACCGTGAGCTGGAAC-3')
MEL1-anti2
(5'-CGGAGCTCCATCAATACTTCTCGCCCTGCR-3')
MEL1-anti3
(5'-GCAGATCTAAGAAGAGGGTCTCAACCTATAGAAG-3')
M13 iniciador universal y M13 iniciador
inverso
Utilizando pUC19, YEp13, YEp24 (para éstos, ver
Pouwels, P. H. et al., Cloning vectors, Elsevier Science
Publishers B. V., 1985), pYPR2831 (Horiuchi, H. et al.,
Agric. Biol. Chem., 54, 1771-1779, 1990),
pGFPuv (Clontech, Palo Alto, Calif., USA) y pYEX-S1
(Amrad, Victoria, Australia), se prepararon y utilizaron los
siguientes plásmidos. Estos plásmidos incluyen vectores
recombinantes que contienen los genes utilizados para fijar una
proteína indicadora sobre una pared celular o una membrana celular
de un microorganismo como una proteína anclada vía GPI. Se utilizó
pGEM-T Vector System (Promega, Madison, Wis., USA)
para subclonación de productos PCR, y se utilizó el kit Transformer
Site-Directed Mutagenesis (Clontech) para
introducción de mutaciones. Se realizaron según procedimientos
convencionales la recuperación de fragmentos de ADN a partir de
agarosa, defosforilación, enromado de extremos, ligazón y digestión
con enzimas de restricción. Las estructuras de los plásmidos
mayores se representan en la Figura 1. En la figura, oriB representa
el origen de replicación de Escherichia coli, oriY
representa el origen de replicación de levadura de panadería, Ampr
representa un gen resistente a ampicilina, dLEU2 representa un
marcador de LEU2 parcialmente deficiente, Pro representa un
promotor de fosfoglicerato quinasa, SS representa una señal
secretora, y Ter representa un exterminador fosfoglicerato
quinasa.
pUXS1: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con HindIII fue insertado en el sitio HindIII de
pUC19.
pUXS2: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp13 con XhoI y SalI fue insertado en el sitio SalI de
pUC19.
pUAC1: Una parte de CWP2 (Varrt. J. M. et
al., J. Bacteriol., 177, 3104-3110, 1995) fue
amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPHSO0, iniciadores: CWP2-sen1 y CWP2-anti1) y subclonada en PGEM-T.
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPHSO0, iniciadores: CWP2-sen1 y CWP2-anti1) y subclonada en PGEM-T.
\global\parskip0.950000\baselineskip
pUAC1a: pUAC1 fue digerido con EcoRI y PstI y
entonces auto-enlazado.
pUAC3: Una parte de MELL (Liljestrom, P. L.,
Nucl. ácidos Res., 13, pág. 7257-7268, 1985)
fue amplificada mediante PCR (patrón: ADN cromosómico de cepa IFO
0565, iniciadores: MEL1-sen1 y
MEL1-anti1) y subclonada en
pGEM-T.
pUAC5a: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUAC3 con ScaI y BglII fue insertado en los sitios ScaI y BglII
de pUAC1a.
pUAC8: Una parte de MELL fue amplificada
mediante PCR (patrón: ADN cromosómico de cepa IFO 1226,
iniciadores: MEL1-sen3 y MEL1-anti1)
y subclonada en pGEM-T.
pUAC12: Una parte de SUC2 (Taussig, R. et
al., Nucl. Acids Res., 11, pág. 1943-1954,
1983) fue amplificada mediante PCR (patrón: ADN cromosómico de
cepa YHP500, iniciadores: SUC2-seN1 y
SUC2-anti2) y subclonada en
pGEM-T.
pUAC13: Una parte de MEL1 fue amplificada
mediante PCR (patrón: ADN cromosómico de cepa IFO 0565, iniciadores:
MEL1-sen3 y MEL1-anti3) y subclonada
en pGEM-T.
pUAC14: Se introdujo una mutación en pGFPuv
(iniciadores: GFP-SM2 y
GFP-SM3).
pUAC15: pEAC8a fue digerido con StuI y
auto-enlazado.
pUAC15a: Se introdujo una mutación en pUAC15
(iniciadores: YEX-SM4 y
YEX-SM7).
pUAC16: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUAC12 con NaeI y SpeI fue insertado entre los sitios SpeI y
StuI de pUAC15a.
pUAC19: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUXS1 con EcoRV y PvuII fue insertado en el sitio EcoRV de
pEAC12.
pUAC19a: Se introdujo una mutación en pUAC19
(iniciadores: GFP-SM4, YEX-SM8 y
YEX-SM9).
pUAC20: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUXS2 con EcoRV y PvuII fue insertado en el sitio EcoRV de
pEAC12.
pUAC20a: Se introdujo una mutación en pUAC20
(iniciadores: GFP-SM4, YEX-SM8 y
YEX-SM9).
pUAC21: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pYPR2831 con PstI fue enromado en sus extremos e insertado en el
sitio EcoRV de pEAC12.
pUAC21a: Un fragmento obtenido mediante
digestión de pUAC19a con SacI y BglII fue insertado entre los
sitios SacI y BglII de pUAC21.
pUAC28: Una parte de GAS1 (Val, M., et
al., J. Biol. Chem., 266, 12242-12248, 1990) fue
amplificada mediante PCR (patrón: ADN cromosómico de cepa YPHSO0,
iniciadores: GAS1-sen1 y
GAS1-anti3) y subclonada en
\hbox{pGEM-T.}
pUAC29b: Un fragmento obtenido mediante
digestión de pUAC28 con BglII y SacII fue insertado entre los
sitios BglII y SacI de pUAC20a.
pUAC30b: Un fragmento obtenido mediante
digestión de pUAC29b con BglII y BamHI fue insertado en el sitio
BglII de pUAC19a.
pUAC31b: Un fragmento obtenido mediante
digestión de pUAC29b con BglII y BamHI fue insertado en el sitio
BglII de pUAC21a.
pEAC3: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUAC5a con EcoRI y SalI fue insertado entre los sitios EcoRI y
SalI de pYPR2831.
pEAC6: Una parte de pEAC3 fue amplificada
mediante PCR (patrón: pEAC3, iniciadores: MEL1-sen3
y MEL1-anti2) y subclonada en
pGEM-T, y un fragmento obtenido mediante digestión
del plásmido obtenido con SacI fue insertado en el sitio SacI de
pYEX-S1.
pEAC6a: Se introdujo una mutación en pEAC6
(iniciadores: YEX-SM2 y
YEX-SM3).
pEAC7: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUAC8 con SacI y BglII fue insertado entre los sitios SacI y
BglII de pEAC6a.
pEAC7a: Se introdujo una mutación en pEAC7
(iniciadores: YEX-SM4 y
YEX-SM5).
pEAC8: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUAC13 con SacI y BglII fue insertado entre los sitios SacI y
BglII de pEAC6a.
pEAC8a: Se introdujo una mutación en pEAC8
(iniciador: YEX-SM6).
pEAC9: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUAC14 con SacI y BglII fue insertado entre los sitios SacI y
BglII de pEAC6a.
pEAC11: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pEAC7a con SacI y NdeI fue insertado entre los sitios SacI y
NdeI de pUAC16.
pEAC12: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pEAC9 con SacI y BglII fue insertado en los sitios SacI y BglII
de pEAC11.
En la Figura 1, para pEAC6a, el indicador es
\alpha-galactosidasa. Para pEAC8a, el indicador
es GFPuv. Para pUAC19, el indicador es EGFP, el marcador es URA3, y
AS es la señal de anclaje CWP2. Para pUAC19a, el indicador es EGFP,
el marcador es URA3, y AS es la señal de anclaje CWP2. Para
pUAC20a, el indicador es EGFP, el marcador es LEU2, y AS es la
señal de anclaje CWP2. Para pUAC21a, el indicador es EGFP, el
marcador es TRP1, y AS es la señal de anclaje CWP2. Para pUAC29b,
el indicador es EGFP, el marcador es LEU2, y AS es la señal de
anclaje GAS1. Para pUAC30b, el indicador es EGFP, el marcador es
URA3, y AS es la señal de anclaje GAS1. Para pUAC31b, el indicador
es EGFPuv, el marcador es TRP1, y AS es la señal de anclaje
GAS1.
Se eligió como proteína indicadora,
\alpha-galactosidasa derivada de S.
cerevisiae (Turakainen, H., et al., Appl. Environ.
Microbiol., 59, 2622-2630, 1993; MEL1) o una
proteína fluorescente verde (GFP). Como GFP, se utilizaron GFPuv y
EGFPuv (Cormack, B. P., et al., Gene, 173, 33-38,
1996; obtenida introduciendo una mutación en GFPuv de forma que
Phe64 y Ser65 sean reemplazadas con Leu y Thr, respectivamente). Se
diseñó un gen que codifica una proteína de fusión que consta de
cada una de las proteínas añadidas con una señal secretora de SUC2
en el N-terminal y una señal de anclaje CWP2 vía GPI
en el C-terminal, y el gen fue insertado entre el
promotor y el exterminador del gen fosfoglicerato quinasa a fin de
obtener una "casete de expresión". Se obtuvieron levaduras
estructurales tipo pared mediante transformación utilizando un
plásmido obtenido por la inserción de la casete de expresión en un
vector tipo YEp (pEAC6a, pEAC8a o pEAC9) para cepas AYE1, AYE2 o
AYE3, o por linearización de un plásmido obtenido mediante inserción
de la casete de expresión en un vector tipo YIp (pUAC19a, pUAC20a o
pUAC21a) e introducción entonces en ADN cromosómico de cada cepa
(cepas AY-2, AY-5,
AY-16, AY-14 o
AY-17). La levadura estructural tipo membrana
(cepas AY-12 o AY-15) se preparó
reemplazando la señal de anclaje vía GPI con cualquiera de las
derivadas de GAS1 (pUAC29b, pUAC30b o pUAC31b). Las cepas
preparadas se exponen en la Tabla 2.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron apropiadamente YPAUD (1% extracto
de levadura, 2% peptona, 2% glucosa, 40 \mug/ml adenina, 20
\mug/ml uracilo), RPMIB (RPMI1640 (Sigma), 1 M sorbitol, 100 mM
tampón fosfato potásico (pH 4,0-7,0), 2% glucosa, 40
\mug/ml adenina, 20 \mug/ml uracilo) e YNB (0,67% levadura base
nitrógeno sin aminoácido (Difco), 2% glucosa, nutrientes adicionales
(40 \mug/ml adenina, 20 \mug/ml histidina, 60 \mug/ml
leucina, 30 \mug/ml lisina, 40 \mug/ml de triptófano, 20
\mug/ml uracilo)). Los medios agar fueron obtenidos añadiendo
1,5-2% de agarosa a los antes mencionados medios
líquidos.
Se utilizó el procedimiento de Schreuder et
al. (Schreuder, M. P., et al., Yeast, 9,
399-409, 1993). Se añadieron 160 \mul de un
caldo de cultivo de una cepa levadura cultivada en YNB en la última
fase de crecimiento logarítmico con 20 \mul de cada uno de 1 M
tampón acetato (pH 4,5) y 0,1 M
p-nitrofenil-\alpha-galactopiranosida
(Boehringer Mannheim) y se dejó reaccionar a 37ºC durante 5 minutos.
La mezcla de reacción se añadió con 1 ml de carbonato sódico al 2%,
y entonces se midió la absorbancia (OD_{410}).
Células de levadura cultivadas en RPMIB (pH 7,0)
en la fase de crecimiento logarítmico se cosecharon y
resuspendieron con agua a OD_{595}=1,0, y se realizó la medición.
La intensidad fluorescente y las longitudes de onda óptimas se
midieron utilizando un fluorómetro (F-2000, Hitachi
Koki Co., Ltd.). Además, se detectó la fluorescencia de cada célula
utilizando un microscopio fluorescente (Axioplan, Zeiss).
Células de levadura cultivadas en un medio
líquido en la fase de crecimiento logarítmico se cosecharon y
resuspendieron con un tampón apropiado. La mezcla se añadió con
400-6,25 \mug/ml de Zymolyase 100T (Seikagaku
Corporation) y agitada a 30ºC durante 30 minutos. Después de la
reacción, las células de levadura y el tampón se separaron mediante
filtración por medio de un filtro, y la intensidad de fluorescencia
en el tampón se midió por un fluorómetro (excitación=487 nm,
emisión=513 nm).
Células de levadura (cepa AY-2)
cultivadas en un medio líquido en la fase de crecimiento
logarítmico fueron fragmentadas físicamente utilizando cuentas de
vidrio, entonces se fraccionaron la pared celular, membrana celular
y proteínas solubles, y cada fracción fue suspendida en un tampón
apropiado. Se midió la intensidad de fluorescencia de cada fracción
(excitación=487 nm, emisión=513 nm) y se representó en términos de
una proporción basada en la intensidad total de fluorescencia del
conjunto de células.
La cepa KRE6 fragmentada (cepa
AY-16) se cultivó con agitación a 30ºC. El fluido de
cultivo se filtró mediante un filtro después de 3 y 6 horas, y se
midió la intensidad de la fluorescencia en el medio.
Se cosecharon las células de levadura cultivadas
en la fase de crecimiento logarítmico (cepa AY-2 o
cepa AY-12), y se dejaron actuar sobre las células
de levadura varios agentes. Se midió la intensidad de fluorescencia
del cultivo sobrenadante utilizando un fluorómetro Cytofluor 2300
(Millipore, excitación=480 nm, emisión=530 nm). La intensidad de
fluorescencia tras tratamiento con cada uno de los varios agentes
se mostró en términos de una diferencia de intensidad de
fluorescencia comparada con la propia de un control en el que no se
añadió agente.
Se produjeron diversas levaduras estructurales
tipo pared, utilizando tres clases de proteínas indicadoras,
\alpha-galactocidase, GFPuv y EGFPuv, y aplicando
un método de utilizar un vector con alto número de copia o un método
de inserción en el cromosoma como un procedimiento de expresión, y
se comparó la actividad de \alpha-galactosidasa e
intensidad de fluorescencia prestada por estas cepas de levadura.
Como resultado, solamente se observó una débil actividad en ambas
de las cepas expresoras de \alpha-galactosidasa
(cepa AYE-1 y cepa AYE-2). Además,
cuando se examinó una cepa de levadura (cepa AYE-3)
en la cual se expresó GFPuv utilizando un vector con alto número de
copia con un microscopio de fluorescencia, se observó una
dispersión significativa en la intensidad de fluorescencia entre
las células individuales, lo que sugería la existencia de un
problema en la estabilidad del plásmido. Mientras que cuando se
compararon (Tabla 3) intensidades de fluorescencia de las cepas
obtenidas por inserción de casetes de expresión EGFPuv y GFPuv en el
cromosoma (cepa AY-5 y cepa AY-17),
la intensidad de fluorescencia de EGFPuv fue tres o más veces mayor
que la de GFPuv. Con fundamento en estos resultados, se concluyó que
el empleo de una proteína fluorescente como proteína indicadora era
apropiado y que la cepa en la cual fue insertada EGFPuv en el
cromosoma como la proteína indicadora era particularmente
preferible. Cuando se midieron las longitudes de onda óptimas de la
cepa, la excitación máx. apareció como 487 nm, y la emisión máx.
como 513 nm.
La cepa en la fase de crecimiento logarítmico se
suspendió en agua y se midió su intensidad de fluorescencia.
La cepa AY-2 fue cultivada en un
tubo de ensayo, y las células se cosecharon y trataron con
zimoliasa. Se midió la intensidad de fluorescencia en el cultivo
sobrenadante después de tratamiento con zimoliasa. Cuando se deja
actuar la zimoliasa sobre la cepa AY-2 bajo
protección de la presión osmótica, se incrementa la intensidad de
fluorescencia en el tampón dependiendo de la concentración de la
zimoliasa añadida (Tabla 4). Estos resultados sugieren que una gran
cantidad de GFP estaba fijada sobre la pared celular.
Se estima que al menos 6 clases de enzimas están
implicados en la biosíntesis de
(1,6)-\beta-glucano en
Saccharomyces cerevisiae. Entre estos enzimas, se ha revelado
que al menos uno de un producto (una proteína) codificado por el
gen KRE6 presente en el cuerpo de Golgi y un producto (una
proteína) codificado por el gen SKN1, que es un homólogo del mismo,
es esencial para el crecimiento (Gaughran, J. P. et al., J.
Bacteriol., 176, pág. 5857-5860, 1994). Además,
se estima que existen también ampliamente homólogos de KRE6 en
hongos, tal como Candida albicans (típico hongo patogénico).
Con fundamento en los anteriores hallazgos, se espera que Kre6p (un
producto del gen KRE6) sea un objetivo preferible para el desarrollo
de nuevos agentes antifúngicos.
Para verificar el efecto de la liberación de GFP
por la disrupción de KRE6, las cepas AY-5 y
AY-16 (KRE6 fragmentada) fueron cultivadas en tubos
de ensayo, y la liberación de GFP se midió con el transcurso del
tiempo (Figura 2). Como resultado, casi el mismo nivel de
intensidades de fluorescencia se detectó en los fluidos de cultivo
(levadura+medio) para ambas cepas en cualquier tiempo durante el
periodo de cultivo, mientras que la intensidad de fluorescencia en
el cultivo sobrenadante de la cepa AY-16 fue
aparentemente más elevada que la de la cepa AY-5.
Además, cuando estas dos cepas de levadura fueron cultivadas en
tubos de ensayo y las células fueron examinadas en la fase de
crecimiento logarítmico bajo un microscopio de fluorescencia
(x400), la intensidad de fluorescencia de la cepa
AY-16 se atenuó. Estos resultados sugieren que la
disrupción de KRE6 acelera la liberación de GFP. Por lo tanto,
estos resultados empíricos indican que un agente que inhibe el
producto del gen KRE6 puede ser cribado con éxito utilizando los
microorganismos preparados (levaduras estructurales).
La localización de GFP se comparó en la cepa
AY-2 (levadura estructural tipo pared) y la
AY-12 cepa (levadura estructural tipo membrana).
Cada cepa levadura se cultivó en un tubo de ensayo, y las células
fueron cosechadas y fraccionadas en la pared celular, membrana
celular, y proteínas solubles. Las intensidades de fluorescencia de
las fracciones resultantes fueron medidas y cada relación fue
calculada (unidad: %) con fundamento en la intensidad de
fluorescencia total. Los resultados se exponen en la Tabla 5. Se
revelé que una gran cantidad respectiva de GFP estaba fijada sobre
la pared celular de la levadura estructural tipo pared y la
membrana celular de la levadura estructural tipo membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprobar si el procedimiento antes
mencionado puede ser utilizado o no para una criba de agentes con
un sitio de acceso distinto del Kre6p, los efectos de la liberación
de GFP en la cepa AY-2 (levadura estructural tipo
pared) y la cepa AY-12 (levadura estructural tipo
membrana) se compararon bajo la acción de agentes antifúngicos
disponibles. Las células de cepa AY-2 y las células
de cepa AY-12 cada una cultivadas en un tubo de
ensayo se suspendieron con un medio (RPMIB) protegido de presión
osmótica, y se dejó actuar sobre las células a cada uno de los
agentes. Después del cultivo, se midió la intensidad de
fluorescencia del sobrenadante, y se calculó la diferencia con un
control sin adición del agente. Los resultados se exponen en la
Figura 3.
Un marcado efecto de la liberación de GFP se
observó en la cepa AY-2 tratada con aculeacina A
(inhibidor de síntesis
(1,3)-\beta-glucano) y
tunicamicina (inhibidor de síntesis manano) actuando ambas sobre
las paredes celulares, mientras que casi no se observó efecto de la
liberación en la cepa AY-12. Ligero efecto de la
liberación se observó en ambas cepas tratadas con anfotericina B,
fluconazol y salinomicina las cuales actúan sobre la membrana
celular. Los agentes distintos de los anteriores no proporcionaron
un claro efecto de la liberación de GFP solamente sobre la levadura
estructural tipo pared (cepa AY-2). Estos
resultados revelan que diversas clases de agentes que actúan sobre
una pared celular pueden ser cribados con éxito mediante el
procedimiento de cribado antes mencionado.
Los genes incorporados en los microorganismos,
la cepa AY-15 y la cepa AY-14, se
exponen en el siguiente listado de secuencias.
SEQ ID No: 1 es el gen incorporado en la cepa
AY-15, que es una levadura estructural tipo
membrana, como un gen tipo genoma-incorporado. El
gen corresponde a una secuencia nucleotídica de SS (señal
secretora)-EGFPuv-señal de anclaje
de membrana (AS) y fue obtenido añadiendo mutaciones a un GFPuv
disponible comercialmente (la posición 312 fue sustituida con
"g", la posición 315 con "a", y la posición 316 con
"a" para los nucleótidos que en el GFPuv original eran
"t", "c" y "t", respectivamente).
SEQ ID No: 2 es el gen incorporado en la cepa
AY-14, que es una levadura estructural tipo pared,
como un gen tipo genoma-incorporado. El gen
corresponde a una secuencia nucleotídica de SS (señal
secretora)-EGFPuv-señal de anclaje
de pared (AS) y fue obtenido añadiendo mutaciones a un GFPuv
disponible comercialmente (la posición 312 fue reemplazada con
"g", la posición 315 con "a", y la posición 316 con
"a" para los nucleótidos que en el GFPuv original eran
"t", "c" y "t", respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
(Presente
invención)
Se utilizaron cepas de Escherichia coli
JM109 y DH5\alpha, y cepas de Saccharomyces. cerevisiae
YPH499 y YPH500. La transformación se realizó según el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1 mencionado anteriormente o utilizando un
kit de transformación de levadura (Invitrogen, Carlsbad, Calif.,
USA) de acuerdo con el manual del envase. Las cepas utilizadas en
este ejemplo se exponen en la Tabla 6. En cuanto al medio, se
utilizaron apropiadamente los descritos en el Ejemplo 1.
En el experimento, las siguientes 24 clases de
oligonucleótidos fueron sintetizadas y utilizadas
apropiadamente.
KRE6-Sen3
(5'-CGCGGCCGTAACAAAACGAACAACATGAGACAAAACCCG-3')
KRE6-Ant3
(5'-CGAGGCCTTTAGTTCCCTTTATGACCCGATTTGAAC-3')
SKN1-Sen1
(5'-CGAAGCTTCTTCGTATTTTCAGTCGCTC-3')
SKN1-Ant1
(5'-CGATGGCTGCTTCCGTACCCAAATCT-3')
GAS1-Sen1
(5'-GCGCATGCCGCAAACGTGGAGATGGGAA-3')
GAS1-Ant1
(5'-GCCCGCGGCTTATCGAGTTATTATGTATGTGTCGAAGC-3')
GPI1-Sen1
(5'-GCGCATGCTTCCTTATGTTAGCTTGTCACC-3')
GPI1-Ant1
(5'-GCGCATGCCTTTACACTCAATGGCTTACATGGCA-3')
KEX2-Sen1
(5'-GCGCATGCGACGTGTTCTTTCTCTCGTTTC-3')
KEX2-Ant1
(5'-GCGCATGCATTTTATTCGCGGGTGCAAACAAT-3')
BCK1-Sen1
(5'-GCGCATGCAGCACATACACATTCTAGGTCTGATTCG-3')
BCK1-Ant1
(5'-GCGCATGCGGAATTGGTGGTGCCGATTTTGACTTTCC-3')
PMT1-Sen1
(5'-GCGCATGCTCATTCTACGCTTGTCATCCAC-3')
PMT1-Ant1
(5'-GCGCATGCGCGAAATGATAATACCACTGAAACTACTTG-3')
PMT2-Sen1
(5'-GCCAGCTGGTTCTTTCCATATTCACCACGTTTGTCG-3')
PMT2-Ant1
(5'-GCCAGCTGAGTACCAGAAGCAACCAATTACAAGTGCCA-3')
PMT4-Sen1
(5'-GCGCATGCGTTGAAGTACACGAAGGCCGCGC-3')
PMT4-Ant1
(5'-GCGCATGCAAGGCGTTCAGTTCGTTTGTGGTTAGTG-3')
KRE2-Sen1
(5'-GCGGATCCACCAGCAACAAACCAATACAGACCA-3')
KRE2-Ant1
(5'-GCGGATCCGTTTCATTTGTTTTATCTCGGCTCG-3')
MNN9-Sen1
(5'-GCGGATCCAAAAAATCATCATCACATCACAGAACCG-3')
MNN9-Ant1
(5'-GCGGATCCAAGCGCATTGACTGGAGAAGGT-3')
FKS1-Sen1
(5'-GCGGATCCATGAAACTCTAATCCTACTATCGGCG-3')
FKS1-Ant1
(5'-GCGGATCCTGCTCCTCATACCTTAAACCGG-3')
Utilizando pAUC19a, pUAC29b, pUAC20a, pUAC30b,
pUAC21a, pUAC31b (para éstos, ver la Figura 8), pUC19 y YEp24
descritos en el Ejemplo 1, se prepararon los plásmidos siguientes.
Se utilizó el sistema vector pGEM-T (Promega,
Madison, Wis., USA) para la subclonación de productos PCR, y se
llevó a cabo recuperación de fragmentos de ADN desde agarosa,
enlace y digestión con enzimas de restricción según los
procedimientos descritos en el Ejemplo 1.
pUXS1: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con HindIII (Ura3) fue insertado en el sitio HindIII de
pUC19.
pUAO1: KRE6 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
KRE6-sen3 y KRE6-ant3) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB1: SKN1 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
SKN1-sen1 y SKN1-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB3: GAS1 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
GAS1-sen1 y GAS1-ant1) y subclonada
en PGEM-T.
pUAB4: GPI1 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
GPI1-sen1 y GPI1-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB5: KEX2 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
KEX2-sen1 y KEX2-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB6: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con ClaI y SmaI fue insertado en los sitios ClaI y MscI de
pUAB3.
pUAB7: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con ClaI y SmaI fue insertado en los sitios ClaI y HpaI de
pUAB4.
pUAB8: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con ClaI y NheI fue insertado en los sitios ClaI y XbaI de
pUAB5.
pUAB9: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con BamHI y EcoRI fue insertado en los sitios BgIII y
EcoRI de pUAO1.
pUAB10: Un fragmento obtenido mediante digestión
de pUXS1 con KpnI y PvuII fue insertado en los sitios ClaI y XbaI
de pUAB1.
pUAB11: BCK1 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
BCK1-sen1 y BCK1-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB12: PMT1 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
PMT1-sen1 y PMT1-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB13: PMT2 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
PMT2-sen1 y PMT2-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB14: PMT4 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
PMT4-sen1 y PMT4-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB15: KRE2 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
KRE2-sen1 y KRE2-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB16: FKS1 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
FKS1-sen1 y FKS1-ant1) y subclonada
en pGEM-T.
pUAB17: MNN9 fue amplificada mediante PCR
(patrón: ADN cromosómico de cepa YPH500, iniciadores:
MNN9-sen1 y MNN9-ant1) y subclonada en pGEM-T.
MNN9-sen1 y MNN9-ant1) y subclonada en pGEM-T.
pUAB18: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con EcoRI y NheI fue insertado en los sitios EcoRI y NheI
de pUAB11.
pUAB19: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con EcoRI y SmaI fue insertado en los sitios EcoRI y EcoRV
de pUAB12.
pUAB20: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con EcoRI y SalI fue insertado en los sitios XhoI y MunI
de pUAB13.
pUAB21: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con ClaI y SmaI fue insertado en los sitios ClaI y HpaI de
pUAB14.
pUAB22: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con EcoRI y SmaI fue insertado en los sitios EcoRI y EcoRV
de pUAB15.
pUAB23: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con EcoRI y SmaI fue insertado en los sitios EcoRI y EcoRV
de pUAB16.
pUAB24: Un fragmento obtenido mediante digestión
de YEp24 con EcoRI y SmaI fue insertado en los sitios EcoRI y HpaI
de pUAB17.
La disrupción de genes se realizó de una forma
convencional. Las cepas de gen fragmentado preparadas se exponen en
la anterior Tabla 6, junto con los plásmidos utilizados. Las cepas
AY-10k, AY-101,
AY-12k y AY-121 se prepararon como
sigue. La cepa YPH499 se transformó con YEp24, y el transformante
formado se conjugó con la cepa AY-10 o cepa AY- 12.
Los plásmidos fueron eliminados de los diploides resultantes a fin
de obtener cepa AY-17 y cepa AY-18,
respectivamente. Las cepas AY-17 y
AY-18 fueron transformadas con un producto SphI de
digestión de pUAB7 o producto Eco521 de digestión de pUAB9, y se
separaron los haploides de los transformantes obtenidos. El
haploide resultante y las cepas AY-10u fueron por
su parte inoculados en el medio RPMIB, y cultivados a 30ºC con
agitación. Se compararon las intensidades de fluorescencia de los
fluidos resultantes del cultivo para seleccionar colonias que
presentan una intensidad comparable a la obtenida con la cepa
AY-10u así como cepas AY-10k,
AY-101, AY-12k y
AY-12I.
Se cosecharon las células en la fase de
crecimiento logarítmico después de inoculación en el medio líquido
y cultivo a 30ºC, y se suspendieron en un nuevo medio del mismo tipo
para preparar una suspensión celular por inoculación. Las células
fueron cultivadas a 30ºC. Se midió la intensidad de fluorescencia
del cultivo sobrenadante (excitación=480 nm, emisión=530 nm)
utilizando ARVO sx (Wallac, Tokyo). El efecto de la liberación de
GFP de las cepas de gen fragmentado se representó en términos de
una diferencia con la propia de una cepa sin gen fragmentado (cepa
AY-10u o cepa AY12u). Después de la medida de la
intensidad de fluorescencia, los cultivos sobrenadantes fueron
concentrados mediante ultrafiltración. Los sobrenadantes
concentrados se sometieron a separación mediante
SDS-PAGE y absorción sobre una membrana PVDF, y se
detectó la GFP utilizando anticuerpos anti-GFP
disponibles comercialmente (conejo IgG, Santa Cruz Biotechnology)
para comparar los pesos moleculares (detección "Western
blotting").
Se utilizaron, tunicamicina (TM, Funakoshi,
Tokio), aculeacina A (AC, Wako Pure Chemical Industries, Osaka) y
estaurosporina (SP, Boehringer Mannheim, Tokio) como agentes
confirmados por poseer una acción inhibitoria de síntesis de la
pared celular de levaduras. La cepa AY-14 se
utilizó como un microorganismo.
Cuando se inhibió la síntesis de cadenas
sacáridas de la pared celular o la síntesis normal de la pared
celular, la GFP fue liberada desde las paredes celulares en el medio
(Ejemplo 1). Según se representa en la Figura 9, cuando se
fragmentó un gen implicado en la síntesis de la pared celular (ver
Tabla 7), no se observó liberación significativa para todas las
cepas de gen fragmentado obtenidas desde la cepa
AY-12 (levadura estructural tipo membrana) como una
cepa madre, mientras que se observó evidente liberación de GFP para
las cepas de gen fragmentado obtenidas desde la cepa
AY-10 (levadura estructural tipo pared) como una
cepa madre, especialmente, la cepa \DeltaGAS1 (\Delta indica
disrupción del gen, y el mismo símbolo se utilizará a
continuación), cepa \DeltaGPI1, cepa \DeltaKRE6 y cepa
\DeltaPMT2. Estos resultados sugieren que pueden ser cribados por
este procedimiento los agentes que inhiben la vía de biosíntesis de
(1,6)-\beta-glucano (KRE6),
biosíntesis de anclaje GPI (GPI1), vía de síntesis de cadenas
sacáridas O-tipo (PMT2) y la reacción de entrelazado
de cadena sacárida hetérica (GAS1).
Cuando cada uno de SP (PKC1 inhibidor de
proteína quinasa C), AC (inhibidor de síntesis de
(1,3)-\beta-glucano) y TM
(inhibidor de síntesis de cadena sacárida N-tipo),
que inhiben la síntesis de polímeros de la pared celular, se
dejaron actuar aisladamente en el experimento sobre la cepa
AY-14, se observó liberación de GFP (los efectos de
la liberación de AC y TM se representan en el Ejemplo 1). Así, es
evidente que también pueden ser cribados los inhibidores para la
vía de síntesis de
(1,3)-\beta-glucano, vía de
síntesis de cadena sacárida N-tipo, vía reguladora
de síntesis de cadena sacárida (glucano), y similares.
Entre las vías de inhibición (sitios de acceso)
del agente seleccionado por este procedimiento, aquellas sugeridas
como vías en las cuales existe un enzima específico para hongos y
que existe solamente en hongos, son la vía de síntesis de
(1,3)-\beta-glucano, vía de
síntesis de (1,6)-\beta-glucano,
vía de síntesis de cadena sacárida O-tipo y reacción
de polimerización (o entrelazado) de cadenas sacáridas hetéricas
(Tabla 7). Por tanto, se requiere una operación para seleccionar,
además, agentes que inhiben vías o reacciones bioquímicas
específicas para hongos en cada sitio de acceso desde los agentes
seleccionados mediante la criba antes mencionada.
En la Figura 10, se exponen los resultados del
análisis del peso molecular de GFP liberada desde las cepas de gen
fragmentado con base en la detección "Western blotting". Como
se aprecia a partir de estos resultados, el peso molecular de GFP
liberada por las cepas de gen fragmentado proporciona una
diversidad de cambios.
En la Figura 11, se representan los resultados
de la comparación de los pesos moleculares de GFP liberada
observados cuando aisladamente cada uno de SP (PKC1 inhibidor de
proteína quinasa C), AC (inhibidor de síntesis de
(1,3)-\beta-glucano) y TM
(inhibidor de síntesis de cadena sacárida N-tipo)
se dejó actuar sobre la cepa AY-14. El peso
molecular de GFP fue marcadamente reducido por la acción de TM,
comparado con lo observado en ausencia de la acción del agente.
Además, el peso molecular de la GFP liberada se incrementó
aproximadamente en 10 kDa o menos mediante la acción de AC, mientras
que el peso molecular se redujo aproximadamente en 10 kDa o menos
por la acción de SP.
Según se ha descrito, la presencia de un enzima
específico para hongos está sugerida en la vía de síntesis de
(1,3)-\beta-glucano, vía de
síntesis de (1,6)-\beta-glucano,
vía de síntesis de cadena sacárida O-tipo y
reacción de polimerización (o entrelazado) de cadenas sacáridas
hetéricas. Cuando se aplican los agentes que inhiben cualquiera de
estas vías de síntesis o reacción bioquímica, el cambio del peso
molecular de GFP fue tan escaso como dentro del intervalo de 10
kDa. Mediante los agentes de cribado que proporcionan tal cambio en
peso molecular, pueden seleccionarse los agentes que poseen acción
selectiva sobre los hongos, especialmente sobre las paredes
celulares de los hongos.
Según el procedimiento de la presente invención,
un sitio de acceso de un agente que posee una acción inhibitoria
selectiva sobre una pared celular puede ser determinado conveniente
y adecuadamente, y así un agente dirigido hacia un sitio de acceso
deseable puede ser cribado eficientemente entre los agentes que
actúan sobre una pared celular.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para cribar un agente
que actúa sobre la pared celular
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A21544M
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para cribar un agente
que actúa sobre la pared celular
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P21315EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 02 775 378.9
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-10-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 323293/2001
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-10-22
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (6)
1. Un procedimiento para cribar un agente que
está dirigido hacia un sitio de acceso particular de agentes que
actúan sobre la biosíntesis de la pared de células fúngicas, que
comprende las etapas:
(1) cultivar un microorganismo fúngico que
presenta una proteína indicadora fijada sobre una pared celular
como una proteína anclada vía GPI en presencia de un agente de
ensayo que actúa sobre una pared celular;
(2) analizar una cadena sacárida de una
sustancia derivada de la proteína indicadora liberada en un fluido
de cultivo del microorganismo; y
(3) estimar un sitio de acceso del agente de
ensayo sobre la pared celular, con fundamento en la información de
la cadena sacárida de la sustancia derivada de la proteína
indicadora obtenida en la etapa (2).
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el cual el análisis de la cadena sacárida de la sustancia
derivada de la proteína indicadora se realiza midiendo el peso
molecular de la sustancia derivada de la proteína indicadora.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o
2, en el cual la proteína indicadora es una proteína fluorescente
verde.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el cual el agente que actúa sobre la
pared celular es un agente antifúngico.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el cual antes de la etapa (1) los
agentes que actúan sobre una pared celular son cribados mediante las
siguientes etapas:
(A1) cultivar un microorganismo que posee una
proteína indicadora `ijada sobre una pared celular como una
proteína anclada vía GPI y un microorganismo que presenta una
proteína indicadora fijada sobre una membrana celular como una
proteína anclada vía GPI en presencia de un agente de ensayo;
(A2) determinar una sustancia derivada de la
proteína indicadora liberada en cada fluido de cultivo del
microorganismo cultivado; y
(A3) ponderar que el agente de ensayo es un
agente que posee una acción inhibitoria selectiva sobre una pared
celular cuando la sustancia derivada de la proteína indicadora es
liberada por el microorganismo que presenta la proteína indicadora
fijada sobre la pared celular en el fluido de cultivo y la
sustancia derivada de la proteína indicadora no es substancialmente
liberada por el microorganismo que posee la proteína indicadora
fijada sobre la membrana celular en el fluido de cultivo; y
entonces las etapas (1) a (3) se realizan para los agentes en que
se ha determinado que son agentes que presentan una acción
inhibitoria selectiva sobre una pared celular en la etapa (A3).
6. Un procedimiento para estimar un sitio de
acceso de un agente que actúa sobre la biosíntesis de la pared de
células fúngicas, que comprende las etapas:
(1) cultivar un microorganismo fúngico que
presenta una proteína indicadora fijada sobre una pared celular
como una proteína anclada vía GPI en presencia de un agente de
ensayo que actúa sobre una pared celular;
(2) analizar una cadena sacárida de una
sustancia derivada de la proteína indicadora liberada en un fluido
de cultivo del microorganismo; y
(3) estimar un sitio de acceso del agente de
ensayo sobre la pared celular, con fundamento en la información de
la cadena sacárida de la sustancia derivada de la proteína
indicadora obtenida en la etapa (2).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001323293 | 2001-10-22 | ||
| JP2001-323293 | 2001-10-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2294172T3 true ES2294172T3 (es) | 2008-04-01 |
Family
ID=19140207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02775378T Expired - Lifetime ES2294172T3 (es) | 2001-10-22 | 2002-10-22 | Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7459268B2 (es) |
| EP (1) | EP1445327B1 (es) |
| JP (1) | JP4204471B2 (es) |
| AT (1) | ATE370243T1 (es) |
| CA (1) | CA2464396A1 (es) |
| DE (1) | DE60221883T2 (es) |
| ES (1) | ES2294172T3 (es) |
| NO (1) | NO20042089L (es) |
| WO (1) | WO2003035898A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2294172T3 (es) | 2001-10-22 | 2008-04-01 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. |
| EP1926745A1 (en) * | 2005-09-22 | 2008-06-04 | Suntory Limited | Gene encoding cell wall mannoprotein and use thereof |
| TWI428091B (zh) * | 2007-10-23 | 2014-03-01 | Du Pont | 殺真菌劑混合物 |
| WO2020018888A1 (en) | 2018-07-20 | 2020-01-23 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Antimicrobial peptides and methods of use |
| CN115094142B (zh) * | 2022-07-19 | 2024-05-28 | 中国医学科学院肿瘤医院 | 用于诊断肺肠型腺癌的甲基化标志物 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU95105899A (ru) | 1992-07-08 | 1997-03-20 | Унилевер Н.В. (NL) | Способ иммобилизации фермента, полинуклеотид, вектор, химерный блок, низшие эукариоты, способ осуществления ферментативного процесса |
| JPH0956384A (ja) * | 1995-08-25 | 1997-03-04 | Toray Ind Inc | 細胞の標識方法 |
| EP0916726A1 (en) * | 1997-11-13 | 1999-05-19 | Rijksuniversiteit te Groningen | Attaching substances to micro-organisms |
| AU4566699A (en) * | 1998-06-25 | 2000-01-10 | Collaborative Group, Ltd., The | Beta(1,6)-glucan synthesis and cell wall assembly assay |
| JP2000102387A (ja) | 1998-09-29 | 2000-04-11 | Daicel Chem Ind Ltd | 発光蛋白質発現組換えベクター、及びこの組換えベクターにより形質転換された酵母 |
| AU2001252604A1 (en) | 2000-05-01 | 2001-11-12 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of screening drug acting on cell wall |
| ES2294172T3 (es) | 2001-10-22 | 2008-04-01 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. |
-
2002
- 2002-10-22 ES ES02775378T patent/ES2294172T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-22 CA CA002464396A patent/CA2464396A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-22 DE DE60221883T patent/DE60221883T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-22 AT AT02775378T patent/ATE370243T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-22 WO PCT/JP2002/010932 patent/WO2003035898A1/ja active IP Right Grant
- 2002-10-22 US US10/492,202 patent/US7459268B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-22 EP EP02775378A patent/EP1445327B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-22 JP JP2003538398A patent/JP4204471B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-05-21 NO NO20042089A patent/NO20042089L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4204471B2 (ja) | 2009-01-07 |
| US20050069965A1 (en) | 2005-03-31 |
| EP1445327A4 (en) | 2005-09-14 |
| CA2464396A1 (en) | 2003-05-01 |
| ATE370243T1 (de) | 2007-09-15 |
| EP1445327A1 (en) | 2004-08-11 |
| NO20042089L (no) | 2004-05-21 |
| JPWO2003035898A1 (ja) | 2005-02-10 |
| DE60221883D1 (de) | 2007-09-27 |
| WO2003035898A1 (fr) | 2003-05-01 |
| DE60221883T2 (de) | 2008-04-30 |
| US7459268B2 (en) | 2008-12-02 |
| EP1445327B1 (en) | 2007-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hein et al. | NPI1, an essential yeast gene involved in induced degradation of Gap1 and Fur4 permeases, encodes the Rsp5 ubiquitin—protein ligase | |
| Schuetzer‐Muehlbauer et al. | The Candida albicans Cdr2p ATP‐binding cassette (ABC) transporter confers resistance to caspofungin | |
| Binder et al. | Candida albicans | |
| Bermejo et al. | The sequential activation of the yeast HOG and SLT2 pathways is required for cell survival to cell wall stress | |
| Hamasaki et al. | The early secretory pathway contributes to autophagy in yeast | |
| Bonilla et al. | Mitogen-activated protein kinase stimulation of Ca2+ signaling is required for survival of endoplasmic reticulum stress in yeast | |
| Peterson et al. | The class C Vps complex functions at multiple stages of the vacuolar transport pathway | |
| Bahn et al. | Increased high‐affinity phosphodiesterase PDE2 gene expression in germ tubes counteracts CAP1‐dependent synthesis of cyclic AMP, limits hypha production and promotes virulence of Candida albicans | |
| Treitschke et al. | The myosin motor domain of fungal chitin synthase V is dispensable for vesicle motility but required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis | |
| Ecker et al. | Induction of autophagic flux by amino acid deprivation is distinct from nitrogen starvation-induced macroautophagy | |
| Nishikawa et al. | Molecular and phenotypic analysis of CaVRG4, encoding an essential Golgi apparatus GDP-mannose transporter | |
| Johnston et al. | Three prevacuolar compartment Rab GTPases impact Candida albicans hyphal growth | |
| ES2294172T3 (es) | Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. | |
| Pal et al. | SCFCdc4-mediated degradation of the Hac1p transcription factor regulates the unfolded protein response in Saccharomyces cerevisiae | |
| Johnston et al. | Role for endosomal and vacuolar GTPases in Candida albicans pathogenesis | |
| Straede et al. | The effect of tea tree oil and antifungal agents on a reporter for yeast cell integrity signalling | |
| Palmer | Endosomal and AP-3-dependent vacuolar trafficking routes make additive contributions to Candida albicans hyphal growth and pathogenesis | |
| ES2312425T3 (es) | Procedimiento para cribar un medicamento que actua sobre la pared celular. | |
| Kim et al. | Subunits of the vacuolar H+-ATPase complex, Vma4 and Vma10, are essential for virulence and represent potential drug targets in Candida albicans | |
| Shiflett et al. | Bph1p, the Saccharomyces cerevisiae homologue of CHS1/beige, functions in cell wall formation and protein sorting | |
| Fry et al. | Research Paper Early and Late Molecular Events of Glucose-Induced Pexophagy in Pichia pastoris Require Vac8 | |
| Randhawa et al. | The sixth HAMP domain negatively regulates the activity of the group III HHK containing seven HAMP domains | |
| Valenti et al. | Human gasdermin D and MLKL disrupt mitochondria, endocytic traffic and TORC1 signalling in budding yeast | |
| Liu et al. | Degradation of the gluconeogenic enzyme fructose-1, 6-bisphosphatase is dependent on the vacuolar ATPase | |
| US20090047701A1 (en) | Method for screening antifungal agents |