ES2293695T3 - Secuencias nucleotidicas que codifican el fenotipo del tomate que es hipersensible a la luz, proteinas codificadas y utlizaciones de las mismas. - Google Patents
Secuencias nucleotidicas que codifican el fenotipo del tomate que es hipersensible a la luz, proteinas codificadas y utlizaciones de las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína, o una parte funcional de la misma, la cual, si se modifica, es responsable del fenotipo mutante hipersensible a la luz en plantas Solanum lycopersicum, comprendiendo dicho fenotipo un crecimiento reducido de la planta asociado con niveles elevados de carotenoides y/o clorofilas y/o flavonoides, en el que dicha proteína es la proteína TDET1 (HP-2) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
Description
Secuencias nucleotídicas que codifican el
fenotipo del tomate que es hipersensible a la luz, proteínas
codificadas y utilizaciones de las mismas.
La presente invención se refiere a secuencias
nucleotídicas que codifican el fenotipo del tomate que es
hipersensible a la luz, a las proteínas codificadas y a las
utilizaciones de las mismas.
En particular, la presente invención se refiere
a secuencias nucleotídicas que codifican una proteína, cuya
modificación cualitativa o cuantitativa y/o inhibición en las
plantas induce niveles altos de carotenoides y/o flavonoides y/o
clorofilas, en comparación con las plantas de tipo natural o salvaje
("wild-type"); la presente invención también
se refiere a la utilización de estas secuencias nucleotídicas para
la producción de plantas mediante ingeniería genética para su
utilización en el sector agroindustrial.
La luz es una señal medioambiental crítica que
controla muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de las
plantas. Se percibe por una serie sofisticada de fotorreceptores:
los fitocromos, que absorben la luz roja y roja lejana, los
criptocromos, que absorben longitudes de onda de luz azul y
UV-A, y los receptores UV-B
(Mustilli y Bowler, 1997). Junto con las señales hormonales
endógenas, estos fotorreceptores regulan los cambios en el
desarrollo conocidos como fotomorfogénesis. La fotomorfogénesis se
define como la influencia de la luz en el desarrollo de la planta y
comprende el desarrollo de las hojas y de los cloroplastos y la
regulación de los componentes del aparato fotosintético, mediante
la expresión coordinada tanto de los genes nucleares como
citoplásmicos. Además, debido a la respuesta a la luz, también se
producen pigmentos fotoprotectores, tales como los flavonoides. Las
modificaciones que tienen lugar durante la fotomorfogénesis se han
caracterizado mediante el estudio de los efectos de la luz en el
desarrollo de la plántula de Arabidopsis (von Arnim y Deng,
1996). Las plántulas de Arabidopsis que han crecido con luz
muestran hipocotilos cortos, cotiledones abiertos y expandidos y la
expresión de genes regulados por la luz que son responsables de la
biosíntesis de flavonoides y clorofila (por ejemplo, chalcona
sintasa, CHS; proteína de unión a clorofila A/B, CAB). Las
plántulas que han crecido en oscuridad muestran hipocotilos
alargados, cotiledones cerrados y la represión de los genes
regulados por la luz.
En plantas superiores, los fitocromos están
codificados por una familia de genes (por ejemplo,
PHYA-E en Arabidopsis, Sharrock y Quail,
1989; Clack y otros, 1994) y aunque son los fotorreceptores mejor
caracterizados, se sabe relativamente poco acerca de la forma en
que las señales de luz percibidas por los fitocromos se transducen
al núcleo para activar las diferentes respuestas del desarrollo,
fisiológicas y moleculares a la luz. Recientemente, estudios
bioquímicos que utilizan la microinyección en células del tomate
mutante aurea (au) deficientes en fitocromo, junto con
estudios farmacéuticos en cultivos celulares fotomixotróficos de
soja, han implicado proteínas G heterotriméricas, GMPc, calcio y
calmodulina como intermediarios en las vías de transducción de
señal del fitocromo (Bowler y Chua, 1994; Mustilli y Bowler, 1997).
Paralelamente, se han desarrollado varias pantallas genéticas para
identificar mutantes potencialmente afectados en la transducción de
la señal de la luz (Chamowitz y Deng, 1996). La mayor parte de los
mutantes fotomorfogénicos se han caracterizado en Arabidopsis
y se pueden clasificar como mutantes insensibles o bien
constitutivos. Los mutantes insensibles muestran un fenotipo ciego
a la luz y alargado en la luz. Algunos están mutados en los propios
fotorreceptores, mientras que otros se supone que codifican
reguladores positivos de las vías de transducción de señal de luz
(Chamovitz y Deng, 1996; Chory y otros, 1996; Whitelam y Harberd,
1994). Por el contrario, los mutantes desetiolados constitutivos
(por ejemplo, cop/de/fus/cpd) muestran morfologías de
crecimiento con luz, cuando han crecido en oscuridad, en algunos
casos, junto con la expresión inadecuada de genes regulados por la
luz, tales como CAB y CHS (Millar y otros, 1994;
Szekeres y otros, 1996). La naturaleza recesiva de estas mutaciones
sugiere que presentan pérdida de función y que los genes de tipo
salvaje son represores de la fotomorfogénesis en la oscuridad. Sin
embargo, aunque los ensayos de epistasis con mutantes deficientes en
fitocromos han indicado que éstos funcionan más abajo
("downstream") del fitocromo, no están mutados específicamente
en la transducción de señal del fitocromo porque muchos tienen
especificidades de tejido modificadas, así como otros fenotipos
adicionales no relacionados directamente con la luz (Mayer y otros,
1996; Chory y Peto, 1990; Millar y otros, 1994; Szekeres y otros,
1996). Por lo tanto, no está claro como funcionan las proteínas
COP/DET/FUS/CPD en las vías de transducción de señal definidas
bioquímicamente (Bowler y Chua,
1994).
1994).
Un enfoque más dirigido para identificar
componentes específicos de las vías de transducción de señal
específicas para el fitocromo podría ser el aislamiento de mutantes
con dinámicas modificadas de respuestas a la luz, en lugar de
mutantes con fenotipos constitutivos en ausencia de luz. Algunos de
estos mutantes hipersensibles a la luz ya se han aislado en el caso
del tomate (denominados hp-1,
hp-2, atv, lp; Kendrick y otros, 1994). En
particular, se han caracterizado los mutantes recesivos no alélicos
hp-1 y hp-2 por su
grado de respuesta a la luz exagerado, mostrando niveles superiores
de antocianina (un subgrupo de flavonoide), hipocotilos más cortos
y frutos pigmentados más intensamente que las plantas salvajes.
Estos mutantes se identificaron por primera vez en 1917 (Reynard,
1956) y en 1975 (Soressi, 1975), respectivamente. Recientemente, se
han aislado mutantes hp-1^{W} (Peters y
otros, 1989) y hp-2^{j} (Van Tuinen y
otros, 1997) y se han identificado como nuevos alelos
hp-1 y hp-2,
respectivamente. Dado que estos fenotipos parecen ser idénticos a
los obtenidos por la expresión ectópica del fitocromo A
(PHYA) en tomate (Boylan y Quail, 1989), parecería que la
mutación hp puede influir bastante específicamente en las
respuestas del fitocromo. La naturaleza recesiva de las mutaciones,
asociada con los resultados de los ensayos de epistasis de
hp-1 con los tomates mutantes aurea (au),
phyA (fri), y phyB (tri) deficientes en fitocromo, han
sugerido que los genes HP codifican reguladores negativos de los
mecanismos de transducción de señal de luz, que actúan más abajo
("downstream") tanto de PhyA como de PhyB (Kerckhoffs y otros,
1997). El hecho de que no se hayan aislado homólogos de los
mutantes hp hasta el momento en Arabidopsis, junto con
la observación de que en tomate, la producción de antocianina y la
expresión de genes fotorregulados (por ejemplo, CHS y
CAB) es estrictamente dependiente de la luz, indica la
importancia de los mutantes hp para el estudio de la
transducción de señal dependiente de fitocromo. Además, los estudios
basados en microinyección, que utilizan el mutante de tomate au,
han mostrado que el tomate es un excelente sistema modelo para el
mapeo del papel de componentes individuales en la cascada de
señalización activada por fitocromo (Bowler y Chua, 1994). Por lo
tanto, la identificación y caracterización de genes hp es
probable que sea muy importante para el estudio de la regulación de
la fotomorfogénesis en las plantas. La publicación de Fray y otros
se refiere a tomates transgénicos que expresan un gen de fitoeno
sintasa de fruta y muestran, de este modo, un fenotipo que se
parece al fenotipo hipersensible a la luz al que se hace referencia
en la presente invención (Fray y otros, 1995). Tanksley y otros se
refieren a CT151 sin ninguna referencia a
hp-2 (Tanksley y otros, 1992) y Kerckhoffs y
otros muestran la participación de hp-2 en la
regulación de la biosíntesis de antocianina en tomate (Kerckhoffs y
otros,
1997).
1997).
Los autores de la presente invención han clonado
el gen HP-2 del tomate y han estudiado a nivel
molecular el papel de la proteína HP-2 durante la
modulación de la fotomorfogénesis y el desarrollo de la fruta. Los
presentes autores han encontrado que el gen HP-2 del
tomate muestra una homología de secuencia elevada con el gen
DET1 de Arabidopsis, que pertenece al grupo de
mutantes constitutivos COP/DET/FUS descritos anteriormente.
Por lo tanto, el gen HP-2 del tomate se ha
redenominado TDET1.
Los presentes autores han utilizado plantas de
la especie Solanum lycopersicum (tomate), pero los expertos
en la técnica reconocerán que la clonación se podría repetir, sin
esfuerzos inventivos, con cualquier otra especie de planta, sin que
constituya limitación, tal como pimiento, berenjena, soja, uva,
melón, arroz, zanahoria, espinaca, limón, pomaceae y especies
ornamentales. Los presentes autores han clonado y secuenciado el gen
responsable de la mutación hp de tomate (pigmento intenso),
que causa un fenotipo hipersensible a la luz, aumentando, de este
modo, los niveles de carotenoides, y/o clorofila y/o flavonoides. El
gen es el primero que se ha identificado que causa tal fenotipo
mutante.
Los mutantes hp potencialmente tienen una
aplicación directa en el sector agroindustrial para la generación
de frutos de tomate con contenidos elevados de carotenoides y/o
flavonoides. En particular, en los frutos de tomate de mutantes
hp, se ha observado un contenido elevado del carotenoide
licopeno, así como de otros carotenoides y flavonoides (Thompson,
1955; Yen y otros, 1997). Sin embargo, hasta el momento, la
utilización de mutantes hp en el sector agroindustrial,
incluso cultivados en diversas variedades comerciales, se ha visto
perjudicada por el hecho de que la mutación hp genera otros
fenotipos indeseados, tales como la longitud del internodo reducida
y vigor de planta reducido.
La clonación del gen TDET1 y su
utilización mediante tecnologías de transferencia de genes ofrece
ventajas considerables con respecto a las técnicas de reproducción
convencionales. Es posible la transferencia de genes adecuada para
la agricultura entre diferentes especies y la inactivación y/o
diseño de genes de la misma especie, incluso solamente en tejidos
vegetales específicos. Además, la transferencia de genes es una
técnica mucho más rápida que la reproducción convencional.
La clonación del gen TDET1 permite en la
actualidad la producción de plantas diseñadas genéticamente que
muestran todas las características favorables de la mutación
hp con ninguno de los efectos secundarios indeseados. Tales
plantas podrían pertenecer al género Solanum, pero los
expertos en la técnica reconocerán que, sin esfuerzo inventivo, es
posible transferir el gen o partes del mismo, subclonado en vectores
de expresión adecuados, a vegetales que pertenecen a diferentes
géneros, como por ejemplo, aunque no son limitativos, pimiento,
berenjena, soja, uva, melón, arroz, zanahoria, espinaca, limón,
pomaceae y especies ornamentales.
Realmente, se ha reconocido que una dieta rica
en licopeno y otros carotenoides o su administración en forma de
pastillas, produce efectos favorables en la salud humana. En
realidad, los carotenoides tienen propiedades antioxidantes, el
\beta-caroteno es una provitamina A y el licopeno
se sabe que es un agente antitumoral eficaz (Bartley y Scolnik,
1995; Giles e Ireland, 1997; Hoffmann y Weisburger, 1997; Pappalardo
y otros, 1997; Pool-Zobel y otros, 1997; Rock y
otros, 1997; Sharoni y otros, 1997; Stahl y Sies, 1996). Por lo
tanto, las plantas diseñadas genéticamente de la presente invención
se pueden utilizar ventajosamente como fuente de los mencionados
compuestos en forma de alimentos frescos o procesados o bien como
productos nutracéuticos.
Además, los mutantes hp-2
tienen niveles elevados de flavonoides, tales como antocianinas (Von
Wettstein-Knowles, 1968), las cuales también se
considera que son excelentes antioxidantes y las cuales muestran, en
algunos casos, propiedades antitumorales (Fotsis y otros, 1997;
Rice-Evans y otros, 1997). Además, algunos
flavonoides muestran un papel en la protección de los vegetales
contra agentes patogénicos y la irradiación con luz UV (Shirley,
1996).
Además, la manipulación de la actividad de TDET1
se puede utilizar para modificar el contenido de carotenoides y/o
flavonoides en algunas especies de plantas (por ejemplo, tomate,
pimiento, berenjena, soja, uva, melón, arroz, zanahoria, espinacas,
limón y pomaceae) para utilizaciones biotecnológicas en los sectores
biomédico y agroindustrial.
Además, la manipulación de la expresión del gen
TDET1 se puede utilizar para modificar el contenido de
antocianinas y carotenoides en especies ornamentales para la
obtención de nuevas variantes de color (Griesbach, 1984).
Además, dado que se ha reconocido que un elevado
contenido en carotenoides mejora la resistencia a los herbicidas
del tipo Norflurazon, otra aplicación del gen TDET1 es la
producción de plantas transgénicas mediante selección utilizando
herbicidas en lugar de compuestos antibióticos (Misawa y otros,
1993).
Además, en la misma planta es posible combinar
una actividad TDET1 modificada con mutaciones tales como rin,
nor y Nr, que interrumpen el proceso de maduración de
los frutos o con genes biosintéticos de la vía de biosíntesis de
carotenoides (Bartley y Scolnik, 1995), para obtener variedades que
muestran nuevas características cualitativas para la
agroindustria.
El logro de un fenotipo mutante hp
mediante el enfoque biotecnológico se puede llevar a cabo
ventajosamente mediante la inhibición de la actividad TDET1.
Actualmente, el mejor método para la reducción de la expresión de
genes es a través de la introducción, mediante transferencia de
genes, de la secuencia antisentido del mismo gen o parte del mismo
bajo el control de las secuencias reguladoras adecuadas. La
utilización de tales técnicas en plantas se ha llevado a cabo en
varios ejemplos existentes (Oeller y otros, 1991; Penarrubia y
otros, 1992), pero los expertos en la técnica reconocerán que se
pueden utilizar técnicas alternativas, sin alejarse del alcance de
la presente invención.
Además, mediante la utilización de vectores
específicos, tal como, por ejemplo, aunque no es limitativo,
pE8mGFP4, el cual contiene secuencias reguladoras del gen E8 de tomate (Figura 9) (Deikman y Fischer, 1988), la inactivación del gen TDET1 se puede modular específicamente en el fruto del tomate. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden utilizar otras secuencias reguladoras, por ejemplo, que se originen a partir del gen de la poligalacturonasa (PG) (Nicholass y otros, 1995), en lugar del promotor del gen E8 para obtener modulación de la expresión del gen TDET1 específica de tejido.
pE8mGFP4, el cual contiene secuencias reguladoras del gen E8 de tomate (Figura 9) (Deikman y Fischer, 1988), la inactivación del gen TDET1 se puede modular específicamente en el fruto del tomate. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden utilizar otras secuencias reguladoras, por ejemplo, que se originen a partir del gen de la poligalacturonasa (PG) (Nicholass y otros, 1995), en lugar del promotor del gen E8 para obtener modulación de la expresión del gen TDET1 específica de tejido.
Dentro del alcance de la presente invención el
término "fenotipo hipersensible a la luz" significa crecimiento
de la planta reducido asociado con niveles elevados de carotenoides
y/o clorofilas y/o flavonoides.
El término "proteína o partes funcionales de
la misma, responsables del fenotipo mutante hipersensible a la
luz" significa una secuencia de aminoácidos la cual, si se
modifica estructuralmente o de cualquier otra forma, induce un
fenotipo hipersensible a la luz en una planta.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención es una molécula de ácido nucleico aislada que codifica
una proteína o una parte funcional de la misma, la cual, si se
modifica, es responsable del fenotipo mutante hipersensible a la
luz en plantas Solanum lycopersicum, comprendiendo dicho
fenotipo un crecimiento reducido de la planta asociado con niveles
elevados de carotenoides y/o clorofilas y/o flavonoides, en el que
dicha proteína es la proteína TDET1 (HP-2) que
tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2.
Más preferentemente, la molécula de ácido
nucleico tiene una secuencia nucleotídica comprendida en SEQ ID No.
1 o una parte funcional de la misma, responsable del fenotipo
mutante hipersensible a la luz. Alternativamente, la molécula de
ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica complementaria a
la SEQ ID No. 1 o una parte funcional de la misma, responsable del
fenotipo mutante hipersensible a la luz.
En un aspecto de la presente invención el ácido
nucleico de SEQ ID No. 1 comprende una mutación que es capaz de
inducir el fenotipo mutante hipersensible a la luz; preferentemente,
una sustitución C\rightarrowT en la posición 1640;
alternativamente, el ácido nucleico de SEQ ID No. 1 se suprime del
nt. 1581 al nt. 1589.
Otro objetivo de la presente invención es un
vector de expresión que incluye, bajo el control de un promotor
vegetal activo e inducible, el ácido nucleico de la presente
invención. Preferentemente, el promotor es activo selectivamente en
frutos. Más preferentemente, el fruto es tomate. Los vectores
preferentes son capaces de conducir la transcripción de un ARN
antisentido, por ejemplo,
pBIN-E8-HP2-AS1 y
pBIN-E8-HP2-AS2.
Otro objetivo de la presente invención es la
utilización de vectores de la presente invención para la producción
de plantas transgénicas que comprenden el ácido nucleico, bajo el
control de secuencias reguladoras específicas, preferentemente en
órganos de la planta preseleccionados. Las plantas pertenecen al
género Solanum.
Otro objetivo de la presente invención es una
planta transgénica, que se puede conseguir mediante la
transformación con los vectores de la presente invención. Las
plantas pertenecen al género Solanum.
Los expertos en la materia conocen técnicas de
transformación genética de vegetales y comprenden, aunque no son
limitativas, la transformación mediante Agrobacterium, la
electroporación, la microinyección o el bombardeo con partículas
recubiertas con ADN (Christou, 1996). Otro objetivo de la presente
invención es un fruto de una planta de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención incluye
una proteína aislada, o una parte de la misma, la cual, si se
modifica, es responsable del fenotipo hipersensible a la luz en
plantas Solanum lycopersicum, en las que dicha proteína
tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
En un aspecto de la presente invención la
proteína comprende una modificación de la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID No. 2 o una parte de la misma, que es responsable del
fenotipo hipersensible a la luz en plantas Solanum
lycopersicum; preferentemente, como mínimo una modificación en
su parte C-terminal; más preferentemente, una
sustitución de prolina en la posición 498, la más preferente, serina
como sustituta de prolina; alternativamente, una supresión, como
mínimo de un aminoácido en el segundo dominio NLS, preferentemente,
como mínimo de tres aminoácidos, más preferentemente desde el aa.
478 hasta el aa. 480 de SEQ ID No. 2.
La presente invención se describirá con
referencia a ejemplos explicativos, aunque no limitativos, en los
que se hará referencia a las siguientes figuras:
Figura 1. Fenotipos de plántulas de tomate de
tipo salvaje, hp-2, y
hp-2^{j} que han crecido en presencia o
ausencia de luz. a) Longitud de hipocotilos de plántulas que han
crecido en ausencia (Oscuridad) y en presencia de luz (Luz). b)
Contenido de antocianinas en los hipocotilos (barras a rayas) y en
los cotiledones (barras vacías) de plántulas que han crecido con
luz. Los datos representan los valores promedio de diez plántulas.
Después de un periodo de pregerminación de tres días en oscuridad,
las plántulas se hicieron crecer en oscuridad (Oscuridad) o bien en
un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad (Luz)
durante 6 días.
Figura 2. Secuencia nucleotídica de ADNc de
TDET1 (HP-2) (SEQ ID NO. 1). La secuencia que
codifica la proteína TDET1 se representa en letras mayúsculas. La
secuencia del marcador CT151 de RFLP cubre desde el nt. 830 hasta
el nt. 2000.
Figura 3. Secuencia de aminoácidos de la
proteína TDET1 (HP-2) (SEQ ID No. 2). Los
aminoácidos se representan en el código estándar de una letra para
aminoácidos.
Figura 4. Estructura exón-intrón
del gen de tomate TDET1 (HP-2) y sitios de
las mutaciones en alelos mutantes hp-2 y
hp-2^{j}. Las cajas punteadas indican
exones. Los exones corresponden a las siguientes secuencias de SEQ
ID No. 1 (Figura 2): Exón 1: del nt. 149 al nt. 220; Exón 2: del nt.
221 al nt. 648; Exón 3: del nt. 649 al nt. 877; Exón 4: del nt. 877
al nt. 1012; Exón 5: del nt. 1013 al nt. 1081; Exón 6: del nt. 1082
al nt. 1138; Exón 7: del nt. 1139 al nt. 1219; Exón 8: del nt. 1220
al nt. 1384; Exón 9: del nt. 1385 al nt. 1480; Exón 10: del nt.
1481 al nt. 1580; Exón 11: del nt. 1581 al nt. 1720; b) Sitios de
corte y empalme ("splice sites") de donador y aceptor del
intrón 10 del tipo salvaje y del mutante
hp-2. Los paréntesis indican sitios de corte
y empalme, los puntos indican secuencia de intrón interna (no
mostrada), y los aminoácidos se muestran en el código de una letra.
El asterisco en la secuencia de hp-2 indica
el sitio de la mutación.
Figura 5. Alineación de las secuencias de
aminoácidos de TDET1 de S. lycopersicum, DET1 de
Arabidopsis, y secuencias de aminoácidos EST deducidas de
mamíferos con homología a DET1 (determinada utilizando el método de
Clustal; Higgins y Sharp, 1988). El supuesto NLS bipartido tiene una
línea por encima. Los aminoácidos que faltan en el mutante
hp-2 se indican con asteriscos, y la
sustitución de aminoácidos en hp-2j se
indica por una señal de más. Las secuencias de mamíferos son una
compilación de secuencias de aminoácidos derivadas de ESTs de ratón
y humano (números de acceso al GenBank AA756238, AA236057, AA050184,
y W64359). Los residuos en cajas indican aminoácidos conservados,
los rayados indican inserciones arbitrarias.
Figura 6. Efecto de las citoquininas en las
plántulas de tomate de tipo salvaje. (a) y (b) Longitud de
hipocotilo (cm) y contenido de antocianina (por mg de peso fresco
[FW]), respectivamente, de plántulas de tomate de tipo salvaje
crecidas en presencia de 0, 1, 5, 20, 100, y 500 \mug/l de
benzoaminopurina. Las plántulas se hicieron crecer a 25ºC durante 5
días en oscuridad absoluta (Oscuridad) o en un fotoperiodo de 16
horas de luz, 8 horas de oscuridad (Luz). En (a) los valores son la
media de 10 plántulas. Se obtuvieron resultados muy similares con
la citoquinina zeatina (datos no mostrados).
Figura 7. Fenotipo del fenotipo mutante doble
au hp-2. Se muestran la longitud de
hipocotilo (cm) y la acumulación de antocianina (por plántula) en
tipo salvaje, au, hp-2, y mutante
doble au hp-2. Las plántulas se hicieron
crecer a 25ºC durante 6 días en un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8
horas de oscuridad. Los valores son la media de las 15 plántulas, y
los experimentos se repitieron tres veces.
Figura 8. Expresión de genes en plántulas de
tipo salvaje, hp-2, y
hp-2^{j}. Las plántulas se hicieron crecer
a 25ºC durante 5 días en oscuridad absoluta (D), seguido de 2 días
en luz blanca continua (L). Los ARNs se extrajeron a partir de
plántulas completas (oscuridad) o de cotiledones (C) e hipocotilos
(H) (luz). Las modificaciones en la expresión de genes en plántulas
hp-2 y hp-2^{j}
comparadas con las plántulas de tipo salvaje (wt) se muestran como
principalmente dependientes de la luz. Muestras de diez microgramos
de ARN total se cargaron sobre geles y se analizó su expresión de
genes CHS1 (CHS), CAB6 (CAB),
PR1-1b1 (PR) seguido de la
transferencia en gel de ARN. Se muestra ARNr 30S como control para
la carga.
Figura 9. Plásmidos binarios para su
transferencia a vegetales.
R. E. Kendrick y M. Koornneef (Wageningen
Agricultural University, Países Bajos) facilitaron amablemente los
mutantes de fotorrespuesta exagerada hp-2 y
hp-2j, el mutante doble au
hp-2 y las correspondientes semillas de
tomate de tipo salvaje (Solanum lycopersicum cv Money Maker).
Las semillas se esterilizaron superficialmente y se sembraron
directamente en cajas de magenta (Sigma) que contenían 4,3 g/l de
sales de Murashige-Skoog (Sigma) y un 0,8% de agar.
Después de 2 días de pregerminación en la oscuridad, las plántulas
se hicieron crecer a 25ºC en un fotoperiodo de 16 horas de luz, 8
horas de oscuridad o bien en oscuridad continua, según
correspondió. Para el tratamiento con citoquinina, las semillas se
sembraron en presencia de diferentes concentraciones de
bencilaminopurina (Sigma).
Las antocianinas se extrajeron de cotiledones,
hipocotilos, y plántulas completas con 0,5 ml de metanol acidificado
(1% HCl) durante 48 horas en oscuridad con agitación. Los extractos
se separaron mediante la adición de 0.4 ml de H_{2}O y 1 ml de
cloroformo, seguido de centrifugación durante 5 min a 3.000 rpm. La
absorbancia de la fase superior se determinó
espectrofotométricamente a 535 nm (A_{535}), y el contenido de
antocianina se calculó como (A_{535})/mg de peso fresco o
(A_{535})/plántula.
A efectos de determinar el contenido de
carotenoide y de clorofila en el fruto de tomate, se pesaron e
incubaron secciones de pericarpio de fruto verde (25 días después
de la polinización) o maduro (50 días después de la polinización)
durante 48 horas a 65ºC en DMSO (dimetil sulfóxido) en ausencia de
luz. Los contenidos en carotenoides y clorofilas se determinaron
mediante HPLC y los valores se presentaron como \mug/g de peso
fresco.
Se llevaron a cabo extracciones de ADN y ARN de
muestras de hoja según Dellaporta y otros (1983) y Verwoerd y otros
(1989), respectivamente.
Se transfirieron geles de ARN (10 \mug por
carril) en membranas Hybond N+ (Amersham) y se hibridaron con
sondas estimuladas aleatoriamente (ver posteriormente). La
hibridación se llevó a cabo durante 24 horas a 50ºC en tampón
fosfato (7% SDS, Na_{2}HPO_{4} 0,5 M, pH 7,2, EDTA 1 mM),
seguido de lavados de 20 minutos en NaPO_{4} 40 mM pH 7,2, 1% SDS
y EDTA 1 mM. Las sondas fueron el gen CHS1 de chalcona
sintasa de tomate (O'Neill y otros, 1990), el gen de la proteína de
unión a la clorofila a/b CAB6 (Piechulla y otros, 1991) y el
gen de la proteína relacionada con la patogénesis
PR-1b1 (Tornero y otros, 1997). Todas las
transferencias en gel del ARN se repitieron, como mínimo dos veces
y utilizando diferentes muestras.
La amplificación en 5' de ADNc se llevó a cabo
utilizando el sistema RACE (Gibco/BRL) sobre ARN total de hoja de
tomate con el oligonucleótido
5'-CATCAACACTGCCAAAC-3' (SEQ ID No.
3), obtenido a partir de la secuencia del marcador CT151 de RFLP.
Se obtuvo un producto de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
de 0,8 kb, que contenía el extremo 5' del ADNc de TDET1,
después de dos reacciones diferentes de amplificación con
polimerasa Taq1 (Perkin Elmer) utilizando dos cebadores anidados
derivados de CT151:
5'-GAAAGCAGCCGTTGCT-3' (SEQ ID No.
4) y 5'-AGTTCATCATCTTCACGGC-3' (SEQ
ID No. 5), con el cebador de anclaje suministrado (Gibco/BRL). El
fragmento de PCR de 0,8kb se secuenció directamente en ambas cadenas
con termosecuenasa (Amersham).
Se obtuvieron ADNc total a partir de tomate de
tipo salvaje (cv. Money Maker) y los correspondientes mutantes
hp-2 y hp-2^{j}
mediante transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa del
virus de la mieloblastosis aviar (Promega) de poli(A) ARNm
aislado de hojas mediante Dynabeads oligo(dT) (Dynal). A
partir de estas muestras se amplificó mediante PCR la secuencia de
ADNc de TDET1 (HP-2) con los oligonucleótidos
específicos:
5'-GTATGATTCACTAGTTTAATGCTGCTGAAAG-3'
(SEQ ID No. 6) y 5'-CCCATACTAGTCGTCTTGGCA
CTCTATCAAG-3' (SEQ ID No. 7), mediante el sistema de Alta Fidelidad de Ampliación ("Expand High Fidelity system") (Boehringer Mannheim). Posteriormente el producto de amplificación se subclonó en pBluescript como un fragmento Spel y se secuenciaron 4 clones independientes sobre ambas cadenas.
CTCTATCAAG-3' (SEQ ID No. 7), mediante el sistema de Alta Fidelidad de Ampliación ("Expand High Fidelity system") (Boehringer Mannheim). Posteriormente el producto de amplificación se subclonó en pBluescript como un fragmento Spel y se secuenciaron 4 clones independientes sobre ambas cadenas.
Se cribaron librerías genómicas de tomate en
\lambda-DASH y \lambda-FIXII
(facilitados amablemente, respectivamente, por Jim Giovannoni,
Texas A&M University, College Station, TX, y el "Centro
Genómico del Tomate" ("Tomato Genome Center"), Rehovot,
Israel) mediante métodos estándares (Sambrook y otros, 1989) con un
fragmento CT151 marcado con ^{32}P como sonda. Los fragmentos que
se superpusieron a partir de diferentes fagos recombinantes se
subclonaron en pBluescript SK+ para la secuenciación de ambas
cadenas.
Se utilizaron los oligonucleótidos
5'-GAAGGTAATTTTATATTAAACATAGAATAGA-3'
(SEQ ID No. 8) y
5'-GTGATTTCTAGGTTGATTTCAATCTAGA-3'
(SEQ ID. No. 9) para amplificar la secuencia 3' del gen
HP-2 a partir de ADN genómico del mutante
hp-2. El producto de la amplificación de
1.300 pb se secuenció directamente con el cebador
5'-CAAATCGGTAACATAT-3' (SEQ ID No.
10) utilizando un kit de Termosecuenasa (Amersham).
Los fragmentos de ADN que contenían el promotor
E8 específico de fruto de tomate (Deikman y Fischer, 1988) se
amplificaron por PCR a partir de ADN total de S. lycopersicum
con los siguientes nucleótidos:
5'-GGGGAAGCTTT
TTCACGAAATCGGCCCTTA-3' (SEQ ID No. 11) y 5'-CCCGGATCCTTCTTTTGCACTGTGAATGATTAG-3'
(SEQ ID No. 12). Los productos de amplificación de 1,2 kb se subclonaron como fragmentos HindIII-BamHI en el vector de expresión binario pmGFP4, obtenido de pBI121 (Bevan, 1984; Jefferson y otros, 1987; Haseloff y otros, 1997) en lugar del promotor 35S, obteniéndose el plásmido pE8mGFP4. El gen mGFP4 se suprimió y la secuencia invertida o complementaria del gen HP-2 o partes de la misma, se insertaron como fragmentos BamHI-SacI, obteniéndose el plásmido pBIN-E8-HP2-AS1 y pBIN-E8-HP2-AS2, respectivamente (Figura 9).
TTCACGAAATCGGCCCTTA-3' (SEQ ID No. 11) y 5'-CCCGGATCCTTCTTTTGCACTGTGAATGATTAG-3'
(SEQ ID No. 12). Los productos de amplificación de 1,2 kb se subclonaron como fragmentos HindIII-BamHI en el vector de expresión binario pmGFP4, obtenido de pBI121 (Bevan, 1984; Jefferson y otros, 1987; Haseloff y otros, 1997) en lugar del promotor 35S, obteniéndose el plásmido pE8mGFP4. El gen mGFP4 se suprimió y la secuencia invertida o complementaria del gen HP-2 o partes de la misma, se insertaron como fragmentos BamHI-SacI, obteniéndose el plásmido pBIN-E8-HP2-AS1 y pBIN-E8-HP2-AS2, respectivamente (Figura 9).
Las plántulas de mutante
hp-2 mostraron una respuesta a la luz
exagerada con respecto a las plántulas de tipo salvaje.
Particularmente, la longitud de hipocotilo se redujo (Figura 1a) y
el contenido en pigmentos de antocianina en los cotiledones fue
superior al del tipo salvaje (Figura 1b). Dichos fenotipos fueron
estrictamente dependientes de la presencia de luz; en realidad, en
ausencia de luz, la longitud de hipocotilo no fue considerablemente
diferente a la del tipo salvaje (Figura 1a) y no se produjeron
antocianinas (datos no mostrados). El mutante
hp-2^{j} mostró un fenotipo más fuerte que
el mutante hp-2, con referencia tanto a la
longitud de hipocotilo como al contenido de antocianinas (Figura
1).
Los frutos obtenidos de plantas de mutantes
hp-2 y hp-2^{j}
también mostraron respuestas exageradas a la luz. En los frutos
verdes de los mutantes hp-2 y
hp-2^{j} el contenido en clorofila fue
aproximadamente cinco veces superior al de los frutos de plantas de
tipo salvaje, mientras que en frutos maduros el contenido total de
carotenoides fue aproximadamente dos veces el de los frutos de
plantas de tipo salvaje. (Tabla 1).
La mutación hp-2 se ha
mapeado previamente mediante análisis de polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP) de una población segregante
obtenida de un cruce entre el mutante hp-2
(S. lycopersicum) y S. pennellii. Los datos del mapeo
con una segunda población de retrocruzamiento (BC-2)
indicaron una posición cercana al centrómero del cromosoma 1,
dentro de una agrupación ("cluster") de varios marcadores de
RFLP (Balint-Kurti y otros, 1995; Van Tuinen y
otros, 1997; Broun y Tansksley, 1996). Los autores de la presente
invención han encontrado que el marcador CT151 de RFLP (Tanksley y
otros, 1992), incluido en esta agrupación, presentaba elevada
homología con el gen DET1 de Arabidopsis, en el cual
se identificaron previamente mutaciones como causantes del fenotipo
desetiolado de mutantes detl.
La comparación de CT151 con DET1 de
Arabidopsis mostró que CT151 tenía homología con el extremo
3' de DET1. Los autores de la presente invención aislaron un
ADNc de longitud completa que codifica TDET1 mediante
amplificación rápida de los extremos de ADNc 5' (Loh y otros, 1989).
Posteriormente, el gen TDET1 se aisló a partir de librerías
genómicas en \lambda-DASH y
\lambda-FIXII. La alineación del ADNc de
TDET1 y de secuencias genómicas mostró la presencia de 10
intrones, lo cual es similar al número encontrado en
Arabidopsis (Figura 4a). Nueve intrones se localizan en las
mismas posiciones que las del gen DET1 de Arabidopsis,
mientras que el intrón 2 de TDET1 no está presente en el
homólogo de Arabidopsis (Figura 4a) (Pepper y otros, 1994).
El análisis comparativo de secuencia de proteína entre DET1
de Arabidopsis y TDET1 mostró un 81,3% de semejanza y
un 74,8% de identidad (Figura 5). No se encuentran presentes
diferencias importantes entre las secuencias, a excepción de una
supresión pequeña de 16 aminoácidos en el centro de TDET1, la
cual sugiere que los genes de tomate y de Arabidopsis son
verdaderos homólogos. En el genoma de levadura o en cualquier
genoma de procariota secuenciado hasta la fecha no está presente
ningún homólogo de DET1 (datos no mostrados). Sin embargo,
se han identificado marcadores de secuencia (ESTs) expresados por
ratones y humanos con homología a DET1 (Figura 5), así como
un homólogo de Drosophila.
Teniendo en cuenta la presencia de una señal de
localización nuclear (NLS) (Robbins y otros, 1991) en la secuencia
de aminoácidos de DET1de Arabidopsis, y observando que la
proteína quimérica DET1-GUS se localiza en el
núcleo (Pepper y otros, 1994), DET1en Arabidopsis puede ser
responsable de la represión transcripcional de la fotomorfogénesis
en ausencia de luz. Teniendo en cuanta la homología con
HP-2 es posible para éste último tener una función
análoga en el tomate. La proteína TDET1 se ha encontrado localizada
en el núcleo (datos no mostrados).
Los ADNcs que codifican TDET1 del tipo salvaje,
y de los mutantes hp-2 y
hp-2^{j} se amplificaron con cebadores
específicos de ARNm de hoja. Los fragmentos amplificados se
subclonaron en pBluescript y se secuenciaron 4 clones
independientes sobre ambas cadenas. En hp-2
los presentes autores identificaron una sustitución que implicaba T
en lugar de C en el exón 11 (nt. 1640) que causa una sustitución de
prolina por serina en la región C-terminal de la
proteína (aa. 498) (Figura 4a). En el mutante
hp-2 los presentes autores identificaron un
lugar de corte y empalme ("splicing") alternativo para el
intrón 10, que causa una supresión de tres aminoácidos (Gly, Pro,
Glu) en el comienzo del exón 11, en el segundo dominio NLS de la
proteína (aa. 478-480) (Figura 4a). Para encontrar
el sitio de la mutación que era responsable del lugar de corte y
empalme alternativo, los presentes autores secuenciaron el extremo
3' del gen TDET1 del mutante hp-2,
mediante un fragmento obtenido por amplificación PCR de ADN
genómico. Se identificó una sustitución de AG por TG en el punto de
corte y empalme de 3' consenso del intrón 10 (Figura 4b). Estos
resultados demostraron que el fenotipo "pigmento intenso" de
los mutantes de tomate hp-2 y
hp-2^{j} está causado por la mutación de
la mutación del gen TDET1.
La secuenciación de los ADNcs de TDET1
obtenidos del mutante hp-2 mostraron que la
mutación produce dos productos de corte y empalme del intrón 10
diferentes (Figura 4b), sugiriendo la presencia de una cantidad
limitada de proteína TDET1 de tipo salvaje y que el mutante
hp-2 no es un alelo inactivo. Esto es
coherente con la observación de que el alelo mutante
hp-2 es más débil que el alelo de
hp-2^{j} (Figura 1 y Tabla 1). El hecho de
que la mutación hp-2^{j} sea nula, queda
pendiente de un análisis más profundo, aunque el residuo de prolina
mutado en el mutante hp-2^{j} se conserva
en las dos secuencias de plantas. Sin embargo, dado que la mutación
de hp-2 está situada en el dominio
C-terminal de TDET1, tal como ocurre en la mutación
en el alelo mutante detl-5 de Arabidopsis,
que tiene un fenotipo claramente desetiolado (Pepper y otros,
1994), está claro que los fenotipos del mutante
hp-2 no son comparables con el fenotipo del
mutante detl en Arabidopsis. Además, los alelos claramente
débiles de det-1 en Arabidopsis, por
ejemplo, det1-1, muestran fenotipos oscuros
visibles.
Tal como queda claro a partir de los resultados
presentados, los mutantes hp-2 son
fenotípicamente diferentes de los mutantes detl. La mayor evidencia
es que no muestran fenotipos de oscuridad, tales como longitud de
hipocotilo reducida, ganchos apicales abiertos, o cotiledones
alargados, mientras que éstos eran criterios de selección para el
aislamiento de det y cop en Arabidopsis (Chory y otros, 1989;
Deng y otros, 1991). Por el contrario, los mutantes det1
pueden incluso desarrollar verdaderas hojas y brotes florales en
oscuridad prolongada. Ninguno de los mencionados fenotipos se
pueden observar en plántulas de tomate hp que han crecido a
oscuras.
Los mutantes de Arabidopsis detl también
se caracterizan por el alto nivel de expresión de genes regulados
por la luz, tales como CHS y CAB en oscuridad, mientras que
con luz, la expresión de los genes CHS y CAB es similar a la
observada en plantas de tipo salvaje (Chory y otros, 1989). Para
analizar los efectos de las mutaciones hp-2
y hp-2^{j} sobre la expresión de genes, los
autores han desarrollado un análisis de transferencia en gel de ARN
de la expresión de genes regulada por la luz utilizando fragmentos
de los genes CHS y CAB como sondas. De acuerdo con los
fenotipos débiles de las plántulas de mutantes
hp-2 y hp-2^{j} que
han crecido en oscuridad, no se observó ninguna modificación
dramática de la expresión de los genes CHS y CAB. Sin
embargo, los niveles de ARNm de CHS y CAB eran ligeramente
superiores en el alelo hp-2^{j} cuando se
comparaba con plántulas de hp-2 y de tipo
salvaje (Figura 8). De forma interesante, el ARNm de CHS
pareció ser de un tamaño ligeramente inferior que el encontrado en
el material que había crecido con luz, indicando tal vez un corte y
empalme ("splicing") diferencial dependiente de la luz. De
forma coherente con el grado de fotorrespuesta exagerado de los
mutantes hp-2 y
hp-2^{j}, los niveles de ARNm de
CHS aumentaron significativamente en comparación con las
plántulas de tipo salvaje después de una irradiación de luz durante
48 horas (Figura 8). Las plántulas de
hp-2^{j} contenían niveles de expresión de
CHS superiores a los de hp-2, y el
ARNm de CHS era particularmente abundante en hipocotilos. A
diferencia de CHS, los niveles de ARNm de CAB fueron mayores
en cotiledones que en hipocotilos, y fueron ligeramente inferiores
en plántulas de mutantes hp-2 y
hp-2^{j} expuestas a la luz cuando se
compararon con el tipo salvaje (Figura 8). En resumen, por lo
tanto, en mutantes hp-2 de tomate la
expresión en oscuridad de los genes CHS y CAB sólo es muy
ligera y la desregulación de la expresión de genes es
fundamentalmente dependiente de la luz. Esta es una gran diferencia
con respecto a las características de desregulación de los genes
CHS y CAB de los mutantes det1 de Arabidopsis
(Pepper y otros,
1994).
1994).
También se ha informado que las plántulas de
det1 muestran una expresión fuertemente aumentada de genes
relacionados con el estrés, tales como los que codifican proteínas
relacionadas con la patogénesis (PR) y glutationa reductasa (Mayer
y otros, 1996). Para analizar si éste era también el caso de los
mutantes hp-2 y
hp-2^{j} se hibridaron transferencias en
gel de ARN con una sonda que codificaba
PR-1b1 de tomate (Tornero y otros, 1997).
Aunque los hipocotilos de las plántulas de
hp-2 mostraron reproduciblemente la expresión
del gen PR-1b1 a niveles ligeramente
superiores en comparación con las plántulas del tipo salvaje, este
efecto fue muy débil comparado con el observado en mutantes
det1 de Arabidopsis y nunca se ha observado en
mutantes hp-2^{j} (Figura 8).
A pesar de estas diferencias mencionadas
anteriormente, los presentes autores encontraron que el desarrollo
de plástidos en oscuridad en los cotiledones de plántulas de
hp-2 y hp-2^{j} era
similar al observado en los mutantes detl de Arabidopsis
(datos no mostrados; Chory y otros, 1989).
Observaciones previas en Arabidopsis han
demostrado que la aplicación exógena de citoquinina puede fenocopiar
un fenotipo detl (Chory y otros, 1994).
Para determinar los efectos del tratamiento con
citoquinina en tomate, los presentes autores trataron plántulas de
tipo salvaje con diferentes concentraciones de citoquinina en
oscuridad y con luz (Figura 6). Se encontró que la citoquinina no
fenocopió una mutación detl en tomate. En plántulas que crecieron en
oscuridad, aunque los hipocotilos son más cortos en presencia de
citoquinina, no se observaron apertura de gancho apical, expansión
de cotiledones y biosíntesis de antocianina (Figura 6), incluso
después de periodos prolongados (hasta tres semanas) (datos no
mostrados). Sin embargo, con luz, la citoquinina puede fenocopiar la
mutación hp: las plántulas mostraron hipocotilos más cortos
y gruesos y acumularon niveles elevados de antocianina (Figura
6).
Estos resultados, por lo tanto, indican que,
como mínimo en cuanto a lo que concierne a los efectos de la
citoquinina, la mutación hp en tomate es equivalente a la
mutación detl en Arabidopsis. Dicha suposición es coherente
con el hecho de que hasta el momento no se han identificado mutantes
desetiolados constitutivos en tomate y la expresión del gen
CHS y la consiguiente acumulación biosintética de pigmentos
de antocianina es estrictamente dependiente de la luz, mientras que
en Arabidopsis las antocianinas se pueden producir también
en ausencia de luz (Mustilli y Bowler, 1997).
El análisis de mutantes dobles con det1 y
mutantes deficientes en fitocromo en Arabidopsis indican que
la mutación det1 es completamente epistática a las mutaciones
de fotorreceptores (Chory, 1992). La interpretación es que este
hecho significa que DET1 actúa más abajo ("downstream") del
fitocromo. Para determinar la relación entre TDET1 y la función del
fitocromo, los presentes inventores analizaron los efectos de la
mutación hp-2 en los antecedentes del mutante
aurea, un mutante deficiente en el cromóforo fitocromo
(Terry y Kendrick, 1996). A diferencia de su mutante doble homólogo
en Arabidopsis, au hp-2 es similar al
mutante individual au. Por ejemplo, los hipocotilos se alargan y la
acumulación de antocianina es limitada (Figura 7). Aunque en
términos genéticos este resultado, por lo tanto, insinúa que au es
epistático a hp-2, los autores de la
presente invención consideran, sin embargo, que es más probable que
TDET1 actúe más abajo ("downstream") del fitocromo, tal como
se ha propuesto para Arabidopsis, pero que su actividad como
regulador negativo es estrictamente dependiente de la presencia de
fitocromo activo. Este requisito claramente no se observa en
Arabidopsis (Chory, 1992). La reducción pequeña pero
significativa de longitud de hipocotilo y el incremento pequeño en
antocianina encontrado en el mutante doble au
hp-2 en comparación con au (Figura 7) es
probable, por lo tanto, que sea resultado de la hipersensibilidad
causada por la mutación hp-2 hacia las bajas
cantidades de fitocromo funcional presente en el mutante au, las
cuales se estiman que son un 3%, aproximadamente, de los niveles
del tipo salvaje (Adams y otros, 1989; Parks y otros, 1987). Por lo
tanto, el fenotipo hp-2 en tomate es
estrictamente dependiente de la presencia de fitocromo, mientras que
en Arabidopsis la mutación detl es independiente de la
presencia o ausencia de fotorreceptores funcionales.
La ausencia de mutantes desetiolados en tomate y
la estricta dependencia a la luz y al fitocromo del fenotipo
mutante hp puede sugerir que la función de TDET1 en tomate es
redundante o bien que las vías de transducción de señal que regulan
su actividad operan de diferentes formas en las dos plantas
(Mustilli y Bowler, 1997). Dado que los presentes autores han
demostrado mediante análisis Southern que en tomate, igual que en
Arabidopsis (Pepper y otros, 1994), sólo está presente un
gen homólogo a DET1 (datos no mostrados) la anterior
hipótesis parece ser más probable.
En base a los descubrimientos de los presentes
autores, es probable que sólo se encuentren algunos reguladores
claves que sean responsables del control de las respuestas a la luz
en todas las plantas superiores. Por lo tanto, sería muy
interesante clonar otros genes de tomate que codifican proteínas
homólogas a COP/DET/FUS y examinar si la modificación de su
actividad también da como resultado fenotipos hipersensibles a la
luz.
A efectos de generar plantas de tomate con un
fenotipo hp-2 específicamente en el fruto,
los presentes autores construyeron plásmidos que son capaces de
producir la secuencia de ARN antisentido de TDET1 o partes
de la misma, sólo en el fruto mediante la utilización de secuencias
reguladoras del gen E8 de tomate (Figura 9).
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Stazione Zoologica "Anton Dohrn"
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Villa Comunale
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nápoles
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Italia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 80121
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias nucleotídicas que codifican el fenotipo hipersensible a la luz del tomate, proteínas codificadas y utilizaciones de las mismas.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete ("Floopy disk")
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTER: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS/DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip0.500000\baselineskip
- (2)
- INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2000 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:.
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 149..1720
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 524 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCAACACT GCCAAAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAAGCAGCC GTTGCT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTCATCAT CTTCACGGC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATGATTCA CTAGTTTAAT GCTGCTGAAA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCATACTAG TCGTCTTGGC ACTCTATCAA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGGTAATT TTATATTAAA CATAGAATAG A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGATTTCTA GGTTGATTTC AATCTAGA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAATCGGTA ACATAT
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGAAGCTT TTTCACGAAA TCGGCCCTTA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGATCCT TCTTTTGCAC TGTGAATGAT TAG
\hfill33
Claims (22)
1. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína, o una parte funcional de la misma, la cual,
si se modifica, es responsable del fenotipo mutante hipersensible a
la luz en plantas Solanum lycopersicum, comprendiendo dicho
fenotipo un crecimiento reducido de la planta asociado con niveles
elevados de carotenoides y/o clorofilas y/o flavonoides, en el que
dicha proteína es la proteína TDET1 (HP-2) que tiene
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
2. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína o una parte funcional de la misma, que tiene
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
3. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 1 ó 2, que comprende SEQ ID No. 1, o una parte
funcional de la misma responsable del fenotipo mutante
hipersensible a la luz.
4. Molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia nucleotídica complementaria a la SEQ ID No.
1 o una parte funcional de la misma responsable del fenotipo mutante
hipersensible a la luz.
5. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 3 ó 4, que comprende una mutación que es capaz de
inducir el fenotipo mutante hipersensible a la luz.
6. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 5, en la que un residuo de Timidina está presente en
la posición 1640 de SEQ ID No. 1.
7. Molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 5, en la que se han suprimido los nucleótidos de 1581
a 1589 de SEQ ID No. 1.
8. Vector de expresión que comprende la molécula
de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, bajo el control de un promotor que es activo en las
plantas.
9. Vector, según la reivindicación 8, en el que
dicho promotor es selectivamente activo en los frutos.
10. Vector, según la reivindicación 9, en el que
dicho fruto es un tomate.
11. Vector, según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, que es capaz de controlar la transcripción
de un ARN antisentido de dicha molécula de ácido nucleico.
12. Utilización de un vector, según cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 11, para la producción de plantas
transgénicas pertenecientes al género Solanum que contiene el
ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones
1-6, bajo el control de secuencias reguladoras
específicas, preferentemente activas en órganos seleccionados de
las plantas.
13. Planta transgénica obtenible mediante la
utilización, según la reivindicación 12.
14. Fruto de una planta, según la reivindicación
13.
15. Proteína aislada, o una parte de la misma,
la cual, si se modifica, es responsable del fenotipo hipersensible
a la luz en plantas Solanum lycopersicum, en el que dicha
proteína tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
16. Proteína, según la reivindicación 15, que
comprende una modificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
No. 2, o una parte de la misma, que es responsable del fenotipo
hipersensible a la luz en plantas Solanum lycopersicum.
17. Proteína, según la reivindicación 16, que
comprende, como mínimo una modificación en la parte
C-terminal de SEQ ID No. 2.
18. Proteína, según la reivindicación 17, en la
que dicha modificación en la parte C-terminal
comprende una sustitución de prolina en el aminoácido 498 de SEQ ID
No. 2.
19. Proteína, según la reivindicación 18, en la
que dicha sustitución comprende una serina como sustituta de
prolina.
20. Proteína, según la reivindicación 19, en la
que dicha modificación en la parte C-terminal
comprende una supresión, como mínimo de un aminoácido en el segundo
dominio NLS.
21. Proteína, según la reivindicación 20, en la
que dicha supresión comprende, como mínimo tres aminoácidos.
22. Proteína, según la reivindicación 21, en la
que se han suprimido los aminoácidos del 478 al 480 de SEQ ID No.
2.
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