ITRM970760A1

ITRM970760A1 - Sequenze nucleotidiche codificanti per il fenotipo ipersensibile alla luce in pomodoro, proteine da esse codificate, e loro usi

Info

Publication number: ITRM970760A1
Application number: IT97RM000760A
Authority: IT
Inventors: Chris Bowler; Anna Chiara Mustilli
Original assignee: Stazione Zool Anton Dohrn
Priority date: 1997-12-09
Filing date: 1997-12-09
Publication date: 1999-06-09
Also published as: MXPA00005669A; BR9813497A; AU1577799A; US6429299B1; IL136496A; WO1999029866A1; ATE373713T1; DE69838459D1; TR200001683T2; CA2313447A1; EP1053327A1; JP2001526034A; ES2293695T3; EP1053327B1; IL136496A0; IT1297106B1

Description

DESCRIZIONE

“Sequenze nucleotidiche codificanti per il fenotipo ipersensibile alla luce in pomodoro, proteine da esse codificate, e loro usi”

La presente invenzione concerne sequenze nucleotidiche codificanti per il fenotipo ipersensibile alla luce in pomodoro, proteine da esse codificate, e loro usi.

In particolare l’invenzione riguarda sequenze nucleotidiche codificanti per una proteina, la cui alterazione per quantità o qualità, e/o inibizione è in grado di indurre un elevato livello, rispetto al fenotipo selvatico, di carotenoidi e/o flavonoidi e/o clorofille nella pianta, nonché il loro uso per la produzione di piante ingegnerizzate, da utilizzarsi nel settore agroindustriale.

La luce e' uno dei piu' importanti segnali ambientali che regolano la crescita e lo sviluppo vegetale. Essa e' intercettata nelle piante superiori da una sofisticata serie di fotorecettori : i fitocromi che assorbono luce rossa e rossa lontana, i criptocromi che assorbono luce blu e raggi UV-A e i recettori UV-B (Mustilli and Bowler, 1997). Insieme a segnali ormonali endogeni delle piante, questi fotorecettori regolano le modifiche durante lo sviluppo, note come fotomormogenesi. La fotomorfogenesi e' definita come l'influenza della luce sullo sviluppo vegetale e nelle piante comprende la formazione di foglie e cloroplasti, nonché' la regolazione dei componenti dell'apparato fotosintetico, a mezzo di un'espressione coordinata di geni, sia nucleari che citoplasmatici. Inoltre, in risposta alla luce, si ha anche la produzione di pigmenti fotoprotettivi, come i flavonoidi. Le modifiche durante la fotomorfogenesi sono state ben caratterizzate dallo studio dell'influenza della luce sullo sviluppo di piante di Arabidopsis (von Amim and Deng, 1996). Germogli cresciuti alla luce mostrano ipocotili corti, cotiledoni espansi e l'espressione dei geni responsabili della sintesi di flavonoidi e clorofille (per es. calcone sintetasi, CHS; clorofilla a/b binding protein, CAB), mentre quelli cresciuti al buio hanno ipocotili allungati, cotiledoni chiusi e mancanza di espressione dei geni normalmente regolati dalla luce.

Nelle piante superiori i fitocromi sono codificati da una famiglia ' genica (per es. PHYA-E in Arabidopsis ; Sharrock and Quail, 1989; Clack et al, 1994) e, sebbene siano i fotorecettori meglio caratterizzati, relativamente poco e' ancora conosciuto su come i segnali luminosi, percepiti dai fitocromi, siano poi trasferiti nel nucleo per attivare le diverse risposte fisiologiche e molecolari alla luce, che influenzano lo sviluppo della pianta. Recentemente, studi biochimici mediante microiniezione in cellule del mutante di pomodoro aurea ( au ) fitocromo deficiente, insieme a studi farmacologici in colture di cellule fotomixotrofìche di soia, hanno individuato il ruolo delle proteine G eterotri meridie e del cGMP, caldo e calmodulina come intermediari nel segnale di trasduzione del fitocromo (Bowler and Chua, 1994; Mustilli and Bowler, 1997)

Allo stesso tempo, diversi metodi di selezione genetica sono stati utilizzati per identificare mutanti alterati nelle vie di trasduzione dei segnale luminoso (Chamovitz and Deng, 1996). La maggior parte dei mutanti fotomorfogenici isolati e caratterizzati in Arabidopsìs sono stati classificati come “insensibili” e “costitutivi”. I mutanti insensibili mostrano un fenotipo allungato del tipo “crescita in mancanza di luce”, anche in presenza di una fonte luminosa. Alcuni sono mutati nei fotorecettori, mentre altri presumibilmente codificano per regolatori positivi delle vie di trasduzione del segnale luminoso (Chamovitz and Deng, 1996; Chory et al., 1996; Whitelam and Harberd, 1994). Al contrario, i mutanti de-eziolati costitutivi (per esempio cop/det/fus/cpd) mostrano morfologie del tipo “crescita alla luce”, anche quando cresciuti al buio, in concomitanza, in alcuni casi, con l’espressione inappropriata di geni regolati dalla luce, come CAB e CHS (Millar et al., 1994). La natura recessiva di queste mutazioni suggerisce una assenza della funzione normalmente attiva nelle piante selvatiche. Pertanto si ritiene che i geni selvatici agiscano come repressori della fotomorfogenesi al buio. Tuttavia, sebbene saggi epistatici su mutanti costitutivi e mutanti fitocromo-deficienti abbiano indicato che influenzano le vie a valle del fitocromo, essi non controllano in maniera specifica la trasduzione del segnale mediata dai fitocromi, poiché la maggior parte ha una specificità tissutaie alterata, così come altri fenotipi aggiuntivi non direttamente correlati alia risposta luminosa (Mayer et al., 1996; Chory and Peto, 1990; Millar et al., 1994; Szekeres et al., 1996). Non è chiaro pertanto come e se le proteine COP/DET/FUS/CPD si inseriscano nelle vie di trasduzione del segnale, come definito biochimicamente (Bowler and Chua, 1994).

Un approccio più mirato per identificare componenti specifici nella trasduzione del segnale mediata dai fitocromi potrebbe essere quello di isolare mutanti con risposte alterate alla luce, piuttosto che con fenotipi costitutivi in assenza di luce. Alcuni mutanti, con fenotipo ipersensibile alla luce, sono già state isolate in pomodoro (denominate hp-1, hp-2, atv, lp\ Kendrick et al., 1994). In particolare i mutanti recessivi non allelici hp-1 e hp-2 sono stati caratterizzati dalla loro risposta esagerata alla luce, mostrando alti livelli di antociani (un sottogruppo di flavonoidi), ipocotili più corti e frutti più pigmentati rispetto alle piante selvatiche. Questi mutanti sono stati identificati, rispettivamente, nel 1917 (Reynard, 1956) e nel 1975 (Soressi, 1975). Recentemente, i mutanti hp-1<w >(Peters et al., 1989) e hp-2 <J >(Van Tuinen et al., 1997) sono stati isolati ed identificati come nuovi alleii di hp-1 e hp-2, rispettivamente. Poiché il fenotipo dei mutanti hp sembra essere identico a quello ottenuto dall’espressione ectopica del fitocromo A (PHYA) in pomodoro (Boylan and Quail, 1989), sembrerebbe che le mutazioni hp possano interferire in maniera specifica sulle risposte dei fitocromi. La natura recessiva delle mutazioni, insieme ai risultati dei saggi epistatici di hp-1 con mutanti di pomodoro fitocromo-deficienti, aurea ( au ), phyA (fri) phyB (tri), suggeriscono che i geni hp codificano per regolatori negativi dei meccanismi di trasduzione del segnale luminoso, agendo a valle sia di PhyA che PhyB (Kerckhoffs et al., 1997). Il fatto che, fino ad ora, in Arabidopsis non sia stato isolato nessun mutante del tipo hp, insieme con l’osservazione che la produzione di antociani in pomodoro e l'espressione di geni fotoregolati (per es. CHS e CAB ) siano fenomeni strettamente dipendenti dalla luce, indica l’importanza dei mutanti hp per lo studio della trasduzione del segnale del fitocromo. Inoltre, studi basati su microiniezione utilizzando il mutante di pomodoro au hanno mostrato che il pomodoro è un modello eccellente per mappare i diversi componenti nella cascata dei segnali attivati dai fitocromi (Bowler and Chua, 1994). L’identificazione e la caratterizzazione dei geni hp pertanto è di rilevante interesse per lo studio della regolazione della fotomorfogenesi nelle piante.

Gli autori della presente invenzione hanno clonato il gene HP-2 da pomodoro ed indagato a livello molecolare sul ruolo della proteina HP-2 nella modulazione della fotomorfogenesi e della composizione del frutto in pomodoro. Gli autori hanno anche trovato che il gene HP-2 presenta una elevata omologia con il gene DEH di Arabidopsis, che appartiene al gruppo dei mutanti costitutivi COP/DET/FUS , precedentemente descritto.

Gli autori hanno utilizzato piante della specie Solarium lycopersicon L. (pomodoro), ma gli esperti del settore realizzeranno che la tecnologia può essere utilizzata senza alcun sforzo inventivo anche per altre specie vegetali come, ma non limitatamente, peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinacio, agrumi, pomacee e specie di interesse floreale. Gii autori hanno clonato e sequenziato il gene responsabile per la mutazione hp (high pigment, alto pigmento) in pomodoro, che rende le piante ipersensibili alla luce e provoca un aumento della sintesi di carotenoidi, e/o clorofille, e/o flavonoidi. Il gene clonato dagli autori della presente invenzione è il primo gene ad essere isolato in pomodoro per questa mutazione.

Le piante mutanti hp hanno potenzialmente un’applicazione diretta nel settore agroindustriale, per generare pomodori con alto contenuto di carotenoidi e flavonoidi. In particolare nei frutti di pomodoro si osserva un elevato contenuto del carotenoide licopene e di flavonoidi (Thompson, 1955; Yen et al. 1997).

Tuttavia, l’uso di mutanti hp nella agroindustria, anche incrociati con diverse varietà commerciali, non è stato possibile finora perchè la mutazione hp causa diversi altri fenotipi non desiderabili, così come il nanismo e un vigore ridotto delle piante.

La clonazione del gene responsabile per la mutazione hp e l’utilizzo di tecnologie di trasferimento genico offre vantaggi considerevoli rispetto alle classiche tecniche di incrocio varietale. Non solo geni utilizzabili nell’agricoltura da specie non correlate possono essere trasferiti facilmente, ma geni della stessa specie possono essere inattivati o ingegnerizzati, anche solo in particolari tessuti vegetali. Inoltre, il trasferimento genico è una tecnica molto più rapida degli incroci classici.

La clonazione del gene HP oggetto della presente invenzione permette adesso la generazione di piante ingegnerizzate che possiedono tutte le caratteristiche vantaggiose della mutazione hp, senza gli effetti collaterali non desiderabili. Tali piante possono appartenere allo stesso genere Solarium, ma gli esperti del settore realizzeranno che il gene, o parti di esso, subclonati nell'opportuno vettore di espressione possono essere trasferiti, senza alcun sforzo inventivo, anche in piante appartenenti a generi diversi, come ad esempio, ma non limitatamente, peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinacio, agrumi, pomacee e specie di interesse floreale.

E' stato ampiamente dimostrato che una dieta ricca in licopene e sostanze carotenoidi, come pure la loro somministrazione in forma di pillole, ha dei benefici effetti sulla salute umana. Infatti, i carotenoidi hanno proprietà antiossidanti, il β-carotene in particolare é una provitamina A ed il licopene risulta essere un efficace antitumorale (Bartley and Scolnik, 1995; Giles and Ireland, 1997; Hoffmann and Weisburger, 1997; Pappalardo et al, 1997; Pool-Zobel et al, 1997; Rock et al, 1997; Sharoni et al, 1997; Stahl and Sies, 1996). Le piante ingegnerizzate dell’invenzione trovano pertanto anche una vantaggiosa applicazione in questo settore.

Inoltre, i mutanti hp-2 mostrano un elevato contenuto di flavonoidi quali gli antociani (Von Wettstein-Knowles, 1968), che sono considerati anche degli eccellenti antiossidanti con in alcuni casi proprietà antitumorali (Fotsis et al, 1997; Rice-Evans et al, 1997). Inoltre, alcuni flavonoidi hanno un ruolo nella protezione delle piante da agenti patogeni e da radiazioni UV (Shirley, 1996).

Pertanto, la manipolazione dell'attività del gene HP-2 può essere usata per modificare il livello di carotenoidi e flavonoidi in diverse specie vegetali (per es. pomodoro, peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinaci, agrumi, pomacee), per il loro utilizzo biotecnologico sia in campo biomedico che agroindustriale.

Inoltre, la manipolazione del gene HP-2 può essere utilizzata per modificare il livello di antociani e carotenoidi in specie floricole, per ottenere nuove variazioni di colore (Griesbach, 1984).

Ed inoltre, poiché é stato dimostrato che un elevato contenuto in carotenoidi migliora la resistenza ad erbicidi, tipo Norflurazon, un ulteriore applicazione della modificazione dell'attività del gene HP-2, può riguardare la selezione di piante transgeniche mediante l'uso di erbicidi, anziché di sostanze antibiotiche (Misawa et al, 1993).

Ed inoltre, la manipolazione dell'attività del gene HP-2, può essere combinata nella stessa pianta con quella di altri geni tipo RIN, NOR, che bloccano il processo di maturazione della bacca o con geni strutturali nelle biosintesi dei carotenoidi (Bartley and Scolnik, 1995), per ottenere varietà con nuove caratteristiche qualitative di interesse medico-agroindustriale.

L'ottenimento del fenotipo hp-2 per via biotecnologica può essere vantaggiosamente effettuato tramite l'inibizione dell'espressione del gene HP-2. Attualmente il metodo migliore per bloccare l'espressione di un gene é quello attraverso l'introduzione, tramite trasferimento genico, della sequenza antisenso del gene stesso o di parte di esso sotto il controllo di sequenze regolatrici. Esistono diversi esempi dell'utilizzo di tali tecnologie nelle piante (Oeller et al, 1991; Penarrubia et al, 1992), ma gli esperti del settore realizzeranno che tecnologie alternative possono essere utilizzate, senza uscire dall’ambito di protezione della presente invenzione.

Inoltre, utilizzando vettori specifici come, ad esempio ma non limitatamente, pE8m6FP4 che contiene sequenze regolatrici del gene di pomodoro £8 (Fig. 8) (Deikman and Fischer, 1988), l'inattivazione del gene HP-2 può essere specificatamente modulata nei frutti. Gli esperti nel settore realizzeranno che altre sequenze regolatrici, ad esempio derivanti dal gene della poligalatturonasi (PG ) (Nicholass et al, 1995) potranno essere utilizzate al posto del £8 per avere una modulazione specifica nei tessuti del gene HP-2.

Nell’ambito della presente invenzione per fenotipo ipersensibile alla luce si intende una ridotta crescita della pianta, associata a livelli elevati di carotenoidi, e/o clorofille, e/o flavonoidi.

Per proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile per il fenotipo mutante ipersensibile alla luce si intende una sequenza amminoacidica che, se alterata in sè stessa e/o nella sua sintesi, conferisce alla pianta il fenotipo ipersensibile alla luce.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidica codificante per una proteina, o porzioni funzionali di essa, che quando alterata è responsabile per il fenotipo mutante ipersensibile alla luce in piante di Solarium lycopersicon , detto fenotipo comprendente una ridotta crescita della pianta, associata a livelli elevati di carotenoidi, e/o clorofille, e/o flavonoidi. Acidi nucleici codificanti per proteine di pomodoro omologhe alle proteine della famiglia COP/DET/FUS di Arabidopsis precedentemente descritti, se quando alterate sono responsabili del fenotipo ipersensibile alla luce, rientrano pertanto nell’ambito della presente invenzione.

Preferibilmente l’acido nucleico comprende la sequenza nucleotidica codificante per la proteina HP-2, o porzioni funzionali di essa. Più preferibilmente l’acido nucleico comprende una sequenza nucleotidica codificante per la proteina avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No. 2, o porzioni funzionali di essa. Più preferibilmente l’acido nucleico ha una sequenza nucleotidica compresa nella SEQ ID No. 1, ancora più preferibilmente dal nt. 149 al nt. 1720. Alternativamente l’acido nucleico ha una sequenza nucleotidica complementare a SEQ ID No. 1 , o a parti di essa.

In un aspetto dell’invenzione l’acido nucleico di SEQ ID No. 1 comprende una mutazione in grado di indurre il fenotipo ipersensibile alla luce; preferibilmente almeno una sostituzione da C a T in posizione 1640; alternativamente l’acido nucleico di SEQ ID No. 1 comprende almeno una delezione dei nucleotidi da 1581 a 1589.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è un vettore di espressione comprendente, sotto il controllo di un promotore attivo e regolabile in piante, l’acido nucleico dell’invenzione. Preferibilmente il promotore è attivo selettivamente solo in alcuni organi vegetali, più preferibilmente nei frutti. Vettori preferiti sono in grado di dirigere la trascrizione di un RNA antisenso, ad es. pBIN-E8-HP2-AS1 e pBIN-E8-HP2-AS2.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è l’uso dei vettori dell’invenzione per la produzione di piante transgeniche che contengono l’acido nucleico dell’invenzione, sotto il controllo di sequenze regolatrici specifiche preferibilmente in organi vegetali selezionati. Le piante possono appartenere alle specie di peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinacio, agrumi, pomacee, e specie di interesse floreale.

Ulteriore oggetto dell’invenzione è una pianta transgenica ottenibile per trasformazione con i vettori dell’invenzione, o parti di essa. Le piante possono appartenere alle specie di peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinacio, agrumi, pomacee e specie di interesse floreale.

Le tecniche di trasformazione genetica di piante sono note agli esperti del settore e comprendono, ma non sono limitate a trasformazione con Agrobacterium, elettroporazione, microiniezione, bombardamento con particelle rivestite di DNA (Christou, 1996).

In un altro aspetto l’invenzione comprende una proteina, o porzioni funzionali di essa, la cui alterazione è responsabile per il fenotipo ipersensibile alla luce in piante di Solarium lycopersicon. Proteine di pomodoro omologhe alle proteine della famiglia COP/DET/FUS di Arabidopsis, quando alterate, se responsabili del fenotipo ipersensibile alla luce, rientrano pertanto nell’ambito della presente invenzione. Preferibilmente la proteina comprende la sequenza amminoacidica di SEQ ID No. 2 o porzioni di essa.

In un aspetto dell’invenzione la proteina comprende un'alterazione in grado di indurre il fenotipo ipersensibile alla luce; preferibilmente almeno una alterazione nella porzione C-terminale di essa; più preferibilmente una sostituzione della prolina in posizione 498, ancora più preferibilmente da prolina in serina; alternativamente una delezione di almeno un amminoacido nel secondo dominio NLS, preferibilmente di almeno tre amminoacidi, più preferibilmente degli amminoacidi da 478 a 480.

La presente invenzione verrà ora descritta in riferimento a suoi esempi esplicativi, ma non limitativi, in cui verranno citate le seguenti figure:

Figura 1. Fenotipo di piantine di pomodoro selvatiche, hp-2, hp-2 J cresciute alla luce ed al buio, a) Lunghezza degli ipocotili al buio (Dark) e alla luce (Light). b) Contenuto di antociani negli ipocotili (barre segmentate) e nei cotiledoni (barre bianche) di piantine cresciute alla luce. I valori sono ottenuti dalla media di 10 piantine. Le piantine, dopo 3 giorni di pregerminazione al buio, sono state cresciute in buio assoluto (Dark) o con un fotoperiodo di 16 ore luce /8 ore buio (Light) per 6 giorni.

Figura 2. Sequenza nucleonica del cDNA del gene HP-2. La sequenza codificante é riportata in maiuscolo. La sequenza compresa nel marker RFLP CT151 va dal nucleotide 830 al 2000.

Figura 3. Sequenza amminoacidica della proteina HP-2.

Figura 4. a) Struttura esone-introne del gene HP-2 di pomodoro e siti di mutazione in hp-2 e hp-2 J. I riquadri chiusi indicano gli esoni. Gli esoni corrispondono alle seguenti sequenze di SEQ ID No. 1 (Fig. 2): Esone 1: da 149 a 220; Esone 2: da 221 a 877; Esone 3: da 878 a 1012; Esone 4: da 1013 a 1081 ; Esone 5: da 1082 a 1138; Esone 6; da 1139 a 1219; Esone 7: da 1220 a 1384; Esone 8: da 1385 a 1480; Esone 9: da 1481 a 1580; Esone 10: da 1581 a 1720; b) Siti donatore ed accettore di spiicing dell'introne 9 del mutante hp-2 e del gene selvatico.

Figura 5. Allineamento della sequenza amminoacidica di HP-2 di pomodoro e di DET1 di Arabidopsis. I putativi segnali di localizzazione nucleare di DET1 (NLS) sono sottolineati. Gli amminoacidi mancanti nel mutante hp-2 sono segnati da (*). L'amminoacido modificato in hp-2<1 >e' segnato da (+).

Figura 6. Effetto delle citochinine sul fenotipo di piantine di pomodoro selvatiche, a) Lunghezza degli ipocotili e b) contenuto di antociani in ipocotili e cotiledoni di piantine di pomodoro selvatiche cresciute in presenza di diverse concentrazioni di citochinine (benzoaminopurina, BAP) per 5 giorni al buio assoluto (Dark) o in luce continua (Light). Figura 7. Fenotipo del doppio mutante au,hp-2. Lunghezza degli ipocotili e contenuto di antociani in piantine di pomodoro selvatiche e dei mutanti au, hp-2 e au.hp-2. Le piantine, dopo 3 giorni di pregerminazione al buio, sono state cresciute con un fotoperiodo di 16 ore luce/8 ore buio per 6 giorni.

Figura 8. Plasmidi binari per l'espressione in piante.

Materiali e metodi

Materiale vegetale e condizioni di crescita

I semi dei mutanti hp-2 e hp-2Ì, aventi una risposta esagerata alla luce, e del corrispondente pomodoro selvatico ( Solarium lycopersicon L., cv. Money Maker) sono stati gentilmente forniti da R.

Kendrick e M. Koomneef (Wageningen, Olanda) (Van Tuinen et al.

1997). I semi sono stati sterilizzati con Na ipoclorito, e direttamente posti in contenitori Magenta (Sigma) contenenti 4.3 g/L di sali Murashige-Skoog (Sigma) pH 5.6, e 0.8% agar (DIFCO). Per le condizioni di crescita, dopo 3 giorni di pregerminazione al buio a 25°C, ie piantine sono state cresciute a 25°C con un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio, oppure al buio completo, oppure in luce continua.

Per il trattamento con le citochinine, al substrato sono state aggiunte diverse concentrazioni di benzoaminopurina (BAP, Sigma), da uno stock di 10 mg/l dissolto in 1N NaOH.

Analisi antociani

Gli antociani sono stati estratti da cotiledoni, ipocotili o da intera piantina con 0.5 mi metanolo acidificato alN% HCI, per 48 ore in agitazione al buio. Gli antociani sono stati separati, dopo l'aggiunta di 0.4 mi di acqua distillata ed 1ml di cloroformio, per centrifugazione a 3,000 rpm per 5 minuti. L'assorbanza (A535) della fase superiore e<1 >stata determinata allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 535 nm ed il contenuto di antociani calcolato come A535 per mg peso fresco o per piantina. Ogni valore e' la media di 10 campioni.

Analisi carotenoidi e clorofille

Per la determinazione dei carotenoidi e delle clorofille nel frutto di pomodoro, sezioni di pericarpo di frutti immaturi (25 giorni dall'allegagione) o maturi (50 giorni dall'allegagione) sono stati pesati ed incubati per 48 ore a 65 °C in DMSO (dimetilsulfossido) al buio. Il contenuto di carotenoidi e clorofille e' stato determinato per HPLC ed i valori riportati come μg/g di peso fresco.

Estrazione di DNA e RNA

Le estrazioni di DNA e di RNA da campioni di foghe sono state effettuate rispettivamente come descritto da Della Porta et al. (1983) e da Verwoerd et al. (1989).

Isolamento e sequenza di cloni aenomici. cDNA e prodotti di PCR La trascrizione inversa della sequenza al 5' del mRNA di HP-2 e stata effettuata utilizzando il sistema 5' RACE (Gibco/BRL) su RNA totale da foglie di pomodoro con l'oligonucleotide 5'-CATCAACACTGCCAAAC-3' (SEQ ID No.3), derivato dalla sequenza del marker RFLP CT151. Il 5' del cDNA di HP-2 e’ stato ottenuto dopo due reazioni di amplificazione per PCR con taql polimerasi (Perkin Elmer) utilizzando due diversi oligonucleotidi, derivati dalla sequenza di CT151. Nella prima reazione e’ stato usato il 5-GAAAGCAGCCGTTGCT-3' (SEQ ID No.4) e nella seconda il 5'-AGTTCATCATCTTCACGGC-3' (SEQ ID No.5), entrambi insieme all<1 >oligonucleotide di ancoraggio fornito dal sistema Gibco/BRL. Il prodotto di PCR di circa 0.8 kb cosi ottenuto e' stato direttamente sequenziato con il sistema termosequenasi (Amersham).

Il cDNA totale di pomodoro selvatico (Money Maker) e dei corrispondenti mutanti hp-2 e hp-2 J e' stato ottenuto per trascrizione inversa (AMV, Promega) dal poly(A) RNA isolato da foglie, usando il sistema delle oligod(T) Dynabeads (Dynal). Da questi campioni, la sequenza cDNA di HP-2 e' stata amplificata per PCR con oligonucleotidi specifici:

usando il sistema Expand High Fidelity (Boehringer). Successivamente, il prodotto di amplificazione e' stato sublonato in pBluescript come frammento Spel e 4 cloni indipendenti sono stati sequenziati in entrambe le eliche.

La genoteca genomica di pomodoro in λ-DASH (Stratagene) (gentilmente fornita da J. Giovannoni, Texas A&M University) e' stata usata per lo screening con metodi standard (Sambrook et al, 1989) utilizzando il frammento CT151 marcato con <32>P. Due diversi frammenti provenienti da due fagi ricombinanti, risultati positivi nello screening, sono stati subclonati in pBluescript e sequenziati in entrambe le eliche.

ID No.9) sono stati utilizzati per amplificare la sequenza 3' del gene DNA genomico del mutanti hp-2. Il prodotto di amplificazione bp e' stato direttamente sequenziato con l'oligonucleotide 5'- (SEQ ID No.10) usando la Thermosequenase (Amersham).

Costruzione dei plasmidi binari per la trasformazione in pianta

Il frammento di DNA contenente il promotore E8 (Deikman and Fischer, 1988) di pomodoro, specifico per l'espressione in frutto, e' stato amplificato per PCR sul DNA totale di S. lycopersicon usando i seguenti oligonucleotidi:

No.12). Il prodotto di amplificazione di 1.2 kb e' stato subclonato come frammento Hindlll-BarnHI nel vettore binario di espressione pmGFP4, derivato da pBI121 (Bevan, 1984; Jefferson et al., 1987; Haseloff et al., 1997) al posto del promotore 35S, 1ttenendo il plasmide pE8mGFP4. Successivamente, da questo plasmide e' stato exciso il gene mGFP4 ed e' stata inserita, come frammento BamHI-Sacl, la sequenza inversa e complementare al gene HP-2 o parte di essa, ottenendo rispettivamente i plasmidi pBIN-E8-HP2-AS1 e pBIN-E8-HP2-AS2 (Fig.8).

Risultati

Caratteristiche dei mutanti ho-2

Piantine dei mutanti hp~2 mostrano un'esagerata risposta alla luce rispetto al selvatico, in particolare, la lunghezza degli ipocotili é ridotta (Fig. 1a) ed il contenuto di pigmenti antociani é presente a piu' alta concentrazione sia negli ipocotili die nei cotiledoni rispetto al selvatico (Fig. 1b). Tale fenotipo é strettamente dipendente dalla luce, infatti al buio la lunghezza dell'ipocotile non é differente dal selvatico in modo significativo (Figura 1a) e gli antociani non sono prodotti (dati non mostrati). Sia per la lunghezza degli ipocotili che per il contenuto di antociani, il mutante risulta avere un fenotipo più forte del mutante hp-2 (Fig. 1).

Frutti provenienti da piante di mutanti hp-2 e hp-2 J presentano anche risposte esagerate alla luce. Nei frutti immaturi dei mutanti hp-2 e hp-2 J il contenuto di clorofille é circa cinque volte più elevato rispetto a quello delle piante selvatiche, mentre nei frutti maturi il contenuto dei carotenoidi totali é circa il doppio rispetto a quello delle piante selvatiche (Tabella 1).

'Tabella 1: Contenuto di clorofille e carotenoidi nel frutto di pomodoro da piante selvatiche e da mutanti hp-2, hp-2J

Il fenotipo mutante hp-2 è causato da mutazioni del gene HP-2 di pomodoro.

La mutazione hp-2 è stata mappata precedentemente attraverso analisi RFLP di una popolazione segregante derivante dall’incrocio tra il mutante hp-2 e Lycopersicon pennelli (Van Tuinen et al., 1997). L’analisi RFLP sulla popolazione backcross 2 (BC2) ha indicato la posizione del gene sul cromosoma 1 nelle vicinanze del centromero, all’interno di un cluster che contiene diversi marcatori RFLP (Van Tuinen et al., 1997; Brovn and Tanksley, 1996). Gli autori della presente invenzione hanno scoperto che il marcatore RFLP CT151 (Tanksley et al., 1992), compreso in questo cluster, ha una alta omologia con il gene DET1 di Arabidopsis thaliana (Pepper et al., 1994). Poiché sia il mutante di pomodoro hp-2 che il mutante di Arabidopsis det1 sono mutanti fotomorfogenici, gli autori hanno ipotizzato che CT151 sia parte del gene HP-2 e che il fenotipo mutante hp-2 sia il risultato di una mutazione nel gene omologo a DET1 in pomodoro.

Il confronto tra la sequenza di CT151 e del cDNA di DET1 di Arabidopsis ha mostrato che CT151 ha un’alta omologia con la parte terminale del gene DET1. Gli autori hanno isolato il cDNA completo che codifica per la proteina HP-2 di pomodoro utilizzando il sistema 5’ RACE (Figg. 2 e 3). In seguito il gene HP-2 è stato isolato da una libreria genomica in λ-DASH. Il DNA da due diversi fagi ricombinanti è stato isolato e i frammenti contenenti la sequenza nucleotidica genomica HP-2, sono stati subclonati in pBluescript e sequenziati. L’allineamento tra il cDNA di HP-2 e la sequenza genomica ha rivelato la presenza di 9 introni, così come in Arabidopsis (si veda Fig. 4). Sebbene gli introni siano localizzati nelle stesse posizioni di quelli del gene DET1 di Arabidopsis , alcuni sono molto più lunghi. Inoltre, l'introne 8 di 10 kb contiene sequenze simili a retrotrasposoni. Un’analisi comparativa delle sequenze proteiche di DET1 tra Arabidopsis e pomodoro mostra una similarità dell’81.3% e una identità del 74.8% (Fig. 5). Nessuna differenza principale è presente tra le sequenze, suggerendo che il gene di pomodoro HP-2 è l’omologo del gene di Arabidopsis.

Inoltre, dalla presenza di un segnale di localizzazione nucleare (NLS) bipartito (Robbins et al., 1991) nella sequenza amminoacidica di DET1 in Arabidopsis e dall'osservazione che fa proteina chimerica DET1-GUS é localizzata nel nucleo (Pepper et al, 1994), è stato proposto che DET1 in Arabidopsis è responsabile della repressione trascrizionale della fotomorfogenesi al buio. In considerazione dell’omologia con HP-2, è possibile che quest’ultimo abbia un'analoga funzione in pomodoro.

I cDNA codificanti per la proteina HP-2, sia dal cultivar selvatico che dai mutanti hp-2 e hp-2 sono stati amplificati con oligonucleotidi specifici da campioni di cDNA totale, ottenuti per trascrizione inversa di mRNA da foglie. I prodotti di cDNA amplificati sono stati subclonati in pBluescript e 4 cloni indipendenti sono stati sequenziati in entrambe le eliche. In hp-2!, gli autori hanno identificato una mutazione da C a T nell’esone 10 (nucleotide 1640), che provoca una sostituzione da prolina in serina nella regione C-terminale della proteina (amminoacido 498) (Fig. 4a). Nel mutante hp-2 gli autori hanno identificato uno splicing alternativo dell’introne 9, che provoca una delezione dei primi tre amminoacidi (gly, prò, giu) all’inizio dell’esone 10, nel secondo dominio NLS della proteina (amminoacidi 478-480) (Fig. 4a). Per trovare il sito della mutazione che causa lo splicing alternativo, gli autori hanno sequenziato il 3’ dei gene HP-2 nel mutante hp-2, ottenuto per amplificazione con PCR da DNA genomico, E’ stata così identificata una sostituzione AG in TG nella giunzione consensus al 3’ dell’introne 9 (Fig. 4b). Questi risultati mostrano che il fenotipo "high pigment" del mutante di pomodoro hp-2 è causato dalla mutazione del gene HP-2.

Il sequenziamento del cDNA di HP-2 dal mutante hp-2 indica che la mutazione porta a due diversi prodotti di splicing dell’introne 9 (Fig. 4b), suggerendo che una quantità limitata di proteina HP-2 selvatica è presente e che il mutante hp-2 non è un ailele nullo. Ciò è consistente con l’osservazione che hp-2 è un ailele più debole rispetto ad hp2?, in accordo alla riduzione della lunghezza deH'ipocotile e dei livelli di antociani (Fig. 1). Tuttavia, poiché la mutazione hp2! è localizzata nel dominio C-terminale di HP-2, come l’allele det1-5 di Arabidopsis (Pepper et al. 1994), è chiaro che i fenotipi mutanti hp-2 non sono comparabili con il fenotipo mutante det1 in Arabidopsis.

Similarità tra i fenotipi hp-2 e det1

I mutanti hp-2 sono fenotipicamente diversi dai mutanti det1. Essi infatti non mostrano alcun fenotipo al buio, mentre i mutanti det1 di Arabidopsis hanno una ridotta lunghezza deH’ipocotile, delle vere foglie, un accumulo di antociani e l'espressione di geni fotoregolati (cioè CAB, CHS ) al buio. In effetti, questi sono stati i criteri di selezione per l'isolamento dei mutanti det/cop/fus (Chory et al., 1989; Deng et al., 1991). Inoltre, osservazioni precedenti hanno mostrato che in Arabidopsis il fenotipo det1 al buio può essere fenocopiato da una applicazione esogena di citochinine (Chory et al., 1994). Per determinare gli effetti del trattamento con citochinine in pomodoro, gli autori hanno trattato piantine di pomodoro selvatiche con diverse concentrazioni di citochinine al buio e alla luce. Le citochinine non fenocopiano la mutazione det1 nel pomodoro, ma possono parzialmente fenocopiare hp (Fig. 6). Alla luce, le citochinine causano ipocotili più corti e più spessi e un accumulo di antociani più elevato (Fig. 6), nonché un'inibizione dello sviluppo delle radici (dati non mostrati). Nel trattamento con citochinine al buio, gli ipocotili sono più corti e più spessi, ma non si osserva né l'apertura dei cotiledoni, né la biosintesi degli antociani (Fig. 6). Questi risultati pertanto indicano che, a questo riguardo, la mutazione hp-2 nel pomodoro può ritenersi equivalente a det1 in Arabidopsis. Tale ipotesi è consistente col fatto che nessun mutante costitutivo de-eziolato è stato fino ad ora identificato in pomodoro e che l'espressione del gene CHS e il conseguente accumulo biosintetico di antociani sono strettamente dipendenti dalla luce, mentre in Arabidopsis possono essere indotti anche in assenza di luce (Mustilli and Bowler, 1997).

L'analisi dei doppi mutanti det1 ed i mutanti fitocromo deficienti phyA (hy8), phyB (hy3) in Arabidopsis hanno mostrato che la mutazione det1 e<1 >totalmente epistatica sul fenotipo fitocromo deficiente (Chory, 1992). Pertanto l'attività del gene DET1 in Arabidopsis si trova a valle del fitocromo. Per verificare se anche in pomodoro questa gerarchia e' rispettata, gli autori hanno analizzato il doppio mutante au,hp-2, gentilmente fornito da D. Kendrick e M. Koomneef. E' molto interessante notare che tale doppio mutante e' risultato differente dal rispettivo in Arabidopsis. Infatti, il fenotipo e' molto piu' simile al singolo mutante au per quanto riguarda la lunghezza dell'ipocotile e l'accumulo di antociani (Fig. 7). La leggera riduzione della lunghezza dell'ipocotile ed il lieve aumento di antocianì nel doppio mutante rispetto ad au, può essere spiegato dalla ipersensibilità' dovuta alla mutazione hp-2 verso la piccola quantità' di fitocromo presente nel mutante au (Parks et al, 1987). Quindi il fenotipo hp-2 in pomodoro risulta strettamente dipendente dalla presenza di fitocromo, mentre in Arabidopsis l'attività' del gene DET1 e' invece non influenzata esclusivamente dal segnale del fitocromo.

La mancanza di un fenotipo det1 nel pomodoro e il fatto che il fenotipo mutante hp è dipendente dalla luce potrebbe suggerire che nel pomodoro vi è una ridondanza nella funzione genica di DET1, oppure che la rete di trasduzione del segnale è regolata in maniera differente in pomodoro e in Arabidopsis (Mustilli and Bowler, 1997). Poiché' da analisi Southern risulta la presenza di un solo gene omologo a DET1 in pomodoro (dati non mostrati), la seconda ipotesi sembra piu' accettabile. Sarebbe quindi molto interessante clonare altri geni codificanti proteine omologhe alla famiglia COP/DET/FUS in pomodoro e vedere se l’alterazione anche delle loro funzioni regolatrici sia responsabile del fenotipo ipersensibile alla luce, nonché se le loro funzioni siano piu' strettamente correlate con la risposta alla luce di quelle di Arabidopsis.

Plasmidi binari per la modulazione del gene HP-2

Per la generazione di piante aventi le caratteristiche del fenotipo hp-2 specificamente nel frutto, gli autori hanno costruito dei plasmidi tali da produrre la sequenza antisenso dell'RNA di HP-2 o parte di essa solo nel frutto usando le sequenze regolatrici del gene di pomodoro E8 (Fig. 8).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidicà codificante per una proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile se alterata del fenotipo mutante ipersensibile alla luce in piante di Solarium lycopersicon , detto fenotipo comprendente una ridotta crescita della pianta, associata a livelli elevati di carotenoidi, e/o clorofille, e/o flavonoidi.
2. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1 codificante per una proteina di pomodoro omologa ad almeno una delle proteine della famiglia COP/DET/FUS di Arabidopsis, responsabile per il fenotipo mutante ipersensibile alla luce.
3. Acido nucleico secondo la rivendicazione 2 comprendente la sequenza nucleotidicà codificante per la proteina HP-2, o porzioni funzionali di essa.
4. Acido nucleico secondo la rivendicazione 3 comprendente una sequenza nucleotidicà codificante per la proteina avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No. 2, o porzioni funzionali di essa.
5. Acido nucleico secondo la rivendicazione 4 comprendente una sequenza nucleotidicà compresa nella SEQ ID No. 1.
6. Acido nucleico secondo la rivendicazione 5 in cui la sequenza nucleotidicà compresa nella SEQ ID No. 1 è quella dal nt. 149 ai nt. 1720, o porzioni di essa.
7. Acido nucleico comprendente una sequenza nucleotidicà complementare a SEQ ID No. 1 , o a porzioni di essa.
8. Acido nucleico secondo la rivendicazione 3 o 4 comprendente una mutazione in grado di indurre il fenotipo ipersensibile alla luce.
9. Acido nucleico secondo la rivendicazioni 8 in cui la SEQ ID No. 1 comprende almeno una sostituzione da C a T in posizione 1640.
10. Acido nucleico secondo la rivendicazione 8 in cui la SEQ ID No. 1 comprende almeno una delezione dei nucleotidi da 1581 a 1589.
11. Vettore di espressione comprendente, sotto il controllo di un promotore attivo e regolabile in piante, l’acido nucleico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
12. Vettore secondo la rivendicazione 11 in cui detto promotore è attivo selettivamente solo in alcuni organi vegetali.
13. Vettore secondo la rivendicazione 12 in cui detto promotore è attivo nei frutti.
14. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13 in grado di dirigere la trascrizione di un RNA antisenso.
15. Vettore secondo la rivendicazione 14 in cui detto vettore è il vettore PBIN-E8-HP2-AS1 o pBIN-E8-HP2-AS2.
16. Uso del vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 15 per la produzione di piante transgeniche che contengono l’acido nucleico secondo una delle rivendicazioni da 1 a 10, sotto il controllo di sequenze regolatrici specifiche, preferibilmente in organi vegetali selezionati.
17. Uso del vettore secondo la rivendicazione 16 in cui detta pianta transgenica alla specie di pomodoro, peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinacio, agrumi, pomacee o specie di interesse floreale.
18. Pianta transgenica ottenibile per trasformazione con il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 15.
19. Pianta transgenica secondo la rivendicazione 18 appartenente alle specie di pomodoro, peperone, melanzana, soia, uva, riso, carota, spinacio, agrumi, pomacee o specie di interesse floreale.
20. Proteina, o porzioni funzionali di essa, responsabile se alterata del fenotipo ipersensibile alla luce in piante di Solarium lycopersicon.
21. Proteina secondo la rivendicazione 20 di pomodoro omologa ad almeno una delle proteine della famiglia COP/DET/FUS di Arabidopsis, responsabile del fenotipo ipersensibile alla luce.
22. Proteina secondo la rivendicazione 21 comprendente la sequenza amminoacidica di SEQ ID No. 2 o porzioni di essa.
23. Proteina secondo la rivendicazione 22 comprendente un’alterazione in grado di indurre il fenotipo ipersensibile alla luce della sequenza amminoacidica di SEQ ID No. 2 o porzioni di essa.
24. Proteina secondo la rivendicazione 23 comprendente almeno una alterazione nella porzione C-terminale di SEQ ID No.2.
25. Proteina secondo la rivendicazione 24 in cui detta alterazione nella porzione C-terminale comprende una sostituzione della prolina in posizione 498.
26. Proteina secondo la rivendicazione 25 in cui detta sostituzione è una sostituzione da prolina in serina.
27. Proteina secondo la rivendicazione 24 in cui detta alterazione nella porzione C-terminale comprende una delezione di almeno un amminoacido nel secondo dominio NLS.
28. Proteina secondo la rivendicazione 27 in cui detta delezione è di almeno tre amminoacidi.
29. Proteina secondo la rivendicazione 28 in cui detta delezione di almeno tre amminoacidi è degli amminoacidi da 478 a 480.