ES2290015T3 - Metodo para la purificacion, recuperacion y esporulacion de quistes y ooquistes. - Google Patents
Metodo para la purificacion, recuperacion y esporulacion de quistes y ooquistes. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la esporulación de ooquistes, que comprende: formar una suspensión acuosa de los ooquistes con agua y peróxido de hidrógeno, en el que el peróxido de hidrógeno está presente en una cantidad suficiente para eliminar el crecimiento microbiológico no deseado; y burbujear con aire la suspensión acuosa para mantener el contenido de oxígeno disuelto en un nivel suficiente para permitir a los ooquistes esporular, para así esporular los ooquistes.
Description
Método para la purificación, recuperación y
esporulación de quistes y ooquistes.
Esta invención se refiere de forma general a
métodos para la purificación, la recuperación y la esporulación de
protozoos enquistados para su uso en la producción de vacunas. Los
protozoos son patógenos conocidos que atacan el tracto
gastrointestinal del huésped. En una situación en la que el huésped
tiene un sistema inmunológico débil o deprimido, tal como en
huéspedes inmuno-deprimidos muy jóvenes o muy
viejos, la infección puede ser fatal. Tal pérdida puede traducirse
en una pérdida económica también. Los protozoos están presentes en
el medio ambiente en una forma de quiste relativamente estable,
también llamado ooquiste cuando el protozoo es un esporozoo. En la
ingestión en el huésped, los protozoos enquistados responden a las
condiciones del tracto gastrointestinal e infectan al huésped.
Para impedir o aliviar el problema de estas
enfermedades, se han desarrollado vacunas no
in-ovo. Estas vacunas típicamente exponen al
huésped a un nivel bajo de protozoos para desarrollar la inmunidad
en el huésped sin causar enfermedad. Tales vacunas incluyen una
vacuna contra la coccidiosis aviar causada por cualquiera de un
número de especies de coccidia (patente de EE.UU. Nº.
5.055.292), una vacuna para gatos contra toxoplasma (patente de
EE.UU. Nº. 5.045.313), y vacunas para cerdos y otro ruminantes
(patente de EE.UU. Nº. 4.808.404). Estas vacunas son sólo
parcialmente eficaces porque se deben administrar por alimentación
forzada o suministrándolas al agua o al alimento del animal. La
alimentación forzada es ineficaz porque requiere la introducción de
la vacuna manualmente. También, muchos polluelos mueren debido a su
manipulación. La adición de la vacuna al alimento o al agua es
también ineficaz dado que los polluelos jóvenes comen poco
directamente después de la incubación; por lo tanto, el control de
la enfermedad se retrasa. El resultado es una ganacia de peso menos
rápida y un tiempo más largo para alcanzar el peso requerido por el
mercado.
Para producir la vacuna, debe ser obtenido un
suministro de protozoos enquistados suficientemente purificados.
Las técnicas de separación y de recuperación actuales emplean
materiales corrosivos, peligrosos y tóxicos. Deben ser emprendidas
medidas para compensar a estos materiales, tales como operaciones de
lavado extensas para eliminar estos materiales que causan un bajo
rendimiento del producto. El método típico para obtener protozoos
enquistados incluye la obtención de una fuente de protozoos
enquistados, tales como los intestinos o excrementos de animales
infectados. La materia intestinal o materia fecal tiene que ser
separada de los protozoos enquistados y se usa un método de
flotación. Se han usado procedimientos de flotación con medio
pesado o sedimentación cuando el medio pesado es cloruro de sodio
(patente de EE.UU. Nº. 4.863.731) o sacarosa (patente de EE.UU. Nº.
5.068.104). El medio pesado se usa en una mezcla acuosa.
Lamentablemente, el uso de mezclas acuosas del medio pesado puede
tener efectos adversos. Por ejemplo, las mezclas acuosas de cloruro
de sodio pueden conducir a una severa corrosión del equipo.
Antes de que el esporozoo enquistado pueda
volverse infeccioso, los ooquistes separados deben ser esporulados
mediante una oxidación suave. La oxidación suave es lograda por la
colocación de la suspensión sobre una mesa vibradora o burbujeando
aire a través de la suspensión de los ooquistes. El dicromato de
potasio es empleado típicamente para suprimir cualquier crecimiento
microbiano no deseado durante la esporulación. Pero, el dicromato
de potasio es un material peligroso. Su uso crea problemas de
disposición y de manejo. Su eliminación causa un menor rendimiento
reducido y mayores gastos.
Una etapa final de blanqueamiento que usa
hipoclorito de sodio es usada para eliminar cualquier material
orgánico restante y microorganismo indeseado. Los ooquistes
blanqueados deben ser lavados para reducir la concentración de
agente blanqueante residual a un nivel aceptable. El lavado se logra
mediante una serie de diluciones y operaciones de recuperación del
ooquiste para reducir los niveles del agente blanqueante produciendo
un concentrado del ooquiste. El concentrado de ooquiste final se
convierte en una vacuna en condiciones estériles. Cada vacuna puede
incluir múltiples especies de protozoos para proporcionar la mayor
cantidad de protección posible.
Existe una necesidad de un método de vacunación
más eficiente. Tal método de vacunación emplearía una vacuna viva
medicada en un nivel suficiente para generar una respuesta inmune
para producir la inmunidad, pero suficientemente bajo para no
causar síntomas agudos. Por ejemplo, una vacuna
in-ovo contra la coccidiosis aviar puede
acortar los tiempos de tratamiento y permitir una dosificación más
uniforme. Este método también podría ser usado para recoger y
producir vacunas humanas para la protección contra protozoos
incluyendo Cryptosporidium y Giardia lamblia. El
método emplearía un procedimiento de flotación de medio denso no
corrosivo o un procedimiento de flotación por gas que elimine
completamente la necesidad de la sal. Este mejor método no usaría
ningún biocida peligroso tal como el dicromato de potasio. Tal
biocida alternativo u oxidante también podría usarse como agente
blanqueante, eliminando otras etapas del procedimiento y otros
compuestos peligrosos.
La presente invención se refiere a un método
para la esporulación de ooquistes como se describe en la
reivindicación 1. En las realizaciones preferidas, el método de la
invención se refiere a la purificación y la recuperación de los
ooquistes, incluyendo la separación de estos a partir de una
suspensión que los contiene mediante un procedimiento de flotación
con sal en el que la sal es una sal tal como sulfato de sodio,
sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio o sus
mezclas o un procedimiento de flotación por gas, antes de la
esporulación.
En una realización, el método para separar los
ooquistes se logra mediante un procedimiento de flotación con sal,
siendo la sal el sulfato de sodio. En esta realización, el método
incluye preparar una mezcla que comprende los ooquistes y el
sulfato de sodio, centrifugar la mezcla y recuperar el sobrenadante
de ésta, formar una dilución a partir del sobrenadante y
centrifugar la dilución, y recuperar el concentrado a partir de la
dilución centrifugada. Esta realización también puede incluir
homogeneizar la mezcla por homogeneización de alta intensidad. El
sulfato de sodio está presente en la mezcla en una cantidad de
aproximadamente 3 a aproximadamente 30 por ciento en peso. Además,
la densidad de la dilución puede ser menor que la densidad de los
ooquistes. El concentrado comprende de aproximadamente 1 x 10^{4}
a aproximadamente 1,5 x 10^{6} ooquistes/ml.
En otra realización, la separación de los
ooquistes se logra mediante un procedimiento de flotación por gas.
El procedimiento de flotación por gas incluye ajustar la suspensión
a un pH suficiente para afectar a la adherencia entre las burbujas
del gas en la suspensión y los ooquistes, acondicionar la suspensión
ajustada del pH añadiendo una cantidad suficiente de un compuesto
tensioactivo para revestir selectivamente partículas en la
suspensión y una cantidad suficiente de un compuesto heteropolar
para producir una espuma estable, pasando la suspensión
acondicionada a través de al menos una célula de flotación por gas y
recuperar los ooquistes a partir de la célula de flotación por gas.
Los gases adecuados incluyen el aire. Cuando el gas es el aire, el
pH puede ser ajustado de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,5.
Los compuestos tensioactivos incluyen una sal de sodio de
hidrógeno-sulfato de alquilo de cadena larga, un
compuesto de amonio cuaternario, una mezcla de un acetato de amonio
graso y 2-etilhexanol, un compuesto de éster/amida,
un alquiloxi polietilenoxietanol y sus mezclas. Los compuestos
heteropolares incluyen alcoholes de amilo, alcoholes de butilo,
terpinoles, cresoles y sus mezclas. Los caudales de gas adecuados
para la célula de flotación por gas están en el intervalo de
aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1,1 volúmenes de gas por
volumen de suspensión por minuto. En una realización preferida, la
célula de flotación por gas comprende al menos dos unidades de
flotación de gas en serie, y estas unidades pueden tener diferentes
caudales de gas.
El método para la esporulación de ooquistes de
la presente invención incluye formar una suspensión acuosa de los
ooquistes con agua y peróxido de hidrógeno, en el que el peróxido de
hidrógeno está presente en una cantidad suficiente para eliminar el
crecimiento microbiológico no deseado, y burbujear aire en la
suspensión acuosa para esporular los ooquistes. La suspensión
acuosa puede ser burbujeada con aire durante un período de tiempo
mayor que aproximadamente 40 horas en condiciones tal que la
suspensión acuosa durante la aireación tiene un nivel de oxígeno
disuelto mayor que aproximadamente 80% del nivel de saturación a una
temperatura de aproximadamente 22ºC a aproximadamente 32ºC y puede
tener un nivel de agitación suficiente para suspender
suficientemente todos los sólidos. En esta realización, la
suspensión acuosa puede incluir una concentración de ooquistes de
aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{6} ooquistes/ml y
una concentración de peróxido de hidrógeno de aproximadamente 1.000
a aproximadamente 20.000 mg/l.
La presente invención se refiere a un método
para la purificación, la recuperación y la esporulación de ooquistes
que incluye separar los ooquistes a partir de una primera
suspensión que comprende los ooquistes y esporular los ooquistes
separados por los métodos de la presente invención. Los ooquistes
adecuados son Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria tenella,
Eimeria acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria necatrix, Eimeria
praecox, y sus mezclas. En una realización, la separación de los
ooquistes se logra mediante un procedimiento de flotación con
sulfato de sodio que incluye preparar una mezcla que comprende los
ooquistes y el sulfato de sodio, centrifugar la mezcla y recuperar
el sobrenadante de ésta, formar una dilución del sobrenadante y
centrifugar la dilución y recuperar el concentrado a partir de la
dilución centrifugada.
En otra realización, la separación de los
ooquistes se logra mediante un procedimiento de flotación por gas
que incluye ajustar la primera suspensión a un pH suficiente para
afectar a la adherencia entre las burbujas del gas en la suspensión
y los protozoos enquistados, acondicionar la suspensión ajustada del
pH añadiendo una cantidad suficiente de un compuesto tensioactivo
para revestir selectivamente las partículas en la suspensión y una
cantidad suficiente de un compuesto heteropolar para producir una
espuma estable, pasar la suspensión acondicionada a través de al
menos una célula de flotación por gas, y recuperar los protozoos
enquistados a partir de la célula de flotación por gas. Esta
realización puede incluir además añadir un agente blanqueante a los
ooquistes esporulados en una cantidad suficiente para inactivar a
los microorganismos residuales y eliminar la materia orgánica
residual, y blanquear los ooquistes esporulados. En otra
realización, el blanqueo se lleva a cabo simultáneamente con la
esporulación, y el agente blanqueante es peróxido de hidrógeno. En
otra realización más, el agente blanqueante es hipoclorito de sodio
presente en una cantidad de aproximadamente 5.000 a aproximadamente
10.000 partes por millón sin cloro disponible, el ozono está
presente en una cantidad de hasta aproximadamente el 3% en aire y
sus combinaciones.
Este método puede incluir además lavar los
ooquistes blanqueados mediante filtración con membrana
contracorriente para disminuir la concentración del agente
blanqueante residual hasta un nivel aceptable. En otra realización
más, el agente blanqueante es el hipoclorito de sodio presente
después del lavado en una concentración suficiente para suprimir el
crecimiento microbiano residual y la suspensión de ooquistes
blanqueada y lavada tiene una concentración de aproximadamente 1 x
10^{6} a aproximadamente 2,5 x 10^{6} ooquistes/ml, un tamaño de
sólidos máximo de menos de aproximadamente 200 micras, y sulfato de
sodio presente en una cantidad suficientemente baja para no
interferir con la viabilidad y la infectividad de los quistes u
ooquistes, preferiblemente menos que aproximadamente el 3 por
ciento, más preferiblemente menos que aproximadamente el 0,9 por
ciento. Este método además puede incluir concentrar los ooquistes
blanqueados y lavados en un concentrado estéril, combinar los
concentrados estériles de una o varias especies de ooquistes en un
concentrado combinado y envasar el concentrado combinado en
condiciones estériles.
La figura 1A es un digrama de flujo que ilustra
las realizaciones del método de la presente invención;
La figura 1B es un digrama de flujo que ilustra
las realizaciones del método de la presente invención;
La figura 2 es una gráfica que muestra la
concentración de ooquistes frente a la concentración de sulfato de
sodio;
La figura 3 es una gráfica que muestra el tanto
por ciento de esporulación frente al tiempo después del cultivo del
quiste.
El presente método se refiere a la producción de
un concentrado de ooquistes esporulados que se utiliza en una
vacuna. Específicamente, el método se refiere a la producción de un
concentrado de ooquistes de coccidios aviares esporulados que se
usan para producir una vacuna in-ovo contra
la coccidiosis. La producción de una vacuna adecuada y aceptable
requiere un procedimiento de tratamiento de múltiples etapas que
constituye una pluralidad de procesos unitarios. Como se muestra en
las figuras 1A y 1B, el procedimiento de producción de la vacuna
puede incluir tomar una suspensión de ooquistes, homogeneizar la
suspensión, separar los ooquistes a partir de la suspensión por
flotación con sal o por flotación por gas, esporular los ooquistes,
blanquear los ooquistes esporulados, lavar el producto blanqueado,
concentrar los ooquistes, combinar los concentrados de múltiples
especies de ooquistes y rellenar de forma estéril para producir una
vacuna. Estas etapas son descritas con detalle más abajo.
Los ooquistes pueden ser obtenidos a partir de
varias fuentes incluyendo suspensiones purificadas, membranas
intestinales y suspensiones fecales. Especialmente cuando los
ooquistes se obtienen a partir del excremento, las suspensiones o
las mezclas pueden incluir cantidades significativas de sólidos
suspendidos indeseables. Por ejemplo, las suspensiones pueden
incluir de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 por ciento en
peso de sólidos o excrementos. Preferiblemente, la suspensión
incluye de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en
peso de sólidos cuando se usa flotación con sal y aproximadamente 1
por ciento en peso cuando se usa flotación por gas. Para liberar
los quistes de las sustancias orgánicas asociadas a la suspensión,
la suspensión puede ser sometida a una etapa de homogeneización. La
suspensión puede ser homogeneizada durante un período de tiempo de
más de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 minutos,
preferiblemente 1 minuto dependiendo de la intensidad de la
homogeneización. Las condiciones de homogeneización deben ser lo
suficientemente intensas para liberar los ooquistes, pero lo
bastante suave para prevenir su destrucción.
Los ooquistes tienen que separarse de esta
primera suspensión, preferiblemente para alcanzar al menos
aproximadamente un 70% de rendimiento de protozoos enquistados y al
menos aproximadamente un 80% de restos sólidos. Típicamente esto
causa una concentración de ooquistes de aproximadamente 1 x 10^{4}
a aproximadamente 1,5 x 10^{6} ooquistes/ml. La separación puede
ser lograda mediante un procedimiento de flotación con sal o
mediante un procedimiento de flotación por gas.
Cuando se usa un procedimiento de flotación con
sal, se prepara una mezcla de los ooquistes no purificados y la
sal. Las soluciones salinas adecuadas incluyen soluciones densas de
sales solubles en agua incluyendo cloruros, sulfatos, fosfatos,
nitratos y acetatos de amonio, sodio, potasio, calcio, magnesio y
cinc. Compuestos orgánicos con puentes de hidrógeno altamente
adecuados incluyen la urea y las sales de guanidiena.
Preferiblemente, las sales incluyen sulfato de sodio, sulfato de
magnesio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio y sus mezclas. Más
preferiblemente, la sal es el sulfato de sodio. Estas sales
proporcionan la ventaja de ser considerablemente menos corrosivas
para el equipo del proceso. La sal se añade en una cantidad
suficiente para producir una diferencia entre las densidades de los
ooquistes y la mezcla. Preferiblemente, la densidad de los ooquistes
será menor que la densidad de la mezcla. La sal está presente en un
cantidad de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 por ciento en
peso, preferiblemente aproximadamente de 14 a aproximadamente 20 por
ciento en peso, más preferiblemente aproximadamente 20 por ciento
en peso.
La mezcla entonces se somete a centrifugación y
el sobrenadante y el concentrado se recogen. Dependiendo de las
condiciones de mezcla, los ooquistes pueden estar contenidos en el
sobrenadante o el concentrado. La mezcla se centrifuga de
aproximadamente 3000 a aproximadamente 15.000 g, preferiblemente
12.000 g durante un periodo de tiempo necesario para separar
suficientemente a los ooquistes, típicamente hasta aproximadamente
10 minutos. Para una solución de sulfato de sodio del 20%, los
ooquistes estarán contenidos en el sobrenadante; por lo tanto, el
sobrenadante se recoge y el concentrado o pelete es llevado a los
residuos. Como se muestra en la figura 2, una concentración de
sulfato de sodio del 20% proporciona una alta concentración de
ooquistes en el sobrenadante (producto) y sólo una pequeña cantidad
de ooquistes en el pelete (residuo). Una dilución es formada por la
adición de agua al sobrenadante recuperado. El sobrenadante se
diluye suficientemente de modo que la densidad de los ooquistes sea
mayor que la densidad de la dilución. Por lo tanto, los ooquistes
tenderán a sedimentarse en la dilución. Para una concentración de
sulfato de sodio del 20%, la relación del peso de la dilución
frente al peso del sobrenadante es de aproximadamente 4 a
aproximadamente 8.
La dilución entonces se centrifuga por una
segunda vez en condiciones de centrifugación comparables a las de
la primera centrifugación, tal que la concentración de sal residual
es menos de aproximadamente 10 por ciento en peso, preferiblemente
menos de aproximadamente 1 por ciento en peso, y la concentración de
quiste resultante es aproximadamente de 10^{4} a 10^{6}
quistes/ml representando un rendimiento de aproximadamente 80 a
aproximadamente 95 por ciento. La tasa de desecho de restos sólidos
es preferiblemente de aproximadamente 90 a aproximadamente 99 por
ciento. En esta realización, los ooquistes se recuperan a partir del
concentrado y el sobrenadante se lleva a residuos.
En otra realización, la separación de los
ooquistes se logra mediante un procedimiento de flotación por gas.
Preferiblemente el gas es el aire, aunque cualquier gas, incluyendo
oxígeno y nitrógeno, podría ser usado. Cuando se usa la flotación
por gas, el pH de la suspensión se ajusta a un pH suficiente para
afectar a la adherencia entre las burbujas de gas en la suspensión
y los ooquistes cambiando la química superficial de los ooquistes.
El pH típicamente se ajusta a un pH de aproximadamente 2 a
aproximadamente 9, preferiblemente de aproximadamente 2,5 a 3,5,
más preferiblemente aproximadamente 3.
La suspensión con el pH ajustado además se
acondiciona por la adición de un compuesto tensioactivo, a veces
denominado compuesto colector y un compuesto heteropolar, a veces
denominado compuesto espumante. El compuesto tensioactivo, también
llamado detergente selectivo, agente humectante o emulsionante se
añaden en una cantidad suficiente para promover el contacto entre
los sólidos seleccionados y las burbujas de gas formando un
revestimiento delgado sobre las partículas que se ponen en
flotación, dando lugar a estas partículas hidrófobas, que no
revisten otras partículas. Por lo tanto, por la selección del
compuesto tensioactivo, pueden ser determinadas las partículas que
se ponen en flotación. Por lo tanto, los ooquistes podrían ser
recogidos en un procedimiento de flotación por gas en el cual son
puestos en flotación o en un procedimiento de flotación inverso en
el cual los sólidos que se eliminan son puestos en flotación.
Agentes tensioactivos adecuados incluyen una sal de sodio de
hidrógeno-sulfato de alquilo de cadena larga, un
compuesto de amonio cuaternario, una mezcla de un acetato de amonio
graso y 2-etilhexanol, un compuesto de éster/amida,
un alquiloxi-polietilenoxietanol y sus mezclas.
Preferiblemente, el compuesto tensioactivo es
lauril-sulfato de sodio. El agente tensioactivo
debe estar presente en una cantidad suficiente para revestir las
partículas que se ponen en flotación. El agente tensioactivo está
presente en una cantidad de aproximadamente 0,5 (0,227 kg) a 2 Ib
(0,907 kg) por tonelada (1.000 kg) de sólidos en la suspensión
acondicionada, preferiblemente 0,5 Ib (0,227 kg) por tonelada
(1.000 kg) de sólidos. De forma alternativa, el compuesto
tensioactivo puede tener aproximadamente 0,5 libras (0,227 kg) de
dodecil-amina por tonelada (1.000 kg) de sólidos que
han sido acidificados con ácido clorhídrico hasta que se obtiene un
pH neutro, o aproximadamente 0,5 Ib (0,227 kg) de sal de potasio de
ácido oleico por tonelada (1.000 kg) de sólidos.
Los compuestos heteropolares son seleccionados
por su capacidad de cambiar la tensión superficial del agua y
producir espumas estables. Típicamente estos compuestos
heteropolares contienen uno o varios grupos hidrocarburo unidos a
un grupo polar, teniendo el radical hidrocarburo hasta 5 ó 6 átomos
de carbono. Compuestos heteropolares adecuados incluyen alcoholes
de amilo y butilo, terpinoles, cresoles y sus mezclas.
Preferiblemente, el compuesto heteropolar es
metil-isobutil-carbinol (MIBC)
también denominado
metil-amil-alcohol y denominado con
más exactitud 4-metilpentanol,-2. El compuesto
heteropolar está presente en una cantidad suficiente para producir
una espuma estable. Preferiblemente, el compuesto heteropolar está
presente en una cantidad de hasta aproximadamente 2,0 Ib (0,907 kg)
por tonelada (1.000 kg) de sólidos, más preferiblemente de
aproximadamente 0,5 (0,227 kg) a 2,0 Ib (0,907 kg) por tonelada
(1.000 kg) de sólidos, más preferiblemente aproximadamente 0,5 Ib
(0,227 kg) por tonelada (1.000 kg) de sólidos. Una tonelada es
igual a 2.240 libras.
La suspensión acondicionada se pasa a través de
una célula de flotación por gas y los ooquistes son recuperados.
Dependiendo del pH, el compuesto tensoactivo y el compuesto
heteropolar seleccionado, los ooquistes pueden ser puestos en
flotación o ser mantenidos en suspensión. Preferiblemente, los
ooquistes se ponen en flotación. El procedimiento de flotación por
gas se lleva a cabo durante un periodo de tiempo y con un caudal de
aire suficiente para recuperar aproximadamente de 20 a 100 por
ciento, típicamente de aproximadamente 85 por ciento de los
ooquistes desechando aproximadamente de 20 a 90 por ciento,
típicamente 70 por ciento de los restos sólidos. El procedimiento
de flotación por gas se lleva a cabo durante un periodo de tiempo de
aproximadamente 3 minutos a más de aproximadamente 10 minutos,
preferiblemente aproximadamente 10 minutos. El caudal de gas en la
célula de flotación de aire es de aproximadamente 0,25 a
aproximadamente 1,1 volúmenes de gas por volumen de solución por
minuto ("vvm"), preferiblemente de aproximadamente 0,25 a
aproximadamente 0,83 vvm, más preferiblemente de aproximadamente
0,25 a aproximadamente 0,75 vvm. La célula de flotación por gas
puede incluir una pluralidad de unidades de flotación en serie.
Preferiblemente, la célula de flotación por gas incluye al menos dos
unidades de flotación en serie. Preferiblemente, las unidades de
flotación son columnas de flotación por gas. El caudal de gas en
las unidades de flotación en serie puede ser igual o diferente.
Preferiblemente, los flujos de gas son diferentes, por ejemplo de
aproximadamente 0,47 vvm para una columna de 81,3 cm (32 pulgadas)
de alto, 5,08 cm (2 pulgadas) de diámetro y aproximadamente 0,27
vvm para una columna de 152,4 cm (60 pulgadas) de alto, 5,08 cm (2
pulgadas) de diámetro.
Los ooquistes se esporulan. Como se muestra en
la figura 3, la esporulación debe ocurrir tan pronto como sea
posible después del cultivo de los ooquistes, preferiblemente, los
ooquistes deben ser esporulados a los 3 días después del cultivo.
Una suspensión acuosa de los ooquistes y un oxidante o biocida se
prepara, y la suspensión acuosa se airea durante un periodo de
tiempo suficiente para esporular a los ooquistes. Si fuera usado un
procedimiento de flotación con sal para separar los ooquistes,
entonces la concentración de sal durante la esporulación debería
ser menor de aproximadamente 10 por ciento en peso, preferiblemente
menor de aproximadamente 2 por ciento en peso, más preferiblemente
menor de aproximadamente 1 por ciento en peso. Preferiblemente, la
concentración de quiste durante la esporulación es de
aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{6} ooquistes/ml,
más preferiblemente aproximadamente 10^{5} ooquistes/ml. Los
ooquistes deben ser esporulados a aproximadamente de 1 a 24 horas
después de la recuperación del concentrado del quiste purificado. El
pH de la suspensión acuosa debe ser de aproximadamente 5,0 a 7,0,
preferiblemente de aproximadamente 5,2 a 6,8. La temperatura de la
suspensión acuosa en una realización es de aproximadamente 20 a
aproximadamente 33ºC, preferiblemente de aproximadamente 22 a
aproximadamente 32ºC, más preferiblemente de aproximadamente 25 a
aproximadamente 29ºC, lo más preferiblemente aproximadamente 25ºC.
La tasa de aireación en una realización es de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 10 vvm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 2,0 vvm. En general, el nivel de agitación debe ser
suficiente para suspender totalmente todos los sólidos durante la
esporulación, pero no lo bastante para destruir los ooquistes. Esto
puede ocurrir mediante aireación, vibración, agitación y sus
combinaciones. Cuando se usa agitación, por ejemplo, la agitación
debe ser suficiente para mantener los sólidos suspendidos en la
suspensión, pero no lo bastante como para destruir los ooquistes.
La agitación adecuada en un recipiente de diámetro 15,2 cm (6
pulgadas) puede ocurrir a aproximadamente de 121 a 204 rpm,
preferiblemente de aproximadamente 197 a 200 revoluciones por
minuto, más preferiblemente a aproximadamente 200 revoluciones por
minuto. El contenido de oxígeno disuelto debe ser mantenido en un
nivel suficiente para permitir que los ooquistes esporulen,
preferiblemente a aproximadamente 80% de la concentración de
saturación a la temperatura dada. El período de tiempo para la
esporulación puede aumentar hasta aproximadamente 72 horas,
preferiblemente entre aproximadamente 40 y aproximadamente 72 horas,
más preferiblemente de aproximadamente 48 a aproximadamente 50
horas.
El oxidante se añade en una cantidad suficiente
para inactivar el crecimiento microbiano indeseable en la
suspensión acuosa. El oxidante o biocida es el peróxido de
hidrógeno. En una realización preferida el oxidante es peróxido de
hidrógeno presente en una cantidad de aproximadamente 1.000 a
aproximadamente 20.000 mg/l, preferiblemente aproximadamente 5.000
mg/l. El peróxido de hidrógeno proporciona la ventaja de un manejo
más fácil y menos caro, y la generación de subproductos de desecho
peligrosos a partir de este procedimiento se reduce.
La aireación puede ser lograda agitando en una
tabla de agitación o burbujeando aire en un tanque de esporulación
(por ejemplo, un tanque de fermentación). Preferiblemente, la
aireación se logra en un tanque de burbujeo de aire porque la
transferencia de masa de aire es mayor, reduciéndose así el tiempo
para la esporulación y el tamaño requerido del equipo.
Después de la esporulación, si fuera necesario,
los ooquistes pueden ser lavados para reducir la concentración de
oxidante residual hasta un nivel aceptable. El peróxido de hidrógeno
proporciona la ventaja de eliminar la necesidad de esta etapa. El
lavado puede ser logrado por lavados sucesivos, preferiblemente, el
lavado se logra por filtración con membrana, más preferiblemente
por diafiltración. En el caso de filtración con membrana, el tamaño
de poro de la membrana se selecciona para permitir el paso de
solutos a través de la membrana restringiendo el paso de los
ooquistes de un lado de la membrana al otro. En una realización, el
lavado se lleva a cabo con agua a una presión de transmembrana de
aproximadamente hasta aproximadamente 206 kPa (30 psi),
preferiblemente de 138 kPa a 172 kPa (de 20 a 25 psi), una velocidad
contracorriente de hasta aproximadamente 10 m/s, preferiblemente
aproximadamente 2 m/s, y un flujo a través de la membrana de hasta
aproximadamente 10 I/min/m^{2}, preferiblemente aproximadamente 3
I/min/m^{2}.
Los ooquistes pueden ser blanqueados para
inactivar los microorganismos residuales y eliminar la materia
orgánica residual. Primero, una cantidad suficiente de un agente
blanqueante es añadida, y luego los ooquistes se blanquean o se
ponen en contacto con el agente blanqueante durante un período
suficiente de tiempo. Los ooquistes pueden ser blanqueados durante
un periodo de hasta 1,5 horas. Los agentes blanqueantes adecuados
incluyen hipoclorito de sodio, peróxido de hidrógeno, ozono y sus
mezclas. El agente blanqueante puede estar al principio presente en
una cantidad de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 mg/l,
preferiblemente de aproximadamente 8.000 a aproximadamente 10.000
mg/l, más preferiblemente, 8.000 mg/l. El agente blanqueante no debe
estar presente en una cantidad suficiente que cause la corrosión en
el equipo del proceso. Cuando se usa peróxido de hidrógeno para la
esporulación, el blanqueo y la esporulación pueden ser llevados a
cabo simultáneamente. Después del blanqueo, la suspensión
blanqueada se lava, si fuera necesario, para reducir la
concentración de oxidante residual a un nivel aceptable. Cuando el
hipoclorito de sodio es el agente blanqueante, el nivel aceptable
es menos de aproximadamente 1 mg/l. El lavado puede ser logrado por
lavado en serie o por diafiltración.
La suspensión blanqueada puede ser concentrada
en una concentración estéril que tenga una concentración lo
bastante alta para una manipulación eficiente y eficaz. Por ejemplo,
la suspensión de oocitos concentrada final puede incluir un tamaño
de sólidos máximo de menos de aproximadamente 200 micras,
preferiblemente menos de aproximadamente 25 micras, un contenido de
sal de menos de aproximadamente 0,9 por ciento, una concentración
de cloro libre residual de menos de aproximadamente 1 mg/l, pero lo
suficiente para mantener el crecimiento microbiano residual
deprimido, y una concentración de quiste de aproximadamente 1 x
10^{6} a 2,5 x 10^{6} quistes/ml.
Cuando numerosos protozoos enquistados o
diferentes especies de un género de protozoos enquistados se usa en
una sola vacuna, los concentrados estériles de las diferentes
especies son combinados en un concentrado estéril solo. Por
ejemplo, los protozoos enquistados puede ser ooquistes de coccidios
aviares que incluyan Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria
tenella, Eimeria acervulina, Eimeria brunetfi, Eimeria necatrix,
Eimeria praecox, y sus mezclas incluyendo múltiples cepas de
cada uno. Finalmente, los concentrados combinados se someten al
relleno y al envasado en condiciones estériles, y así se produce la
vacuna.
Aunque las realizaciones preferidas de la
presente invención hayan sido descritas, se entiende que el presente
método pueda ser usado para producir otras vacunas para numerosos
tipos de animales y para seres humanos. Este método, de hecho,
podría ser usado para inmunizar a seres humanos contra protozoos
típicos en solución acuosa tales como Cryptosporidium y
Giardia lamblia. Además, aun cuando sea descrito el
procedimiento de recuperación entero, sus procesos unitarios pueden
ser usados por separado o insertados en otros esquemas de
recuperación, control, o tratamiento sin apartarse del alcance y del
espíritu de la presente invención.
Claims (21)
1. Un método para la esporulación de ooquistes,
que comprende:
formar una suspensión acuosa de los ooquistes
con agua y peróxido de hidrógeno, en el que el peróxido de hidrógeno
está presente en una cantidad suficiente para eliminar el
crecimiento microbiológico no deseado; y
burbujear con aire la suspensión acuosa para
mantener el contenido de oxígeno disuelto en un nivel suficiente
para permitir a los ooquistes esporular, para así esporular los
ooquistes.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
los ooquistes son ooquistes de coccidios aviares.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
los ooquistes de coccidios aviares se seleccionan a partir del
grupo que consiste en ooquistesde Eimeria maxima, Eimeria mitis,
Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria
necatrix, Eimeria praecox y sus combinaciones.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la suspensión acuosa
se burbujea con aire durante un período de tiempo de hasta
aproximadamente 72 horas.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que la suspensión acuosa
durante la aireación tiene un nivel de oxígeno disuelto mayor que
aproximadamente el 80% del nivel de saturación a una temperatura de
aproximadamente 22ºC a aproximadamente 32ºC y con un nivel de
agitación suficiente para suspender suficientemente todos los
sólidos.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 4-5 anteriores, en el que la
suspensión acuosa se burbujea con aire durante un período de tiempo
de entre aproximadamente 40 y 72 horas.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que la suspensión acuosa
comprende una concentración de ooquistes de aproximadamente
10^{4} a aproximadamente 10^{6} ooquistes/ml y una concentración
de peróxido de hidrógeno inicial de aproximadamente 1.000 a
aproximadamente 20.000 mg/l.
8. Un método para la purificación, recuperación
y esporulación de ooquistes, que comprende:
separar los ooquistes a partir de una primera
suspensión que comprende los ooquistes;
esporular los ooquistes separados por el método
de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
la separación de los ooquistes se logra mediante un procedimiento de
flotación con sal.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
el procedimiento de flotación con sal comprende:
- preparar una mezcla que comprende los ooquistes y la sal;
- centrifugar la mezcla y recuperar el sobrenadante a partir de ésta;
- formar una dilución del sobrenadante y centrifugar la dilución; y
- recuperar el concentrado a partir de la dilución centrifugada.
11. El método de la reivindicación 9 o la
reivindicación 10, en el que la sal comprende una sal seleccionada
a partir del grupo que consiste en sulfato de sodio, sulfato de
potasio, sulfato de magnesio, fosfato de sodio, fosfato de potasio,
fosfato de magnesio, acetato de sodio, acetato de potasio, acetato
de magnesio y sus mezclas.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
la sal comprende el sulfato de sodio.
13. El método de la reivindicación 11, en el que
la sal comprende el sulfato de magnesio.
14. El método de la reivindicación 8, en el que
la separación de los ooquistes se logra mediante un procedimiento
de flotación por gas que comprende:
ajustar la primera suspensión a un pH suficiente
para afectar a la adherencia entre las burbujas de gas en la
suspensión y los protozoos enquistados;
acondicionar la suspensión con el pH ajustado
añadiendo una cantidad suficiente de un compuesto tensioactivo para
revestir selectivamente partículas en suspensión y una cantidad
suficiente de un compuesto heteropolar para producir una espuma
estable;
pasar la suspensión acondicionada a través de al
menos una célula de flotación por gas; y
recuperar los protozoos enquistados a partir de
la célula de flotación por gas.
15. El método de la reivindicación 14, que
comprende además:
añadir un agente blanqueante a los ooquistes
esporulados en una cantidad suficiente para inactivar los
microorganismos residuales y eliminar la materia orgánica residual;
y
blanquear los ooquistes esporulados.
16. El método de la reivindicación 15, en el que
el agente blanqueante es peróxido de hidrógeno, hipoclorito de
sodio, ozono o sus mezclas.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el agente blanqueante es peróxido de hidrógeno y el blanqueo se
lleva a cabo simultáneamente con la esporulación.
18. El método de la reivindicación 16, en el que
el agente blanqueante es:
- (a)
- hipoclorito de sodio en una cantidad de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 10.000 partes por millón de cloro libre disponible,
- (b)
- ozono en una cantidad de hasta aproximadamente el 3% en aire,
- (c)
- peróxido de hidrógeno en una cantidad de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 20.000 mg/l, o
- (d)
- cualquier combinación de (a), (b) y (c).
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 15-18, que comprende además lavar
los ooquistes blanqueados por filtración con membrana en
contracorriente para disminuir la concentración de agente
blanqueante residual hasta un nivel aceptable.
20. El método de la reivindicación 19, en el que
la suspensión de ooquistes blanqueada y lavada tiene una
concentración de aproximadamente 1 x 10^{6} a aproximadamente 2,5
x 10^{6} ooquistes/ml, un tamaño de sólidos máximo de menos de
aproximadamente 200 micras, y un contenido de sal de menos de
aproximadamente el 0,9 por ciento.
21. El método de la reivindicación 19 o la
reivindicación 20, que comprende además:
- concentrar los ooquistes blanqueados y lavados en un concentrado estéril;
- combinar los concentrados estérilesde una o varias especies de ooquistes en un concentrado combinado; y
- envasar el concentrado combinado en condiciones estériles.
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