ES2288842T3 - Identificacion de antigenos especificos de micobacterias expresados diferencialmente y el uso medico de las proteinas micobacterianas rv0068 y rv3407. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que comprende al menos una proteína que se expresa diferencialmente en una cepa virulenta comparada con una cepa no virulenta del género Mycobacterium, en la que dicha al menos una proteína es la oxidorreductasa (Rv0068) o la proteína hipotética (Rv3407).

Description

Identificación de antígenos específicos de micobacterias expresados diferencialmente y el uso médico de las proteínas micobacterianas Rv0068 y Rv3407.

La presente invención se refiere a composiciones útiles en la inmunización contra organismos patógenos del género Mycobacterium y para el propósito de diagnóstico. En particular, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína que se expresa diferencialmente en una cepa virulenta comparada con una cepa no virulenta de una micobacteria patógena, en la que dicha al menos una proteína es oxirreductasa (Rv0068) o la proteína hipotética (Rv3407). Además, la invención se refiere a composiciones que comprenden proteínas de fusión, fragmentos antigénicos, moléculas de ácido nucleico que codifican los compuestos proteicos mencionados y/o anticuerpos de los mismos. Además, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden o que usan compuestos de la invención. Además, la presente invención se refiere al uso de los compuestos de la invención para el tratamiento de enfermedades inducidas por micobacterias y/o para la preparación de una vacuna para la vacunación contra enfermedades inducidas por micobacterias.

Desde principios de los años 80, se ha observado una nueva tendencia en los países industrializados. Por una parte, ha aumentado la resistencia a lo antibióticos, lo cual dificulta o incluso hace imposible tratar muchos de los agentes que producen enfermedades. Por otra parte, surgen enfermedades infecciosas nuevas que no se conocían hasta ahora, y reaparecen enfermedades antiguas. Por ejemplo, la malaria y la tuberculosis son epidemias antiguas y que están en aumento en muchas partes diferentes del mundo. En especial la tuberculosis (TB), una enfermedad infecciosa crónica que generalmente es producida por la infección con Mycobacterium tuberculosis, es una enfermedad que preocupa mucho. Cada año se describen de 8 a 10 millones de casos nuevos de TB, y se producen más de 3 millones de muertes al año, por lo que la TB es una enfermedad importante en los países en vías de desarrollo así como un problema creciente en zonas desarrolladas del mundo debido, por ejemplo, a la resistencia a los antibióticos.

La inhibición de la expansión de la TB requerirá la vacunación eficaz y un diagnóstico precoz y preciso de la enfermedad. Actualmente, el procedimiento más eficaz es la vacunación con bacterias vivas para inducir inmunidad protectora. La micobacteria más común para este propósito es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa no virulenta de Mycobacterium bovis.

Sin embargo, la seguridad y eficacia de BCG es una fuente de controversia, y algunos países como Estados Unidos y Holanda no vacunan a la población general.

Además, se ha mostrado que la vacunación con BCG proporciona más protección contra la lepra que contra la tuberculosis (Ponninghaus, Lancet 339 (1992), 639). Además, M. bovis BCG no ha protegido contra la TB en varios ensayos (WHO, Tech. Rep. Ser. (1980), 651, 1-15) por razones que no están del todo claras (Fine, Tubercle 65 (1984), 137-153). Además, se ha mostrado que la cepa de la vacuna de M. bovis BCG sólo confiere protección frente a la forma grave de tuberculosis miliar en niños (Fine, Lancet 346 (1995), 1339-1345). En contraste con esto, su capacidad protectora contra la forma más común, la tuberculosis pulmonar en adultos, es baja y muy variable (Colditz (1994), JAMA 271, 698).

El diagnóstico de la TB normalmente se logra usando una prueba en la piel, que implica la exposición intradérmica a la tuberculina PDD (derivado proteico purificado). Las respuestas de las células T específicas de antígeno dan como resultado un endurecimiento mensurable en el sitio de la inyección 48-72 horas después de la inyección, que indica la exposición a antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad han sido un problema en esta prueba, y los individuos vacunados con BCG no se pueden distinguir de los individuos infectados.

Por lo tanto, tiene un gran interés el desarrollo de vacunas seguras y eficaces y de terapias para la inmunización y el tratamiento de la TB, así como de diagnósticos fiables.

Así pues, el problema técnico de la presente invención era proporcionar composiciones útiles para la inmunización eficaz contra los organismos patógenos, para la terapia eficaz de seres humanos y animales infectados que se pueda usar con confianza con dosis bajas y sustancialmente sin efectos secundarios y/o para la detección/diagnóstico de organismos patógenos en muestras biológicas/médicas.

La solución a este problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína que se expresa diferencialmente en una cepa virulenta comparado con una cepa no virulenta del género Mycobacterium, en el que dicha al menos una proteína es la oxidorreductasa (Rv0068) o la proteína hipotética
(Rv3407).

El término "composición", como se usa de acuerdo con la presente invención, comprende al menos una proteína, un fragmento antigénico de dicha proteína, una proteína de fusión, una molécula de ácido nucleico y/o un anticuerpo de esta invención, y opcionalmente, otras moléculas, solas o combinadas, como por ejemplo, moléculas que pueden optimizar el procesamiento de antígenos, citoquinas, inmunoglobulinas, linfoquinas o regiones de ADN que contienen CpG, u opcionalmente, adyuvantes. La composición puede estar en forma de sólido, líquido o gas, y puede estar, entre otras, en forma de (un) polvo(s), (un) comprimido(s), (una) solución(es) o (un) aerosol(es). En una realización preferida, dicha composición comprende al menos dos, preferiblemente tres, más preferiblemente cuatro, de la forma más preferible cinco proteínas expresadas diferencialmente.

El término "proteína", de acuerdo con la presente invención, significa un péptido(s) o (un) (poli)péptido(s) que abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, en las que los restos aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes. Sin embargo, la invención también abarca peptidomiméticos de dichas proteínas en los que el (los) aminoácido(s) y/o enlace(s) peptídico(s) se ha(n) sustituido por análogos funcionales. De acuerdo con esta invención, una proteína puede comprender diferentes especies de proteínas. Una especie de proteína se define por su composición química y las modificaciones de dicho(s) péptido(s)/(poli)péptido(s) por, entre otras, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, lipidaciones o por intercambios de aminoácidos, y la expresión describe una molécula claramente definida químicamente y corresponde, entre otros, a una mancha en un patrón de 2-DE de alto rendimiento (Jungblut, Electorphoresis 17 (1996), 839-847). Por lo tanto, la expresión especie de proteína se define como la unidad más pequeña de una clasificación de proteínas, definida por su estructura química.

La expresión "expresada diferencialmente" en el contexto de la presente invención indica proteínas/especies de proteínas que se expresan, regulan y/o modifican de forma distinta. Por lo tanto, la expresión "expresada diferencialmente" incluye proteína(s)/especies de proteínas que están ausentes, que se encuentran en distintas cantidades y/o que comprenden diferentes modificaciones postraduccionales en una cepa "virulenta" comparada con una cepa "no virulenta" de un organismo patógeno. La expresión "expresada diferencialmente" tal como se usa de acuerdo con la invención, indica, por lo tanto, no solo proteínas/especies de proteínas que no están en una cepa comparada con otra (variantes +/-), si no que también comprende variantes de movilidad y/o variantes de intensidad. Las variantes de intensidad son especies de proteínas que se encuentran en patrones de 2DE de proteínas comparativos que difieren en la cantidad. Una variante +/- se puede considerar como una variante de intensidad extrema, en la que la especie de proteína se encuentra en un patrón y está ausente en el otro. Si la proteína se encuentra en dos patrones diferentes comparados en diferentes posiciones, esas dos posiciones se pueden considerar como una indicación de dos especies de proteínas diferentes de esa proteína (entre otros, debido a modificaciones secundarias como se ha explicado antes en el presente documento) que se definen como variantes de movilidad. Estas variantes (+/-, intensidad o movilidad) se pueden detectar por análisis de proteoma.

Previamente, la determinación de determinantes patógenos y/o antígenos inmunógenos de organismos patógenos había sido obstaculizada por el hecho de que no se podía analizar el proteoma entero de dichos organismos, tales como micobacterias, por medios convencionales. Sin embargo, el análisis previamente usado de fracciones y/o fragmentos celulares (tales como membranas bacterianas) sólo puede reflejar un número limitado de proteína(s)/especies de proteínas expresadas diferencialmente, si hay alguna, debido a la pérdida de material proteico durante el fraccionamiento y aislamiento de dichos fragmentos. De acuerdo con la presente invención, se ha usado un procedimiento nuevo (como se ilustra en los ejemplos) que permite el análisis de los organismos patógenos enteros, y se ha encontrado, sorprendentemente, que se puede identificar un gran número de proteínas expresadas diferencialmente en una cepa virulenta comparada con una cepa no virulenta de micobacterias.

Las proteínas (especies de proteínas) expresadas diferencialmente se pueden identificar, detectar y/o trasladar a una correlación biológica, entre otros, por análisis de proteoma de los organismos enteros (como micobacterias), o, menos preferido, de fracciones bioquímicamente definidas (como, entre otras, lipoproteínas, glicoproteínas, fosfoproteínas) o de fracciones biológicamente definidas (como, entre otras, membranas, citosol, elementos estructurales de un organismo patógeno); véase, por ejemplo, Wilkins (1997), ``Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics, Springer-Publishers Berlin; Kahn, Science 270 (1995), 369-370; Jungblut, J. Biotech. 41 (1995), 111-120; Blüggel, Biospektrum 5 (1998), 39-44; Lohaus, Biospektrum 5 (1998), 32-39; Jungblut, Electrophoresis 17 (1996), 839-847; Scheler, Electrophoresis 19 (1998), 918-927.

Como saben los expertos en la materia, el análisis de proteomas de menor complejidad, p. ej. ribosomas con 60 especies de proteínas, se puede llevar a cabo, entre otros, por separación y estrategias de identificación de proteínas/especies de proteínas, que comprenden, por ejemplo, electroforesis en gel bidimensional (2-DE; Kaltschmidt, Anal. Biochem. 36 (1970), 401) o HPLC (Kamp, J. Chromatogr. 317 (1984), 181). Sin embargo, el análisis de proteomas de mayor complejidad se puede llevar a cabo, entre otros, por una combinación de isoelectroenfoque y SDS-PAGE (Vesterburg, Acta Chem. Scand. 20 (1966), 820; Laemmli, Nature 227 (1970), 680) y el uso de geles de gran tamaño (Jungblut, Electrophoresis 15 (1994), 685; Klose, Electrophoresis 16 (1995), 1034). La comparación de geles 2-DE específicos e individuales permite la identificación de proteínas expresadas diferencialmente y el experto en la materia conoce la identificación de proteínas separadas por 2-DE (véase, p. ej., Patterson, Electrophoresis 16 (1995), 1791; Jungblut, Electrophoresis 17 (1996), 839; Jungblut, Mass Spectrometry Reviews 16 (1997), 145; Kaufmann, Jahrbuch der MPG (1998), 42-57; Blüggel (1998), citado antes, Schaible, DGHM-Kongress (1998), Einhoon-Resse Verlag (ISSN 1433-3988), 20).

Con el fin de identificar mejor las proteínas expresadas diferencialmente, se pueden usar varias técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas comprenden, pero no se limitan a digestiones en gel, procedimientos de electroelución, microsecuenciación, análisis de aminoácidos, secuenciación de Edman o espectroscopía de masas. Por ejemplo, algunas técnicas empiezan directamente a partir de gel(es), y otras necesitan una transferencia a membranas por transferencia por adsorción. Al primer grupo pertenecen, entre otros, la coelectroforesis, comparación de posiciones por internet, cartografía de péptidos por SDS-PAGE (Cleveland, J. Biol. Chem. 252 (1977), 1102), elución de proteínas y MALDI-MS o secuenciación N-terminal por degradación de Edman (Edman, Acta Chem. Scand. 4 (1950), 283), digestión enzimática en gel, análisis de péptidos directamente en la mezcla por espectrometría de masas, huella peptídica (Pappin, Curr. Biol. 3, (1993), 327), PSD-MALDI-MS (Spengler, Rapid Commun: Mass Spectrom. 6, (1992), 105), ESI-MS (EM de ionización por electropulverización) y/o (después de separación) por micro-HPLC. Los péptidos separados por HPLC se pueden analizar más, entre otros, por degradación de Edman, PSD-MALDI-MS, EM/EM (Wilm, Nature 379, (1996), 466) o secuenciación escalonada (Thiede, FEBS Lett. 357, (1995), 65) con el fin de obtener una secuencia de péptidos. Las proteínas inmovilizadas sobre membranas permiten la identificación por inmunotinción (Towbin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, (1979), 4350), secuenciación N-terminal (directamente o después de desbloqueo) (Hirano, Electrophoresis 14, (1993), 839), determinación de la masa de la proteína (Eckerskorn, Electrophoresis 13, (1992), 664), análisis de aminoácidos (Jungblut, J. Prot. Chem. 11, (1992), 603) y/o digestión enzimática con las mismas técnicas químicas de proteínas descritas para las digestiones en gel. Los resultados de dichos análisis son las huellas de masas. Las masas peptídicas resultantes se buscan mediante programas de búsqueda (p. ej. http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.2/msfit.htm; http://www.expasy.ch/tools/peptident.html) en bases de datos de secuencias (EMBL, PIR, NCBI, MIPS, Swiss-Prot, OWL). Usando dichas huellas de masas se pueden deducir y secuenciar las secuencias de aminoácidos. A partir de estos fragmentos de aminoácidos secuenciados se pueden deducir y sintetizar oligonucleótidos degenerativos que se pueden usar para seleccionar, por ejemplo, bibliotecas genómicas o de ADNc para identificar y clonar el correspondiente gen/ADNc.

Las proteínas identificadas se pueden producir, por ejemplo, por técnicas recombinantes o por técnicas bioquímicas o sintéticas conocidas por el experto en la materia (Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)).

Otros procedimientos para la elucidación de proteínas expresadas diferencialmente incluyen, pero no se limitan a actividad enzimática, mediciones de la actividad del receptor, inmunotinciones, procedimientos inmunohistoquímicos.

Como se muestra en los ejemplos adjuntos, la expresión diferencial de proteínas se puede detectar por preparación de microorganismos, o menos preferido, de sus compartimentos/fragmentos, 2-DE, análisis por sustracción e identificación de proteínas por la huella peptídica (PMF, por sus siglas en inglés peptide mass fingerprinting) con o sin confirmación por otros procedimientos.

Se describió que la identificación de especies de proteínas a partir de patrones de 2-DE por sólo uno de los procedimientos descritos antes, la huella peptídica o el análisis de aminoácidos, conducía a la identificación falsa (Cordwell, Electrophoresis 16 (1995), 438; Mortz, Biol. Mass. Spec. 23 (1993), 249). Sin embargo, la presente invención mostró, sorprendentemente, que las proteínas expresadas diferencialmente se pueden identificar por la huella peptídica sin confirmación por un procedimiento adicional. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, las mejoras en la preparación de la muestra, p. ej., reducción de volúmenes y contactos de superficie, el uso de tampones volátiles y las mejoras en la espectrometría de masas, introducción de la extracción retardada, dan como resultado la mejora de la precisión, resolución y sensibilidad de las masas, lo que conduce a una cobertura alta de la secuencia de al menos 30%. Esta cobertura de la secuencia es suficiente para la identificación y no necesita confirmación adicional. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar proteínas expresadas diferencialmente como se ha discutido antes y se ilustra en los ejemplos 2, 4 y 8.

La expresión "cepa virulenta", de acuerdo con la presente invención, indica la capacidad de una cepa patógena del género Mycobacterium para infectar a un huésped y/o producir enfermedad, definida ampliamente en términos de gravedad de los síntomas en un huésped. Por lo tanto, una "cepa virulenta" puede producir síntomas en un huésped susceptible, mientras que otro huésped puede no ser afectado por esta cepa, que entonces se puede considerar que es una "cepa no virulenta" en este segundo huésped. Tal como se usa de acuerdo con la presente invención, la expresión "cepa no virulenta" indica cepas de una micobacteria que no es capaz de inducir infección y/o producir enfermedad en un huésped específico o en una especie de huésped. La expresión "cepas no virulentas" indica además cepas atenuadas de microorganismos.

Los términos cepas "virulentas" y "no virulentas" no se refieren solo a cepas de laboratorio si no que también comprende cepas naturales. En la técnica se conoce la virulencia de una cepa y la describen, entre otros, Brandis y col., "Lehrbuch der medizinischen Mikrobioiogie", Gustav Fischer Verlag, 7. Auflage (1994), Zinsser Microbiology, ed Joklik, Willett, Amos, Wilten 20^{m} edition, Appleton & Lange, 1992.

En una realización preferida de la composición de la presente invención, dichas cepas se seleccionan del grupo constituido por M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. africanum, M. kanasasii, M. intracellulare, M. ulcerans, M. paratuberculosis, M. simiae, M. scrofulaceam, M. szulgai, M. xenopi, M, fortuitum, M. chelonei, M. leprae y M. marinum.

En una realización más preferida de la composición de la presente invención, dicha proteína se expresa diferencialmente en M. tuberculosis y en M. bovis.

En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a una composición en la que dicha cepa virulenta es M. tuberculosis H37Rv o M. tuberculosis Erdman y dicha cepa no virulenta es M. bovis BCG. Además, la presente invención se refiere a una composición en la que dicha proteína se expresa diferencialmente en M. tuberculosis H37Rv y M. tuberculosis Erdman comparado con M. bovis BCG.

En el presente documento se describen proteínas expresadas diferencialmente y comprenden 2-isopropil malato sintasa (Rv3710), s-adenosilmetionina sintasa (metK, Rv1392), cadena \alpha de la succinil-CoA sintasa (sucD, Rv0952), oxidorreductasa de la familia de aldo/ceto reductasas (Rv2971), oxidorreductasa (Rv0068), factor G de elongación (FusA2, Rv0120c), uridilato cinasa (PyrH, Rv2883c), transportador de tipo ABC (Rv1463), familia de deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (Rv1856c), 1,3,4,6-tetracloro-1,4,-ciclohexadieno hidrolasa (LinB, Rv2579), subunidad catalítica de fosforribosilamino-imidazol carboxilasa (PurE, Rv3275c), proteína hipotética (Rv2557), proteína hipotética (Rv3407), proteína hipotética (Rv3881c), proteína hipotética (Rv2449c), proteína hipotética (Rv0036c), proteína hipotética (Rv2005c) o regulador de la transcripción (familia Crp/Fr) (Rv 3676). Como se muestra en los ejemplos adjuntos, aunque la 2-isopropil malato sintasa (Rv3710) es expresada en M. tuberculosis H37Rv, no es detectada e identificada en M. bovis BCG. Además, la s-adenosilmetionina sintasa (metK, Rv1392), cadena \alpha de la succinil-CoA sintasa (sucD, Rv0952), oxidorreductasa de la familia de aldo/ceto reductasas (Rv2971) u oxidorreductasas (Rv0068), representan especies de proteínas expresadas diferencialmente en M. tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG y representan variantes de movilidad. Como variantes de intensidad se pueden considerar proteínas que corresponden a los números Rv Rv0652, Rv2429, Rv2428, Rv0569, Rv0475, Rv3463, Rv3054c. Como variantes +/- se pueden considerar Rv2883c, Rv0120c, Rv1463, Rv2579, Rv3275c, Rv3407, Rv3881c, Rv2449c, Rv0036c, Rv2005c o Rv3676. Como se muestra en los ejemplos adjuntos, aunque el factor G de elongación (Rv0120c), uridilato cinasa (Rv2883c), transportador de tipo ABC (Rv1463), proteínas de la familia deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (Rv1856c), 1,3,4,6-tetracloro-1,4,-ciclohexadieno hidrolasa (Rv2579), subunidad catalítica de la fosforribosilaminoimidazol carboxilasa (Rv3275c), proteína hipotética (Rv2557), y proteína hipotética (Rv3407) son expresados en M. tuberculosis H37Rv y M. tuberculosis Erdman, no son detectados en M. bovis BCG Chicago y M. bovis BCG Copenhagen. Además, la mancha de proteína A607 en M. tuberculosis H37Rv y la mancha correspondiente de A148 en M. tuberculosis Erdman no tienen sus equivalentes en M. bovis BCG Chicago y M. bovis BCG Copenhagen. Esta proteína se identificó en el presente documento como la proteína hipotética Rv3881c. Además las manchas de C434 de M. tuberculosis H37Rv y la mancha correspondiente de C508 de M. tuberculosis Erdman no tienen sus equivalentes en M. bovis BCG Chicago y M. bovis Copenhagen. Se identificaron como proteínas hipotéticas (Rv2005c). Rv2005c se encuentra en el patrón de 2-DE en otra forma en una posición diferente en las cuatro cepas. Además, las manchas de B69, C176, D12 y D115 de M. tuberculosis H37Rv con sus equivalentes en M. tuberculosis Erdman, B54, C404, D115 y D130, respectivamente, no tienen sus equivalentes en M. bovis BCG Chicago y M. bovis BCG Copenhagen. B69 se identificó como una proteína hipotética (Rv2449c). C176 se identificó como una proteína hipotética (Rv0036c). D12 y D115 de M. tuberculosis H37Rv se identificaron como reguladores de la transcripción (familia Crp/Fnr) (Rv3676). Como se describirá a continuación en el presente documento estas proteínas/especies de proteínas pueden servir, entre otros, en las composiciones farmacéuticas y de diagnóstico. Cole (Nature 393 (1998), 537) publicó la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv e identificó un total de 3924 genes individuales que se clasificaron de acuerdo con la clasificación de Riley (Microbiol. Rev. 57 (1993), 862). Las identificaciones de estos genes putativos se realizaron mediante búsquedas de homología de marcos de lectura abiertos deducidos de otros microorganismos. Por lo tanto, la expresión "números Rv" tal como se usa en el presente documento corresponde a secuencias de ácidos nucleicos claramente definidas (marcos de lectura abiertos deducidos) como describen Cole y col. (citado antes). Sin embargo, para la mayoría de los genes putativos identificados de M. tuberculosis, no está claramente demostrado que sean realmente expresados. También está disponible información adicional de secuencias sobre genes micobacterianos en el Sanger Centre, Reino Unido. Se encuentra disponible información sobre la secuencia genómica de M. tuberculosis en http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/. Por lo tanto, los "números Rv" no se refieren solo a secuencias de ácido nucleico sino también a secuencias de proteínas depositadas en la base de datos de Sanger. Se encuentra más información sobre la secuencia de M. tuberculosis en el Institut Pasteur, Paris en http.//bioweb.pasteur.fr/GenoList/TubercuList/.

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un fragmento antigénico de la proteína como se define en el presente documento, en concreto de la oxidorreductasa Rv0068 o la proteína hipotética Rv3407.

La expresión "fragmento antigénico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de dicho fragmento para provocar una respuesta inmunitaria (p. ej., humoral o celular) en un sujeto, tal como un ser humano y/o en una muestra biológica. Estos fragmentos pueden consistir enteramente en la parte antígena y/o inmunógena de la proteína o pueden contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales se pueden obtener de dicha proteína o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias adicionales pueden ser (pero no necesariamente) antígenas y/o inmunógenas. La antigenicidad de una secuencia de aminoácidos se puede deducir/predecir por procedimientos conocido por la persona experta en la materia, como describe por ejemplo Parker, J. Immunol. 152 (1994), 163 (http://bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bind/), Meister, Vaccine 13 (1995), 581-591 o Bull, Biochem. Biophys. 161 (1974), 665-670. Además, se pueden usar predicciones por ordenador para elucidar la hidrofilicidad y/o antigenicidad de las secuencias y regiones de aminoácidos. Dichos programas de ordenador pueden ser el análisis de Garnier del paquete gráfico v.2.5e, el software de GCG derivado del Center Cambridge HGMP (Rice (1995) Programa manual para el paquete de EGCG, Cambridge (B10 IKQ, Inglaterra) o el programa basado en Kyte/Dolittle, J. Mol. Biol. 157 (1982), 105-132 (véase también http://www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl).

El fragmento antigénico se puede producir de forma recombinante usando una secuencia polinucleótida que codifique el fragmento antigénico o se puede producir por técnicas bioquímicas o sintéticas. Los expertos en la materia conocen estos procedimientos (véase, por ejemplo, Sambrook y col., citado antes; Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2146; Stewart, "Solid Phase Peptide Synthesis", WH Freeman Co, San Francisco (1969); Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1987); Janson, "Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications", VCH Publishers, New York, Weinheim, Cambridge 1989); Wrede, "Concepts in Protein Engineering and Design", Walter de Gruyter, Berlin, New York (1994); Wittmann-Liebold, Jungblut "Analysis and Characterization of Proteins", 47-107).

Además, la invención se refiere a una nueva composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión que comprende Rv0068 o Rv3407 y/o un fragmento antigénico de Rv0068 o Rv3407.

La proteína y/o el fragmento antigénico de la presente invención pueden comprender un dominio adicional, estando dicho dominio unido por enlaces covalentes o no covalentes. La unión se puede basar en fusión genética de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica (Sambrook y col., citado antes; Ausubel, citado antes) o se puede realizar, por ejemplo, por reticulación química como se describe, p. ej., en el documento WO 94/04686. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende la proteína de la invención se puede unir directamente (es decir, sin que intervengan aminoácidos) o se puede unir mediante un conector flexible, ventajosamente un conector polipéptido, en el que dicho conector polipéptido comprende aminoácidos hidrófilos, plurales, unidos por enlaces peptídicos, de una longitud suficiente para extender la distancia entre el extremo C-terminal de dicho dominio adicional y el extremo N-terminal de la proteína o viceversa. La proteína de fusión descrita antes puede comprender además un conector escindible o un sitio de escisión que, por ejemplo, es reconocido específicamente y es escindido por proteinasas o agentes químicos. Las secuencias de conectores escindibles incluyen, pero no se limitan a Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.).

Además, dicho dominio adicional puede tener una especificidad o función predefinidas. En este contexto, se entiende que la proteína de la invención se puede modificar más por procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Esto permite la construcción de proteínas de fusión que comprenden la proteína de la invención y otras secuencias de aminoácidos funcionales, por ejemplo, proteínas importantes desde el punto de vista inmunológico como citoquinas, linfocitos, interferones o etiquetas de proteínas (GST, GFP, péptido h-myc, FLAG, péptido HA) que se pueden obtener a partir de proteínas heterólogas.

En otra realización preferida más, la presente invención se refiere a una composición que comprende al menos una proteína expresada diferencialmente como se ha definido antes en el presente documento, en la que dicha proteína expresada diferencialmente se modifica de forma bioquímica, biofísica y/o recombinante. Dichas modificaciones pueden comprender sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones y/o duplicaciones de aminoácidos, en la que dicha proteína expresada diferencialmente debe comprender además al menos un fragmento antigénico o epítopo que sea reconocido específicamente por un anticuerpo dirigido a, construido contra y/o diseñado para detectar la proteína expresada diferencialmente no modificada como se ha definido antes en el presente documento. La secuencia de aminoácidos no modificada de una proteína expresada diferencialmente la puede deducir la persona experta en la materia como se ha descrito antes en el presente documento, entre otros, usando procedimientos bioquímicos y recombinantes y bases de datos de secuencias. Además, la secuencia de aminoácidos no modificada de una proteína expresada diferencialmente como se ha definido antes en el presente documento se puede deducir a partir de las secuencias de ácidos nucleicos y/o marcos de lectura abiertos propuestos como conoce el experto en la materia. Por ejemplo, la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis H37Rv la han publicado Cole y col. (1998, citado antes).

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica de proteína de fusión que comprende al menos dos proteínas como se define en el presente documento y/o (un) fragmento(s) antigénico(s) como se define en el presente documento.

En una realización adicional la proteína de fusión comprendida en la composición farmacéutica de la presente invención comprende una molécula inmunoestimuladora.

La expresión "molécula inmunomoduladora" de acuerdo con la presente invención indica moléculas o fragmentos de las mismas que, entre otros, activan y/o estimulan la respuesta humoral y celular de un sistema inmunitario. Pueden, por ejemplo, activar las células presentadoras de antígeno, estimular los linfocitos agresores naturales, potenciar la producción de anticuerpos dirigidos contra un antígeno y/o un patógeno o inducir la proliferación de células del sistema inmunitario. Estas moléculas son conocidas en la técnica y comprenden, entre otros, citoquinas, linfoquinas, inmunoglobulinas, interleuquinas y/o factores complementarios (véase, por ejemplo, Paul, "Fundamental Immunology", Raven Press (1989); Schaible, Adv. In Immunology 71 (1999), 261-377).

En una realización adicional preferida la proteína de fusión comprendida en la composición farmacéutica de la presente invención, dicha proteína de fusión comprende una molécula capaz de optimizar el procesamiento de antígeno.

El reconocimiento celular inmunitario es mediado por una clase especial de células linfoides, las células T. Estas células no reconocen antígenos enteros sino que en su lugar responden a fragmentos peptídicos degradados de los mismos que aparecen en la superficie de la célula diana unidos a proteínas llamadas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (procesamiento de antígeno). Esencialmente todas las células nucleadas tienen moléculas MHC de clase I, mientras que las MHC II están restringidas a células inmunitarias con cualidades de presentación especiales. Las moléculas que son capaces de optimizar el procesamiento de antígeno son conocidas en la técnica y comprenden, entre otras, listeriolisina, que mejora las respuestas inmunitarias restringidas a MHC de clase I (véase, p. ej, Hess, PNAS 95 (1998), 5299-5304).

La expresión "proteína de fusión" como se ha usado en lo que antecede, también se refiere a proteínas quiméricas en las que dichas proteínas quiméricas comprenden al menos una proteína expresada diferencialmente y/o (un) fragmento(s) de la misma, preferiblemente antígeno, combinado con al menos otra proteína, péptido o fragmento(s) de la misma. Además, dicha proteína quimérica puede comprender al menos dos proteínas expresadas diferencialmente modificadas como se ha definido antes en el presente documento.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de fusión como se ha definido en lo que antecede.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína Rv3407 o Rv0068 expresada diferencialmente modificada como se define en el presente documento, el fragmento antigénico como se define en el presente documento y/o una proteína de fusión como se define en el presente documento.

La molécula de ácido nucleico comprendida en la composición farmacéutica de la invención o usada en los procedimientos o composiciones de la invención puede ser ADN tal como ADNc o ARN tal como ARNm. Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede ser PNA. Su origen puede ser natural, sintético o semisintético, o puede ser un derivado, tal como dicho ácido nucleico peptídico (Nielsen, Science 254 (1991), 1497-1500). Además, dicha molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ácido nucleico quimérica producida de forma recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas sola o combinada. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico es parte de un vector.

Dichos vectores pueden ser, p. ej., un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector, usado, p. ej., de forma convencional en ingeniería genética, y puede comprender otros genes tales como genes marcadores que permitan la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y en condiciones adecuadas.

Además, los vectores pueden comprender, además de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, elementos del control de la expresión, que permitan la expresión adecuada de las regiones de codificación en huéspedes adecuados. Dichos elementos de control son conocidos para el experto y pueden incluir un promotor, codón de iniciación de la traducción, sitio de traducción e inserción para introducir un inserto en el vector. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de la invención está operativamente unida a dichas secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células eucariotas o procariotas.

Los elementos de control que aseguran la expresión en células eucariotas y procariotas son bien conocidas por los expertos en la materia. Como se ha mencionado antes, normalmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y opcionalmente señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción así como de la traducción y/o regiones promotoras heterólogas o asociadas de forma natural. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión, por ejemplo, en células huésped de mamíferos, comprenden el promotor timidina cinasa de CMV-HSV, SV40, promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), promotor 1\alpha del factor de elongación humano, potenciador de CMV o potenciador de SV40. Para la expresión en células procariotas, se han descrito una multitud de promotores incluyendo, por ejemplo, el promotor tac-lac o el promotor trp. A parte de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, secuencia abajo del polinucleótido. En este contexto, en la técnica se conocen vectores de expresión adecuados tales como vector de expresión de ADNc Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), o vectores de expresión procariotas, tales como labda gt11. A parte de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, el vector puede comprender además secuencias de ácidos nucleicos que codifican las señales de secreción. Dichas secuencias las conoce bien el experto en la materia. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, se pueden añadir secuencias líder capaces de dirigir la proteína/(poli)péptidos a un compartimento celular, a la secuencia codificadora de las moléculas de ácido nucleico de la invención y son conocidas en la técnica. La(s) secuencia(s) líder se acopla(n) en la fase adecuada con secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente una secuencia líder puede dirigir la secreción de la proteína traducida o una proteína de la misma, en el especio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación C o N-terminal que imparte las características deseadas, p. ej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped adecuado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para un nivel de expresión alto de las secuencias de nucleótidos, y según convenga, puede seguir la recolección y purificación de proteínas, fragmentos antigénicos o proteínas de fusión de la invención. Por supuesto, el vector también puede comprender regiones reguladoras de organismos patógenos.

Además, dicho vector también puede ser un vector de transferencia de genes o vector director. La terapia génica, que se basa en la introducción de genes terapéuticos (por ejemplo por vacunación) en células por técnicas ex vivo o in vivo, es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia de genes. En la bibliografía se describen vectores adecuados, sistemas de vectores y procedimientos para la terapia génica in vitro o in vivo y son conocidos para los expertos en la materia; véase, p. ej., Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documento WO 94/29469; documento WO 97/00957, Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 o Verma, Nature 389 (1997), 239-242 y referencias citadas en los mismos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención y los vectores descritos antes en el presente documento se pueden diseñar para la introducción directa o para la introducción mediante liposomas o vectores víricos (p. ej., adenovírico, retrovírico) en la célula. Además, se puede usar un sistema de baculovirus como sistema de expresión eucariota para las moléculas de ácido nucleico de la invención. Además de la producción recombinante, los fragmentos de la proteína, la proteína de fusión o los fragmentos antigénicos de la invención se pueden producir por síntesis peptídica directa usando técnicas de fase sólida (véase, Stewart y col. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o automáticas. La síntesis automática se puede lograr usando, por ejemplo, el sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City CA) de acuerdo con las instrucciones que suministra el fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varios fragmentos por separado y combinarlos usando procedimientos químicos para producir la molécula de longitud completa.

En el presente documento también se describen composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico como se define en el presente documento y/o al menos una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas expresadas diferencialmente como se definen en el presente documento. Dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína expresada diferencialmente, puede codificar Rv3710, Rv1392, Rv0952, Rv2971, Rv0120c, Rv2883c, Rv1463, Rv1856c, Rv2579, Rv3275c, Rv2557, Rv3881c, Rv2449c, Rv0036c, Rv2005c o Rv3676. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden al menos una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Rv0068 expresada diferencialmente y/o la proteína Rv3407 expresada diferencialmente. Más preferiblemente dicha molécula de ácido nucleico es la molécula de ácido nucleico descrita con dicho número Rv en http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis o http://bioweb.pasteur.fr/GenoList/TubercuList. Sin embargo, la presente invención también se refiere a composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la molécula de ácido nucleico de Rv3407 o Rv0068. "Condiciones restrictivas" son preferiblemente condiciones como describe Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{nd} edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Dichas secuencias de hibridación preferiblemente muestran una identidad de al menos 50%, más preferiblemente de al menos 70% y de la forma más preferible de al menos 90% en el nivel de ácido nucleico respecto a las secuencias descritas antes. Las moléculas que hibridan con las moléculas de ácido nucleico descritas con los números Rv citadas antes o con las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas Rv3407 o Rv0068 que se van a usar en las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la invención, también comprenden fragmentos, derivados y variantes de alelo de las moléculas de ácido nucleico Rv3407 o Rv0068 descritas antes que codifican una proteína expresada diferencialmente (o un fragmento de la misma) como se describe en la presente invención. Con respecto a esto, los fragmentos se definen como partes de las moléculas de ácido nucleico que son suficientemente largas con el fin de codificar al menos un epítopo/fragmento antigénico que es reconocido específicamente por un anticuerpo dirigido, construido y/o diseñado para detectar una proteína expresada diferencialmente. El término derivados significa que las secuencias de estas moléculas de hibridación difieren de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico mencionadas antes en una o más posiciones y que presentan un grado alto de homología con estas secuencias. Por la presente, homología significa una identidad de secuencia de al menos 50%, en particular una identidad de al menos 60%, preferiblemente de más de 70% y todavía más preferiblemente una identidad de secuencia de más de 90%. Las desviaciones que se producen cuando se comparan con las moléculas de ácido nucleico descritas antes pueden ser producidas por deleción, sustitución, inserción o recombinación.

Dicha composición farmacéutica es útil, entre otros, para propósitos médicos y de diagnóstico, en particular para propósitos farmacéuticos y de vacunación.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento o un derivado del mismo dirigido contra la proteína como se define en el presente documento, el fragmento antigénico de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención o la proteína de fusión como se define en el presente documento. Dichos anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos o de cadena sencilla o fragmentos o derivados de dichos anticuerpos.

La metodología general para producir anticuerpos se conoce bien y se ha descrito, por ejemplo, en Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 494 y se ha revisado en J.G.R. Hurrel, ed., "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982), así como lo enseñado por L T. Mimms y col., Virology 176 (1990), 604-619. Como se ha expuesto antes, de acuerdo con la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales. Los fragmentos de anticuerpos o derivados comprenden los fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv o scFv; véase, por ejemplo, Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. Además, de acuerdo con la presente invención, los derivados pueden ser producidos por peptidomiméticos. Dichos procedimientos de producción son bien conocidos en la técnica y los puede aplicar el experto en la materia sin más experimentación.

Por consiguiente, la invención se refiere a una composición que comprende al menos un anticuerpo, un fragmento o un derivado del mismo como se ha definido antes. Dichos anticuerpos, fragmentos o derivados se pueden usar con propósitos de diagnóstico o farmacéuticos, es decir, para el tratamiento de enfermedades inducidas por micobacterias o la vacunación contra estos patógenos.

La invención se refiere a una composición farmacéutica como se ha definido antes que es una composición que además comprende, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender las proteínas de la presente invención, las proteínas de fusión de la presente invención, fragmentos antigénicos de la invención y/o anticuerpos (o sus fragmentos o derivados) de la invención, solos o combinados. La composición farmacéutica de la presente invención se puede usar para la terapia eficaz de seres humanos y animales infectados y/o con propósitos de vacunación.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un vehículo, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se pueden formular por procedimientos convencionales conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto con una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar por diferentes vías, p. ej., por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. El régimen de dosificación lo determinará el médico que atiende y los factores clínicos. Como se sabe bien en medicina, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área superficial corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. La materia farmacéuticamente activa proteínica puede estar presente en cantidades entre 1 ng y 10 mg por dosis; sin embargo se contemplan dosis inferiores o superiores a este intervalo de ejemplo, en especial considerando los factores mencionados. La administración de las composiciones adecuadas se puede realizar por vías diferente, p. ej., por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de unidades de 1 \mug a 10 mg por kg de peso corporal por minuto, respectivamente. El avance se puede seguir mediante evaluación periódica. Las composiciones de la invención se pueden administrar local o sistémicamente. La administración en general será por vía parenteral, p. ej., intravenosa. Las composiciones de la invención también se pueden administrar directamente al sitio objetivo, p. ej., mediante suministro biolístico a un sito objetivo interno o externo o mediante catéter a un sitio en la arteria. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas.

Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen restablecedores de fluidos y nutrientes, restablecedores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer), y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes de quelación y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender otros agentes tales como interleuquinas, interferones y/o regiones de ADN que contienen CpG, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica.

En una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica como se define en el presente documento es una vacuna.

Las vacunas se pueden preparar, entre otros, a partir de una o más proteínas, derivados de las proteínas, moléculas de ácido nucleico, proteínas de fusión, fragmentos antigénicos o anticuerpos, fragmentos de dichos anticuerpos o derivados de los anticuerpos de la invención.

Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar para la vacunación génica o como vacunas de ADN. En la técnica se conocen bien las vías de administración de vacunas de genes/ADN y la vacunación con ADN se ha usado con éxito para provocar respuestas inmunitarias aloinmunes, antitumorales y antiidiotipo (Tighe M. y col., Immunology Today 19 (1998), 89-97). Además, se ha encontrado que la inoculación con moléculas de ácido nucleico/ADN es protectora en diferentes modos de la enfermedad (Fynan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 11478-11482; Boyer, Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Webster, Vaccine 12 (1994), 1495-1498; Montgomery y col., DNA Cell Biol. 12 (1993), 777-783; Barry, Nature 311 (1995), 632-635; Xu and Liew, Immunology 84 (1995), 173-176; Zhoug, Eur. J. Immunol. 26 (1996), 2749-2757; Luke, J. Inf. Dis. 175 (1997), 91-97; Mor, Biochem. Pharmacology 55 (1998), 1151-1153; Donelly, Annu. Rev. Immun. 15 (1997), 617-648; MacGregor, J. Infect. Dis. 178(1998), 92-100).

Las proteínas, moléculas de ácido nucleico, proteínas de fusión, fragmentos antigénicos o anticuerpos, fragmentos o derivados de dichos anticuerpos de la invención usados en una composición farmacéutica como una vacuna, se pueden formular, p. ej., en las formas neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables, tales como las sales de adición de ácido, y otras, se conocen en la técnica. Las vacunas se pueden usar, entre otros, para el tratamiento y/o la prevención de una infección con patógenos y se administran en dosificaciones compatibles con el procedimiento de formulación, y en cantidades tales que serán farmacológicamente eficaces para los tratamientos profiláctico o terapéutico.

Las proteínas, fragmentos de proteínas y/o derivados de proteínas usados como vacunas se conocen bien en la técnica (véase, p. ej., Cryz, "Immunotherapy and Vaccines", VCH Weinheim (1991); Paul (1989), citado antes). Además, se ha mostrado que incluso las enzimas intracelulares de los patógenos bacterianos pueden actuar como entidades antígenas que proporcionan protección inmunológica (Michetti, Gastroenterology 107 (1994), 1002; Radcliff, Infect. Immun. 65 (1997), 4668; Lowrie, Springer Semin. Immunopathol. 19 (1997), 161).

Un protocolo de vacunación puede comprender la inmunización activa o pasiva, por el cual la inmunización activa conlleva la administración de un antígeno o antígenos (como las composiciones de la presente invención o proteínas, moléculas de ácido nucleico, proteínas de fusión, fragmentos antigénicos o anticuerpos, fragmentos de dichos anticuerpos o derivados de los anticuerpos de la presente invención) al huésped /paciente en un intento de provocar una respuesta inmunitaria protectora. La inmunización pasiva conlleva la transferencia de inmunoglobulinas o derivados o fragmentos de los mismos previamente formados (p. ej., los anticuerpos, los derivados o fragmentos de los mismos de la presente invención) a un huésped/paciente. Los principios y la práctica de la vacunación y las vacunas son conocidos para el experto en la materia, véase, por ejemplo, en Paul, "Fundamental Immunology" Raven Press, New York (1989) o Morein, "Concepts in Vaccine Development", ed: S.H.E. Kaufmann, Walter de Gruyter, Berlin, New York (1996), 243-264. Típicamente, las vacunas se preparan como preparaciones inyectables, sea en forma de soluciones líquidas o de suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación se puede emulsionar o la proteína se puede encapsular en liposomas. Los ingredientes inmunógenos activos a menudo se mezclan con excipientes farmacológicamente aceptables que son compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares; también se pueden usar combinaciones de estos excipientes en diferentes cantidades. La vacuna también puede contener pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como reactivos humectantes o emulsionante, agentes de tamponamiento del pH, y/o adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna. Por ejemplo, dichos adyuvantes pueden incluir composiciones de aluminio, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o fosfato-hidróxido de aluminio (como se usa en "Gen H-B-Vax®" o "DPT-Impfstoff Behring"), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado nor-MDP), N-acetilmuramiul-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-S-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominado MTP-PE), MF59 y RIBI (MPL + TDM + CWS) en una emulsión de escualeno/Tween-80® al 2%. Los adyuvantes adicionales pueden comprender ADN u oligonucleótidos tales como, entre otros, restos que contienen CpG (oligonucleótidos de CpG; Krieg, Nature 374 (1995), 546-549; Pisetsky, An. Internal. Med. 126(1997), 169-171).

Las vacunas normalmente se administran por inyección intravenosa o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, pero no se limitan a polialquilenglicoles o triglicéridos. La formulación oral incluye los excipientes usados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones pueden tener la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen de aproximadamente 10% a aproximadamente 95% del principio activo, preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.

Las vacunas se administran en una forma compatible con la formulación de dosificación, y en cantidades tales que sean profiláctica y/o terapéuticamente eficaces. La cantidad que se va a administrar en general está en el intervalo de aproximadamente 5 microgramos a aproximadamente 250 microgramos de antígeno por dosis, y depende del sujeto al que se va a administrar, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección buscado. Las cantidades exactas del principio activo que hay que administrar también pueden depender del criterio del médico y pueden ser únicas para cada sujeto. La vacuna se puede dar en un esquema de una sola dosis o de múltiples dosis. Un esquema de múltiples dosis es aquel en el que un primer transcurso de la vacunación puede ser de una a diez dosis separadas, seguido de otras dosis dadas a intervalos de tiempo posteriores necesarios para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, de uno a cuatro meses para una segunda dosis, y si el individuo lo necesita, (una) dosis posterior(es) después de varios meses. El régimen de dosificación también vendrá determinado, al menos en parte, por la necesidad del individuo, y dependerá del criterio del médico. Está contemplado que la vacuna que contiene los compuestos inmunógenos de la invención se puede administrar junto con otros agentes inmunorreguladores, por ejemplo, con inmunoglobulinas, con citoquinas o con moléculas que optimizan el procesamiento de antígenos, como listeriolisina.

La composición descrita en el presente documento también se puede usar como una composición de diagnóstico que además comprende, opcionalmente, medios adecuados para la detección.

Para el diagnóstico y la cuantificación de patógenos como micobacterias, fragmentos patógenos, sus derivados, sus (poli)péptidos (proteínas), sus polinucleótidos, etc., en muestras clínicas y/o científicas, se han desarrollado una variedad de procedimientos inmunológicos, así como procedimientos de biología molecular, como ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, ensayos de PCR o inmunoensayos enzimáticos de ADN (DEIA; Mantera y col., Clinical Chemistry 37 (1991), 422-429) y se conocen bien en la técnica. En este contexto, debe indicarse que las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden comprender PNA, análogos de ADN modificados que contienen uniones amida a la cadena principal. Dichos PNA son útiles, entre otros, como sondas para la hibridación de ADN/ARN. Las proteínas de la invención, entre otros, pueden ser útiles para la detección de anticuerpos antipatógenos (como, por ejemplo, antibacterianos o antivíricos) en muestras de ensayo biológicas de individuos infectados. También se contempla que los anticuerpos y las composiciones que comprenden dichos anticuerpos de la invención pueden ser útiles en la discriminación de las infecciones agudas de las no agudas.

La composición de diagnóstico opcionalmente comprende medios de detección adecuados. Las proteínas, fragmentos antigénicos, proteínas de fusión y anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos descritos antes, son adecuados, por ejemplo, para usar en inmunoensayos en los que se pueden usar en fase líquida o unidos a un soporte en fase sólida. Los soportes en fase sólida son conocidos para los expertos en la materia y pueden comprender perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas metálicas coloidales, astillas y superficies de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membranas, láminas, glóbulos rojos animales, o fantasmas de glóbulos rojos, duracitos y paredes de los pocillos de una placa de reacción, tubos de plástico u otros tubos de ensayo. Los procedimientos adecuados para inmovilizar ácidos nucleicos, (poli)péptidos, proteínas, anticuerpos, microorganismos etc. en fases sólidas, incluyen, pero no se limitan a interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Los ejemplos de inmunoensayos que pueden usar dichas proteínas, fragmentos antigénicos, proteínas de fusión, anticuerpos o fragmentos o derivados de dichos anticuerpos de la invención son los inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto. Los ensayos de detección habitualmente usados pueden comprender procedimientos con radioisótopos o sin radioisótopos. Los ejemplos de dichos inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA), el tipo sándwich (ensayo inmunométrico) y el ensayo de transferencia Western. Además, estos procedimientos de detección comprenden, entre otros, IRMA (Ensayo inmunoradiométrico), EIA (Ensayo inmunoenzimático), ELISA (Inmunoensayo con enzimas ligadas), FIA (Inmunoensayo de fluorescencia) y CLIA (Inmunoensayo quimioluminiscente). Otros procedimientos de detección que se usan en la técnica son los que no usan moléculas trazadoras. Un prototipo de estos procedimientos es el ensayo de aglutinación, basado en la propiedad de una molécula dada de unir al menos dos partículas.

Las proteínas, fragmentos antigénicos, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico y/o proteínas de fusión para usar en el contexto de la invención se pueden unir a muchos soportes diferentes. Los ejemplos de soportes conocidos incluyen vidrio, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del soporte puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención.

Los marcadores y procedimientos adecuados para el marcaje son conocidos para los expertos en la materia. Los ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente invención incluyen, entre otros, fluorocromos (como fluoresceína, rodamina, Rojo Texas, etc.), enzimas (como peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina), isótopos radiactivos (como ^{32}P o ^{125}I), biotina, digoxigenina, metales coloidales, compuestos quimio o bioluminiscentes (como dioxetanos, luminol o acridinio).

Hay disponibles una variedad de técnicas para el marcaje de biomoléculas, son conocidas para los expertos en la materia y se considera que están dentro del alcance de la presente invención, y comprenden, entre otras, acoplamiento covalente de enzimas o grupos biotinilo, yodaciones, fosforilaciones, biotinilaciones, sensibilizaciones aleatorias, traslaciones de corte, adición de cola de nucleótidos (usando transferasas terminales). Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Tijssen, "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH and von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985), "Basic methods in molecular biology"; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer y col., (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987), o en las series "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.

Los procedimientos de detección comprenden, pero no se limitan a autorradiografía, microscopía de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas, etc.

Dichas composiciones de diagnóstico se pueden usar para procedimientos para detectar un organismo patógeno en una muestra biológica y/o médica y/o para detectar la expresión de una proteína o una molécula de ácido nucleico de la invención por detección de la presencia del ARNm que codifica una proteína de la invención, que comprende, por ejemplo, obtener el ARNm de las preparaciones de patógenos (como preparaciones bacterianas o víricas) y poner en contacto el ARNm así obtenido con una sonda/cebador que comprende una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar específicamente con una molécula de ácido nucleico de la invención en condiciones adecuadas y detectar la presencia del ARNm hibridado con la sonda/cebador. Otros procedimientos de diagnóstico que conducen a la detección de moléculas de ácido nucleico en una muestra, comprenden, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), transferencia Southern combinada con hibridación de ácido nucleico, hibridación de genoma comparativa (CGH) o análisis de diferencias representativas (RDA). Estos procedimientos para ensayar la presencia de moléculas de ácido nucleico son conocidos en la técnica y se pueden llevar a cabo sin excesiva experimentación.

La invención se refiere además a un procedimiento para producir una vacuna contra una cepa virulenta del género Mycobacterium que comprende las etapas de

(a) expresión recombinante de una proteína expresada diferencialmente seleccionada de Rv0068 o Rv3407, un fragmento antigénico como se ha definido antes o la proteína de fusión de la invención; y

b) combinación de dicha proteína expresada diferencialmente y expresada de forma recombinante, fragmento antigénico o proteína de fusión con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además, la invención se refiere a un procedimiento para producir una vacuna contra una cepa virulenta del género Mycobacterium, por combinación de un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína expresada diferencialmente Rv0068 o Rv3407, un fragmento antigénico o la proteína de fusión de la invención con un vehículo biológicamente aceptable, en el que dicha molécula de ácido nucleico en dicho vector se pone bajo el control de una secuencia de control de la expresión.

Además, la invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína diferencialmente expresada seleccionada de Rv3407 o Rv0068, un fragmento antigénico como se ha definido antes o la proteína de fusión de la invención, por los procedimientos descritos en el presente documento.

La invención se refiere además al uso de al menos una de las proteínas, un fragmento antigénico, una molécula de ácido nucleico, una proteína de fusión o el anticuerpo o fragmentos o derivados de los mismos como se definen en el presente documento, para preparar una composición para el tratamiento de una enfermedad inducida por Mycobacterium.

La invención se refiere además al uso de al menos una de las proteínas, un fragmento de antígeno, una molécula de ácido nucleico, una proteína de fusión o el anticuerpo o fragmentos o derivados de los mismos como se define en el presente documento, para preparar una vacuna para la vacunación contra una enfermedad inducida por Mycobacterium.

En una realización preferida del uso de la presente invención, dicha enfermedad inducida por Mycobacterium se selecciona del grupo constituido por tuberculosis, lepra, úlcera dérmica tropical, ulceración, abscesos, enfermedad pulmonar, enfermedad granulomatosa (piel), infecciones oportunistas con micobacterias no tuberculosas así como de enfermedades provocadas por micobacterias atípicas tales como M. avium que incluyen enfermedad pulmonar, linfadenitis, enfermedades cutáneas y diseminadas, p. ej., en pacientes inmunocomprometidos. El uso no está restringido a las enfermedades inducidas por micobacterias en seres humanos, sino que comprende también el uso de la presente invención en enfermedades animales, como la tuberculosis bovina.

Las figuras muestran:

Fig. 1: gel 2-DE de la proteína celular total de (A) M. bovis BCG, (B) M. tuberculosis H37Rv y (C) líquido sobrenadante del cultivo de H37Rv.

Fig. 2: patrón de 2-DE de las proteínas celulares de M. Bovis BCG Chicago en 6 sectores (2a-2f). Las proteínas identificadas están marcadas con números de entradas correspondientes a los números de entrada en la Tabla 1.

Fig. 3: patrón de 2-DE del líquido sobrenadante del cultivo de M. tuberculosis H37Rv en 6 sectores (3a-3f). Las proteínas identificadas están marcadas con números de entradas correspondientes a los números de entrada en la Tabla 1.

Fig. 4: Sectores del patrón que muestran las diferencias de intensidad o posición entre proteínas celulares de diferentes cepas micobacterianas.

a)

Comparación entre A, C, E, M. bovis BCG Chicago y B, D, F, M. tuberculosis H37Rv. C645 es una variante de movilidad de C527. Ambas manchas se identificaron como cadena \alpha de la succinil-CoA sintasa (Rv 0952). C126 y C125 son variantes de movilidad, ambas identificadas como oxidorreductasas de la familia de aldo/ceto reductasas (Rv2971). C31 tiene mayor intensidad en BCG Chicago comprado con C53 de H37Rv. Esta proteína se identificó como la cadena C de la alquil-peróxido reductasa (Rv2428). C71 está ausente en BCG Chicago y se identificó como MPT64 (Rv1980c).

b)

Comparación entre A y C, M. tuberculosis H37Rv con B y D, Erdman. Las proteínas de la familia de glutamato tienen mayor intensidad en el patrón de Erdman: A511 y A195 y sus correspondientes manchas en H37Rv A386 y B17 son acetilornitina aminotransferasas ArgD (Rv1655) y D20 es N-acetil-glutamilfosfato reductasa (Rv1652). Dos manchas en A y B están desplazadas a una posición más ácida en el patrón de Erdman. A473 y A267 se identificaron como reguladores de la transcripción MoxR (Rv1479). La región mostrada en C y D pone de manifiesto 3 diferencias de intensidad: D59 se identificó como Rv 3213c; D153 como Rv1996; y D10 como halógenoalcano deshalogenasa Rv2296.

Fig. 5: Zonas del patrón que muestran diferencias +/- o variantes de movilidad entre proteínas celulares de diferentes cepas micobacterianas. A, M. bovis BCG Chicago; B, M. bovis BCG Copenhagen; C, M. tuberculosis H37Rv; D, M. tuberculosis Erdman. Las manchas indicadas con flechas sólo se detectaron en los patrones de las cepas virulentas de Mycobacterium tuberculosis H37Rv y Mycobacterium tuberculosis Erdman.

a)

Las proteínas A186 de M. tuberculosis H37Rv y A312 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como 2-isopropilmalato sintasa (LeuA) expresada a partir del gen Rv3710.

b)

Las proteínas A264 de M. tuberculosis H37Rv y A226 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como s-adenosilmetionina sintasa (MetK) expresadas a partir del gen Rv1392.

c)

Las proteínas C527 de M. tuberculosis H37Rv y C336 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como cadena alfa de succinil-CoA sintasa (SucD) expresada a partir del gen Rv0952.

d)

Las proteínas C125 de M. tuberculosis H37Rv y C143 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como oxidorreductasas de la familia de aldo/ceto reductasas a partir del gen Rv2971.

e)

La proteína D92 de M. tuberculosis H37Rv se identificó como oxirreductasa expresada a partir del gen Rv0068.

f)

Las proteínas A187 de M. tuberculosis H37Rv y A509 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como factor G de elongación (FusA2) expresadas a partir del gen Rv0120c.

g)

Las proteínas C236 de M. tuberculosis H37Rv y C271 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como uridilato cinasa (PyrH) expresadas a partir del gen Rv2883c.

h)

Las proteínas C608 de M. tuberculosis H37Rv y C523 de M. tuberculosis se identificaron como transportador de tipo ABC expresadas a partir del gen Rv1463.

i)

Las proteínas C416 de M. tuberculosis H37Rv y C487 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como de la familia de deshidrogenasas/reductasas de cadena corta expresadas a partir del gen Rv1856c.

j)

Las proteínas C278 de M. tuberculosis H37Rv y C315 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como 1,3,4,6-tetracloro-1,4-ciclohexadieno hidrolasa (LinB) expresadas a partir del gen Rv2579.

k)

Las proteínas C407 (parte inferior) de M. tuberculosis H37Rv y C474 (parte inferior) de M. tuberculosis Erdman se identificaron como la subunidad catalítica de fosforribosilaminoimidazol carboxilasa (PurE) expresadas a partir del gen Rv3275c.

l)

Las proteínas C144 de M. tuberculosis H37Rv y C2 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como proteína hipotética expresadas del gen Rv2557.

m)

Las proteínas F52 de M. tuberculosis H37Rv y F44 de M.tuberculosis Erdman se identificaron como proteína hipotética expresadas a partir del gen Rv3407.

n)

Las proteínas A607 de M. tuberculosis H37Rv y A148 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como proteína hipotética expresadas a partir del gen Rv3881c.

o)

Las proteínas B69 de M. tuberculosis H37Rv y B54 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como proteína hipotética expresadas a partir del gen Rv2449c.

p)

Las proteínas C176 de M. tuberculosis H37Rv y C404 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como proteína hipotética expresadas a partir del gen Rv0036c.

q)

Las proteínas C434 de M. tuberculosis H37Rv y C508 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como proteína hipotética expresadas a partir del gen Rv2005c.

r)

Las proteínas D12 de M. tuberculosis H37Rv, D115 de M. tuberculosis H37Rv, D115 de M. tuberculosis Erdman y D130 de M. tuberculosis Erdman se identificaron como regulador de la transcripción (familia Crp/Fnr) expresadas a partir del gen Rv3676.

La invención ahora se ilustrará con referencia a los siguientes ejemplos que son simplemente ilustrativos y no deben considerarse como una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Cepas micobacterianas y sus condiciones de cultivo

Se cultivaron M. tuberculosis H37Rv y Erdman así como M. bovis BCG Chicago y Copenhagen (M. tub. H37Rv y Erdman, BCG Chicago de: Stammsammlung MPI für Infektionsbiologie, Berlín, BCG Copenhagen de: Statensemen Instittutet, Kopenhagen) en medio de Middlebrook (900 ml de Difco 0713-01-7 + enriquecimiento con 100 ml de ADC 0714-64-0) durante 6-8 días 37ºC; hasta una densidad celular de 10^{8} células por ml. Para la preparación de las proteínas del líquido sobrenadante del cultivo (CSN), se cultivaron cepas micobacterianas en medio de Sauton (por 4 litros de medio de Sauton enriquecido con sal sódica del ácido pirúvico y glucosa: 16,00 g de asparagina, 2,00 g de heptahidrato de sulfato magnésico p.A., 8,00 g de monohidrato de ácido cítrico, 2,00 g de hidrógenofosfato de dipotasio, 0,20 g de citrato ferri-amónico, 19,28 g de monohidrato de D(+)-glucosa, 19,28 g de sal sódica de ácido pirúvico, 240 ml de glicerol (86-88%)) con agitación permanente durante 10 a 15 días a 37ºC o sin agitación durante 30 días a 37ºC hasta que se alcanzó una densidad celular de 1-2 x 10^{8} células por ml.

Ejemplo 2 Separación de proteínas y estrategia de identificación para las proteínas expresadas diferencialmente (análisis de proteoma)

El análisis de proteoma de una entidad biológica depende de los procedimientos de separación adecuados para la complejidad del sistema. Mientras que los proteomas de ribosomas que contienen aproximadamente 50 - 100 especies de proteínas se pueden investigar por sistemas de 2-DE pequeños (Kaltschmidt (1970), Anal. Biochem. 36: 401) o cromatografía líquida de alto rendimiento (Kamp (1984), J. Chromatogr. 317: 181), el análisis de proteoma de bacterias y organismos superiores requiere técnicas de alta resolución. La combinación del isoelectroenfoque y SDS-PAGE, ambos procedimientos de alta resolución (Vesterberg (1966), Acta Chem. Scand. 20: 820; Laemmli (1970), Nature 227: 680), y el uso de geles de gran tamaño (al menos 20 cm x 30 cm) da como resultado un poder de resolución de 5.000 - 10.000 especies de proteínas con suficiente calidad para permitir la comparación de geles entre diferentes laboratorios (Jungblut (1994), Electrophoresis 15: 685; Klose (1995), Electrophoresis 16: 1034).

Se analizaron dos cepas virulentas de M. tuberculosis, H37Rv y Erdman; y dos cepas de vacuna de M. bovis BCG Chicago y Copenhagen. Con el fin de preparar una fracción de proteínas celulares (CP), las micobacterias eran como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células se lavaron en PBS y se trataron con ultrasonidos en presencia de inhibidores de proteinasa (TLCK: 100 \mug/ml, E64: 25 \mug/ml, Leupeptina: 50 \mug/ml, Pepstatina A: 50 \mug/ml), y las proteínas se trataron con urea 9 M, DTT 70 mM, anfolitos al 2% pH 2-4 (Serva Biochemicals, Alemania) y Triton X-100 al 2%, para obtener proteínas completamente desnaturalizadas y proteínas reducidas. Las proteínas del líquido sobrenadante del cultivo (CSN) se prepararon a partir de los cultivos micobacterianos cultivados en medio de Sauton como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los CSN se recogieron por filtración y precipitación en ácido tricloroacético al 10%. Las muestras se prepararon de acuerdo con procedimientos convencionales y se aplicaron sobre sistemas de gel de 2-DE (Klose, (1995), citado antes, Jungblut (1999), citado antes).

Para la resolución del proteoma micobacteriano, se aplicó un sistema de gel 2-DE en una versión de 23 cm x 30 cm y se logró un poder de resolución de aproximadamente 5.000 especies de proteínas. Para los análisis de sustracción (como se describe en Aebersold (1990), Electrophoresis 11: 517) y la construcción de bases de datos, se usaron geles de 0,75 mm de grosor en la segunda dimensión y se aplicó tinción con plata sobre estos geles (Jungblut (1990), J. Biochem. Biophys. Meth. 21: 47). Con el fin de identificar las proteínas se produjeron geles de 1,5 mm de grosor y las proteínas se detectaron por tinción con azul brillante Coomassie R250 (Eckerskom (1988), Electrophoresis 9: 830) o G250 (Doherty (1998), Electrophoresis 19: 355), o tinción negativa (Fernandez-Patrón (1995), Anal. Biochem. 224: 203).

Los patrones de 2-DE de todas las cepas investigadas eran muy similares y puesto que se conocen muchas manchas de acotamiento, estos patrones se pueden comparar fácilmente. Sólo se usaron las diferencias obvias fácilmente reconocibles por evaluación visual para detectar las especies de proteínas de las diferentes cepas micobacterianas con respecto a la intensidad o posición. Cada comparación se repitió al menos tres veces con preparaciones de muestras diferentes de las mismas cepas. Sólo se aceptaron como especificas de la cepa las diferencias confirmadas en todas las preparaciones.

La identificación de proteínas separadas por 2-DE ha sido revisada (Patterson (1995), Electrophoresis 16: 1791; P. Jungblut (1996), Electrophoresis 17: 839; Jungb (1997), Mass Spectrometry Reviews 16: 145) en 2-De que combina isoelectroenfoque en la primera dimensión con SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con didecilsulfato sódico) en la segunda dimensión. Las proteínas se separan por dos parámetros independientes, carga y masa molecular. Los intercambios de aminoácidos individuales se pueden detectar. El poder de resolución de la técnica usada (tamaño del gel 23 cm x 30 cm) es aproximadamente 5000 especies de proteínas, que debería ser suficiente para un microorganismo con aproximadamente 3700 genes como Mycobacterium tuberculosis o bovis. La expresión especie de proteína se define como la unidad más pequeña de una clasificación de proteínas, definida por su estructura química. Se usaron la digestión tríptica en gel (Otto (1996), Electrophoresis 17: 1643) y la huella peptídica de MALDI-MS (Henzel (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5011; Pappin (1993), Current Biology 3: 327; Mann (1993), Biol. Mass Spectrom. 22: 338; James (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 58) con la posibilidad de secuenciación por MALDI-MS con descomposición metaestable (Spengler (1992), Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 105) con el fin de identificar las 263 primeras proteínas, con prioridad para las proteínas de alta densidad y para las variantes entre las cepas micobacterianas investigadas. Las huellas peptídicas se buscaron usando el programa MS-FIT (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml/msfit.htm) reduciendo las proteínas de la base de datos de NCBI a las proteínas micobacterianas y a un intervalo de masa molecular estimado de 2-DE +/- 20%, que permite una precisión de la masa de 0,1 Da para la masa del péptido. En ausencia de correspondencias se amplió la ventana de la masa molecular. En estas búsquedas se consideraron las escisiones enzimáticas parciales que dejan dos sitios de escisión, la oxidación de metionina, la formación de ácido piroglutámico en la glutamina N-terminal y la modificación de cisteína por la acrilamida.

La metodología 2-DE usada conduce a una resolución del proteoma micobacteriano de 1.800 especies de proteínas distintas. Se comparó la composición de las proteínas celulares así como del filtrado de los cultivos celulares de dos cepas de M. tuberculosis y de M. bovis BCG. Por este medio, ya se han identificado 263 proteínas, 157 y 53 en la fracción de proteínas celulares (CP) de M. bovis BCG Chicago y M. tuberculosis (H37Rv y Erdman), respectivamente, así como también 53 proteínas del filtrado del cultivo (CSN) de H37Rv. A partir de los patrones de las CP, 8 proteínas eran únicas para BCG y 13 para M. tuberculosis H37Rv. La identificación se llevó a cabo por la huella peptídica (PMF) usando espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), y si era necesario por confirmación con secuenciación por descomposición metaestable (PSD).

Ejemplo 3 Formato de las bases de datos de 2-DE micobacterianas para el acceso electrónico

Los datos obtenidos como se describe en los Ejemplos 2 y 8 se muestran en las figuras 1 a 5 y se ilustran en las Tablas 1 a 4. Hay más información disponible en internet (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE/). La base de datos de 2D-PAGE cumple con todas las normas de acuerdo con las directrices mundiales para 2D-PAGE para construir una base de datos confederada (Appel (1996), Electrophoresis 17: 540). Para navegar por la base de datos es necesario un navegador compatible con Java (p. ej. Netscape 4.0 o Internet Explorer 4.0). El programa consiste en guiones de interfaz de pasarela común (CGI) escritos en PERL. Un conjunto de datos comprende tres ficheros. La unión entre el fichero de imagen, el fichero de mapa y el fichero de datos racionales se construye con sus nombres. El fichero de imagen es un escáner de alta densidad del gel 2-D. El fichero del mapa describe la localización y el tamaño de las manchas como polígonos. El fichero de datos racionales es un documento en formato de Microsoft Access que está conectado con el servidor WWW mediante un controlador de conectividad abierta de bases de datos (ODBC) de MySQL. Esta conexión asegura que después de una transferencia individual de todos los datos, no es necesario más trabajo de mantenimiento y administración. El archivo de datos racionales está situado en un microordenador con dirección IP en cualquier localización elegida. Los documentos en lenguaje de marcado de hipertextos (HTML) presentados por internet son generados de forma dinámica basándose en los datos disponibles para cada sesión individual. Las propiedades de las proteínas se presentan en las ventanas de comentarios de las manchas. Un ejemplo para dicho comentario es: ID de mancha: C191, Pm (2-DE): 27100, Pm (teórico) 28160, pl (2-DE) 4,7, Procedimiento de identificación PMF/PSD, Secuencia cubierta 35%, Nombre de la proteína, subunidad beta de la flavoproteína de transferencia electrónica, abreviado fixA, Rv-No Rv3029c, EMBL: Z99263, NCBI: 2414529, Nº de identificación MLCB637, Nº de gen MLCB637.03. Los números EMBL y NCBI tienen hipervínculos para obtener fácilmente más información.

Ejemplo 4 Análisis de la composición de proteínas micobacterianas por análisis de proteoma detallado

Las preparaciones de células enteras de micobacterias dieron como resultado patrones 2-DE que contenían 1.500-2.000 manchas de proteínas distintas dependiendo de las condiciones de tinción con plata y la cantidad de muestra aplicada a los geles. Los patrones estándar de M. bovis BCG Chicago y M. tuberculosis H37Rv elegidos para la construcción de la base de datos de 2-DE micobacteriano se muestran en las figuras 1a y b. Las calibraciones de la masa molecular y el punto isoeléctrico se obtuvieron mediante proteínas marcadoras de micobacterias internas identificadas durante este procedimiento. Algunas proteínas marcadoras para la calibración son: Mancha A540, tuf, Rv0685, pl 5,3, Pm 43594; Mancha A543, acn, Rv1475c, pl 4,9, Pm 102500; Mancha A10, tig, Rv2462c, pl 4,4, Pm 50616; Mancha B5, probable ácido graso-acil-CoA reductasa, Rv1543, pl 9,1, Pm 36821, Mancha C342, nuoC, pl 5,4, Pm 26932; Mancha E54, rpIL, Rv0652, pl 4,6, Pm 13441; Mancha F58, probable proteína de choque térmico, pl 6,8, Pm 10269. Ambas especies micobacterianas comprenden patrones con una alta densidad de manchas en el intervalo ácido, mientras que en el intervalo básico, la densidad de manchas es claramente menor. Los patrones de las 4 cepas investigadas eran muy similares y se pueden comparar fácilmente. Se dividieron en 6 sectores para promover el manejo de los datos para la inspección visual y la evaluación con el ordenador personal (figura 2).

Se identificaron proteínas seleccionadas de los 6 sectores mediante la huella peptídica (Pappin, Curr. Biology 3 (1993), 327) usando MALDI-MS. Se identificaron proteínas seleccionadas de los 6 sectores por la huella peptídica usando MALDI-MS. Empezando con el procedimiento descrito por Otto (Electrophoresis 17 (1996), 1643) se mejoró la sensibilidad durante el curso de la identificación de 270 especies de proteínas por minimización. La identificación partiendo de 1 mancha por especie de proteína tubo éxito. Las manchas del gel se lavaron en 500 \mul de Tris/HCl 100 mM pH 8,5 en acetonitrilo al 50% durante 20 min a 30ºC. La posterior estabilización del pH y reducción de la concentración de acetonitrilo se obtuvo por el siguiente equilibrado en 500 \mul de Tris 100 mM/HCl pH 8,1 en acetonitrilo al 10%. Después el gel se encogió por evaporación en un concentrador Eppendorf 5301 (Eppendorf, Hamburg, Alemania) a aproximadamente 20% del volumen inicial. Dependiendo del tamaño de la mancha del gel se añadieron de 20 a 100 \mul de un tampón que contenía Tris 100 mM/HCl pH 8,1, CaCl_{2} 1 mM en acetonitrilo al 10% junto con 0,5 \mug de tripsina/100 \mul de tampón. La tripsinización se llevó a cabo toda la noche a 37ºC. La digestión enzimática se paró por solución de TFA al 2%. Se usó un dispositivo de recolección de péptido minimizado, que reducía la cantidad de material de fase inversa (gel de sílice funcionalizada con octadecilo, Aldrich, Steinheim, Alemania) a aproximadamente un quinto (Otto, (1996) citado antes) para lavar y concentrar la muestra. Los péptidos unidos sin sal después se eluyeron de la columna con 50 \mul de acetonitrilo al 60% en TFA al 0,1%. Se obtuvo una mejora más de la sensibilidad usando bicarbonato amónico 50 mM pH 7,8 en acetonitrilo al 10% como tampón de digestión, un tampón volátil que permite omitir el dispositivo de recolección de péptidos y por lo tanto reducir drásticamente los contactos de superficie y por lo tanto la pérdida de péptidos. Se aceptó que una proteína estaba identificada si se detectaban los péptidos que cubrían al menos 30% de la secuencia completa. Sólo se aceptaba una asignación que cubriera menos de 30% de la secuencia, si (i) al menos 3 picos principales del espectro de masas se correspondían con una secuencia de la base de datos, (ii) el número de picos de baja intensidad era claramente menor y la masa de la proteína no escindida se ajustaba dentro del 20%, o (iii) por PSD se confirmaba la proteína propuesta. En particular, el procedimiento se caracteriza por la capacidad de analizar organismos patógenos enteros (como micobacterias) y/o fracciones de los mismos debido a la posibilidad de identificación de proteína(s)/especies de proteínas expresadas diferencialmente por la huella peptídica sin confirmación mediante un procedimiento adicional. La mayoría de las proteínas se correspondían con 1 entrada de la base de datos con un número claramente mayor de péptidos comunes comparado con el segundo candidato. Sólo 3 manchas en BCG contenían 2 proteínas: la mancha C100 de BCG Chicago incluye un homólogo de proteína de una proteína de M. tuberculosis H37Rv hipotética conservada, Rv3075c, y además la proteína de antiterminación de la transcripción NusG, Rv0639. BCG Chicago C241 contiene una adenilato cinasa probable, Rv0733, y una transposasa probable, Rv1041c; y C600 una tiorredoxina reductasa, Rv3913, y 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, Rv0468. En algunos casos se detectaron péptidos de manchas vecinas de menor intensidad además de los péptidos de la proteína principal.

Empezando con el azul brillante Coomassie R-250 o G-250 o en algunos casos geles teñidos de forma negativa, se analizaron 312 manchas de proteínas micobacterianas. A partir de estas manchas, las huellas peptídicas identificaron 263 proteínas. Empezando por la identificación de las CP de la cepa Chicago de M. bovis BCG, se identificaron 157 proteínas. De las cepas H37Rv y Erdman de M. tuberculosis se identificaron 53 y 12 proteínas por PMF (huella peptídica) respectivamente. La información de secuencias adicional confirmó las asignaciones de PMF para 34 proteínas. Debido a que todos los resultados de PSD confirmaron las asignaciones de las PMF, se podía demostrar que cubrir el 30% de la secuencia es suficiente para la identificación de proteínas. El PSD sólo tenía que usarse si se cubría <30% de la secuencia. Como se determinó por PMF, las 23 manchas de H37Rv tienen la misma identidad que sus equivalentes en la misma posición en el patrón de BCG. Las proteínas se identificaron por comparación de la posición de la mancha de estas dos especies de micobacterias. Esto dio como resultado un total de 162 proteínas identificadas en BCG Chicago y un total de 626 proteínas identificadas en las CP de todas las cepas.

Las proteínas identificadas de las especies de micobacterias investigadas se clasificaron de acuerdo con la clasificación de genes de M. tuberculosis H37Rv de Cole (1998; citado antes) y se asignaron los correspondientes números Rv (Tabla 1). Después de identificar aproximadamente 3% de todos los productos génicos predichos, empezando con las proteínas más comunes, se encontraron especies de muchas categorías. Sin embargo, sólo en dos categorías, es decir traducción/modificación de proteína y chaperonas/choque térmico, se identificaron más de 40% de los productos génicos predichos en los patrones de 2-DE obtenidos. Se puso de manifiesto la expresión de 30 hipotéticas conservadas y 6 desconocidas, no descritas previamente hasta la fecha a nivel de proteínas.

En el CSN de M. tuberculosis H37Rv se resolvieron aproximadamente 300 proteínas por 2-DE (Figuras 1c y 3). Hasta el momento, se identificaron 53 manchas de proteínas en el CSN de M. tuberculosis H37Rv (Tabla 1). Similares a los patrones de CP, los patrones de CSN eran muy comparables. Comparado con las CP, las proteínas del CSN se encontraban en más series de manchas (Fig. 1c) respecto al número total de manchas. De las 164 proteínas identificadas en las CP, 20 productos génicos, y de las 53 del CSN 12, aparecían como más de 1 mancha en los patrones de 2-DE, lo que sugería su existencia como diferentes especies de proteínas, probablemente debido a la modificación postraduccional, tal como la fosforilación, glicosilación o acilación. La mayor proporción de series de manchas en el CSN podía ser causada además por la mayor carga por proteína en el gel, por un mayor grado de modificaciones postraduccionales de las proteínas secretadas, o por degradación de las proteínas fuera de la célula bacteriana. Por ejemplo, en el CSN se tiñeron tres series adyacentes que contenían 8 manchas. Cuatro de estas manchas se identificaron por la PMF como el factor de elongación Tu (tuf), Rv0685. El antígeno de 14 kDa (Rv2031c) y la chaperonina de 10 kDa (Rv3418c) aparecían como 6 y 5 manchas, respectivamente. Un ejemplo de las CP, la esteroide deshidrogenasa de BCG Chicago correspondiente a Rv0148, se encuentra en 6 manchas aleatoriamente distribuidas en un sector del patrón de 2-DE.

Ejemplo 5 Comparación de patrones de proteínas de diferentes cepas de M. tuberculosis y M. bovis BCG

Los genomas del complejo de M. tuberculosis, que comprende las 4 cepas investigadas, son altamente conservados (Sreevatsan (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 9869). Los patrones de 2-DE confirman la predicción de que la amplia mayoría de proteínas tienen sus equivalentes en todas las cepas investigadas. Sin embargo, se pudieron detectar claras diferencias en la intensidad, presencia o ausencia de la mancha, y posición de las manchas entre estas cepas. La evaluación se concentró en las variaciones de las manchas fácilmente detectables, que eran constantes en todos los patrones de 2-DE obtenidos. La investigación se dirigió principalmente a la elucidación de proteínas que se encuentran exclusivamente en las cepas virulentas para detectar los factores de virulencia potenciales y los antígenos candidatos de vacuna (Tabla 2). Entre BCG Chicago y H37Rv, se detectaron 31 variantes. En comparación con BCG, H37Rv comprendía 13 manchas adicionales y carecía de 8 manchas; 9 manchas tenían menos intensidad y 1 mancha la tenía mayor. La tabla 3 ilustra las especies de proteínas que disminuyeron o aumentaron (1 mancha) de intensidad e indica las "diferencias de intensidad" entre BCG Chicago y M. tuberculosis H37Rv. De las 31 variantes, 25 se identificaron por la PMF. Seis proteínas identificadas en H37Rv no tenían ningún equivalente en BCG: L-alanina deshidrogenasa (antígeno de 40 kDa, Rv 2780), isopropil malato sintasa (Rv 3710), nicotinato-nucleótido pirofosfatasa (Rv1596), MPT64 (Rv1980c), y 2 hipotéticas conservadas (Rv2449c y Rv0036c). La ausencia de L-alanina deshidrogenasa en BCG confirma una observación previa (Andersen (1992), Infect Immun. 60: 2317) y demuestra que las proteínas expresadas diferencialmente se pueden detectar por procedimientos descritos en los ejemplos descritos en el presente documento. Se mostró que 8 de las variantes +/- eran variantes de movilidad, posiblemente causadas por intercambios de aminoácidos o modificaciones postraduccionales. En la figura 4a se muestran 2 variantes de posición obvias, 1 variante de intensidad y 1 variante +/-. La cadena alfa de la succinil-CoA sintasa (Rv0952) se desplazó de una variante de Pm mayor en BCG a una menor en H37Rv. Una oxidorreductasa de la familia de aldo/ceto reductasas (Rv2971) se desplazó diagonalmente de una forma más básica de menor Pm en BCG a una forma más ácida de mayor Pm en H37Rv. La cadena C de la alquil-hidroperóxido reductasa (Rv2428) disminuyó en H37Rv, y MPT64 (Rv1980c) se encontraba como una mancha adicional en H37Rv.

La comparación entre M. tuberculosis Erdman y M. bovis BCG Chicago puso de manifiesto 4 variantes de movilidad, pertenecientes a una oxidorreductasa de la familia de aldo/ceto reductasas descrita como Rv2971 en H37Rv, cadena \alpha de la succinil-CoA sintasa (Rv0952), S-adenosilmetionina sintasa (Rv1392), y oxirreductasa (Rv0068).

Las variantes de posición también son candidatos interesantes para vacunas si la variación de posición es producida por intercambios de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos relevante para el reconocimiento de células T. Además, si este no es el caso, las enzimas que median una modificación postraduccional son interesantes para el desarrollo de la vacuna o con propósitos de diagnóstico.

La comparación de los patrones de 2-DE de M. tuberculosis H37Rv frente a Erdman puso de manifiesto 18 proteínas variantes, 16 de las cuales se identificaron. En el proteoma de M. tuberculosis Erdman, aparecían 6 especies de proteínas con mayor intensidad; aparecían 2 especies de proteínas nuevas; 6 estaban ausentes; y 2 representaban variantes de movilidad. Se muestran algunos ejemplos en la Figura 4b. Dos manchas de la acetilornitina aminotransferasa ArgD (Rv1655) estaban presentes tanto en H37Rv como en Erdman, pero ambas claramente con mayores intensidades en Erdman. El regulador de la transcripción MoxR (Rv1479) se desplazó a una posición más ácida en el patrón de 2-DE de Erdman. La halógenoalcano deshalogenasa (Rv2296), 2 manchas que contenían L-alanina deshidrogenasa (Rv2780) y la proteasa IV (Rv0724) estaban ausentes del proteoma de Erdman, mientras que la proteína desconocida Rv3213c, que comparte similitudes con una proteína Soj de posible importancia para la segregación de cromosomas, y la proteína hipotética conservada Rv2641, estaban ausentes en el proteoma de H37Rv.

BCG Chicago y Copenhagen expresaron patrones de 2-DE muy similares. Sólo se identificaron 3 variantes obvias. La proteína hipotética conservada Rv0968 estaba ausente en el proteoma de Copenhagen, y 2 manchas de una neuraminidasa probable (Rv3463) tenían mayor intensidad en la cepa Chicago.

Ejemplo 6 Clasificación de las proteínas identificadas

De las 263 proteínas identificadas por 2-DE en las CP totales y CSN tanto de M. tuberculosis H37Rv/Erdman como de M. bovis BCG, aproximadamente un tercio correspondían a proteínas de mantenimiento implicadas en la regulación de genes, biosíntesis, degradación o metabolismo. Entre las proteínas de mantenimiento implicadas en la transcripción/traducción, 4 polipéptidos tienen una función en el control de la transcripción tal como la ARN polimerasa A (Rv3457c) y la proteína de terminación de la transcripción rho (Rv1297). Cuatro proteínas son proteínas ribosómicas tales como 50S L7/L12 (Rv0652), y 7 proteínas están implicadas en la traducción y modificación de proteínas tal como los factores de elongación Tu (Rv0685) y Ts (Rv2889c) y el homólogo del factor de elongación de la transcripción greA de M. leprae (Rv1080). EF-Tu estaba presente en las CP así como en el CSN. Este factor se ha localizado en la pared celular de M. leprae y se asocia con la membrana y el especio periplásmico de otras bacterias tales como E. coli y Neisseria gonorrhoeae pero su función sigue siendo dudosa (Marques (1998), Infect Immun. 66: 2625; Jacobson (1976), Nature 261: 23; Porcella (1987), Microbiol. 142: 2481).

Hay 2 reguladores de la respuesta de dos componentes (Rv1626, Rv3133c) presentes en el proteoma. Una de estas proteínas, Rv1626, muestra fuertes similitudes con los sistemas de dos componentes de Methanobacterium thermoautotroficum, Azetobacter vinelandii y Streptomyces coelicolor, lo que indica el uso del sensor medioambiental y los sistemas de regulación por las micobacterias de forma similar a otras procariotas (Smith (1997), J. Bacteriol. 179: 7135; Gutierrez (1995), Mol. Microbiol. 18: 579; Brian (1996), J. Bacteriol. 178: 3221). En A. vinelandii, esta proteína está implicada en la regulación negativa del sistema de la nitrato-nitrato reductasa. En S. coelicolor, un miembro de los Actinomycetaceae estrechamente relacionado con Mycobactreiaceae, es un elemento regulador negativo en la síntesis de antibióticos. MoxR (Rv1479), que estaba aparentemente modificado en H37Rv cuando se comparaba con Erdman es una molécula reguladora putativa probablemente implicada en la formación de una metanol deshidrogenasa activa como se muestra para Paracoccus denitrificans (Van Spanning (1991), J. Bacteriol. 173: 6948). De la misma forma, el antígeno de 40 kDa (Rv2780), una alanina deshidrogenasa, que es única para M. tuberculosis y M. marinum (Andersen (1992), Infect. Immun. 60: 2317), era regulada positivamente en H37Rv cuando se comparaba con Erdman. Todavía no está claro si este polipéptido es expresado exclusivamente en micobacterias virulentas. Sin embargo, podría contribuir a la virulencia porque se ha implicado como parte de la maquinaria de la síntesis de la pared celular puesto que L-alanina es un constituyente importante de la capa de peptidoglicanos. De acuerdo con esta idea, está proteína también esta presente en la pared de las células micobacterianas e incluso en la cápsula más externa (Ortalo-Magne (1995), Microbiol. 141:1609).

Se identificaron 25 manchas de proteínas como proteínas de choque término putativas que incluyen Hsp60 (groEL2; Rv0440), Hsp70 (dnaK; Rv0350), Hsp10 (groES; Rv3418) y ClpB (38; Rv0384c). Debido a la alta homología de secuencia entre Hsp60 micobacteriana y humana, se ha sugerido que está proteína está implicada en las respuestas autoinmunes desencadenas por la infección. Los experimentos de vacunación con ADN también indican que Hsp60 es un potencial candidato para vacuna (Tascon (1996), Nature Med. 2: 888). Una proteína de 14 kDa (hspX; Rv2031c) relacionada con la proteína de choque término alfa-cristalina, es un inductor fuerte de anticuerpos en pacientes con tuberculosis pulmonar (Verbon (1992), J. Bacteriol. 174: 1352). Es interesante que tanto M. bovis BCG como M. tuberculosis contienen una rotamasa putativa (peptidil-prolil cis-trans isomerasa; Rv0009) homóloga a las ciclofilinas, los receptores específicos para el fármaco inmunosupresor ciclosporina A.

Una serie de proteínas identificadas en el proteoma micobacteriano están implicadas en la biosíntesis/degradación de los ácidos grasos y glicolípidos que son componentes esenciales del complejo de la pared celular ácidorresistente. Son ejemplos la metoxi-ácido micólico sintasa 4 (Rv0642c), y los tres objetivos moleculares para los fármacos habitualmente usados contra la tuberculosis, isoniazid y etambutol: La enoil (ACP) reductasa (Rv1484) y \beta-cetoacil (ACP) sintasa (Rv2246) son fundamentales para la biosíntesis de los ácidos micólicos, y recientemente se han identificado como objetivos para isoniazid (Mdluli (1998), Science 280: 1607; Rozwarski (1998), Science 279: 98; Sacchettini (1996), Res. Microbiol. 147: 36). El objetivo para el etambutol, la arabinosil transferasa (Rv0020c), participa en la síntesis de arabinogalactano y es específico para las bacterias ácidorresistentes, incluidas las micobacterias (Lety (1997), Antimicrob. Agents Chemother. 41: 2629). Los miembros del complejo del antígeno 85 (Rv1886c, Rv3803c, Rv3804c) también son parte de la cascada enzimática de la síntesis de la pared celular, es decir las micolil transferasas, pero aparentemente también tienen el potencial de mediar la unión de micobacterias a la fibronectina (Belisle (1997),
Science 276: 1420; Abou-Zeid (1988), Infect. Immun. 56: 3046). Además, se consideran candidatos para vacunas (Kaufmann and Andersen (1998), en "Chemical Immunology: Immunology of Intracellular Parasitism" (Ed. F.Y.Liew): 21-59).

Entre las proteínas identificadas en el proteoma micobacteriano, algunas se ha sugerido que son antígenos micobacterianos de valor putativo para el desarrollo de vacunas y/o para el diagnóstico: Estas incluyen la alanina deshidrogenasa (Rv2780), Hsp60 (Rv0440), Hsp70 (Rv0350), miembros del complejo de antígenos 85 (Rv1886c, Rv3803c, Rv3804c), cristalina \alpha (Rv2031) y el antígeno de 35 kDa (Rv2744c) (Kaufmann and Andersen (1998) citado antes; O'Connor (1990), Res. Microbiol. 141, 407). La proteína de 34 kDa específica de micobacterias, denominada antígeno 84 (Rv2145c), se ha identificado en M. kansasii, M. bovis BCG, M. leprae y M. tuberculosis y es reconocida por anticuerpos en el 60% de los pacientes con lepra lepromatosa (Hermans (1995), Infect. Immun. 63: 954). MPT64 (Rv1980c) y MPT51 (Rv3803c), un homólogo del antígeno 85, son ambas proteínas del CSN y MPT64 es un inductor conocido de las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado en cobayas (Kaufmann and Andersen (1998) citado antes).

Aunque la pared de la célula ácidorresistente y su maquinaria enzimática contribuyen a la supervivencia micobacteriana en el huésped y a la resistencia a los mecanismos de defensa del huésped, otros factores deben contribuir a la virulencia de M. tuberculosis, aunque todavía se está lejos de elucidarlos. Hasta ahora, sólo se han descrito 5 potenciales genes de la virulencia: catalasa-peroxidasa y superóxido dismutasa que protegen contra los productos intermedios de oxígeno reactivos (ROI); noxR1 que confiere resistencia contra los productos intermedios de nitrógeno reactivos (RNI); mce y sigA que codifican el factor de colonización de macrófagos y el factor sigma, respectivamente (Collins (1996), Trends Microbiol. 4: 426; Ehrt (1997), J. Exp. Med. 186: 1885; Arruda (1993), Science 261: 1454). Además, el genoma de M. tuberculosis contiene un homólogo de smpB, un gen de Salmonella typhimurium implicado en la supervivencia intracelular (Cole (1998) citado antes). Es interesante que ninguna de estas proteínas se identificaron en este análisis. Además, la secuencia de genoma puso de manifiesto genes para lipasas, fosfolipasas C, esterasas y proteasas que potencialmente contribuyen a la virulencia de las micobacterias (Cole (1998) citado antes). Hasta ahora, sólo se han identificado dos alquil hidroperóxido reductasas (ahpC Rv2428, ahpD Rv2429) en el proteoma.

Las micobacterias patógenas sobreviven dentro del fagosoma en los macrófagos huésped e interfieren con la maduración del fagosoma por mecanismos prácticamente desconocidos hasta ahora (Russell (1997), Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 352: 1303). Recientemente se ha mostrado que HspX (cristalina \alpha; Rv2031c) es importante para la supervivencia intracelular de micobacterias en macrófagos (Harth (1994), Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 91: 9342; Clemens (1995), J. Bacteriol. 177: 5644). Se ha sugerido que la ureasa y glutamina sintasa de M. tuberculosis tamponan el pH dentro del fagosoma y por lo tanto bloquean la fusión con lisosomas (Sturgill-Koszycki (1996), EMBO J. 15: 6960; Schaible (1998), J. Immunol. 160: 1290). El fagosoma micobacteriano representa un compartimento endosómico temprano que intercepta la ruta del transporte de hierro (Dussurget (1998), Trends Microbiol. 6: 354; Gobin (1995), Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 92: 5189). Allí, las proteínas con una alta afinidad de unión por el hierro tales como las exocelinas, micobactinas y proteínas de tipo ferritina (bfrA, bfrB)compiten con el sistema de gestión de hierro de la célula huésped (Cole (1998) citado antes; Dussurget (1998) citado antes). En condiciones en las que el hierro está limitado, estas proteínas se han detectado por 2-DE (Dussurget (1998) citado antes).

En resumen, de todas las proteínas analizadas 39 polipéptidos son proteínas hipotéticas conservadas y 6 son proteínas desconocidas que usan la información contenida en la secuencia del genoma de M. tuberculosis. Además, se detectaron 6 proteínas identificadas en M. tuberculosis H37Rv, pero no se pudieron identificar en M. bovis BCG. Estas proteínas comprenden: L-alanina deshidrogenasa (antígeno de 40 kDa, Rv 2780), isopropil malato sintasa (Rv 3710), nicotinato-nucleótido pirofosfatasa (Rv1596), MPT64 (Rv1980c), y 2 hipotéticas conservadas (Rv2449c y Rv0036c).

Ejemplo 7 El análisis de proteoma identifica diferencias conocidas en las cepas virulentas y no virulentas

Como se ha descrito antes en el presente documento (Ejemplo 5) se pudieron identificar 2 proteínas que son expresadas en M. tuberculosis H37Rv, pero no en M. bovis BCG: L-alanina-deshidrogenasa (antígeno de 40 kDa; Rv 2780) y MPT64 (Rv 1980c). La ausencia de alanina deshidrogenasa en BCG se ha descrito previamente (Andersen y col. Infect. Immun. 60, 2317 (1992)) y se confirmó mediante este procedimiento. MPT64 (Rv1980c) es una proteína del CSN y es un inductor conocido de las respuestas de hipersensibilidad de tipo retrasado en cobayas (S. H. K. Kaufmann and P. Andersen, en "Chemical Immunology: Immunology of Intracellular Parasitism" (Ed. F.Y.Liew), 1998: 21-59.). Esta proteína estaba ausente en los patrones de 2-DE de BCG. Este ejemplo ilustra el potencial del procedimiento aquí descrito para el análisis de proteoma en cepas de organismos patógenos.

Además, el ejemplo muestra que las proteínas expresadas diferencialmente se pueden identificar por este procedimiento.

Ejemplo 8 Comparaciones adicionales de patrones de proteínas de diferentes cepas de M. tuberculosis y M. bovis BCG

Los patrones de 2-DE de las 4 cepas investigadas (H37Rv, Erdman, Chicago y Copenhagen) son muy conservativas. La evaluación de los patrones de 2-DE comparando 4 cepas de microorganismos es difícil y requiere tiempo. Por lo tanto, en un segundo procedimiento, el análisis adicional se concentró en las diferencias +/- entre las cepas virulentas comparadas con las cepas no virulentas. Esta investigación confirmó los resultados descritos en los ejemplos descritos antes en el presente documento. Sin embargo, se encontró que proteínas adicionales Rv1511 (RD6), Rv1980c (RD2), Rv0222 (RD4), Rv1512 (RD6), Rv1978 (RD2), Rv2658c (RD13), Rv3875 (RD1) y Rv 2074 (RD12) eran expresadas diferencialmente, confirmando los resultados de una comparación del genoma de M. tuberculosis con M. bovis por micromatrices de ADN (Science 284 (1999), 1520), en la que se describió la pérdida de 16 regiones (RD) en M. bovis BCG comparado con M. tuberculosis. Además, se pudieron definir proteínas que se encontraban sólo en M. tuberculosis H37Rv y M. tuberculosis Erdman, pero que estaban ausentes en Mycobacterium bovis BCG Chicago y Mycobacterium bovis BCG Copenhagen. Estas proteínas no se podían predecir por investigaciones genómicas y comprendían el factor de elongación G (Rv0120c), uridilato cinasa (Rv2883c), transportador de tipo ABC (Rv1463), proteína de la familia de deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (Rv1856c), 1,3,4,6-tetracloro-1,4,-ciclohexadieno hidrolasa (Rv2579), subunidad catalítica de la fosforribosilaminoimidazol carboxilasa (Rv3275c), proteína hipotética (Rv2557) y proteína hipotética (Rv3407). Los sectores en los que se encuentran estas proteínas en las cepas virulentas se muestran en la figura 5. La asignación de estas especies de proteínas a sus números de mancha y la conexión a la base de datos de secuencias de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) por su nº de acceso se muestran en la tabla 4.

Una mancha, A607 de H37Rv se pudo identificar y definir además como proteína hipotética (Rv3881c). Se confirmó la expresión diferencial y se muestra en la figura 5. No se encontró una especie de proteína adicional (C434 en M. tuberculosis H37Rv y C508 en M. tuberculosis Erdman) en M. bovis BCG Chicago y M. bovis Copenhagen. Se identificó como una proteína hipotética Rv2005c. Esta proteína se encuentra como una especie de proteína diferente en una posición diferente en los patrones de 2-DE en las 4 cepas investigadas. Estas asignaciones de manchas deben corregirse después de una evaluación más detallada de los geles. La manchas B69, C176, D12 y D115 de M. tuberculosis H37Rv con sus equivalentes en M. tuberculosis Erdman, B54, C404, D115 y D130, respectivamente, no tienen equivalentes en M. bovis BCG Chicago y M. bovis BCG Copenhagen. B69 se identificó como una proteína hipotética (Rv2449c). C176 se identificó como una proteína hipotética (Rv0036c). D12 y D115 de M. tuberculosis H37Rv se identificaron como reguladores de la transcripción (familia Crp/Fnr) (Rv3676). Las proteínas que se encontró que eran expresadas diferencialmente en la primera investigación, 2-isopropil malato sintasa (Rv3710), S-adenosilmetionina sintasa (Metk, Rv1392), cadena \alpha de la succinil-CoA sintasa (SucD, Rv0952), oxidorreductasa de la familia de aldo/ceto reductasa (Rv2971), y oxidorreductasa (Rv0068), se confirmaron como expresadas diferencialmente entre las cepas virulentas y no virulentas investigadas aquí.

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TABLA 1 Proteínas identificadas en los patrones de 2-DE de especies micobacterianas

Las proteínas de M. tuberculosis H37Rv (H37Rv), Erdman (Erdman) y M. bovis BCG Chicago (Chic) y Copenhagen (Cop) se separaron por 2-DE. Las manchas de proteínas más intensas se identificaron por PMF usando espectrometría de masas MALDI. Las proteínas se agruparon de acuerdo con la clasificación de proteínas descrita por Cole y col. (Nature 393 (1998), 537), que se deduce de la clasificación de genes de E. coli de Riley (Microbiol. Rev. 57 (1993), 862). Los números entre paréntesis después de cada categoría se refieren al número total de genes de esa categoría (3). n.d., la mancha no se investigó; -, no hay mancha; *, identificada por MALDI-MS.

1

2

3

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8

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30

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2 Variabilidad de proteínas entre las proteínas celulares (CP) de diferentes cepas

Se llevaron a cabo 4 comparaciones: a, CP de M. bovis BCG Chicago frente a CP de M. tuberculosis H37Rv; b, CP de M. tuberculosis H37Rv frente a CP de Erdman; c, CP de M. bovis BCG Chicago frente a CP de Copenhagen; y d, CP de M. bovis Chicago frente a CP de M. tuberculosis Erdman. Cada cepa se preparó al menos 3 veces y se compararon al menos 3 geles de muestras preparadas independientemente. Se comprobaron algunas diferencias obvias de reproducibilidad y sólo se aceptaron las variaciones que se producían con reproducibilidad en todos los geles de una cepa. De estas 59 manchas de variantes se identificaron 50 proteínas. [\uparrow] mancha de mayor intensidad; [\downarrow] mancha de menor intensidad; [-] mancha no detectada en el patrón de 2-DE; MV variante de movilidad, posición de la mancha desplazada, el siguiente nº de mancha corresponde a la mancha desplazada.

32

33

34

35

36

37

TABLA 3 Variantes de intensidad identificadas en los patrones de 2-DE de M. bovis BCG Chicago y M. tuberculosis H37Rv

38

39

TABLA 4 Proteínas expresadas diferencialmente entre cepas virulentas de M. tuberculosis y M. bovis BCG (variantes +/-)

41

Claims (17)

1. Composición farmacéutica que comprende al menos una proteína que se expresa diferencialmente en una cepa virulenta comparada con una cepa no virulenta del género Mycobacterium, en la que dicha al menos una proteína es la oxidorreductasa (Rv0068) o la proteína hipotética (Rv3407).

2. Una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína expresada diferencialmente como se define en la reivindicación 1, en la que dicha proteína expresada diferencialmente está bioquímica, biofísica y/o recombinantemente modificada.

3. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento antigénico de la proteína como se define en la reivindicación 1 ó 2.

4. Una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de fusión que comprende una proteína como se define en la reivindicación 1 ó 2, y/o el fragmento antigénico como se ha definido en la reivindicación 3.

5. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión que comprende al menos dos proteínas como se define en la reivindicación 1 ó 2, y/o un(os) fragmento(s) antigénico(s) como se ha definido en la reivindicación 3.

6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión como se define en la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha proteína de fusión comprende una molécula inmunoestimuladora.

7. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión como se define en la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha proteína de fusión comprende una molécula capaz de optimizar el procesamiento de antígeno.

8. Una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína como se define en la reivindicación 1 ó 2, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 3 y/o una proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento o un derivado del mismo dirigido contra la proteína como se define en la reivindicación 1 ó 2, el fragmento antigénico de la reivindicación 3, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 o la proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

10. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 8 y 9, que es una composición farmacéutica que además comprende, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, que es una vacuna.

12. Un procedimiento para producir una vacuna contra una cepa virulenta del género Mycobacterium que comprende las etapas de

(a) expresión recombinante de una proteína expresada diferencialmente como se define en la reivindicación 1 ó 2, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 3 o la proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, y

(b) combinar dicha proteína expresada diferencialmente expresada de forma recombinante, el fragmento antigénico o la proteína de fusión con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Un procedimiento para producir una vacuna contra una cepa virulenta del género Mycobacterium, por combinación de un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína expresada diferencialmente como se define en la reivindicación 1 ó 2, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 3 o la proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, con un vehículo biológicamente aceptable, en el que dicha molécula de ácido nucleico en dicho vector se pone bajo el control de una secuencia de control de la expresión.

14. Uso de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína expresada diferencialmente como se define en la reivindicación 1 ó 2, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 3 o la proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, para el procedimiento de la reivindicación 12 ó 13.

15. Uso de al menos una de las proteínas como se definen en la reivindicación 1 ó 2, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 3, una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 8, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína expresada diferencialmente como se define en la reivindicación 1 ó 2, una proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 o el anticuerpo como se define en la reivindicación 10 o fragmentos o derivados de los mismos, para la preparación de una composición para el tratamiento de una enfermedad inducida por Mycobacterium.

16. Uso de al menos una de las proteínas como se definen en la reivindicación 1 ó 2, un fragmento antigénico como se define en la reivindicación 3, una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 8, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína expresada diferencialmente como se define en la reivindicación 1 ó 2, una proteína de fusión como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 o el anticuerpo como se define en la reivindicación 10 o fragmentos o derivados de los mismos para la preparación de una vacuna para vacunar contra una enfermedad inducida por Mycobacterium.

17. El uso de la reivindicación 15 ó 16, en el que dicha enfermedad inducida por Mycobacterium se selecciona del grupo constituido por tuberculosis, lepra, úlcera dérmica tropical, ulceración, abscesos, enfermedad granulomatosa (piel), enfermedad pulmonar, linfadenitis y enfermedad cutánea y diseminada.