ES2287535T3 - Terapias cardioprotectoras basadas en la eliminacion enzimatica de peroxidos lipidicos mediante la aleno oxido sintetasa. - Google Patents

Abstract

Uso de la proteína aleno óxido sintasa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una lesión isquémica.

Description

Terapias cardioprotectoras basadas en la eliminación enzimática de peróxidos lipídicos mediante la aleno óxido sintetasa.

La presente invención se refiere al uso de las enzimas de la familia de la aleno óxido sintasa en la fabricación de un medicamento para reducir la lesión miocárdica debida a la reperfusión isquémica asociada al infarto de miocardio, trombolisis, angioplastia y cirugía de bypass coronaria. La invención describe la administración de aleno óxido sintasas, capaces de eliminar lípidos hidroperóxidos, como un potente agente cardioprotector. La invención se basa en el descubrimiento de que la administración de aleno óxido sintasa tras una isquemia global severa, estimula la recuperación cardiaca.

Antecedentes de la invención

La isquemia, término clínico para la deprivación de oxígeno, es la principal causa de muerte en el mundo. Las formas más comunes de isquemia, están causadas por interrupciones en el flujo sanguíneo. Las enfermedades cardiacas, ataque cerebral e importantes pérdidas de sangre debido a lesiones traumáticas constituyen ejemplos de isquemia que producen más del 50% del total de muertes.

En situaciones clínicas de isquemia, el objetivo inmediato es restablecer el flujo sanguíneo en el paciente tan pronto como sea posible. Si se restablece el flujo sanguíneo en un periodo de tiempo adecuado, puede evitarse el daño tisular. Por el contrario, una tardanza excesiva en el restablecimiento del flujo sanguíneo, conlleva una segunda condición denominada lesión por isquemia-reperfusión. La lesión por reperfusión comienza cuando se forman especies dañinas de oxígeno reactivo tras un episodio isquémico. Las especies de oxígeno reactivo se originan por complejas reacciones espontáneas de radicales libres que dañan lípidos, proteínas y ADN y que pueden matar a la célula eventualmente. Los lípidos de las membranas celulares son los objetivos primarios inmediatos del ataque por oxígeno en la sangre, que resulta en la formación de peróxidos lipídicos que son extremadamente citotóxicos (Kilgore KS and Lucchesi BR. 1993, Clin Biochem 26:359-70; Kloner RA., 1993, J Am ColI Cardiol 21:537-45; Huynh TT, et al., 1999, J Surg Res 84:223-32; Kesavulu MM, et al., 2001 Diabetes Res Clin Pract 53:33-9).

La lesión por isquemia-reperfusión puede desarrollarse gradualmente tras un evento isquémico y puede causar daño irreversible a los tejidos. Ejemplos clínicos incluyen la disfunción contráctil cardiaca, las arritmias y el daño miocítico irreversible (muerte de células cardiacas) después del infarto de miocardio (ataque al corazón). Aunque actualmente no hay fármacos para el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión, el daño que causan las lesiones de isquemia-reperfusión es evitable y reversible si ciertos tratamientos son administrados a tiempo. Los tratamientos clínicos más relevantes incluyen la administración de antioxidantes. Los antioxidantes endógenos, como son la glutationa peroxidasa (GPX), la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa, actúan como mecanismo primario de defensa. Además, una dieta rica en vitamina E puede jugar un rol secundario en la atenuación de la lesión por isquemia-reperfusión. La administración de suplementos antioxidantes exógenos, antes o después de la reperfusión, ha mostrado cierta utilidad en sistemas experimentales (Abunasra HJ et al., 2001, Eur J Cardiothorac Surg. 20:153-8; Cuzzocrea S, et al.,2001, Pharmacol Rev Mar 53:135-59; Dhalla NS, et al., 2000, Cardiovasc Res 47:446-56; Galang N, et al, 2000, Toxicology 148:111-8; Hangaishi M, et al., 2001, Biochem Biophys Res Commun 285:1220-5; Kanamasa K, et al.,2001, Acta Cardiol 56:181-6; Laurindo FR, et al., 1991, Circulation 83:1705-15; Li Q, 2001, Circulation 103:1893-8; Prasad K, et al., 1996, Can J CardioI 12:1083-91; Rowland RT, et al., 1995, Surgery 118:446-52; Van Remmen H, et al., 2001, Am J Physiol Heart Circ Physiol 281:H1422-32). Sin embargo, el tratamiento con SOD no ha mostrado efectos beneficiosos en ensayos clínicos con humanos (Flaherty JT, 1994, Circulation
89:1982-91).

La aleno óxido sintasa actúa como antioxidante mediante la rápida eliminación de hidroperóxidos lipídicos del sistema (US Patent No.6,132,711; Pan Z, et al.,1998, J Biol Chem 273:18139-18145). La presente invención proporciona un nuevo método para reducir la lesión por isquemia-reperfusión que se basa en la administración de la aleno óxido sintasa.

Explicación resumida de la invención

La presente invención se refiere al uso de enzimas de la familia de la aleno óxido sintasa en la fabricación de un medicamento para reducir la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión asociada al infarto de miocardio, trombolisis, angioplastia y cirugía de bypass coronaria. La invención describe la administración de la enzima aleno óxido sintasa como un potente agente cardioprotector contra la lesión por isquemia reperfusión. La invención se basa en el descubrimiento de que la administración de la aleno óxido sintasa tras isquemia global severa, es capaz de estimular la recuperación cardiaca.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe composiciones que comprenden enzimas de la familia de la aleno óxido sintasa y el uso de dichas composiciones para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Dichas enfermedades cardiovasculares incluyen, por ejemplo, infarto de miocardio, angina de pecho, trombolisis, angioplastia, cirugía de bypass de la arteria coronaria, isquemia vascular o miocárdica, y condiciones relacionadas que son conocidas por expertos en la materia y que conllevan la disfunción de o el daño del corazón o la vasculatura y en particular al daño tisular relacionado con la acumulación de hidroperóxidos lipídicos citotóxicos.

Además, las composiciones descritas por la presente invención pueden ser usadas para tratar otros tipos de isquemias relacionadas con la acumulación de hidroperóxidos lipídicos en tejidos afectados. Tales isquemias incluyen, pero no se limitan a, isquemias mesentéricas, cerebrales, de miembros, oculares y hepáticas.

Se conocen muchas aleno óxido sintasas y se pueden, por lo tanto, sintetizar mediante procedimientos conocidos a partir de reactivos conocidos o se pueden preparar mediante procedimientos utilizados para preparar aleno óxido sintasa descritos en la literatura. Por ejemplo, la aleno óxido sintasa puede ser expresada en forma recombinarte como se describe en la patente US No. 6,132,711. Por otra parte, la aleno óxido sintasa se puede obtener comercialmente. Para la presente invención puede utilizarse cualquier miembro de la familia de la aleno óxido sintasa siempre que la enzima seleccionada sea capaz de reducir los niveles de hidroperóxidos lipídicos citotóxicos.

La presente invención describe composiciones farmacéuticas que comprenden una aleno óxido sintasa en un portador farmacéuticamente aceptable. Dichos portadores incluyen cualquier disolución fisiológica adecuada, o dispersante o similar como las salinas o las salinas tamponadas. Los portadores pueden incluir también, por ejemplo, cualquier diluyente, excipiente, agente de suspensión, agente lubricante, adyuvante, vehículo, sistema de distribución, emulsificante, absorbente, conservante, tensioactivo, colorante, saborizante o edulcorante, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la adsorción, y similares. Excepto en la medida en que tales portadores, excipientes o agentes convencionales sean incompatibles con el ingrediente activo, su uso en la composición está contemplado.

La presente invención describe asimismo métodos para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. La invención es particularmente útil en conexión con procedimientos quirúrgicos tales como el bypass coronario. En estos casos la aleno óxido sintasa se administraría normalmente antes y, si fuera necesario, tras el procedimiento. La aleno óxido sintasa puede ser utilizada también antes o durante una reperfusión isquémica subsiguiente a un episodio isquémico espontáneo. Dichos episodios espontáneos incluyen, entre otros, individuos que presenten oclusión coronaria.

El método descrito en la invención comprende los pasos de administración a un individuo, antes y/o durante una lesión de isquemia-reperfusión, de una cantidad de aleno óxido sintasa capaz de reducir los niveles de hidroperóxidos lipídicos y de permitir el contacto efectivo entre la aleno óxido sintasa y el tejido con el fin de reducir el daño por isquemia reperfusión. Las composiciones de la invención se podrán administrar de diferentes maneras, entre otras vía oral, pulmonar, parenteral (intramuscular, intra-articular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o por inyección subcutánea), por inhalación (vía formulación de polvo fino o vía spray), transdérmica, nasal, vaginal, rectal, o sublingual y se podrán formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.

En realizaciones preferidas descritas en la invención, la aleno óxido sintasa se administra antes de la lesión por isquemia reperfusión, normalmente por infusión de la aleno óxido sintasa en el torrente sanguíneo. Por otra parte, la aleno óxido sintasa se administra durante la lesión por isquemia reperfusión y antes de la finalización del daño tisular que resulta de la lesión por isquemia reperfusión. En ocasiones, cuando la aleno óxido sintasa se administra seguidamente al comienzo de la lesión por isquemia reperfusión, la administración debe hacerse en los primeros cinco días del comienzo, preferiblemente en las primeras veinticuatro horas del comienzo y más preferiblemente en la primera hora del el comienzo de la lesión.

La dosificación de las composiciones descritas en la presente invención que han de administrarse, se determina en referencia a varios parámetros que incluyen la especie del individuo, la edad, el peso y el estado de la enfermedad y las condiciones fisiológicas particulares que requieren alteración fenotípica. La dosis se elige preferiblemente de manera que su administración cause un resultado efectivo medido según ensayos moleculares o alteraciones fenotípicas. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, medidas de la actividad cardiaca, i.e. Presión sistólica y diastólica, contractibilidad y gasto cardiaco.

6. Ejemplo

La aleno óxido sintasa estimula la recuperación de la función mecánica de corazones tras isquemia 6.1 Materiales y métodos Animales

Ratas Wistar macho (300-350 g) se obtuvieron de los laboratorios Charles River. Se alojaron dos animales por caja y tenían libre acceso a comida (pienso estándar de rata) y agua. Los animales utilizados en este estudio se cuidaron de acuerdo a las recomendaciones en "The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", National Institute of Health, Publ. No. 85-23, revised 1986.

Protocolo de Isquemia

Los corazones de ratas previamente gaseadas con CO_{2} y decapitadas, se perfundieron y canularon como corazones en funcionamiento. En breve, los corazones fueron extirpados rápidamente, colocados en solución tampón helada e inmediatamente perfundidos retrógradamente vía aorta con tampón Krebs-Henseleit, que contiene (en mM): 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH_{2}PO_{4}, 1.2 MgSO_{4}, 2.5 CaCl_{2}, 0.5 EDTA, 25 NaHCO_{3}, 11 glucosa, 1.75 Ca^{2+} (pH 7.4, gaseado con 95% 2-5% CO_{2}). Durante esta perfusión, se recortó el exceso de tejido de los corazones y se canularon las aberturas del atrio izquierdo. Los corazones fueron entonces cambiados al modo de trabajo y perfundidos con una presión de relleno del atrio izquierdo de 11.5 mmHg y 80 mmHg de poscarga aórtica en un sistema de tampón recirculante que contenía 11mM de glucosa y 1.2 mM de palmitato preunido a un 3% de albúmina de suero bovino. Se perfundieron los corazones con esta concentración de ácidos grasos porque imita a la observada en el cuadro clínico de isquemia y reperfusión asociada con cirugía cardiaca. Tras 15 minutos de perfusión aeróbica, se sometieron los corazones a 30 minutos de isquemia global mediante pinzamiento de las líneas de relleno cardiaco y poscarga aórtica. Tras la isquemia, se restablecieron el atrio izquierdo y el flujo aórtico y se perfundieron los corazones durante 30 minutos. Cuando se utilizaba la aleno óxido sintasa, se añadía directamente al perfundido en una concentración de 250 \mug 15 min antes del periodo de reperfusión. Al final de la reperfusión, los corazones se quitaron de la cánula y se congelaron en N_{2} líquido. La función cardiaca se registró utilizando sondas de flujo en línea Transonic (modelo T206) y un "Dig Med Heart Performance Analyzer" (modelo HPA-tau). A lo largo de todo el protocolo de perfusión, cámaras bañadas en agua mantuvieron la temperatura del perfundido a 37ºC.

Análisis Estadístico

Para la comparación estadística de las medias de los grupos, se utilizó el test T de Student. Un valor de p< 0.05 se consideró significativo. Todos los datos se expresan como media \pm SEM.

6.2. Resultados

La tabla 1 muestra los efectos de ADS en la recuperación de la reperfusión de los corazones tras isquemia global severa. Bajo condiciones aeróbicas, la función mecánica fue similar entre los corazones de los grupos control y los tratados con aleno óxido sintasa. Sin embargo, tras 30 minutos de isquemia de no flujo severa, la aleno óxido sintasa fue beneficiosa en la recuperación de la función mecánica. De hecho, tan pronto como a los 5 minutos en la reperfusión, la recuperación de la presión sistólica, presión diastólica final, contractibilidad y CO en los tratados con aleno óxido sintasa mejoró significantemente comparados con los corazones no tratados. A lo largo del resto del periodo de reperfusión se observaron los efectos beneficiosos de la aleno óxido sintasa en la presión sistólica, contractilidad y el gasto cardiaco.

Una liberación de radicales libres observada normalmente en la reperfusión de corazones isquémicos expuestos a niveles altos de palmitato, puede resultar en disfunción cardiaca. Es evidente que la adición de aleno óxido sintasa antes del comienzo de la reperfusión es beneficiosa.

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TABLA 1 Efectos de AOS en la recuperación de la reperfusión tras isquemia

1

Claims (7)

1. Uso de la proteína aleno óxido sintasa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una lesión isquémica.

2. Uso de la reivindicación 1, donde la lesión isquémica es un infarto de miocardio.

3. Uso de la reivindicación 1, donde la lesión isquémica es un ataque cerebrovascular.

4. Uso de la proteína aleno óxido sintasa en la fabricación de un medicamento para reducir la lesión por isquemia-reperfusión en un individuo que sufre una o más de las condiciones seleccionadas del grupo que consiste en: oclusión de la arteria coronaria, infarto de miocardio, angina de pecho, trombolisis, isquemia miocárdica, isquemia mesentérica, ataque cerebrovascular, isquemia hepática, isquemia de un miembro, isquemia ocular; y/o en un individuo que esté sometido o que se haya sometido a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en angioplastia y cirugía de bypass de la arteria coronaria.

5. Uso de la reivindicación 4, donde el individuo sufre un infarto de miocardio.

6. Uso de la reivindicación 4, donde el individuo sufre un ataque cerebrovascular.

7. Uso de la reivindicación 4, donde el individuo está sometido o se ha sometido a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en angioplastia y cirugía de bypass de la arteria coronaria.