ES2285774T3 - Procedimiento informatico que utiliza calculos de energia libre para el diseño de ligandos y la prediccion de dianas de union. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento asistido por ordenador para generar dianas de unión predichas de una molécula seleccionada, usando un ordenador programado que incluye un procesador, un dispositivo de entrada y un dispositivo de salida, que incluye las etapas de: (a) introducir en el ordenador programado, mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en la molécula seleccionada; (b) determinar, usando el procesador, para cada átomo en la molécula seleccionada, una energía libre de Gibbs predicha de unión del átomo a un ligando ideal para el átomo (c) generar, usando el procesador, un modelo de predicción tridimensional de dianas de unión en la molécula seleccionada mediante la generación, usando las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en la molécula seleccionada, de un modelo de átomos en la molécula seleccionada y mapear en cada átomo descrito en el modelo la energía libre de Gibbs de unión predicha correspondientemente determinada; y (d) descargar, al dispositivo de salida, el modelo de predicción tridimensional generado de dianas de unión.
Description
Procedimiento informático que utiliza cálculos
de energía libre para el diseño de ligandos y la predicción de
dianas de unión.
Esta invención se hizo en parte con el respaldo
del gobierno bajo los números de subvención del INS RR04328 y
GM51362. El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos
derechos en la invención.
Esta invención se refiere a procedimientos
asistidos por ordenador para identificar sitios de unión diana en
una molécula de interés y procedimientos para diseñar ligandos que
se unen a una molécula de interés.
El diseño de fármacos basados en la estructura
es una actividad muy importante en los laboratorios farmacéuticos.
El reciente desarrollo de los inhibidores de la proteasa del
VIH-1 es un testimonio muy importante a este
efecto. En el diseño de fármacos basados en la estructura, el
objetivo global es diseñar una pequeña molécula que se una a un
sitio específico en una molécula diana, normalmente una proteína u
otra macromolécula. Si la proteína diana es una enzima, el sitio
diana específico es frecuentemente el sitio de unión del sustrato o
sitio activo de la enzima. Si la proteína diana es un receptor, el
sitio diana específico es frecuentemente el sitio de unión para un
ligando natural del receptor. En todos los casos, el objetivo es
alterar el comportamiento de la molécula diana de un modo
determinado como resultado de la unión de la pequeña molécula.
El punto de partida en el procedimiento de
diseño es la disponibilidad de la estructura de alta resolución de
la proteína diana. Como se indica anteriormente, en la mayoría de
las situaciones, el sitio diana para unir el fármaco de molécula
pequeña es el sitio de unión del sustrato o sitio activo de una
enzima o el sitio de unión del ligando de un receptor. En algunos
casos, la localización de estos sitios en la superficie de la
proteína diana se conoce partir de estudios bioquímicos o
estructurales. Por este motivo, la mayoría de los compuestos más
destacados son análogos de ligandos o sustratos naturales. La
situación es más complicada si la localización de estos sitios no es
conocida o si se requiere la elección como diana de un segundo sitio
de unión (una situación necesaria, por ejemplo, en los casos en los
que se desarrolla resistencia hacia un fármaco existente). Además,
la optimización de compuestos más destacados es un esfuerzo muy
exigente que requiere la síntesis y caracterización química de un
número muy grande de derivados. Es evidente que la disponibilidad
de un algoritmo que pueda identificar, mapear y clasificar sitios
de unión y ligandos de diseño tendría un impacto positivo en el
diseño de fármacos. La presente invención proporciona tales
capacidades.
La invención ofrece un procedimiento basado en
ordenador para la identificación de dianas de unión en proteínas y
otras macromoléculas. Más particularmente, la invención incluye un
algoritmo que tiene como objetivo predecir dianas de unión en
proteínas y otras macromoléculas. El algoritmo, denominado en lo
sucesivo "Woolford", requiere el conocimiento de la estructura
tridimensional de la proteína diana o macromolécula diana
seleccionada. Sin embargo, Woolford no requiere el conocimiento de
la localización o la identidad de sitios de unión o ligandos
naturales. Las dianas de unión en la proteína se identifican y se
clasifican según sus afinidades óptimas esperadas. Las dianas de
unión pueden localizarse en la superficie de la proteína o en
superficies internas que se exponen como resultado de
desplegamiento parcial, cambios conformacionales, disociación de
subunidades u otros acontecimientos. La proteína entera se mapea
según el potencial de unión de sus átomos constituyentes. En otro
aspecto de la invención, una vez que se han identificado las dianas
de unión, los ligandos óptimos se diseñan y se forman
progresivamente por la adición de átomos individuales o aminoácidos
en el caso del diseño de péptidos que complementan estructuralmente
y energéticamente el sitio diana seleccionado.
Se espera que el algoritmo de Woolford y los
procedimientos asociados de la invención tengan aplicaciones
significativas en el diseño de fármacos basados en la estructura ya
que permiten: 1) identificación de dianas de unión en proteínas y
otras macromoléculas; 2) identificación de dianas de unión
adicionales si se conoce una diana de unión primaria; 3) diseño de
moléculas ("ligando") con afinidades de unión óptimas para la
diana de unión seleccionada; y 4) refinamiento de los compuestos más
destacados mediante la definición de la localización y naturaleza
de grupos químicos para la óptima afinidad de unión.
La invención ofrece procedimientos para la
identificación de dianas de unión en proteínas y otras
macromoléculas. Las dianas de unión pueden localizarse en la
superficie de la proteína o en superficies internas que se exponen
como resultado de desplegamiento parcial, cambios conformacionales,
disociación de subunidades u otros acontecimientos.
El procedimiento para la identificación de
dianas de unión internas incluye la identificación de las
conformaciones parcialmente plegadas más probables de una proteína
y/o las energías de disociación.
La invención también ofrece procedimientos para
el diseño de ligandos orgánicos sintéticos y ligandos de péptidos
que se unen a dianas de unión identificadas.
La invención también ofrece procedimientos para
optimizar la conformación de ligandos y el cálculo de las
afinidades de unión esperadas de ligandos.
La invención también ofrece procedimientos para
calcular la energía libre de Gibbs de unión de un ligando a una
macromolécula. El procedimiento implica las etapas de: (a)
introducir en el ordenador programado, a través de un dispositivo
de entrada, datos que incluyen las coordenadas tridimensionales y
la identidad de cada uno de los átomos en el ligando, las
coordenadas tridimensionales y la identidad de cada uno de los
átomos en la macromolécula y las coordenadas tridimensionales de
cada uno de los átomos en el complejo del ligando unido a la
macromolécula; (b) determinar, usando el procesador, la diferencia
entre la energía libre de Gibbs del complejo del ligando y la
macromolécula y la energía libre de Gibbs del ligando no complejado
y la macromolécula no complejada; (c) descargar al dispositivo de
salida la diferencia entre la energía libre de Gibbs del complejo
del ligando y la macromolécula y la energía libre de Gibbs del
ligando no complejado y la macromolécula no complejada.
La fig. 1 es un diagrama de flujo del algoritmo
de Woolford básico.
La fig. 2 es un diagrama de flujo del algoritmo
usado para el diseño de ligandos.
La fig. 3 es un diagrama de flujo que detalla el
procedimiento de identificación del sitio de unión usado en el
algoritmo de diseño de ligandos.
La fig. 4 es un diagrama de flujo que detalla la
creación de un ligando del péptido más destacado.
La fig. 5 es un diagrama de flujo que detalla el
procedimiento de modificación del ligando del péptido más destacado
usado en el algoritmo de diseño de ligandos.
La fig. 6 es un diagrama de flujo que detalla la
creación de un ligando del compuesto más destacado.
La fig. 7 es un diagrama de flujo que detalla el
procedimiento de modificación del ligando del compuesto más
destacado usado en el algoritmo de diseño de ligandos.
La fig. 8 es una ilustración de la superficie de
unión de la proteasa del VIH-1 calculada usando el
algoritmo de Woolford.
La fig. 9 es una ilustración del diseño del
sustrato de la proteasa del VIH-1 usando un
inhibidor como el compuesto más destacado.
La fig. 10 es una serie de estructuras químicas
de los trece inhibidores de la proteasa del VIH-1
considerados en este documento. La bibliografía original para cada
inhibidor se facilita en el texto.
La fig. 11 muestra las afinidades de unión
predichas y experimentales para los trece inhibidores de la
proteasa del VIH-1 considerados en este documento.
Los cálculos se realizaron como se describen usando los archivos
PDB correspondientes para cada complejo (A77003: 1hvi, A78791:
1hvj, A76928: 1hvk, A74704: 9hvp, A76889: 1hvl, VX478: 1hpv,
SB203386: 1sbg, SB203238: 1hbv, SB206343: 1hps, U 100313: 2UPJ,
U89360: 1gno, A98881: 1pro, CGP53820: 1hih).
Las fig. 12A y 12B son dos vistas diferentes de
los residuos de aminoácidos en el punto de unión de la molécula de
proteasa del VIH-1 que contribuyen con más de 0,1
kcal/mol a la energía de Gibbs de unión. Los residuos coloreados de
rojo contribuyen entre -0,7 y -0,9 kcal/mol; los residuos
coloreados de naranja entre -0,5 y -0,7 kcal/mol; los residuos
coloreados de amarillo entre -0,3 y -0,5 kcal/mol; y los residuos
coloreados de verde -0,1 y -0,3 kcal/mol. Como guía para el ojo, el
inhibidor A77003 se muestra usando una representación de
varillas.
La fig. 13 muestra las constantes de estabilidad
de residuos calculadas para la molécula de proteasa del
VIH-1. Estas constantes se calcularon según el
algoritmo de COREX (Hilser y col., 1996 (a); Hilser y col., 1997
(a); Hilser y col., 1997 (b)) y mapean la molécula de proteína en
términos de la estabilidad estructural de regiones diferentes. Los
círculos indican la localización de los residuos que contribuyen
con más de 0,1 kcal/mol a la energía de Gibbs de unión del
inhibidor (tabla 2).
La fig. 14 muestra la diferencia en la
contribución del residuo de proteasa del VIH-1 a la
energía de Gibbs de unión de A77003 a la proteasa de tipo natural y
al mutante resistente V84A. \Delta\DeltaG se calcula como
(\DeltaG_{mutante} - \DeltaG_{tipo \ natural}) para todos
los residuos que contribuyen con más de 0,1 kcal/mol a la energía
libre de unión.
Las fig. 15A y 15B muestran dos conformaciones
diferentes de una cadena lateral hipotética.
La fig. 16 es un perfil de energía para una
cadena lateral de fenilalanina expuesta a disolvente en una
conformación de hélice a como una función de los diedros de cadena
lateral \chi_{1} y \chi_{2}.
La fig. 17 es un cálculo del perfil del
potencial de Gibbs como una función de los diedros de cadena
lateral \chi_{1}, y \chi_{2} para la fenilalanina en la
posición 5 en el mutante A5F de pepstatina A.
La fig. 18 es un cálculo de los valores de
\Delta\DeltaG(25) para doce mutantes diferentes de
pepstatina A en la posición cinco. \Delta\DeltaG(25) es
la diferencia en la energía de unión de Gibbs a endotiapepsina
entre el inhibidor mutante y de tipo natural a 25°C
(\Delta\DeltaG(25) = \DeltaG_{mut} (25) -
\DeltaG_{salvaje} (25)).
Las fig. 19A y 19B muestran la localización de
Ala 5 de pepstatina A en el complejo con endotiapepsina y la
situación predicha para el mutante ASF, respectivamente.
La fig. 20 muestra la localización predicha de
Glu 7 de pepstatina A en el complejo con endotiapepsina.
La realización preferida y los ejemplos
mostrados a lo largo de esta descripción deben considerarse como a
modo de ejemplo, en vez de como limitaciones de la presente
invención. En la descripción de esta invención, la discusión se
centra en las proteínas, pero los conceptos son igualmente válidos
para otras moléculas.
Una molécula de proteína tiene el potencial para
definir muchos sitios de unión (dianas de unión). Sin embargo, se
espera que la inmensa mayoría de esas dianas de unión se unan a
ligandos con afinidades extremadamente bajas. Además, debido a que
la mayoría de esas dianas de unión no son topológica o
estructuralmente únicas, se espera que carezcan de especificidad.
Un ejemplo que viene al caso es la asociación de desnaturalizantes
de proteínas, o la asociación entre proteína y moléculas como ANS
que reconocen rasgos que son comunes a casi todas las proteínas.
Sólo unos pocos puntos en la superficie de una proteína dada
presentarán las características intrínsecas necesarias para la
unión de alta afinidad. Estas características incluyen rasgos
químicos, topológicos y estructurales que juntos pueden maximizar
las contribuciones energéticas a la afinidad de unión.
En el diseño de fármacos, el sitio de unión se
define normalmente por la localización del sitio activo natural o
la localización del sitio de reconocimiento para un ligando
natural. Normalmente se encuentra experimentalmente mediante el
estudio de un complejo formado por la proteína con un ligando o
sustrato natural. Muchas aproximaciones al diseño racional de
fármacos implican la sustitución del ligando o sustrato natural por
un ligando inerte, un inhibidor o alguna otra molécula que altere
la actividad natural de la proteína diana. Por ejemplo, los
inhibidores de la proteasa del VIH-1 inhiben la
proteasa viral mediante la competición con los sustratos naturales
por el mismo sitio de unión. La situación es mucho más difícil si la
localización del sitio de unión del sustrato o ligando en la
molécula diana no es conocida o si se desea un segundo sitio en la
molécula diana.
A diferencia de muchas aproximaciones
convencionales al diseño racional de fármacos, los procedimientos
de la invención no requieren un conocimiento previo de la
localización del sitio de unión del sustrato o ligando (sitio
diana) en la molécula diana. Esto es debido a que los procedimientos
de la invención, mediante el uso del algoritmo de Woolford,
permiten la identificación de sitios diana para el diseño de
fármacos en una molécula diana dada mediante la producción de un
mapeo completo de las contribuciones de unión óptimas de cada átomo
de la molécula diana. El algoritmo de Woolford produce un mapa de
las contribuciones de unión óptimas de cada átomo mediante el uso
de un ligando idealizado que explora la superficie entera de la
molécula diana, normalmente una proteína, y define la contribución
de unión máxima de cada átomo en la molécula diana en condiciones
ideales.
La figura 1 es un diagrama de flujo del
algoritmo de Woolford básico. Las coordenadas tridimensionales
medidas de una molécula seleccionada se introducen en un sistema
informático (Etapa 100). Para cada átomo de la molécula, el
procesador del ordenador determina una energía libre de Gibbs de
unión predicha del átomo respecto al ligando ideal para el átomo
(Etapa 102). Entonces, el procesador genera en la molécula
seleccionada un modelo de predicción tridimensional de dianas de
unión usando las coordenadas tridimensionales de cada uno de los
átomos en la molécula seleccionada y la energía libre de Gibbs de
unión predicha correspondiente determinada en la Etapa 102 se mapea
en cada átomo descrito en el modelo de predicción tridimensional
(Etapa 104). Finalmente, el modelo de predicción tridimensional de
dianas de unión se descarga a un dispositivo de salida adecuado
como la predicción calculada de los sitios de unión actuales de la
molécula (Etapa 106).
El potencial de unión de cada átomo se determina
por la energía de Gibbs de unión. La contribución óptima de cada
átomo en la proteína a la energía de unión se calcula usando una
modificación de parametrización estructural conocida descrita más
adelante (Bardi y col., 1997; D'Aquino y col., 1996; Freire y col.,
1991; Freire, 1993; Gomez y col., 1995 (a); Hilser y col., 1996
(b); Lee y col., 1994; Luque y col., 1996; Luque y col., 1997;
Murphy y col., 1992 (a); Murphy y col., 1992 (b); Murphy y col.,
1993; Murphy y col., 1994; Straume y col., 1992; Xie y col., 1994
(a); Xie y col., 1994 (b)).
\newpage
Las superficies de las proteínas (tanto externas
como internas) son topológica y químicamente heterogéneas. Desde un
punto de vista topológico, las superficies de las proteínas son
rugosas y se caracterizan por la presencia de depresiones,
cavidades, grietas, montañas, prominencias, etc. Desde un punto de
vista químico, las superficies de las proteínas son heterogéneas y
se caracterizan por la presencia de grupos químicos que presentan
diferentes características, por ejemplo grupos hidrófobos, grupos
polares, grupos que están eléctricamente cargados positiva o
negativamente, etc. En general, un sitio de unión es un sitio en la
proteína que tiene características topológicas y químicas que
permiten que otra molécula con características topológicas y
químicas complementarias se una a ese sitio con una afinidad
relativamente alta.
El algoritmo de Woolford puede identificar y
mapear sitios diana potenciales en una molécula diana (por ejemplo,
una proteína), incluyendo sitios activos naturales, y clasificar
cada sitio según sus óptimas afinidades de unión. Además, el
algoritmo crea un ligando ideal que provoca el máximo potencial de
unión de cada sitio diana. Este ligando ideal puede usarse como un
diseño para la identificación o síntesis de moléculas orgánicas que
mejor se aproximen a las características del ligando ideal.
El algoritmo de Woolford se ilustrará de un modo
sencillo. Cualquier región en una proteína se considera como que es
un sitio de unión potencial. Lo que es muy importante, no toda
región tiene el mismo potencial de unión. Sólo muy pocos puntos en
una proteína tienen el potencial de afinidad de alta unión. De
hecho, la inmensa mayoría de los sitios de unión potenciales
mostrarán afinidad mínima si está disponible el ligando ideal para
ese sitio. Entonces, el primer objetivo es identificar aquellas
regiones de la proteína que tienen el potencial de unión más alto.
Esto puede ilustrarse imaginándose una superficie hipotética de la
proteína con un sitio de unión definido por cuatro grupos químicos
diferentes. Un ligando se unirá a ese sitio si complementa el sitio
estructural y químicamente de tal manera que la interacción sea
energéticamente favorable. El objetivo global en el diseño molecular
es precisamente el diseño de una molécula que será complementaria a
los grupos en el sitio de unión. Sin embargo, aunque se encuentre
un ligando que presenta alta complementariedad, no se asegura la
alta afinidad de unión. Hay un límite superior para la afinidad de
unión que puede alcanzarse mediante cualquier sitio de unión dado.
Este límite superior depende de la composición química (tipos de
átomos), tamaño y topología del propio sitio de unión, es decir, es
una propiedad intrínseca de la proteína. En general, este límite
superior sólo será alcanzado por un ligando ideal que ofrezca un
perfecto apareamiento al sitio. No todos los sitios tienen el mismo
límite superior. En principio, este límite superior puede estimarse
para un ligando perfecto idealizado. Esta afinidad de límite
superior se denomina en lo sucesivo "potencial de unión". En
esencia, el potencial de unión representa la máxima contribución de
cualquier átomo o grupo de átomos dados dentro de la proteína a la
energía de Gibbs de unión del mejor ligando posible.
En las proteínas hay muchos grupos químicos,
pudiendo servir todos ellos como sitios de unión potenciales,
aunque con potenciales de unión infinitamente diferentes. El
objetivo del algoritmo de Woolford es estimar el potencial de unión
de cada átomo en la proteína y seleccionar las regiones que
contienen una alta densidad de átomos con altos potenciales de
unión. Estas regiones constituyen dianas de unión para el diseño de
fármacos.
El problema tratado por el algoritmo puede
expresarse brevemente del siguiente modo:
Dado un cierto número de grupos con diferentes
geometrías, topologías y características químicas, ¿puede
identificarse y mapearse la región o regiones que definen sitios de
unión de alta afinidad? ¿pueden clasificarse esos sitios de unión
en términos de sus potenciales de unión? Además, ¿se pueden crear
los ligandos ideales que complementan perfectamente cada sitio de
unión? La solución a este problema tiene implicaciones
significativas en el diseño de fármacos: 1) permite la
identificación de dianas de unión en proteínas; 2) permite la
identificación de dianas adicionales si se conoce la diana
primaria; 3) permite refinar los compuestos más destacados mediante
la definición de la localización y naturaleza de grupos químicos
para la afinidad de unión óptima; y 4) permite el diseño de nuevos
ligandos para cada sitio de unión.
La mayor afinidad que puede alcanzar un sitio de
unión se corresponde con la esperada para el ligando ideal. La
afinidad hacia el ligando ideal es por definición el límite
superior o la afinidad óptima que puede expresarse por cualquier
átomo dado y se usa para definir el potencial de unión. El ligando
ideal es por definición perfectamente complementario al sitio de
unión. Además, la conformación del ligando ideal en disolución es
igual a la conformación unida y no pierde entropía conformacional
con la unión. El ligando ideal es un constructo informático, el
apareamiento perfec-
to para un sitio de unión. Por este motivo también se proporciona el modelo para diseñar y construir ligandos reales.
to para un sitio de unión. Por este motivo también se proporciona el modelo para diseñar y construir ligandos reales.
Cada átomo en la proteína es una diana de unión
potencial; sin embargo, cada átomo no tiene el mismo potencial de
unión. Una región de proteína con el potencial para unirse a un
ligando con alta afinidad es una que presenta una alta densidad de
átomos con alto potencial de unión. La tarea de identificar sitios
diana reduce en gran parte el cálculo y el mapeo de la proteína
según el potencial de unión de sus diferentes átomos.
El flujo completo del procedimiento de diseño de
ligandos se ilustra en la figura 2. En primer lugar se identifica
un sitio de unión diana (Etapa 1000). En algunos casos, el sitio de
unión diana será conocido basándose en datos experimentales. En los
casos en los que no se conoce el sitio de unión diana, el algoritmo
de Woolford puede usarse para seleccionar un sitio de unión diana
(Etapa 2000). Además, incluso si ya se conoce un sitio de unión
diana, puede desearse identificar, usando el algoritmo de Woolford,
un sitio de unión diana alternativo (Etapa 2000).
En segundo lugar, el usuario selecciona la
estructura general del ligando deseado (Etapa 3000), por ejemplo, o
un péptido o algún otro compuesto (por ejemplo, una molécula
orgánica no peptídica).
En tercer lugar se identifica un ligando más
destacado (o un péptido (Etapa 4000) o algún otro compuesto (Etapa
5000)) o de datos experimentales o mediante cálculos ab
initio, es decir, cálculo de un "ligando más destacado
idealizado" (Etapa 7000 o Etapa 9000), véase la figura 4 y la
figura 6.
En cuarto lugar, el ligando más destacado se
modifica o en la Etapa 6000 o en la Etapa 8000 y la constante de
unión esperada se calcula (véase la figura 5 y la figura 7) usando
la parametrización estructural descrita anteriormente.
La primera etapa en el procedimiento de diseño
de ligandos se explica resumidamente en la figura 3, que es un
diagrama de flujo del algoritmo de Woolford usado para identificar
potenciales sitios de unión diana. Las coordenadas tridimensionales
medidas de una molécula diana seleccionada se introducen en un
sistema informático (Etapa 2100). Para cada átomo de la molécula
diana, el procesador del ordenador determina una energía libre de
Gibbs de unión predicha del átomo respecto al ligando ideal para ese
átomo. Entonces, el procesador genera un modelo tridimensional de
dianas de unión en la molécula diana seleccionada mediante el uso
de las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en la
molécula diana seleccionada. Entonces, la energía libre de Gibbs de
unión predicha correspondiente se mapea en cada átomo descrito en
el modelo tridimensional de la molécula diana (Etapa 2200). El
procesador identifica las regiones con el potencial de unión más
alto (Etapa 2300 y Etapa 2400) y clasifica cada sitio de unión
potencial según la naturaleza química, área superficial,
localización, etc. (Etapa 2500). Finalmente, el procesador
selecciona un sitio de unión diana potencial según criterios del
usuario, por ejemplo, tipo de ligando, afinidad de unión, tamaño,
geometría y un modelo de predicción tridimensional de la diana de
unión se descarga a un dispositivo de salida adecuado (Etapa
2600).
La figura 4 es un diagrama de flujo del
procedimiento usado para el diseño de novo de un diseño de
péptidos más destacados. Una vez que se ha seleccionado el sitio de
unión diana, el procesador caracteriza el sitio de unión según uno
o más criterios, por ejemplo, su geometría, naturaleza química y
potencial de unión (Etapa 7100). Con esta información, el procesador
selecciona varios dipéptidos "semilla" de una biblioteca que
está constituida por 400 dipéptidos de procedencia natural,
aminoácidos no nativos y aminoácidos químicamente modificados
(Etapa 7200).
Entonces, el procesador revisa los posibles
dipéptidos semilla y determina qué dipéptidos semilla podrían
producir ligandos adecuados dada su geometría y características
químicas (Etapa 7300). La afinidad de unión para cada uno de los
dipéptidos semilla seleccionados se calcula del siguiente modo. En
primer lugar, el procesador coloca el dipéptido semilla en el sitio
de unión diana seleccionado (Etapa 7400). En segundo lugar, el
procesador minimiza la función de energía del dipéptido semilla
unido mediante rotación alrededor del esqueleto del péptido y
ángulos de torsión de las cadenas laterales (Etapa 7425). En tercer
lugar, el procesador calcula la afinidad de unión para el dipéptido
semilla cuando el dipéptido semilla está en la conformación
minimizada en energía determinada en la etapa precedente (Etapa
7450).
Después de completarse este procedimiento, el
procesador selecciona los ligandos de dipéptidos semilla con las
mayores afinidades de unión (Etapa 7500).
El procesador empieza ahora un procedimiento de
"reptación", descrito más adelante, que forma un ligando del
péptido más destacado a partir de un dipéptido semilla seleccionado
mediante la adición de aminoácidos en uno o ambos extremos del
dipéptido semilla seleccionado (Etapa 7600). Después de la adición
de cada aminoácido, el procesador minimiza la función de energía
del péptido más destacado unido mediante cambios conformacionales
en los ángulos de rotación del esqueleto y de torsión de las cadenas
laterales (Etapa 7625). Una vez minimizada, el procesador calcula
la afinidad de unión para el péptido más destacado (Etapa
7650).
En la Etapa 7675, el procesador sigue añadiendo
aminoácidos (Etapa 7600), minimizando la energía conformacional
(Etapa 7625) y calculando la afinidad de unión (Etapa 7650) hasta
que no aumente la afinidad de unión calculada.
El procesador selecciona el siguiente dipéptido
semilla y empieza a formar otro péptido más destacado del mismo
modo que se describe anteriormente (Etapa 7500 a Etapa 7675). Una
vez que el procesador ha usado todos los dipéptidos semilla para
formar péptidos más destacados, se identifica el péptido más
destacado con la mayor afinidad de unión (Etapa 7700). Este péptido
más destacado puede someterse a modificación, como se describe más
adelante (véase la figura 5).
Una vez que se ha identificado un ligando del
péptido más destacado, puede modificarse. Este procedimiento se
explica resumidamente en la figura 5, que es un diagrama de flujo
de un procedimiento de modificación para un ligando identificado
del péptido más destacado.
En primer lugar, el procesador del ordenador
calcula la energía libre de Gibbs de unión del péptido más
destacado para el sitio de unión diana (Etapa 6100). Entonces, el
procesador calcula la contribución de cada residuo de aminoácido a
la energía de unión (Etapa 6200). Los residuos de aminoácidos que
menos contribuyen a la energía de unión se seleccionan para
modificarse mediante mutación, adición o deleción de aminoácidos
(Etapa 6300).
El procesador selecciona e inserta
sistemáticamente aminoácidos usados para la adición y mutación para
crear y alterar el péptido más destacado (Etapa 6400). El
procesador genera las coordenadas atómicas para cada péptido más
destacado alterado (Etapa 6400). Entonces se determina la energía
conformacional más baja de cada péptido más destacado alterado
(Etapa 6500). A continuación se calcula la constante de unión
esperada para unir el péptido más destacado alterado al sitio de
unión diana (Etapa 6600). Entonces se determina un mapa
tridimensional de cada péptido más destacado alterado unido al
sitio de unión diana (Etapa 6700). El procedimiento de modificación
(Etapa 6100 a Etapa 6700) puede repetirse según sea necesario hasta
que la modificación del ligando del péptido más destacado dé como
resultado una mejora de la afinidad de unión calculada.
La figura 6 es un diagrama de flujo de un
algoritmo usado para crear un ligando del compuesto más destacado.
Una vez que se ha identificado el sitio de unión diana basado o en
datos experimentales o en el algoritmo presentado anteriormente
(véase la figura 3), el procesador caracteriza el sitio de unión
según su geometría, naturaleza química y potencial de unión (Etapa
9100). Con esta información, el procesador sitúa, a distancias de
van der Waals óptimas, varios átomos que son energéticamente
complementarios a los átomos en el sitio de unión (Etapa 9200). La
disposición geométrica del conjunto de átomos se usa como una
plantilla para seleccionar varios compuestos más destacados (Etapa
9300). La selección se hace o a partir de una base de datos de
compuestos conocidos o mediante la construcción de una molécula con
una disposición atómica apropiada.
La afinidad de unión para cada compuesto más
destacado se calcula del siguiente modo. En primer lugar, el
procesador sitúa uno de los compuestos más destacados en el sitio
de unión diana seleccionado (Etapa 9400). En segundo lugar, el
procesador minimiza la función de energía del compuesto más
destacado unido mediante la rotación sistemática de enlaces (Etapa
9425). En tercer lugar, el procesador calcula la afinidad de unión
para el compuesto más destacado en su configuración minimizada en
energía (Etapa 9450). Entonces, el procesador selecciona los
compuestos más destacados con las mayores afinidades de unión
(Etapa 9500).
El procesador empieza ahora un procedimiento
-similar al procedimiento de reptación tratado anteriormente- para
optimizar cada uno de los compuestos más destacados seleccionados
mediante la adición o sustitución de grupos químicos (Etapa 9600).
Después de cada adición o sustitución, el procesador minimiza la
función de energía del compuesto más destacado modificado unido
mediante rotación sistemática de enlaces (Etapa 9625). Una vez que
se ha identificado la conformación minimizada en energía del
compuesto más destacado modificado, el procesador calcula la
afinidad de unión del compuesto más destacado modificado minimizado
en energía para el sitio de unión diana (Etapa 9650). En la Etapa
9675, el procesador sigue modificando (Etapa 9600), minimizando la
energía conformacional (Etapa 9625) y calculando la afinidad de
unión (Etapa 9650) hasta que no aumente la afinidad de unión
calculada. El procesador selecciona el siguiente compuesto más
destacado y empieza a modificar el compuesto más destacado del
mismo modo que se describe anteriormente (Etapa 9500 a Etapa 9675).
Una vez que el procesador ha modificado todos los compuestos más
destacados, se selecciona el compuesto más destacado con la mayor
afinidad de unión (Etapa 9700) para someterse a modificación
adicional (véase la figura 7).
La figura 7 es un diagrama de flujo de un
procedimiento de modificación para un ligando del compuesto más
destacado. El procesador del ordenador calcula el cambio de la
energía libre de Gibbs del compuesto más destacado unido al sitio
de unión de la molécula diana (Etapa 8100) e identifica la
contribución de cada átomo a la energía de unión (Etapa 8200). Los
átomos que menos contribuyen a la energía de unión se seleccionan
para modificarse mediante sustitución de grupos químicos, adición
de grupos químicos o deleción de grupos químicos (Etapa 8300). Los
grupos químicos para la sustitución o adición se seleccionan de una
caja de herramientas de grupos orgánicos habituales, por ejemplo
metilo, amino, hidroxilo y similares (Etapa 8400). Para cada
modificación, el procesador genera las coordenadas atómicas del
compuesto más destacado modificado (Etapa 8400), la conformación de
energía más baja del compuesto más destacado modificado (Etapa
8500) y la constante de unión esperada para cada compuesto más
destacado modificado minimizado en energía (Etapa 8600). Se genera
un mapa tridimensional para el compuesto mutado unido al sitio de
unión diana (Etapa 8700). El procedimiento de modificación (Etapa
8100 a Etapa 8700) puede repetirse según sea necesario hasta que la
modificación del ligando del compuesto más destacado dé como
resultado una mejora de la afinidad de unión calculada.
La afinidad de unión se determina mediante la
energía de Gibbs de unión. La afinidad de unión del ligando ideal
se calcula calculando la energía de Gibbs esperada de cada átomo en
la proteína para un ligando ideal. La energía de Gibbs es sensible
al contexto y depende de la posición y naturaleza de los átomos
restantes. El potencial de unión se calcula a partir de las
consideraciones termodinámicas basadas en la estructura. En los
cálculos de energía presentados en este documento se usa una
parametrización estructural de las energías descritas en este
documento. El nivel de refinamiento previamente conocido de esta
parametrización se resume en la siguiente bibliografía: (Bardi y
col., 1997; D'Aquino y col., 1996; Gomez y col., 1995 (a); Gomez y
col., 1995 (b); Hilser y col., 1996 (b); Luque y col., 1996). Esta
parametrización estructural de las energías ha mostrado que predice
correctamente afinidades de unión de la estructura para una variedad
de moléculas, incluyendo el conjunto de inhibidores de la proteasa
del VIH-1 para los que están disponibles
estructuras de alta resolución (ejemplo 1). Sin embargo, el
algoritmo de Woolford no depende de esta función de energía y puede
ponerse en práctica con otras funciones de energía. La puesta en
práctica del algoritmo de Woolford con cualquier otra función de
energía está dentro del alcance de la presente invención.
La energía de Gibbs de unión está compuesta de
componentes entálpicos y entrópicos. Ambos componentes incluyen
contribuciones debidas a la formación de interacciones entre el
ligando y la proteína, y contribuciones debidas a cambios en la
hidratación. Las contribuciones entálpicas son una función de la
distancia de separación entre átomos y los cambios en la
accesibilidad atómica al disolvente. El cambio de entropía contiene
contribuciones del disolvente que también son proporcionales a los
cambios en la accesibilidad del disolvente, y la reducción en
grados de libertad conformacionales. Los cambios en los grados de
libertad translacionales son los mismos para diferentes ligandos y
por tanto no contribuyen a la discriminación entre afinidades de
unión, aunque contribuyen a la afinidad
actual.
actual.
Si se supone que el ligando ideal establece las
características de empaquetamiento atómico promedio encontradas en
el interior de proteínas, entonces la mayor contribución al valor
de entalpía a cualquier temperatura dada
(\DeltaH_{gen}(T)) viene dada por una ecuación de la
forma:
en la que los coeficientes
a_{H}(T) y b_{H}(T) son parámetros de
parametrización estructural y \DeltaASA_{ap} y
\DeltaASA_{pol} son los cambios en las accesibilidades de
disolventes apolares y polares para los átomos tanto en la proteína
como en el ligando con la unión. Similarmente, a cualquier
temperatura T dada, la entropía asociada al disolvente
\DeltaS_{disolv}(T):
también se reduce a términos de los
cambios en las accesibilidades de disolventes apolares y polares
con un conjunto de coeficientes a_{S}(T) y
b_{S}(T) también obtenidos de la parametrización
estructural conocida de las energías. Por otra parte, los cambios
en la entropía conformacional no se relacionan linealmente con
cambios en la accesibilidad, aunque se espera que la flexibilidad
conformacional sea proporcional a la exposición al disolvente. Las
interacciones electrostáticas se calculan según un potencial de
Coulomb estándar que depende de las distancias interatómicas entre
cargas.
De las ecuaciones anteriores es obvio que el
área superficial que queda tapada por el disolvente 5 con la unión,
expresada como cambios en las accesibilidades de los disolventes,
son cantidades clave en el cálculo de potenciales de unión,
especialmente ya que su magnitud depende de la configuración
topológica del sitio de unión. Para cualquier átomo en la proteína
o ligando, el cambio en la accesibilidad del disolvente es igual a
la accesibilidad en la forma libre menos la accesibilidad del mismo
átomo en el complejo. La accesibilidad atómica 0 en la proteína
libre se calcula a partir de la estructura de alta resolución. El
cambio en la accesibilidad del disolvente con la unión depende de
la localización topológica del átomo y del tamaño y geometría del
ligando.
La fracción del área tapada por el disolvente
con la unión de un ligando de pequeño peso molecular depende de la
geometría de la superficie. En general, el cambio en el área
superficial accesible del disolvente 5 con la unión es una función
de la concavidad de la superficie en la que está localizado. En
general, excepto para grupos cargados, la energía de unión es
proporcional al cambio en la accesibilidad del disolvente (es
decir, la cantidad de área superficial que se tapa por el
disolvente con la unión). Por esta razón, los sitios de unión de
alta afinidad están localizados generalmente en puntos o grietas
que optimizan la cantidad de superficie que se tapa por el
disolvente.
Las dianas de unión se identifican mapeando el
potencial de unión de cada átomo en la estructura tridimensional de
la proteína. Las dianas de unión pueden clasificarse según su
naturaleza química (por ejemplo, grado de hidrofobicidad, carga,
etc.), su área superficial u otro parámetro apropiado. En la
mayoría de las situaciones, el tamaño de la diana de unión y la
hidrofobicidad son los parámetros más importantes. Debido a que se
prefieren compuestos de bajo peso molecular como fármacos
farmacéuticos, la alta afinidad debe provocarse en una diana de
unión pequeña. Esta consideración favorece fuertemente ligandos
sumamente hidrófobos, haciendo que el efecto hidrófobo sea la
fuerza impulsora dominante en la unión de estas pequeñas moléculas
orgánicas.
El algoritmo de Woolford permite al usuario
examinar potenciales de unión en términos del grado de
hidrofobicidad del sitio. Así por ejemplo, es posible buscar dianas
de unión con el potencial de unión más alto, o dianas de unión con
el mayor potencial para un grado de hidrofobicidad dado. Dentro de
este contexto, el grado de hidrofobicidad se expresa en términos de
la proporción de átomos polares y no polares en cualquier sitio
dado. El área superficial de integración (el tamaño del sitio de
unión) también es una variable que puede ajustar el usuario.
Una vez que se ha identificado un sitio de unión
potencial, el ligando ideal se forma mediante la colocación de
átomos que son energéticamente complementarios a aquellos en el
sitio de unión a distancias de van der Waals óptimas. El conjunto
de formación básico está compuesto de átomos carbono, nitrógeno y
oxígeno, aunque pueden incluirse otros tipos de átomos. Los átomos
de este fondo se usan para llenar el sitio de unión. El número, tipo
y localización exacta de cada átomo se obtiene mediante la
optimización global de la energía de unión de Gibbs.
El conjunto de átomos resultante (número, tipo y
coordenadas de posición) define el ligando ideal. En esta fase, los
átomos en el ligando ideal no pertenecen a ningún tipo o clase
particular de molécula. En este nivel, el ligando se define como un
agregado de átomos que sólo satisface requisitos de radios de van
der Waals y niveles de energía óptimos. El modo particular en que
se unen los átomos de ligando entre sí se resuelve posteriormente
usando procedimientos apropiados de química orgánica.
Los tipos de átomos se colocan diferentes en el
espacio tridimensional de forma que la afinidad de unión hacia la
diana seleccionada sea óptima. Los átomos en el ligando ideal no
están unidos juntos. Definen un diseño tridimensional para la
identificación y/o diseño de moléculas orgánicas que se aproximan
mucho a las características del ligando
ideal.
ideal.
El ligando ideal se define como una matriz
tridimensional de átomos que maximizará la afinidad de unión si
estuvieran formando una única molécula. Como tal, esta matriz puede
usarse como un diseño para identificar o construir una molécula que
presentará la misma disposición atómica respecto a la diana de
unión. Esta disposición puede definirse exclusivamente mediante los
átomos especificados por el algoritmo o por un mayor número de
átomos, o como se requiera para presentar la superficie de unión
apropiada para la diana.
La afinidad de unión de un ligando real sólo se
puede aproximarse a la del ligando ideal. El ligando ideal no sólo
presenta complementariedad perfecta, sino que también carece de
grados de libertad conformacionales cuando está libre en
disolución, es decir, no pierde entropía conformacional con la
unión. Estos requisitos son muy difíciles de reproducir en la
realidad.
El procedimiento de construir una molécula de
ligando implica la identificación del la mejor disposición de unión
que concuerde con las coordenadas de posición de los átomos en la
molécula de ligando. Esto puede hacerse usando consideraciones de
teoría de gráficos u otros procedimientos apropiados que incluyen
la identificación de la molécula de ligando más apropiada de un
base de datos empíricos de compuestos químicos. Este procedimiento
no siempre conduce a una única molécula y en algunas situaciones
son posibles varios candidatos potenciales.
En la descripción de la invención, la superficie
de la proteína de la estructura de la proteína nativa se ha usado
como un ejemplo para identificar dianas de unión. Sin embargo, el
algoritmo también se aplica a superficies internas de proteínas que
se exponen como resultado de cambios conformacionales, o a
interfases de oligomerización en proteínas multiméricas. Por tanto,
la aplicación de este algoritmo a otras macromoléculas (por ejemplo,
ácidos nucleicos) o membranas biológicas también debe incluirse en
la invención.
Tradicionalmente, la localización de dianas de
unión se ha restringido a las superficies expuestas de una
proteína. Un área nueva y aún sin explorar es la elección como
diana de ligandos para superficies internas. El algoritmo de
Woolford también considera la existencia de sitios de unión
localizados en superficies internas. Estas superficies internas
normalmente no están accesibles para el disolvente o los ligandos.
Están localizadas en interfases entre diferentes regiones de
proteínas o en las interfases entre subunidadades en el caso de
proteínas de múltiples subunidades. Con el fin de que se produzca
la unión, parte de la proteína necesita desplegarse (o separarse
mediante un cambio conformacional del resto de la proteína) y poner
a disposición el sitio de unión. Formalmente puede decirse que el
ligando estabiliza un estado de la proteína parcialmente plegado,
es decir, un estado de la proteína en el que algunas regiones están
plegadas y otras regiones están desplegadas.
En la situación anterior, la energía de Gibbs
total asociada con la unión del ligando es la suma de la energía de
Gibbs requerida para desplegar la región de la proteína que expone
el sitio de unión (o la energía de Gibbs para el cambio de
conformación) más la energía de Gibbs intrínseca de unión.
Es evidente que la energía de unión total se
optimizará si la energía de Gibbs requerida para desplegar la
región de la proteína que expone el sitio de unión es pequeña. Por
tanto, un elemento crucial en el descubrimiento de sitios de unión
internos es la correcta identificación de aquellas regiones de la
proteína que tienen la estabilidad estructural más baja o,
equivalentemente, la identificación de los estados parcialmente
plegados que tienen las mayores probabilidades de poblarse.
El algoritmo para identificar los estados
parcialmente plegados más probables implica el uso de la estructura
de alta resolución de una proteína como una plantilla para generar
un gran número de conformaciones parcialmente plegadas. Las
conformaciones parcialmente plegadas se crean desplegando ciertas
regiones de la proteína con el ordenador, a la vez que las regiones
restantes se mantienen en su conformación nativa. Las energías de
Gibbs de todos los estados parcialmente plegados se calculan usando
la parametrización estructural de las energías junto con un
conjunto de parámetros estructurales optimizados para el estado
desplegado. El estado parcialmente plegado con la mayor
probabilidad es el de menor energía de Gibbs.
La generación de estados parcialmente plegados
se alcanza usando un algoritmo combinatorio seguido por el
refinamiento de la estructura parcialmente plegada resultante. El
algoritmo combinatorio considera la proteína como si estuviera
formada de un número arbitrario de unidades plegables. Cada unidad
plegable puede estar o plegada o desplegada. Los estados de las
proteínas se generan con el ordenador de un modo combinatorio
mediante el plegamiento y desplegamiento de unidades plegables en
todas las combinaciones posibles. El número total de estados que se
genera es proporcional al número de unidades plegables (N) y es
igual a 2^{N}. El número de unidades plegables determina la
resolución del análisis. El punto de partida es normalmente N=16,
que da como resultado un conjunto inicial de 65536 estados. Una vez
que se ha identificado el estado parcialmente plegado con la menor
energía de Gibbs, los límites precisos de aminoácidos se localizan
usando un procedimiento de refinamiento que implica mover los
límites entre regiones plegables/desplegables por un residuo en un
tiempo.
Una vez que se ha encontrado el estado
parcialmente plegado más probable, se identifica la superficie que
se expone como resultado del despliegue parcial. Esta superficie
está localizada en las regiones plegadas del estado parcialmente
plegado, pero está tapada por el disolvente en el estado nativo.
Esta superficie se expone al disolvente con el despliegue de las
regiones adyacentes. La identificación de la diana de unión con el
potencial de unión más alto en esta superficie sigue el mismo
procedimiento descrito en esta descripción para otras dianas de
unión.
Se presenta un algoritmo para el diseño y
acoplamiento de ligandos de péptidos. Este algoritmo usa la
estructura tridimensional de una proteína u otra macromolécula como
una plantilla para el diseño de péptidos que se asociarán con
afinidad de unión predefinida a sitios diana seleccionados en una
molécula de proteína. Se consideran dos situaciones, una en la que
se conoce la estructura de alta resolución de la proteína diana en
asociación con un péptido más destacado o de tipo natural; y una en
la que sólo se conoce la estructura de la proteína diana. En la
primera situación, el diseño de ligandos puede hacerse mediante la
adición, deleción o sustitución de aminoácidos específicos en
localizaciones específicas dentro del péptido más destacado. En la
segunda situación, el punto de partida en el procedimiento de
diseño es la definición de un péptido de núcleo mínimo que se trata
como un péptido más destacado virtual por el algoritmo. El diseño
molecular se pone en práctica mediante sustitución, adición o
deleción molecular o atómica secuencial seguida por minimización de
energía. La construcción molecular se realiza poniendo en práctica
un procedimiento de "reptación" guiado por energía. El péptido
de núcleo mínimo se define mediante una búsqueda sistemática o
exhaustiva de una biblioteca de péptidos pequeños (dipéptidos,
tipéptidos, etc.) hasta que se encuentra un péptido más destacado
apropiado. En todos los procedimientos de energía se usa una
parametrización estructural empíricamente derivada de las energías.
El algoritmo puede usarse con sitios diana conocidos o para
descubrir nuevos sitios de unión diana de péptidos. Además, el
algoritmo se pone en práctica para aminoácidos naturales o
no
naturales.
naturales.
Los estudios con diferentes péptidos que se unen
a proteínas (por ejemplo angiotensina, pepstatina A, etc.) indican
que la energía de unión total no se distribuye uniformemente por
toda la molécula y que algunos grupos (frecuentemente llamados
puntos calientes en la bibliografía) llevan una mayor proporción de
la energía de unión. Usando péptidos pequeños como sondas es posible
identificar sitios específicos en la proteína que tienen la mayor
afinidad de unión potencial. Esto es un problema que puede tratarse
con el ordenador. Si sólo se incluyen aminoácidos naturales son
posibles 400 dipéptidos y 8.000 tripéptidos. Los números no
aumentan significativamente si se incluyen aminoácidos no
naturales. La primera etapa en el procedimiento es el mapeo de la
superficie de la proteína en términos del potencial de unión de
cada uno de sus átomos constituyentes. Usando este mapa se
seleccionan los péptidos que son complementarios a los sitios con
el mayor potencial de unión. Al final de este procedimiento se
obtiene un mapa de la superficie de la proteína en términos de
afinidades de unión máximas para pequeños péptidos más destacados.
Entonces, este mapa se usa en la selección de un sitio de unión y
el diseño de un ligando de péptido usando el péptido más destacado
como punto de partida.
En el pasado, uno de los obstáculos principales
para los algoritmos de diseño molecular basados en la estructura ha
sido la ausencia de una función de energía con la capacidad para
predecir con exactitud la afinidad de unión. La presente invención
proporciona una función de energía que puede predecir con exactitud
la afinidad de unión.
Como se indica anteriormente, la afinidad de
unión se determina mediante la energía de Gibbs de unión. La
contribución óptima de cada átomo en la proteína a la energía de
unión se calcula usando una modificación especial de una
parametrización estructural previamente desarrollada de las
energías de unión (Bardi y col., 1977; D'Aquino y col., 1996; Freire
y col., 1991; Freire, 1993; Gomez y col., 1995 (a); Hilser y col.,
1996 (b); Lee y col., 1994; Luque y col., 1996; Luque y col., 1997;
Murphy y col., 1992 (a); Murphy y col., 1992 (b); Murphy y col.,
1993; Murphy y col., 1994; Straume y col., 1992; Xie y col., 1994
(a); Xie y col., 1994 (b)).
En la realización preferida, el diseño de un
ligando de péptido empieza con la identificación de un péptido más
destacado. Hay cuatro posibilidades, pudiendo tratarse todas
mediante el algoritmo:
- 1)
- El péptido más destacado y el sitio de unión no son conocidos.
- 2)
- El sitio de unión es conocido, pero el péptido más destacado no es conocido.
- 3)
- El péptido más destacado es conocido y el sitio de unión no es conocido.
- 4)
- El péptido más destacado y el sitio de unión son conocidos.
En el primer caso, la primera tarea es usar la
estructura de alta resolución de la proteína con el fin de
identificar la localización del sitio de unión y la secuencia de
aminoácidos del péptido más destacado (normalmente, pero no se
limita a un dipéptido). Esto es una búsqueda conjunta ya que el
potencial de unión esperado de un sitio dado en la proteína no
puede realizarse a menos que se especifique la secuencia óptima de
péptidos. La identificación de candidatos para posibles
localizaciones del sitio de unión se hace mediante la construcción
de un mapa de la superficie de la proteína en términos de
afinidades de unión potenciales para "péptidos más destacados
idealizados". Una vez que se han identificado los mejores
candidatos se hace una búsqueda sistemática con las estructuras
atómicas completas de los péptidos. Este procedimiento da como
resultado la selección de un sitio de unión y el péptido más
destacado correspondiente, que constituye el punto de partida para
el diseño del ligando del péptido final.
En el segundo caso, la localización del sitio de
unión es conocido y por tanto la búsqueda para la mejor
localización y secuencia del péptido más destacado se restringe a
una región más pequeña de la proteína. En este caso, la
identificación del mejor péptido más destacado se hace directamente
con estructuras atómicas completas de todos los posibles péptidos
más destacados.
En el tercer caso, el péptido del ligando es
conocido pero el sitio de unión no es conocido. Esta situación se
aproxima al problema de acoplamiento clásico. En el algoritmo, el
péptido del ligando original se descompone en sus componentes
dipeptídicos elementales. Entonces, el mismo procedimiento usado en
el caso uno se realiza para cada uno de los dipéptidos elementales.
Los dipéptidos elementales se usan en el análisis porque sus
conformaciones pueden tratarse con el ordenador, mientras que no
las de péptidos más largos. Una vez que se ha identificado el
péptido más destacado se usa el mismo procedimiento de minimización
de energía, excepto que el resto de la secuencia de péptidos ya es
conocida.
En el cuarto caso, en el que el péptido más
destacado y el sitio de unión son conocidos, el problema puede
reducirse a encontrar la conformación que minimiza la energía de
unión. Sin embargo, en situaciones en las que se conoce la
estructura de alta resolución de una proteína en complejo con un
ligando de péptido, el objetivo es frecuentemente el diseño de una
versión diferente del péptido con diferentes características de
unión. Si este es el caso, el péptido experimental se usa como
péptido más destacado. En este documento, la primera tarea es
mapear las contribuciones relativas de cada aminoácido en el
péptido a la energía de unión. Entonces, este mapa de energía se
usa para seleccionar aminoácidos que se eligen como diana para la
mutación. Si se desea una afinidad más alta se seleccionan los
aminoácidos que hacen las contribuciones más bajas; y viceversa, si
se desea una afinidad más baja se seleccionan los aminoácidos que
hacen las mayores contribuciones. Si no puede hacerse la
discriminación de aminoácidos, o si las mutaciones no son
factibles, entonces la longitud del péptido es la variable
restante.
El punto de partida para el diseño es el péptido
más destacado. Como se trata anteriormente, el péptido más
destacado se define o mediante ordenador o se define mediante la
estructura de alta resolución de un complejo péptido/proteína
existente. En ambas situaciones, las manipulaciones son
similares.
El diseño de un ligando de péptido que tiene
como punto de partida un péptido más destacado implica tres
operaciones elementales: 1) la adición; 2) deleción; o 3)
sustitución de un tipo de aminoácido por otro (mutación). Se logran
otras operaciones más complejas mediante la combinación de varias
operaciones elementales. Una vez que se realiza la operación, la
conformación más probable se selecciona mediante la identificación
de la de menor energía de unión.
Los aminoácidos pueden añadirse o en los
extremos amino o carboxi del péptido más destacado. Las adiciones
en las posiciones centrales no se consideran explícitamente debido
a que pueden lograrse mediante la combinación de mutaciones con
adición/defecciones en cualquier extremo. El procedimiento por el
que un nuevo aminoácido se añade en el extremo amino o carboxi del
péptido puede considerarse como un movimiento de reptación en el
que el nuevo aminoácido muestra diferentes orientaciones del
esqueleto y de las cadenas laterales hasta que encuentra la que
minimiza la energía de unión. Cada orientación viene impuesta por
un conjunto de valores para los ángulos de torsión \phi y \psi
del esqueleto y el conjunto de diedros de cadenas laterales
{\chi}.
Los aminoácidos pueden someterse a deleción o en
el extremo amino o carboxi del péptido más destacado.
Las mutaciones de aminoácidos pueden realizarse
en cualquier posición a lo largo de la secuencia de péptidos.
Implican la sustitución de cadenas laterales, seguido por la
minimización de energía.
La búsqueda de la conformación más probable es
equivalente a la búsqueda de la conformación que minimiza la
función de potencial de Gibbs \DeltaG_{ef}. La probabilidad de
una conformación de péptido único, definida por un conjunto
específico de coordenadas de las cadenas laterales y del esqueleto,
viene impuesta por la función de potencial de Gibbs,
\DeltaG_{ef}, especificada por la entalpía y entropía de
solvatación. \DeltaG_{ef} es una función de los ángulos de
torsión de las cadenas laterales y del esqueleto. Por definición, la
entropía conformacional del propio péptido no entra en la ecuación.
\DeltaG_{ef} es la función de energía de Gibbs de una única
conformación y no debe confundirse con la energía de Gibbs de unión
que incluye todas las conformaciones aceptables. La probabilidad de
cualquier conformación dada viene dada por la ecuación
en la que e^{\Delta G}
_{ef,i}/RT es el exponente de Boltzmann para esa conformación, y
la suma en el denominador es la función de partición conformacional
definida como la suma de los exponentes de Boltzmann de todas las
conformaciones. La función de potencial de Gibbs, \DeltaG_{ef},
se usa para identificar la conformación más probable de una cadena
lateral o esqueleto. Debe tenerse en cuenta que el procedimiento de
minimización de energía usado en este documento implica términos
entálpicos que surgen de interacciones intra e intermoleculares,
además de las interacciones con el disolvente, y la entropía de
solvatación.
Las conformaciones se generan variando
sistemáticamente los ángulos diédricos entre 0 y 360 grados cada 10
grados. Para conformaciones del esqueleto, los ángulos de torsión
también se varían cada 10 grados entre 0 y 360 grados. Se hacen
refinamientos identificando conformaciones que están próximas a un
mínimo de energía y reducen los intervalos de rotación. Para
situaciones sencillas es posible una búsqueda exhaustiva. Para
situaciones más complicadas se usan algoritmos de búsqueda
habituales que tienen como objetivo identificar mínimos de
funciones (por ejemplo gradiente, simplex, máxima pendiente, etc.).
Debido a los impedimentos estéricos no son factibles todas las
conformaciones generadas por la rotación alrededor de un enlace
dado. Por tanto, para cada conformación se comprueban las
condiciones de van der Waals usando el conjunto de MMII de radios
de van der Waals eficaces publicados por Iijima y col. (1987). Se
rechazan aquellas conformaciones que presentan colisiones de van
der Waals. La función de potencial de Gibbs \DeltaG_{ef} sólo
se calcula para conformaciones permitidas.
La afinidad de unión se determina por la energía
libre de Gibbs de unión, descrita en más detalle a continuación.
Todos los cálculos de energía presentados en este documento se
basan en una parametrización estructural de las energías descritas
en este documento. El nivel de refinamiento anterior de esta
parametrización se resume en la siguiente bibliografía: (Bardi y
col., 1997; D'Aquino y col., 1996; Gomez y col., 1995 (a); Gomez y
col., 1995 (b); Hilser y col., 1996 (b); Luque y col., 1996). Esta
parametrización estructural proporciona la mayor parte de la
energía de Gibbs. Sin embargo, para el nivel de exactitud requerido
en este algoritmo, algunas veces se requieren términos adicionales.
Estos términos adicionales incluyen, entre otros, restricciones
conformacionales debidas a la densidad de carga, una parametrización
explícita de las restricciones conformacionales debidas a puentes
disulfuro u otros enlaces covalentes, la dependencia de la
constante dieléctrica en la accesibilidad del disolvente, la
dependencia de pK de grupos químicos en el entorno, valores
habituales parametrizados para las accesibilidades de las cadenas
laterales de todos los aminoácidos. Además, se han incluido
descripciones paramétricas de aminoácidos no habituales.
La energía de Gibbs de unión está compuesta de
componentes entálpicos y entrópicos. Ambos componentes incluyen
contribuciones debidas a la formación de interacciones entre el
ligando y la proteína, y contribuciones debidas a cambios en la
hidratación. Las contribuciones entálpicas son una función de la
distancia de separación entre átomos y los cambios en la
accesibilidad atómica al disolvente. El cambio de entropía contiene
contribuciones del disolvente que también son proporcionales a los
cambios en la accesibilidad del disolvente, y la reducción en los
grados de libertad conformacionales. Las interacciones
electrostáticas y los acontecimientos de protonación/desprotonación
acoplados a la unión también son importantes y se incluyen en el
análisis. Los cambios en los grados de libertad translacionales son
los mismos para diferentes ligandos y por tanto no contribuyen a la
discriminación entre afinidades de unión, aunque contribuyen a la
afinidad actual.
La identificación de la conformación con menor
energía utiliza una función de energía similar a la energía de
Gibbs parametrizada de unión, excepto que no contiene el término de
entropía conformacional. El motivo es que en el procedimiento de
minimización de energía se está tratando con conformaciones
únicas.
Cada conformación de péptido se define por un
conjunto de diedros de cadenas laterales {\chi} y ángulos de
torsión \phi y \chi del esqueleto. La energía de unión es una
función de {\chi}, \phi y \chi. Por tanto, en la rutina de
minimización de energía, el objetivo es encontrar el conjunto de
{\chi}, \phi y \chi para el que la energía es un mínimo.
Están disponibles varios procedimientos matemáticos para encontrar
los mínimos de las funciones. El algoritmo usado en los
procedimientos de la invención no se basa en un procedimiento
particular de localización de mínimos.
Si el sitio de unión no es conocido, es
necesario seleccionar algunas regiones en la proteína como los
candidatos más probables para servir de sitios de unión de
péptidos. Esto se hace mapeando la superficie de la proteína en
términos del potencial de unión de cada uno de sus átomos
constituyentes usando el algoritmo de Woolford (descrito más
adelante).
Una vez que se ha obtenido el mapa de
potenciales de unión atómicos, se transforma en un mapa de
potenciales de unión de dipéptidos. Este nuevo mapa se obtiene
seleccionando regiones de dimensiones similares a las encontradas
en los dipéptidos (normalmente oscilan de 7,0 por 2,5 \ring{A} a
14 por 6,0 \ring{A}, que se corresponden con
Gly-Gly y Trp-Trp). Las dimensiones
geométricas y la distribución de la superficie polar y no polar
dentro de cada región se usa para determinar progresivamente la
secuencia del dipéptido más apropiado. La filosofía general en este
documento es aumentar el nivel de detalle en la descripción del
candidato para dipéptido más destacado a medida que avanza el nivel
de refinamiento. Así por ejemplo, un protocolo común es aumentar el
nivel de detalle según el siguiente orden: 1) dimensiones
geométricas del sitio de unión seleccionado; 2) fracción de
superficie polar y no polar; 3) distribución topológica de la
superficie polar y no polar; 4) descripción atómica completa.
En todos los casos presentados en este
documento, la energía de Gibbs de unión, \DeltaG, se calculó a
partir de las estructuras cristalográficas publicadas usando
procedimientos previamente descritos (D'Aquino y col., 1996; Gomez
y col., 1995 (a); Gomez y col., 1995 (b); Hilser y col., 1996 (b);
Luque y col., 1996). Estos cálculos requieren las estructuras del
complejo, además de las estructuras de la proteína no ligada y el
inhibidor no ligado. En esta aproximación, la parte genérica de la
energía de Gibbs, \DeltaG_{gen}, se calcula a partir de un
cálculo por separado de sus componentes de entalpía y entropía.
Esta parte de la energía de Gibbs contiene las contribuciones
normalmente asociadas con la formación de la estructura secundaria
y terciaria (interacciones de van der Waals, enlace por puente de
hidrógeno, hidratación y entropía conformacional). Las
contribuciones adicionales a la energía de Gibbs de unión no se
separan en componentes entálpicos y entrópicos. Incluyen efectos
electrostáticos y de ionización, G_{ion}, y la contribución del
cambio en grados de libertad translacionales, \DeltaG_{tr},
Las contribuciones estructurales/ de solvatación
más significativas a la energía libre total de unión están
contenidas en el término \DeltaG_{gen} = \DeltaH_{gen} -
T\cdot\DeltaS_{gen}, que se calcula estimando por separado sus
componentes de entalpía y entropía. Los cambios estructurales
importantes para estos cálculos son los cambios en las áreas
superficiales accesibles de disolventes apolares y polares
(\DeltaASA_{ap} y \DeltaASA_{pol}) y la distribución de las
distancias interatómicas entre diferentes tipos de átomos que
determina la densidad de empaquetamiento.
Los cambios en las áreas superficiales
accesibles se calcularon poniendo en práctica el algoritmo de Lee y
Richards (Lee y col., 1971). En todos los cálculos se usaron un
radio de disolvente de 1,4\ring{A} y un ancho de corte de
0,25\ring{A}.
Con el fin de definir mejor pequeñas diferencias
en la accesibilidad del disolvente entre inhibidores o mutantes se
consideran 64 orientaciones de proteínas/inhibidores diferentes con
respecto al plano de corte en los cálculos del área superficial
accesible. Estas orientaciones se generan rotando la molécula
alrededor del eje x, y y z cada 90 grados. De este modo, la
accesibilidad del disolvente resultante para cada átomo es el
promedio en número de los valores obtenidos para todas las
orientaciones moleculares. Si se necesitan las accesibilidades del
disolvente para conformaciones desplegadas se usa un conjunto de
valores optimizados de energía libre (Luque y col., 1996).
En la unión o el plegamiento, la mayor parte del
cambio de entalpía origina la formación de interacciones internas
(enlaces de van der Waals, de hidrógeno, etc.) y la desolvatación
paralela de los grupos que interactúan. Como es lógico, la mayor
parte del cambio de entalpía se reduce tanto en términos de cambios
de \DeltaASA como en las distancias interatómicas entre los
grupos que interactúan. A la temperatura de referencia de 60°C puede
escribirse como (Hilser y col., 1996 (b)):
en la que los coeficientes
empíricos \alpha y \beta se han estimado a partir de un
análisis de la base de datos termodinámica de proteínas y son
iguales a \alpha_{ap} = -12,96, \beta_{ap} = 25,34,
\alpha_{pol}, = 24,38, \beta_{pol} = 16,57 y
\alpha_{mix} = 16,42. Los términos U_{i} representan la
densidad de empaquetamiento de átomos apolares, polares y mixtos y
es igual a la energía promedio en peso de la relación entre la
distancia de separación en el mínimo en el pozo de potencial y la
separación actual entre tipos de átomos. La ecuación anterior puede
generalizarse para tipos arbitrarios de átomos
como:
Para la densidad de empaquetamiento promedio en
las proteínas, \DeltaH_{gen}(60) se aproxima mucho
a:
A cualquier otra temperatura,
\DeltaH_{gen}(T) se obtiene de la ecuación termodinámica
habitual:
\DeltaH_{gen} no necesita ser igual a la
entalpía experimental. Por ejemplo, se ha mostrado que para
procedimientos de unión en los que los protones se liberan o se
absorben, la entalpía medida depende de la entalpía de ionización
del tampón (Gomez y col., 1995 (b)).
En el cálculo del cambio de entropía se incluyen
dos contribuciones primarias, una debido a cambios en la
solvatación y la otra debida a cambios en los grados de libertad
conformacionales (\DeltaS_{gen}(T) =
\DeltaS_{solv}(T) + \DeltaS_{conf}). La entropía de
solvatación depende de la temperatura, mientras que la entropía
conformacional es esencialmente una constante a diferentes
temperaturas. La entropía de solvatación puede escribirse en
términos de capacidad calorífica si las temperaturas a las que las
entropías de hidratación apolares y polares son cero (T*S,ap y
T*S,pol) se usan como temperaturas de referencia:
Se ha sabido que T*_{S,ap} es igual a 385,15K
durante algún tiempo (Baldwin, 1986; Murphy y col., 1992 (b)) y
recientemente se ha encontrado que T*_{S,pol} es próxima a
335,15K (D'Aquino y col., 1996). Mientras que la entropía de
solvatación apolar parece ser aditiva, se sabe que la situación para
la solvatación polar depende en número y proximidad de los grupos
funcionales polares en la molécula (Cabani y col., 1981).
Las entropías conformacionales con la unión o el
plegamiento se evalúan considerando explícitamente las tres
siguientes contribuciones para cada aminoácido: 1)
\DeltaS_{bu->ex}, el cambio de entropía asociado con la
transferencia de una cadena lateral que está tapada en el interior
de la proteína respecto a su superficie; 2) \DeltaS_{ex->u},
el cambio de entropía ganado por una cadena lateral expuesta en la
superficie cuando el esqueleto del péptido cambia de una
conformación única a una conformación desplegada; y 3)
\DeltaS_{bb}, el cambio de entropía ganado por el propio
esqueleto con el despliegue de una única conformación. Se ha
estimado la magnitud de estos términos para cada aminoácido
mediante análisis computacional de la probabilidad de diferentes
confórmeros como una función de los ángulos diédricos y de torsión
(D'Aquino y col., 1996; Lee y col., 1994; Luque y col., 1996).
Debido a que algunos ligandos considerados no
son péptidos, puede ponerse en práctica una parametrización
especial para explicar el cambio en los grados de libertad
conformacionales entre las formas unidas y libres de las moléculas
de ligando. Como se muestra en la figura 10, el número total de
átomos, además del número de enlaces rotatorios, varía entre
ligandos. En general, la entropía conformacional del ligando libre
en disolución será proporcional al número de enlaces rotatorios.
Sin embargo, para un número dado de enlaces rotatorios, los efectos
de volumen excluidos aumentarán con el número total de átomos en la
molécula. Por tanto, como una primera aproximación, el cambio de
entropía conformacional de ligandos no peptídicos con la unión,
\DeltaS_{np}, se consideró como una función lineal del número de
enlaces rotatorios (N_{rb}) y del número total de átomos
(N_{átomos})
Los coeficientes k_{1} y k_{2} se estimaron
a partir de una base de datos experimental de ligandos no
peptidicos. Se encontró que el coeficiente k_{1} era igual a
-1,76 cal/K\cdotmol, que está próximo al valor de entropía
conformacional observada para enlaces C-C en
parafinas de cadena larga (Schellman, 1955 (a); Schellman, 1955
(b)). Se encontró que el coeficiente k_{2} era igual a 0,414
cal/K\cdotmol y esencialmente explica las restricciones de
entropía conformacional en el ligando libre debido al volumen
excluido.
El cambio de capacidad calorífica es una función
débil de la temperatura y se ha parametrizado en términos de
cambios en áreas superficiales accesibles del disolvente
(\DeltaASA) ya que origina principalmente cambios en la
hidratación (Gomez y col., 1995 (a); Gomez y col., 1995 (b); Murphy
y col., 1992 (a)):
en las que los coeficientes
a_{C}(T) = 0,45 + 2,63x10^{-4} \cdot (T - 25) -
4,2x10^{-5}\cdot (T - 25)^{2} y b_{C}(T) =
-0,26 + 2,85x10^{-4} \cdot (T - 25) + 4,31x10^{-5} \cdot (T
- 25)^{2}. La hidratación del grupo hidroxilo en las
cadenas laterales de hidroxilo alifático (Ser y Thr) parece
contribuir positivamente y no negativamente a \DeltaCp como se
supuso previamente (0,17 cal\cdotK^{-1}\cdotmol^{-1}
\ring{A}2 a 25°C) (Gomez y col., 1995 (b)). En la ecuación
anterior, los cambios de \DeltaASA cambios son en \ring{A}2 y la
capacidad calorífica en cal\cdotK^{-1}\cdotmol^{-1}. En
general, para cálculos a baja temperatura (T<80°C), los
coeficientes independientes de la temperatura son suficientes (Gomez
y col., 1995 (a); Gomez y col., 1995 (b)). Los efectos específicos,
como los cambios de capacidad calorífica asociados a cambios en la
protonación, unión diferencial de ligandos o desnaturalizantes,
etc., necesitan considerarse individualmente (Gomez y col., 1995
(a); Gomez y col., 1995
(b)).
(b)).
En esta situación necesitan considerarse dos
tipos de efectos electrostáticos. Las contribuciones de Coulomb
debido a las interacciones entre sitios cargados, y la energía
propia que surge al cargar un único sitio o alternativamente la
energía propia que surge al transferir una carga entre ambientes
con constantes dieléctricas diferentes. Estas contribuciones
electrostáticas se calcularon como se describe por
Garcia-Moreno (Garcia-Moreno, 1995)
usando la ecuación habitual:
en la que Z es la carga, r_{i} el
radio de la partícula cargada, r_{ij} la separación entre dos
cargas, A y A_{ref} los parámetros de atenuación en el complejo y
la referencia. Estos parámetros incorporan efectos dieléctricos y
de selección como se trata en (Garcia-Moreno, 1995)
y (Garcia-Moreno y col.,
1997).
Los efectos protonación se tratan como se
describe anteriormente (Gomez y col., 1995 (b)) a partir de un
conocimiento del pKa de los grupos que cambian el estado de
ionización con la unión.
La asociación de dos o más moléculas reduce los
grados de libertad translacionales disponibles para esas moléculas.
Ha habido una discusión considerable en lo referente a la magnitud
exacta de este término ya que no se dispone de cálculos precisos
(véase, por ejemplo, Janin, 1995; Kauzmann, 1959; Murphy y col.,
1994). En este trabajo (Gomez y col., 1995 (b); Murphy y col.,
1994) se ha encontrado que el valor que mejor explica los resultados
experimentales en la entropía crática propuesta por Kauzmann
(Kauzmann, 1959). Para la formación de un complejo bimolecular, la
entropía crática es igual a -8 cal/K\cdotmol, que asciende a
aproximadamente 2,4 kcal/mol a 25°C.
Las constantes de estabilidad aparente de
residuos dan un conjunto importante de parámetros para mapear la
estabilidad estructural de diferentes regiones de una proteína.
Para cualquier residuo dado, la constante de estabilidad aparente
por residuo, K_{fj}, se define como la relación de las
probabilidades de todos los estados en los que el residuo está
plegado, P_{fj}, respecto a las probabilidades de los estados en
los que el mismo residuo no está plegado:
La constante de estabilidad aparente por
residuo, K_{fj}, es la cantidad de que se medirá si fuera posible
determinar experimentalmente la estabilidad de la proteína
monitorizando cada residuo individual. Por tanto, las variaciones en
las constantes de estabilidad por residuo permiten una evaluación
de las diferencias de estabilidad estructural entre regiones de la
proteína. En muchos casos, los factores de protección de
intercambio de hidrógeno medidos por RMN permiten una determinación
experimental de las constantes de estabilidad aparente por residuo
(Hilser y col., 1996 (a); Hilser y col., 1997 (a); Hilser y col.,
1997 (b)).
La proteasa del VIH-1 ha sido
objeto de intensa investigación durante los últimos años. El
desarrollo de inhibidores de la proteasa es un esfuerzo importante
para varias compañías farmacéuticas, ya que la inhibición
satisfactoria de esta proteína detiene la maduración viral. Los
inhibidores de la proteasa del VIH-1 son análogos
de sustrato, es decir, funcionan compitiendo con los sustratos
naturales por el sitio activo. Debido a que los sustratos se
hidrolizan rápidamente por la proteasa, las estructuras
cristalográficas de complejos enzima/sustrato no pueden obtenerse,
creándose así obstáculos adicionales para el procedimiento de
diseño.
En el ejemplo presentado en este documento, la
conocida estructura de la proteasa del VIH-1 con el
inhibidor
Ace-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg-NH_{2}
(4hvp del archivo pdb) se usa para generar la estructura del
sustrato cromogénico ampliamente usado
Lys-Ala-Arg-Val-Nle-NPhe-Glu-Ala-Nle-NH_{2}.
En las formulas químicas, Nle representa norleucina y NPhe
p-nitro-fenilalanina. El inhibidor
tiene seis aminoácidos con un enlace peptídico reducido entre Nle 3
y Nle 4. Por otra parte, el sustrato tiene nueve aminoácidos, sólo
uno de ellos (Nle 3) se conserva del inhibidor. Por consiguiente,
el diseño del sustrato se hace usando el inhibidor como un péptido
más destacado y poniendo en práctica una combinación de mutaciones
y extensiones de péptidos en ambos extremos carboxi y amino (figura
9).
El algoritmo de Woolford se aplicó a la
estructura cristalográfica de VIH-1 y se le pidió
que buscara dianas de unión sin especificar a priori la
localización del sitio de unión natural. Woolford predice
correctamente la localización del sitio de unión principal,
incluyendo la participación de aminoácidos de tanto la región de
lengüeta como del cuerpo principal de la proteína (figura 8). Debe
tenerse en cuenta que el algoritmo también predice la presencia de
sitios adicionales con potencial diana. Estos sitios adicionales
representan dianas potenciales secundarias que pueden explorarse
para el desarrollo de nuevos fármacos.
El siguiente estudio de la unión de la proteasa
del VIH-1 a inhibidores de proteasa del
VIH-1 conocidos ilustra funciones de parametrización
de energía que pueden usarse en el procedimiento de la invención.
Sin embargo, la invención no se limita al uso de estas funciones.
Aquellos expertos en la materia pueden usar otras funciones.
Varios inhibidores de la proteasa del
VIH-1 ya están en uso clínico y han mostrado una
promesa significativa en tratamientos de combinación que incluyen
inhibidores de nucleosidos o varios inhibidores de la proteasa. Un
resultado clínico significativo ha sido la aparición de cepas
virales que presentan resistencia a múltiples inhibidores de la
proteasa del VIH-1 (Condra y col., 1995, Ho y col.,
1994, Kaplan y col., 1994, Roberts, 1995, Tisdale, 1996).
La pérdida de sensibilidad a los inhibidores de
la proteasa se produce porque las cepas virales resistentes
codifican moléculas de proteasa que contienen mutaciones de
aminoácidos específicos que disminuyen la afinidad por los
inhibidores, manteniendo todavía suficiente afinidad por el
sustrato. Todavía no están claros los orígenes de la resistencia.
Mientras que algunas de las mutaciones observadas se localizan
directamente en el sitio de unión, otras mutaciones están lejos del
punto de unión. También es aparente que los diferentes inhibidores
provocan diferentes modelos mutacionales y que los modelos de
resistencia cruzada no son los mismos, a pesar del hecho de que
todos los inhibidores eligen como diana el mismo sitio de unión.
Sería útil predecir la afinidad de unión de una
molécula dada a la proteasa del VIH. El procedimiento descrito en
este documento puede usarse para hacer tales predicciones.
La parametrización estructural de las energías
de unión y plegamiento descritas más adelante explican
cuantitativamente la unión de trece inhibidores de la proteasa del
VIH-1 para los que están disponibles estructuras de
alta resolución (A77003, A78791, A76928, A74704, A76889, VX478,
SB203386, SB203238, SB206343, U100313, U89360, A98881, CGP53820).
Las energías libres de unión para los inhibidores se predicen con
una desviación estándar de \pm 1,1 kcal/mol o \pm 10%. Además,
el formalismo predice correctamente el cambio observado en la
constante de inhibición para el complejo de A77003 y el mutante de
proteasa resistente V82A, para el que también está disponible la
estructura de alta resolución. El análisis presentado en este
documento proporciona un mapeo estructural de las diferentes
contribuciones a las energías de unión. La comparación del mapa de
unión con el mapa de estabilidad del residuo indica que el punto de
unión en la molécula de proteasa tiene un carácter dual, la mitad
del sitio de unión se define por la región más estable de la
proteína, mientras que la otra mitad no está estructurada antes de
la unión del inhibidor o sustrato. Esta característica del sitio de
unión acentúa efectos cooperativos que permiten mutaciones en
residuos distales que tienen un efecto significativo en la afinidad
de unión. Estos resultados permiten una evaluación inicial de los
efectos de mutaciones en la actividad de los inhibidores de la
proteasa.
El desarrollo de estrategias satisfactorias para
el diseño molecular basado en la estructura requiere la capacidad
de predecir con exactitud afinidades de unión a partir de
consideraciones estructurales. Se conoce la parametrización
estructural de la energía de plegamiento y unión de proteínas y
péptidos (D'Aquino y col., 1996; Gomez y col., 1995 (a); Gomez y
col., 1995 (b); Hilser y col., 1996 (b); Luque y col., 1996). Se ha
mostrado que esta parametrización es suficientemente exacta para
predecir las propensiones helicoidades de aminoácidos con una
exactitud mejor de 0,2 kcal/mol (Luque y col., 1996), y para
predecir correctamente la estabilidad global de proteínas y las
constantes de estabilidad por residuo como se refleja en el modelo
de factores de intercambio de hidrógeno detectados por RMN (Hilser
y col., 1996 (a); Hilser y col., 1997 (a); Hilser y col., 1997
(b)).
Esta metodología se ha aplicado a la asociación
de trece inhibidores diferentes de la proteasa del
VIH-1 para los que están disponibles estructuras
cristalográficas de alta resolución. Están disponibles las
constantes de inhibición para estos inhibidores, algunos de los
cuales están en ensayos clínicos o uso clínico. Los trece
inhibidores son: A77003, A78791, A76928, A74704, A76889, VX478,
SB203386, SB203238, SB206343, U100313, U89360, A98881, CGP53820
(Abdel-Meguid y col., 1994; Erickson y col., 1990;
Fassler y col., 1993; Hoog y col., 1995; Kim y col., 1995; Lin y
col., 1993; Madhusoodan y col., 1994; Thaisrivongs y col., 1995;
Thompson y col., 1994). Sus estructuras se muestran en la figura
10. El análisis también se realizó en el complejo de A77003 con el
mutante de proteasa resistente al inhibidor V82A para el que está
disponible alta resolución (Baldwin y col., 1995).
El desarrollo de una nueva generación de
inhibidores de la proteasa que trate eficazmente el asunto de la
resistencia requiere un mejor entendimiento de las interacciones,
tanto entre proteasa e inhibidores como entre proteasa y sustratos.
La secuenciación de cepas virales de pacientes que se someten a
tratamiento con inhibidores de la proteasa ha permitido identificar
la localización y el carácter de las mutaciones, pero no ha
proporcionado la descripción molecular del origen de la resistencia.
El análisis presentado en este documento proporciona un mapeo
estructural detallado de las energías de unión para trece
inhibidores diferentes de la proteasa y una explicación
cuantitativa de los efectos de la mutación V82A en la afinidad por
el inhibidor A77003. Como tales, estos estudios deben ayudar en el
desarrollo de una nueva generación de inhibidores.
El conjunto de constantes de estabilidad de
residuos para la molécula de proteasa del VIH-1 se
calculó de la estructura según el algoritmo de COREX (Hilser y
col., 1996 (a), Hilser y col., 1997 (a), Hilser y col., 1997 (b)).
En estos cálculos se usaron un total de 126.496 estados con grados
de plegamiento que oscilaban de los estados nativos a los
completamente desplegados. Los estados se generaron usando un
bloque de deslizamiento de ventanas de 16 aminoácidos cada una. La
energía de Gibbs, la función de partición y la probabilidad
relativa de los 126.496 estados se calcularon usando la
parametrización estructural de las energías descritas
anteriormente.
La figura 11 muestra las afinidades de unión
predichas y experimentales para los trece inhibidores de la
proteasa del VIH-1 considerados en este documento.
Para estos complejos proteasa/inhibidor para los que está
disponible la estructura de la enzima libre, los cálculos se
realizaron usando ambos, la estructura de la enzima libre (Spinelli
y col., 1991), además de la estructura de la enzima en el complejo,
pero sin el inhibidor, como proteína no ligada. Los resultados
fueron equivalentes en ambos casos, siendo las diferencias en las
energías de Gibbs en promedio inferiores a 0,5 kcal/mol. Para los
casos en los que las desviaciones fueron mayores (2upj, 1hvi, 1hvj,
1hvk, 9hvp del archivo pdb), las desviaciones se hallaron en las
conformaciones de cadena lateral de Phe 53B, Lys 55B, Arg 41A y Arg
41B. Estas cadenas laterales se exponen a disolventes y lejos del
sitio de unión, que indica que las diferencias conformacionales no
están referidas al inhibidor. El análisis estadístico de los datos
revela que las energías libres de unión se predicen con una
desviación estándar de \pm 1,1 kcal/mol y un error estándar de
0,3 kcal/mol. La desviación estándar asciende a una incertidumbre
relativa de \pm 10%. El análisis de correlación entre los valores
de \DeltaG experimentales y predichos da una pendiente de 0,982
con un coeficiente de correlación de 0,85. Las predicciones
estructurales no muestran desviaciones sistemáticas y son
suficiente exactas para permitir un examen de las diferentes
contribuciones a la energía de
unión.
unión.
Según el análisis, la unión de los trece
inhibidores a la enzima está dominada por el efecto hidrófobo. Con
la unión, no sólo el propio inhibidor, sino también los residuos de
proteasa localizados en el punto de unión, tapan una superficie no
polar significativa del disolvente. De hecho, la fracción promedio
de área no polar tapada por el disolvente con la unión es 0,737
\pm 0,02, que es mucho mayor que la fracción tapada por una
proteína globular típica con el plegamiento (entre
0,55-0,60). Como es lógico, la mayor contribución a
la energía de Gibbs de unión se da por la entropía favorable
resultante de la liberación de las moléculas de agua asociadas con
la desolvatación de estas superficies. Por otra parte, las
contribuciones entálpicas debidas a esos efectos genéricos son
desfavorables a temperatura ambiente ya que están dominadas por la
entalpía positiva de desolvatar grupos hidrófobos. El desglose de
las energías se resume en la tabla 1.
Los valores de capacidad calorífica enumerados
en la tabla 1 son de la misma magnitud que los medidos para otros
inhibidores de la proteasa (Gomez y col., 1995). La magnitud de los
cambios de las capacidades caloríficas está dominada por cambios en
la solvatación de grupos polares y no polares y no se espera que
esté significativamente afectada por otras interacciones (Gomez y
col., 1995). Los valores de las entalpías enumeradas en la tabla 1
sólo incluyen contribuciones genéricas y no pueden compararse
directamente con valores experimentales ya que no están incluidas
las contribuciones electrostáticas y otras. Esta entalpía genérica
está compuesta fundamentalmente de dos efectos opuestos, un
componente favorable debido a la formación de enlaces de van der
Waals, de hidrógeno y otras interacciones entre el inhibidor y la
proteasa, y un componente desfavorable debido a la desolvatación.
Debido al carácter sumamente hidrófobo de los inhibidores, el
término dominante es el término de desolvatación. Sin embargo, esto
no es un fenómeno general como se demuestra para la unión de algunos
inhibidores de péptidos que presenta una entalpía favorable en
ciertas condiciones (Gomez y col., 1995 (b)). Como se muestra en la
tabla 1, los términos de estructura/solvatación incluidos en
\DeltaG_{gen} hacen la mayor contribución a la energía de Gibbs
total de unión. Todos los inhibidores son sumamente hidrófobos y
carecen de grupos polares. Por este motivo se predice que las
interacciones electrostáticas contribuyen muy poco a la energía de
Gibbs de unión. La única contribución electrostática significativa
descrita por la ecuación 10 surge del cambio en el entorno de Asp
25, Asp 29 y Asp 30, que pueden contribuir hasta 0,7 kcal/mol
dependiendo del inhibidor. Esta contribución surge de la
transferencia de carga del agua a un entorno con una constante
dieléctrica algo inferior. Según los resultados experimentales de
Garcia-Moreno y col. (Garcia-Moreno
y col., 1997), la constante dieléctrica en el interior de una
proteína no es inferior a \sim15. Según estos autores, la
constante dieléctrica de diferentes regiones de proteínas oscila
entre 15 y 78,5 dependiendo de la accesibilidad del disolvente.
Para el conjunto entero de inhibidores,
esencialmente el mismo conjunto de residuos de proteasa, aunque con
diferente resistencia, se observó que contribuyen a las energías de
unión, reflejando el hecho de que han sido elegidas como diana para
el mismo sitio en la molécula. La tabla 2 resume los aminoácidos en
la molécula de proteasa que contribuyen con más de 0,1 kcal/mol a
la energía libre total de unión para al menos uno de los
inhibidores. Los valores enumerados en la tabla no incluyen la
contribución correspondiente al inhibidor (\sim 55% de la energía
de Gibbs total de unión) o la entropía translacional que no puede
atribuirse a un aminoácido particular. Las figuras 12A y 12B
muestran la localización de estos aminoácidos en la estructura de
proteasa.
Desde un punto de vista energético, el punto de
unión se define por aminoácidos que pertenecen a cuatro regiones no
contiguas en la secuencia. Los aminoácidos en la región contienen
el grupo Asp catalítico (Asp25, GIy27, A1a28, Asp29, Asp30), la
denominada región de lengüeta (Met 46, Ile 47, Gly 48, Gly 49, Ile
50), la hebra entre los residuos 80-86 (Pro 81, Val
82, Ile 84) y Arg8 que contribuye significativamente a la energía
de unión. Debido a la estructura química de los inhibidores, ambas
cadenas en la molécula de proteasa contribuyen de un modo más o
menos simétrico a la energía de Gibbs total de unión. En todos los
casos, la región que contiene el grupo Asp catalítico es la mayor
contribuyente a la energía de unión.
La figura 13 muestra las constantes de
estabilidad de residuos calculadas para la molécula de proteasa del
VIH-1. Estas constantes mapean la molécula de
proteína en términos de la estabilidad estructural de regiones
diferentes (Hilser y col., 1996 (a); Hilser y col., 1997 (a); Hilser
y col., 1997 (b)). Los residuos de proteínas con una alta
probabilidad de estar en la conformación nativa se caracterizan por
altas constantes de estabilidad, mientras que los residuos que son
más probables de no estar estructurados tienen bajas constantes de
estabilidad.
Se predice que dos regiones de la molécula de
proteasa del VIH-1 tienen la mayor estabilidad. La
región que incluye los residuos 13-32 y la región
que incluye los residuos 82-92. Estas dos regiones
están distantes en la secuencia, pero próximas en el espacio
tridimensional y definen, hasta un grado significativo, el núcleo
hidrófobo de la molécula. Se predice que las partes de estas dos
regiones (residuos 23-29 en el extremo amino y
86-99 en el extremo carboxi), además de los nueve
primeros residuos en la secuencia, contribuyen significativamente a
la interfase de dimerización. Se predice que esta región de la
proteína está plegada y bien estructurada en la inmensa mayoría de
los estados conformacionales que son accesibles a la proteasa en
condiciones nativas. La tríada del sitio activo (Asp 25, Thr 26, Gly
27) está localizada en la parte más estable de la molécula como se
muestra en las figuras 12A y 12B. Esta conclusión concuerda con los
resultados de los análisis cristalográficos que identifican este
área de la molécula como bastante rígida debido a una densa red de
enlaces de hidrógeno (Wlodawer y col., 1993). Los residuos
82-92 comprenden la mayoría de la hélice h' bien
definida y sumamente estable. A la inversa, la región entre los
residuos 40-60, que se corresponde con la lengüeta,
se caracteriza por constantes de estabilidad muy bajas por residuo
y se predice que no está estructurada, incluso en condiciones
nativas. En los complejos, la lengüeta está estabilizada por sus
interacciones con los inhibidores. Se obtuvieron resultados
similares con la estructura de la proteína libre (1hhp del archivo
pdb) o con estructuras de proteínas obtenidas de complejos mediante
la eliminación de las coordenadas del inhibidor. Esta observación
sugiere que en el complejo proteasa/inhibidor la lengüeta está
estabilizada por interacciones con el inhibidor y no con la
proteína.
Las figuras 12A, 12B y 13 también indican la
localización de los residuos que contribuyen significativamente a
la energía de Gibbs de unión. Es obvio que el sitio de unión está
compuesto de residuos que pertenecen a las regiones más y menos
estables de la molécula de proteasa. Este carácter dual del punto
de unión define uno de los rasgos más fundamentales de la unión del
inhibidor a la molécula de proteasa. Esencialmente, la mitad del
sitio de unión está previamente formado, mientras que la otra mitad
se forma durante la unión. La región más estable (que contiene
componentes del sitio de unión Asp 25, Gly 27, Ala 28, Asp 29, Asp
30, Pro 81, Val 82, Ile 84) está esencialmente bloqueada en una
conformación competente por la unión antes de que se produzca la
unión. Por otra parte, la región de lengüeta (que contiene
componentes del sitio de unión Met 46, Ile 47, Gly 48, Gly 49, Ile
50) no está estructurada en buena parte antes de la unión y está
forzada a una única conformación por su interacción con el
inhibidor. Por este motivo, los residuos de proteasa que no están
en contacto directo con el inhibidor, pero que pueden afectar,
estructural o energéticamente, la facilidad con la que la lengüeta
adopta su conformación de unión, influirán las energías de unión
globales.
Las energías de unión descritas anteriormente
proporcionan cierto entendimiento sobre la naturaleza de los
cambios en los mutantes de la proteasa del VIH-1
que se han observado que provocan resistencia in vivo a
múltiples inhibidores. Se han identificado varias mutaciones en
cepas virales de pacientes tratados con inhibidores de la proteasa.
Por ejemplo, se ha mostrado que el tratamiento con
Ro31-8959 (saquinavir) induce consistentemente el
mutante doble G48V + L90M (Roberts, 1995). La selección in
vitro de mutantes por A77003 incluyen V821, M46L, M46F, V321,
V32I + V82I y R8Q (Kaplan y col., 1994). Las variantes resistentes a
VX478 que se han identificado son M461 y 150V (Schinazi y col.,
1996; Tisdale, 1996). Un estudio reciente ha mostrado que cuatro
mutaciones (M46I + L63P + V82T + 184V) son suficientes para provocar
resistencia cruzada a los inhibidores MK639, XM323, A80987,
Ro31-8959, VX478 y SC52151 (Condra y col., 1995).
Algunas de estas mutaciones están localizadas en el punto de unión y
se cree que afectan la afinidad de unión mediante una alteración
directa de las interacciones proteasa/inhibidor. Otras mutaciones
están en localizaciones distantes y se espera que afecten la
afinidad mediante interacciones cooperativas.
En general, las mutaciones en la proteasa del
VIH-1 pueden afectar las energías de unión mediante
una interacción directa con el inhibidor, mediante un efecto
cooperativo en que el aminoácido mutado no interacciona
directamente con el inhibidor, pero afecta las interacciones entre
los residuos de proteasa que provocan una interacción
proteasa/inhibidor alterada, o mediante cualquier combinación de
ambos. Por ejemplo, algunas mutaciones están localizadas o en la
región de lengüeta o bisagra y algunas de ellas están distales del
sitio de unión (por ejemplo L63P, A71 V). Como se trata
anteriormente, la lengüeta está esencialmente desordenada en la
enzima libre. Por tanto, si una mutación induce una barrera de
energía sustancial para que la lengüeta adopte su conformación
unida, afectará la afinidad de unión, aunque la mutación está
distal del punto de unión. Las mutaciones como L63P o A71 V
disminuirán los grados de libertad conformacionales de esa región y
harán inaccesibles algunas conformaciones o energéticamente
desfavorables (D'Aquino y col., 1996).
Se han medido las constantes de inhibición para
A77003 hacia algunos mutantes (Kaplan y col., 1994) y hay un caso
para el que también está disponible la estructura cristalográfica
del complejo; el complejo de A77003 con la proteasa del
VIH-1 del mutante V82A (Baldwin y col., 1995). Los
cálculos termodinámicos basados en la estructura se realizaron en el
complejo mutante dando una energía libre de unión de -12394 cal/mol
comparada con el valor de -13167 cal/mol obtenido para el tipo
natural. Estas energías libres se traducen en un reducción de 3,7
veces la afinidad de unión para el mutante que se compara
favorablemente con la reducción de 4 veces medida experimentalmente
(Baldwin y col., 1995). Más importante que la comparación numérica
es el mecanismo mediante el que una única mutación afecta la
afinidad de unión. El mapeo estructural de las energías de unión en
los complejos salvajes y mutantes revela que el hecho de la
mutación no puede asignarse a un único sitio y que la energía libre
de Gibbs de unión está redistribuida por todo el punto de unión.
Este resultado está de acuerdo con el análisis cristalográfico de
Baldwin y col. (Baldwin y col., 1995), quienes también concluyeron
que el efecto de la mutación V82A no puede racionalizarse por la
deleción de un único grupo metilo en cada cadena, y que el efecto
global es debido a que la reorganización del esqueleto inducida por
esa mutación. La figura 14 muestra los valores de \Delta\DeltaG
calculados entre el tipo mutante y salvaje para todos los residuos
que contribuyen con más de 0,1 kcal/mol a la energía libre de
unión. Este caso ilustra muy claramente que, incluso para la
sustitución de un único grupo metilo, la energía de Gibbs de unión
no puede racionalizarse mediante la simple adición de contribuciones
de grupo. Las contribuciones tales como aquellas tabuladas en la
tabla 2 dependen del contexto global de cada grupo. También indica
que la interpretación del efecto de mutaciones en la afinidad de
unión de un inhibidor requiere un análisis global, aunque la
mutación está localizada en el punto de unión.
La energía libre de unión del inhibidor a la
molécula de proteasa refleja un discreto equilibrio entre términos
de entalpía y entropía mutuamente compensatorios. Estos términos
compensatorios definen los controles termodinámicos principales en
el diseño molecular. Las modificaciones moleculares que dan como
resultado una entalpía más favorable ocasionan contribuciones de
entropía desfavorables, un fenómeno conocido como compensación de
entalpía-entropía. Por tanto, los propios cambios de
entalpías y entropías están compuestos de contribuciones opuestas.
La entalpía de desolvatación se opone a la entalpía de formación de
interacciones internas, y la entropía conformacional se opone a la
entropía de desolvatación. El diseño molecular requiere una
predicción exacta de estos efectos con el fin de minimizar las
consecuencias no deseadas de cambios compensatorios.
La alta exactitud con la que pueden predecirse
las afinidades de unión de varios inhibidores de la proteasa del
VIH-1 a partir de la estructura sugiere que la
aproximación presentada en este documento pueden usarse para ayudar
en el diseño de nuevos inhibidores de la proteasa. Además, dado que
la parametrización estructural de las energías de unión explica bien
el cambio observado en la constante de inhibición entre el tipo
natural y un mutante resistente de la proteasa del
VIH-1 para el que está disponible la estructura de
alta resolución, esta aproximación tiene potencial para tratar el
asunto de la resistencia en el diseño molecular.
El desarrollo de una parametrización de la
estructura de las energías de plegamiento y unión de la proteína
(Bardi y col., 1997; D'Aquino y col., 1996; Gomez y col., 1995 (a);
Gomez y col., 1995 (b); Hilser y col., 1996 (b); Luque y col.,
1996) ha mostrado ser suficientemente exacto para predecir las
propensiones helicoidades de aminoácidos con una exactitud mejor de
0,2 kcal/mol (Luque y col., 1996), para predecir correctamente la
estabilidad global de proteínas y las constantes de estabilidad por
residuo como se refleja en el modelo de los factores de protección
de intercambio de hidrógeno detectados por RMN (Hilser y col., 1996
(c); Hilser y col., 1997 (a); Hilser y col., 1997 (b)), y para
predecir la afinidad de unión de trece inhibidores de la proteasa
del VIH-1 para los que están disponibles
estructuras de alta resolución con una exactitud mejor a \pm 1
kcal/mol (Bardi y col., 1997). Debido a que la parametrización ha
alcanzado el estado en el que parece posible la exacta predicción
de energías de plegamiento de proteínas o afinidades de unión,
parece apropiado empezar el desarrollo de estrategias de diseño
molecular basadas en estos principios termodinámicos.
Las proteinasas aspárticas comprenden una gran
familia de enzimas ampliamente distribuidas encontradas en
vertebrados, hongos, plantas y retrovirus. Algunos miembros de la
familia han llegado a ser el foco de interés creciente debido a su
relevancia médica, por ejemplo, la proteasa del VIH codificada por
el virus de la inmunodeficiencia humana que desempeña un papel
principal en la maduración del virus, la renina que desempeña un
papel importante en la regulación de la tensión arterial, catepsina
D, una enzima clave en la degradación intracelular de proteínas y
de la que se sospecha que participa en procedimientos tales como el
catabolismo de proteínas, procesamiento de antígenos, enfermedades
degenerativas y progresión del cáncer de mama, etc. Previamente se
ha mostrado que la endotiapepsina es un modelo de buen
comportamiento para el análisis termodinámico de proteasas
aspárticas (Gomez y col., 1995 (b)). En particular, la asociación
del inhibidor general de proteasas aspárticas, pepstatina A, se ha
estudiado en gran detalle con esta proteína (Gomez y col., 1995
(b)). Además, las estructuras cristalográficas del complejo de
endotiapepsina con pepstatina A, además de la proteína libre, son
conocidas (Bailey y col., 1993; Blundell y col., 1990), facilitando
así la aplicación y prueba de las estrategias de diseño basadas en
la estructura tratadas en este documento.
En el ejemplo presentado en este documento se ha
puesto en práctica un simple algoritmo de minimización para
identificar la secuencia de un ligando de péptido que satisface
criterios de unión predeterminados. El punto de partida de este
algoritmo es la estructura de alta resolución del complejo
péptido/proteína que se usa como una plantilla para mutaciones y el
análisis conformacional. La aplicación satisfactoria de este
algoritmo a la asociación de pepstatina A y endotiapepsina
demuestra que la parametrización estructural de las energías puede
usarse en el diseño molecular racional.
Este ejemplo trata de la modificación de un
ligando de péptido y el diseño de variantes de péptidos que
presentan diferentes afinidades de unión para la proteína diana. Se
consideran dos procedimientos no mutuamente exclusivos. Las
mutaciones en la secuencia mediante la sustitución de cadenas
laterales en posiciones existentes en el péptido y la alteración de
la longitud de cadena del péptido mediante la adición o deleción de
aminoácidos. En todos los casos, el punto de partida es un complejo
péptido/proteína para el que se conoce la estructura de alta
resolución. Se supone que la estructura global del complejo mutado
permanece esencialmente inalterada y que los efectos de una
mutación están restringidos a sus alrededores inmediatos.
Una vez que se hace la mutación es necesario
mostrar el conjunto de posibles conformaciones y evaluar la energía
y probabilidad correspondiente de cada conformación. La
probabilidad de una única conformación de péptido, definida por un
conjunto específico de coordenadas de las cadenas laterales y el
esqueleto, viene impuesta por una función de energía de Gibbs,
\DeltaG_{ef}, especificada por la entalpía de interacciones
péptido/proteína intra e intermoleculares más la entalpía y
entropía de solvatación. \DeltaG_{ef} es una función de los
ángulos de torsión de las cadenas laterales y el esqueleto. Por
definición, la entropía conformacional del propio péptido no entra
dentro de la ecuación. \DeltaG_{ef} es la función de energía de
Gibbs o función de potencial de Gibbs de una única conformación y
no debe confundirse con la energía de Gibbs de unión que incluye
todas las conformaciones aceptables. La situación se ilustra en las
figuras 15A y 15B para dos conformaciones hipotéticas de una cadena
lateral. Estas conformaciones no sólo presentan diferentes
interacciones intramoleculares, sino también diferentes grados de
solvatación que definen la función de energía de Gibbs,
\DeltaG_{ef}. La probabilidad de cualquier conformación dada
viene dada por la ecuación
en la que e^{- \Delta G}
_{ef,i}/RT es el exponente de Boltzmann para esa conformación, y
la suma en el denominador es la función de partición conformacional
definida como la suma de los exponentes de Boltzmann de todas las
conformaciones. La función de potencial de Gibbs, \DeltaG_{ef},
se usa para identificar la conformación más probable de una cadena
lateral o esqueleto. Para cualquier conformación dada,
\DeltaG_{ef} se calcula a partir de la estructura usando la
parametrización estructural de las energías descritas anteriormente
(Bardi y col., 1997; Gomez y col., 1995 (a); Gomez y col., 1995
(b); D'Aquino y col., 1996; Hilser y col., 1996 (b); Luque y col.,
1996) sin incluir la entropía
conformacional.
Las conformaciones de cadenas laterales se
generan variando sistemáticamente los ángulos diédricos entre 0° y
360° (\chi_{1} para Cys, Ser, Thr y Val; y \chi_{2} para
Asn, Asp, His, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr; \chi_{1}, \chi_{2} y
\chi_{3} para Gln, Glu, Met; \chi_{1}, \chi_{2},
\chi_{3} y \chi_{4} para Lys; y \chi_{1}, \chi_{2},
\chi_{3}, \chi_{4} y \chi_{5} y para Arg). Para estas
cadenas laterales con un único diedro, el valor de \chi_{1}
varía cada grado, para cadenas con hasta tres diedros cada 10°, y
para números mayores cada 30°. Para conformaciones del esqueleto
los ángulos de torsión \phi y \psi también varían cada 10°
entre 0° y 360°.
Pueden hacerse refinamientos identificando
conformaciones que están próximas a un mínimo de energía y reducen
los intervalos de rotación. No todas las conformaciones generadas
de este modo son factibles debido a impedimentos estéricos. Para
cada conformación se comprueban las colisiones de van der Waals
usando el conjunto de MMII de radios de van der Waals eficaces
publicados por Iijima y col. (Calibration of effective van der
Waals atomic contact radii for proteins and peptides, Protein,
2:330-339, 1987). Se rechazan aquellas
conformaciones que presentan colisiones de van der Waals. La
función de potencial de Gibbs \DeltaG_{ef} sólo se calcula para
conformaciones permitidas. Este algoritmo de minimización se ha
puesto en práctica en el programa informático CALVIN.
Se probó la capacidad de la parametrización
estructural para localizar correctamente mínimos de energía
mediante la aplicación del algoritmo de minimización para la
optimización de conformaciones de cadena lateral en posiciones
centrales de hélices alfa expuestas. Los perfiles de energías
resultantes y en particular la localización de los mínimos y
submínimos se caracterizaron bien por el algoritmo y concuerdan
bien con los publicados anteriormente (Janin y col., 1978; Lee y
col., 1994). Los resultados obtenidos para fenilalanina se ilustran
en la figura 16.
En todos los casos, los conjuntos de coordenadas
para los complejos entre la proteína y los péptidos mutados se
generan usando las coordenadas del complejo de tipo natural como
una plantilla. Los mutantes de sustitución se crean mediante la
sustitución de la cadena lateral original con la mutación deseada,
dejando el esqueleto en la conformación original. Para mutaciones
que implican la adición de un aminoácido extra en cualquier extremo
de la cadena del péptido, los ángulos de torsión del esqueleto
también están incluidos en la minimización.
La pepstatina A
(Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta,
en la que Iva representa ácido isovalérico) es un potente inhibidor
y de procedencia natural de la proteinasa aspártica. El inhibidor
contiene dos residuos del aminoácido inusual estatina (Sta: ácido
4(S)-amino-3(S)-hidroxi-6-metilheptanoico).
La estatina central actúa como un estado de transición no
hidrolizable de manera análoga a los dos residuos que contribuyen al
enlace peptídico escindible en el sustrato. Se estudiaron dos
diferentes mutaciones de pepstatina A. En la primera se eligió como
diana para la sustitución Ala 5, que se identificó antes como un
débil contribuyente a la energía de Gibbs de unión (Gomez y col.,
1995 (b)). En esta posición se consideraron doce mutaciones posibles
(Cys, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val). Para
cada una de estas mutaciones se identificó la conformación más
probable. En el segundo caso se consideró la adición de un
aminoácido al extremo carboxi de pepstatina A. En este caso se
realizó una optimización simultánea de las conformaciones de la
cadena lateral y el esqueleto con el fin de identificar la
conformación más probable.
La afinidad de unión del péptido para la
proteína viene impuesta por la energía de Gibbs de unión que se
calcula a partir de las estructuras del complejo, la proteína libre
y el péptido libre como se describen anteriormente (Bardi y col.,
1997; D'Aquino y col., 1996; Gomez y col., 1995 (a); Gomez y col.,
1995 (b); Hilser y col., 1996 (b); Luque y col., 1996). Para cada
complejo mutante se usaron las coordenadas atómicas
correspondientes a la conformación que minimiza la función de
potencial de Gibbs. Para los péptidos libres, las accesibilidades
del disolvente se corresponden con un promedio en peso de Boltzmann
de las conformaciones de las cadenas laterales y del esqueleto
(Luque y col., 1996).
La figura 17 muestra el perfil del potencial de
Gibbs como una función de los diedros de cadenas laterales
\chi_{1} y \chi_{2} para el mutante A5F. Claramente se
observa que el anillo aromático está esencialmente bloqueado en un
estrecho conjunto de valores de \chi_{1}, mientras que tiene una
probabilidad finita de mostrar un intervalo más amplio de valores
de \chi_{2}. Las probabilidades a lo largo de \chi_{1} y
\chi_{2} se determinan mediante una estadística de Boltzmann
definida en términos del potencial de Gibbs de cada conformación. A
lo largo del eje \chi_{1} y \chi_{2}, el perfil del
potencial de Gibbs muestra un mínimo bien definido a 169° y 51°,
respectivamente.
La figura 18 resume las diferencias esperadas en
energías de Gibbs calculadas para las diferentes mutaciones de
aminoácidos en la posición 5. Los valores de \Delta\DeltaG están
referidos al tipo natural. Es obvio en el gráfico que los
aminoácidos aromáticos (Phe, Trp y Tyr) están predichos para
provocar el mayor aumento en la afinidad de unión. Las constantes
de unión predichas para los tres aminoácidos aromáticos están
dentro de 0,2 kcal/mol, que está por debajo de la incertidumbre de
predicción esperada y no pueden considerarse estadísticamente
significativas. Para comprobar la predicción termodinámica basada
en la estructura se sintetizó el mutante A5F de pepstatina A y la
constante de inhibición global se determinó experimentalmente. Como
se muestra en la tabla 3, según el comportamiento predicho, el
mutante A5F se une a endotiapepsina más fuertemente que la propia
pepstatina A. Su constante de unión predicha, 7,4 x 10^{9}
M^{-1}, está muy próxima a la experimentalmente determinada, 5,3
x 10^{9} M^{-1}, y la desviación de \DeltaG de su valor
predicho (0,2 kcal/mol) está dentro del error experimental.
Desafortunadamente, debido a que el mutante A5F es más hidrófobo que
la pepstatina A de tipo natural y presenta menor solubilidad en
agua, en este caso no fue posible una medición calorimétrica
directa del cambio de la entalpía de unión y de la capacidad
calorífica.
La segunda mutación considerada en este estudio
implicó la adición de un aminoácido en el extremo carboxi del
péptido. Con el fin de mejorar la solubilidad del péptido y
facilitar el análisis calorimétrico, se decidió añadir un residuo
de glutamato a pesar de la predicción de una menor afinidad de
unión. A 16°C, la unión de este inhibidor fue exotérmica y se
caracterizó por un cambio de entalpía (\DeltaH) de -4,6 \pm 0,1
kcal/mol. El cambio de la capacidad calorífica (\DeltaC_{p})
obtenido a partir de la dependencia de la temperatura de la
entalpía de unión fue igual a -260 \pm 20 cal/K\cdotmol. Para
comparación, la capacidad calorífica calculada de la estructura
derivada es -220 cal/K\cdotmol, y el cambio de entalpía genérica,
excluyendo los efectos de protonación, es -6,8 kcal/mol. Estos
valores son del mismo orden que los medidos para pepstatina A en
las mismas condiciones (\DeltaH = -4,1 kcal/mol y \DeltaC_{p}
= -310 cal/K-mol)^{2}. Este resultado
indica que la diferencia principal en las afinidades de unión entre
el tipo natural y el mutante de adición E7 es fundamentalmente
entrópica.
Los parámetros termodinámicos experimentales y
calculados para pepstatina A y las dos mutaciones se resumen en la
tabla 3. Como se predice, el mutante A5F tiene una afinidad más alta
que la pepstatina A de tipo natural, mientras que el mutante de
adición E7 tiene una afinidad inferior que el tipo natural. La
concordancia entre los valores de \DeltaG predichos y
experimentales es excelente. La diferencia promedio entre \DeltaG
predicha y experimental es 0,23 \pm 0,06 kcal/mol. Este resultado
indica que la parametrización basada en la estructura de las
energías tiene suficiente sensibilidad y resolución para el diseño
de péptidos.
Para endotiapepsina se conocen las estructuras
de alta resolución de la proteína en su forma libre y unida y son
posibles cálculos exactos de afinidades de unión. Sin embargo, en
muchos casos sólo se conoce la estructura del complejo. Si este es
el caso, las energías de Gibbs de unión del mutante respecto al
tipo natural todavía pueden calcularse con la misma exactitud, y
por tanto el diseño de péptidos puede hacerse con la misma
precisión. Esta situación persiste aunque haya un cambio
conformacional significativo entre las proteínas libres y
complejadas.
En pepstatina A, el residuo de alanina en la
posición 6 está localizado en un sitio hidrófobo relativamente
grande sin establecer buenos contactos de van der Waals con la
enzima y sin tapar una superficie significativa del disolvente
(figura 19A). Se predice que Phe, Tyr y Trp presentan una afinidad
más alta debido a que el anillo aromático de estos aminoácidos se
ajusta parcialmente en esa cavidad y optimiza las interacciones con
Leu 133, Ser 78, Ile 77 y Ser 39 como se muestra en la figura 19B.
Aunque el anillo aromático de fenilalanina sólo se tape
parcialmente, las interacciones y la desolvatación adicional
presentada por Leu 133, Ser 78, Ile 77 y Ser 39 proporcionan más de
la energía de Gibbs adicional de unión.
La energía de Gibbs de unión del mutante A5F es
aproximadamente 1 kcal/mol más favorable que el tipo natural. La
contribución debido a la entropía de desolvatación adicional que se
produce tapando un número mayor de grupos hidrófobos es próxima a 4
kcal/mol. Sin embargo, esta contribución entrópica está
parcialmente compensada por un cambio de entalpía menos favorable
(\sim2 kcal/mol más positiva para A5F) y una mayor pérdida de
entropía conformacional (\sim1 kcal/mol) debido a las
restricciones adicionales en los grados de libertad de la cadena
lateral con la formación del complejo. El cambio de entalpía para
A5F es menos favorable que para el tipo natural porque la entalpía
de desolvatación adicional no puede completarse completamente por
las interacciones adicionales entre el péptido y la molécula de
proteasa. Como es el caso en todos los procedimientos de unión,
simultáneamente se producen varias interacciones de compensación: 1)
compensación de entalpía/entropía; 2) compensación entálpica entre
interacciones de solvatación/intermoleculares; y 3) compensación
entrópica entre entropía de solvatación y conformacional. Como
resultado, el cambio de energía libre global es más pequeño que las
contribuciones aisladas.
En el caso del mutante E7, la longitud del
péptido se ha aumentado en el extremo carboxi. El glutamato
adicional indica hacia fuera del cuerpo de la proteína y no
interacciona significativamente con ningún residuo. Esto se refleja
en las entalpías similares y las capacidades caloríficas observadas
para este mutante y la pepstatina A de tipo natural. La diferencia
en las energías de Gibbs de unión es principalmente entrópica y
debida fundamentalmente a la pérdida de entropía conformacional del
glutamato con la unión. Esta pérdida de entropía conformacional no
está compensada por una interacción favorable ni entálpica ni
entrópica, y da como resultado un aumento significativo en \DeltaG
y la consiguiente pérdida de afinidad de unión. La figura 20
muestra la localización predicha del residuo de glutamato.
Los resultados presentados en este documento
demuestran que la parametrización estructural de las energías
desarrolladas anteriormente en este laboratorio (Bardi y col.,
1997; D'Aquino y col., 1996; Gomez y col., 1995 (a); Gomez y col.,
1995 (b); Hilser y col., 1996 (b); Luque y col., 1996) tiene la
exactitud y resolución necesaria para usarse en algoritmos de
minimización para el diseño molecular. El algoritmo descrito en
este documento ha permitido el diseño de dos péptidos mutantes que
presentan energías de unión experimentales similares a las
predichas mediante ordenador. El éxito de este procedimiento valida
el uso de esta aproximación en el diseño de ligandos de
péptidos.
Los procedimientos y mecanismos descritos en
este documento no se limitan a ninguna configuración particular de
hardware o software, sino que pueden encontrar aplicabilidad en
cualquier entorno informático o de procesamiento usado junto con
servicios informáticos en línea.
La invención puede ponerse en práctica en
hardware o software, o una combinación de ambos. Sin embargo,
preferentemente, la invención se pone en práctica en programas
informáticos ejecutados en ordenadores programables, comprendiendo
cada uno al menos un procesador, al menos un sistema de
almacenamiento de datos (que incluye memoria volátil y no volátil
y/o elementos de almacenamiento), al menos un dispositivo de entrada
y al menos un dispositivo de salida. El código de programa se
aplica para introducir datos para realizar las funciones descritas
en este documento y generar información de salida. La información
de salida se aplica de modo conocido a uno o más dispositivos de
salida.
Cada programa se pone en práctica
preferentemente en un lenguaje de programación de procedimiento de
alto nivel u orientado a objetos para comunicar con un sistema
informático.
Sin embargo, los programas pueden ponerse en
práctica en conjunto o lenguaje de máquina, si se desea. En
cualquier caso, el lenguaje puede ser un lenguaje compilado o
interpretado.
Cada uno de tales programas informáticos se
almacena preferentemente en un medio o dispositivo de
almacenamiento (por ejemplo, ROM o disquete magnético) legible por
un ordenador programable para fines generales o especiales, para
configurar y hacer funcionar el ordenador cuando el medio o
dispositivo de almacenamiento es leído por el ordenador para
realizar los procedimientos descritos en este documento. El sistema
inventivo también puede considerarse como puesto en práctica como
un medio de almacenamiento legible por ordenador configurado con un
programa informático, en el que el medio de almacenamiento así
configurado hace que un ordenador funcione de un modo específico y
predefinido para realizar las funciones descritas en este
documento.
Se han descrito varias realizaciones de la
presente invención. Sin embargo, se entenderá que pueden hacerse
diversas modificaciones sin apartarse del alcance de la invención.
Por consiguiente, otras realizaciones están dentro del alcance de
las reivindicaciones.
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Claims (12)
1. Un procedimiento asistido por ordenador para
generar dianas de unión predichas de una molécula seleccionada,
usando un ordenador programado que incluye un procesador, un
dispositivo de entrada y un dispositivo de salida, que incluye las
etapas de:
(a) introducir en el ordenador programado,
mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad
y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en la
molécula seleccionada;
(b) determinar, usando el procesador, para cada
átomo en la molécula seleccionada, una energía libre de Gibbs
predicha de unión del átomo a un ligando ideal para el átomo
(c) generar, usando el procesador, un modelo de
predicción tridimensional de dianas de unión en la molécula
seleccionada mediante la generación, usando las coordenadas
tridimensionales de cada uno de los átomos en la molécula
seleccionada, de un modelo de átomos en la molécula seleccionada y
mapear en cada átomo descrito en el modelo la energía libre de
Gibbs de unión predicha correspondientemente determinada; y
(d) descargar, al dispositivo de salida, el
modelo de predicción tridimensional generado de dianas de
unión.
2. Un procedimiento asistido por ordenador para
predecir la afinidad de unión de un ligando seleccionado para
unirse a un sitio de unión seleccionado de una molécula
seleccionada, usando un ordenador programado que incluye un
procesador, un dispositivo de entrada y un dispositivo de salida,
que incluye las etapas de:
(a) generar dianas de unión predichas de la
molécula seleccionada según el procedimiento de la reivindicación
1;
(b) identificar el sitio de unión seleccionado
como una región de la molécula seleccionada con una alta densidad
de átomos con alto potencial de unión;
(c) introducir en el ordenador programado,
mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad
y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en el
sitio de unión seleccionado de una molécula seleccionada;
(d) introducir en el ordenador programado,
mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad
y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en un
compuesto seleccionado;
(e) generar, usando el procesador, un modelo del
compuesto seleccionado unido al sitio de unión seleccionado;
(f) determinar, usando el procesador, las
coordenadas tridimensionales de una estructura minimizada en
energía del compuesto seleccionado cuando el compuesto seleccionado
está unido al sitio de unión seleccionado; y
(g) determinar, usando el procesador, una
afinidad de unión predicha del compuesto seleccionado minimizado en
energía para el sitio de unión seleccionado.
3. Un procedimiento asistido por ordenador para
construir un modelo de un ligando ideal para unirse a un sitio de
unión seleccionado de una molécula seleccionada, usando un
ordenador programado que incluye un procesador, un dispositivo de
entrada y un dispositivo de salida, que incluye las etapas de:
(a) generar dianas de unión predichas de la
molécula seleccionada según el procedimiento de la reivindicación
1;
(b) identificar el sitio de unión seleccionado
como una región de la molécula seleccionada con una alta densidad
de átomos con alto potencial de unión;
(c) introducir en el ordenador programado,
mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad
y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en el
sitio de unión seleccionado de la molécula seleccionada;
(d) determinar, usando el procesador, la
identidad y localización de un conjunto de átomos de ligando que
son energéticamente complementarios a cada uno de los átomos en el
sitio de unión seleccionado de la molécula seleccionada basado en
la optimización global de la energía de Gibbs de unión de cada uno
de los átomos de ligando en el conjunto de átomos de ligando;
(e) generar, usando el procesador, un modelo
tridimensional del conjunto de átomos de ligando unido al sitio de
unión seleccionado;
(f) descargar, al dispositivo de salida, el
modelo tridimensional del conjunto de átomos de ligando unido al
sitio de unión seleccionado.
\newpage
4. Un procedimiento asistido por ordenador para
clasificar cada ligando en un conjunto de ligandos seleccionados
por sus afinidades de unión predichas para unirse a un sitio de
unión seleccionado de una molécula seleccionada, usando un
ordenador programado que incluye un procesador, un dispositivo de
entrada y un dispositivo de salida, que incluye las etapas de:
(a) generar dianas de unión predichas de la
molécula seleccionada según el procedimiento de la reivindicación
1;
(b) identificar el sitio de unión seleccionado
como una región de la molécula seleccionada con una alta densidad
de átomos con alto potencial de unión;
(c) introducir en el ordenador programado,
mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad
y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en un
sitio de unión seleccionado de una molécula seleccionada;
(d) determinar la afinidad de unión predicha de
cada ligando en el conjunto de ligandos para el sitio de unión
seleccionado de la molécula seleccionada mediante:
- (i)
- introducción en el ordenador programado, mediante el dispositivo de entrada, de datos que incluyen la identidad y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en el compuesto seleccionado;
- (ii)
- generación, usando el procesador, de un modelo del compuesto seleccionado unido al sitio de unión seleccionado;
- (iii)
- determinación, usando el procesador, de las coordenadas tridimensionales de una estructura minimizada en energía del compuesto seleccionado cuando el compuesto seleccionado está unido al sitio de unión seleccionado; y (iv) determinación, usando el procesador, de una afinidad de unión predicha del compuesto seleccionado minimizado en energía para el sitio de unión seleccionado; y
(e) clasificar cada ligando según su afinidad de
unión predicha determinada.
5. El procedimiento asistido por ordenador para
generar dianas de unión predichas de una molécula seleccionada
según la reivindicación 1, en el que las dianas de unión predichas
están en una superficie interna no expuesta al disolvente de la
molécula seleccionada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
de:
(a) introducir en el ordenador programado,
mediante el dispositivo de entrada, datos que incluyen la identidad
y las coordenadas tridimensionales de cada uno de los átomos en un
estado parcialmente desplegado seleccionado de la molécula
seleccionada, incluyendo el estado parcialmente plegado
seleccionado una parte plegada y una parte desplegada;
(b) determinar, usando el procesador, para cada
átomo en la parte plegada del estado parcialmente desplegado
seleccionado de la molécula seleccionada, una energía libre de
Gibbs predicha de unión del átomo al ligando ideal para el
átomo;
(c) generar, usando el procesador, un modelo de
predicción tridimensional de dianas de unión en la parte plegada
del estado parcialmente desplegado seleccionado de la molécula
seleccionada mediante la generación, usando las coordenadas
tridimensionales de cada uno de los átomos en la parte plegada del
estado desplegado seleccionado de la molécula seleccionada, de un
modelo de los átomos en la parte plegada del estado parcialmente
desplegado seleccionado de la molécula seleccionada y mapear en
cada átomo descrito en el modelo la energía libre de Gibbs predicha
determinada correspondiente de unión; y
(d) descargar, al dispositivo de salida, el
modelo de predicción tridimensional generado de dianas de
unión.
6. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que dicho ligando seleccionado es un dipéptido.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que
incluye además: repetir las etapas (a)-(g) para una pluralidad de
dipéptidos seleccionados e identificar como dipéptido más destacado
el dipéptido seleccionado que tiene la mayor afinidad de unión
determinada.
8. El procedimiento de la reivindicación 6 o la
reivindicación 7, que incluye además:
(h) seleccionar un primer polipéptido de tres o
más aminoácidos, incluyendo el polipéptido el dipéptido;
(i) generar, usando el procesador, un modelo del
primer polipéptido seleccionado unido al sitio de unión
seleccionado;
(j) determinar, usando el procesador, las
coordenadas tridimensionales de una estructura minimizada en
energía del primer polipéptido seleccionado cuando el primer
polipéptido seleccionado está unido al sitio de unión seleccionado;
y
(k) determinar, usando el procesador, una
afinidad de unión predicha del primer polipéptido minimizado en
energía para el sitio de unión seleccionado.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, que
incluye además:
(l) seleccionar un segundo polipéptido que
incluye el primer polipéptido;
(m) generar, usando el procesador, un modelo del
segundo polipéptido seleccionado unido al sitio de unión
seleccionado;
(n) determinar, usando el procesador, las
coordenadas tridimensionales de una estructura minimizada en
energía del segundo polipéptido seleccionado cuando el segundo
polipéptido seleccionado está unido al sitio de unión seleccionado;
y
(o) determinar, usando el procesador, una
afinidad de unión predicha del segundo polipéptido minimizado en
energía para el sitio de unión seleccionado.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, que
incluye además:
(l) seleccionar una variante del polipéptido
seleccionado;
(m) generar, usando el procesador, un modelo del
polipéptido de variante seleccionada unido al sitio de unión
seleccionado;
(n) determinar, usando el procesador, las
coordenadas tridimensionales de una estructura minimizada en
energía del polipéptido de variante seleccionada en el que el
polipéptido de variante seleccionada está unido al sitio de unión
seleccionado; y
(o) determinar, usando el procesador, una
afinidad de unión predicha del polipéptido de variante seleccionado
minimizado en energía para el sitio de unión seleccionado.
11. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que el estado parcialmente desplegado seleccionado es el estado
parcialmente desplegado que tiene la menor energía de Gibbs de
cualquier estado parcialmente desplegado potencial de la molécula
seleccionada.
12. Un producto de programa informático que
reside en un medio legible por ordenador para realizar las etapas
de una cualquiera las reivindicaciones 1 a 11 cuando dicho producto
se ejecuta en un ordenador.
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|---|---|---|---|
| ES98925162T Expired - Lifetime ES2285774T3 (es) | 1997-06-02 | 1998-06-02 | Procedimiento informatico que utiliza calculos de energia libre para el diseño de ligandos y la prediccion de dianas de union. |
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