ES2277536B1 - Metodo molecular para el estudio genetico de poblaciones y el analisis de pedigri de la dorada (sparus aurata) y kit correspondiente (sparus aurata genotyping and paternity tool kit). - Google Patents
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Abstract
Método molecular para el estudio genético de poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus aurata) y kit correspondiente (Sparus aurata genotyping and paternity tool kit). Se presenta una herramienta molecular basada en marcadores microsatélites, consistente en la coamplificación mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa y el análisis de 10 loci, permitiendo, de una forma rápida y fiable, la obtención de suficientes datos de un individuo o grupo de individuos para llevar a cabo estudios de poblaciones, establecer relaciones de parentesco o de pedigrí con gran precisión. Esta información permite controlar e incluso mejorar las características de los stocks reproductores de dorada. Además, este protocolo ha sido adecuado para la detección y análisis automático en equipos de secuenciación AB (Applied Biosystem). Se presenta asimismo un kit con tres posibles formatos que permite la estandarización y automatización del método de forma sencilla y completamente reproducible.
Description
Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) y kit correspondiente (Sparus aurata genotyping and
paternity tool kit).
Tipificación genética; Identificación por
genotipado, pedigrí y parentesco molecular.
La dorada (Sparus aurata), es una especie
ampliamente distribuida por el mar Mediterráneo y la costa
Atlántica desde las Islas Británicas hasta la Isla de Cabo Verde e
Islas Canarias. Además, la dorada representa una de las especies
con mayor importancia en acuicultura marina, sobre todo en área del
Mediterráneo. Los principales productores son Grecia, Turquía,
España, Italia y Francia. Otras producciones menores se dan en
Portugal, Croacia, Chipre, Israel, Malta, Egipto, Túnez y
Marruecos, mientras que hay producciones incipientes en Albania,
Argelia y Libia. En España, la evolución del consumo aparente de
dorada crecerá en el periodo 2003-2006 de un 18% a
un 22,1% anualmente, según se den las condiciones de crecimiento de
renta y oferta de pescado blanco en un escenario medio u optimista,
para superar en 2006 las 37.000 ó 43.000 Tm respectivamente, sin
tener en cuenta el efecto positivo que tendría la posible
comercialización de transformados y de nuevas presentaciones de las
especies.
El éxito de la acuicultura moderna se basa en el
control sobre la reproducción de las especies, en el mejor
conocimiento de su biología, y en las innovaciones tecnológicas. Sin
embargo, en el cultivo de Dorada son muchas las dificultades que
surgen en el control y manejo de los stocks reproductores,
debido fundamentalmente al elevado número de individuos que se
manejan, la dificultad para identificar a los padres o de
identificar huevos o larvas en los primeros meses de desarrollo.
Estos y otros aspectos imposibilitan un control integral de la
reproducción de esta especie en cautividad y por tanto, de su
domesticación. De la misma forma el control de la trazabilidad
supone un reto para garantizar la seguridad alimenticia de los
productos derivados de la explotación comercial de esta especie,
tanto de su origen cultivado como procedente de la pesca.
Llegados a este punto, resulta imprescindible
contar con herramientas precisas que nos permitan conocer y evaluar
la estructura genética de las poblaciones tanto salvajes como
cultivadas y así trascender de una forma objetiva a la conservación
genética de sus recursos. En la actualidad se pueden encontrar en
distintas bases de datos, abundante información sobre secuencias de
ADN descritas para S. aurata. Esta información permite llevar
a cabo la tipificación de individuos de formas muy variadas. Sin
embargo hasta la actualidad, no se han estandarizado ningún método
para llevar a cabo dicha tipificación genética para la dorada.
Se presenta una nueva herramienta molecular
basada en marcadores microsatélites. Esta herramienta consiste en
la coamplificación mediante la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y análisis de 10 loci conjuntamente, de manera que,
de una forma rápida y fiable se obtienen suficientes datos de un
individuo o grupo de individuos como para llevar a cabo estudios de
poblaciones, establecer relaciones de parentesco o de pedigrí con
una gran precisión. Además, demostramos la utilidad de esta
herramienta en la caracterización genética de poblaciones naturales
y cultivadas, así como en la reconstrucción del pedigrí en puestas
obtenidas en una empresa del sector. Esta información permite
controlar e incluso mejorar las características de los
stocks reproductores de dorada.
La selección de los marcadores empleados, la
optimización de las condiciones de 2 reacciones de PCR (Reacción A
y reacción B), la caracterización de los loci empleados y su
adaptación al análisis automático, suponen el sustrato de la
presente solicitud. Además, este protocolo ha sido adecuado para
la detección y análisis automático en equipos de secuenciación AB
(Applied Biosystem). A partir de estos resultados se presenta un kit
con tres posibles formatos comercializables que permite la
estandarización y automatización de la técnica de genotipado de una
forma sencilla y completamente reproducible.
El empleo del protocolo desarrollado o de los
productos derivados de este (kit) presentan entre otras las
siguientes ventajas:
- -
- El método implementado de PCR múltiplex reduce el tiempo y coste de la técnica, minimizando el riesgo de errores de manejo, ya que reduce considerablemente la manipulación.
- -
- Metodología sencilla, sólida y reproducible que asegura unos resultados precisos.
- -
- Para realizar estos análisis tan solo es necesario una pequeña cantidad de ADN (aprox. 50 ng), que puede obtenerse de cualquier tipo de muestra que contenga células nucleadas, sin causar daño al animal, tales como huevos, larvas, trozo de aleta, sangre, trozos de tejidos de peces muertos o despiezados e incluso procesados.
- -
- Estandarización de los loci empleados y posible comparación de resultados de distintos trabajos realizados con esta herramienta.
- -
- Los loci empleados son altamente informativos y han sido probados en la identificación de individuos, en estudios de pedigrí y caracterización de poblaciones con resultados muy satisfactorios.
Si bien se han descrito métodos de genotipado
desarrollados para otros organismos (humanos y otras especies
domésticas de animales como caballos, perros, vacas, etc.), no
existe antecedente alguno para peces y en concreto para el caso de
la dorada. Por otra parte, para realizar análisis similares a los
que se pueden llevar a cabo con esta herramienta, se podrían usar
otros de los muchos loci existentes en la bibliografía, bien
mediante la estrategia de PCR sencilla o de múltiplex. No
obstante, ello conllevaría un importante esfuerzo adicional
consistente en: a) elegir en cada caso loci con un alto
polimorfismo y que presenten patrones amplificables bien
definidos; b) ajustar las condiciones de la PCR; c) investigar la
posible ocurrencia de alelos nulos; d) probar su utilidad con
muestras reales.
Los marcadores moleculares tipo microsatélite
son secuencias de ADN repetido que se distribuyen aleatóriamente a
lo largo del genoma de los organismos y que constituyen zonas muy
variables y por tanto, distintas de unos individuos a otros.
Estudiando estas regiones podemos distinguir a un individuo del
resto de individuos de la misma especie con una altísima precisión.
Esto es lo que significa la tipificación genética o genotipado de
un individuo. La herramienta propuesta permite también realizar
estudios de pedigrí para identificar los padres biológicos de un
individuo concreto. Cuanto más numerosas y variables son estas
regiones que estudiamos, mayor precisión se obtiene.
La invención consiste en un protocolo optimizado
para el estudio de 10 de estos marcadores en la dorada, Sparus
aurata ( Sparus aurata genotyping and paternity
tool). Se describe la coamplificación (PCR multiplex),
mediante 2 reacciones simultáneas (denominables como A y B) de 10
marcadores microsatélites (loci) mediante la técnica de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), usando para ello cebadores
específicos de cada microsatélite. Se incluye la selección de loci,
la composición de cada una de las reacciones (A amplifica 6 loci y
la B, 4 loci), las condiciones bajo las que se llevan a cabo, así
como su adaptación para el análisis automático mediante
fluorescencia. Ambas reacciones pueden emplearse bien de forma
individual o conjunta.
Los objetivos finales de la detección automática
consisten en optimizar las condiciones para hacer el análisis en
secuenciadores automáticos del tipo AB 310, 3100, 3130 y 3130
Avance (Applied Biosystem). No obstante, cambiando el marcaje
con fluorocromos, esta herramienta podría igualmente ser empleada
con otros equipos de análisis de marcadores genéticos.
Esta método se puede llevar a cabo mediante un
producto comercializable consistente en un kit con tres
presentaciones posibles que permiten la estandarización y
automatización de la técnica de genotipado de una forma sencilla y
completamente reproducible.
Estas tres presentaciones o formatos consisten
en reacciones de PCR de varios loci, cuyas disoluciones principales
se suministran preparadas en proporciones óptimas. A partir de estas
soluciones y del ADN del individuo se llevan a cabo las reacciones
siguiendo un protocolo detallado. Se contempla también la
posibilidad de presentaciones comercializables adicionales en las
que los componentes del kit se proporcionen liofilizados y
sólo se requiera añadir la muestra e hidratar la mezcla para que se
puedan desarrollar las reacciones. Las principales presentaciones
del kit, independientemente de que comprendan reactivos en una u
otra forma, son: Sparus aurata genotyping and paternity tool kit
sixplex, en la que se amplifican conjuntamente 6 loci
(anteriormente nos hemos referido a ella como Reacción A y lo
seguiremos haciendo a fin de simplificar su lectura). Sparus
aurata genotyping and paternity tool kit fourplex (a la
que nos referiremos como Reacción B), en la que se amplifican
conjuntamente 4 loci y Sparus aurata genotyping and
paternity tool kit six+fourplex (como Reacción A+B) en la que se
comercializan ambas reacciones. El modo de empleo irá descrito en un
protocolo detallado.
Este método se ha probado con excelentes
resultados, en la identificación de individuos y determinación del
pedigrí en individuos nacidos en una granja de doradas, aspecto de
singular importancia en el cultivo de peces en los que no es
posible hacer un seguimiento de los reproductores que realmente
participan en las puestas, a menos que se haga fecundación
artificial. Además esta herramienta se ha probado en la
caracterización genética de una población de 50 individuos
procedentes del medio natural.
Este método se puede emplear para controlar la
estructura genética de los stocks y así mantener niveles de
variabilidad acordes con una óptima eficiencia biológica, aplicar
métodos de selección y/o facilitar un seguimiento preciso de los
procesos de reproducción, cría, comercialización y trazabilidad.
Este control de los stocks cultivados permitiría evitar
posibles desastres ecológicos en las poblaciones naturales, tras
posibles escapes o repoblación.
El desarrollo de la metodología y el empleo de
los productos se detallan a continuación:
- -
- Selección de los loci y sus correspondientes cebadores
- -
- Condiciones de las PCR tipos A y B.
- -
- Caracterización de los loci empleados el las PCR A y B.
- -
- Condiciones requeridas para su análisis automático mediante fluorescencia
- -
- Desarrollo de un producto kit comercializable
- -
- Sensibilidad del método.
De un total de 20 loci probados, se
seleccionaron 10 loci, por sus características de amplificación y
tamaño. Finalmente, se emplean 20 cebadores (2/locus), 12 para la
reacción A, donde se amplifican 6 loci y 8 para la reacción B donde
se amplifican 4 loci. En la siguiente tabla se muestra el nombre del
los 10 loci del conjunto, el número de acceso a la base de datos
Genebank, reacción en la que se incluye la secuencia de los
cebadores (Forward y Reverse), así como los autores
que los describieron.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones son las generales de cualquier
protocolo de amplificación por PCR, entre las que figuran la
presencia de polimerasa termoestable, dNTPs (desoxirribonucleosido
trifosfato); condiciones de fuerza iónica [ClMg+2] y un pH
adecuados para la actividad de la enzima. Sin embargo, para la
amplificación óptima y equilibrada de los distintos loci son
necesarios unas condiciones de ciclo y proporciones de reactivos y
cebadores muy específicas.
Los resultados de la optimización de las
reacciones A y B se describen a continuación (entre paréntesis se
presentan las concentraciones de partida de las soluciones stock de
cada reactivo):
Reacción
A
- -
- Condiciones de ciclo: 5 minutos a 95ºC, 20 ciclos de (30 segundos 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC, seguido de 7 minutos 72ºC.
- -
- Proporción de reactivos: 1 \mul de ADN (50 - 500 ng), 1 \mul de Buffer (10X), 1 \mul de ClMg_{2} (15 mM), 1 \mul de dNTPs (2 mM), 3 \mul de primer mix A (5 pmol/\mul), 3 \mul de H_{2}O bidestilada estéril, 0.2 \mul de Taq Gold (5 U/\mul; Applied Biosystem).
- -
- Proporciones de cebadores (primer mix A): 6 de SaI 15 (5 pmol/\mul), 2 de SaI 12 (5 pmol/\mul), 2.5 de SaI 147 (5 pmol/\mul), 4 de Sau K140 (5 pmol/\mul), 6 de Sau AN (5 pmol/\mul) y 3 de Sau E82 (5 pmol/\mul).
Reacción
B
- -
- Condiciones de ciclo: 5 minutos a 95ºC, 25 ciclos de (30 segundos 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC), seguido de 7 minutos 72ºC.
- -
- Proporción de reactivos: 1 \mul de ADN (50 - 500 ng), 1 \mul de Buffer (10X), 1 \mul de ClMg_{2} (15 mM), 1 \mul de dNTPs (2 mM), 3 \mul de primer mix B (5 pmol/\mul), 3 \mul de H_{2}O bidestilada estéril, 0,2 \mul de Taq Gold (5 U/\mul; Applied Biosystem).
- -
- Proporción de cebadores (primer mix B): 8 de Sau E97 (5 pmol/\mul), 4 de SaI 10 (5 pmol/\mul), 8 de pSAGT26 (5 pmol/\mul) y 1.5 de SaI 19 (5 pmol/\mul).
Para la caracterización de los 10 loci se
realizó un estudio en muestras de DNA de 50 doradas obtenidas del
medio natural. Los resultados se detallan a continuación. La
probabilidad de identidad representa la inversa del número de
individuos que deben ser analizados antes de encontrar el mismo
genotipo en una muestra seleccionada al azar. El poder de exclusión
se refiere a la probabilidad de que un adulto escogido al azar sea
excluido como parental de un descendiente.
El alto poder de exclusión de esta herramienta
permite que en muchos estudios no sea necesario el empleo de los
diez loci. Por ello, el método se divide en dos reacciones A (de 6
loci) y B (de 4 loci) que además pueden ser empleadas
conjuntamente A+B (6+4 loci) para conseguir el mayor poder
discriminatorio.
Mediante Sparus aurata genotyping and
paternity tool kit A+B se consigue un valor Mp de 2.13048
e^{-31}, lo que indica que la probabilidad de que dos individuos
presenten la misma huella de identidad es prácticamente cero.
Además, Sparus aurata genotyping and
paternity tool kit A+B permite realizar estudios de pedigrí
mediante métodos de exclusión molecular. La exclusión directa de la
paternidad significa que cuando un hijo tiene una información
genética que no tiene ni la madre ni el presunto padre, ambos deben
ser excluidos como padres biológicos. El poder de exclusión de
estas herramientas se puede medir mediante estimadores de exclusión
(Valor de Exclusión 1 cuando ninguno de los parentales es conocido
y Valor de Exclusión 2 cuando al menos conocemos uno de los
padres). Sparus aurata genotyping and paternity tool kit
proporciona valores de exclusión 1 y 2 de 0.999789 y 0.999998,
respectivamente, lo que evidencia. De la misma forma la siguiente
tabla muestra la sensibilidad de las reacciones A, B y A+B.
Para el análisis automático de las muestras
mediante fluorescencia es necesario marcar uno de los cebadores de
cada pareja con una molécula fluorescente. Existen varias empresas
que suministran cebadores marcados hasta con 5 rangos de
fluorescencia, lo cual permite discernir moléculas de loci
distintos aunque tengan el mismo tamaño.
En las reacciones A y B, los distintos cebadores
deben presentar diferentes señales de fluorescencia. En el
siguiente cuadro y de forma general, se muestran como 1, 2, 3, y 4
los diferentes marcajes. El tipo de moléculas para el marcaje
depende del tipo de aparato secuenciador empleado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este protocolo permite la estandarización y
automatización de la técnica de tipificación o genotipado de forma
sencilla y completamente reproducible. Los kits desarrollados se
basan en la metodología descrita con anterioridad, con la
particularidad de que los cebadores están marcados con etiquetas
fluorescentes específicas para el análisis en secuenciadores
automáticos tipo AB 310, 3100, 3130 y 3130 Avance (Applied
Biosystem).
Las etiquetas fluorescentes descritas
anteriormente son las siguientes: 1 corresponde a
6-FAM (Applied Biosystem), 2 corresponde a NED
(Applied Biosystem), 3 corresponde a PET (Applied Biosystem) y la 4
corresponde a VIC (Applied Biosystem).
Fig. 1. Esquema simplificado del método objeto
de protección.
Fig. 2. Esquema simplificado de un modo de
realización preferido (determinación del pedigrí). Contrastación de
la huella de ADN de un individuo con la de sus supuestos
progenitores (método de exclusión). Estos análisis permiten
determinar la paternidad de un individuo con una fiabilidad
prácticamente del 100%. Los círculos indican loci excluyentes.
Para el caso de un modo o ejemplo de realización
consistente en el tipificado o genotipado de una muestra se
describe el siguiente protocolo. La exposición que sigue no pretende
ser limitativa en su alcance.
Para llevar a cabo la tipificación de un
individuo es necesaria una pequeña cantidad de ADN genómico, en un
rango de 50 a 500 ng. Este protocolo se ha ensayado con distintos
métodos de extracción: mediante precipitación salina y resinas de
Chelex®, así como con distintos tipos de muestras: huevos (24 horas
o más), larvas, sangre, músculo y aleta caudal. Todos estos métodos
proporcionan ADN cualitativa y cuantitativamente idóneo para la
obtención resultados altamente fiables, si bien combinando muestras
y estrategias alternativas, es posible optimizar los resul-
tados.
tados.
Preparación de la Reacción A; Añadir 0.5 \mul
de la Reacción A, 0.5 \mul de 500 LIZ^{TM} Size Standard
(Applied Biosystem) y 10 \mul de formamida desionizada.
Desnaturalizar 10 minutos a 94ºC y poner en frió hasta su carga en
el aparato.
Preparación de la Reacción B; Añadir 2 \mul de
la Reacción B, 0.5 \mul de 500 LIZ^{TM} Size Standard (Applied
Biosystem) y 10 \mul de formamida desionizada. Desnaturalizar 10
minutos a 94ºC y poner en frió hasta su carga en el aparato.
Preparación de la mezcla de reacciones A y B;
Añadir 0.5 \mul de la reacción A, 2 \mul de la reacción B, 0.5
\mul de 500 LIZ^{TM} Size Standard (Applied Biosystem) y 10
\mul de formamida desionizada. Desnaturalizar 10 minutos a 94ºC y
poner en frió hasta su carga en el aparato.
Módulo: GS STR POP4 (1 ml) G5.md5
Matriz: Matrix standard set DS33
Parámetros: GS500Analisys.gsp
Voltaje de carrera: 15000 voltios
Voltaje de inyección: 15000 voltios
Duración de inyección: 7 segundos
Temperatura: 60ºC
Poder del láser: 9 mWatios
<110> Universidad de Málaga
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método molecular para el estudio
genético de poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada
(Sparus aurata) y kit correspondiente (Sparus aurata
genotyping and paternity tool kit)
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<160> 20
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipattgggtggc agtttagtag g
\hfill
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<210> 2
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipcactgcgatg agtgaccc
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<210> 3
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggtatgga gtcaactgc
\hfill
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipccccttttgg tacatcatag
\hfill
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskiptttcactgag ctggagactt g
\hfill
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagttgagt ctgttgcatg c
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<140> P200502458
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipacactgtctt tctgtccctc acac
\hfill
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<140> P200502458
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipgagtaacaca gcctcagttg aagc
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskiptgttggagct tgttggtaca c
\hfill
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<140> P200502458
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgagctgtaaa ccgctcagg
\hfill
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipacagtacccc actgtctcc
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<140> P200502458
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<223> Oligonucleótido cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatatcatt acactgtggc
\hfill
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipgcctctcaac cgtatgtag
\hfill
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<223> Oligonucleótido cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipattcttcaca ggcccaacac aaa
\hfill
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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\hskip-.1em\dddseqskiptcacggggga ccaagactg
\hfill
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<210> 18
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcacactgc ctaattagca caga
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200502458
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 04/10/2005
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacattcatgt gtaaaatcgg
\hfill
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<140> P200502458
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<141> 04/10/2005
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<210> 20
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido cebador
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipttggaagaac agaaatctaa tg
\hfill
Claims (9)
1. Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) caracterizado porque consiste en el análisis de
10 marcadores microsatélites o loci (con los oligonucleótidos
correspondientes) a través de su coamplificación mediante la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
2. Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) según la reivindicación anterior que consiste en la
coamplificación de 10 loci (Sau E82, SaI 12, Sau K140, SaI 15, Sau
AN, Sau 147, pSAGT26, SaI 19, SaI 10 y Sau E97), usando cebadores
específicos para cada uno de ellos (SEQ ID NO 1 a 20), marcados con
"etiquetas fluorescentes" que permitan el análisis automática
de las muestras mediante fluorescencia.
3. Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) según la reivindicación anterior en la que dicha
coamplificación comprende 2 reacciones, denominables como
"reacción A" y "reacción B", en las que se amplifican
separadamente 6 (Sau E82, SaI 12, Sau K140, SaI 15, Sau AN y Sau
147) y 4 loci (pSAGT26, SaI 19, SaI 10 y Sau E97), respectivamente,
pudiendo emplearse ambas reacciones de forma individual o
conjunta.
4. Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) según la reivindicación anterior caracterizado
porque la denominable "reacción A" comprende las siguientes
características técnicas:
- -
- Condiciones de ciclo: 5 minutos a 95ºC, 20 ciclos de (30 segundos 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC, seguido de 7 minutos 72ºC.
- -
- Proporción de reactivos: 1 \mul de ADN (50 - 500 ng), 1 \mul de tampón (10X), 1 \mul de ClMg_{2} (15 mM), 1 \mu1 de dNTPs (2 mM), 3 \mul de "primer mix A" (5 pmol/\mul), 3 \mul de H_{2}O bidestilada estéril, 0.2 \mul de Taq Gold (5 U/\mul; Applied Biosystem).
- -
- Proporciones de cebadores (primer mix A): 6 de SaI 15 (5 pmol/\mul), 2 de SaI 12 (5 pmol/\mul), 2.5 de Sau I47 (5 pmol/\mul), 4 de Sau K140 (5 pmol/\mul), 6 de Sau AN (5 pmol/\mul) y 3 de Sau E82 (5 pmol/\mul).
5. Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) según la reivindicación 3 caracterizado porque la
denominable "reacción B" comprende las siguientes
características técnicas:
- -
- Condiciones de ciclo: 5 minutos a 95ºC, 25 ciclos de (30 segundos 95ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC), seguido de 7 minutos 72ºC.
- -
- Proporción de reactivos: 1 \mul de ADN (50 - 500 ng), 1 \mul de tampón (10X), 1 \mul de ClMg_{2} (15 mM), 1 \mul de dNTPs (2 mM), 3 \mul de "primer mix B" (5 pmol/\mul), 3 \mul de H_{2}O bidestilada estéril, 0,2 \mul de Taq Gold (5 U/\mul; Applied Biosystem).
- -
- Proporción de cebadores (primer mix B): 8 de Sau E97 (5 pmol/\mul), 4 de SaI 10 (5 pmol/\mul), 8 de pSAGT26 (5 pmol/\mul) y 1.5 de SaI 19 (5 pmol/\mul).
6. Método molecular para el estudio genético de
poblaciones y el análisis de pedigrí de la dorada (Sparus
aurata) según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en el que
los cebadores específicos están marcados con las siguientes
"etiquetas fluorescentes": 6-FAM (loci Sau
KI40, SaI 19 y SaI 10), NED (loci Sau AN y Sau I47), PET (loci SaI
15 y Sau E97) y VIC (loci Sau E82, SaI 12 y pSAGT26).
7. Kit desarrollado para llevar a cabo el método
molecular para el estudio genético de poblaciones y el análisis de
pedigrí de la dorada (Sparus aurata) descrito en las
reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende
set de cebadores, tampón de reacción, mezcla de dNTPs, muestra de
ADN control, y enzima ADN polimerasa.
8. Kit desarrollado para llevar a cabo el método
molecular para el estudio genético de poblaciones y el análisis de
pedigrí de la dorada (Sparus aurata) según la reivindicación
anterior que comprende la presentación de los componentes del mismo
en estado liofilizado.
9. Kit desarrollado para llevar a cabo el método
molecular para el estudio genético de poblaciones y el análisis de
pedigrí de la dorada (Sparus aurata) según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 8 que comprende tres presentaciones o formatos
comercializables caracterizadas por permitir desarrollar las
reacciones de amplificación de forma individual o conjunta
[Sparus aurata genotyping and paternity tool kit sixplex
("reacción A"), Sparus aurata genotyping and paternity tool
kit fourplex ("reacción B"), y Sparus aurata genotyping
and paternity tool kit six+fourplex ("reacción A" +
"reacción B")].
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200502458A ES2277536B1 (es) | 2005-12-13 | 2005-12-13 | Metodo molecular para el estudio genetico de poblaciones y el analisis de pedigri de la dorada (sparus aurata) y kit correspondiente (sparus aurata genotyping and paternity tool kit). |
| PCT/ES2006/000679 WO2007068774A2 (es) | 2005-12-13 | 2006-12-12 | Método molecular para el estudio genético de poblaciones y el analisis de pedigrí de la dorada (sparus aurata) y kit correspondiente |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200502458A ES2277536B1 (es) | 2005-12-13 | 2005-12-13 | Metodo molecular para el estudio genetico de poblaciones y el analisis de pedigri de la dorada (sparus aurata) y kit correspondiente (sparus aurata genotyping and paternity tool kit). |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2277536A1 ES2277536A1 (es) | 2007-07-01 |
| ES2277536B1 true ES2277536B1 (es) | 2008-06-16 |
Family
ID=38163274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200502458A Active ES2277536B1 (es) | 2005-12-13 | 2005-12-13 | Metodo molecular para el estudio genetico de poblaciones y el analisis de pedigri de la dorada (sparus aurata) y kit correspondiente (sparus aurata genotyping and paternity tool kit). |
Country Status (2)
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| ES (1) | ES2277536B1 (es) |
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| CN106947816B (zh) * | 2016-10-28 | 2020-08-04 | 中山大学 | 一种斜带石斑鱼亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法 |
| CN106520939B (zh) * | 2016-11-04 | 2019-09-13 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种鲷鱼种质鉴定的方法及其应用 |
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-
2005
- 2005-12-13 ES ES200502458A patent/ES2277536B1/es active Active
-
2006
- 2006-12-12 WO PCT/ES2006/000679 patent/WO2007068774A2/es active Search and Examination
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|---|---|
| ES2277536A1 (es) | 2007-07-01 |
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| WO2007068774A2 (es) | 2007-06-21 |
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