ES2310137B1 - Metodo de analisis genetico por deteccion simultanea de marcadores microsatelites en una unica reaccion pcr para el analisis del parentesco en la especie solea senegalensis. - Google Patents

Metodo de analisis genetico por deteccion simultanea de marcadores microsatelites en una unica reaccion pcr para el analisis del parentesco en la especie solea senegalensis. Download PDF

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Abstract

Método de análisis genético por detección simultánea de marcadores microsatélites en una única reacción PCR para el análisis del parentesco en la especie Solea senegalensis.
La presente invención se refiere a un método de análisis del parentesco en poblaciones de Solea senegalensis, basado en la amplificación de un grupo de microsatélites aportados por la invención. Estos marcadores moleculares son altamente informativos, puesto que tienen un elevado número de alelos, no se encuentran ligados y dos de ellos se localizan en regiones codificantes (poco variables). Además, son susceptibles de ser amplificados en una única reacción de PCR, a partir de una serie de cebadores que también describe la invención.

Description

Método de análisis genético por detección simultánea de marcadores microsatélites en una única reacción PCR para el análisis del parentesco en la especie Solea senegalensis.
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La presente invención se refiere un método de análisis del parentesco en poblaciones de Solea senegalensis, basado en la amplificación de un grupo de microsatélites aportados por la invención. Estos marcadores moleculares son altamente informativos, puesto que tienen un elevado número de alelos, no se encuentran ligados y dos de ellos se localizan en regiones codificantes (poco variables). Además, son susceptibles de ser amplificados en una única reacción de PCR, a partir de una serie de cebadores que también describe la invención.
Estado de la técnica anterior
El lenguado, Solea senegalensis es una especie de pez plano naturalmente distribuido en el mar Mediterráneo y en las áreas atlánticas de África. Esta especie tiene un elevado valor comercial y es considerada de gran potencial para la acuicultura, aunque aun se encuentra en estadios tempranos de domesticación. Existe por tanto, una creciente necesidad de desarrollar herramientas moleculares (Porta J.; et al. (2006) Aquaculture 251, 46-55.), que permitan llevar a cabo análisis genéticos de los individuos y las poblaciones de S. senegalensis.
El análisis genético de las poblaciones en cultivo es muy útil en la asignación de la paternidad, con el objeto de seleccionar individuos reproductivos para los criaderos, evitando de esta manera los efectos de tipo fundador o de cuello de botella, y también para valorar los cambios genéticos que ocurren en estos cultivos estableciendo el grado de degeneración genética en las poblaciones. En este sentido, los microsatélites, repeticiones variables en tamden de unos pocos pares de bases, son una herramienta ampliamente utilizada en los estudios de parentesco o de paternidad y en los análisis comparativos en poblaciones, ya que posibilitan la asignación de individuos a grupos de familias e incluso la estimación de la relación entre individuos, para así poder seguir la evolución de la descendencia.
Hasta el momento, únicamente unos pocos microsatélites han sido descritos para la elaboración de los estudios genéticos poblaciones de S. senegalensis (Porta J. et al. (2004). Molecular Ecology Notes 4, 277-279; Fuentes, V. Et al. (2004). Molecular Ecology Notes 4, 339-341). Sin embargo, la necesidad de realizar varias reacciones de amplificación para el análisis de los microsatélites y su localización en regiones no codificantes del genoma los hacen deficientes para su utilización en análisis de parentesco en poblaciones amplias.
En la actualidad se conocen al menos dos análisis de paternidad o del parentesco para S. senegalensis (Castro, J. et al. (2006). Aquaculture 261, 1194-1203; Porta J. et al. (2006b). Aquaculture 256, 159-166), los cuales ofrecen una información limitada acerca de las poblaciones y necesitan llevar a cabo al menos dos reacciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para analizar un grupo 4 y 5 microsatélites. Además, todos los microsatélites empleados en estos tests proceden de regiones no codificantes del genoma del S. senegalensis, de modo que la información que aportan es más limitada que si su origen estuviese en una región codificante.
Descripción de la invención
Los autores de la presente invención han desarrollado un método el análisis de la paternidad o del parentesco en individuos y poblaciones de S. senegalensis, basado en el análisis de un grupo de microsatélites aportado por la invención. Además, este grupo de microsatélites presenta la ventaja de ser susceptible de amplificación en una única reacción de PCR (PCR múltiple), e incluso ser detectado empleado cebadores marcados con sólo tres cromóforos.
A partir de cuatro genotecas propias de S. senegalensis se seleccionaron 55 microsatélites, los cuales mostraron una amplificación eficiente y un elevado nivel de polimorfismo, y a partir de genotecas de cDNA se caracterizaron otros 20. De los 75 microsatélites iniciales se tomaron finalmente 8, 6 procedentes de la primera genoteca (Mss1, Mss3, Mss11, Mss14, Mss28, Mss44) y 2 (Sse2H15, Sse3H07) de la segunda. Estos microsatélites mostraron diferentes motivos de repetición (Tabla 2), y su selección se basó en dos condiciones fundamentales: (i) la similitud en las condiciones de amplificación por PCR y (ii) el tamaño de los fragmentos amplificados para cada microsatélite. Estos marcadores han permitido el desarrollo una potente herramienta para el análisis del parentesco en la especie S. senegalensis, que además puede ser llevada a cabo en una única reacción en cadena de la polimerasa.
La aplicación del método que aporta la invención se extiende a varios campos muy diversos como son los estudios en genética de poblaciones, utilización en programas de mejora genética, expresión génica, caracterización de loci con interés cuantitativo (QTLs) y estudios filogenéticos y de evolución (Takezaki, N. y Nei, M. (1996). Genetics 144, 389-399).
En el campo de la acuicultura el empleo de este tipo de análisis es de gran utilidad para el establecimiento inicial de los cardúmenes de reproductores, puesto que el uso de una única población como fuente para el cultivo de una determinada especie, causa una reducción en la diversidad intraespecífica debido a la consanguinidad (lo cual conlleva a muchos problemas de viabilidad) y/o propagación de genotipos alóctonos (con las consecuencias negativas que ello implica para los genotipos autóctonos). De este modo, el análisis de la variabilidad genética de los cardúmenes cultivados (estudio de la heterozigosidad), con estos microsatélites, permite detectar la presencia o no de depresión por consanguinidad en un cultivo con el objeto de controlarlo y evitar situaciones de riesgo.
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Estos análisis también posibilitan la comprobación de la relación de parentesco entre los individuos usados como reproductores o poner de manifiesto en un stock qué individuos son los que están realizando las puestas, para así actuar en la selección y distribución de los ejemplares reproductores más adecuados.
Por otro lado, existen expectativas referidas a la posibilidad de encontrar alelos de microsatélites que estén relacionados con caracteres de interés comercial y poder así ser utilizados en la selección de genotipos de interés. En este mismo sentido, es posible descartar genotipos no deseados impidiendo así su propagación.
Por último, comentar que la información sobre la diversidad genética de las poblaciones usando estos microsatélites puede utilizarse, bien en poblaciones naturales para la aplicación de mejores estrategias de gestión de los cardúmenes de los individuos salvajes S. senegalensis, bien en poblaciones cultivadas y que quieran ser utilizadas para programas de repoblación del medio natural.
Así, un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método de análisis del parentesco en la especie S. senegalensis, en adelante método de la invención, que comprende:
a.
Amplificar al menos 4 microsatélites, y en realizaciones sucesivamente más preferidas 5, 6, 7 u 8, que se encuentran comprendidos en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:1-8, su secuencia complementaria o variantes alélicas de las mismas en una muestra problema. Estas variantes alélicas se encuentran recogidas, sin ningún tipo de limitación, en la tabla 2.
b.
Detectar la amplificación de los microsatélites del paso a) para obtener el genotipo de la muestra problema.
c.
Comparar el genotipo de la muestra problema con el genotipo de la una segunda muestra con la que se quiere establecer el parentesco.
El paso b) puede ser llevado a cabo mediante metodologías sobradamente conocidas en el estado de la técnica, entre las que se pueden incluir sin ningún tipo de limitación electroforesis de poliacrilamida y detectar los resultados mediante cebadores marcados con radioactividad, mediante tinción con plata del gel, sondas, etc. En estos últimos métodos, las reacciones de PCR o PCR múltiple y electroforesis no podrían llevarse a cabo conjuntamente para todos los microsatélites, teniendo que realizarse en grupos de dos o de tres. Así, en una realización preferida de la invención, la detección es llevada a cabo a través del marcaje de los cebadores, preferentemente con al menos tres cromóforos, posterior electroforesis capilar e identificación de los microsatélites por espectrometría.
En una realización preferida de este aspecto de la invención la amplificación de los microsatélites se realiza empleado cebadores específicos (SEQ ID NO:9-24) según se indica en la tabla 2. Del mismo modo, cebadores complementarios a los indicados en la mencionada tabla podrían ser empleados para amplificar las secuencias complementarias a SEQ ID NO:1-8 y sus variantes alélicas.
Un segundo aspecto de la invención se refiere una secuencia aislada seleccionada de cualquiera del grupo de secuencias que comprende las SEQ ID NO:1-8, fragmentos de dichas secuencias que comprendan los microsatélites, sus secuencias complementarias o variantes alélicas de las mismas.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a cebadores capaces de amplificar cualquiera de los microsatélites comprendidos en las secuencias mencionadas en el segundo aspecto de la invención. Preferentemente, dichos cebadores comprenden cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:9-24 y cebadores complementarios.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de cualquiera de los microsatélites de la invención para llevar a cabo estudios genéticos en la especie S. senegalensis, y más preferentemente análisis del parentesco.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un kit para llevar cabo el método de la invención que comprende cebadores, preferentemente marcados, capaces de amplificar al menos 4 de los microsatélites de comprendidos en las secuencias SEQ ID NO:1-8, sus secuencias complementarias y variantes alélicas de las mismas. En una realización preferida el Kit comprende al menos 4 parejas de cebadores seleccionados del grupo SEQ ID NO:9-24 y cebadores complementarios (ver tabla 2).
Definiciones
Kit de análisis: se entiende por kit cualquier soporte que permita llevar a cabo la detección de los microsatélites de la invención. Estos soportes pueden contener cebadores, preferentemente marcados, para la amplificación de los microsatélites y sondas, preferentemente marcados, que capaces de hibridar con los microsatélites amplificados. Adicionalmente, el kit puede además contener cualquier reactivo o compuesto necesario para su puesta a punto.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1.- La figura muestra la lectura de emisión de fluorescencia ofrecida por el secuenciador automático AIB 3100 Advant, tras llevar a cabo la amplificación de los microsatélites y la electroforesis capilar.
Exposición detallada y modos de realización
El método aportado por la presente invención, basado en la detección de microsatélites, permite la amplificación simultánea de 8 de estos marcadores. En concreto, seis de los microsatélites (Mss1, Mss3, Mss11, Mss14, Mss28, Mss44) se encuentran en secuencias no codificantes, y el resto (Sse2H15 y Sse3H07) se localiza en regiones codificantes, concretamente en la región 5' de los genes Casein kinase II subunidad alpha (Sse2H15) e Interferon-related developmental regulator 2 (Sse3H07), ofreciendo así una información más completa que el primer grupo de marcadores. Todos estos microsatélites tienen un elevado número de alelos (diversidad génica) (Tabla 1) y el rango alélico, que corresponde a los tamaños de los fragmentos amplificados (desde el de menor tamaño hasta el de mayor tamaño) para cada loci, es variable (véase también Tabla 1). En los estudios genéticos aplicados al cultivo es indispensable utilizar loci microsatélites con altos niveles de variabilidad. La alta variabilidad y la codominancia permitirían establecer pedigríes en el cultivo y además inferir relaciones de parentesco entre reproductores de los cuales no se conoce su origen, a partir de la composición genotípica analizando la similitud genética entre ellos.
Cabe también destacar que tanto en el primer grupo de microsatélites como el segundo se comienza a conocer las relaciones de ligamiento entre ellos y la distancia que ocupan con respecto al centrómero, mediante el análisis de su herencia en progenies ginogenéticas (Tabla 1). Así, los datos de la progenie, obtenida a partir del calentamiento de los huevos procedentes de una hembra fertilizada con esperma irradiado procedente de un único macho, indicarían la ausencia de ligamiento entre los microsatélites de la invención. De hecho, mediante análisis de tétradas, han sido mapeados los 6 de los 8 microsatélites de la invención, calculando así, como resultado del análisis homocigótico de la progenie ginogenética, la frecuencia de segregación en la segunda división meiótica. Finalmente, con los datos obtenidos de la progenie ginogenética, se llevó a cabo un análisis de segregación a partir de tablas de contingencia 3x3 con el objeto de mostrar la segregación independiente de los microsatélites. Los resultados ofrecidos por estos ensayos demostraron la inexistencia de ligamiento entre los marcadores (requisito indispensable en las pruebas de parentesco), dando así una mayor fiabilidad al método.
En relación a la diversidad génica de los microsatélites, subrayar que éstos tienen entre 9 y 16 alelos (con una media por locus 11.50) y una heterocigosis esperada de 0.616 a 0.860 (con una media de 0.757), hecho que determina su viabilidad para ser empleados en los análisis genéticos poblacionales. Además, el contenido de informacion polimórfica (PIC) también presenta un elevado rango de valores que se sitúa entre 0.587 y 0.860 (con una media de 0.729).
Tomando como base los datos de diversidad genética de cada microsatélite, se calcularon los coeficientes de probabilidad de exclusión 1 (Marshall et al. (1999). Molecular Ecology 7, 639-655.) y 2 (Chakravarti and Li (1983). Inclusion Probabilities in Parentage Testing (ed. Walker RH), pp. 411-422.), obteniéndose respectivamente unos valores comprendidos entre 0.290-0.624 y 0.471-0.769 (Tabla 2). Estos resultados revelan un muy elevado poder de exclusión del método de la invención, de tal modo que la combinación de los microsatélites ofrece unos coeficientes de exclusión para el primer parental de 0.983 y de 0.9988 para el segundo. Estos datos posibilitan que, en ausencia de mutaciones o errores en el manejo del material, la fiabilidad de asignación del parentesco del método de la invención sea del 100%.
TABLA 1 Caracterización de los microsatélites. Distancia al centrómero en centimorgans (d), número total de alelos (k), número de individuos analizados (N), heterocigosis esperada (He) y observada (Ho), contenido de informacion polimórfica (PIC), y probabilidad de exclusión para el primer (Excl 1) y segundo parental (Excl 2) para cada locus
1
Otra de las ventajas de la invención se deriva de la situación de los locus que contienen microsatélites, al permitir que éstos sean susceptibles de ser amplificados en una única reacción de PCR, posibilitando así la obtención de mayor información génica de individuos o poblaciones de S. senegalensis en un único paso. Además, los alelos pueden ser fácilmente diferenciados utilizando únicamente 3 fluorocromos, pues los rangos alélicos no solapan entre los diferentes colores, pudiendo por ello, analizar el resultado en una única electroforesis capilar por muestra.
A continuación se detallan los materiales y métodos que han sido empleados para el desarrollo de la presente invención, así como los ejemplos de realización de la invención.
Materiales y métodos
El ADN genómico del lenguado se aisló según se describe en Sambrook J, et al (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Este ADN fue digerido en tres diferentes reacciones de restricción con las enzimas RsaI, HaeIII y RsaI+HaeIII. Para cada reacción de restricción los fragmentos generados fueron ligados a moléculas adaptadoras. Se realizó una pre-amplificación de los fragmentos utilizando como cebadores oligos complementarios a los adaptadores y posteriormente se hibridó con oligos 5'-biotinilados. De esta forma, cuatro reacciones fueron llevadas a cabo: restricción con RsaI e hibridación con una mezcla de los oligos b(CT)30, b(ACA)15 y b(GATA)10; restricción con HaeIII e hibridación con la mezcla de oligos b(GT)30, b(TGA)16 and b(AGA)15; restricción con RsaI+HaeIII e hibridación con b(CA)30 y por último, restricción con RsaI+HaeIII e hibridación con b(GATA)10. Tras la incubación, los fragmentos unidos a los oligos biotinilados fueron separados utilizando estreptavidina. Estos fragmentos una vez purificados se utilizaron para realizar las amplificaciones selectivas. Los amplificados de estas reacciones de PCR fueron clonados en un vector de clonación (TOPO TA Cloning Kit for sequencing, Invitrogen) y secuenciados mediante el sistema de BigDye Terminator (Applied Biosystems) usando los oligos T7 y T3. De las cuatro librerías, se seleccionaron 250 clones que fueron secuenciados. Se detectaron unas 150 secuencias con microsatélites en las cuales era posible diseñar cebadores. De estos microsatélites analizados, 55 de ellos fueron polimórficos. Por otro lado, 20 secuencias de una librería realizada a partir de cDNA (base de datos del proyecto Pleurogene) que contenían microsatélites, fueron también utilizada para el diseño de cebadores.
En ambos casos (microsatélites de ADN genómico y de cDNA), los cebadores se diseñaron en las regiones flanqueantes usando el programa Primer3 (Rozen and Skaletsky, 1998). Las condiciones de PCR se optimizaron para cada microsatélite usando un gradiente de temperatura (de 50°C a 65°C) y varias concentraciones de MgCl2. Las muestras usadas corresponden a reproductores y progenie procedentes del centro CIFAP "Agua del Pino" (IFAPA, Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía).
La determinación del rango alélico se realizó en un secuenciador ABI 3100 Avant y utilizando el software GeneMapper (Applied Biosystems). El análisis estadístico se realizó usando el programa informático CERVUS 2.0 (Marshall, et al. (1998) Statistical confidence for likelihoop-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology 7, 639-655. 1998). Los loci Mss1, Mss3, Mss11, Mss14, Mss28, Mss44 y Sse2H15 y Sse3HO7 fueron analizados en una única reacción de amplificación usando una multiplex-PCR conteniendo las ocho parejas de cebadores. Uno de los oligos de cada pareja fue marcado mediante fluorescencia, utilizando los colorantes HEXTM, 6-FAMTM y NEDTM, teniendo en cuenta el rango de amplificación de cada locus. Las condiciones de amplificación fueron optimizadas para la multiplex-PCR. La reacción de amplificación fue llevada a cabo en 40 ml conteniendo 40 ng de DNA de la muestra, 10 mM Tris-ClH, pH=8.3; 5 mM NH4C; 50 mM KCl; 0.2 mM de cada dNTPs, y una concentración variable de cada cebador (ver tabla 1) y 3 U Taq polimerasa. Las condiciones de temperaturas y tiempos de amplificación también fueron puestas a punto: 5 min a 94°C; 25 cycles de 30s a 94°C, 45s a 61°C, 30s a 72°C y 10 min a 72°C.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Microsatélites empleados en el método de la invención, sus motivos de repetición y concentración de cebadores en para llevar cabo la reacción de PCR o PCR-múltiple
2
La detección de los resultados se realiza mediante una electroforesis capilar (ejemplo usado por nosotros un secuenciador ABI 3100 Advant) y posterior análisis en un programa de análisis de fragmentos (ejemplo GeneMapper de Applied Biosystems).
Ejemplo 1 Análisis del parentesco
Para llevar a cabo el test con una mayor eficacia se han puesto a punto las condiciones de PCR para que sea posible amplificar conjuntamente en una única reacción los ocho microsatélites (PCR múltiple -ver material y métodos-) en cada muestra.
Una vez obtenidos los genotipos de los posibles parentales y de los ejemplares problemas para los ocho microsatélites, se puede asignar la paternidad o el parentesco entre dos ejemplares según la combinación que presenten todos los alelos mediante diferentes softwares, como por ejemplo el programa CERVUS 2.0. En este programa los genotipos de los parentales candidatos se comparan con el genotipo de cada descendiente, de tal forma que aquellos que presentan una o más incongruencias mendelianas son excluidos como padres.
En la tabla que se presenta a continuación (Tabla 3) se ilustran, a modo de ejemplo, los resultados obtenidos para cuatro microsatélites. Los Parentales 1 y 3 son excluidos por presentar genotipos (alelos para cada microsatélite) que no son concordantes con el genotipo del individuo problema. Así, se asigna la paternidad a los Parentales 2 y 4, que son los únicos individuos que portan alelos para cada uno de los microsatélites que explican el genotipo del descendiente (subrayados se indican los alelos de cada uno de los parentales que aparecen en la descendencia):
TABLA 3 Tabla de genotipos
3 
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<110> FUNDACIÓN GENOMA ESPAÑA
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<120> Método de análisis del parentesco en la especie Solea senegalensis 
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<130> ES.1755.1
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<160> 24
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<170> PatentIn version 3.4
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<210> 1
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<211> 254
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<212> DNA
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<213> S. senegalensis 
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<400> 1
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5 
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<210> 2
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<211> 314
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<212> DNA
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<213> S. senegalensis 
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<400> 2
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50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 778
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. senegalensis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
500
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. senegalensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 502
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. senegalensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (432)..(432)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (456)..(456)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (458)..(458)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (467)..(467)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (471)..(471)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (484)..(484)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (497)..(497)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (500)..(500)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. senegalensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (498)..(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (511)..(511)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (520)..(520)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (525)..(525)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
70
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 716
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. senegalensis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
80 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 748
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. senegalensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (656)..(656)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
800
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcattgaa gggtgcacta a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacaacttt tgcacggtga 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attctgtccc caattcacca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattgtggtc cgggttgtt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cattaggacg ggtccatgtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatgtggac tggaccagaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgtgagagg aagtggtgct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggctccaat gtcagatttt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgccctgaac gatgactgta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaatttcct cagtaaccaa gagg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttggcatgat ttggcagtt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagttgggca acctattatt tga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accaaagtag cgcagattcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttcatcagc agccaaactg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaattaca atagtggcct gt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttcaatgc ttcagctgtc t 
\hfill
21

Claims (4)

1. Método de análisis del parentesco en la especie S. senegalensis que comprende:
a.
La amplificación simultanea en una única reacción PCR de los microsatélites que se encuentran comprendidos en las secuencias SEQ ID N° 1-8 con cebadores específicos;
b.
Detectar la amplificación de los microsatélites del paso a) para obtener el genotipo de la muestra problema; y
c.
Comparar el genotipo de la muestra problema con el genotipo de una segunda muestra con la que se quiere establecer el parentesco.
2. Método de análisis del parentesco, según la reivindicación anterior, donde los cebadores específicos están marcados con al menos 3 cromóforos.
3. Método de análisis del parentesco, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los cebadores específicos se seleccionan del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID N° 9-24 o sus secuencias complementarias.
4. Kit para llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende cebadores específicos de llevar a cabo la amplificación simultanea de los 8 microsatélites que se encuentran comprendidos en las secuencias SEQ ID N° 1-8.
ES200701576A 2007-06-07 2007-06-07 Metodo de analisis genetico por deteccion simultanea de marcadores microsatelites en una unica reaccion pcr para el analisis del parentesco en la especie solea senegalensis. Withdrawn - After Issue ES2310137B1 (es)

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