ES2274814T3

ES2274814T3 - Uso de compuestos carboxy tales como cloruro de 2(4-acetofenil) -2cloro-n-metil-etilamonio como agentes antiinflamatorios.

Info

Publication number: ES2274814T3
Application number: ES00985264T
Authority: ES
Inventors: Karolien De Bosscher; Wim Vanden Berghe; Guy Haegeman
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2007-06-01
Anticipated expiration: 2020-12-21
Also published as: ATE342716T1; DE60031439D1; WO2001045693A1; US7053120B2; EP1239850B1; DE60031439T2; EP1239850A1; US20030055030A1; CA2395119A1; AU2173101A

Abstract

Uso de un compuesto (I) con la fórmula (Ver fórmula) y su derivado aziridínico, en la que R es un grupo acetilo, X es un grupo cloruro e Y es un grupo metilo en la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar las inflamaciones.

Description

Uso de compuestos carboxy tales como cloruro de 2(4-acetofenil)-2cloro-N-metil-etilamonio como agentes antiinflamatorios.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización del cloruro de 2(4-acetoxifenil)-2-cloro-N-metil-etilamonio en el tratamiento de los trastornos inflamatorios.

Antecedentes de la invención

Los glucocorticoides sintéticos continúan siendo unos de los principios activos más eficaces en el tratamiento de los trastornos inflamatorios crónicos. Sin embargo, su utilización terapéutica se ve limitada debido a unos efectos secundarios importantes. En las actividades fisiológicas y terapéuticas de los glucocorticoides interviene un receptor nuclear que pertenece a la superfamilia de los factores de transcripción inducibles por un ligando que, a parte de regular directamente sus programas genéticos análogos, pueden interferir con otras vías de señalización tales como las que utilizan el factor NF-\kappaB.

El NF-\kappaB es un factor de transcripción inducible complejo que regula la expresión de diversos genes implicados en las respuestas inflamatorias e inmunitarias. Se activa cuando se exponen las células a citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1), a oxidantes (peróxido de hidrógeno, ozono, aniones de superóxido), a compuestos bacterianos (LPS), a productos víricos (dsARN, la proteína de los genes tax del HTLV-I ), a activadores de la proteína cinasa C (PKC) (ésteres de forbol, factores activadores de los trombocitos), y a irradiación con rayos UV o rayos \gamma.

El NF-\kappaB constituye un objetivo prometedor en los tratamientos antiinflamatorios e inmunodepresores. Está muy demostrada la inhibición de la actividad del NF-\kappaB mediante la utilización de glucocorticoides (GC), a pesar de que también se han observado algunos efectos de los GC en la estimulación de genes.

A pesar de que los GC continúan encontrándose, tal como se ha mencionado anteriormente, entre los fármacos inmunodepresores y antiinflamatorios más potentes disponibles actualmente, y que resultan especialmente eficaces en el tratamiento del asma crónico o la artritis reumatoide, los efectos secundarios tales como la insuficiencia del eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal, diabetes, alteraciones en el metabolismo lipídico, miopatía esteroidea, osteoporosis y complicaciones infecciosas y neuropsiquiátricas, limitan la utilización terapéutica de los agonistas glucocorticoides clásicos. Por lo tanto, existe la necesidad de investigar y de encontrar nuevos compuestos que presenten unas propiedades antiinflamatorias sin que presenten efectos secundarios importantes.

El compuesto A (Cpd A) o cloruro de 2(4-acetoxifenil)-2-cloro-N-metil-etilamonio es un análogo estable del precursor de la hidroxi-fenilaziridina que se encuentra en el arbusto namibio Salsola tuberculatiformis Botschantzev (Louw, 1997). Se han atribuido propiedades anticonceptivas a las plantas del género Salsola ya desde 1902 y se reconoció y se transmitió mediante la tradición oral bosquimana (Brodegaard, 1973). Los experimentos alimentarios realizados con el propio arbusto provocaron unos efectos anticonceptivos en ratas y prolongaron la gestación en ovejas (van der Merwe, 1976; Basson, 1969). Un estudio realizado por van de Merwe et al. (1976) permitió el aislamiento de una fracción activa pero muy inestable, obtenida mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) a partir de material vegetal seco, la hidroxifenilaziridina, y la síntesis de un análogo más estable pero biológicamente activo, el Cpd A (Louw, 1997). Las recientes investigaciones realizadas por el grupo de Louw y colaboradores permitieron descubrir el mecanismo de la acción anticonceptiva y las dianas moleculares del análogo derivado de dicha planta del desierto. Se observaron múltiples niveles de interferencia con la acción de los glucocorticoides endógenos. A partir de sus resultados se llegó a la conclusión que el Cpd A interrumpe el período de celo de las ratas al interactuar con proteínas que se unen con los glucocorticoides tales como los enzimas esteroidogénicos y globulinas plasmáticas que se unen con los esteroides, alterando de este modo la interacción entre el hipotálamo, la pituitaria, las glándulas suprarrenales y la gónadas (el eje HPA frente al eje HPG) (Louw, 1997 y 1999).

La presente invención se refiere al descubrimiento sorprendente de que los compuestos carboxi tales como el Cpd A presentan un efecto antinflamatorio específico de un nivel similar al de los glucocorticoides sin que presenten los importantes efectos secundarios de los glucocorticoides.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Las células L929sA con el constructo genético indicador p1168hu.IL6P-luc+ integrado establemente se trataron con 1 \muM de DEX, 0,1 ó 1 \muM de Cpd A, tal como se indica, en ausencia o en presencia de 2000 UI/ml de TNF. La DEX o el Cpd A se añadieron 2 horas antes que el TNF alcanzando un período de inducción total de 8 horas.

Se analizó la actividad de la luciferasa en los lisados celulares y se normalizó en función del contenido proteínico. La actividad como promotor se expresa como "factor de inducción", es decir, el índice de los niveles de expresión registrados tanto en condiciones inducidas como en condiciones no inducidas. Se realizaron los análisis por triplicado y los resultados son representativos de por lo menos dos experimentos de inducción independientes.

Figura 2. Las células L929sA con el constructo genético indicador p1168(\kappaBmut)IL6P-luc+ integrado establemente se trataron con 1 \muM de DEX, 0,1, 1 ó 10 \muM de Cpd A, tal como se indica, en ausencia o en presencia de 60 nM de estaurosporina (STS). El protocolo de inducción y de realización de los diagramas de los resultados es similar al de la Figura 1.

Figura 3. Las células L929sA con el constructo genético indicador p1168(AP-1-mut)IL6P-luc+ integrado establemente se trataron con 1 \muM de DEX, 1 ó 10 \muM de Cpd A, tal como se indica, en ausencia o en presencia de 2000 UI/ml de TNF. La DEX o el Cpd A se añadieron 2 horas antes que el TNF alcanzando un período de inducción total de 8 horas. El protocolo de inducción y de realización de los diagramas de los resultados es similar al de la
Figura 1.

Figura 4. Las células L929sA con el constructo genético indicador p(IL6\kappaB)_{3}50hu.IL6P-luc+ integrado establemente se trataron con 1 \muM de DEX, 0,1, 1 ó 10 \muM de Cpd A, tal como se indica, en ausencia o en presencia de 2000 UI/ml de TNF. La DEX o el Cpd A se añadieron 2 horas antes que el TNF alcanzando un período de inducción total de 8 horas. El protocolo de inducción y de realización de los diagramas de los resultados es similar al de la
Figura 1.

Figura 5. Las células L929sA con el constructo pE-selectina-Luc integrado establemente se trataron con 1 \muM de DEX, 1 ó 10 \muM de Cpd A, en ausencia o en presencia de 2000 UI/ml de TNF. El protocolo de inducción y de realización de los diagramas de los resultados es similar al de la Figura 1.

Figura 6. Las células L929sA con el constructo pICAM-Luc integrado establemente se trataron con 1 \muM de DEX, 1 ó 10 \muM de Cpd A, en ausencia o en presencia de 2000 UI/ml de TNF. El protocolo de inducción y de realización de los diagramas de los resultados es similar al de la Figura 1.

Figura 7. Se realizó la inducción de las células L929sA con el constructo p(GRE)_{2}-50-luc+ integrado establemente con 1 \muM de DEX, en ausencia o en presencia de o,l ó 1 \muM de Cpd A alcanzando un período de inducción total de 8 horas. La realización de los diagramas de los resultados es similar al de la Figura 1.

Figura 8. Se realizó una prueba ELISA IL-6 (prueba de inmunoabsorción enzimática) con células murinas utilizando el medio de cultivo sobrenadante de células inducidas subconfluentes. Las células se trataron con 1 \muM de DEX ó 10 \muM de Cpd A, en ausencia o en presencia de 2000 UI/ml de TNF. La DEX o el Cpd A se añadieron 2 horas antes que el TNF alcanzando un período de inducción total de 8 horas. Esta figura representa dos experimentos independientes.

Figura 9. A a D. Se realizó la transfección transitoria de células HEK293T con 100 ng de p(IL6\kappaB)_{3}50hu.IL6P-luc+ (A y B) o pNF-\kappaB-Luc (C y D), 100 ng de un plásmido de control de la \beta-galactosidasa y 200 ng de ADN Mock (A y C) o pSVhGR\alpha (B y D). Después de la transfección, se realizó la incubación previa de las células durante 2 horas con 1 \muM de DEX y 10 \muM de Cpd A y RU486, en los casos en que se indica. Posteriormente se añadió el TNF (2000 UI/ml), en los casos en los que resultó necesario y se continuaron las inducciones durante 6 horas más. El diagrama con los resultados se describe del mismo modo que en la Figura 1, con la excepción que el estado no inducido se toma como 100.

Figura 10. Las células L929sA se dejaron sin tratar o se trataron con DEX (1 \muM) y diversas concentraciones de Cpd A, tal como se indica (en \muM), solo o junto con TNF (2000 UI/ml). La DEX y el Cpd A se añadieron 2 horas antes que el TNF, manteniéndose durante un período total de 4 horas. El extracto proteico total se incubó con el elemento de respuesta IL-6 NF-\kappaB marcado con 32P y los complejos formados por proteína y ADN se analizaron mediante una prueba EMSA (análisis de movilidad electroforética). La punta de las flechas indica el complejo \kappaB activado, la proteína de unión recombinante expresada constitutivamente (RBP)-J\kappa y la sonda libre. La composición de los complejos NF\kappaB se ha descrito en detalle en (Vanden Berghe et al., 1999, J. Biol. Chem 274: 32091 - 32098, Plaisance et al 1997 Mol. Cell. Biol. 17:3733 - 3743).

Figura 11. Diversas estirpes celulares de L929sA con diversos constructos con una transfección estable de la Gal4, tal como se indica en el gráfico, se sometieron a una transfección transitoria con el gen indicador p(Gal)_{2}-5hu.IL6P-luc+. Después de la transfección, se dejaron las células sin tratar o se trataron con DEX (1 \muM) y diversas concentraciones de Cpd A, tal como se indica (en \muM).

Figura 12. Las células L929sA se tratan con 1 \muM de DEX, 1 ó 10 \muM de Cpd A y/o 2000 UI/ml de TNF. Se realizaron los lisados celulares y se activaron. La JNK, p38 o ERK se detectaron utilizando los anticuerpos MAK fosfoespecíficos correspondientes (Figuras 12 A, B y C respectivamente). La banda superior de la Figura 12A es una banda constitutiva inespecífica que realmente actúa de control de carga adicional.

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Descripción detallada de la presente invención

La presente invención se refiere a la utilización de un compuesto carboxi que tiene la fórmula siguiente (I) o su derivado aziridínico como fármaco:

1

en la que R es un grupo acetilo, X es un grupo cloruro e Y es un grupo metilo. Los productos farmacéuticos que comprenden sinefrina, compuestos de fórmula (I) en la que R es hidrógeno, X es un grupo hidroxilo e Y es un grupo metilo se dan a conocer en la patente JP-A-02032016 para el tratamiento de las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas. Estos últimos compuestos pueden utilizarse sorprendentemente como sustancias antiinflamatorias para tratar trastornos inflamatorios. Dichos compuestos se pueden utilizar también como sustancias para tratar trastornos relacionados con la expresión genética en la que intervienen el NF-\kappaB y/o el AF-1.

La presente invención se refiere además a composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas, que comprenden como ingrediente activo por lo menos uno de los compuestos definidos por la fórmula (I) junto con excipientes (farmacéuticamente) aceptables. Inesperadamente, parece ser que los compuestos con una fórmula (I), en la que el R es un grupo acetilo, X es un grupo cloruro e Y es un grupo metilo, presentan una fuerte actividad inhibidora de los genes activados por el NF-\kappaB, pero que ejercen una actividad débil o nula en relación con la respuesta de los genes que dependen del elemento de respuesta a los glucocorticoides (GRE). El compuesto preferido que ejerce dicha actividad es el cloruro de 2(4-acetoxifenil)-2-cloro-N-metil-etilamonio, y tiene un peso molecular de 264,14. Dicho compuesto es higroscópico y sensible a la luz. Se ha de mantener en el congelador (a -4ºC) y no se puede exponer a la luz. Dicho compuesto de hecho se empieza a ciclar en la correspondiente aziridina, cuando se mantiene en disolución (especialmente a un pH de 5 o superior) tal como se describe en Louw et al., 1997 (Biochem, Pharmacol 24:
167 - 75).

El término "compuesto" (o "compuesto de tipo farmacológico") resulta muy conocido por los expertos en la materia y comprende compuestos aptos para utilizar en medicina, por ejemplo como principio activo en un medicamento. Los compuestos de la presente invención se pueden purificar a partir de plantas tal como se ha indicado anteriormente pero se pueden sintetizar también mediante cualquier técnica conocida en química orgánica, biología molecular o bioquímica. Más específicamente, los compuestos de la presente invención se pueden sintetizar tal como se describe en Louw et al., 1997 (Biochem, Pharmacol 24: 167 - 75).

Resulta claro que los compuestos de la presente invención se pueden utilizar también como "moléculas iniciales". Es decir, pueden proporcionar un punto de partida en el diseño de otros compuestos que pueden presentar otras características.

Los compuestos de la presente invención presentan una actividad antiinflamatoria, analgésica y antipirética comparable a la de los glucocorticoides, pero evitan los efectos secundarios y resultan útiles en los métodos de tratamiento de enfermedades o trastornos en los que se encuentra implicado el NF-\kappaB/IL6. Dichas enfermedades y trastornos comprenden aquellos en los que se produce una inflamación o lesión tisular tales como la artrosis, la artritis reumatoide, la espondiloartritis anquilosante y otros signos reumáticos y dolorosos. Otras enfermedades en las que se produce una inflamación y en la que los compuestos de la presente invención resultan útiles comprenden el asma, la psoriasis, el choque septicémico y la enteropatía inflamatoria. Se cree, además, que el NF-\kappaB se encuentra implicado en trastornos en las que se produce apoptosis. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención resultan útiles en la limitación de los daños tisulares y/o celulares y pueden resultar beneficiosos en las enfermedades isquémicas, en las lesiones nerviosas y en los infartos de miocardio. Los compuestos de la presente invención resultan útiles en el tratamiento o en la prevención de la enfermedad de Alzheimer. Retardan la aparición de la enfermedad de Alzheimer o ralentizan el desarrollo de la misma, incluso cuando se utilizan en pequeñas cantidades.

Los compuestos o composiciones (fórmulas) de los mismos de la presente invención mencionados anteriormente se pueden administrar mediante cualquier método convencional comprendiendo la administración oral y la inyección parenteral (es decir, subcutánea, intraperitoneal, intravascular o intramuscular). El tratamiento puede consistir en una dosis única o en una pluralidad de dosis a lo largo de un período de tiempo.

De este modo, la presente invención comprende un método para tratar un paciente que presente un trastorno inflamatorio o relacionado con una inflamación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención. La presente invención resulta útil en el tratamiento de las inflamaciones, sin que se encuentre limitada a ello, de un paciente, y en el tratamiento de otros trastornos relacionados con las inflamaciones tal como el dolor, las jaquecas o la fiebre. Tal como ya se ha indicado anteriormente, los compuestos de la presente invención resultan útiles en el tratamiento de las artritis, comprendiendo pero sin limitarse a las mismas la artritis reumatoide, la espondiloartritis, la gota, la artrosis, el lupus eritematoso diseminado y la artritis reumatoide juvenil. Los compuestos de la presente invención resultan también útiles en el tratamiento del asma, la bronquitis, la dismenorrea, la tendinitis, la bursitis y los trastornos cutáneos tales como la psoriasis, los eczemas, las quemadas y la dermatitis. Además, los compuestos de la presente invención resultan útiles en el tratamiento de trastornos gastrointestinales tales como la enteropatía inflamatoria, la enfermedad de Crohn, la gastritis, el síndrome del colon irritable y la colitis ulcerosa y en la prevención o el tratamiento del cáncer, tal como el cáncer colorrectal, el cáncer de mama, el cáncer de próstata o la leucemia. Los compuestos de la presente invención resultan útiles además en el tratamiento de las inflamaciones en trastornos tales como las angiopatías, las jaquecas, la panarteritis nodular, la tiroiditis, la anemia aplásica, el linfoma de Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica, la esclerodermia, la fiebre reumatoide, la diabetes de tipo I, la miastenia grave, la esclerosis múltiple, la sarcoidosis, el síndrome nefrótico, el síndrome de Bechet, la polimiositis, la gingivitis, la hipersensibilidad, la inflamación alérgica que se produce tras una herida, la isquemia miocárdica y similares. Además, los compuestos de la presente invención resultan útiles en el tratamiento de enfermedades oftálmicas tales como la retinitis, las retinopatías, la conjuntivitis, la uveítis, la fotofobia ocular y las lesiones agudas del tejido ocular. Los compuestos de la presente invención resultan también útiles en el tratamiento de las inflamaciones pulmonares, tales como las que se encuentran relacionadas con las infecciones víricas y la mucoviscidosis. Los compuestos de la presente invención resultan útiles además en el tratamiento de determinados trastornos del sistema nervioso central tales como las demencias corticales, entre ellas la enfermedad de Alzheimer. ¡Se ha de hacer hincapié en el hecho de que los compuestos de la presente invención resultan útiles como sustancias antiinflamatorias con la ventaja adicional de presentar unos efectos secundarios significativamente menos perjudiciales que los glucocorticoides!. Además, los compuestos de la presente invención pueden resultar también útiles en el tratamiento de la rinitis alérgica, el síndrome de dificultad respiratoria, el síndrome del choque endotóxico, la arterioesclerosis y las lesiones producidas en el sistema nervioso central como consecuencia de un accidente cardiovascular, de una isquemia o de un traumatismo. Dichos compuestos, aparte de resultar útiles en el tratamiento de seres humanos, resultan también útiles en el tratamiento de mamíferos, entre ellos los caballos, los perros, los gatos, las ratas, los ratones, las ovejas, los cerdos, etc.

Con la frase "terapéuticamente eficaz" se pretende calificar la cantidad de sustancia a utilizar en el tratamiento que conseguirá el objetivo de mejorar en la gravedad de una inflamación y el de evitar los efectos secundarios habituales relacionados con tratamientos alternativos.

La presente invención se refiere también a composiciones que comprenden el compuesto de la presente invención junto con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o aditivos (farmacéuticamente aceptables) atóxicos (a los que se hará referencia colectivamente en la presente memoria como "excipientes") y, si así se pretende, otros ingredientes. Los principios activos y las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, mediante administración oral, intravascular, intraperitonial, subcutánea, intramuscular o tópica. En el caso de la administración oral, la composición (farmacéutica) se puede realizar en forma de por ejemplo comprimido, de cápsula, de suspensión de aerosol o líquida. La composición farmacéutica se realiza preferentemente en forma de unidades posológicas que comprende una cantidad particular del principio activo. Los ejemplos de dichas unidades posológicas son los comprimidos o las cápsulas. El principio activo se puede administrar también mediante inyección como composición en la que, por ejemplo, se puede utilizar una disolución salina, una disolución glucosada o agua como excipiente apto.

La cantidad de compuestos terapéuticamente activos que se administran y la pauta posológica para tratar el cuadro clínico con los compuestos y/o composiciones de la presente invención depende de diversos factores, entre ellos la edad, el peso, el sexo y la enfermedad del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía y la frecuencia de administración, y el compuesto particular utilizado, pudiendo de este modo variar ampliamente. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender principios activos en una cantidad comprendida aproximadamente entre 0,1 y 2.000 mg, preferentemente comprendida aproximadamente entre 0,5 y 500 mg y más preferentemente comprendida aproximadamente entre 1 y 100 mg. Se puede considerar adecuada una dosis diaria comprendida aproximadamente entre 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal, preferentemente comprendida aproximadamente entre 0,5 y 20 mg/kg de peso corporal y más preferentemente comprendida aproximadamente entre 0,1 y 10 mg/kg de peso corporal. La dosis diaria se puede administrar en una a cuatro tomas al día.

En el caso de la psoriasis y otros trastornos cutáneos, puede resultar preferible aplicar una preparación tópica de los compuestos de la presente invención sobre el área afectada de dos a cuatro veces al día.

En el caso de las inflamaciones oculares o de otros tejidos externos, por ejemplo, bucales o cutáneos, las fórmulas se aplican preferentemente como ungüento o crema tópica, o como supositorio, comprendiendo los principios activos en una cantidad total comprendida, por ejemplo, entre el 0,075 y el 30% p/p, preferentemente comprendida entre el 0,2 y el 20% p/p y más preferentemente comprendida entre el 0,4 y el 15% p/p. Cuando se formulan en un ungüento, los principios activos se pueden utilizar tanto en una base para el ungüento de tipo parafínico como de tipo hidromiscible. Alternativamente, los principios activos se pueden formular en forma de crema con una base para la crema de tipo aceite en agua. Si se pretende, la fase acuosa de la base para la crema puede comprender, por ejemplo, por lo menos un 30% p/p de un alcohol polihídrico tal como el propilenglicol, el butano-1-diol, el manitol, el sorbitol, la glicerina, el macrogol polietilen-glicol y mezclas de los mismos. La fórmula tópica puede comprender preferentemente un compuesto que aumente la absorción o la penetración del principio activo a través de la piel o de otras áreas afectadas. Los ejemplos de dichas sustancias que aumentan la penetración cutánea comprenden el dimetilsulfóxido y los análogos relacionados. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar también mediante un dispositivo transdérmico. Preferentemente se realizará la administración tópica utilizando un parche tanto de los que comprenden un depósito y una membrana porosa como de los de la variedad de matriz sólida. En cada caso el principio activo se administra de un modo continuo desde el depósito o microcápsulas a través de una membrana hasta el adhesivo permeable al principio activo, que se encuentra en contacto con la piel o mucosa del receptor. Si el principio activo se absorbe a través de la piel, un flujo controlado y determinado previamente del principio activo se administra al receptor. En el caso de que se utilicen microcápsulas, la sustancia utilizada para el encapsulado puede actuar asimismo de membrana.

La fase oleosa de las emulsiones de la presente invención se puede realizar a partir de ingredientes conocidos de un modo conocido. Mientras que la fase puede comprender simplemente un emulsionante, puede comprender una mezcla de por lo menos un emulsionante con un lípido sólido (graso) o un lípido líquido (aceite) o con ambos tipos de lípido. Preferentemente, comprende un emulsionante hidrófilo junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizante. Se prefiere también que comprenda tanto un lípido líquido como un lípido sólido. Juntos, el(los) emulsionante(s), con o sin estabilizante(s) forman la llamada cera emulsionante, y la cera junto con el lípido líquido y el lípido sólido forman la base del llamado ungüento emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las fórmulas para cremas. Los emulsionantes y los estabilizantes de la emulsión aptos para utilizar en la fórmula de la presente invención comprenden el Tween 60, el Span 80, el alcohol cetoestearílico, el alcohol miristílico, el monoestearato de glicerilo, el laurilsulfato sódico, entre otros. La elección de los lípidos líquidos o los lípidos sólidos aptos para la fórmula se basa en alcanzar las propiedades cosméticas que se pretenden, ya que la solubilidad del principio activo en la mayoría de los lípidos líquidos que probablemente se utilicen en fórmulas de emulsiones farmacéuticas es muy baja. Por lo tanto, preferentemente la crema ha de ser un producto no graso, que no manche y lavable con una consistencia suficiente para evitar que se produzcan pérdidas en tubos u otros recipientes. Pueden utilizarse ésteres alquílicos monobásicos o dibásicos, de cadena lineal o ramificada tales como el diisoadipato, el estearato de isocetilo, el diéster de propilenglicol y ácidos grasos de coco, el miristato de isopropilo, el oleato decílico, el palmitato de isopropilo, el estearato de butilo, el palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena ramificada. Dichos productos se pueden utilizar solos o en combinación en función de las propiedades que se requieran. Alternativamente, se pueden utilizar lípidos con un punto de fusión elevado tales como la vaselina filante y/o la vaselina líquida u otros lípidos líquidos minerales.

Las fórmulas aptas para la administración tópica ocular comprenden también los colirios en los que los principios activos se disuelven o se suspenden en un vehículo apto, especialmente un disolvente acuoso de los principios activos. Los principios activos antiinflamatorios se encuentran presentes en dichas fórmulas preferentemente en una concentración comprendida entre el 0,5 y el 20%, ventajosamente comprendida entre el 0,5 y el 10% y particularmente de aproximadamente el 1,5% p/p. Para su utilización terapéutica, los principios activos de la combinación de la presente invención se combinan habitualmente con uno o más aditivos aptos para la vía de administración indicada. Si se administra por vía oral, se pueden mezclar los compuestos con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres celulósicos de ácidos alcanoicos, ésteres alquílicos de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato magnésico, óxido magnésico, sales sódicas y cálcicas de los ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma arábiga, alginato sódico, povidona y/o alcohol polivinílico, y a continuación se comprimen o se encapsulan para su administración adecuada. Dichas cápsulas o comprimidos pueden comprender una fórmula de liberación controlada tal como se puede proporcionar en una dispersión el principio activo en hipromelosa. Las fórmulas para la administración parenteral se pueden realizar en forma de disoluciones o suspensiones para inyecciones estériles isotónicas acuosas o no acuosas. Dichas disoluciones y suspensiones se pueden preparar a partir de polvos o gránulos estériles que presenten uno o más de los vehículos o diluyentes mencionados para ser utilizados en las fórmulas de administración oral. Se puede disolver el compuesto en agua, macrogol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro sódico y/o diversas sustancias estabilizantes del pH. Otros aditivos y modos de administración resultan ampliamente conocidos en la técnica farmacéutica.

La presente invención se explicará a continuación más detalladamente mediante una sección de "Ejemplos", sin que se limite al alcance de la presente invención.

Ejemplos Materiales y Métodos Citocinas y reactivos

El TNF murino recombinante, producido en nuestro laboratorio, presenta una actividad biológica específica de
1,3 x 10^{8} unidades/mg de proteína y contiene una cantidad < 1,8 ng de endotoxina/mg de proteína. La actividad específica se determinó mediante un análisis normalizado de citotoxicidad en células 164 WEHI cl 13 en comparación con una preparación normalizada internacional de TNF (National Institute for Biological Standards and Control ["Instituto nacional de normativas y control biológico"], Potters Bar, UK. La dexametasona se adquirió en Sigma. Se preparó de modo habitual una disolución inicial del reactivo en sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma-Aldrich) y se almacenó a 4ºC. Se siguió el mismo procedimiento con el antiglucocorticoide RU38486, descrito previamente (Vanden Berghe et al., 1999). La estaurosporina (STS) (Tamaoki et al., 1986; Ruegg et al., 1989) se adquirió en Calbiochem-Novabiochem International (San Diego, CA) y se almacenó como disolución 2 mM en DMSO a -20ºC. El compuesto A o cloruro de 2(4-acetoxifenil)-2-cloro-N-metil-etilamonio presenta un peso molecular de 264,14. Se preparó una disolución inicial en DMSO, se tomó una cantidad equivalente y se almacenó a 4ºC en la oscuridad.

Los experimentos de control verificaron que la concentración final del disolvente orgánico no interfería con ninguno de los análisis.

Los anticuerpos policlonales anti MAPK (cinasa activada por mitógenos) de conejo p38 (Thr-180 / Tyr-182), p42/p44 (Thr-202 / Tyr-204) y SAPK/JNK (Thr-183 / Tyr-185) detectan únicamente la forma fosforilada dual de la proteína MAPK. Se adquirieron en New England Biolabs (Beverly, MA, EE. UU.) como parte de un kit, que comprende también anticuerpos anti IgG de conejo acoplados a la peroxidasa de rábano, que se utiliza como segundo anticuerpo en la inmunotransferencia de tipo Western.

El reactivo con la luciferasa (luc) comprendía 270 \muM de CoA (Sigma), 470 \muM de luciferina (Sigma) y 530 \mum de ATP (Boehringer Mannheim) en 10 mM de tricina, 0,54 mM de (MgCO_{3})_{4}Mg(OH)_{2}, 1,34 mM de MgSO_{4}, 0,05 mM de ácido edético (EDTA) y 16,7 mM de ditiotreitol (DTT) (todos ellos adquiridos en Sigma).

Los plásmidos p1168hu.IL6P-luc+, p1168(AP-1-mut)IL6P-luc+, p1168(\kappaBmut)IL6P-luc+ y p(IL6\kappaB)_{3}50hu.IL6P-luc+ se encuentran previamente descritos (Plaisance, 1997; Vanden Berghe, 1998). El pE-selectina-Luc constituyó un amable obsequio por parte del Dr. D. Goeddle (Tularik). El psVhGR\alpha y el pMMTV-Luc constituyeron un generoso obsequio por parte del Dr. W. Rombauts (Leuven). El pNF\kappaB-Luc se adquirió en Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA). El p(GRE)_{2}-50hu.IL6P-luc+ se obtuvo substituyendo los grupos \kappaB del p(IL6\kappaB)_{3}50hu.IL6P-luc+ con una región ligadora, comprendiendo dos secuencias de consenso GRE (subrayadas) flanqueadas por unas secuencias de restricción BgIII i PstI. Se produjo la hibridación de los siguientes nucleótidos: AGATCTCTCTGCTGTA
CAGGATGTTCTAGCGGAT CCTGCTGTACAGGATGTTCTAGCTACCTGCAG y TCTAGAGAGACGACATGT
CCTACAAGATCGCCTAGGACGACATGTCCTACAAGATCGATGGACGTC. Los plásmidos pGal4, pGal4-p65 y
pGal4-VP16 fueron proporcionados generosamente por el Dr. M. L. Schimtz (DKFZ, Heidelberg). El p(Gal)_{2}-50hu.
IL6P-luc+ se encuentran previamente descritos (De Bosscher, 1997).

Procedimiento de transfección. Se realizó la transfección estable de los fibroblastos de ratón L9292sA mediante el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio según los protocolos estándar (Graham et al., 1973; Vanhoenacker et al., 1994) utilizando un excedente diez veces mayor del plásmido de interés sobre el plásmido seleccionado pPGK\betaGeobpA. Las células transfectadas se seleccionaron en 500 \mug/ml de G418 durante dos semanas. Posteriormente, se cultivaron los clones celulares resistentes a fin de estabilizar las variaciones de los clones individuales en la expresión y proporcionar de este modo una respuesta fiable con la inducción. El plásmido cotransfectado pPGK\betaGeobpA, que proporciona resistencia al G418 y que expresa la actividad enzimática constitutiva de la \beta-galactosidasa, se utilizó también como control interno en el cálculo de la concentración proteica. Se realizó la transfección transitoria de las células L9292sA mediante el método de transfección del DEAE-dextrano, esencialmente como se ha descrito previamente (De Bosscher et al., 1997).

Se realizó la transfección transitoria de las células embrionarias humanas de riñón HEK293T mediante la técnica de precipitación con fosfato cálcico. En resumen, se cultivaron 10^{5} células en crecimiento activo en placas de 24 pocillos 24 horas antes de realizar la transfección y se realizó la transfección de 400 ng de ADN total. 16 horas después de la transfección, se sustituyó el medio con un medio fresco que contenía suero fetal al 5% y suero de ternera recién nacida al 5% (Life Technologies, Paisley, GB), que comprendían los productos inductores adecuados. Se procedió a la lisis celular con una disolución amortiguadora lítica (TROPIX, Bedford, MA) y se analizaron las muestras con relación a su contenido proteico o su contenido en \beta-galactosidasa y la actividad de la luciferasa.

Análisis del gen indicador. Se realizaron los análisis de la luciferasa según las instrucciones del fabricante (Promega Biotech). Se determinó la emisión de luz en un contador de luminiscencia para microplacas (Top-Count; Packard Instrument Co., Meridan, CT). La actividad de la luciferasa, expresada en unas unidades lumínicas arbitrarias, se corrigió en relación con la concentración proteica de la muestra mediante la normalización a los niveles coexpresados de \beta-galactosidasa. Los niveles de la proteína \beta-galactosidasa se determinaron con un equipo Galacto-Light (TROPIX, Bedford, MA) para análisis quimioluminiscentes del indicador. La actividad del promotor se expresa como factor de "inducción relativa", es decir, la proporción entre los niveles de expresión en el estado inducido en comparación con el estado no inducido, tomándose este último como 1.

Cultivo celular. Se cultivaron 10^{5} células en placas de 24 pocillos y se realizaron las inducciones por lo menos por triplicado en cada experimento independiente, que se realizó dos veces. Las inducciones con DEX o Cpd A en las concentraciones indicadas se añadieron a -2 h y se dejaron un total de 8 h, mientras que el TNF (2000 UI/ml) o la STS (60 nM) se añadieron en el instante cero y se dejaron con las células durante 6 h.

Los lisados se realizaron lavando las células una vez con PBSA y a continuación se añadieron 100 \mul de disolución amortiguadora lítica (TROPIX, Bedford, MA) por cada 24 pocillos. Se determinaron los niveles de luciferasa y de \beta-galactosidasa tal como se ha indicado anteriormente.

Prueba ELISA para la IL-6. Se realizó una prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para la IL-6 murina utilizando un kit, realizándose el análisis según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, GB). Al realizar el gráfico estándar, se pudieron correlacionar las determinaciones de absorbencia (OD) con los niveles de IL-6 presente en el sobrenadante de las células inducidas. Los niveles de IL-6 se expresaron en pg/ml.

\newpage

EMSA. Se realizó un análisis de movilidad electroforética o EMSA esencialmente tal como se ha descrito anteriormente (De Bosscher et al., 1997). La actividad de unión con el ADN se analizó con un oligonucleótido que contenía la secuencia del NF-\kappaB que comprendía la secuencia 5'- AGCTATGTGGGATTTTCCCATGAGC-3' (se ha subrayado la secuencia simple KB derivada del promotor de la IL-6). Se añadieron DEX (1 \muM) y Cpd A (1 y 0,1 \muM) dos horas antes del TNF (2.000 UI/ml). Para el desplazamiento, 1 \mul del anticuerpo policlonal anti-p65 obtenido en Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) se añadió a la reacción de unión.

Análisis de la activación de la MAPK. Se realizó el análisis esencialmente tal como se ha descrito por Boone et al., 1998. En resumen, se cultivaron las células L929sA en placas de 6 pocillos a 250.000 células/pocillo. Después de 24 h, las células se dejaron sin tratar o bien se trataron con 1 \muM de DEX o con Cpd A (1 ó 10 \muM, tal como se indica en la figura) durante 2 horas y/o 2.000 UI/ml de TNF durante 15 minutos. Al final del período de incubación, se lavaron las células en PBS. Los extractos celulares se prepararon esencialmente tal como se describe en el protocolo del kit de anticuerpos PhosphoPlus p38 MAPK (New England Biolabs). Una quinta parte del total del lisado celular (20 \mul) se separó con SDS-PAGE al 12% y se realizó la inmunotransferencia en una membrana de nitrocelulosa. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western se realizó para detectar las proteínas MAPK fosforiladas.

Ejemplo 1 El Cpd A actúa de represor transcripcional de la actividad promotora de la IL-6 inducida por el TNF

A fin de investigar si la acción inhibidora del Cpd A se produce en el nivel transcripcional de la inducción del gen de la IL-6, se analizó el efecto del Cpd A en un constructo genético indicador activado por el promotor de la IL-6. La Figura 1 ilustra que la inducción con TNF de un constructo p1168hu.IL6P-luc+ integrado establemente en células L929sA, se puede inhibir eficazmente con 1 \muM de DEX. Se pone ya de manifiesto un efecto de modulación por disminución del Cpd A a 0,1 \muM, mientras que una concentración de 1 \muM de Cpd A junto con el TNF disminuye el factor de inducción relativo de la luciferasa por lo menos en el mismo grado que 1 \muM de DEX.

Ejemplo 2 El Cpd A inhibe la variante del promotor de la IL-6 activada por el AP-1 e inducida por la STS

Los glucocorticoides pueden asimismo ejercer una represión transcripcional sobre los genes activados mediante el AP-l. A fin de observar si la acción inhibidora del Cpd A se puede dirigir también a la actividad del AP-1, se procedió a la mutación de la secuencia KB del promotor de la IL-6. En dicha variante del promotor, los resultados previos habían demostrado una pérdida completa de la inducibilidad por parte del TNF (Vanden Berghe et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 3285 - 3290). Por este motivo, se analizó el efecto del Cpd A en la actividad del promotor inducida por la STS. La Figura 2 ilustra que la STS puede activar claramente un constructo p1168(\kappaBmut)IL6P-luc+, integrado establemente en células L9292sA, y que 1 \muM de DEX inhibe eficazmente la activación transcripcional en la que interviene el AP-1. El Cpd A también puede inhibir la activación transcripcional inducida por la STS a unas concentraciones de 0,1, 1 y 10 \muM.

Ejemplo 3 El Cpd A realiza la represión transcripcional de la actividad del promotor de la IL-6 inducida por el TNF mediante una interferencia negativa con el factor de transcripción NF-\kappaB

Los estudios previos realizados por nuestro grupo han indicado que el NF-\kappaB es el factor de transcripción más importante implicado en la inducción genética de la IL-6 en la que interviene el TNF. Sin embargo, la inducción del promotor de la IL-6 por parte del TNF activa no únicamente el NF-\kappaB sino también el AP-1. A fin de descartar el efecto adicional del TNF en la actividad del AP-1 y para investigar el objetivo real del factor de transcripción del Cpd A, se realizó una mutación en la secuencia de unión del AP-l. La Figura 3 ilustra cómo el TNF activa el constructo p1168(AP-1-mut)IL6P-luc+ integrado establemente en las células L9292sA, y que 1 \muM de DEX inhibe eficazmente la activación transcripcional en la que interviene el NF-\kappaB. De nuevo, el Cpd A a unas concentraciones de 1 \muM y 10 \muM puede inhibir significativamente la actividad del promotor inducida por el TNF. La Figura 4 ilustra como el Cpd A inhibe, en un nivel similar al de la DEX, el constructo genético indicador recombinante p(IL6\kappaB)_{3}50hu.IL6Pluc+ activado por el TNF.

Ejemplo 4 El Cpd A regula por disminución la actividad del promotor de la E-selectina inducida por el TNF

Se analizó la regulación por disminución del Cpd A en otros promotores fisiológicos, tales como los de los genes de la E-selectina y del ICAM. La Figura 5 ilustra cómo la inhibición en la que interviene el Cpd A se puede demostrar asimismo en la pE-selectina-luc+ inducida por el TNF, integrada establemente en las células L929sA. 10 \muM de Cpd A inhiben el indicador activado por el TNF en un nivel equivalente a 1 \muM de DEX, es decir, a un nivel de fondo. 1 \muM de Cpd A junto con el TNF resulta también eficaz, a pesar de que en un nivel inferior. Se obtuvieron unos resultados similares con el promotor del 1CAM (Figura 6).

Ejemplo 5 El Cpd A no presenta potencial de activación transcripcional en el gen indicador que depende del GRE

El Cpd A presentó una actividad represora de la transcripción en los genes activados por el NF-\kappaB y el AP-1 similar a la de los glucocorticoides. Resultaba interesante conocer si el Cpd A intervenía en dichos efectos uniéndose al receptor de los glucocorticoides y modularlo del mismo modo que el ligando esteroideo, la DEX. Se analizó si el Cpd A puede estimular el promotor activado por el GRE acoplado a la luciferasa.

La Figura 7 demuestra la falta de actividad del Cpd A a 0,1 y 10 \muM en el constructo p(GRE)_{2}-50-luc+, integrado establemente en las células L9292sA. Contrariamente, la DEX puede aumentar la activación transcripcional en por lo menos 8 veces. La estimulación con ambos productos juntos indica que se produce la competición por las moléculas GR (receptores esteroideos) presentes en la célula.

Ejemplo 6 El Cpd A inhibe la producción de la proteína IL-6 inducida por el TNF

Los corticoesteroides ejercen su acción antiinflamatoria al modular por descenso la expresión de los genes pro-inflamatorios. Resulta interesante conocer si el Cpd A puede reprimir la citocina pro-inflamatoria IL-6 en comparación con la dexametasona, un ligando esteroideo sintético para los GR.

La Figura 8 ilustra como el TNF puede estimular la producción de la IL-6 murina endógena en las células L9292sA, y que el Cpd A a 0,1 \muM y a 10 \muM puede disminuir eficazmente dichos niveles inducidos por el TNF.

Ejemplo 7 La represión que ejerce el Cpd A en los genes activados por el NF-\kappaB depende de la presencia de los GR y de la constitución de la secuencia TATA

En las células HEK293T, la cantidad de GR endógenos resulta insignificante, por lo tanto, se utilizaron dichas células para analizar si el efecto del Cpd A depende de la presencia de los GR. La Figura 9 (panel A y panel B) demuestran que, únicamente cuando se encuentran presentes los GR, la DEX y el Cpd A pueden reprimir el TNF activo p (IL6-\kappaB)_{3}50hu.IL6P-luc+ (compárense los carriles 4 y 8 del panel A con los carriles 12 y 16 del panel B). Dicho resultado demuestra que el Cpd A actúa por medio de los GR activados. Previamente se ha observado que la represión de los glucocorticoides dependía de la identidad de la secuencia TATA. Hemos descubierto que el TNF puede activar un constructo NF-\kappaB-Luc que comprenda la secuencia TATA E1B, pero que deja de presentar respuesta a la represión de los GC, sin embargo, todavía se desconoce el mecanismo molecular responsable de dicho notable fenómeno. Se pretendía descubrir si la represión del Cpd A estaba influida por el contexto de la secuencia TATA.

De un modo interesante, de un modo similar al observado con la DEX, el Cpd A tampoco puede intervenir en la represión del pNF-\kappaB-Luc, lo que sugiere que el Cpd A y la DEX actúan mediante un mecanismo similar (Figura 9, panel C y D).

Ejemplo 8 El Cpd A no interfiere con la actividad de unión del NF-\kappaB con el ADN

El mecanismo de acción por el que el Cpd A inhibe la expresión del gen dirigido por el NF-\kappaB puede tener lugar a distintos niveles. Previamente, hemos demostrado que en las células L929sA la DEX reprime los genes dirigidos por el NF-\kappaB sin afectar a la capacidad de unión del NF-\kappaB con el ADN. Debido a que algunos efectos del Cpd A recuerdan la represión genética en la que intervienen los GR, se investigó el efecto del Cpd A en la actividad de unión del NF-\kappaB con el ADN. La Figura 10 ilustra cómo también en el caso del Cpd A no se observa cambio alguno en la actividad de unión del NF-\kappaB con el ADN a todas las concentraciones indicadas. Se obtuvieron unos resultados similares con células endoteliales TC10 de ratón (no se ilustran los datos). Dichos resultados sugieren que el mecanismo de represión por parte del Cpd A no se realiza suprimiendo la actividad de unión del NF-\kappaB con el ADN y permite suponer un mecanismo que recuerda al publicado en relación con la represión de los genes dirigidos por la IL-6 en la que intervienen los GC (De Bosscher, 1997).

Ejemplo 9 El Cpd A inhibe la activación transcripcional del p65

Nuestros datos anteriores demostraron que los glucocorticoides intervenían en la represión transcripcional del NF-\kappaB mediante un mecanismo de interferencia nuclear entre dicho factor de transcripción y los GR activados (De Bosscher, 1997). Debido a que el Cpd A, de un modo similar a la DEX, no afecta la actividad de unión del NF-\kappaB con el ADN, se analizó su efecto en la capacidad de activación transcripcional del p65, utilizando una proteína híbrida Gal4-p65. Dicha proteína de fusión estimula un gen indicador que depende del galo. La Figura 11 ilustra como la DEX, así como 10 \muM de Cpd A, puede realizar una inhibición semimáxima de la actividad de la Gal4-p65. La especificidad de la represión se demuestra utilizando la Gal 4 fusionada con el activador vírico VP16 como control negativo.

Ejemplo 10 El Cpd A no inhibe la actividad de la cinasa JNK

Se ha publicado que parte del mecanismo por el que los GC pueden intervenir en la represión genética de los genes dirigidos por el AP-1 consiste en inhibir la actividad de la cinasa JNK. La DEX puede evitar la fosforilación y la posterior activación de la JNK, a su vez incapaz de fosforilar el componente c-Jun del AP-1 (Caelles, 1997). Nuestra intención era la de descubrir si el Cpd A podía asimismo inhibir la MAPK activada, de un modo similar a lo que sucede con la DEX. Se realizaron análisis de la MAPK con lisados obtenidos a partir de células L929sA y se obtuvieron los siguientes resultados interesantes (Figura 12). A diferencia de la DEX, que puede inhibir la cantidad de JNK fosforilada, el Cpd A no afecta a la cantidad de JNK p46 y p54 activada. La cantidad de cinasas MAPK p38 y ERK fosforiladas activadas no se vio afectada ni por la DEX ni por el Cpd A. A partir de dicho resultado podemos llegar a la conclusión de que el Cpd A no interviene en la represión del gen que depende del AP-1 mediante la interferencia con la vía de la cinasa JNK.

Ejemplo 11 11.1. Actividad beneficiosa del Cpd A en las pruebas del granuloma provocado con una bolita de algodón y del edema provocado con aceite de crotón en el oído

Se analizó la actividad antiinflamatoria del Cpd A en dos modelos con animales, la prueba del granuloma provocado con una bolita de algodón realizado con hembras de rata Wistar y la prueba del edema provocado con aceite de crotón en el oído con ratones.

Se realizó la prueba del granuloma provocado con una bolita de algodón tal como describen Meier, R. et al. (1950: Experientia 6: 469-477), Vayssiere, B. M. et al. (Mol. Endocrinol. 1997 Agosto; 11(9): 1245 - 55) y Vanden Berghe et al. (Mol. Pharmacol. 1999, Octubre; 56(4): 797 - 806). Se introdujeron dos bolitas de algodón (de 10 mg cada una de ellas) en la hipodermis de la zona superior dorsal de hembras de rata Wistar (con un peso comprendido entre 90 y 100 g, Iffa Credo, Francia). Los compuestos a analizar se administraron por vía oral durante 4 días. Veinticuatro horas después del tratamiento, se sacrificó el animal, se extrajo cuidadosamente la bolita de algodón con el granuloma que lo envuelve y se determinó su peso seco. Para ello, se calentaron el granuloma y la bolita de algodón a 60ºC durante la noche. Se determina el peso seco del granuloma restando el peso inicial de la bolita de algodón. El potencial antinflamatorio de los compuestos se analiza mediante su capacidad para evitar la formación del granuloma y se expresa como las dosis del compuesto a las que disminuye la formación del granuloma en un 50% (ED50, proporcionada en miligramos/kg) que se estima a partir de las curvas de dosis y respuesta. En la misma prueba, se extrae el timo y se determina la timólisis. Las dosis de Cpd A necesarias para obtener una reducción del 50% en el peso del timo (ED50) se proporcionan en miligramos/kg.

Las pruebas del edema provocado con aceite de crotón en el oído se realizaron tal como describen Tonelli, G. et al., 1965 (Endocrinology, 77: 625 - 634), Vayssiere, B. M. et al. (Mol. Endocrinol. 1997 Agosto; 11(9): 1245 - 55) y Vanden Berghe W. et al. (Mol. Pharmacol. 1999, Octubre; 56(4) : 797 - 806) en grupos de ocho machos de ratones OF1 que presentaban un peso comprendido entre 18 y 22 g (Iffa Credo, L'Arbresle, Francia). Se provoca el edema en un oído mediante la aplicación de una disolución de aceite de crotón (2% vol/vol) en piridina, agua y éter en una proporción de 4:1:14,6 (en volumen). Se sacrificaron los animales 6 horas más tarde, se extrajeron los oídos y se pesaron. Se determinó el edema a partir de la diferencia en peso que se presentaba entre los oídos tratados con la sustancia irritante y el oído contralateral. El compuesto a analizar se disuelve en la disolución de aceite de crotón y se aplica por vía tópica en el oído durante 6 horas. Los valores de la ED50 corresponden a las dosis que reducen el edema de control en un 50%. Los valores de la ED50 se expresan en microgramos/oído.

11.2. Efectos beneficiosos del Cpd A en los trastornos autoinmunitarios en los modelos con ratones

Los modelos experimentales de ratones con trastornos autoinmunitarios de encefalomielitis (EAE), uveítis (EAU), conjuntivopatías inflamatorias II (CIA), tiroiditis, nefritis, miastenia grave, orquitis, lupus, diabetes y artrosis tal como describen en detalle Matthys, P. et al. (J. Leukoc. Biol. 2000, Octubre; 68(4): 447) - 54, Matthys, P. et al. (J. Immunol. 1995, Octubre; 15; 155(8): 3823 - 9), Matthys, P. et al. (Eur. J. Immunol. 1993, Septiembre; 23 (9): 2209 - 16), Eynon, E. E. et al. (Immunol Rev., 1999, Junio; 169: 5 - 10) y Kollias G. et al. (Immunol Rev., 1999, Junio; 169:175-94) se utilizan para analizar los efectos beneficiosos del Cpd A en los trastornos autoinmunitarios. El Cpd A se administra por vía sistémica (intravenosa o intraperitoneal) y/o local (intrarticular) mediante inyección. En el caso de producirse una depuración del principio activo con una estabilidad y rapidez bajas, se utiliza una bomba peristáltica a fin de obtener un flujo continuo y una acumulación de Cpd A en el tejido específico que se está investigando. El Cpd A se administra en una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación descritos en detalle en Alegre et al. (J. Immunol., 1991 vol.
146, p. 1184).

11.3. Efectos beneficiosos del Cpd A en la letalidad del TNF en modelos con ratones

Se utilizaron hembras de ratones C57BI/6 (Charles River, Sulzfeld, Alemania), ratones deficientes en eNOS (Huang et al., Nature, 1995, vol. 377, p. 239 - 242) o ratones deficientes en iNOS (Laubach et al., Proc. Natl. Acad. Sci, EE. UU., 1995, vol. 92, p. 10688 - 10692) (Jackson Laboratories) de una edad comprendida entre las 7 y las 12 semanas al principio del experimento. Se alojaron los animales en unas instalaciones con aire acondicionado y la temperatura controlada, con ciclos de luz y oscuridad de 12 horas, y con alimentos y agua a discreción. Todos los experimentos están autorizados y realizados según las directrices del Comité de Ética en Experimentación Animal de las universidades de Ghent, Bélgica, y Maastricht, Holanda. Se utilizaron cuatro distintos modelos de letalidad del TNF. En el modelo I se inyecta una dosis letal de TNF por vía intravenosa en ratones sanos no sensibilizados. Los modelos de sensibilización II, III y IV se realizaron tal como se ha descrito en detalle anteriormente (Cauwels et al., J. Immunol., 1995, vol. 154, p. 2753 - 2763; J., Immunol., 1996, vol. 156, p. 4686 - 4690). En resumen, en el modelo II los ratones que presentan un tumor LLCH61 intramuscular con un diámetro de aproximadamente 15 mm se someten a una prueba de provocación con 20 \mug de hTNF, mientras que en el modelo III se sensibiliza los ratones mediante una infección con BCG 2 semanas antes de someterlos a una prueba de provocación mediante una inyección de 10 a 15 \mug de hTNF. El modelo IV consiste en un tratamiento intraperitoneal diario con 1 \mug de rmIL-12 durante 5 días consecutivos y a continuación, después de un intervalo de 2 días, se someten a una provocación con una dosis letal de hTNF de 5 a 10 \mug. Todas las inyecciones de TNF se realizaron por vía intravenosa (200 \mul, diluido en una PBS sin endotoxinas) y 100% letal. Se determinó la DL100 con exactamente el mismo lote de TNF y ratones antes de iniciar cada uno de los experimentos individuales. Se alcanza la letalidad generalmente al cabo de 7 días después de la provocación con TNF. Las citocinas, las estirpes celulares y los reactivos hTNF, mTNF y mlFNg recombinantes se produjeron en Escherichia coli y se purificaron hasta homogeneizar en nuestro laboratorio. El contenido en endotoxinas es de 0,02 ng/mg, tal como se valoró mediante un análisis cromogénico del lisado del amebocito de Limulus (Coatest; Kabivitrium, Estocolmo, Suecia). Los organismos vivos BCG se obtuvieron en el Instituto Pasteur de Brabant (Bruselas, Bélgica) y los recombinantes mIL-12 fueron proporcionados generosamente por el Dr. M. Gately (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ). El clon LLC murino H61 y la sublínea de melanoma B16BL6 son gentileza del Dr. M. Mareel (University Hospital, Ghent, Bélgica) y gentileza del Dr. G. Vaes y el Dr. I. Fidler, respectivamente. Las células tumorales se cultivaron en DMEM enriquecido con FCS al 10%, 50 U/ml de penicilina G, 50 mg/ml de sulfato de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Antes de la inyección, se lavaron dos veces las células en PBS. Se inyectó el Cpd A por vía intravenosa a una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que los valores de prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación. Se disolvió el Cpd A en una disolución apta para inyectar por vía intravenosa. Las disoluciones para las inyecciones se diluyeron en PBS sin endotoxinas y, excepto cuando se indica lo contrario, los volúmenes de las inyecciones fueron de 200 \mul. Se administró el Cpd A por vía sistémica (intravenosa o intraperitoneal) o local (intrarticular) mediante inyección. En el caso de producirse una depuración del principio activo con una estabilidad y rapidez bajas, se utiliza una bomba peristáltica a fin de obtener un flujo continuo y una acumulación de Cpd A en el tejido específico que se está investigando. El Cpd A se administra en una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación descritos en detalle en Alegre et al. (J. Immunol., 1991 vol. 146, p. 1184). Más detalles del experimento descrito anteriormente se pueden encontrar en Cauwels et al. (Immunity. 2000 Agosto; 13(2): 223 - 31), Freeman, B. D. y Natanson, C. (Expert. Opin. Investig. Drugs. 2000 Julio; 9(7): 1651 - 63), Meduri G. U. (J. Chemother., 1999 Diciembre; 11(6): 541 - 50) y Kollias et al. (Immunol. Rev. 1999, Junio; 169: 175 - 94).

11.4. Efectos beneficiosos del Cpd A en la colitis aguda en modelos con animales

En el presente experimento se utilizan los modelos experimentales con ratones que se describen en detalle en Steidler, L., W. Hans, et al. (2000, Science 289(5483); 1352 - 5). Bhan et al. (Immunol. Rev. 1996 Junio; 169: 195 - 207); Aranda et al. (J. Immunol. 158(7): 3464 - 73), Berg, D. J. y N. Davidson, et al. (1996, J. Clin Invest. 98(4): 1010 - 20),
Kojouharoff, G., W. y Hans, et al. (1997, Clin. Exp. Immunol. 107(2): 353 -8), Kuhn, R., J. Lohler, et al. (1993, Cell 75(2): 263 -74), Okayasu, I., S. Hatakeyama et al. (1990), Gastroenterology 98(3): 694 - 702) y/o Powrie, F., R. L. Coffman, et al. (1994, Res. Immunol. 145(5): 347 - 53).

Se administró el Cpd A a una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación descritos en detalle en Steidler, L., W. Hans, et al. (2000, Science 289(5483); 1352 - 5).

11.5. Efectos beneficiosos del Cpd A en un modelo de choque hepático (modelo de hepatitis)

Se utilizó en el presente experimento un modelo experimental de choque tal como se describe en Van Molle et al. (Infect. Immun. 2000 Septiembre; 68(9): 5026 - 9) y Hochepied et al. (J. Biol. Chem. 19 de Mayo de 2000; 275(20): 14903 - 9). Se utilizaron hembras de ratones C57BL/6 (Iffa-Credo, Saint Germain-sur-l'Arbresle, Francia) de una edad comprendida entre 8 y 12 semanas. Se crearon ratones transgénicos con \alpha-1-AGP de rata tal como se describe a continuación. Se generaron inyectando ADN genómico en cigotos (C57BL/6 3 DBA/2)F1 y con los ratones transgénicos resultantes se realizó un retrocruzamiento de ocho generaciones a un C57BL/6 previo. Los ratones transgénicos heterocigóticos de la línea 9,5-5 producen constitutivamente aproximadamente 2 mg/ml de \alpha-1-AGP. Ello es 10 veces más que en los animales silvestres (wt). Se hizo proliferar la colonia criando los ratones transgénicos heterocigóticos con hembras de ratones C57BL/6; de la descendencia, que comprendía las crías transgénicas heterocigóticas y las crías silvestres, se obtuvo su genotipo en la edad de destete mediante una prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA). Se recogieron 100 \mul de sangre mediante hemorragia retroorbital y a continuación se preparó el suero. Se purificó el \alpha-1-AGP mediante extracción con fenol y se recubrió en el fondo de una placa de análisis de inmunoabsorción enzimática. Después de lavar, se detectó el \alpha-1-AGP de rata utilizando un anticuerpo policlonal anti \alpha-1-AGP de rata (generados en conejos por H. Baumann) (1/1.000) y un anticuerpo anti-conejo, conjugado con la fosfatasa alcalina (Sigma, San Luís, MO; 1/5.000) El anticuerpo anti \alpha-1-AGP de rata no presenta reactividad cruzada con el \alpha-1-AGP. Aproximadamente el 50% de la descendencia es transgénica heterocigótica. En los experimentos se utilizaron únicamente hembras de ratón con una edad comprendida entre 8 y 12 semanas. Tanto los ratones transgénicos como los de control (crías no transgénicas) presentaron unos pesos corporales comparables. Se mantuvieron los ratones en unas instalaciones para ratones convencionales, con aire acondicionado, con ciclos de luz y oscuridad de 12 horas, y con alimentos y agua a discreción. Las inyecciones intraperitoneales fueron de un volumen de 0,5 ml. Los reactivos se diluyeron en una disolución salina amortiguadora de fosfato (PBS) sin pirógenos justo antes de la inyección. Se inyectaron los ratones por vía intramuscular con bacterias (muslo derecho) en un volumen de 100 \mul. Se recogió la sangre de los ratones mediante hemorragia retroocular o mediante punción cardíaca sometidos a anestesia con éter o tribromoetanol. (160 mg/kg), respectivamente, y se preparó por coagulación durante 30 minutos a 37ºC, se extrajo el coágulo y se centrifugó (15 minutos a 15.000 g). El \alpha-1-AGP bovino, la seroalbúmina bovina (BSA), la IgG anti conejo conjugada con la fosfatasa alcalina y el fosfato de p-nitrofenilo se obtuvieron en Sigma. Las preparaciones del \alpha-1-AGP comprenden 10 ng de endotoxina/mg de proteína. El \alpha-1-AGP era puro al 99% tal como mencionaba el fabricante tal como se comprobó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y la posterior tinción con azul de Coomassie. El IL-15 recombinante de ratón se expresó y se purificó a partir de E. coli en nuestro laboratorio, presentando una actividad específica de 3,65\cdot10^{8} unidades/mg, y conteniendo menos de 10 ng de endotoxina/mg de proteína. La K. pneumoniae (ATCC 43816), una cepa que produce una infección letal en los ratones normales, se inyectó en el músculo del muslo derecho tal como se ha descrito. Se utilizó un inóculo de 1 a 3\cdot10^{6} UFC (unidades formadoras de colonias) / ratón excepto en los estudios con los ratones transgénicos con \alpha-1-AGP de rata, en la que se utilizaron l0^{5} UFC/ratón. Se valoró la supervivencia tras un período de por lo menos 5 días. Depuración de bacterias: 36 horas después de la inyección de K. pneumoniae, se anestesiaron los ratones mediante una inyección intraperitoneal de tribromoetanol. Se extrajo la sangre mediante punción cardíaca. Para la preparación del plasma, se añadieron 450 \mul de sangre a 50 \mul de citrato sódico (0,1 M). Inmediatamente a continuación, se sacrificaron los animales por luxación cervical. A continuación se perfundieron los ratones con 10 ml de una disolución de NaCl al 0,9% para quitar la sangre. Se extrajeron de un modo aséptico el hígado, el bazo y los riñones, se pesaron y se homogeneizaron mecánicamente en una disolución salina estéril. Para realizar la homogeneización, se diluyó el hígado (p/v) dos veces; el bazo y los riñones se diluyeron 10 veces. Se diluyeron las suspensiones y se sembraron en agar nutritivo estéril. Tras incubar durante la noche a 37ºC, se determinaron los valores de las UFC. Determinación del \alpha-1-AGP. Se determinó la concentración de \alpha-1-AGP en el suero murino utilizando un análisis doméstico de inmunoabsorción enzimática intercalada. Con el anticuerpo monoclonal de rata se recubrieron (0,1 mg/mi) unas placas Maxisorb de 96 pocillos. Después de bloquear con BSA y PBS al 1%, se valoraron las muestras y el \alpha-1-AGP estándar, y a continuación se incubaron las placas durante 1 h a 37ºC. Se utilizaron como segundo y tercer anticuerpo un antisuero policlonal de conejo (1/1.000) y posteriormente anticuerpos de conejo conjugados con la fosfatasa alcalina (1/5.000). Se determinó el \alpha-1-AGP humano por nefelometría utilizando un anticuerpo policlonal de cabra anti \alpha-1-AGP humano. El efecto del Cpd A contra la infección letal con K. pneumoniae: para investigar si el Cpd A proporciona protección, se trataron previamente los ratones con Cpd A 24 o 48 horas antes con una provocación bacteriana (106 UFC excepto cuando se indique lo contrario) de K. pneumoniae. Se administró Cpd A por vía sistémica (intravenosa o intraperitoneal) o local (intrarticular) mediante inyección. En el caso de producirse una depuración del principio activo con una estabilidad y rapidez bajas, se utiliza una bomba peristáltica a fin de obtener un flujo continuo y una acumulación de dicho compuesto en el tejido que se está investigando. El Cpd A se administra en una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del
mismo intervalo de valores de dosificación descritos en detalle en Alegre et al. (J. Immunol., 1991 vol. 146, p. 1184).

11.6. Efectos beneficiosos del Cpd A en trastornos atópicos (asma, alergia)

Hart et al. (Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000 Enero; 161:(1): 224 - 31) describen en detalle el modelo experimental de asma in/ex vivo utilizado en el presente experimento. En resumen, se determina si el tratamiento con el Cpd A inhalado modula la actividad del factor de transcripción, el factor nuclear kappa B (NF-\kappaB) durante una crisis asmática. Se puede someter a los pacientes con asma leve a un lavado broncoalveolar (BAL), realizando biopsias bronquiales en un estudio de diseño cruzado, controlado con placebo y con doble anonimato tras inhalar el placebo.

El Cpd A (en una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que en el caso de los corticoides, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación, es decir, 500 \mug dos veces al día).

Beyaert et al. (Eur. J. Immunol. 1992 Agosto; 22(8).2181 - 4) describen en detalle el modelo experimental de psoriasis in/ex vivo utilizado también en el presente experimento. En resumen, se inyectaron por vía subcutánea 50 \mul de PBS que comprendía TNF+LiCl en la espalda de ratones, lo que provocó una reacción inflamatoria psoriasiforme. Los efectos del Cpd A se analizaron en muestras cutáneas obtenidas por biopsia. Se sacrificaron los animales por luxación cervical a distintos intervalos de tiempo. Se extrajeron los fragmentos cutáneos, con un diámetro de 4 mm, y se analizaron por histoinmunoquímica o se sumergieron en PBS y se congelaron a -200ºC. Posteriormente, se descongelaron los fragmentos cutáneos y se homogeneizaron en PBS en 30 lotes con un homogeneizador Dounce y se centrifugaron a 15.000 g durante 10 minutos. Se analizaron los sobrenadantes con relación a la actividad funcional de las citocinas mediante el correspondiente ELISA o mediante bioanálisis. Se aplica el Cpd A mediante un dispositivo transdérmico a una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente la misma dosis (tratamiento eficaz).

11.7. Efectos beneficiosos del Cpd A en los modelos víricos de replicación

Debido a que la replicación del virus VIH depende del NF-\kappaB, el Cpd A puede resultar beneficioso para regular por disminución la replicación del VIH (véase Kurata Si & Yamamoto N. J., Cell. Biochem. 1999; 76(1): 13 - 9 y DeLuca et al. Cytokine Growth Factor Rev. 1999, Septiembre - Diciembre; 10(3 - 4): 235 - 53).

Se utiliza en el presente experimento un modelo de latencia promielocítica experimental que describen en detalle Critchfield et al. (Antivir. Chem. Chemother. 1999 Septiembre; 10(5): 275 - 84). El Cpd A se administró según Critchfield et al. (Antivir. Chem. Chemother. 1999 Septiembre; 10(5): 275 - 84) a una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación (preferentemente 10-5 a 10-9 M).

11.8. Análisis de los efectos beneficiosos del Cpd A en los modelos de infección por parásitos

Debido a que el NF-\kappaB es un objetivo terapéutico importante en las infecciones parasitarias, el Cpd A resulta beneficioso en el tratamiento de dichas infecciones parasitarias. Se utilizó un modelo experimental murino con Plasmodium chabaudi chabaudi tal como describen en detalle Scorza et al. (Parasite Immunol. 1999, Noviembre; 21(11): 545 - 54). El Cpd A se administra por vía sistémica (intravenosa o intraperitoneal) o local (intrarticular) mediante inyección. En el caso de producirse una depuración del principio activo con una estabilidad y rapidez bajas, se utiliza una bomba peristáltica a fin de obtener un flujo continuo y una acumulación de dicho compuesto en el tejido que se está investigando. El Cpd A se administra en una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación descritos en detalle en Alegre et al. (J. Immunol., 1991 vol. 146, p. 1184).

11.9. Efectos beneficiosos del Cpd A en el tratamiento del cáncer

Debido a que el NF-\kappaB desempeña un papel en el cáncer y en la apoptosis, los inhibidores del NF-\kappaB tales como el Cpd A resultan beneficiosos como sensibilizantes de la quimioterapia.

Se utilizó un modelo experimental CLL ex vivo tal como describen en detalle Van Causbroeck et al. Tijdschrift van de Belgische Vereniging voor Laboratoriumtechnologen, Diciembre de 2000.

Se administra el Cpd tal como se describe en Van Causbroeck et al. (Tijdschrifvt an de Belgische Vereniging voor Laboratoriumtechnologen, Diciembre de 2000) a una dosis preferentemente 10 veces más concentrada que la prednisolona, más preferentemente comprendida dentro del mismo intervalo de valores de dosificación (preferentemente 10^{-5} a 10^{-9} M).

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<110> VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT VOOR BIOTECHNOL

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<120> Utilización de compuestos carboxi tales como el cloruro de 2(4-acetoxifenil)-2-cloro-N-metil-etilamonio como productos antiinflamatorios

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<130> CHA/COMP/047

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<140>

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<141>

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<150> 99204433.9

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<151> 21-12-1999

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<160> 3

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<170> Patente en ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido híbrido

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<400> 1

2

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<210> 2

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido híbrido

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido híbrido

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

agctatgtgg gattttccca tgagc

\hfill

25

Claims

1. Uso de un compuesto (I) con la fórmula

4

y su derivado aziridínico,

en la que R es un grupo acetilo, X es un grupo cloruro e Y es un grupo metilo en la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar las inflamaciones.

2. Uso de un compuesto (I) con la fórmula según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar enfermedades inflamatorias o inflamaciones relacionadas con trastornos escogidos de entre el grupo que comprende la artritis, el asma, la bronquitis, la tendinitis, la psoriasis, los eczemas, las dermatitis, las quemaduras, las enteropatías inflamatorias, el cáncer, las angiopatías, la esclerosis múltiple, las enfermedades oftálmicas, las inflamaciones pulmonares, las enfermedades infecciosas y los trastornos del sistema nervioso.

3. Composición que comprende como principio activo un compuesto (I) con la fórmula según la reivindicación 1 y un excipiente aceptable.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que dicha composición es una composición farmacéutica.

5. Composición según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 para utilizarla como medicamento.

6. Uso de una composición según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en la fabricación de un medicamento destinado a prevenir o tratar enfermedades inflamatorias o inflamaciones relacionadas con trastornos escogidos de entre el grupo que comprende la artritis, el asma, la bronquitis, la tendinitis, la psoriasis, los eczemas, las dermatitis, las quemaduras, las enteropatías inflamatorias, el cáncer, las angiopatías, la esclerosis múltiple, las enfermedades oftálmicas, las inflamaciones pulmonares, las enfermedades infecciosas y los trastornos del sistema nervioso.