ES2274516T3 - Ensayo de tiempo de protrombina en seco. - Google Patents
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Abstract
LOS ARTICULOS DE ENSAYO MEJORADOS DE LA PRESENTE INVENCION, COMPRENDEN UNA FORMULACION DE PROTROMBINA SECA, INCLUIDA EN UN ARTICULO DE ENSAYO APROPIADO PARA APLICAR SANGRE O PLASMA, AGENTES NEUTRALES DE COAGULACION UTILIZADOS PARA FACILITAR LA TOMA Y DISTRIBUCION DE LA MUESTRA, Y UN MECANISMO QUE DETECTA EL TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE LA APLICACION DE LA MUESTRA, Y LA APARICION DE COAGULACION EN EL ARTICULO DE ENSAYO. LA TROMBOPLASTINA MEJORADA ES SELECCIONADA PARA MANTENER UNA ALTA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD PARA LA REACCION DE LA PROTROMBINA, AUN SIENDO REHIDRATADA CON UNA MUESTRA DE ENSAYO. PREFERIBLEMENTE, LA TROMBOPLASTINA SE PREPARA SINTETICAMENTE POR RELIPIDACION DE UNA PREPARACION DE UN FACTOR TISULAR PURO, UTILIZANDO UNA FRACCION LIPIDICA QUE FACILITA LA SOLUBILIZACION DEL COMPLEJO FACTOR TISULAR-TROMBOPLASTINA LIPIDICA EN MEDIO ACUOSO. EN LA REALIZACION PREFERIDA DE LA INVENCION, LA TROMBOPLASTINA SE PREPARA UTILIZANDO FACTOR TISULAR HUMANO SINTETIZADO A PARTIR DE DNA RECOMBINANTE.
Description
Ensayo de tiempo de protrombina en seco.
La presente invención se refiere en general a la
prueba de coagulación de la sangre tiempo de protrombina, y más
particularmente a artículos para la prueba de tiempo de protrombina
de reactivos secos; y métodos de la prueba de tiempo de protrombina
que están basados en la rehidratación de la tromboplastina seca en
presencia de sangre o plasma.
Las pruebas de coagulación de la sangre pueden
realizarse para una diversidad de propósitos, que incluyen la
determinación de la propensión de hemorragia de pacientes sometidos
a cirugía y la monitorización de pacientes sometidos a terapia
anticoagulante para la prevención de coágulos de sangre. Actualmente
se utilizan una diversidad de pruebas de coagulación. Uno de los
más populares es la prueba del "tiempo de protrombina" (PT) que
está basado en la inducción del camino de coagulación extrínseco
por activación del factor de coagulación proteasa VII por la
tromboplastina en una muestra de sangre a ensayar.
El camino de coagulación extrínseco da como
resultado la producción de trombina, que es una enzima proteolítica
que cataliza la conversión de fibrinógeno en fibrina. Dicha
conversión es una función esencial en el mecanismo de la
coagulación.
Hasta ahora, tales pruebas de coagulación de la
sangre han tendido a ser complejos, estando limitada generalmente
su realización a laboratorios clínicos. Si bien tales pruebas
centralizadas pueden ser adecuadas para pacientes quirúrgicos, la
visita a la consulta de un médico o una clínica sobre una base
regular para monitorizar la terapia
anti-coagulación es menos aceptable. Por tanto, es
evidente la necesidad de una prueba de monitorización de la
coagulación cómoda y práctica en el hogar.
Se han ideado pruebas de la sangre en el hogar
satisfactorias para otros componentes químicos, tales como
colesterol y glucosa. Entre los dispositivos más adecuados para uso
en el hogar se encuentran dispositivos de prueba de reactivos secos
que contienen todos los componentes de prueba
pre-mezclados, y preservados en una forma seca
adecuada para almacenamiento a largo plazo. Estos dispositivos de
prueba de reactivos secos incluyen tiras de prueba, pequeñas
cámaras de plástico, y análogos.
Los ensayos de reactivos secos tienen
típicamente menos precisión que los ensayos en fase líquida. Esto es
debido a las diferencias estructurales entre ambos tipos. Los
ensayos en fase líquida tienen una zona de reacción muy simple y
uniforme que está formada por las paredes del recipiente en el cual
tiene lugar la reacción. En contraste, los ensayos de reactivos
secos tienen una zona de reacción compleja, formada por las
superficies de los productos químicos secos de la reacción y la
matriz de soporte. Típicamente, las matrices de soporte de
reactivos secos son membranas porosas o cámaras capilares con
aberturas, que tienen relaciones de superficie a volumen mayores
que las cubetas de reacción utilizadas típicamente para los ensayos
en fase líquida. Así, las muestras de prueba que intervienen en un
ensayo de reactivos secos tienen una probabilidad mucho mayor de
interaccionar con los componentes del ensayo de una manera variable,
lo que da como resultado una pérdida de precisión. Si la precisión
del ensayo de reactivos secos es demasiado baja, la prueba puede
llegar a ser esencialmente inútil para aplicaciones clínicas
prácticas.
La precisión de una prueba puede describirse
óptimamente por el coeficiencia de varianza, que es la relación
entre la dispersión en los resultados de prueba obtenidos en la
prueba de grandes números de muestras idénticas, dividida por la
magnitud de la señal de prueba global. Si la dispersión en las
réplicas de prueba es grande con relación a la señal de prueba
global, la prueba tiene una precisión deficiente. Inversamente, si
la dispersión en los resultados de prueba es pequeña con relación a
la señal de prueba global, la prueba tiene una mejor precisión. Por
tanto, existen dos vías para mejorar la precisión de una prueba. La
primera consiste en reducir la dispersión en los resultados de
prueba mientras que se mantiene la magnitud de la señal, y la
segunda consiste en aumentar la magnitud de la señal mientras que
se mantiene esencialmente constante la dispersión. A menudo, el
segundo método, aumento de la magnitud de la señal de prueba, es la
vía más práctica para mejorar la precisión.
La sangre y el plasma contienen una familia de
serina-proteasas que regulan el proceso de la
coagulación. Estas serina-proteasas se denominan
"factores" de coagulación, se designan típicamente con números
romanos (con un sufijo "a" añadido si el factor se encuentra
en un estado enzimáticamente activo), y operan en una cascada de
amplificación regulada de modo preciso para formar coágulos de
sangre en sitio en el que se ha lesionado el tejido. Estos coágulos
de sangre actúan para detener la hemorragia en el sitio lesionado.
Este modo particular de coagulación de la sangre se denomina el
camino de coagulación "extrínseco".
El tejido normal contiene una proteína fijada a
la membrana, denominada factor tisular, que se libera cuando se
lesiona el tejido. El proceso de coagulación extrínseca comienza
cuando este factor tisular forma un complejo con el factor de
coagulación VII y/o VIII (a). Este factor tisular - complejo de
factor VII (a) activa a su vez el factor X, que en concierto con el
co-factor V transforma la
trombina-proteasa inactiva en la enzima trombina
activa. La trombina transforma luego el fibrinógeno en fibrina, que
forma el coágulo de sangre real. Este proceso se describe en
detalle en Tissue Factor and Hemostasis, Y. Nemerson, Blood
71(1), 1-8, 1988. La nomenclatura en este
documento sigue la de Nemerson. La prueba de tiempo de protrombina
estimula este camino de coagulación in vitro, utilizando un
extracto tisular denominado tromboplastina para iniciar el camino de
la coagulación.
Los ensayos PT convencionales han empleado
usualmente tromboplastina purificada a partir de un extracto acuoso
de tejido cerebral secado con acetona. Este extracto bruto contiene
muchos componentes. El componente activo de la tromboplastina
normal es una mezcla deficientemente definida de complejos
moleculares del reactivo factor VII, formados cada uno por una
interacción entre las proteínas del "factor tisular", y la
mezcla de lípidos cerebrales que queda después de la extracción. En
contraste, la tromboplastina recombinante sintética
(r-DNA-tromboplastina), está
constituida por un complejo relativamente simple y bien definido
formado por proteína de factor tisular recombinante purificada, y
una población de lípidos artificiales purificada.
Se sabe que, en los ensayos en fase líquida,
preparaciones de tromboplastina diferentes pueden aumentar o
reducir la discriminación entre muestras de sangre que tengan
tiempos de protrombina diferentes. Aquellas tromboplastinas con
una discriminación mayor se denominan "más sensibles". La
sensibilidad en fase líquida de una preparación de tromboplastina
se clasifica por el uso del índice internacional de sensibilidad, o
ISI. Este valor ISI se encuentra representado gráficamente, en una
escala logarítmica, del tiempo de protrombina monitorizado con un
lote de tromboplastina en cuestión, frente a los valores del tiempo
de protrombina monitorizados con un lote estandarizado de
tromboplastina (definido análogamente, que tiene un valor ISI de 1).
El valor ISI es la pendiente de la línea resultante, multiplicada
por el ISI de la tromboplastina de referencia.
La escala propiamente dicha no es del todo
intuitiva. Las tromboplastinas más sensibles tienen números ISI
inferiores, típicamente alrededor de 1,0, y los lotes de
tromboplastina menos sensibles tienen números ISI más elevados,
típicamente alrededor de 2-3. La explicación
molecular para la diferencia entre lotes no se conoce totalmente en
la actualidad.
En el caso de los ensayos de tiempo de
protrombina, la precisión alta tiene una importancia clínica
extremada. Dependiendo de la severidad de la dispersión, una
muestra de sangre con una Relación Normalizada Internacional real
(INR) de 2,5 podría, con una prueba imprecisa, consignarse como
poseedora de un valor INR de 2,0 ó 3,0. Dicha imprecisión puede
conducir a decisiones clínicas diferentes. Un médico podría decidir
aumentar la dosificación de anticoagulante si se obtuvieran unos
resultados del INR 2,0, y disminuir la dosificación de
anticoagulante si se obtuviera un INR de 3,0. Ambas decisiones
tendrían un impacto importante sobre el bienestar del paciente, y
ambas podrían ser erróneas, dado que un resultado de prueba
"correcto" del INR de 2,5 podría dar como resultado que la
decisión no se ajustara en modo alguno a la dosificación de
anticoagulante.
Debido a estos problemas clínicos, los métodos
para mejorar la precisión de los ensayos de tiempo de protrombina
de reactivos secos son por tanto de importancia considerable en el
campo.
Tromboplastinas y factores tisulares producidos
por tecnología de DNA recombinante se describen en las Patentes
U.S. Núms. 5.110.730 y 4.966.852. Métodos para preparar
tromboplastinas con sensibilidad más alta para los ensayos en fase
líquida se describen en las Patentes U.S. Núms. 5.270.451 y
4.416.812. El uso del factor tisular recombinante de las pruebas de
tiempo de protrombina se describe en Recombinant Tissue Factor as
Substitute for Conventional Thromboplastin in the Prothrombin
Time Test, A. Tripodi, A. Arbim, V. Chantarangkul, y P.
Mannucci, Thrombosis and Haemostasis 67(1)
42-45 (1992). El uso de la Relación Normalizada
Internacional (INR) para explicar las diferencias en la
sensibilidad entre tipos de tromboplastina se describe en
Calibration of Reference Thromboplastins and Standardization of
the Prothrombin Time Ratio, T. Kirkwood, Thromb, Haemostasis
49(3) 238-244 (1983) y en Requirements for
Thromboplastins and Plasma Used to Control Oral Anticoagulant
Therapy, WHO Expert Committee on Biological Standardization,
Informe 33º, WHO Tech. Rep. Ser 1983; 67:81-105. El
mecanismo por el cual el factor tisular activa el factor VIIa en la
cascada de coagulación del tiempo de protrombina se expone en
The Interaction of Human Factor VIIa with Tissue Factor, S.
Kirshnaswamy, The Journal of Biological Chemistry 267 (33)
23696-23706 (1992).
Puebas de tiempo de protrombina de reactivos
secos que utilizan tiras de prueba con tromboplastina seca se
describen en las solicitudes Núms. de Serie 07/874.667 y 08/003.791,
también en tramitación.
De acuerdo con la presente invención, un
artículo de prueba y un método mejorados para realización de los
ensayos de tiempo de protrombina de reactivos secos emplea
preparaciones de tromboplastina altamente purificadas y bien
definidas. Tales preparaciones de tromboplastina se seleccionan de
modo que mantengan un alto grado de sensibilidad y especificidad en
su activación del factor de coagulación VII(a) en muestras de
prueba durante las transiciones de tromboplastina desde un estado
seco a un estado hidratado. Son particularmente útiles y ventajosas
tromboplastinas preparadas por relipidación artificial de factor
tisular preparado por técnicas de DNA recombinante (a las que se
hace referencia en lo sucesivo como "tromboplastina
recombinante").
Sorprendentemente, se ha encontrado que
preparaciones de tromboplastina que tienen valores ISI en fase
líquida prácticamente idénticos, pueden diferir notablemente en los
valores ISI cuando se incorporan en ensayos de tiempo de
protrombina de reactivos secos. Con la tromboplastina natural
purificada, esto efecto puede dar como resultado pruebas de tiempo
de protrombina de reactivos secos que tienen una utilidad clínica
marginal. En contraste, se ha encontrado que la tromboplastina
recombinante es mucho más resistente a este efecto. Las
tromboplastinas recombinantes tienen prácticamente la misma
sensibilidad (valor ISI) tanto en fase líquida como en pruebas de
reactivos secos, y producen ensayos de tiempo de protrombina de
reactivos secos con utilidad clínica excelente.
La explicación de esta diferencia parece ser
resultado de la bioquímica de la reacción de la tromboplastina. Es
sabido que la actividad del factor tisular y la tromboplastina se ve
afectada críticamente por la asociación de la proteína del factor
tisular con su población lipídica circundante. La proteína del
factor tisular en solución por sí misma es esencialmente inactiva.
La proteína debe situarse en una matriz lipídica para ser activa.
Los lípidos y las lipoproteínas existen en una fase acuosa como
agregados ordenados en forma de monocapas, micelas, y bicapas.
Estos agregados tienen estructuras que son críticamente dependientes
de la interacción entre sus constituyentes lipídicos hidrófobos, y
la matriz acuosa circundante. Una exposición más completa de este
efecto se encuentra en las páginas 219-232 del
capítulo 9: The structure of biological membranes, en
Biochemistry, J. David Rawn, 1989, Neil Patterson Publishers,
Carolina del Norte.
En los ensayos de tiempo de protrombina en fase
líquida, existirán a la vez tromboplastina natural purificada y
recombinante en equilibrio con la fase líquida. En particular, las
porciones de factor tisular y las porciones de factor lipídico de
la tromboplastina se encuentran en una distribución micelar
relativamente estable, e interaccionan con una muestra (factor VII)
de una manera relativamente consistente. En contraste, en un ensayo
de reactivos secos, la tromboplastina pasa por varias
transposiciones de conformación espectaculares, al mismo tiempo que
está siendo rehidratada por una muestra. En particular, los
componentes lipídicos y proteínicos de la tromboplastina deben
pasar por una transición entre la fase seca, en la cual dominan las
interacciones iónicas, y los efectos hidrófobos son inexistentes, y
una fase líquida en la cual las interacciones hidrófobas son
críticas. Entre estas dos fases, se forman cierto número de estados
de transición de vida corta. Estos estados de transición, aunque de
vida corta, tienen su propia serie de propiedades singulares. Una
transición análoga puede observarse cuando se añade agua a un
detergente seco - la solución pasa a través de una fase intermedia
"turbia" antes de sedimentarse finalmente en una fase estable
"clara".
Una diferencia fundamental entre los ensayos PT
de fase líquida y de reactivos secos es que el componente factor
VII (a) de la muestra de prueba de coagulación no se ve expuesto a
los estados de transición de tromboplastina intermedios en la
prueba de fase líquida, y por tanto no se ve influido por ellos. En
contraste, en una prueba de tiempo de protrombina de reactivos
secos, el componente factor VII (a) de la muestra de prueba de
coagulación se ve expuesto a estos estados intermedios.
Una segunda diferencia entre la fase líquida
convencional y los ensayos PT de reactivos secos es que los
artículos de la prueba de reactivos secos contienen típicamente uno
o más polímeros solubles o agentes proteínicos que son nominalmente
inactivos (coagulación "neutra" para una prueba de tiempo de
protrombina) con respecto a la química de prueba en un ensayo
líquido, pero que juegan un papel en el funcionamiento adecuado de
la prueba de reactivos secos. Tales agentes pueden utilizarse para
modular la absorción de la muestra líquida en el vehículo de
reactivos secos, controlar la difusión de los componentes de prueba,
facilitar la solubilización de los productos químicos de la prueba
de reactivos secos, o facilitar la estabilidad al almacenamiento a
largo plazo de los componentes de la prueba de reactivos secos.
Tales agentes pueden ser polímeros simples, tales como
hidroxipropil-celulosa, gantrez, poli(alcohol
vinílico), polietilenglicol, y análogos. Se utilizan también
proteínas, tales como seroalbúmina de bovino y análogas. Los
azúcares, tales como glucosa, trehalosa, polisacáridos tales como
almidón o dextrano, se han utilizado también para estos propósitos.
Se han utilizado también detergentes, tales como Triton®
X-100 y análogos.
Aunque requeridos para el funcionamiento
apropiado de la prueba de reactivos secos, tales agentes de
coagulación "neutros" pueden influir en el estado de
conformación de la tromboplastina durante el proceso de
rehidratación. En particular, tales agentes pueden afectar
negativamente a la sensibilidad de la tromboplastina (capacidad
para interaccionar con el factor de coagulación VII (a)) durante el
proceso de rehidratación. Lamentablemente, para las tromboplastinas
naturales purificadas, algunos de los estados de transición
intermedios formados unos cuantos segundos después de la
rehidratación inicial aparecen para la muestra de tiempo de
protrombina como una tromboplastina funcional de sensibilidad
aberrante. Esto puede reducir la utilidad clínica del ensayo de
reactivos secos.
Sin embargo, se ha encontrado inesperadamente
que los ensayos de tiempo de protrombina de reactivos secos que
emplean tromboplastina recombinante se comportan de modo
excepcionalmente satisfactorio. Los ensayos de reactivos secos
basados en r-DNA tromboplastina no exhiben el cambio
característico en sensibilidad obtenido típicamente cuando se
utiliza tromboplastina convencional. Como resultado, estos ensayos
ofrecen una discriminación mejorada entre las muestras con tiempo
de protrombina diferente, sin aumentar la dispersión intramuestra.
Esto aumenta la precisión del ensayo.
La eficiencia mejorada de los ensayos de tiempo
de protrombina que emplean tromboplastina recombinante parece estar
relacionada directamente con la naturaleza pura del reactivo
r-DNA. La composición compleja de la tromboplastina
natural purificada da como resultado un número muy grande de estados
de transición intermedios que ocurren durante la rehidratación. En
contraste, la composición relativamente simple y bien definida de la
tromboplastina recombinante da como resultado un número mucho menor
de estados de transición intermedios durante la rehidratación. Como
resultado, la probabilidad de producir una forma de transición
intermedia de tromboplastina con sensibilidad aberrante se
reduce.
Alternativamente, la tromboplastina puede
considerarse como sometida a una transición de fases entre un estado
seco y uno líquido. Un material de partida más puro y más homogéneo
(tromboplastina recombinante) sufrirá típicamente una transición de
fases mucho más clara y bien definida que un material menos puro o
menos homogéneo (tromboplastina convencional).
En cualquier caso, el resultado sorprendente e
impredecible es que cuando se utiliza en una prueba de tiempo de
protrombina tromboplastina seca que está exenta de sustancias que
causan estados de transición intermedios aberrantes a medida que se
rehidrata la tromboplastina, estando particularmente exenta de tales
sustancias de estados de transición aberrantes de tromboplastina
que se encuentran en la tromboplastina purificada a partir de
extracto de cerebro, la muestra de prueba se verá expuesta a una
diversidad mucho menor de estados de transición de tromboplastina
intermedios diferentes, y resultará una transición más clara entre
la tromboplastina deshidratada "inactiva" inicial y la
tromboplastina completamente activa final. Ambos efectos son
favorables, y conducen a ensayos de tiempo de protrombina de
reactivos secos que tienen una mayor discriminación entre muestras
con valores de tiempo de protrombina diferentes. Tales pruebas se
comportan con precisión incrementada.
Fig. 1 muestra el efecto de diferentes
preparaciones de tromboplastina sobre la sensibilidad de un ensayo
de tiempo de protrombina en fase líquida. En el eje "X", se
muestran tres tromboplastinas normales, con índices de sensibilidad
ISI comprendidos entre 1,2 y 3,0. Se muestra también una
tromboplastina recombinante, con un índice de sensibilidad ISI de
0,92. El eje "Y" del gráfico muestra la sensibilidad relativa
del ensayo, expresada como la diferencia en segundos entre el valor
del tiempo de protrombina obtenido con un plasma de control de
nivel II, y un plasma de control de nivel I. La sensibilidad de la
r-DNA tromboplastina cae dentro de la curva
extrapolada a partir del comportamiento de la tromboplastina
normal.
Fig. 2 muestra el efecto de diferentes
preparaciones de tromboplastina sobre la sensibilidad de un ensayo
de tiempo de protrombina de reactivos secos. En el eje "X", se
muestran tres tromboplastinas normales, con índices de sensibilidad
ISI entre 1,2 y 3,0. Se muestra también una tromboplastina
recombinante con un índice de sensibilidad ISI de 0,92. El eje
"Y" del gráfico muestra la sensibilidad relativa del ensayo,
expresada como la diferencia en segundos entre el valor del tiempo
de protrombina obtenido con un plasma de control de nivel II, y un
plasma de control de nivel I. Obsérvese que la sensibilidad de la
tromboplastina recombinante cae fuera de la curva extrapolada a
partir del comportamiento de la tromboplastina normal.
Fig. 3 muestra el efecto de preparaciones de
tromboplastina diferentes sobre la sensibilidad de un ensayo
simplificado de tiempo de protrombina de reactivos secos, compuesto
de tromboplastina liofilizada en una cubeta de reacción. En el eje
"X" se muestran tres tromboplastinas normales con índices de
sensibilidad ISI entre 1,2 y 3,0. Se muestra también una
tromboplastina recombinante con un índice de sensibilidad ISI de
0,92. El eje "Y" del gráfico muestra la sensibilidad relativa
del ensayo, expresada como la diferencia en segundos entre el valor
del tiempo de protrombina obtenido con un plasma de control de nivel
II, y un plasma de control de nivel I. Obsérvese que la
sensibilidad de la tromboplastina recombinante se mantiene sobre la
curva extrapolada a partir del comportamiento de la tromboplastina
normal.
Fig. 4 compara directamente el efecto de
preparaciones diferentes de tromboplastina sobre la sensibilidad de
un ensayo de tiempo de protrombina en fase líquida, frente a un
ensayo con tira de prueba de tiempo de protrombina de reactivos
secos. En el eje "X" se muestra la diferencia en tiempos PT
entre un control de nivel I y un control de nivel II, para un
ensayo en fase líquida, utilizando tres tromboplastinas normales, y
una tromboplastina recombinante. . El eje "Y" muestra la
diferencia en tiempos PT entre un control de nivel I y un control
de nivel II, para un ensayo con tira de prueba de reactivos secos,
utilizando las mismas tromboplastinas. Obsérvese que, nuevamente,
la sensibilidad de la tromboplastina recombinante cae fuera de la
curva extrapolada a partir del comportamiento de la tromboplastina
normal.
Fig. 5 compara directamente el efecto de
preparaciones diferentes de tromboplastina sobre la sensibilidad de
un ensayo de tiempo de protrombina en fase líquida frente a un
ensayo de tiempo de protrombina de reactivos secos simplificado. En
el eje "X" se muestra la diferencia en tiempos PT entre un
control de nivel I y un control de nivel II para un ensayo en fase
líquida, utilizando tres tromboplastinas normales y una
tromboplastina recombinante. El eje "Y" muestra la diferencia
en tiempos PT entre un control de nivel I y un control de nivel II
para el ensayo de reactivos secos simplificado, utilizando las
mismas tromboplastinas. Obsérvese de que nuevo, para el ensayo de
reactivos secos simplificado, la sensibilidad de la tromboplastina
recombinante se mantiene sobre la curva extrapolada a partir del
comportamiento de la tromboplastina normal.
Los artículos de prueba mejorados de la presente
invención comprenden una formulación de tromboplastina sintética
seca inmovilizada en un artículo de prueba adecuado para la
aplicación de sangre o plasma sin diluir. El artículo de prueba
incluirá también usualmente agentes de coagulación neutros secos
utilizados para facilitar la absorción y distribución de la muestra
y pueden emplearse con un mecanismo de detección que detecta el
tiempo transcurrido entre la aplicación de la muestra, y el
comienzo de la coagulación en el artículo de prueba.
La tromboplastina sintética seca se selecciona
de modo que mantenga sensibilidad y especificidad elevadas para la
reacción del tiempo de protrombina mientras la tromboplastina está
siendo rehidratada con la muestra de prueba, y en particular estará
sustancialmente exenta de sustancias que causan estados de
transición intermedios aberrantes a medida que se rehidrata la
tromboplastina, estando más particularmente exenta de dichas
sustancias de estados de transición de tromboplastina de
funcionamiento aberrante encontradas en la tromboplastina purificada
a partir de extractos de cerebro. Preferiblemente, la
tromboplastina se prepara por la relipidación de una preparación
pura de factor tisular, utilizando una fracción lipídica que
facilita la solubilización del complejo factor
tisular-tromboplastina lipídica en medios acuosos.
En la realización más preferida, la tromboplastina se prepara
utilizando factor tisular humano sintetizado a partir de DNA
recombinante. Una tromboplastina sintética seca ilustrativa es un
factor tisular humano recombinante relipidado tal como la
tromboplastina Innovin™ disponible de Baxter Healthcare
Corporation, Dade Division, Miami, Florida.
La fase sólida puede ser una estructura no
secante o secante. Las estructuras no secantes serán típicamente
estructuras impermeables que tienen caminos de flujo capilares
discretos en ellas para recibir la muestra de sangre o plasma que
se ensaya. La tromboplastina seca y el o los agentes neutros
opcionalmente coagulantes se aplicarán en forma de capa sobre la o
las paredes de los caminos de flujo capilares de tal modo que la
tromboplastina se rehidratará a medida que la muestra se aspira a
través de ella por acción capilar.
Las estructuras absorbentes pueden estar
compuestas de un material que puede absorber líquido y que puede
contener, en forma seca, el o los reactivos necesarios para realizar
un ensayo deseado. Podrían utilizarse una gran diversidad de
materiales de matriz absorbente, que incluyen papel,
metil-celulosa, polímeros porosos, y análogos. En
la realización preferida en la que se analizan muestras pequeñas,
una matriz absorbente será una estructura de membrana porosa
compuesta de un material matriz polímero hidrófilo (absorbente), no
hinchable, que tiene dimensiones de poro que permiten la entrada de
plasma sanguíneo y proteínas en tanto que excluyen las células de
la sangre, particularmente los glóbulos rojos (eritrocitos). La
membrana debería estar compuesta de un material polímero simple y
continuo con una estructura de tipo alveolar constituida por una red
tortuosa de canales que tienen anchuras del orden de micrómetros
(\mum). La red tortuosa de canales está "densamente
compactada" en el sentido de que el "volumen vacío" ocupado
por el espacio vacío de los canales es un porcentaje apreciable del
volumen total de la membrana, típicamente 10% o mayor. Dado que toda
la química de la reacción, y la generación de señales subsiguiente,
tiene lugar en el volumen vacío, es deseable un alto volumen vacío
para producir una señal fuerte. Es deseable una red tortuosa de
canales a lo largo de poros lineales y directos (tales como los
poros cortos y directos obtenidos con membranas nucleoporosas), dado
que las longitudes medias de canal más largas tienden a producir un
aislamiento creciente entre la zona de la membrana en la que tiene
lugar la química de la reacción, y la muestra en exceso remanente en
la superficie de la membrana. Esto contribuye a hacer el sistema
menos sensible a las variaciones en el volumen de muestra
aplicado.
La estructura porosa de la membrana se
impregnará con los reactivos necesarios para inducir la coagulación
en el plasma sanguíneo que entra en el interior de la matriz porosa
y producir una señal detectable como indicación de la capacidad de
coagulación de la sangre. Es particularmente crítico para la
presente invención que el material polímero de la matriz de la
membrana porosa esté sustancialmente exento de interferencia con el
camino de coagulación que está siendo inducido. En particular, el
material polímero de la matriz debería estar exento de efectos de
superficie, interacciones, y artefactos que pudieran inducir la
coagulación o desactivar componentes tales como enzimas, del camino
iniciado. La iniciación no intencionada de un camino de coagulación
podría conducir a resultados positivas falsos en tanto que la
desactivación de las enzimas podría conducir a resultados negativos
falsos. Por consiguiente, es importante que el material polímero de
la matriz no tenga efecto alguno promotor o inhibidor de las
reacciones de coagulación que ocurren en el interior de la membrana.
Pueden establecerse criterios para determinar si una membrana es
aceptable para uso en pruebas de coagulación, los cuales se exponen
en detalle en la solicitud Núm. de Serie 07/874.667, también en
tramitación. Un material de matriz polímero particularmente
preferido para realización de ensayos de coagulación de la sangre es
un material de membrana de polisulfona asimétrica de 0,45 \mum
disponible de Filterite-Memtec, 9690 Deeveco Road,
Apartamento 7, Timonium, Maryland 21093, Núm. de Catálogo
BTS-25.
Los agentes de coagulación neutros se
seleccionarán de manera que mejoren la absorción de la muestra
líquida en la fase sólida en tanto que exhiban poco o ningún efecto
sobre el tiempo de protrombina medido. Agentes adecuados incluyen
proteínas, tales como seroalbúmina bovina; polímeros, tales como
hidroxipropil-celulosa, gantrez,
poli(alcohol vinílico), y polietilenglicol; azúcares, tales
como glucosa y trehalosa; polisacáridos, tales como almidón y
dextranos, y agentes tensioactivos, tales como éteres de
polioxietileno.
La membrana se procesa ulteriormente en una tira
de prueba, con una estructura de cubierta, típicamente en la forma
de electrodos apartados, separados por una abertura, en el lado de
aplicación de la muestra de la membrana, y un soporte de tira
transparente en el lado opuesto de la membrana.
Durante el uso, la tira se coloca en un detector
de fluorescencia con una platina de sujeción de la tira calentada a
37ºC, y con medios dispuestos para monitorizar la caída de
resistencia a través de los electrodos cuando se aplica una muestra
al lado de aplicación de la muestra de la membrana. El detector de
fluorescencia adquiere luego una serie de medidas de fluorescencia
de la fluorescencia observada en el lado inferior de la membrana.
Criterios más detallados para construir tales artículos de prueba y
detectores se establecen en detalle en la solicitud de patente Núm.
de Serie 08/003.771, también en tramitación.
Una preparación de tromboplastina puede
ensayarse en cuanto a la presencia, o ausencia, de sustancias
intermedias de estados de transición de tromboplastina de
funcionamiento aberrante por una prueba funcional. Para hacer esto,
una muestra de la tromboplastina se disuelve en una solución acuosa,
y la eficiencia totalmente hidratada de la tromboplastina se
caracteriza en una prueba de tiempo de protrombina en fase líquida,
utilizando muestras de sangre o plasma que contienen factor VII/VII
(a) con actividad del camino de coagulación extrínseco (tiempos de
protrombina) diferentes. A continuación, se incorpora una muestra
deshidratada de la preparación de tromboplastina en cuestión en un
ensayo de tiempo de protrombina de reactivos secos, que puede
contener uno o más agentes neutros de coagulación adicionales para
facilitar la función del ensayo de reactivos secos. La eficiencia
de la muestra de tromboplastina deshidratada en el ensayo de
reactivos secos se evalúa por rehidratación de la misma con
muestras de sangre o plasma que contienen factor VII/VII(a)
con actividad del camino de coagulación extrínseco diferente. Se
considera que la muestra de tromboplastina tiene sustancias en
estado de transición de tromboplastina intermedias de
funcionamiento aberrante si la capacidad del ensayo de reactivos
secos para discriminar entre muestras de tiempos de protrombina
diferentes está deteriorada, con relación al ensayo de tiempo de
protrombina en fase líquida.
Sustratos de Trombina:
Boc-Val-Pro-OH, y
Tos-Gly-Pro-OH se
adquirieron de Bachem Bioscience, Philadelphia, PA.
(Boc-Val-Pro-Arg)_{2}-Rhodamine
110 y
(Tos-Gly-Pro-Arg)_{2}-Rhodamine
110 se prepararon por conjugación de
Boc-Val-Pro-OH, y
Tos-Gly-Pro-OH
respectivamente sobre Rhodamine-110 siguiendo los
métodos de Mangel, et al. (Patentes U.S. Núms. 4.547.862 y
4.640.893).
Membranas: Se obtuvo una membrana de
polisulfona asimétrica de Memtec Corporation, Timmunium, MD.
Tromboplastina: Se obtuvieron
Tromboplastina C Dade, C Plus, IS e Innovin (tromboplastina humana
preparada a partir de fuentes de DNA recombinante) de Baxter,
Healthcare Corporation, Miami, Florida.
Plasma de control: Se obtuvieron plasmas
de control disponibles comercialmente de Sigma. Éstos eran Control
de Coagulación C-7916 Nivel I (tiempo de
tromboplastina parcial activada y tiempo de protrombina dentro de
límites normales), Control de Coagulación C-8916
Nivel II (valores moderadamente elevados para tiempo de
tromboplastina parcial activada y tiempo de protrombina), y Control
de Coagulación C-9916 Nivel III Sigma (niveles muy
elevados para tiempo de tromboplastina parcial activada y tiempo de
protrombina).
La sero-albúmina bovina (BSA)
utilizada era Sigma A 3294, polvo de fracción V exento de
proteasas.
Preparación de membrana: Excepto donde se
indique otra cosa, las soluciones de reactivos, o "dips"
estaban constituidas por HEPES 0,1 M de pH 7,4 CaCl_{2} 10 mM,
sero-albúmina bovina Sigma exenta de proteasas 20
mg/ml, 50 mg/ml de poli(alcohol vinílico) hidrolizado en un
87-89% (PM 13.000-23.000, Aldrich
Chemical Company), tromboplastina liofilizada ajustada para obtener
el equivalente de una solución estándar al 40%, y 2 x 10^{-4} M
del sustrato de trombina fluorescente. Para facilitar la
solubilización, los sustratos de trombina fluorescentes basados en
Rhodamine-110 se pre-disolvieron en
una solución stock 10X de isopropanol al 50%. Las soluciones se
prepararon típicamente disolviendo en primer lugar los componentes
de BSA y PVA. Se añadieron posteriormente los sustratos de
tromboplastina y trombina por este orden para minimizar el posible
deterioro de cualquiera de estos componentes biológicamente
activos.
Las membranas se recubrieron poniendo suavemente
en contacto un lado (el lado de poros mayores, más permeable) de la
membrana a la superficie de inmersión de los reactivos durante
aproximadamente 5 segundos. El exceso se dejó escurrir suavemente,
y la membrana recubierta se secó inmediatamente al aire en un horno
de convección mecánica a 50ºC durante 15 minutos. Las membranas
secas se guardaron luego en recipientes herméticamente cerrados con
gel de sílice como desecante a la temperatura ambiente, o a 4ºC,
hasta su utilización.
Para prevenir la evaporación durante los
estudios basados en medidor, las membranas preparadas se montaron
sobre estireno transparente de 254 micrómetros de espesor,
utilizando cinta adhesiva 3M 415 adherente por las dos caras, y se
cubrieron con lámina de aluminio de 25,4 micrómetros de espesor. La
muestra se observó a través de la capa de estireno
transparente.
Aparato medidor: Las membranas de tiempo
de protrombina de reactivos secos se observaron con un instrumento
equipado con un filtro de 550 nanómetros con anchura de banda de 25
nanómetros. Las muestras se iluminaron mediante una lámpara de
wolframio filtrada a través de un filtro de 500 nanómetros con
anchura de banda de 25 nanómetros. Este instrumento tenía
adicionalmente una platina de reactivos calentada, que mantenía la
membrana a 47ºC a todo lo largo del ensayo.
Ambos instrumentos utilizaban un fotodetector
Siemens BPW-34B. La señal de salida del fotodetector
se amplificó mediante un amplificador de instrumentación,
digitalizado por un convertidor analógico-digital de
12 bits y se registraron en un ordenador personal IBM
compatible.
Instrumento de Referencia: Los valores de
tiempo de protrombina de referencia se obtuvieron utilizando un
medidor de coagulación MLA Electra 750.
Efecto de tipos de tromboplastina diferentes
sobre las pruebas de tiempo de protrombina de reactivos líquidos y
secos. En este experimento, se realizaron pruebas de tiempo de
protrombina utilizando tres tromboplastinas normales, con
evaluaciones ISI entre 1,2 y 2,9, y una tromboplastina recombinante,
con una evaluación ISI de 0,92. Las tromboplastinas se dividieron
en partes alícuotas, utilizándose una parte alícuota para realizar
un ensayo de tiempo de protrombina en fase líquida, y utilizándose
la segunda parte alícuota para preparar tiras para la prueba de
tiempo de protrombina de reactivos secos. Las reacciones de tiempo
de protrombina se llevaron a cabo luego utilizando estas tiras de
prueba. Las tromboplastinas utilizadas se muestran en la tabla
1:
| Innovin™ | Dade IS | Dade C+ | Dade C | |
| (r-DNA) | ||||
| Valor ISI | 0,92 | 1,2 | 2,1 | 2,9 |
Tanto el ensayo en fase líquida, como el ensayo
de reactivos secos, se enfrentaron luego con control de coagulación
Sigma nivel I (INR nominal de 1,0), y control de coagulación Sigma
nivel II (INR nominal de aproximadamente 3,0). El ensayo de fase
líquida se llevó a cabo en un instrumento MLA Electra 750, que
determina ópticamente la formación de coágulo por observación de
los cambios de turbidez en una cubeta de reacción del estilo de un
tubo de prueba.
El ensayo de reactivos secos se llevó a cabo en
un medidor óptico de fluorescencia controlado termostáticamente,
como se describe en la Solicitud de Patente Núm. de Serie
08/003.771, también en tramitación. Otros experimentos (no
representados), habían demostrado que el tiempo transcurrido entre
la aplicación inicial de la muestra, y el momento en que la
intensidad de fluorescencia normalizada excedía por primera vez del
10% del máximo (donde la intensidad de fluorescencia para el tiempo
0 se define como cero, y la intensidad de fluorescencia para la
fluorescencia máxima se define como 1), designado como
Tiempo_{10%max}, o (T_{10%}) daban resultados esencialmente
equivalentes al valor de tiempo de protrombina clásico en fase
líquida. A no ser que se indique otra cosa, todos los resultados de
reactivos secos están basados en este valor T_{10%}.
La diferencia entre los valores de tiempo de
protrombina de control nivel II y nivel I, obtenidos por las
pruebas de tiempo de protrombina en fase líquida y de reactivos
secos, se representó luego gráficamente frente a la evaluación
nominal ISI en fase líquida del reactivo tromboplastina. Los
resultados en fase líquida se muestran en la Figura 1, y los
resultados de reactivos secos se muestran en la Figura 2. Como puede
verse, los resultados de tiempo de protrombina en fase líquida
obedecen a los cálculos de sensibilidad ISI clásicos. A medida que
disminuye el valor ISI desde 2,9 a 0,92 (se hace más sensible),
existe un aumento continuo en la capacidad del sistema de reactivos
para discriminar entre los valores de tiempo de protrombina de nivel
II y nivel I. Cuando la curva de sensibilidad obtenida con la
tromboplastina normal se extrapola a un valor ISI de 0,92, la
tromboplastina recombinante se ajusta casi con precisión a esta
curva.
En contraste, los resultados de reactivos secos
son muy diferentes. En contraste con los resultados en fase
líquida, existe solamente un aumento muy ligero en la sensibilidad
del reactivo cuando las tromboplastinas normales varían entre ISI
1,2 y 2,9. Cuando la curva de sensibilidad obtenida con
tromboplastina normal se extrapola a un valor ISI de 0,92, la
tromboplastina recombinante exhibe una desviación clara del
comportamiento esperado. La misma es mucho más sensible que lo que
podría esperarse, basándose en extrapolaciones a partir de la
actividad de la tromboplastina normal.
Efecto de tipos diferentes de tromboplastina en
un ensayo de reactivos secos simplificado. Este experimento se
realizó para determinar si la desviación de la tromboplastina
respecto al comportamiento ideal, en el estado seco, era debida
enteramente a efectos de rehidratación, o si se debía a
interacciones entre la tromboplastina seca y los otros ingredientes
de la prueba de reactivos secos.
Para hacer esto, se pusieron muestras de
tromboplastina liofilizada directamente en cubetas de reacción MLA
Electra 750, sin rehidratación, y sin exposición a los otros
productos químicos de prueba utilizados típicamente en la prueba
del tiempo de protrombina de reactivos secos (seroalbúmina bovina,
poli(alcohol vinílico), etc.). Estos polvos de
tromboplastina liofilizados se rehidrataron directamente con plasma
de control I y control II, diluido para alcanzar la misma
concentración efectiva que se obtendría normalmente si se hubiera
utilizado la tromboplastina en su forma líquida normal. Se
determinaron luego los valores de tiempo de protrombina obtenidos
con la tromboplastina rehidratada en presencia de la muestra. Los
resultados se presentan en la Figura 3.
Los resultados indican que en el ensayo de
reactivos secos simplificado se registraba un incremento continuo
en la capacidad del sistema de reactivos para discriminar entre los
valores de tiempo de protrombina de nivel II y nivel I. Cuando la
curva de sensibilidad obtenida con tromboplastina normal se
extrapoló a un valor ISI de 0,92, la tromboplastina recombinante se
ajustaba casi con precisión a esta curva.
Los resultados sugieren que la interacción entre
tromboplastina normal, y los otros productos químicos incorporados
normalmente en la tira de reactivos secos, o la matriz de la tira
propiamente dicha, contribuía al comportamiento relativamente
deficiente de la tromboplastina normal en este ensayo de reactivos
secos.
Comparación directa entre la cinética de los
ensayos de reactivos secos y los ensayos en fase líquida realizad0s
utilizando diferentes tipos de tromboplastinas.
Para ver si las diferencias entre los tipos de
tromboplastina podían apreciarse directamente, se repitieron los
Ejemplos 1 y 2, comparando directamente esta vez las diferencias en
las cinéticas de tiempo de protrombina entre un plasma de control
de nivel I y uno de nivel II en un ensayo de fase líquida, con las
mismas diferencias obtenidas en un ensayo de tiempo de protrombina
con tira de prueba de reactivos secos, y el mismo ensayo de tiempo
de protrombina de reactivos secos simplificado utilizado en el
Ejemplo 2. Los resultados obtenidos comparando directamente el
ensayo de la tira de prueba seca con un ensayo líquido se muestran
en la Figura 4, y los resultados obtenidos comparando directamente
el ensayo de reactivos secos simplificado con el ensayo líquido se
muestran en la Figura 5.
Los resultados confirman los hallazgos
iniciales. Cuando la curva de sensibilidad obtenida con la
tromboplastina normal se extrapola a un valor ISI de 0,92, en el
ensayo de la tira de prueba seca, la tromboplastina recombinante
exhibe una desviación clara respecto al comportamiento esperado. La
misma es mucho más sensible que lo que podría esperarse, basándose
en extrapolaciones a partir de la actividad de la tromboplastina
normal.
Análogamente, cuando la curva de sensibilidad
obtenida con tromboplastina normal se extrapoló a un valor ISI de
0,92, con el ensayo de reactivos secos simplificado, la
tromboplastina recombinante se ajustaba casi con precisión a esta
curva.
Los resultados sugerían de nuevo que la
interacción entre la tromboplastina normal y los otros productos
químicos incorporados normalmente en la tira de reactivos secos, o
la matriz de la tira propiamente dicha, contribuía al
comportamiento relativamente deficiente de la tromboplastina normal
en este ensayo de reactivos secos.
Efecto de tipos de tromboplastina diferentes
sobre la precisión de los ensayos de tiempo de protrombina de
reactivos secos. En este experimento, se prepararon tiras de
reactivos, y se ensayaron con 10 réplicas de plasma de control
Sigma nivel I y nivel II. Los valores INR predichos obtenidos a
partir de este ensayo se calcularon luego utilizando la
ecuación:
INR =
(Tiempo_{10%max}/Tiempo_{ref})^{ISI}
donde Tiempo_{10%max} es el
tiempo requerido para que el plasma de control nivel II desarrolle
inicialmente una intensidad de fluorescencia de 10% de su nivel
máximo (que se corresponde estrechamente con un tiempo PT clásico
en este ensayo), Tiempo_{ref} es el tiempo requerido para que el
plasma de control nivel I normal desarrolle una intensidad de
fluorescencia de 10% de su nivel máximo (que corresponde
estrictamente a un tiempo PT de control en este ensayo), y el valor
ISI se selecciona a fin de calibrar adecuadamente la eficiencia del
lote particular de tiras a plasmas de referencia con valores INR
conocidos.
Se muestra a continuación el coeficiente de
varianza (CV) en los resultados INR obtenidos con los cuatro lotes
de tiras: el mismo se obtuvo utilizando 10 réplicas de plasma de
control II. Para ver si el efecto estaba distorsionado por valores
aislados, se desechó el valor aislado más extremo de cada muestra, y
se calcularon de nuevo los valores CV. Esto se muestra en la Tabla
2.
| Innovin™ | Dade IS | Dade C+ | Dade C | |
| ISI nominal | 0,92 | 1,2 | 2,1 | 2,9 |
| CV: (10 réplicas) | 1,83% | 4,22% | 3,02% | 2,92% |
| CV: (las 9 mejores) | 1,39% | 2,35% | 2,66% | 2,23% |
Obsérvese que el ensayo de reactivos secos
utilizando tromboplastina recombinante tenía una precisión
significativamente mejor que los ensayos de reactivos secos que
utilizaban tromboplastina normal, aun cuando la evaluación ISI en
fase líquida de la tromboplastina recombinante era prácticamente
idéntica a la evaluación ISI en fase líquida de la formulación Dade
IS.
Efecto de tipos diferentes de tromboplastina
sobre la precisión obtenida con una tira de prueba de tiempo de
protrombina de reactivos secos, en un estudio clínico. En este
experimento, se prepararon dos lotes de tiras de prueba de tiempo
de protrombina como se ha descrito previamente, utilizando o bien
tromboplastina recombinante Dade Innovin™ o tromboplastina normal
Dade C. Estas tiras se utilizaron luego en un estudio clínico con
25 pacientes. Se sometieron dos muestras de réplica de cada paciente
a cada formulación de tromboplastina, y se calculó la concordancia
entre cada muestra de réplica. Para el reactivo de tromboplastina
recombinante, el coeficiente de correlación R^{2} entre las dos
réplicas era 0,965. En contraste, el coeficiente de correlación
R^{2} entre las dos réplicas obtenidas utilizando la formulación
de tromboplastina normal era sólo 0,663.
Claims (12)
1. Un artículo de prueba para realización de
ensayos de tiempo de protrombina de reactivos secos, comprendiendo
dicho artículo de prueba:
una matriz de fase sólida;
tromboplastina recombinante seca purificada
inmovilizada en o dentro de la matriz de fase sólida, en donde la
tromboplastina está exenta de sustancias encontradas en la
tromboplastina purificada a partir de extracto de cerebro que
causan estados de transición intermedios de funcionamiento aberrante
cuando la tromboplastina se rehidrata con muestra líquida; y
uno o más agentes de coagulación neutros que
facilitan la rehidratación de la tromboplastina por contacto de la
matriz en fase sólida con la muestra líquida, en donde la matriz de
fase sólida es una estructura absorbente o no absorbente, y en
donde la estructura absorbente es una estructura de membrana porosa
compuesta de un material de matriz polímero hidrófilo y no
susceptible de hinchamiento que tiene dimensiones de poro que
permiten la entrada de plasma sanguíneo y proteínas en tanto que
excluyen las células de la sangre; y en donde la estructura no
absorbente es una estructura impermeable que tiene al menos un
camino de flujo capilar discreto.
2. Un artículo de prueba de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual la tromboplastina recombinante seca
purificada es factor tisular recombinante relipidado.
3. Un artículo de prueba de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual los agentes de coagulación neutros se
seleccionan del grupo constituido por proteínas, polímeros solubles
en agua, azúcares, polisacáridos, detergentes y agentes
tensioactivos.
4. Un artículo de prueba de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual el artículo comprende una tira de
prueba y la matriz de fase sólida comprende:
una membrana permeable que tiene una cara de
aplicación y una cara indicadora en oposición lateral, estando
dicha membrana exenta de interferencia con un camino de coagulación
iniciado por tromboplastina y mediado por factor VII o VIIa;
y en donde dichos uno o más agentes de
coagulación neutros están impregnados dentro de la membrana y
facilitan la rehidratación de la tromboplastina por contacto de la
membrana con una muestra líquida;
y en donde dicha tromboplastina recombinante
seca purificada está impregnada en el interior de la membrana;
y
un sustrato impregnado en el interior de la
membrana, sustrato que produce una señal detectable después de la
activación por un componente del camino de coagulación; en donde las
muestras que contienen el factor de coagulación VII o VII(a)
se aplican a la cara de aplicación de la membrana a fin de producir
la señal detectable sobre la cara indicadora como resultado de la
activación del sustrato por el componente del camino de
coagulación.
5. La tira de prueba de acuerdo con la
reivindicación 4, en la cual los agentes de coagulación neutros se
seleccionan del grupo constituido por proteínas, polímeros solubles
en agua, azúcares, polisacáridos, detergentes y agentes
tensioactivos.
6. Un método de ensayo mejorado del tiempo de
protrombina del tipo en el cual una muestra de sangre o plasma se
aplica a una matriz de fase sólida para contacto con tromboplastina
seca purificada a fin de iniciar una reacción detectable, en donde
la mejora comprende proporcionar uno o más agentes de coagulación
neutros en el interior de la matriz y poner en contacto dicha
tromboplastina seca purificada que es tromboplastina recombinante y
está exenta de sustancias encontradas en la tromboplastina
purificada a partir de extracto de cerebro que causan estados de
transición de funcionamiento aberrante cuando la tromboplastina se
rehidrata con la muestra, en donde la matriz en fase sólida es una
estructura absorbente o no absorbente, y en donde la estructura
absorbente es una estructura de membrana porosa compuesta de un
material de matriz polímero hidrófilo y no susceptible de
hinchamiento que tiene dimensiones de poros que permiten la entrada
de plasma sanguíneo y proteínas en tanto que excluyen las células
de la sangre; y en donde la estructura no absorbente es una
estructura impermeable que tiene al menos un camino de flujo
capilar discreto.
7. Un método de ensayo mejorado del tiempo de
protrombina de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual los
agentes de coagulación neutros se seleccionan del grupo constituido
por albúminas, polímeros solubles en agua, y agentes
tensioactivos.
8. Un método de ensayo mejorado del tiempo de
protrombina de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual el
camino de flujo capilar es para recibir una muestra de sangre o
plasma.
\newpage
9. Un método de ensayo mejorado del tiempo de
protrombina de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la
tromboplastina recombinante purificada seca y los agentes de
coagulación neutros se aplican en forma de capa sobre una pared del
camino de flujo capilar de tal modo que la tromboplastina se
rehidrata a medida que se hace pasar una muestra a su través por
acción capilar.
10. Un artículo de prueba de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual dichos uno o más agentes de coagulación
neutros son seroalbúmina bovina y poli(alcohol
vinílico).
11. Un método de ensayo mejorado del tiempo de
protrombina de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la
tromboplastina recombinante seca purificada es factor tisular
recombinante relipidado.
12. Un método de ensayo mejorado del tiempo de
protrombina de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual dichos
uno o más agentes de coagulación neutros son seroalbúmina bovina y
poli(alcohol vinílico).
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