ES2274439T3

ES2274439T3 - Agregacion de polipeptidos dependiente del ph y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2274439T3
Application number: ES04722562T
Authority: ES
Inventors: Ralph Zahn
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2004-03-23
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2024-03-23
Also published as: AU2004224157B2; DE602004002943D1; CN100595209C; ATE343794T1; US20040192887A1; CN1764840A; AU2004224157A1; JP4354956B2; JP2007523831A; WO2004085464A2; CA2519993C; NZ543111A; WO2004085464A3; DE602004002943T2; EP1606628A2; CA2519993A1; EP1606628B1

Abstract

Procedimiento para la agregación y/o disociación reversibles de polipéptidos, que comprende la etapa de oligomerizar un polipéptido a un pH comprendido entre 6, 2 y 7, 8, y/o disociar un agregado de polipéptidos a un pH comprendido entre 4, 5 y 5, 5 en un ambiente fluido, en el que el polipéptido se caracteriza porque: (i) el polipéptido comprende una o más estructuras repetitivas de péptido derivadas de proteínas priónicas; (ii) y la proteína se oligomeriza en fluido a un pH comprendido entre 6, 2 y 7, 8 y se disocia en monómeros a un pH comprendido entre 4, 5 y 5, 5.

Description

Agregación de polipéptidos dependiente del PH y su utilización.

Antecedentes de la invención

La proteína priónica (PrP) se detectó durante los intentos para identificar el agente infectivo de las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) y en consecuencia se conoce mucho sobre la actividad patológica de la forma scrapie, PrP^{Sc}, mientras que la función fisiológica de la forma celular, PrP^{C}, sigue siendo un enigma (Prusiner, S.B., Prions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13363-13383, 1998). PrP^{C} es una glucoproteína sináptica con una distribución heterogénea en el cerebro adulto sano, que se encuentra unida a la superficie celular a través de un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) y se distribuye a dominios membranales que se han denominado balsas lipídicas. La localización de Prp^{C} en la superficie celular sugiere que podría funcionar en la adhesión celular, captación de ligandos o señalización transmembranal.

Basándose en análisis bioquímicos de PrP^{C} de pollo, se ha planteado la hipótesis de que PrP^{C} podría estar implicada en la regulación de la expresión de receptores colinérgicos en las terminaciones sinápticas. En efecto, la inmunohistoquímica de ratones transgénicos que sobreexpresan PrP^{C} ha revelado un patrón de expresión sináptica en el que PrP^{C} se encuentra situado predominantemente en la membrana plasmática sináptica y, en menor grado, en las vesículas sinápticas. La microscopía electrónica ha mostrado que la proteína se encuentra presente tanto presinápticamente como postsinápticamente. También se ha encontrado PrP^{C} a lo largo de los axones en alargamiento, y existe evidencia creciente de que PrP^{C} podría desempeñar un papel en el crecimiento de los axones, quizás como proteína de adhesión.

La región repetitiva de octapéptido, que comprende repeticiones de la secuencia PHGGGWGQ se encuentra entre los segmentos más conservados de PrP en los mamíferos (Schätzl, H.M., Da Costa, M., Taylor, L., Cohen, F.E. y Prusiner, S.B., Prion protein gene variation among primates, J. Mol. Biol. 245:362-374, 1995; Wopfner, F., Weidenhofer, G., Schneider, R., von Brunn, A., Gilch, S., Schwarz, T.F., Werner, T. y Schätzl, H.M., Analysis of 27 mammalian and 9 avian PrPs reveals high conservation of flexible regiones of the prion protein, J. Mol. Biol. 289:1163-1178, 1999). Los residuos 60 a 91 en el PrP humano consisten de cuatro repeticiones de octapéptido (OPR) que contienen His, y los residuos 51 a 59 consisten de la secuencia homóloga PQGGGGWGQ (figura 1).

La figura 1 muestra la estructura primaria de la proteína priónica humana (PrPh). La proteína priónica humana madura consiste de los residuos 23 a 230. La secuencia de aminoácidos detallada de la región OPR, de los residuos 51 a 91 (cajas de color gris), se muestra al fondo, en la que se han subrayado los residuos asignados inequívocamente por los espectros de la resonancia magnética nuclear (RMN). Para el segmento 54 a 89, sólo se detectó un único conjunto de señales de resonancia para cada aminoácido repetido. Los elementos de estructura secundaria regular se han representado en color negro. El enlace disulfuro (S-S) entre Cys179 y Cys214 se ha dibujado como una línea de color gris. Las flechas en la parte superior indican los sitios de truncado N-terminal de los constructos de PrPh utilizados en el presente estudio.

La unión del cobre a las OPR de las proteínas priónicas de mamífero y de ave fue demostrada por primera vez por Hornshaw y colaboradores (Hornshaw, M.P., McDermott, J.R., Candy, J.M y Lakey, J.H., Copper binding to the N-terminal tandem repeat region of mammalian and avian prion protein: structural studies using synthetic peptides, Biochem. Biophys. Res. Commun. 214:993-999, 1995; Hornshaw, M.P., McDermott, J.R., Candy, J.M. y Lakey, J.H., Copper-Binding to the N-Terminal Tandem Repeat Region of Mammalian and Avian Prion Protein-Structural Studies Using Synthetic Peptides, Biochemical and Biophysical Research Communications 214:993-999, 1995) y se ha sugerido que la unión del cobre se encuentra implicada en la función fisiológica de PrP^{C} (Brown, D.R. et al., The cellular prion protein binds copper in vivo, Nature 390:684-687, 1997). Recientemente, se ha identificado un sitio de unión de la heparina dentro de la OPR de la PrP^{C}, en la que la unión resulta incrementada en presencia de Cu^{2+}. El descubrimiento de que la proteína receptora de la laminina actúa como receptor para PrP^{C} en presencia de heparán sulfato sugiere la existencia de una compleja interacción entre la proteína priónica, el cobre y la heparina/heparán sulfato y las proteínas receptoras, con implicaciones para la función celular de las proteínas priónicas. También se ha sugerido que PrP^{C} se libera de las vesículas sinápticas, evitando la unión no específica del cobre a las proteínas en la hendidura sináptica, y que da soporte a la recaptación del cobre en la presinapsis mediante endocitosis.

Problemas observados en la técnica anterior

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) o enfermedades priónicas son trastornos fatales del sistema nervioso central causados por agentes infecciosos no convencionales (priones) que están compuestos de una proteína priónica (PrP^{Sc}) (Prusiner, S.B., Prions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13363-13383, 1998). El suceso clave en la TSE es el cambio de conformación de una proteína del huésped, la proteína priónica celular (PrP^{C}), codificada por el gen priónico PRNP, en la isoforma neuropatológica PrP^{Sc} que se agrega formando fibrillas amiloides y que se acumula en las células neurales y linforeticulares (Doi, S., Ito, M., Shinagawa, M., Sato, G., Isomura, H. y Goto, H., Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice, J. Gen. Virol. 69(parte 4):995-960, 1988; Wadsworth, J.D.F., Joiner, S., Hill, A.F., Campbell, T.A., Desbruslais, M., Luthert, P.J. y Collinge, J., Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay, Lancet 358:171-180, 2001). Las estrategias diagnósticas utilizadas para la detección de otros agentes infecciosos, tales como la PCR, por lo tanto resultan inútiles. Sin embargo, se necesitan procedimientos diagnósticos exactos en etapas tempranas de indicios clínicos o durante la etapa preclínica de la enfermedad, tales como ensayos de cribado in vivo o la identificación de los individuos infectados. Estos ensayos todavía no se encuentran disponibles, aunque se han realizado enormes esfuerzos en los últimos años.

La formación de PrP^{Sc} se produce únicamente en las TSE y por lo tanto es un marcador específicos de estos trastornos. A pesar de la amplia distribución de PrP^{Sc} y de la infectividad en el cuerpo de los huéspedes afectados por TSE, las lesiones histológicas y bioquímicas se limitan únicamente al sistema nervioso central (SNC), denominándose encefalopatía espongiforme. En la TSE esporádica y genética, se desconoce en qué tejido se origina la PrP^{Sc}, pero es probable que se inicie la PrP^{Sc} en el SNC, provocando de esta manera que resulte inútil el desarrollo de procedimientos de diagnóstico precoz basados en la detección de PrP^{Sc} en tejidos o líquidos corporales de fácil acceso. Durante la infección por priones, resulta fácil detectar la PrP^{Sc} en los tejidos linforeticulares (Doi, S. et al., Western blot detection of scrapie-associated fibril protein in tissues outside the central nervous system from preclinical scrapie-infected mice, J. Gen. Viral 69(parte 4):955-960, 1988), conduciendo a que se sugiera medir PrP^{Sc} en tejido de la amígdala obtenido durante biopsia para el diagnóstico de scrapie en ovejtas y de CJDv (Hill, A.F., Zeidler, M., Ironside, J. y Collinge, J., Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy, Lancet 349:99-100, 1997), una nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob que se ha transmitido de vacas infectadas por BSE al ser humano.

En los últimos años se ha prestado mucha atención a la posible utilización de la detección de PrP^{Sc} en tejidos periféricos y accesibles (tales como las amígdalas) o líquidos corporales (tales como el líquido cerebroespinal (CSF) o la sangre) para el diagnóstico in vivo preclínico de las TSE. Los datos experimentales no han conseguido detectar infectividad de la sangre en pacientes afectados por cualquier forma de TSE humana, aunque una excepción podrían ser los pacientes de CJDv, en los que se ha planteado la existencia de infectividad de la sangre, en gran parte debido al elevado nivel de PrP^{Sc} y de infectividad de los tejidos linforreticulares.

Desde la perspectiva del diagnóstico preclínico, la sensibilidad de los procedimientos diagnósticos y de los procedimientos para concentrar la PrP^{Sc} resulta crucial debido a que la cantidad de PrP^{Sc} fuera del SNC puede ser extremadamente reducida. El límite de detección de los procedimientos de detección de PrP^{Sc} disponibles actualmente, tales como la ELISA, es de aproximadamente 2 pM (Ingrosso, L., Vetrugno, V., Cardone, F. y Pocchiari, M., Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies, Trends in Molecular Medicine 8:273-280, 2002). El nuevo procedimiento mejorado de extracción de PrP^{Sc} con fosfotungstato sódico (Wadsworth, J.D.F. et al., Tissue distribution of protease resistant prion protein in variant Creutzfeldt-Jakob disease using a highly sensitive immunoblotting assay, Lancet 358:171-180, 2001) y algunas moléculas recién descubiertas, tales como el plasminógeno (Fischer, M.B., Roeckl, C., Parizek, P., Schwarz, H.P. y Aguzzi, A., Binding of disease-associated prion protein to plasminogen, Nature 408:479-483, 2000) y la fotocadherina-2 (Brown, P., Cervenakova, L. y Diringer, H., Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease, J. Lab. Clin. Med. 137:5-13, 2001), que se unen con elevada afinidad a PrP^{Sc}, podría abrir nuevas perspectivas de diagnóstico preclínico de las TSE. Un enfoque original para incrementar el nivel mínimo detectable de la PrP^{Sc} es el de Saborio y colaboradores (Saborio, G.P., Permanne, B. y Soto, C., Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding, Nature 411:810-813, 2001), quienes desarrollaron un protocolo eficiente para la amplificación de 10 a 100 veces de la PrP^{Sc}.

Objetivos y sumario de la invención

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar una posibilidad alternativa de agregar/disociar reversiblemente polipéptidos. También es un objetivo de la invención proporcionar ligandos que se unan selectivamente a la estructura tridimensional de estos agregados de polipéptidos. Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar sensores que detectan la unión de ligandos a las estructuras tridimensionales de estos agregados de polipéptidos.

Dichos objetivos y otros objetivos adicionales se consiguen mediante el procedimiento según la reivindicación 1, y con las proteínas según la reivindicación 10. Se derivan características adicionales y preferentes de las reivindicaciones dependientes.

Los estudios estructurales de la proteína priónica de mamífero a valores de pH comprendido entre 4,5 y 5,5 establecieron que el dominio N-terminal de 100 residuos se encuentra desordenado flexiblemente, es decir, presenta una información de enrollamiento aleatoria. La presente invención describe que a valores de pH comprendido entre 6,5 y 7,8, es decir, el pH en la membrana celular, las repeticiones de octapéptido en proteína priónica humana recombinante, PrPh(23-230) que abarcan la secuencia altamente conservada PHGGGWGQ se encuentran estructuradas. La estructura de resonancia magnética nuclear (RMN) en solución de la OPR a pH 6,2 revela un nuevo motivo estructural que causa una oligomerización reversible dependiente del pH de la PrP en agregados macromoleculares. La comparación con la estructura cristalina de HGGGW-Cu^{2+} indica que la unión de los iones cobre induce una transición conformacional que presumiblemente modula la agregación de la PrP. Estos resultados sugieren un papel funcional para la proteína priónica celular en la adhesión celular homofílica dentro de la hendidura sináptica.

Los bioreceptores pueden proporcionar la base para biosensores específicos y sensibles (Schultz, J.S., Sensitivity and dynamics of bioreceptor-based biosensors, Ann. N.Y. Acad. Sci. 506:406-414, 1987). Existen muchas fuentes de bioreceptores en la naturaleza para los compuestos bioquímicos de interés en biotecnología y en biomedicina. Estos bioreceptores (anticuerpos, enzimas, proteínas membranales, proteínas de unión) pueden modificarse y producirse en grandes cantidades utilizando técnicas biotecnológicas modernas (Rigler, P., Ulrich, W.P., Hoffmann, P., Mayer, M. y Vogel, H., Reversible immobilization of peptides: surface modification and in situ detection by attenuated total reflection FTIR spectroscopy, Chemphyschem. 4:268-275, 2003). Las características del biosensor también pueden afinarse modificando la estructura del analito-análogo, lo que también proporciona varios órdenes de magnitud de rango de sensibilidad con un bioreceptor dado. La sensibilidad última del biosensor puede encontrarse limitada por la cinética de disociación de la reacción de analito y bioreceptor debido a que existe un compromiso entre la sensibilidad y la tasa de respuesta del sensor a los cambios de concentración del analito.

Las ventajas de la presente invención comprenden:

\bullet: Los polipéptidos o proteínas con capacidad inherente de agregación pueden oligomerizarse por la presencia y la estructura de repeticiones peptídicas situadas en un dominio de este polipéptido flexiblemente desordenado en dependencia del pH.

\bullet: Las repeticiones peptídicas requeridas para la agregación/disociación reversible del polipéptido pueden ser parte, sea solas o conjuntamente con un dominio de proteína flexiblemente desordenado, de la secuencia de aminoácidos nativa o pueden introducirse mediante modificación post-traduccional de un polipéptido o proteína.

\bullet: La oligomerización únicamente depende del pH del ambiente fluido de los polipéptidos o proteínas.

Breve descripción de las figuras

Las figuras siguientes pretenden documentar los antecedentes de la técnica, así como la invención. Las formas de realización preferentes del procedimiento de acuerdo con la invención también se explican por medio de las figuras, sin pretensión de limitar el alcance de la invención.

Fig. 1 Estructura primaria de la proteína priónica humana;

Fig. 2 Peso molecular aparente de los polipéptidos PrPh;

Fig. 3 Dependencia del pH del espectro de RMN-^{1}H de PrPh:

: Fig. 3A PrPh(23-230);

: Fig. 3B PrPh(81-230);

: Fig. 3C PrPh(90-230);

Fig. 4 Vistas tridimensionales de estructuras repetitivas de octapéptido:

: Fig. 4A 20 confórmeros de HGGGWGQP según DYANA afinados según las energías

: Fig. 4B Modelo de rellenado de espacios de (HGGGWGQP)_{3};

: Fig. 4C Comparación de HGGGWGQ y la estructura de rayos X de HGGGW-Cu^{2+};

Fig. 5 Movilidad del esqueleto de PrPh(23-230).

Descripción detallada de la invención

Se han descrito estructuras de RMN en solución para las formas recombinantes de PrP intacta humana (Zahn, R. et al., NMR solution structure of the human prion protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:145-150, 2000), bovina y murina a pH 4,5, y de la PrP de hámster sirio a pH 5,5. Bajo condiciones ácidas, todas las proteínas priónicas contenían un dominio globular C-terminal que se extendía aproximadamente entre los residuos 121 y 230 que contenía una lámina \beta de dos cadenas antiparalelas y tres hélices \alpha, y un dominio N-terminal que abarcaba los residuos 23 a 120 que se encontraba desordenado flexiblemente (figura 1). A pH 7,3, en el ambiente intersticial medio del cerebro, no se dispone de información estructural detallada, excepto la estructura de RMN de un fragmento C-terminal correspondiente al dominio globular de la proteína priónica humana, PrPh(121-230) determinada a pH 7 (Luigi Calzolai y R.Z., resultados no publicados) que en gran parte es similar a la estructura existente bajo condiciones ácidas (Zahn et al., 2000). En la estructura cristalina de la PrPh(90-231) dimérica que ha sido determinada recientemente a partir de cristales
formados en solución a pH 8, los dos dominios globulares se encuentran unidos por enlaces disulfuro entre cadenas.

En un intento de investigar los posibles efectos del pH sobre la estructura de la PrP^{C}, los presentes inventores estudiaron la proteína priónica humana (PrPh) recombinante en solución mediante espectroscopía RMN y dispersión lumínica dinámica. Para estos estudios los presentes inventores produjeron PrPh(23-230) recombinante correspondiente a PrP^{C} madura, así como dos constructos de PrP terminalmente truncada (figura 1). Los presentes inventores descubrieron que la protonación de las cuatro histidinas de OPR resultaba en la agregación de la PrP. A partir de cálculos de restricciones de distancia de PrPh(23-230) marcada con ^{15}N se calculó la estructura de RMN de la OPR en solución a pH 6,2. Esta estructura se comparó con la estructura cristalina recientemente determinada del segmento repetitivo octapéptido de unión a cobre, HGGGW-Cu^{2+} (Burns, C.S. et al., Molecular features of the copper binding sites in the octarepeat domain of the prion protein, Biochemistry 41:3991-4001, 2002). Los resultados se evaluaron con respecto a posibles papeles funcionales de la OPR en la PrP^{C} en presencia y en ausencia de cobre.

Además, la presente invención incluye las aplicaciones siguientes:

\bullet: Provisión y aplicación de un nuevo tipo de ensayo de cribado, así como procedimientos diagnósticos exactos en etapas tempranas de los indicios clínicos o durante la etapa preclínica de las TSE (encefalopatías espongiformes transmisibles), en particular de CJDv (nueva variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob).

\bullet: La inmovilización de proteínas o polipéptidos de fusión etiquetados con OPR en una fase sólida, tal como resinas, perlas de vidrio, etc. permite un nuevo tipo de purificación de afinidad, enriquecimiento o detección de proteínas o polipéptidos de fusión etiquetados que se deben proporcionar y/o aplicar.

\bullet: Provisión de proteínas o polipéptidos de fusión etiquetados con OPR y su aplicación a nuevo tipo de conmutadores moleculares dependientes del pH para tecnologías de la información, o para sensores moleculares o máquinas que operan a nivel molecular.

\bullet: Provisión de proteínas o polipéptidos de fusión etiquetados con OPR que reconocen específicamente proteínas priónicas, como agente terapéutico contra las TSE, así como provisión de vectores de terapia génica para la terapia de la CJDv.

\bullet: Provisión de proteínas o polipéptidos de fusión etiquetados con OPR para la producción de anticuerpos policlonales, monoclonales y/o manipulados.

\bullet: Provisión de ligandos que se unen selectivamente a la estructura tridimensional de dichos agregados de polipéptidos. Estos ligandos comprenden proteínas priónicas (PrP^{C} y PrP^{Sc}), anticuerpos, moléculas químicas y proteínas de fusión que contienen octapéptidos.

\bullet: Provisión de proteínas o polipéptidos de fusión etiquetados con OPR para la tecnología de sensores, incluyendo chips sensores químicos (por ejemplo bioquímicos) y/o físicos (por ejemplo ópticos).

Resultados experimentales 1. Producción y caracterización espectroscópica de proteínas priónicas humanas

Se prepararon los polipéptidos siguientes para el presente estudio (figura 1): la forma madura de la proteína priónica humana, PrPh(23-230); PrPh(81-230), que contiene un solo octapéptido; PrPh(90-230), que carece por completo de la OPR y que corresponde aproximadamente a la secuencia mínima requerida para la propagación del prión; y PrPh(121-230), correspondiente al dominio globular bien estructurado de la PrP (Zahn et al., 2002). Esta serie de constructos permitieron investigar posibles influencias de la longitud total de cadena sobre las características en solución de las proteína priónicas humanas.

2. Influencia del pH sobre el radio hidrodinámico de las proteínas priónicas humanas

Se determinó el radio hidrodinámico (R_{H}) de los polipéptidos PrPh a partir de mediciones de dispersión lumínica dinámica, tal como se resume en la figura 2.

La figura 2 muestra el peso molecular aparente de los polipéptidos PrPh. Se llevaron a cabo mediciones de dispersión lumínica dinámica a 20ºC con soluciones de 4 mg/ml de proteína tamponadas con acetato sódico 10 mM a pH 4,5 (columnas de color gris claro), fosfato sódico 10 mM a pH 7,0 (columnas de color gris oscuro) o acetato sódico 10 mM a pH 4,5 y que contienen cloruro sódico 100 mM (columnas de color negro). Se proporcionan los errores estándar para 4 mediciones independientes con 30 datos puntuales para cada una. La flecha indica que el peso molecular aparente de PrPh(23-230) a pH 7,0 era superior a 4 MDa.

A pH 4,5, el R_{H} de PrPh(121-230) es coherente con el peso molecular de la proteína monomérica. Bajo la suposición de una forma globular esférica del dominio C-terminal, el peso molecular aparente estimado de PrPh(121-230) es de 15,1 kDa, en comparación con 13,1 kDa según se calcula a partir de la secuencia de aminoácidos. El dominio N-terminal de los residuos 23-120 sólo redujo ligeramente la tasa de difusión de las moléculas de PrPh en la solución de pH 4,5, aunque, en presencia de cloruro sódico 100 mM, se produjo un incremento de R_{H} a mayores longitudes del extremo N-terminal. El efecto de la sal sobre el peso molecular aparente más bien es inespecífico, ya que no depende de un motivo de secuencia específico.

Sin embargo, a pH 7,0, la precipitación inmediata de PrPh(23-230) al ajustar la solución de proteína de pH 4,5 a pH 7,0 impidió estimar R_{H} mediante dispersión lumínica dinámica (figura 2), indicando que el tamaño de partícula de los agregados de PrPh era >4 MDa. Los experimentos de cromatografía de exclusión de tamaños no consiguió identificar el tamaño molecular de los agregados de PrP con mayor exactitud debido a que la proteína interaccionaba con el gel de agarosa-dextrano, presumiblemente debido a una afinidad de la OPR por el polisacárido (Hundt, C. et al., Identification of interaction domains of the prion protein with its 37 kDa/67 kDa laminin receptor, Embo Journal 20:5876-5886, 2001). En contraste, los fragmentos C-terminales PrPh(81-230), PrPh(90-230) y PrPh(121-230) sólo mostraron un ligero incremento de R_{H} en comparación con las mediciones en solución de pH 4,5 a fuerza iónica reducida, indicando que la agregación altamente específica de PrPh(23-230) en partículas macromoleculares de proteína puede atribuirse al segmento N-terminal de los residuos 23 a 89 que abarca la OPR (figura 1).

3. Influencia del pD sobre la anchura de línea de la RMN-^{1}H de las proteínas priónicas humanas

Con el fin de caracterizar adicionalmente la agregación dependiente del pH de PrPh(23-230), los presentes inventores llevaron a cabo experimentos de RMN-^{1}H en diversas condiciones de solución. Las anchuras de línea de ^{1}H en experimentos de RMN son aproximadamente proporcionales al tiempo total de correlación rotacional (\tau_{C}) y de esta manera, dependen de la masa molecular y de la forma de la molécula.

Las anchuras de línea significativamente mayores de lo esperado según la masa molecular de la proteína implican un incremento de \tau_{C} debido a agregación, o que efectos de intercambio químico o de intercambio conformacional contribuyen significativamente a la anchura de línea.

La figura 3 muestra la dependencia del pD del espectro de RMN-^{1}H de la PrPh. Se muestra la región espectral entre 6 y 9 ppm en el espectro de RMN-^{1}H de 750 MHz de una solución 0,6 mM de PrPh en D_{2}O a 20ºC. (A) PrPh(23-230). (B) PrPh(81-230). (C) PrPh(90-230). Previamente a estos experimentos, se intercambiaron los protones lábiles por deuterones mediante la disolución de las muestras en D_{2}O. Posteriormente, se incrementó la pD de la muestra escalonadamente (ver la flecha de abajo a arriba) mediante la adición de una cantidad reducida de NaOD, antes de reducirla nuevamente a pD 4,5 con pequeñas adiciones de DCl. Se indican las asignaciones de resonancia para señales de resonancia de aromáticos seleccionados en la parte superior de cada espectro.

La figura 3A muestra la región espectral entre 6 y 9 ppm en el espectro de RMN-^{1}H de la PrPh(23-230) registrada en D_{2}O. A pD 4,5, los protones anulares aromáticos de los residuos His, Phe y Tyr situados dentro del dominio C-terminal plegado mostraban anchuras de línea típicas de una proteína globular de aproximadamente 23 kDa. Las líneas de resonancia menos dispersas de la cola flexiblemente desordenada, tal como las resonancias solapantes de H^{\varepsilon 1} de las histidinas 61, 69, 77 y 85 son significativamente más estrechas debido a que su \tau_{C} efectiva es menor debido a la movilidad incrementada en la cola. A medida que se incrementó la pD escalonadamente de 4,5 a 8, las resonancias H^{\varepsilon 1} de las His presentaron un desplazamiento apantallado de campo y las anchuras de línea ^{1}H se incrementaron generalmente, tal como se muestra para los protones anulares aromáticos en la figura 3A. Los cambios eran reversibles, tal como indica el espectro superior. La repetición del mismo experimento con PrPh(81-230) resultó en un ligero ensanchamiento de línea de las señales de resonancia (figura 3B), mientras que para PrPh(90-230) la anchura de línea resultó independiente de pD (figura 3C).

Debido a que estas mediciones se llevaron a cabo en D_{2}O, en la que sólo se detectan protones no intercambiables, los presentes inventores pueden descartar el intercambio químico como posible fuente para el ensanchamiento de línea uniforme observado en los espectros de RMN. Además, un efecto exclusivo del intercambio conformacional sobre la anchura de línea sería considerablemente menor de lo observado en la figura 3A, y los espectros de RMN registrados no se asemejan a los de una proteína globular fundida con resonancias pobremente dispersadas (Dyson, H.J. y Wright, P.E., Nuclear magnetic resonance methods for elucidation of structure and dynamics in disordered states, Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules, Parte B339, páginas 258 a 270, 2001). Más probablemente, y de acuerdo con los experimentos de dispersión lumínica dinámica (figura 2), el progresivo ensanchamiento de los picos de RMN a valores de pH comprendido entre 6,0 y 8,0 está causado por la agregación de proteínas debida a la desprotonación de las cadenas laterales de His dentro del segmento peptídico 23-89, es decir, de las cuatro histidinas de la OPR (figura 1), resultando en el desplazamiento apantallado de campo observado en las resonancias de H^{\varepsilon 1} (figura 3A). No se produjo ensanchamiento de línea en los espectros de espectroscopía de correlación [^{15}N,^{1}H] (COSY) registrados con mezclas equimolares de PrPh(23-230) no marcada y PrPh(121-230) marcada con ^{15}N en solución de H_{2}O a pH 7,0 (datos no mostrados), indicando que el epítopo de unión de la OPR se encontraba situado dentro del segmento N-terminal 23-120.

4. Asignación de resonancia del dominio N-terminal a pH 6,2

Se obtuvieron las asignaciones específicas de secuencia de los protones y nitrógenos amídicos del esqueleto del segmento N-terminal 23-120 a pH 6,2 a partir de experimentos [^{15}N,^{1}H]-COSY de titulación de pH con PrPh(23-230) marcada con ^{15}N basados en la comparación del desplazamiento químico con espectros registrados a pH 4,5 (Liu, A.Z., Riek, R., Wider, G., von Schroetter, C., Zahn, R. y Wüthrich, K., NMR experiments for resonance assignments of C-13, N-15 doubly-labeled flexible polipetides: Application to the human prion protein hPrP(23-230), Journal of Biomolecular Nmr 16:127-128, 2000). A pH 6,2, al que aproximadamente el 40% de las histidinas no perturbadas se encuentran desprotonadas, las líneas de resonancia en el espectro de [^{15}N,^{1}H]-COSY sólo se encuentran ligeramente ampliadas, indicando que una fracción grande de las moléculas de PrP son monoméricas bajo estas condiciones. Las asignaciones del esqueleto se confirmaron utilizando un espectro de espectroscopía de efecto nuclear Overhauser (NOESY) tridimensional [^{1}H-^{1}H] resuelto con ^{15}N, que posteriormente se utilizó para la asignación de protones de cadena lateral. Se asignaron todas las resonancias del esqueleto polipeptídico, excluyendo los nitrógenos y protones amídicos de Gly35, de Gly93 y de Gly94, que se encuentran solapados con los de los residuos de Gly en la región OPR (Liu et al., 2000). Las líneas de resonancia correspondientes de los segmentos individuales de OPR se solapan por completo, excepto por los dos dipéptidos flanqueantes Gln52-Gly53 y Gly90-Gln91 (figura 1), es decir, la resonancia de un átomo dado de un residuo dado en el octapéptido se produce a la misma frecuencia en las cinco repeticiones. Entre los protones lábiles de cadena lateral, los grupos amida de la totalidad de los 4 residuos Asn y de los 8 residuos Gln pudieron asignarse utilizando NOEs intrarresiduales, con la única excepción de Gln59. Las resonancias de protones \varepsilon de los 3 residuos Arg no pudieron detectarse a pH 6,2 debido al rápido intercambio con el solvente.

5. Recopilación de restricciones conformacionales y cálculos de estructura del dominio N-terminal a pH 6,2

Para la asignación de los picos de correlación cruzada en el NOESY, los presentes inventores utilizaron el software CANDID de asignación automática de NOEs en combinación con el programa de cálculo de estructuras DYANA. Al inicio del cálculo de estructuras del segmento peptídico 23-120 en PrPh(23-230), se asignó un total de 689 picos de correlación cruzada en el NOESY y se integraron en el espectro de NOESY-[^{1}H,^{1}H] resuelto con ^{15}N que se registró a pH 6,2, que proporcionó 322 restricciones de distancia superiores del NOE. Sorprendentemente, pudo identificarse en el NOESY que en total 219 picos de correlación cruzada se originaban en nitrógenos y protones amídicos de la región OPR a pH 6,2, mientras que sólo se observaron 98 de estos picos a pH 4,5. En contraste, no pudieron identificarse picos de correlación cruzada adicionales en el NOESY para los residuos fuera de la OPR, indicando que la formación de estructura dependiente del pH se encontraba limitada a esta región.

Cada uno de los picos de correlación cruzada en el NOESY-[^{1}H,^{1}H] resuelto con ^{15}N podría ser el resultado de una interacción de un protón amídico con un segundo protón del mismo octapéptido o con uno de los demás octapéptidos. Con el fin de investigar la compatibilidad de los picos de correlación cruzada en el NOESY con asignaciones intraoctapéptido e interoctapéptido, los presentes inventores llevaron a cabo un cálculo de estructura de un péptido de 16 residuos (PHGGGWGQ)_{2} correspondiente a dos OPR utilizando los programas CANDID y DYANA, en los que los mismos desplazamientos químicos se atribuyeron a átomos correspondientes de un residuo dado dentro de los dos OPR. De las 80 restricciones de distancia superiores de NOEs que resultaron, 11 restricciones se asignó que eran entre octapéptidos, implicando la Gln C-terminal del primer octapéptido: 7 NOEs secuenciales (i,i+1) con Pro, 2 de rango intermedio (i,i+2) con His, y 2 NOEs de rango largo (i,i+5) con Trp.

Con el fin de mejorar adicionalmente el cálculo de estructura de la OPR, los presentes inventores investigaron la compatibilidad de los picos de correlación cruzada en el NOESY con diversas posibles asignaciones en un solo octapéptido. Los presentes inventores llevaron a cabo una serie de cálculos de estructura CANDID/DYANA utilizando la misma lista de picos como entrada, excepto que la secuencia de aminoácidos en la lista de desplazamientos químicos se modificó con respecto a la secuencia estándar de la OPR, PHGGGWGQ (figura 1). Los resultados en la Tabla 1 muestran que la totalidad de los ocho cálculos de estructura convergían con un valor residual de la función diana de DYANA próximo a 1.

TABLA 1 Caracterización de OPR calculado tras la asignación del NOE utilizando CANDID y DYANA^{a}

1

\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Leyendas de la Tabla 1:\cr \cr 
 \begin{minipage}[t]{140mm} ^{a} Se   generaron ocho secuencias
variantes diferentes de octapéptido mediante el   inicio en
diferentes  posiciones de la secuencia dentro de la región OPR de  
residuos 60 a 91 (figura 1). La entrada para los cálculos  de DYANA
con   segmentos de dos, tres y cuatro OPR se adaptó a partir del
séptimo ciclo del   resultado de  CANDID/DYANA de una sola OPR, la
secuencia de la cual se indica   en la primera columna. Cada cálculo
se inició  con 100 estructuras  
aleatorizadas.\end{minipage} \cr \cr 
 \begin{minipage}[t]{140mm} ^{b} Número   de restricciones de
distancia superiores del NOE en la introducción de cada  
OPR.\end{minipage} \cr \cr 
 \begin{minipage}[t]{140mm} ^{c} Valor   residual de la función
diana de DYANA  (Å^{2}).  Se proporciona la media    \pm  desviación
estándar  para un conjunto de 20 confórmeros utilizados para  
representar la
estructura.\end{minipage} \cr}

Sin embargo, al repetir los cálculos de DYNA utilizando las mismas restricciones de distancia pero para péptidos que contenían dos, tres o cuatro OPR consecutivas, las estructuras resultantes convergieron en diferentes valores de la función diana. Sólo se obtuvieron violaciones de restricciones de residuo constantemente reducido para aquellos péptidos con el elemento de secuencia repetitivo HGGGWGQP (Tabla 1), indicando que estas estructuras son mayoritariamente consistentes con las restricciones experimentales y de esta manera son estéricamente más favorables que las estructuras de las otras siete secuencias de octapéptido.

Los 20 mejores confórmeros de DYANA utilizados para representar la estructura de RMN del péptido de 8 residuos HGGGWGQP y el péptido de 24 residuos (HGGGWGQP)_{3}, correspondiente a los residuos 61 a 84 de PrPh(23-230) (figura 1) se afinaron adicionalmente según energías utilizando el programa OPALp. La Tabla 2 proporciona un resumen de los resultados del cálculo de estructuras.

TABLA 2 Caracterización de los 20 confórmeros de DYANA afinados según energías, que representan las estructuras de RMN de HGGGWGQP y (HGGGWGQP)_{3}

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Leyendas de la Tabla 2:\cr \cr 
 \begin{minipage}[t]{130mm} ^{1} Se   proporcionan los valores
medios  \pm  desviaciones estándar para los 20   confórmeros de
energías minimizadas  con los valores de función diana de DYANA  
más bajos. La entrada consistía de 98 y 294 restricciones superiores
de   distancia de NOE para HGGGWGQP y para (HGGGWGQP) _{3}, 
respectivamente.\end{minipage} \cr \cr   ^{2} Antes   de la
minimización de energía.\cr \cr   ^{3} Valores   de RMSD respecto a
las coordenadas
medias.\cr}

La Tabla 2 muestra que los valores de RMSD global del conjunto de 20 confórmeros de HGGGWGQP son representativos de una determinación de estructura de elevada calidad (figura 4A), mientras que la estructura de RMN de (HGGGWGQP)_{3} ha sido definida con menor precisión debido a las asignaciones que faltan de NOEs de rango largo que conectan la OPR.

La figura 4 muestra vistas tridimensionales de estructuras repetitivas de octapéptido. (A) Representación de todos átomos pesados de los 20 confórmeros afinados según energías de DYANA superpuestos para optimizar la correspondencia de los átomos de N, Cº y C' de HGGGWGQP. El esqueleto se muestra en color gris y las cadenas laterales se muestran en diferentes colores: Trp (amarillo), His (cian), Gln (rosa) y Pro (naranja). (B) Modelo de rellenado de espacios de (HGGGWGQP)_{3}. La numeración corresponde a los residuos 61 a 84 en la secuencia de la proteína priónica humana (figura 1). Se utilizó el mismo código de colores que en (A). (C) Comparación de la estructura de RMN de HGGGWGQP y la estructura de rayos X de HGGGW-Cu^{2+} (Burns et al., 2002). La orientación relativa de las dos moléculas resultó de una superposición para optimizar la correspondencia de los átomos pesados del esqueleto del segmento pentapéptido HGGGW (RMSD de 1,3 Å). Los átomos del esqueleto y de la cadena lateral de la estructura de RMN se muestran en color verde. En la estructura de rayos X, los átomos de oxígeno, nitrógeno, carbono e hidrógeno se muestran en rojo, azul, gris y blanco, respectivamente. Los enlaces de hidrógeno entre el pentapéptido y moléculas de agua ordenadas se indican como líneas discontinuas de color blanco. La posición del Ion de cobre se indica como una esfera de color cian (a título ilustrativo, el radio del cobre no se muestra a escala con el fin de reflejar el radio atómico real). Las líneas roja y azul indican los sitios de coordinación del cobre entre el cobre y los átomos de oxígeno y nitrógeno del péptido, respectivamente.

6. Estructura de RMN de las repeticiones de octapéptido (HGGGWGQP) y (HGGGWGQP)_{3}

La estructura de RMN de HGGGWGQP presenta el mismo plegamiento global de la OPR correspondiente en (HGGGWGQP)_{3}, con un valor de RMSD de 0,32 Å entre los átomos pesados del esqueleto en las estructuras medias de HGGGWGQP y el octapéptido N-terminal de (HGGGWGQP)_{3} correspondiente a los residuos 61 a 68 de PrPh(23-230). Los segmentos HGGGW y GWGQ adoptan una conformación de bucle y una estructura de giro \beta, respectivamente, en la que el giro \beta queda corroborado por un patrón continuo de conectividades NOE d_{NN} y d_{aN}, y una conectividad NOE d_{aN}(i, i+2) entre Trp y Gln. En (HGGGWGQP)_{3}, los octapéptidos se encuentran dispuestos formando un dominio globular triangular (figura 4B). Esta arquitectura molecular se encuentra estabilizada por un conjunto repetitivo de enlaces de hidrógeno: cada una de las tres OPR contiene tres enlaces de hidrógeno intra-octapéptido His(i)H^{N}-O'Gln(i+6), Gly(i+2)H^{N}-N^{\varepsilon 2}His(i) y Trp(i+3)H^{\varepsilon}-O'Gly(i). Los contactos entre las tres OPR resultan estabilizados por dos enlaces de hidrógeno del tipo Gly(i+2)H^{N}-O' Pro(i). Los enlaces peptídicos de Gln(i)-Pro(i+1) se encuentran en conformación trans. Todos los átomos de cadena lateral en gran parte se encuentran expuestos al solvente, incluyendo las cadenas laterales hidrofóbicas de Trp (figura 4B). De esta manera, a partir de la estructura tridimensional de la OPR aparentemente resulta probable que la distribución simétrica de residuos hidrofóbicos expuestos a solvente resulte de importancia para la agregación de la PrP.

7. Dinámica del esqueleto de PrPh(23-230) a pH 6,2

La formación de interacciones de estructura terciaria a pH 6,2 dentro de la OPR se correlaciona con procesos de tasa intramolecular que pueden detectarse mediante la medición de NOEs-^{15}N\{^{1}H\} heteronucleares. En estudios anteriores en solución a pH 4,5 (Zahn et al., 2002), el dominio N-terminal que comprende los residuos 23-120 de PrPh(23-230) mostró NOEs exclusivamente negativos, en contraste con el dominio C-terminal, que mostró valores típicos de un dominio de estructura globular. De esta manera, los tiempos de correlación rotacional efectivos, \tau_{c}, podría estimarse en por lo menos varios nanosegundos para los grupos ^{15}N-^{1}H esqueléticos del dominio C-terminal, mientras que los grupos ^{15}N-^{1}H en el dominio N-terminal deben presentar \tau_{c} < 1 ns, como se esperaría de una cadena polipeptídica enrollada en forma similar a una hélice de manera aleatoria y flexible. En contraste, a pH 6,2, algunos de los grupos ^{15}N-^{1}H del dominio N-terminal, incluyendo la OPR y varios residuos flanqueantes de la OPR (figura 5), muestran NOEs-^{15}N\{^{1}H\} positivos de aproximadamente 0,2, indicando que esta región polipeptídica se encuentra plegada en una estructura globular con cierto grado de movilidad, presumiblemente debido a que se encuentra en equilibrio con conformaciones más desplegadas.

La figura 5 muestra la movilidad del esqueleto de PrPh(23-230). Los NOEs-^{15}N\{^{1}H\} de equilibrio de los grupos amida se midieron en una solución 0,5 M de PrPh(23-230) en 90% de H_{2}O/10% de D_{2}O a pH 6,2 y 20ºC. En la caja entre las posiciones 51 y 91 los círculos indican que los patrones son idénticos para la totalidad de las cinco repeticiones debido a la degeneración de los desplazamientos químicos (ver texto). La flecha indica que los NOEs-^{15}N\{^{1}H\} son inferiores a -1 para Lys23 y para Lys24. Algunos de los NOEs-^{15}N\{^{1}H\} no pudieron cuantificarse debido al solapamiento espectral.

Además de los grupos amídicos del esqueleto, los grupos ^{15}N^{\varepsilon}-^{1}H del indol del Trp de la OPR se caracterizaron por valores NOE próximos a cero, sugiriendo que las cadenas laterales podrían encontrarse implicadas en interacciones transitorias de la estructura terciaria, en coherencia con los resultados de los cálculos de estructura. Aunque la agregación de PrPh(23-230) a valores de pH superiores a 6,2 impidió una caracterización detallada por RMN bajo estas condiciones, resulta probable que la estructura globular de la OPR se encuentre estabilizada adicionalmente a pH 7 debido al mayor grado de desprotonación de las histidinas.

Comentario de los resultados 1. La estructura repetitiva de octapéptido representa un nuevo motivo estructural

El programa DALI (Holm, L. y Sander, C., Protein-Structure Comparison by Alignment of Distance Matrices, Journal of Molecular Biology 233:123-138) no reveló similitudes significativas entre las estructuras de HGGGWGQP y de (HGGGWGQP)_{3} descritas en la presente memoria y cualquiera de los depósitos anteriores en el Protein Data Bank, indicando que la estructura de la OPR representa un motivo estructural nuevo. Los resultados de los cálculos de estructura de los presente inventores se apartan de estudios estructurales anteriores sobre los péptidos sintéticos de OPR. A partir de experimentos de dicroismo circular a pH 7,4 se sugirió que la OPR adoptaba una conformación desplegada con propiedades similares a una hélice de tipo II de poli-L-prolina (Smith, C.J., Drake, A.F., Banfield, B.A., Bloomberg, G.B., Palmer, M.S., Clarke, A.R. y Collinge, J., Conformational properties of the prion octa-repeat and hydrophobic sequences, Febs Letters 405:378-384, 1997), mientras que un estudio reciente de RMN llevado a cabo a pH entre 6,2 y 6,6 sugiere que los segmentos HGGGW y GWGQ adoptan una conformación de bucle y de giro \beta, respectivamente (Yoshida, H., Matsushima, N., Kumaki, Y., Nakata, M. y Hikichi, K., NMR studies of model peptides of PHGGGWGQ repeats within the N-terminus of prion proteins: A loop conformation with histidine and tryptophan in close proximity, Journal of Biochemistry 128:271-281, 2000). Aunque los presentes inventores también observaron una conformación similar a un giro para el segmento GWGQ (figura 4A), la conformación de bucle de la estructura de la presente invención es diferente debido a que los cálculos de estructura realizados por los presentes inventores no son coherentes con una proximidad estrecha entre la cadena lateral imidazol de la His y el anillo aromático del Trp. Debido a que los datos de la RMN de la OPR ciclizada que abarca uno o dos octapéptidos tampoco sugiere la existencia de proximidad estrecha entre las cadenas laterales de His y de Trp (Yoshida et al., 2000), esta interacción podría formarse sólo de manera transitoria.

Las variantes de octapéptido de mamífero comprenden secuencias, tales como PHGGSWGQ (ratón) y
PHGGGWSQ (rata) o pseudooctapéptidos, por ejemplo derivados de estos octapéptidos, con más o con menos de ocho aminoácidos, tales como PHGGGGWSQ (diversas especies) o PHGGGSNWGQ (marsupiales). Los hexapéptidos no de mamífero comprenden secuencias, tales como PHNPGY (pollo) o PHNPSY, PHNPGY (tortuga) o pseudohexapéptidos, por ejemplo derivados de estos hexapéptidos, con más o con menos de seis aminoácidos. Las secuencias comentadas en la presente memoria deben interpretarse como ejemplos no limitativos de la esencia de la presente invención.

2. Posible papel del cobre en la modulación de la agregación de la PrP dependiente del pH

Inesperadamente, el bucle HGGGW en la estructura de RMN de HGGGWGQP presenta un plegamiento del esqueleto similar al de los residuos correspondientes en la estructura cristalina del segmento repetitivo de octapéptido de unión al cobre HGGGW-Cu^{2+} determinado recientemente a partir de cristales formados a pH 7,4 (Burns, C.S. et al., Molecular features of the copper binding sites in the octarepeat domain of the prion protein, Biochemistry 41:3991-4001, 2002). En la estructura de HGGGW-Cu^{2+} (figura 4C), Cu^{2+} se encuentra pentacoordinado con ligación ecuatorial del nitrógeno \delta1 del imidazol de la His y los nitrógenos amídicos de los dos residuos de Gly siguientes, de los que la segunda Gly también contribuye el oxígeno del carbonilo de su amida. Con la excepción del nitrógeno esquelético de la His y de Cº, todos los átomos desde la His hasta el nitrógeno de la tercera Gly se encuentran aproximadamente en el plano ecuatorial y el cobre se encuentra inmediatamente por encima de este plano, lo que es consistente con que sea un complejo pentacoordinado. El indol del Trp también participa a través de un enlace de hidrógeno con la molécula de agua axialmente coordinada, mientras que la glutamina es la única cadena lateral que posee un grupo funcional que no participa en la unión del cobre. A partir de sus datos, Burns y colaboradores sugirieron un modelo en el que las cadenas laterales expuestas de la glutamina situadas dentro de dos repeticiones de octapéptido de "sándwich metálico" de PrP unido a membrana pueden servir como sitio de interacción para el reconocimiento intermolecular entre moléculas de PrP, y de esta manera estimular la endocitosis inducida por el cobre (Pauly, P.C. y Harris, D.A., Copper
stimulates endocytosis of the prion protein, J. Biol. Chem. 273:33107-33110, 1998) o facilitar la formación de PrP^{Sc}.

Aunque la estructura de RMN del bucle HGGGW libre de cobre presenta una conformación de esqueleto similar a los residuos correspondientes en HGGGW-Cu^{2+}, con un valor de RMSD de 1,3 Å entre los átomos pesados esqueléticos de los dos pentapéptidos (figura 4C), existen evidentes diferencias de conformación para las cadenas laterales aromáticas implicadas en la coordinación del cobre en la estructura HGGGW-Cu^{2+}. En la estructura HGGGW libre de cobre, el imidazol de la His se desplaza hacia abajo y se inclina hacia el plano ecuatorial del complejo pentacoordinado de cobre en la estructura HGGGW-Cu^{2+}, resultando en un incremento de la distancia entre el nitrógeno \delta1 de la His y el sitio de unión del Cu^{2+} de 1,9 Å a 3,5 Å. Además, el indol del Trp en HGGGW gira aproximadamente 180º en torno a un eje virtual que es paralelo respecto al que pasa a través del nitrógeno de coordinación y del Cu^{2+}, evitando de esta manera la formación de un enlace de hidrógeno entre la NH\varepsilon del Trp y el átomo de oxígeno de la molécula axial de agua observada en la estructura HGGGW-Cu^{2+}.

A partir de la combinación de los datos estructurales y bioquímicos proporcionados en la presente memoria, y en publicaciones anteriores (Aronoff-Spencer, E. et al., (2000) Identification of the Cu^{2+} binding sites in the N-terminal domain of the prion protein by EPR and CD spectroscopy, Biochemistry 39:13760-13771; Viles, J.H., Cohen, F.E., Prusiner, S.B., Goodin, D.B., Wright, P.E. y Dyson, H.J., Copper binding to the prion protein: structural implications of four identical cooperativa binding sites, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2042-2047, 1999), se observa que aparentemente la conformación del bucle HGGGW dentro de la OPR depende tanto del pH como de la unión del cobre:

5

Según el esquema (1), a valores de pH comprendido entre 4,7 y 5,8, es decir el pH de los compartimientos similares a endosomas, las histidinas de OPR se encuentran mayoritariamente protonadas: en consecuencia, la OPR se encuentra flexiblemente desordenada y se une al cobre sólo con bajas afinidad y cooperatividad. A valores de pH comprendido entre 6,5 y 7,8, es decir, el pH en la membrana celular, las histidinas de OPR se encuentran predominantemente desprotonadas, estabilizando de esta manera la conformación de bucle HGGW que promueve la agregación, y si se encuentra presente, el Cu^{2+} se incorpora en los sitios de unión al cobre. La coordinación del cobre por HGGGW resulta en un cambio de conformación leve aunque significativo que presumiblemente conduce a un cambio estructural de los agregados de PrP. La función del cobre podría ser, de esta manera, de modulador de la agregación pH-dependiente de la PrP, aunque sigue sin haberse demostrado que la unión del Cu^{2+} sea compatible con una agregación inversa de la OPR en agregados diméricos u oligoméricos de proteínas.

En la técnica anterior se desconocía que PrP^{C} forma grandes agregados de proteínas. Además, el descubrimiento de que la agregación de PrP^{C} depende del pH del ambiente fluido es nuevo. Además, no se conocía que la OPR es responsable de la agregación dependiente del pH de PrP^{C} y que se encuentra implicado un cambio de conformación en la dependencia del pH de la agregación de esta OPR. La base de datos actual carece de estructuras 3D similares a las mostradas en la fig. 4. La reacción de oligomerización depende del pH del ambiente fluido y la oligomerización se produce también en ausencia de cationes monovalentes o divalentes, tales como los iones Hg^{2+}, Ni^{2+}, Sn^{2+} o Cu^{2+}.

3. Implicaciones de la agregación dependiente del pH para la función fisiológica de la PrPC

Suponiendo que la PrP^{C} natural in vivo se comporta de manera similar a la PrPh recombinante, su estado de agregación también podría depender en gran parte del pH ambiental. Por lo tanto, la OPR que contiene His, podría actuar como sitio de agregación dependiente del pH que concentra un gran número de moléculas de PrP^{C} dentro de las balsas lipídicas de la superficie de la membrana presináptica. Una balsa lipídica de 44 nm de diámetro proporcionaría suficiente superficie para aproximadamente 80 moléculas de PrP^{C}, con un diámetro de 5 nm. De esta manera, el papel fisiológico del cobre sería modular el número de moléculas de PrP^{C} dentro de las balsas lipídicas, estimulando de esta manera la endocitosis de PrP^{C} en las vesículas presinápticas, en las que las proteínas priónicas se disociarían en monómeros debido al pH localmente ácido. Este modelo estaría de acuerdo con una propuesta por Burns y colaboradores (Burns
et al., 2002), excepto en que el cobre actúa como un modulador y no como un inductor de la agregación de PrP^{C}.

Alternativamente, la OPR en la PrP^{C} de mamífero podría servir como sitio de contacto intercelular para la adhesión célula-célula entre axones neuronales y dendritas. Una potencial implicación de la PrP^{C} en la adhesión celular ha sido demostrada recientemente por Lehmann y colaboradores (Mange, A., Milhavet, O., Umlauf, D., Harris, D. y Lehmann, S., PrP-dependent cell adhesion in N2a neuroblastoma cells, Febs Letters 514:159-162, 2002). Demostraron que las células de neuroblastoma que sobreexpresan PrP^{C} mostraban un mayor comportamiento de agregación en comparación con las células no transfectadas. La adición de quelantes del cobre o de quelantes de cationes durante el ensayo de agregación celular no presentó ningún efecto significativo, indicando que se producía una adhesión mediada por PrP^{C} de una manera independiente de los cationes. El tratamiento de las células de neuroblastoma con un anticuerpo policlonal P45-66 que ha sido cultivado contra un péptido sintético que abarca los residuos 45 a 66 de la PrP murina (Lehmann, S. y Harris, D.A., A mutant prion protein displays an aberrant membrane assocaition when expressed in cultured cells, J. Biol. Chem. 270:24589-24597, 1995) inhibió significativamente la agregación celular. A partir de estos resultados se concluyó que la PrP^{C} podría funcionar como molécula de adhesión en las células neuronales, estando mediada la agregación celular por la unión transcelular específica de PrP^{C} a una proteína heteróloga, tal como N-CAM o un precursor de receptor de la laminina. Sin embargo, basándose en el descubrimiento de los presentes inventores de que la OPR constituye un sitio de agregación dependiente del pH, aparentemente también resultaría posible que la PrP^{C} se encontrase implicada en el reconocimiento célula-célula homofílico. Esto es consistente con la actividad supresora de la agregación que presenta el anticuerpo P45-66, cuyo epítopo comprende las OPR que contienen His responsables de la agregación de PrP dependiente del pH (figura 1). La combinación lineal de dos moléculas de PrP^{C} ancladas a GPI en células contiguas interacciona a través de un sitio de agregación en la OPR dentro de un dominio N-terminal que de otra manera estaría en gran parte no estructurado, abarcando fácilmente los 20 a 30 nm de distancia de la hendidura sináptica (Agnati, L.F., Zoli, M., Stromberg, I. y Fuxe, K., Intercellular Communication in the Brain - Wiring Versus Volume Transmission, Neuroscience 69:711-726, 1995). De esta manera, resulta concebible que las proteínas priónicas sean similares a otras moléculas de adhesión celular homofílica, tales como las cadherinas (Pokutta, S. y Weis, W.I., The cytoplasmic face of cell contact sites, Current Opinion in Structural Biology 12:255-262, 2002), que son críticamente importantes para el establecimiento de la estructura cerebral y la conectividad durante el desarrollo temprano. Además, PrP^{C} podría participar en el remodelado de la arquitectura sináptica y la modificación de la potencia de la señal sináptica, desempeñando de esta manera un papel activo en la estructura, función y plasticidad sinápticas. Debido a que la actividad de agregación celular de PrP^{C} no depende del cobre, el papel del cobre podría ser el de un acompañante que permite que PrP^{C} cambie entre dos conformaciones oligoméricas con funciones celulares independientes, es decir, de adhesión célula-célula independiente del cobre a endocitosis dependiente del cobre, y viceversa.

Materiales y métodos 1. Preparación de las muestras

La clonación, expresión y purificación de polipéptidos PrPh en forma no marcada o con marcaje ^{15}N uniforme se consiguió tal como se ha descrito con anterioridad (Zahn, R., von Schroetter, C. y Wüthrich, K., Human prion proteins expressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding, FEBS Lett. 417:400-404, 1997). Las soluciones de proteína se concentraron utilizando dispositivos de filtro centrífugo Ultrafree-15 (Millipore).

2. Mediciones de RMN y cálculos de estructura

Las mediciones de RMN se llevaron a cabo en espectrómetros Bruker DRX500, DRX750 y DRX800 dotados de cuatro canales de radiofrecuencia y cabezas de sonda de triple resonancia con bobinas blindadas de gradiente z utilizando muestras no marcadas o marcadas con ^{15}N de soluciones 1 mM de proteína en 90% de H_{2}O/10% de D_{2}O o en 99,9% de D_{2}O y a 20ºC. Para la detección de las restricciones conformacionales, se registró un espectro tridimensional NOESY-[^{1}H,^{1}H] resuelto con ^{15}N en H_{2}O a 800 MHz con un tiempo de mezcla \tau_{m} = 100 ms a T = 20ºC, puntos complejos: 207(t_{1}) x 39(t_{2}) x 1024(t_{3}), t_{1.max}(^{1}H)=23,0 ms, t_{2.max}(^{15}N)=21,4 ms, t_{3.max}(^{1}H)=114 ms, y esta tabla de datos se llenó con ceros hasta ocupar 512 x 128 x 2.048 puntos. El procesamientos de estos espectros se llevó a cabo con el programa PROSA (Güntert, P., Dotsch, V., Wider, G. y Wüthrich, K., Processing of Multidimensional Nmr Data with the New Software Prosa, Journal of Biomolecular Nmr 2:619-629, 1992). Los desplazamientos químicos de ^{1}H y de ^{15}N se calibraron respecto a la sal 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato de sodio.

Se midieron los NOEs-^{15}N\{^{1}H\} de equilibrio a 500 MHz de acuerdo con Farrow et al. (Farrow, N.A., Zhang, O.W., Formankay, J.D. y Kay, L.E., A Heteronuclear Correlation Experiment for Simultaneous Determination of N-15 Longitudinal Decay and Chemical-Exchange Rates of Systems in Slow Equilibrium, Journal of Biomolecular Nmr 4:727-734, 1994) utilizando un periodo de saturación de los protones de 3 s mediante la aplicación de una cascada de pulsos de 120 grados a intervalos de 5 ms; t_{1.max}(^{15}N)=117,4 ms, t_{2.max}(^{1}H)=146,3 ms, tamaño de datos de dominio temporal: 250(t_{1}) x 1.024(t_{2}) puntos complejos.

La asignación de NOEs se obtuvo con el programa CANDID (Hermann, T., Güntert, P. y Wüthrich, K., Protein NMR structure determination with automated NOE assignment using the new software CANDID and the torsion angle dynamic algorithm DYANA, Journal of Molecular Biology 319:209-227, 2002) en combinación con el programa de cálculo de estructuras DYANA (Güntert, P., Mumenthaler, C. y Wüthrich, K., Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new programa DYANA, Journal of Molecular Biology 273:283-298). CANDID y DYANA llevan a cabo la asignación automática de NOEs y la calibración de distancias de las intensidades de los NOEs, la eliminación de restricciones de distancia fijadas covalentemente, el cálculo de estructura con dinámica de ángulos de torsión, y análisis automático de violaciones del límite superior de distancia de NOEs. Como entrada para CANDID, se generó una lista de picos del espectro de NOESY anteriormente indicado mediante la selección interactiva de picos con el programa XEASY (Bartels, C., Xia, T.H., Billeter, M., Güntert, P. y Wüthrich, K., The Program Xeasy for Computer-Supported Nmr Spectral-Analysis of Biological Macromolecules, JOurnal of Biomolecular Nmr 6:1-10, 1995) e integración automática de los volúmenes de pico con el programa SPSCAN (Ralf Glaser, comunicación personal). La entrada para los cálculos con CANDID y con DYANA contenían la lista de picos de NOESY y una lista de desplazamientos químicos de las asignaciones de resonancia específicas de secuencia. El cálculo siguió el protocolo estándar de 7 ciclos de asignación iterativa de NOEs y cálculo de estructura (Hermann et al., 2002). Durante los primeros seis ciclos de CANDID, se utilizaron restricciones de distancia ambiguas. Para el cálculo de estructura final, sólo se retuvieron las restricciones de distancia de NOE que correspondían a picos de correlación cruzada de NOEs con asignación no ambigua tras el sexto ciclo de cálculo. Se identificaron las asignaciones estereoespecíficas mediante la comparación de los límites superiores de distancia con la estructura que resultaba del sexto ciclo de CANDID. Se minimizaron las energías de los 20 confórmeros que presentaban los valores finales de función diana de DYANA más bajos, utilizando una cáscara hídrica con el programa OPALp (Luginbühl, P., Güntert, P., Billeter, M. y Wüthrich, K., The new program OPAL for molecular dynamics simultaions and energy refinements of biological macromolecules, Journal of Biomolecular Nmr 8:136-146, 1996) utilizando el campo de fuerzas AMBER. Se utilizó el programa MOLMOL (Koradi, R., Billeter, M. y Wüthrich, K., MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures, Journal of Molecular Graphics 14:51-55, 1996) para analizar los 20 confórmeros de energías minimizadas que resultaron (Tablas 1 y 2) y para preparar dibujos de las estructuras.

3. Experimentos de dispersión lumínica dinámica

Las mediciones de dispersión lumínica dinámica se llevaron a cabo a 20ºC utilizando un instrumento de dispersión lumínica dinámica modelo 801 de Protein Solutions Ltd. (Hertford, U.K.). El instrumento calcula el coeficiente de difusión translacional, D_{T}, de las moléculas en la celda de muestra a partir de la función de autocorrelación de los datos de intensidades de luz dispersada. El radio hidrodinámico, R_{H}, de la partícula dispersada se deriva de D_{T} utilizando la relación de Stokes-Einstein: D_{T}=k_{B}T/6\pi\etaR_{H}, en la que K_{B} es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta en grados Kelvin y \eta es la viscosidad del solvente. La concentración de proteínas era de 4 mg/ml en solución tampón que contenía acetato sódico 10 mM a pH 4,5, o fosfato sódico 10 mM a pH 7,0. Se filtraron soluciones de proteína a través de filtros de 100 nm de tamaño de poro (Whatman, U.K.). Con el fin de reducir la interferencia con burbujas o con polvo, se analizaron 30 puntos de datos por experimento utilizando el programa DYNAMICS de investigación molecular para controlar el instrumento de dispersión lumínica dinámica DynaPro (versión 4.0). Se calculó el radio hidrodinámico, R_{H}, utilizando el procedimiento de histograma de regularización utilizando el modelo de esferas, a partir del que se estimó un peso molecular aparente de acuerdo con una curva estándar calibrada para proteínas globulares conocidas.

Claims

1. Procedimiento para la agregación y/o disociación reversibles de polipéptidos, que comprende la etapa de oligomerizar un polipéptido a un pH comprendido entre 6,2 y 7,8, y/o disociar un agregado de polipéptidos a un pH comprendido entre 4,5 y 5,5 en un ambiente fluido, en el que el polipéptido se caracteriza porque:

(i): el polipéptido comprende una o más estructuras repetitivas de péptido derivadas de proteínas priónicas;

(ii): y la proteína se oligomeriza en fluido a un pH comprendido entre 6,2 y 7,8 y se disocia en monómeros a un pH comprendido entre 4,5 y 5,5.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la repetición de péptido es un octapéptido, pseudooctapéptido, hexapéptido o pseudohexapéptido.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el octapéptido presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por PHGGGWGQ (humano), PHGGSWGQ (ratón) y PHGGGWSQ (rata), o es un pseudooctapéptido derivado de dichas secuencias, preferentemente seleccionadas de entre el grupo constituido por PHGGGGWSQ (diversas especies) y PHGGGSNWGQ (marsupial).

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el hexapéptido presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo constituido por PHNPGY (pollo), PHNPSY, PHNPGY (tortuga) o es un pseudohexapéptido derivado de dichas secuencias.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada una de las repeticiones de péptido comprende una conformación de bucle N-terminal conectada a una estructura de giro \beta C-terminal.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido comprende cuatro octapéptidos idénticos.

7. Utilización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la detección de proteínas priónicas humanas o animales.

8. Utilización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la purificación por afinidad y/o el enriquecimiento de dichos polipéptidos.

9. Utilización de un procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en la que dicho polipéptido se inmoviliza sobre una fase sólida.

10. Utilización de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para tecnología de sensores químicos y/o físicos.