ES2272490T3 - Nuevos compuestos citotoxicos y su uso. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto sustancialmente puro seleccionado del grupo que consiste en N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato, N-eicosapentaenoil-cisteamina-S- fosfato, N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato, N-alfa-linolenoil-cisteamina-S-fosfato y N-gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato.
Description
Nuevos compuestos citotóxicos y su uso.
La presente invención se refiere a nuevas amidas
y a las preparaciones farmacéuticas que comprenden estas amidas, y
su uso, en particular su uso para la fabricación de preparaciones
farmacéuticas para el tratamiento del cáncer. Estos compuestos se
han sintetizado y caracterizado por el presente inventor, como se
describe aquí. Además, su eficacia como agentes antitumorales ha
sido mostrada en estudios in vitro y en estudios en
animales, descritos en los ejemplos que se acompañan.
La resistencia a los fármacos de las células
tumorales es un problema mayor en la quimioterapia del cáncer. Con
el desarrollo de resistencia sigue la necesidad de dosis mayores,
terapias de combinación y otras pautas de tratamiento, a menudo
asociadas con severos efectos secundarios para el paciente.
Los estudios concernientes a la citotoxicidad de
los ácidos grasos esenciales en las líneas celulares de cáncer han
sido publicados por varios grupos de trabajo. Además, varios
estudios experimentales han mostrado que los ácidos poliinsaturados
exógenos (PUFAs) pueden sensibilizar células tumorales a los
fármacos anticancerosos en cultivos celulares o en tumores en
crecimiento en animales.
No ha sido determinado todavía ningún mecanismo
preciso de acción de los PUFAs en la modulación de la eficacia de
los fármacos anticancerosos. Se ha propuesto que el efecto aumentado
para matar células tumorales de los fármacos anticancerosos podría
resultar de alteraciones en las propiedades biofísicas y las
funciones de las membranas originadas por la adición de los
PUFAs.
En adición a los efectos de los PUFAs sobre la
estructura de la membrana, la peroxidación de los ácidos grasos muy
insaturados se ha unido a su citotoxicidad en las células
neoplásicas. En respuesta al estrés oxidativo, los PUFAs sufren una
reacción de rotura de la cadena por radicales libres, lo que origina
la formación de hidroperóxidos de ácido graso e hidróxidos de ácido
graso como productos inmediatos y aldehídos, entre otros productos
finales. Tanto en células tumorales cultivadas como en tumores en
animales, la suplementación con PUFA se ha mostrado que causa una
disminución en la proliferación celular o en el crecimiento tumoral
que correlaciona con un aumento concomitante en el nivel de
peroxidación celular de lípidos. Estas observaciones sugieren que
los PUFAs interfieren con la proliferación de la célula tumoral
in vitro e in vivo debido a la formación de productos
de oxidación. Sin embargo se conoce poco sobre la relación de la
peroxidación de los lípidos en la modulación de la eficacia del
fármaco por PUFAs.
La habilidad de los PUFAs para aumentar la
actividad citotóxica de varios fármacos anticancerosos ha sido bien
documentada. La participación de la peroxidación de lípidos como un
mecanismo potencial a través del que los PUFAs modulan la eficacia
de estos fármacos citotóxicos ha sido sugerida a partir de estudios
experimentales en animales con tumores (Shao Y., et al.,
Lipids, 30, 1035-1045, 1995) o en cultivo celular
(Petersen E.S., et al., Cancer Res., 42,
6263-6269, 1992) que muestran que los PUFAs en
conjunción con oxidantes aumentan fuertemente la actividad de un
fármaco citotóxico que genera un estrés oxidativo y esta
peroxidación de lípido puede estar envuelta en este efecto (Germain
E., et al., Int. J. Cancer, 75, 578-583,
1998).
Estos resultados junto con la observación de que
varios ácidos grasos pueden alterar la actividad de las enzimas
unidas a la membrana celular tal como ATPasa
sódica-potásica y 5'-nucleotidasa,
los niveles de varios antioxidantes, la expresión de p53 y la
concentraciones de la proteinoquinasa C sugieren que los ácidos
esenciales grasos y sus metabolitos pueden revertir la resistencia
al fármaco de la célula tumoral al menos in vitro. (Das U.
N., et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty
Acids, 58, 39-54, 1998).
La influencia de diferentes PUFAs en la
toxicidad celular inducida por doxorubicina ha sido examinada
(Germain E.., et al., supra). De acuerdo con estudios
previos, se observó que DHA fue el más potente de todos los PUFAs
probados para aumentar la eficacia de doxorubicina. Para la mayoría
de los PUFAs, el efecto sobre la actividad del fármaco aumentó con
el índice de dobles enlaces. La única excepción fue
18:3n-6, que fue más potente que
18:3n-3 y que los ácidos grasos con 4 o 5
insaturaciones (20:4n-6 o 20:5n-3).
Esto puede estar relacionado con propiedades específicas del
18:3n-6, como ya se ha documentado en otras líneas
celulares.
En seres humanos, poco se conoce acerca de la
participación de la peroxidación de lípidos en la eficacia del
fármaco. Los PUFAs exógenos son fácilmente incorporados en las
membranas celulares del cáncer de mama (Gore J., et al.,
Amer. J. Physiol., 266, C110-C120, 1994).
El documento de patente internacional WO
00/47589 describe amidas del ácido retinoico todo trans/ácido
retinoico 13-cis, ácido araquidónico, ácido
docosahexaenoico, ácido eicosapentaenoico o ácido linolénico con
2-aminoetanol,
alfa-L-serina,
alfa-L-treonina,
alfa-L-tirosina que contienen grupos
fosfato.
Queda por determinarse hasta que extensión los
efectos colaterales tóxicos de los fármacos citotóxicos conocidos
(tales como su toxicidad hematológica o cardiaca) estarían
afectados. Esto se requiere antes de que cualquier ensayo que
envuelva dicha estrategia pueda ser considerado en pacientes
humanos.
Los problemas que subyacen en la presente
invención son numerosos. Un problema es cómo modular y
preferiblemente aumentar la eficacia de los agentes citotóxicos
conocidos hasta ahora sin cambiar o preferiblemente reduciendo los
efectos secundarios. El evitar los efectos tóxicos sistémicos y sus
complicaciones, tales como toxicidad hematológica o cardiaca es
otro problema de gran importancia.
Todavía otro problema es cómo prevenir el
desarrollo de la resistencia al fármaco de la célula tumoral, que
hasta el momento es una complicación mayor en la quimioterapia del
cáncer. Otros problemas incluyen cómo focalizar localmente el
efecto de los fármacos citotóxicos para las células tumorales u
órganos afectados, y así aumentar la eficacia del tratamiento sin
consecuencias negativas para el paciente. Sabiendo también que
algunos PUFAs tienen la habilidad de aumentar la actividad
citotóxica de varios fármacos antitumorales, continúa siendo un
problema encontrar y sintetizar compuestos nuevos, específicos, que
muestren tanto la habilidad de aumentar la actividad citotóxica de
los fármacos existentes como que tengan un efecto citotóxico en si
mismos.
Además, continúa siendo un problema cómo diseñar
nuevas combinaciones de compuestos específicos, conocidos y
compuestos por conocer, que exhiban un efecto antitumoral
aumentado.
El presente inventor ha mostrado
sorprendentemente, que las amidas descritas del ácido
docosahexaenoico y eicosapentaenoico y el ácido araquidónico, y el
ácido \alpha-linolénico o el ácido
\gamma-linolénico con
cisteamina-S-fosfato ejercen una
acción citotóxica significativa contra las células tumorales in
vitro. Durante el año de prioridad, estos resultados han sido
confirmados en estudios con animales.
Combinaciones del ácido retinoico todo trans y
/o amidas del ácido 13-cis-retinoico
con
O-fosfo-L-tirosina,
y
N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-eicosapentaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato,
N-\alpha-linolenoil-cisteamina-S-fosfato,
y
N-\gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
y sus análogos
N-docosahexaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-eicosapentaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-araquidonoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-\alpha-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-\gamma-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
en diferentes composiciones muestran un efecto inhibitorio marcado
del crecimiento celular y muestran actividad antitumoral en
experimentos in vivo e in vitro.
La invención será descrita en mayor detalle en
la descripción y ejemplos que siguen, para leerse en conexión con
las reivindicaciones adjuntas, que se incorporan aquí en su
totalidad.
En la descripción siguiente, el término
"cáncer" se usa para definir cualquier crecimiento de células
incontrolado, maligno o benigno. El término "tratamiento" se
usa con el propósito de que comprenda el tratamiento activo o
curativo, así como el tratamiento paliativo.
El término "agente citotóxico" se usa para
definir cualquier compuesto farmacológico que inhibe la
proliferación de células dentro del cuerpo, y en particular los
fármacos existentes y futuros usados en la terapia del cáncer.
Doxorubicina (DXR) es un antibiótico de antraciclina bien conocido,
usado en el tratamiento de una variedad de enfermedades neoplásicas
malignas. En la descripción presente, DXR se usa como un ejemplo de
un agente citotóxico.
Los compuestos nuevos según la presente
invención son amidas del ácido docosahexaenoico y del ácido
eicosapentaenoico y del ácido araquidónico, y del ácido
\alpha-linolénico o
\gamma-linolénico, con
cisteamina-S-fosfato.
Los compuestos específicos nuevos según la
presente invención son por ejemplo (el número del compuesto se da en
paréntesis para facilitar la referencia):
- N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato (C1)
- N-eicosapentaenoil-cisteamina-S-fosfato (C2)
- N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato (C3)
- N-\alpha-linolenoil-cisteamina-S-fosfato (C4)
- N-\gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato (C5)
Los análogos siguientes
N-acil-O-fosfo-2-aminoetanol
se han descrito en el documento PCT/IB99/02064 por el presente
inventor, pero han suscitado ahora renovado interés:
- N-docosahexaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol (C6)
- N-eicosapentaenoil O fosfo-2-aminoetanol (C7)
- N-araquidonoil O fosfo-2-aminoetanol (C8)
- N-\alpha-linolenoil O-fosfo-2-aminoetanol (C9)
- N-\gamma-linolenoil O-fosfo-2-aminoetanol (C10)
Se ha mostrado por el presente inventor que los
nuevos compuestos (C1-C5) ejercen una acción
citotóxica frente a células tumorales in vitro.
Se ha mostrado también que una combinación de
uno cualquiera de los compuestos nuevos C1 a C5, o uno cualquiera
de sus análogos
N-acil-O-fosfo-2-aminoetanol
(C6 a C10) y N-(todo
trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
(C11) o
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
(C12) ejerce una acción citotóxica pronunciada frente a células
tumorales in vitro y también exhibe actividad antitumoral
in vivo.
Un ensayo de citotoxicidad de las preparaciones
se llevó a cabo en la bien conocida línea celular HeLa de carcinoma
cervical humano. La magnitud de la inhibición del crecimiento
celular causado por las preparaciones ensayadas se usó para evaluar
su citotoxicidad.
La magnitud de la inhibición del crecimiento
celular de estas preparaciones a una concentración final de cada
compuesto en el intervalo de 5x10^{-10} a 15x10^{-10} moles/l se
muestra en la tabla 1.
| Primer compuesto | Segundo compuesto | Inhibición (%) |
| C1 | - | 25,3% (p<0,02) |
| C2 | - | 24,2% (p<0,01) |
| C3 | - | 22,8% (p<0,05) |
| C4 | - | 21,2% (p<0,05) |
| C5 | - | 20,1% (p<0,05) |
| C1 | C11 | 64,6% (p<0,001) |
| C1 | C12 | 61,3% (p<0,001) |
| C2 | C11 | 62,5% (p<0,001) |
| C2 | C12 | 60,2% (p<0,001) |
| C3 | C11 | 59,6% (p<0,001) |
| C3 | C12 | 55,4% (p<0,001) |
| C4 | C11 | 56,9% (p<0,001) |
| C4 | C12 | 55,2% (p<0,001) |
| C5 | C11 | 57,4% (p<0,001) |
| C5 | C12 | 53,7% (p<0,001) |
| C6 | C11 | 45,3% (p<0,01) |
| C6 | C12 | 42,7% (p<0,01) |
| C7 | C11 | 43,5% (p<0,01) |
| C7 | C12 | 40,1% (p<0,01) |
| C8 | C11 | 37,4% (p<0,01) |
| C8 | C12 | 35,7% (p<0,02) |
| C9 | C11 | 35,8% (p<0,01) |
| C9 | C12 | 30,2% (p<0,02) |
| C10 | C11 | 33,1% (p<0,01) |
| C10 | C12 | 31,5% (p<0,02) |
Los compuestos C1 a C10 son análogos de
lisofosfatidato (LPA). El Lisofosfatidato se sabe que es un
mensajero intercelular fosfolípido con un amplio intervalo de
efectos biológicos (Nietgen G. W., Durieux M. E., Cell Adhesión and
Communication, 5, 221-235, 1998). En particular, un
número de células derivadas del tumor fueron inhibidas en su
crecimiento por LPA. LPA tiene propiedades antimitógenas en líneas
de células de mieloma e induce un aumento del cAMP insensible a la
toxina pertussis. Junto con el descubrimiento en el linfoma de
células T de Jurkat y en líneas celulares primarias de astrocitos,
donde LPA es ineficaz para alterar la proliferación celular, esto
sugiere que LPA debe de jugar un papel como regulador de la
proliferación celular. Probablemente, la acción de LPA sobre las
células tumorales y sobre la inhibición de la proliferación de
células HeLa por los compuestos C1-C5 procede por un
mecanismo similar.
\newpage
Los compuestos C11 y C12 pueden considerarse
como interceptores de bajo peso molecular, que bloquean las
proteinoquinasas de señalización o que activan las
proteinofosfatasas de señalización en células tumorales.
Combinaciones de los compuestos C1 a C10 y C11(C12) en
diferentes composiciones se ha mostrado aquí que tienen un
sorprendente y significativo aumento del efecto citostático
comparado con los compuestos C1-C10 solos y
C11(C12) solos. Una explicación para este fenómeno, según el
presente inventor, podría ser lo siguiente: la acción de los
compuestos C1-C10 y C11 (C12) sigue diferentes
caminos de señalización simultáneamente y esto produce un aumento
de la inhibición del crecimiento de la célula cancerosa.
Los compuestos según la invención pueden usarse
como tales o como componentes en composiciones farmacéuticas, por
ejemplo en mezcla o asociación con agentes citotóxicos conocidos
actualmente.
La doxorubicina es un antibiótico
aminoglicosídico de antraciclina y se usará como un representante
típico de este grupo de compuestos.
Las composiciones C1+C11, C2+C11, C3+C11,
C4+C11, C5+C11 y C1+C12, C2+C12, C3+C12, C4+C12,
C5+C12 muestran marcada actividad antitumoral frente a ascitos de carcinoma de Ehrlich (EAC) en ratones. La magnitud de la inhibición del tumor es de cerca del 30%.
C5+C12 muestran marcada actividad antitumoral frente a ascitos de carcinoma de Ehrlich (EAC) en ratones. La magnitud de la inhibición del tumor es de cerca del 30%.
Las composiciones C6+C11, C7+C11, C8+C11,
C9+C11, C10+C11, y C6+C12, C7+C12, C8+C12, C9+C12, C10+C12 muestran
acción antitumoral pronunciada frente a EAC en ratones La magnitud
de la inhibición tumoral está en el intervalo del 20% al 30%. El
pretratamiento con las composiciones C6+C11, C7+C11, C8+C11, C9+C11,
C10+C11, y C6+C12, C7+C12, C8+C12, C9+C12, C10+C12 muestra marcado
aumento de la acción antitumoral de DXR frente a EAC en ratones. La
magnitud de la inhibición del tumor comparada a la de DXR está
aumentada en el intervalo de 25% a 40%.
Los nuevos compuestos (C1-C5)
muestran buena solubilidad en agua debido a la presencia de grupos
de fosfato en las moléculas. Los valores críticos de concentración
de micelas (CMC) para los compuestos 1 a 5 se determinaron como se
describe por A. Chattopadhyay y E. London (Anal. Biochem., 1984,
139, p. 408-412). Los valores de CMC para las sales
amónicas de los compuestos 1 a 5 (C1-C5) están en el
intervalo 1,1 x 10^{-4}-1,8 x 10^{-4}M. En los
experimentos presentes, los compuestos 1 a 10
(C1-C10) se disolvieron en suero normal de ratones y
mostraron efectos inhibitorios de crecimiento celular y mostraron
actividad antitumoral en forma de micelas.
Los compuestos según la invención pueden usarse
como tales o como componentes en composiciones farmacéuticas. Los
compuestos pueden administrarse por vía sistémica o localmente, por
ejemplo tópicamente. Modelos adecuados de administración de los
compuestos incluyen administración intravenosa, administración
intraperitoneal, así como oral, rectal y administración
transdérmica. Los compuestos según la invención pueden administrase
solos o en combinación con otros fármacos, antes, durante o después
del tratamiento quirúrgico o independientemente del mismo.
El modo que se pretende de administración se
toma naturalmente en consideración en la preparación de la
composición farmacéutica final. Naturalmente pueden usarse
adyuvantes farmacéuticos habituales y los compuestos pueden hacerse
disponibles en la forma de soluciones inyectables, ungüentos,
cápsulas o comprimidos, en la forma de parches transdérmicos o
supositorios según el uso que se intenta y/o el modo de
administración.
La dosis terapéutica eficaz para la
administración intravenosa de los compuestos está en los
intervalos:
- Compuestos C1 a C5: de alrededor de 2 mg/kg a alrededor de 5 mg/kg de peso corporal
- Compuestos C6 a C10: de alrededor de 5 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal
- Compuestos C11 y C12: de alrededor de 5 mg/kg a alrededor de 30 mg/kg de peso corporal.
Los compuestos pueden administrarse por vía
sistémica o local, por ejemplo tópicamente sobre la piel o
inyectados en un tumor o en un órgano, afectado por cáncer. Modos
adecuados de administración de los compuestos incluye la
administración intravenosa, administración intramuscular, inyección
local, administración intraperitoneal, así como administración
oral, rectal y transdérmica. El modo pretendido de administración se
toma naturalmente en consideración en la preparación de la
composición farmacéutica final. Naturalmente pueden usarse
adyuvantes farmacéuticos habituales y los compuestos pueden hacerse
disponibles en forma de soluciones inyectables, preparaciones de
liberación retardada, ungüentos, cápsulas o comprimidos, en forma de
parches transdérmicos o supositorios según el uso que se intenta y/o
el modo de administración.
Es posible administrar el compuesto o mezcla de
compuestos de la invención antes de, sustancialmente simultáneamente
o después de la administración de un agente citotóxico, por ejemplo
doxorubicina. Preferiblemente, los compuestos de la presente
invención se administran antes o sustancialmente simultáneamente con
el agente citotóxico, más preferiblemente mezclados con éste.
Tricloruro de fósforo (1,38 mg, 10 mmoles) y
trietilamina (2,53 mg, 25 mmoles) se disolvieron en 10 ml de
tetrahidrofurano seco y se enfriaron a -15ºC, después se añadieron
t-butanol (2,97 mg, 40 mmoles) y trietilamina (2,
53 mg, 25 mmoles) en 10 ml de tetrahidrofurano seco. Después de 10
minutos, la mezcla libre de hidrocloruro de trietilamina precipitado
se filtró a través de óxido de alúmina (básico, Brockmann II), se
evaporó a sequedad y se disolvió en 2 ml de benceno seco.
b) Ácido araquidónico (152 mg, 0,5 mmoles) y
trietilamina (52 mg, 0,51 mmoles) se disolvieron en 3 ml de
acetonitrilo seco y se enfriaron a -15ºC, y se añadieron 70 mg
(0,51 mmoles) de cloroformiato de butilo. Después de 30 minutos, la
mezcla libre del hidrocloruro de trietilamina precipitado se pipeteó
en una solución de dihidrocloruro de cistamina (56 mg, 0,25 mmoles)
y trietilamina (52 mg, 0,51 mmoles) en 1 ml de metanol, la agitación
se continuó durante 15 minutos a -15ºC, después la mezcla obtenida
se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 2 h, se añadió
HCl 0,5 M, y la mezcla se extrajo con éter (20 ml). El extracto se
lavó con agua, después se secó con Na_{2}SO_{4}, y evaporó a
presión reducida. El residuo se disolvió en 2 ml de cloroformo y
purificó en columna de cromatografía (2 x 2 cm) sobre óxido de
aluminio (básico, Brockmann II). La elución de la columna con
cloroformo - metanol (9:1 v/v) y la evaporación de las fracciones
apropiadas dio 181 mg (75%) del deseado
N,N'-diaraquidonoilcistamina como un sólido tipo
cera: CCF, placas preparadas de gel de sílice Merck 60 [sistema A:
benceno-dioxano-ácido acético (25:5:1 v/v/v)]
R_{f} 0,5.
La solución de
N,N'-diaraquidonoilcistamina en 2 ml de benceno seco
se añadió a la solución de "agente fosforilante". La mezcla de
reacción se agitó durante 4 días a 20ºC, se evaporó a sequedad, se
disolvió en 1 ml de benceno, y se añadió ácido trifluoroácetico
(114 mg, 1 mmol). Después de 20 h a temperatura ambiente la mezcla
de reacción se concentró a vacío y se aplicó a una columna de gel
de sílice. El producto deseado se eluyó de la columna con
cloroformo - metanol (30-20 : 70-80,
v/v), las fracciones que contenían la sustancia pura se tiñeron
sobre las placas de CCF pulverizando con molibdato, se combinaron y
evaporaron a sequedad para dar 53 mg (24%) de (C3): R_{f}
0,15-0,20 [sistema B:
cloroformo-metanol-NH_{3} acuoso
(9:7:2 v/v/v)] ^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3},
200MHz) \delta 0,9-1,0 (t, 3H,
\omega-CH_{3}); 1,3 (s, 8H, 4CH_{2});
2,0-2,2 (m, 6H, 2CH_{2}CH=CH y CH_{2}CO); 2,6 -
2,9 (m, 8H, CH_{2}SP y 3HC=CHCH_{2}CH=CH), 3,2 - 3,3 (s
ancho, 2H, CH_{2}NH); 5,2 - 5,4 (s ancho, 8H, 4HC=CH); 8,3
- 8,5 (m, 3H, NH y 2POH).
Este compuesto se preparó como se describió
anteriormente para el compuesto 3 (C3), usando 0,5 mmoles (164 mg)
de ácido
cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico;
rendimiento, 58 mg (25%); R_{f} 0,15-0,20 (sistema
B); ^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}, 200 MHz)
\delta 0,9-1,0 (t, 3H,
\omega-CH_{3}); 2,0-2,1 (t, 2H,
CH_{2}CO); 2,2-2,4 (m, 4H, 2CH_{2}CH=CH);
2,6-2,9 (m, 12H, CH_{2}SP y
5HC=CHCH_{2}CH=CH); 3,2-3,3 (s ancho, 2H,
CH_{2}NH); 5,2-5,4 (s ancho, 12H, 6HC=CH);
8,3-8,5 (m, 3H, NH y 2POH).
Este compuesto se preparó como se describió
anteriormente para el compuesto 3 (C3), usando 0,5 mmoles (151 mg)
de ácido
cis-5,8,11,14,17-eicosapentanoico;
rendimiento, 57 mg (26%); R_{f} 0,15-0,20 (sistema
B); ^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}, 200 MHz)
\delta 0,9-1,0 (t, 3H,
\omega-CH_{3}); 1,5-1,6 (t, 2H,
CH_{2}); 2,0-2,2 (m, 6H, CH_{2}CO y
2CH_{2}-CH=CH); 2,6-2,9 (m,
10H, CH_{2}SP y 4HC=CHCH_{2}CH=CH);
3,2-3,3 (s ancho, 2H, CH_{2}NH);
5,2-5,4 (s ancho, 10H, 5HC=CH);
8,3-8,5 (m, 3H, NH y 2POH).
Este compuesto se preparó como se describió
anteriormente para el compuesto 3 (C3), usando 0,5 mmoles (139 mg)
de ácido
cis-9,12,15-octadecatrienoico;
rendimiento, 42 mg (20%); R_{f} 0,15-0,20 (sistema
B); ^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}, 200 MHz)
\delta 0,9-1,0 (t, 3H,
\omega-CH_{3}); 1,3 (s, 8H, 4CH_{2});
1,4-1,5 (s ancho, 2H, CH_{2}CH_{2}CO);
2,0-2,2 (m, 6H, CH_{2}CO y 2CH_{2}CH=CH);
2,6-2,9 (m, 6H, CH_{2}SP y
2HC=CH-CH_{2}-CH=CH);
3,1-3,2 (s ancho, 2H, CH_{2}NH);
5,2-5,4 (s ancho, 6H, 3HC=CH);
8,3-8,5 (m, 3H, NH y 2POH).
Este compuesto se preparó como se describió
anteriormente para el compuesto (C3), usando 0,5 mmoles (139 mg) de
ácido cis-6,9,12-octadecatrienoico;
rendimiento, 46 mg (22%); R_{f} 0,15-0,20 (sistema
B); ^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}, 200 MHz)
\delta 0,9-1,0 (t, 3H,
\omega-CH_{3}); 1,3 (s, 8H, 4CH_{2});
1,4-1,5 (s ancho, 2H, CH_{2}CH_{2}CO);
2,0-2,2 (m, 6H, CH_{2}CO y 2CH_{2}CH=CH);
2,6-2,9 (m, 6H, CH_{2}SP y
2HC=CH-CH_{2}-CH=CH);
3,1-3,2 (s ancho, 2H, CH_{2}NH);
5,2-5,4 (s ancho, 6H, 3HC=CH);
8,3-8,5 (m, 3H, NH y 2POH).
Donde acilo es:
- -
- cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoil (C1)
- -
- cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoil (C2)
- -
- cis-5,8,11,14-eicosatetraenoil (araquidonoil) (C3)
- -
- cis-9,12,15-octadecatrienoil (\alpha-linolenoil) (C4)
- -
- cis-6,9,12-octadecatrienoil (\gamma-linolenoil) (C5)
El ácido poliinsaturado (1 mmol) y trietilamina
(103 mg, 1,02 mmoles) se disolvieron en 2 ml de tetrahidrofurano
seco, después se añadió acetonitrilo seco (4 ml), la mezcla se
enfrió a -15ºC, y se añadieron 139 mg (1,02 mmoles) de cloroformiato
de butilo. Después de 30 minutos, la mezcla libre del hidrocloruro
de trietilamina precipitado se pipeteó en una solución de
cisteamina-S-fosfato
("Sigma-Aldrich", 269 mg, 1,5 mmoles) en 3 ml
de Na_{2}CO_{3} 1M y 3 ml de H_{2}O. La mezcla obtenida se
agitó durante 1 h a 20-25ºC, se acidificó con HCl 1M
a pH 2-3 y extrajo con
cloroformo-metanol (2:1, v/v). El extracto se lavó
con metanol-agua (10:9, v/v), concentró a presión
reducida y disolvió en cloroformo-metanol NH_{3}
acuoso (13:5:1, v/v/v). La solución obtenida se evaporó a presión
reducida y se disolvió en etanol-agua (2:3, v/v, 15
ml). La emulsión obtenida se lavó con éter (2 x 10 ml) y evaporó a
presión reducida lo que dio la sal amónica de
N-acil-cisteamina-S-fosfato.
Todos los productos obtenidos son idénticos a
los compuestos preparados por el método que usa el "agente
fosforilante" para la fosforilación de los
N-acilderivados.
Para los análisis de los espectros de
^{1}H-RMN, las sales amónicas se convirtieron en
las formas ácidas por medio del lavado de las soluciones
cloroformo-metanol (2:1, v/v) con HCl 1M.
Donde acil es:
- -
- cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoil (C6)
- -
- cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoil (C7)
- -
- cis-5,8,11,14-eicosatetraenoil (araquidonoil) (C8)
- -
- cis-9,12,15-octadecatrienoil (\alpha-linolenoil) (C9)
El ácido poliinsaturado (1 mmol) y trietilamina
(103 mg, 1,02 mmoles) se disolvieron en 2 ml de tetrahidrofurano
seco, después se añadió acetonitrilo seco (4 ml), la mezcla se
enfrió a -15ºC, y se añadieron 139 mg (1,02 mmoles) de
cloroformiato de butilo. Después de 30 minutos, la mezcla libre del
hidrocloruro de trietilamina precipitado se pipeteó en una solución
de O-fosforiletanolamina
("Sigma-Aldrich", 212 mg, 1,5 mmoles) en 3 ml
de Na_{2}CO_{3} 1M y 3 ml de H_{2}O. La mezcla obtenida se
agitó durante 1 h a 20-25ºC, se acidificó con HCl
1M a pH 2-3 y extrajo con
cloroformo-metanol (2:1, v/v). El extracto se lavó
con metanol-agua (10:9, v/v), se concentró a
presión reducida y se disolvió en
cloroformo-metanol-NH_{3} acuoso
(13:5:1, v/v/v). La solución obtenida se evaporó a presión reducida
y se disolvió en etanol-agua (2:3, v/v 15 ml). La
emulsión obtenida se lavó con éter (2 x 10 ml) y evaporó a presión
reducida lo que dio la sal amónica de
N-acil-O-fosfo-2-aminoetanol.
Todos los productos obtenidos son idénticos a
los compuestos preparados por el método que usa
\beta-cianoetilfosfato para la fosforilación de
los N-acilderivados.
Para los análisis de los espectros de
^{1}H-RMN, las sales amónicas se convirtieron en
las formas ácidas por medio del lavado de las soluciones
cloroformo-metanol (2:1, v/v) con HCl 1M.
El análisis de los espectros
^{1}H-RMN para los compuestos
C6-C9 se ha descrito en el documento PCT/IB99/02064
por el mismo inventor.
Este compuesto se preparó como se describió
anteriormente (ejemplo 7), usando 0,5 mmoles (139 mg) de ácido
cis-6,9,12-octadecatrienoico;
rendimiento, 84 mg (42%); R_{f} 0,10-0,15 [sistema
B: cloroformo-metanol-NH3 acuoso
(9:7:2 v/v/v)]; ^{1}H-RMN (CD_{3}SOCD_{3}, 200
MHz) \delta 0,9-1,0 (t, 3H,
\omega-CH_{3}); 1,3 (s, 8H, 4CH_{2});
1,4-1,5 (s ancho, 2H, CH_{2}CH_{2}CO);
2,0-2,2 (m, 6H, CH_{2}CO y 2CH_{2}CH=CH);
2,7-2,9 (s ancho, 4H,
2HC=CH-CH_{2}-CH=CH);
3,1-3,2 (s ancho, 2H, CH_{2}NH);
3,7-3,8 (s ancho, 2H, CH_{2}OP);
5,2-5,4 (s ancho, 6H, 3HC=CH);
8,2-8,4 (m, 3H, NH y 2POH).
Donde retinoil es:
- -
- todo trans retinoil (C11)
- -
- 13-cis-retinoil (C12)
Ácido retinoico (1 mmol) y trietilamina (103 mg,
1,02 mmoles) se disolvieron en 6 ml de tetrahidrofurano, la mezcla
se enfrió a -15ºC, y se añadieron 139 mg (1,02 mmoles) de
cloroformiato de butilo. Después de 30 minutos, la mezcla se añadió
a la solución de 261 mg (1 mmol) de
O-fosfo-L-tirosina
("Sigma-Aldrich") en 3 ml de Na_{2}CO_{3}
1M y 3 ml de H_{2}O. Después se añadieron 3 ml de EtOH. La mezcla
obtenida se agitó durante 4 h a 20-25ºC, se
acidificó con HCl 1M a pH 2-3 y se extrajo con
cloroformo-metanol (2:1, v/v). El extracto se lavó
con metanol-agua (10:9, v/v), concentró a presión
reducida y disolvió en
cloroformo-metanol-NH_{3} acuoso
(13:5:1, v/v/v). La solución obtenida se evaporó a presión reducida
y se disolvió en etanol-agua (2:3, v/v, 15 ml). La
emulsión obtenida se lavó con éter (5 x 10 ml) y evaporó a presión
reducida lo que dio la sal amónica del
N-retinoil-O-fosfo-L-tirosina.
Todos los productos obtenidos son idénticos a
los compuestos preparados por el método que usa
\beta-cianoetilfosfato para la fosforilación de
los N-acilderivados.
Para los análisis de los espectros de
^{1}H-RMN, las sales amónicas se convirtieron en
las formas ácidas por medio del lavado de las soluciones
cloroformo-metanol (2:1, v/v) con HCl 1M. Los datos
de los espectros ^{1}H-RMN para los compuestos C11
y C12 se han descrito en el documento PCT/IB99/02064 por el mismo
inventor.
El ensayo de citotoxicidad de las preparaciones
de la invención se llevó a cabo en la línea celular bien conocida
de carcinoma cervical humano HeLa. Las células HeLa se cultivaron en
medio de cultivo completo, que contenía 80% de medio Eagle Minimal
Essential con glutamina (Sigma), 20% de suero bovino normal,
penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100 \mug/ml. Se sembraron
células HeLa a la concentración de 10^{5} células/ml en placas de
24 pocillos para líneas celulares adhesivas (Sarstedt) en un volumen
de 2 ml por pocillo. Las células HeLa se cultivaron en
incubador-CO_{2} a la temperatura de 37ºC en
atmósfera humidificada, que consistía en aire 95% y CO_{2} 5%. Al
día siguiente, los cultivos experimentales se suplementaron con
soluciones de las preparaciones de la invención en suero normal
bovino (NBS) en un volumen de 20 \mul, para obtener la
concentración necesaria para estudiar estas en cultivos. Los
cultivos de control se suplementaron con suero bovino normal.
Después de esto las células HeLa fueran cultivadas dos días de nuevo
en las mismas condiciones. En el tercer día, las células HeLa de
cada cultivo se recolectaron separadamente. El número de células
viables se contó usando la prueba de exclusión del azul de tripán y
un hemocitómetro.
Para la evaluación de la acción citotóxica de
estas preparaciones ensayadas con células HeLa se calcularon el
valor de la medía y los errores estándar de la medía del número de
células viables. La inhibición del crecimiento celular (%) se
calculó como
\frac{Control
- Experimental}{Control} \
x100
La magnitud de la inhibición del crecimiento
celular causado por las preparaciones ensayadas se usó para la
evaluación de su citotoxicidad.
Después de cultivar las células HeLa durante 24
horas, los cultivos ensayados se trataron con soluciones de C1, C2,
C3, C4 y C5 en suero bovino normal (NBS). Las soluciones iniciales
de los compuestos C1, C2, C3, C4 y C5 en NBS tenían una
concentración igual a 0,5 mg/ml. Se prepararon a partir de estas
soluciones dos soluciones de trabajo de cada preparación para
añadirlas a los cultivos:
- C1: 5,93 x 10^{-8} y 11,85 x 10^{-8} moles/l;
- C2: 6,25 x 10^{-8} y 12,50 x 10^{-8} moles/l;
- C3: 6,23 x 10^{-8} y 12,45 x 10^{-8} moles/l;
- C4: 6,59 x 10^{-8} y 13,17 x 10^{-8} moles/l;
- C5: 6,59 x 10^{-8} y 13,17 x 10^{-8} moles/l.
Se añadieron alícuotas (20 \mul) de estas
soluciones de trabajo a 2 ml de cultivos de células HeLa hasta una
concentración final en los cultivos de:
- C1: 5,93 x 10^{-10} y 11,85 x 10^{-10} moles/l;
- C2: 6,25 x 10^{-10} y 12,50 x 10^{-10} moles/l;
- C3: 6,23 x 10^{-10} y 12,45 x 10^{-10} moles/l;
- C4: 6,59 x 10^{-10} y 13,17 x 10^{-10} moles/l;
- C5: 6,59 x 10^{-10} y 13,17 x 10^{-10} moles/l.
En los cultivos de control, se añadieron 20
\mul de NBS como control de disolvente. Después de dos días de
cultivo, se contó el número de células vivas en los cultivos y se
calculó la magnitud de inhibición del crecimiento de las células
HeLa para evaluar la citotoxicidad de las preparaciones
ensayadas.
Después de tres días de cultivo, los cultivos de
control contenían (454,4 \pm 21,75) x 10^{3} células.
Los cultivos tratados en la primera y segunda
series de concentraciones tenían el siguiente número de células
vivas:
C1: (339,4 \pm 26,91) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 25,3% (p < 0,02) y
(344,9 \pm 28,45) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento
celular fue de 24,1% (p < 0,02);
C2: (347,2 \pm 26,54) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 23,6% (p < 0,02) y
(344,3 \pm 22,31) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento
celular fue de 24,2% (p < 0,01);
C3: (357,2 \pm 32,66) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 21,4% (p < 0,05) y
(350,8 \pm 30,62) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento
celular fue de 22,8% (p < 0,05);
C4: (360,8 \pm 30,47) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 20,6% (p < 0,05) y
(358,1 \pm 27,23) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento
celular fue de 21,2% (p < 0,05);
C5: (364,4 \pm 29,72) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 19,8% (p < 0,05) y
(363,1 \pm 26,34) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento
celular fue de 20,1% (p < 0,05).
Así, las preparaciones de C1, C2, C3, C4 y C5
que se añadieron solas a los cultivos en concentraciones pequeñas,
ejercieron una marcada acción citotóxica frente a las células
tumorales humanas puesto que el número de células en los cultivos
tratados fue significativamente reducido, comparado al de los
controles.
Después de cultivar las células HeLa durante 24
horas, los cultivos ensayados se trataron con soluciones de C6, C8
y C11 en NBS. Las soluciones iniciales de las preparaciones C6, C8 y
C11 en NBS tenían una concentración igual a 0,5 mg/ml. Se
prepararon a partir de estas soluciones dos soluciones de trabajo de
cada preparación para añadirlas a los cultivos:
\vskip1.000000\baselineskip
- C6: 6,12 x 10^{-8} y 12,25 x 10^{-8} moles/l;
- C8: 6,44 x 10^{-8} y 12,88 x 10^{-8} moles/l;
- C11: 5,00 x 10^{-8} y 10,00 x 10^{-8} moles/l.
Se añadieron alícuotas de 20 \mul de estas
soluciones de trabajo a 2 ml de cultivos de células HeLa hasta una
concentración final en la primera y segunda serie de cultivos
de:
\vskip1.000000\baselineskip
- C6: 6,12 x 10^{-10} y 12,25 x 10^{-10} moles/l;
- C8: 6,44 x 10^{-10} y 12,88 x 10^{-10} moles/l;
- C11: 5,00 x 10^{-10} y 10,00 x 10^{-10} moles/l.
En los cultivos de control, se añadieron 20
\mul de NBS como control de disolvente. Después de dos días de
cultivo, se contó el número de células vivas en los cultivos y se
calculó la magnitud de inhibición del crecimiento de las células
HeLa evaluando la citotoxicidad de las preparaciones ensayadas.
Después de tres días de cultivo, los cultivos de
control contenían (454,4 \pm 21,75) x 10^{3} células.
Los cultivos tratados en la primera y segunda
series de concentraciones tenían el siguiente número de células
vivas:
C6: (424,2 \pm 18,41) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 6,6% (p > 0,05) y (420,8
\pm 27,79) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue
de 7,4% (p > 0,05);
C8: (440,8 \pm 25,52) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 3,0% (p > 0,05) y (427,5
\pm 26,54) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue
de 5,9% (p > 0,05);
C11: (376,7 \pm 24,52) x 10^{3}, la
inhibición de crecimiento celular fue de 17,1% (p > 0,05) y
(430,8 \pm 16,37) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular
fue de 5,2% (p > 0,05).
Así, las preparaciones de C6, C8 y C11 que se
añadieron solas a los cultivos en concentraciones pequeñas, no
ejercieron una marcada acción citotóxica frente a las células
tumorales humanas puesto que el número de células en los cultivos
tratados no difirió significativamente de los controles.
Después de cultivar las células HeLa durante 24
horas, los cultivos ensayados se trataron con soluciones de
preparaciones de C1 + C11, C2 + C11, C3 + C11, C4 + C11 y C5 + C11
en NBS. Las soluciones iniciales de las preparaciones tenían una
concentración de C1, C2, C3, C4, C5 y C11 igual a 0,5 mg/ml. Se
prepararon a partir de estas soluciones soluciones de trabajo de
cada preparación en NBS para añadirlas a los cultivos:
\vskip1.000000\baselineskip
- C1 + C11: 5,93 x 10^{-8} moles/l de C1 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C2 + C11: 6,25 x 10^{-8} moles/l de C2 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C3 + C11: 6,23 x 10^{-8} moles/l de C3 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C4 + C11: 6,59 x 10^{-8} moles/l de C4 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C5 + C11: 6,59 x 10^{-8} moles/l de C5 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11.
\newpage
Se añadieron alícuotas de 20 \mul de estas
soluciones de trabajo a 2 ml de cultivo de células HeLa hasta una
concentración final en los cultivos de:
- C1 + C11: 5,93 x 10^{-10} moles/l de C1 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C2 + C11: 6,25 x 10^{-10} moles/l de C2 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C3 + C11: 6,23 x 10^{-10} moles/l de C3 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C4 + C11: 6,59 x 10^{-10} moles/l de C4 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C5 + C11: 6,59 x 10^{-10} moles/l de C5 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11.
En los cultivos de control, se añadieron 20
\mul de NBS como control de disolvente. Después de dos días de
cultivo, se contó el número de células vivas en los cultivos y se
calculó la magnitud de inhibición del crecimiento de las células
HeLa evaluando la citotoxicidad de las preparaciones ensayadas.
Después de tres días de cultivo, los cultivos de
control contenían (421,9 \pm 29,38) x 10^{3} células.
Los cultivos tratados tenían el siguiente número
de células vivas:
- C1 + C11: (149,4 \pm 24,96) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 64,6% (p < 0,001);
- C2 + C11: (158,1 \pm 25,27) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 62,5% (p < 0,001);
- C3 + C11: (170,6 \pm 23,34) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 59,6% (p < 0,001);
- C4 + C11: (181,9 \pm 29,39) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 56,9% (p < 0,001);
- C5 + C11: (179,7 \pm 27,30) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 57,4% (p < 0,001).
Así, las preparaciones de C1 + C11, C2 + C11, C3
+ C11, C4 + C11 y C5 + C11 que se añadieron a los cultivos en
concentraciones pequeñas, ejercieron una marcada acción citotóxica
frente a las células tumorales humanas puesto que el número de
células en los cultivos tratados fue significativamente reducido,
comparado al de los controles.
Después de cultivar las células HeLa durante 24
horas, los cultivos ensayados se trataron con soluciones de
preparaciones de C1 + C12, C2 + C12, C3 + C12, C4 + C12 y C5 + C12
en NBS. Las soluciones iniciales de las preparaciones tenían una
concentración de C1, C2, C3, C4, C5 y C12 igual a 0,5 mg/ml. Se
prepararon a partir de estas soluciones soluciones de trabajo de
cada preparación en NBS para añadirlas a los cultivos:
- C1 + C12: 5,93 x 10^{-8} moles/l de C1 y 5,00 x 10^{-8} moles /l de C12;
- C2 + C12: 6,25 x 10^{-8} moles /l de C2 y 5,00 x 10^{-8} moles /l de C12;
- C3 + C12: 6,23 x 10^{-8} moles /l de C3 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12;
- C4 + C12: 6,59 x 10^{-8} moles/l de C4 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12;
- C5 + C12: 6,59 x 10^{-8} moles/l de C5 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12.
Se añadieron alícuotas de 20 \mul de estas
soluciones de trabajo a 2 ml de cultivo de células HeLa hasta una
concentración final en los cultivos de:
- C1 + C12: 5,93 x 10^{-10} moles/l de C1 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C2 + C12: 6,25 x 10^{-10} moles/l de C2 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C3 + C12: 6,23 x 10^{-10} moles/l de C3 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C4 + C12: 6,59 x 10^{-10} moles/l de C4 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C5 + C12: 6,59 x 10^{-10} moles/l de C5 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12.
En los cultivos de control, se añadieron 20
\mul de NBS como control de disolvente. Después de dos días de
cultivo, se contó el número de células vivas en los cultivos y se
calculó la magnitud de inhibición del crecimiento de las células
HeLa evaluando la citotoxicidad de las preparaciones ensayadas.
Después de tres días de cultivo, los cultivos de
control contenían (447,5 \pm 33,02) x 10^{3} células.
Los cultivos tratados tenían el siguiente número
de células vivas:
- C1 + C12: (173,1 \pm 24,13) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 61,3% (p < 0,001);
- C2 + C12: (178,1 \pm 26,24) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 60,2% (p < 0,001);
- C3 + C12: (199,4 \pm 23,14) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 55,4% (p < 0,001);
- C4 + C12: (200,6 \pm 21,61) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 55,2% (p < 0,001);
- C5 + C12: (207,2 \pm 18,75) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 53,7% (p < 0,001).
Así, las preparaciones de C1 + C12, C2 + C12, C3
+ C12, C4 + C12 y C5 + C12 que se añadieron a los cultivos en
concentraciones pequeñas, ejercieron una marcada acción citotóxica
frente a las células tumorales humanas puesto que el número de
células en los cultivos tratados fue significativamente reducido,
comparado al de los controles.
Después de cultivar las células HeLa durante 24
horas, los cultivos ensayados se trataron con soluciones de
preparaciones de C6 + C11, C7 + C11, C8 + C11, C9 + C11 y C10 + C11
en NBS. Las soluciones iniciales de las preparaciones tenían una
concentración de C6, C7, C8, C9, C10 y C11 igual a 0,5 mg/ml. Se
prepararon a partir de estas soluciones soluciones de trabajo de
cada preparación en NBS para añadirlas a los cultivos:
- C6 + C11: 6,12 x 10^{-8} moles/l de C6 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C7 + C11: 6,47 x 10^{-8} moles/l de C7 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C8 + C11: 6,44 x 10^{-8} moles/l de C8 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C9 + C11: 6,83 x 10^{-8} moles/l de C9 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11;
- C10 + C11: 6,83 x 10^{-8} moles/l de C10 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C11.
Se añadieron alícuotas de 20 \mul de estas
soluciones de trabajo a 2 ml de cultivo de células HeLa hasta una
concentración final en los cultivos de:
- C6 + C11: 6,12 x 10^{-10} moles/l de C6 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C7 + C11: 6,47 x 10^{-10} moles/l de C7 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C8 + C11: 6,44 x 10^{-10} moles/l de C8 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C9 + C11: 6,83 x 10^{-10} moles/l de C9 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11;
- C10 + C11: 6,83 x 10^{-10} moles/l de C10 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C11.
En los cultivos de control, se añadieron 20
\mul de NBS como control de disolvente. Después de dos días de
cultivo, se contó el número de células vivas en los cultivos y se
calculó la magnitud de inhibición del crecimiento de las células
HeLa evaluando la citotoxicidad de las preparaciones ensayadas.
Después de tres días de cultivo, los cultivos de
control contenían (380,6 \pm 18,15) x 10^{3} células.
Los cultivos tratados tenían el siguiente número
de células vivas:
- C6 + C11: (208,3 \pm 33,19) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 45,3% (p < 0,01);
- C7 + C11: (215,0 \pm 13,39) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 43,5% (p < 0,001);
- C8 + C11: (238,3 \pm 25,36) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 37,4% (p < 0,01);
- C9 + C11: (244,2 \pm 21,63) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 35,8% (p < 0,01);
- C10 + C11: (254,6 \pm 19,40) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 33,1% (p < 0,01).
Así, las preparaciones de C6 + C11, C7 + C11, C8
+ C11, C9 + C11 y C10 + C11 que se añadieron a los cultivos en
concentraciones pequeñas, ejercieron una marcada acción citotóxica
frente a las células tumorales humanas puesto que el número de
células en los cultivos tratados fue significativamente reducido,
comparado al de los controles.
Después de cultivar las células HeLa durante 24
horas, los cultivos ensayados se trataron con soluciones de
preparaciones de C6 + C12, C7 + C12, C8 + C12, C9 + C12 y C10 + C12
en NBS. Las soluciones iniciales de las preparaciones tenían una
concentración de C6, C7, C8, C9, C10 y C12 igual a 0,5 mg/ml. Se
prepararon a partir de estas soluciones una solución de trabajo de
cada preparación en NBS para añadirlas a los cultivos:
- C6 + C12: 6,12 x 10^{-8} moles/l de C6 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12;
- C7 + C12: 6,47 x 10^{-8} moles/l de C7 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12;
- C8 + C12: 6,44 x 10^{-8} moles/l de C8 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12;
- C9 + C12: 6,83 x 10^{-8} moles/l de C9 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12;
- C10 + C12: 6,83 x 10^{-8} moles/l de C10 y 5,00 x 10^{-8} moles/l de C12.
Se añadieron alícuotas de 20 \mul de estas
soluciones de trabajo a 2 ml de cultivo de células HeLa hasta una
concentración final en los cultivos de:
- C6 + C12: 6,12 x 10^{-10} moles/l de C6 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C7 + C12: 6,47 x 10^{-10} moles/l de C7 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C8 + C12: 6,44 x 10^{-10} moles/l de C8 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C9 + C12: 6,83 x 10^{-10} moles/l de C9 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12;
- C10 + C12: 6,83 x 10^{-10} moles/l de C10 y 5,00 x 10^{-10} moles/l de C12.
En los cultivos de control, se añadieron 20
\mul de NBS como control de disolvente. Después de dos días de
cultivo, se contó el número de células vivas en los cultivos y se
calculó la magnitud de inhibición del crecimiento de las células
HeLa evaluando la citotoxicidad de las preparaciones ensayadas.
Después de tres días de cultivo, los cultivos de
control contenían (399,4 \pm 31,01) x 10^{3} células.
Los cultivos tratados tenían el siguiente número
de células vivas:
- C6 + C12: (228,8 \pm 24,65) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 42,7% (p < 0,01);
- C7 + C12: (239,4 \pm 29,12) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 40,1% (p < 0,01);
- C8 + C12: (256,9 \pm 31,74) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 35,7% (p < 0,02);
- C9 + C12: (278,7 \pm 24,40) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 30,2% (p < 0,02);
- C10 + C12: (273,6 \pm 23,72) x 10^{3}, la inhibición de crecimiento celular fue de 31,5% (p < 0,02).
Así, las preparaciones de C6 + C12, C7 + C12, C8
+ C12, C9 + C12 y C10 + C12, que se añadieron a los cultivos en
concentraciones pequeñas, ejercieron una marcada acción citotóxica
frente a las células tumorales humanas puesto que el número de
células en los cultivos tratados fue significativamente reducido,
comparado al de los
controles.
controles.
\newpage
Se estudiaron los efectos antitumorales de las
composiciones C1 + C11, C2 + C11, C3 + C11, C4 + C11, C5 + C11, C6 +
C11, C7 + C11, C8 + C11, C9 + C11, C10 + C11, C1 + C12, C2 + C12, C3
+ C12, C4 + C12, C5 + C12, C6 + C12, C7 + C12, C8 + C12, C9 + C12 y
C10 + C12 en ratones IRC con carcinoma de ascites de Ehrlich (EAC)
durante el año de prioridad.
Se usaron en el estudio ratones hembras albinas
de la línea IRC criados aleatoriamente, de nuestro propio
estabulario. La habitación que alberga a los animales posee aire
filtrado con 15 cambios cada hora, temperatura de
19-21ºC, humedad relativa de 50-60%
y un día de luz regulado de 12 horas con cambios de luz y oscuridad
a las 6 de la mañana y a las 6 de la tarde. Se mantuvieron los
ratones en jaulas transparentes de policarbonato con el área del
suelo de 600 cm^{2} que contenía un lecho de serrín de madera
blanda. Los animales tuvieron acceso libre a botellas con agua del
grifo de calidad doméstica y a pienso estándar para animales en
crecimiento ad libitum. Se distribuyeron los ratones de
2-2,5 meses de edad, que pesaban 20 - 23 g de forma
aleatoria entre los grupos de prueba y de control, normalizados por
pesos medios. Los grupos de control y de prueba incluyeron 15 y 12
animales respectivamente. Los animales de cada grupo estaban
identificados por marcas específicas en la oreja. Las jaulas con
los animales de cada grupo se identificaron con tarjetas de jaula
marcadas con la fecha del estudio, el número del grupo, el número y
sexo de los animales.
La cepa de EAC, que es una variante
hiperdiploide, se propagó en ratones ICR por inoculación
intraperitoneal de 0,2 ml de fluido de ascitos neto o diluido con
solución salina 1:1 de un animal con EAC en crecimiento
intraperitoneal en el día 7. Los fluidos de ascitos contenían más
del 98% de células tumorales viables según la prueba de exclusión
del azul de tripán. Se preparó para cada ensayo la suspensión de
células de EAC en solución salina estéril en concentración de
10^{7} células tumorales viables/ml en condiciones asépticas del
fluido de ascitos del ratón que tenía EAC en el día 7.
Se inoculó tanto a los ratones del grupo control
como a los del grupo experimental con 2 x 10^{6} células de EAC
por inyección intraperitoneal en un volumen de 0,2 ml en el día 0.
Después de la inoculación de células EAC se realizaron inyecciones
intravenosas en la vena lateral de la cola de los ratones en días
alternos, cuatro veces (día 1, 3, 5 y 7).
Se inyectó por vía intravenosa a los ratones del
grupo control con el vehículo (suero normal de ratones, NMS) en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal (100 \mul en un ratón de peso
corporal de 20 g) (control negativo).
Los ratones de los grupos experimentales
recibieron las composiciones de C1 + C11, C2 + C11, C3 + C11, C4 +
C11, C5 + C11, C6 + C11, C7 + C11, C8 + C11, C9 + C11, C10 + C11, C1
+ C12, C2 + C12, C3 + C12, C4 + C12, C5 + C12, C6 + C12, C7 + C12,
C8 + C12, C9 + C12 y C10 + C12 por vía intravenosa en un volumen de
5 ml/kg de peso corporal (100 \mul en un ratón de peso corporal
de 20 g) en los días 1, 3, 5 y 7. Cada composición contenía el
compuesto C11 o C12 en concentraciones de 0,8 mg/ml y un compuesto
de la serie C1-C10 en una concentración de 0,4 mg/ml
en NMS.
Se ha investigado el efecto de pretratamiento
con las composiciones C6 + C11, C7 + C11, C8 + C11, C9 + C11, C10 +
C11, C6 + C12, C7 + C12, C8 + C12, C9 + C12 y C10 + C12 en la acción
antitumoral de DXR en ratones IRC con EAC.
Se inyectó por vía intravenosa a los ratones del
grupo control con el vehículo en un volumen de 5 ml/kg de peso
corporal (100 \mul en un ratón de peso corporal de 20 g) (control
negativo).
Otro grupo de animales (control positivo)
recibió por vía intravenosa una solución acuosa de DXR (0,7 mg/ml
de concentración) en una dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal en los días 1, 3, 5 y 7.
Los ratones de los grupos experimentales
recibieron DXR solo en la misma dosis en los días 1 y 5. Se
inyectaron por vía intravenosa las composiciones C6 + C11, C7 + C11,
C8 + C11, C9 + C11, C10 + C11, C6 + C12, C7 + C12, C8 + C12, C9 +
C12 y C10 + C12 en un volumen de 5 ml/kg de peso corporal (100
\mul en un ratón de peso corporal de 20 g) en los días 3 y 7. Cada
composición contenía el compuesto C11 o C12 en concentraciones de
1,5 mg/ml y un compuesto de la serie C6-C10 en una
concentración de 0,7 mg/ml. Al principio, se inyectó la composición
(pretratamiento) y dentro de los 15 minutos después de esto se
inyectaron los ratones con la solución acuosa de DXR (concentración
de 0,7 mg/ml) en una dosis de 3,5 mg/kg y en un volumen de 5 ml/kg
de peso corporal en los días
3 y 7.
3 y 7.
Se mató a los ratones por dislocación cervical
un día después del tratamiento final con las sustancias de prueba
en el día 8. Se recogieron los fluidos de los ascitos, se
registraron los volúmenes, y se lavaron las cavidades abdominales
con solución salina 6-7 veces y se reunieron ambos
fluidos. Se registraron también los volúmenes de las pelets
celulares tumorales después de centrifugación a 1000 rpm durante 10
minutos. Se contó el número de células viables por hemocitómetro.
Se calcularon las medias y los errores estandardizados para cada
uno de los grupos de animales. Se llevó a cabo una comparación del
número de células tumorales en los grupos de control y
experimentales usando la prueba t de Student. Se evaluó el efecto de
la composición en la inhibición de crecimiento de EAC por:
Inhibición, \
% = \frac{Control - Experimental}{Control} \ x
100
Se usó la magnitud de inhibición del crecimiento
de EAC en los ratones para evaluar la actividad antitumoral de la
composición probada.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C1 + C11, C2 +
C11, C3 + C11 en NMS (C1, C2 y C3 - 2 mg/kg; C11 - 4 mg/kg). En el
día después del tratamiento final con las composiciones, se mató a
los ratones por dislocación cervical (día 8). Se contaron las
células tumorales y se evaluó la magnitud de inhibición del
crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (1061,7
\pm 82,4) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal.
En los ratones del grupo experimental C1 + C11
el número de células tumorales fue (728,8 \pm 93,6) x 10^{6} y
la inhibición de crecimiento de EAC fue 31,4%, p < 0,02. En los
ratones del grupo C2 + C11 el número de células tumorales fue
(736,2 \pm 125,3) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC
fue 30,7%, p < 0,05. En los ratones del grupo experimental C3 +
C11 el número de células tumorales fue (766,4 \pm 103,9) x
10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue 27,8%, p <
0,05.
Así, las composiciones C1 + C11, C2 + C11 y C3 +
C11 muestran una marcada acción antitumoral frente a EAC. La
magnitud de inhibición del tumor es alrededor del 30%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 23 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C1 + C12, C2 +
C12, C3 + C12 en NMS (C1, C2 y C3 - 2 mg/kg; C12 - 4 mg/kg). En el
día después del tratamiento final con las composiciones, se mató a
los ratones por dislocación cervical (día 8). Se contaron las
células tumorales y se evaluó la magnitud de inhibición del
crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (893,4
\pm 75,5) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal.
En los ratones del grupo experimental C1 + C12
el número de células tumorales fue (630,7 \pm 84,1) x 10^{6} y
la inhibición de crecimiento de EAC fue 29,4%, p < 0,05. En los
ratones del grupo C2 + C12 el número de células tumorales fue (633,4
\pm 98,0) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue
29,1%, p < 0,05. En los ratones del grupo experimental C3 + C12
el número de células tumorales fue (654,8 \pm 86,3) x 10^{6} y
la inhibición de crecimiento de EAC fue 26,7%, p < 0,05.
Así, las composiciones C1 + C12, C2 + C12 y C3 +
C12 muestran una marcada acción antitumoral frente a EAC. La
magnitud de inhibición del tumor es cerca de 30%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C4 + C11, C5 +
C11 en NMS (C4 y C5 - 2 mg/kg; C11 - 4 mg/kg). En el día después
del tratamiento final con las composiciones, se mató a los ratones
por dislocación cervical (día 8). Se contaron las células tumorales
y se evaluó la magnitud de inhibición del crecimiento de EAC en los
ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (965,1
\pm 69,8) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En los
ratones del grupo experimental C4 + C11 el número de células
tumorales fue (700,6 \pm 77,8) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 27,4%, p < 0,02. En los ratones del grupo
C5 + C11 el número de células tumorales fue (694,8 \pm 96,5) x
10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue 28,0%, p <
0,05.
Así, las composiciones C4 + C11 y C5 + C11
mostraron una marcada acción antitumoral frente a EAC. La magnitud
de inhibición del tumor es alrededor de 28%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C4 + C12, C5 +
C12 en NMS (C4 y C5 - 2 mg/kg; C12 - 4 mg/kg). En el día después
del tratamiento final con las composiciones, se mató a los ratones
por dislocación cervical (día 8). Se contaron las células tumorales
y se evaluó la magnitud de inhibición del crecimiento de EAC en los
ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (811,6
\pm 68,2) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En los
ratones del grupo experimental C4 + C12 el número de células
tumorales fue (603,0 \pm 73,4) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 25,7%, p < 0,05. En los ratones del grupo
C5 + C12 el número de células tumorales fue (597,1 \pm 70,7) x
10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue 26,4%, p <
0,05.
Así, las composiciones C4 + C12 y C5 + C12
mostraron una marcada acción antitumoral frente a EAC. La magnitud
de inhibición del tumor es alrededor de 26%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C6 + C11, C7 +
C11, C8 + C11 en NMS (C6, C7 y C8 - 2 mg/kg; C11 - 4 mg/kg). En el
día después del tratamiento final con las composiciones, se mató a
los ratones por dislocación cervical (día 8). Se contaron las
células tumorales y se evaluó la magnitud de inhibición del
crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (1124,8
\pm 92,7) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En los
ratones del grupo experimental C6 + C11 el número de células
tumorales fue (806,3 \pm 109,6) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 28,3%, p < 0,05. En los ratones del grupo
C7 + C11 el número de células tumorales fue (833,5 \pm 103,2) x
10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue 25,9%, p <
0,05. En los ratones del grupo experimental C8 + C11 el número de
células tumorales fue (826,9 \pm 94,8) x 10^{6} y la inhibición
de crecimiento de EAC fue 26,5%, p < 0,05.
Así, las composiciones C6 + C11, C7 + C11 y C8 +
C11 muestran una marcada acción antitumoral frente a EAC. La
magnitud de inhibición del tumor es cerca de 28%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C6 + C12, C7 +
C12, C8 + C12 en NMS (C6, C7 y C8 - 2 mg/kg; C12 - 4 mg/kg). En el
día después del tratamiento final con las composiciones, se mató a
los ratones por dislocación cervical (día 8). Se contaron las
células tumorales y se evaluó la magnitud de inhibición del
crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (1028,5
\pm 87,6) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal.
En los ratones del grupo experimental C6 + C12
el número de células tumorales fue (745,4 \pm 81,3) x 10^{6} y
la inhibición de crecimiento de EAC fue 27,5%, p < 0,05. En los
ratones del grupo C7 + C12 el número de células tumorales fue (741,2
\pm 106,6) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue
27,9%, p < 0,05. En los ratones del grupo experimental C8 + C12
el número de células tumorales fue (769,1 \pm 85,4) x 10^{6} y
la inhibición de crecimiento de EAC fue 25,2%, p < 0,05.
Así, las composiciones C6 + C12, C7 + C12 y C8 +
C12 muestran una marcada acción antitumoral frente a EAC. La
magnitud de inhibición del tumor es cerca de 27%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C9 + C11, C10 +
C11 en NMS (C9 y C10 - 2 mg/kg; C11 - 4 mg/kg). En el día después
del tratamiento final con las composiciones, se mató a los ratones
por dislocación cervical (día 8). Se contaron las células tumorales
y se evaluó la magnitud de inhibición del crecimiento de EAC en los
ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (973,0
\pm 62,3) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En los
ratones del grupo experimental C9 + C11 el número de células
tumorales fue (776,9 \pm 58,5) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 20,2%, p < 0,05. En los ratones del grupo
C10 + C11 el número de células tumorales fue (789,7 \pm 60,4) x
10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC fue 18,8%, p <
0,05.
Así, las composiciones C9 + C11 y C10 + C11
mostraron una significante acción antitumoral frente a EAC. La
magnitud de inhibición del tumor es cerca de 20%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo (NMS). Los ratones de los grupos
experimentales recibieron una de las composiciones C9 + C12, C10 +
C12 en NMS (C9 y C10 - 2 mg/kg; C12 - 4 mg/kg). En el día después
del tratamiento final con las composiciones, se mató a los ratones
por dislocación cervical (día 8). Se contaron las células tumorales
y se evaluó la magnitud de inhibición del crecimiento de EAC en los
ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (1007,3
\pm 65,1) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal.
En los ratones del grupo experimental C9 + C12
el número de células tumorales fue (775,6 \pm 73,0) x 10^{6} y
la inhibición de crecimiento de EAC fue 23,0%, p < 0,05. En los
ratones del grupo experimental C10 + C12 el número de células
tumorales fue (831,2 \pm 53,9) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 17,5%, p < 0,05.
Así, las composiciones C9 + C12 y C10 + C12
mostraron una significante acción antitumoral frente a EAC. La
magnitud de inhibición del tumor es cerca de 23%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo. Otro grupo de animales (control
positivo) recibieron DXR en una dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal
(70 \mug de DXR a un ratón de 20 g de peso corporal) por vía
intravenosa. Los ratones de los grupos experimentales recibieron una
de las composiciones C6 + C11, C7 + C11 (C6 y C7 - 3,5 mg/kg; C11 -
7,5 mg/kg) al principio (pretratamiento) y dentro de los 15 minutos
después de que los ratones fueran inyectados con DXR en una dosis
de 3,5 mg/kg de peso corporal (70 \mug de DXR en 100 \mul a un
ratón de 20 g de peso corporal). En el día después del tratamiento
final, se mató a los ratones por dislocación cervical en el día 8.
Se contaron las células tumorales y se evaluó la magnitud de
inhibición del crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (918,1
\pm 93,7) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En el
grupo de ratones con solo DXR (control positivo) el número de
células tumorales fue (525,2 \pm 74,5) x 10^{6} y la inhibición
de crecimiento de EAC fue 42,8%, p < 0,01. En los ratones del
grupo experimental C6 + C11 el número de células tumorales fue
(318,3 \pm 61,5) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC
fue 65,3%, p < 0,001. La magnitud de inhibición del tumor
comparada con la de DXR se aumentó en 39,4%, p < 0,05. En los
ratones del grupo experimental C7 + C11 el número de células
tumorales fue (342,9 \pm 46,1) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 62,7%, p < 0,001. La magnitud de
inhibición del tumor comparada con la de DXR se aumentó en 34,7%, p
< 0,05.
Así, el pretratamiento con las composiciones C6
+ C11 y C7 + C11 mostró un marcado aumento de la acción antitumoral
de DXR frente a EAC a cerca de 40%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo. Otro grupo de animales (control
positivo) recibieron DXR en una dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal
(70 \mug de DXR para un ratón de 20 g de peso corporal) por vía
intravenosa. Los ratones de los grupos experimentales recibieron
una de las composiciones C6 + C12, C7 + C12 (C6 y C7 - 3,5 mg/kg;
C12 - 7,5 mg/kg) al principio (pretratamiento) y dentro de los 15
minutos después de que los ratones fueran inyectados con DXR en una
dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal (70 \mug de DXR en 100 \mul
a un ratón de 20 g de peso corporal). En el día después del
tratamiento final, se mató a los ratones por dislocación cervical en
el día 8. Se contaron las células tumorales y se evaluó la magnitud
de inhibición del crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (794,7
\pm 118,3) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En el
grupo de ratones con solo DXR (control positivo) el número de
células tumorales fue (436,3 \pm 51,8) x 10^{6} y la inhibición
de crecimiento de EAC fue 45,1%, p < 0,02. En los ratones del
grupo experimental C6 + C12 el número de células tumorales fue
(275,4 \pm 49,7) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC
fue 65,3%, p < 0,001. La magnitud de inhibición del tumor
comparada con la de DXR se aumentó en 36,9%, p < 0,05. En los
ratones del grupo experimental C7 + C12 el número de células
tumorales fue (295,8 \pm 43,3) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 62,8%, p < 0,001. La magnitud de
inhibición del tumor comparada con la de DXR se aumentó en 32,2%, p
< 0,05.
Así, el pretratamiento con las composiciones C6
+ C12 y C7 + C12 mostró un marcado aumento de la acción antitumoral
de DXR frente a EAC de cerca de 37%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo. Otro grupo de animales (control
positivo) recibieron DXR en una dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal
(70 \mug de DXR para un ratón de 20 g de peso corporal) por vía
intravenosa. Los ratones de los grupos experimentales recibieron
una de las composiciones C8 + C11, C9 + C11 (C8 y C9 - 3,5 mg/kg;
C11 - 7,5 mg/kg) al principio (pretratamiento) y dentro de los 15
minutos después de que los ratones fueran inyectados con DXR en una
dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal (70 \mug de DXR en 100 \mul
a un ratón de 20 g de peso corporal). En el día después del
tratamiento final, se mató a los ratones por dislocación cervical en
el día 8. Se contaron las células tumorales y se evaluó la magnitud
de inhibición del crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (1165,8
\pm 139,4) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En el
grupo de ratones con solo DXR (control positivo) el número de
células tumorales fue (614,4 \pm 60,2) x 10^{6} y la inhibición
de crecimiento de EAC fue 47,3%, p < 0,002. En los ratones del
grupo experimental C8 + C11 el número de células tumorales fue
(408,5 \pm 58,7) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC
fue 65,0%, p < 0,001. La magnitud de inhibición del tumor
comparada con la de DXR se aumentó en 33,5%, p < 0,05. En los
ratones del grupo experimental C9 + C11 el número de células
tumorales fue (443,6 \pm 52,6) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 61,9%, p < 0,001. La magnitud de
inhibición del tumor comparada con la de DXR se aumentó en 27,8%, p
< 0,05.
Así, el pretratamiento con las composiciones C8
+ C11 y C9 + C11 mostró un marcado aumento de la acción antitumoral
de DXR frente a EAC a cerca de 33%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo. Otro grupo de animales (control
positivo) recibió DXR en una dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal (70
\mug de DXR para un ratón de 20 g de peso corporal) por vía
intravenosa. Los ratones de los grupos experimentales recibieron
una de las composiciones C8 + C12, C9 + C12 (C8 y C9 - 3,5 mg/kg;
C12 - 7,5 mg/kg) al principio (pretratamiento) y dentro de los 15
minutos después de que los ratones fueran inyectados con DXR en una
dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal (70 \mug de DXR en 100 \mul
para un ratón de 20 g de peso corporal). En el día después del
tratamiento final, se mató a los ratones por dislocación cervical en
el día 8. Se contaron las células tumorales y se evaluó la magnitud
de inhibición del crecimiento de EAC en los ratones.
\newpage
Los ratones en el grupo control tenían (895,4
\pm 126,1) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En el
grupo de ratones con solo DXR (control positivo) el número de
células tumorales fue (542,6 \pm 50,1) x 10^{6} y la inhibición
de crecimiento de EAC fue 39,4%, p < 0,02. En los ratones del
grupo experimental C8 + C12 el número de células tumorales fue
(384,7 \pm 47,5) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC
fue 57,0%, p < 0,002. La magnitud de inhibición del tumor
comparada con la de DXR se aumentó en 29,1%, p < 0,05. En los
ratones del grupo experimental C9 + C12 el número de células
tumorales fue (399,8 \pm 45,9) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 55,3%, p < 0,002. La magnitud de
inhibición del tumor comparada con la de DXR se aumentó en 26,3%, p
< 0,05.
Así, el pretratamiento con las composiciones C8
+ C12 y C9 + C12 mostró un marcado aumento de la acción antitumoral
de DXR frente a EAC de cerca de 29%.
Se inoculó por vía intraperitoneal a ratones IRC
de 20 - 22 g con 2 x 10^{6} células viables de EAC. Empezando en
el día 1, se inyectó a los ratones por vía intravenosa (en un
volumen de 5 ml/kg de peso corporal) una vez al día en días
alternos, cuatro veces (días 1, 3, 5 y 7). Los ratones del grupo
control recibieron vehículo. Otro grupo de animales (control
positivo) recibió DXR en una dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal (70
\mug de DXR para un ratón de 20 g de peso corporal) por vía
intravenosa. Los ratones de los grupos experimentales recibieron
una de las composiciones C10 + C11, C10 + C12 (C10- 3,5 mg/kg; C11 y
C12 - 7,5 mg/kg) al principio (pretratamiento) y dentro de los 15
minutos después de que los ratones fueran inyectados con DXR en una
dosis de 3,5 mg/kg de peso corporal (70 \mug de DXR en 100 \mul
para un ratón de 20 g de peso corporal). En el día después del
tratamiento final se mató a los ratones por dislocación cervical en
el día 8. Se contaron las células tumorales y se evaluó la magnitud
de inhibición del crecimiento de EAC en los ratones.
Los ratones en el grupo control tenían (963,6
\pm 129,6) x 10^{6} células EAC en la cavidad abdominal. En el
grupo de ratones con solo DXR (control positivo) el número de
células tumorales fue (534,8 \pm 39,3) x 10^{6} y la inhibición
de crecimiento de EAC fue 44,5%, p < 0,01. En los ratones del
grupo experimental C10 + C11 el número de células tumorales fue
(400,1 \pm 50,2) x 10^{6} y la inhibición de crecimiento de EAC
fue 58,5%, p < 0,001. La magnitud de inhibición del tumor
comparada con la de DXR se aumentó en 25,2%, p < 0,05. En los
ratones del grupo experimental C10 + C12 el número de células
tumorales fue (401,6 \pm 50,0) x 10^{6} y la inhibición de
crecimiento de EAC fue 58,3%, p < 0,001. La magnitud de
inhibición del tumor comparada con la de DXR se aumentó en 24,9%, p
< 0,05.
Así, el pretratamiento con las composiciones C10
+ C11 y C10 + C12 mostró un marcado aumento de la acción antitumoral
de DXR frente a EAC, alrededor de 25%.
Chattopadhyay A. y London E.
Anal. Biochem., 1984, 139,
p.408-412
Das U.N., et al.,
Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 58,
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Res., 42, 6263-6269, 1992
Shao Y., et al., Lipids,
30, 1035-1045, 1995.
Claims (20)
1. Un compuesto sustancialmente puro
seleccionado del grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-eicosapentaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato,
N-\alpha-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
y
N-\gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato.
2. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto según la reivindicación 1.
3. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto según la reivindicación 1, en forma de
micelas.
4. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto según la reivindicación 1, en combinación
con una cantidad terapéuticamente eficaz de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
5. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto según la reivindicación 1, en combinación
con una cantidad terapéuticamente eficaz de
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
6. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-cisteamina-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-eicosapentaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-araquidonoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-\alpha-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
y
N-\gamma-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
7. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-eicosapentaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-araquidonoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-\alpha-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
y
N-\gamma-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
8. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de
N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato
y uno de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
o
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
9. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de
N-eicosapentaenoil-cisteamina-S-fosfato
y uno de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
o
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
10. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de
N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato
y uno de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
o
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
11. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de
N-\alpha-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
y uno de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
o
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
12. Una preparación farmacéutica,
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de
N-\gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
y uno de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina
o
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
13. El uso de un compuesto según la
reivindicación 1, para la fabricación de una preparación
farmacéutica.
14. El uso de un compuesto según la
reivindicación 1, para la fabricación de una preparación
farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
15. El uso de un compuesto para la fabricación
de una preparación farmacéutica, dicho compuesto se selecciona del
grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-eicosapentaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-araquidonoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-\alpha-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
y
N-\gamma-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol.
16. El uso de un compuesto para la fabricación
de una preparación farmacéutica para el tratamiento del cáncer,
dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-eicosapentaenoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-araquidonoil-O-fosfo-2-aminoetanol,
N-\alpha-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol
y
N-\gamma-linolenoil-O-fosfo-2-aminoetanol.
\newpage
17. El uso de un compuesto seleccionado del
grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-eicosapentaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato,
N-\alpha-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
y
N-\gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
para la fabricación de una preparación farmacéutica para el
tratamiento del cáncer, en donde una cantidad eficaz de dicho
compuesto se mezcla con una cantidad eficaz de
N-(todo-trans-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
18. El uso de un compuesto seleccionado del
grupo que consiste en
N-docosahexaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-eicosapentaenoil-cisteamina-S-fosfato,
N-araquidonoil-cisteamina-S-fosfato,
N-\alpha-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
y
N-\gamma-linolenoil-cisteamina-S-fosfato
para la fabricación de una preparación farmacéutica para el
tratamiento del cáncer, en donde una cantidad eficaz de dicho
compuesto se mezcla con una cantidad eficaz de
N-(13-cis-retinoil)-O-fosfo-L-tirosina.
19. El uso de un compuesto según una cualquiera
de las reivindicaciones 6 - 7, para la fabricación de una
preparación farmacéutica para el tratamiento del cáncer, en donde
una cantidad eficaz de dicho compuesto se mezcla con una cantidad
eficaz de un agente citotóxico.
20. El uso según la reivindicación 19, en donde
el agente citotóxico es la doxorubicina.
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