ES2271263T3 - Nuevos compuestpos para procedimientos de quimioluminiscencia. - Google Patents
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Abstract
Compuestos químicos que constan de un precursor de la región emisora de luz y un precursor del grupo saliente, en el que un grupo carbonilo u otro grupo funcional equiva- lente de dicho precursor de la región emisora de luz se une mediante un enlace amida a un átomo de nitrógeno del pre- cursor del grupo saliente, que se caracteriza, a su vez, en que dicho átomo de nitrógeno del precursor del grupo sa- liente forma parte de una forma reducida de un sistema re- dox donador-pi-donador en dos fases también denominado sis- tema redox reversible en dos fases, en el que tras la oxi- dación el precursor del grupo saliente se transforma en el grupo saliente.
Description
Nuevos compuestos para procedimientos de
quimioluminiscencia.
La presente invención se refiere a un compuesto
químico que consta de un precursor de una región emisora de luz y un
precursor de grupo saliente, unidos entre sí mediante un grupo amida
y se caracteriza porque el precursor del grupo saliente se
transforma en el grupo saliente mediante oxidación. La invención
también se refiere a compuestos que poseen adicionalmente un grupo
de acoplamiento para la utilización de dichos compuestos en el
marcaje de biomoléculas y de forma más general para el uso de dichas
moléculas en procesos de detección por quimioluminiscencia.
Se ha llevado a cabo la detección específica y
la cuantificación de moléculas biológicas con una sensibilidad
excelente con la utilización, por ejemplo, de moléculas indicadoras
marcadas radiactivamente. Los primeros radioinmunoensayos
desarrollados a finales de los años 50 se han convertido en las
herramientas más importantes para el diagnóstico in vitro,
especialmente en medicina, y utilizan una amplia variedad de
distintos sistemas indicadores o de detección. Las enzimas, las
perlas de látex marcadas, los colorantes fluorescentes y, sobretodo,
los colorantes quimioluminiscentes constituyen ejemplos muy
conocidos de sistemas indicadores. Se encuentran disponibles
artículos de revisión que describen la teoría y la práctica de
ensayos de unión específica.
El experto en la materia encontrará todos los
detalles técnicos necesarios para la realización de ensayos de unión
específica en libros de texto como: "Practice and theory of enzyme
immunoassays" Tijssen (1990) Amsterdam, Elsevier y diversas
ediciones de "Methods in Enzymology" Colowick, S. P. y Caplan,
N. O. (1980-1986), Academic Press, que tratan de
métodos de detección inmunológicos, especialmente los volúmenes 70,
73, 74, 84, 92 y 121.
En paralelo al desarrollo de las técnicas de
medición de luz y de la disponibilidad comercial de aparatos de
elevada sensibilidad, los luminóforos han sustituido a los marcajes
radiactivos en muchas aplicaciones. Algunos de los nuevos marcadores
luminiscentes permiten la detección de analitos a niveles de
sensibilidad extremadamente bajos. Por tanto, estos marcajes también
disponibles comercialmente son muy interesantes.
Los marcajes luminiscentes pueden subdividirse
en los grupos de marcajes fluorescentes y marcajes luminiscentes.
Mientras que los marcajes fluorescentes requieren la irradación de
la muestra con una luz de excitación para detectar y medir el
marcaje fluorescente presente, los sistemas quimioluminiscentes no
necesitan una fuente de luz extra.
Sistemas basados en la quimioluminiscencia muy
conocidos utilizan, entre otras, las categorías siguientes de
marcajes: la combinación de luciferinas con sus correspondientes
luciferasas, arilhidrazida cíclica, derivados del acridinio,
dioxetanos estables y derivados del ácido oxálico.
Algunos de los avances conseguidos, así como,
los problemas que todavía surgen en este ámbito pueden ilustrarse
exponiendo un ejemplo específico: los ésteres de acridinio.
Los ésteres de acridinio representan una clase
de compuestos muy importante en la quimioluminiscencia. Un aspecto
esencial de dichos ésteres de acridinio es la sustitución de la
función éster por un grupo saliente apropiado. Los grupos salientes
apropiados se diseñan para cumplir con dos requisitos esenciales:
estabilidad y un elevado rendimiento cuántico.
Por un lado, el grupo saliente de los ésteres de
acridinio debe ser lo más activo posible, por ejemplo,
desprendiéndose rápidamente bajo las condiciones de medida, para
permitir una detección sensible y un elevado rendimiento cuántico.
Por otro lado, esta elevada actividad tiene un costo en
inestabilidad frente a la hidrólisis. Dicha inestabilidad es incluso
más crítica si dichos marcajes quimiolumuniscentes se utilizan para
conjugarse con biomoléculas. El objetivo de conseguir un elevado
rendimiento quimioluminiscente junto con una elevada estabilidad del
reactivo marcado equivale a la búsqueda de un buen equilibrio que
siempre culmina en un compromiso entre el rendimiento cuántico y la
estabilidad.
Para solucionar, al menos en parte, los
problemas existentes, se han diseñado grupos salientes nuevos y
diferentes. Los más populares son los siguientes:
N-sulfonamidas, p.ej. descritas en la patente US 5
669 819; tioésteres descritos en la patente DE 3 645 292; ésteres de
ácido hidroxámico descritos en la patente WO 98/56765; imidazolidas
descritas por Waldrop III, A. A., et al., Luminescence 15
(2000) 169-182; y amidas de piridinio (WO 95/1
9976).
Algunos compuestos químicos que constan de un
colorante de acridinio o acridano y un grupo fenol o hidroxifenol
unido mediante enlace éster se conocen por otro campo de
investigación. Dichos ésteres de acridinio o acridina se han
utilizado como sustratos enzimáticos o se ha descrito que el grupo
fenol modula la estabilidad hidrolítica o labilidad del enlace éster
(WO 97/33884; WO 01/09372; PE 625 510).
Otra estrategia ha consistido en utilizar los
compuestos acridanos (patente US 5 593 845) que tras la oxidación de
su región acridano actúan de forma similar a los colorantes de
acridinio. No obstante, todas las alternativas descritas contienen
una región éster activa que todavía es sujeta a hidrólisis y
requiere de una manipulación y un almacenamiento cuidadosos y
especiales.
La misión de la presente invención es la
búsqueda e identificación de compuestos novedosos para su aplicación
en ensayos de quimioluminiscencia que proporcionen, por un lado,
colorantes o marcajes quimioluminiscentes estables y, por otro lado,
la detección sensible o un elevado rendimiento cuántico. Son
especialmente necesarios aquellos compuestos que consten además de
un grupo de acoplamiento los cuales son apropiados para el marcaje o
la conjugación con una biomolécula.
Sorprendentemente, se ha descubierto que los
compuestos pueden sintetizarse con un precursor de la región emisora
de luz y un precursor del grupo saliente. Este hecho permite superar
algunos de los problemas conocidos en este campo. Estos compuestos
novedosos constan de un enlace amida estable entre el átomo de
nitrógeno del precursor del grupo saliente y el grupo carbonilo del
precursor de la región emisora de luz, en el que este átomo de
nitrógeno forma parte de un sistema redox.
Tras la oxidación del precursor del grupo
saliente el enlace amida o el enlace éster se activa y el precursor
de la región emisora de luz está listo para generar
quimioluminiscencia después de su reacción con el peróxido.
En resumen, la presente invención se refiere a
un compuesto químico, tal y como se describe en las reivindicaciones
anexas, que consta de un precursor de un grupo emisor de luz y un
precursor del grupo saliente, en el que el grupo carbonilo del
mencionado precursor de la región emisora de luz está unido al
precursor del grupo saliente a través de un enlace amida. El
mencionado precursor del grupo saliente se transforma en el grupo
saliente tras su oxidación.
La invención también se refiere, tal y como se
describe en las reivindicaciones anexas, a compuestos que constan
que un precursor de un grupo emisor de luz, un precursor del grupo
saliente y un grupo de acoplamiento.
Dado que los compuestos según la presente
invención presentan tanto estabilidad durante el almacenamiento como
una detección sensible en procedimientos de quimioluminiscencia,
también se utilizan para el marcaje de biomoléculas y los conjugados
resultantes pueden aplicarse proporcionando enormes beneficios en
ensayos de unión específica apropiados para la detección de una
analito en una muestra.
De forma muy ventajosa, estos compuestos
novedosos pueden utilizarse para la detección de peróxido, así como
para la detección de peroxidasa.
La invención también se refiere a un método de
realización de una medición de quimioluminiscencia utilizando un
compuesto novedoso tal y como se ha descrito. En dicho método el
precursor del grupo saliente primero es oxidado, el precursor del
grupo emisor de luz se vuelve reactivo, la energía en forma de luz
se genera según los procedimientos estándar y la luz emitida se mide
de manera habitual.
La presente invención se refiere a un compuesto
químico que consta de un precursor de la región emisora de luz y un
precursor del grupo saliente, en el que un grupo carbonilo u otro
grupo químicamente equivalente del mencionado precursor de la región
emisora de luz se une mediante un enlace amida a un átomo de
nitrógeno del precursor del grupo saliente. Dicho átomo de nitrógeno
del precursor de grupo saliente forma parte de la forma reducida de
un sistema redox en dos fases
donador-pi-donador también conocido
como sistema redox reversible en dos fases, en el que dicho
precursor del grupo saliente se convierte en el grupo saliente
mediante una reacción de oxidación.
Los compuestos químicos de acuerdo con la
presente invención constan de un precursor de la región emisora de
luz y un precursor del grupo saliente. Estas dos entidades químicas
se unen entre sí mediante un enlace amida. Dicho enlace amida es
estable, de modo que asegura la estabilidad de toda la estructura
química. Dicho enlace bastante estable no se hidroliza, p.ej., en
condiciones fisiológicas ni bajo condiciones rutinarias de
almacenamiento. El compuesto químico de acuerdo con la siguiente
invención también puede describirse como un derivado de la región
emisora de luz. Estos derivados novedosos de la región emisora de
luz pueden manejarse fácilmente, p.ej., durante su conjugación con
biomoléculas o bajo condiciones de almacenamiento a largo plazo que
se requieren para muchas aplicaciones comerciales.
Un "precursor de la región emisora de luz"
en el sentido que se da en la presente invención consta de las
mencionadas regiones químicas que tras la activación apropiada puede
utilizarse y medirse con un sistema de análisis basado en la
detección de quimioluminiscencia. Clases de compuestos químicos muy
conocidos utilizados para el marcaje quimiolumuniscente incluye,
entre otros: la combinación de luciferinas con sus correspondientes
luciferasas, arilhidrazidas cíclicas, derivados del acridinio,
dioxetanos estables y derivados del ácido oxálico.
El precursor de la región emisora de luz de la
presente invención debe tener un grupo carbonilo u otro grupo
químicamente equivalente. En un compuesto de acuerdo con la
siguiente invención, el precursor de la región emisora de luz no
está presente, por supuesto, como precursor del grupo emisor de luz
libre sino que consta de un enlace amida con el precursor del grupo
saliente. En otras palabras, el precursor de la región emisora de
luz en los compuestos que se han descrito debe entenderse como la
parte ácido carboxílica de una amida del precursor de un grupo
emisor de luz libre.
La función característica e importante del grupo
carbonilo es que los nucleófilos como el H_{2}O_{2} puede atacar
al átomo de carbono sp^{2}. Se sabe con seguridad que grupos como
los residuos cianimino y los tiocarbonilos proporcionan
características químicas similares. Entre todos esos grupos se
prefieren los grupos carbonilo. Con el objetivo de evitar
redundancias lingüísticas, a partir de ahora se utilizará en la
mayoría de los casos el término grupo carbonilo. No obstante, se
entiende que pueden utilizarse también equivalentes funcionales
apropiados.
El precursor del grupo saliente se convierte en
un grupo saliente mediante oxidación, y tal como indica el término,
sale tras la reacción del grupo carbonilo con peróxido.
El grupo carbonilo que forma parte del enlace
amida estable es el mismo carbonilo que (después de la formación del
grupo saliente) tras el ataque por el peróxido y la emisión de luz
que le acompaña, se escinde del precursor de la región emisora de
luz.
Una de las clases de marcaje quimioluminiscente
preferidas son los compuestos de acridinio. Sus mecanismos
quimioluminiscentes han sido ampliamente estudiados y se encuentran
perfectamente comentados en un artículo de revisión publicado en
"Angewandte Chem. Intern. Ed. Engl"., de Mayer, A. y
Neuenhofer, S. (1994) 1044-1 072, Weinheim, VCH
Verlagsgesellschaft mbH.
Se han propuesto varios mecanismos que llevan a
la emisión de luz según los principios de quimioluminiscencia. Los
intermediarios de vida corta se consideran parte de los procesos que
llevan a la descarboxilación y la emisión de luz. En la Figura 1 se
muestran esquemáticamente los procesos que se han postulado para los
marcadores de éster de acridinio, que resultan en la emisión de luz
o en una reacción secundaria no deseada (reacción oscura),
conduciendo a la hidrólisis del centro.
Según el mecanismo propuesto el grupo carbonilo
(que ha formado parte del enlace éster o amida) se convierte en
parte de la región dioxietanona por el ataque del H_{2}O_{2}. La
descomposición espontánea de la región dioxietanona está acompañada
por la emisión de luz y da lugar a una cetona heterocíclica y
CO_{2}, en el caso del grupo carbonilo, o en términos químicos más
generales, a un heterocumuleno en el caso de la presencia de
equivalentes funcionales del grupo carbonilo.
La Figura 1 hace patente rápidamente que las
reacciones lumínicas (RL) y los procesos oscuros (PO) son
dependientes de las propiedades del grupo saliente Z. Ligeramente
distinto a los compuestos conocidos en este campo y, como se ilustra
en la Figura 1, en un compuesto de acuerdo con la presente
invención, en lugar de un grupo saliente Z se encuentra un grupo
precursor del grupo saliente.
El término "precursor de un grupo saliente"
se utiliza para indicar que sin necesidad de una modificación
química posterior, de acuerdo con la oxidación de la presente
invención, el precursor del grupo saliente no funcionará como grupo
saliente o, al menos, será un grupo saliente bastante pobre y no se
liberará el precursor de la región emisora de luz. Sin la oxidación
del sistema aromático del precursor del grupo saliente, el enlace
amida entre el precursor de la región emisora de luz y el precursor
del grupo saliente es estable frente a la hidrólisis.
Una primera observación al denominado marcador
acridinio-9-(N-sulfonil)carboxamida
parece estructuralmente similar a los compuestos de acuerdo con la
presente invención. En la Figura 2 se muestra un ejemplo de este
tipo de marcadores. No obstante, químicamente los marcadores
acridinio-9-(N-sulfonil)carboxamida
son bastante distintos a los compuestos de acuerdo con la presente
invención. Debido al grupo -SO_{2} próximo, el átomo de nitrógeno
es, químicamente hablando, un nitrógeno electrónicamente pobre y no
forma parte de sistema redox o aromático oxidable, de lo contrario
no funcionaría como grupo saliente. Esas propiedades del átomo de
nitrógeno le vienen dadas especialmente por el grupo
N-sulfonilamida unido a él. En el caso de los
marcadores quimioluminiscentes conocidos en este campo, dichos
marcadores de
acridinio-9-(N-sulfonil)carboxamida
son una solución de compromiso entre la estabilidad del marcador
quimioluminiscente frente a la hidrólisis y la liberación rápida y
eficiente del grupo saliente para permitir sensibilidad en la
detección.
En los compuestos de acuerdo con la presente
invención se utilizan precursores del grupo saliente en lugar de un
grupo saliente. Los precursores, se caracterizan por poseer un
nitrógeno oxidable dentro de un enlace amida que, a su vez, forma
parte de un sistema aromático.
"Oxidable" significa que dicho átomo de
nitrógeno es electrónicamente rico y que los electrones pueden ser
captados fácilmente, es decir, ese nitrógeno o ese oxígeno es
entonces oxidado. Como el experto en materia podrá apreciar, un
nitrógeno o un oxígeno electrónicamente rico necesita la unión de,
al menos, uno de los denominados sustituyentes donadores (de
electrones). El sustituyente donador puede unirse directamente o
alternativamente de forma viníloga o feníloga al átomo de nitrógeno.
En ambos casos el átomo de nitrógeno forma parte de una forma
reducida de un sistema redox en dos fases
donador-pi-donador, también conocido
como sistema redox reversible en dos fases, como describió [Huenig S
Pure Appl Chem (1990) 395-406].
Se conocen bien en el campo los átomos de
nitrógeno oxidables de sistemas aromáticos apropiados. Los sistemas
aromáticos oxidables más populares son colorantes leuco, que tras su
oxidación se convierten en colorantes. En estos sistemas aromáticos
colorante/leuco-colorante el nitrógeno
electrónicamente rico se convierte en electrónicamente pobre tras la
oxidación. Dicha oxidación hace al enlace amida altamente inestable
y la forma oxidada de dicho precursor del grupo saliente funciona,
entonces, como grupo saliente de forma eficiente.
En una realización preferida el compuesto
químico de acuerdo con la presente invención es un compuesto según
la Fórmula 1.
en la
que,
R^{1} = -NR^{3}R^{4}, -OR^{5},
-SR^{6}, -NR^{7}NR^{3}R^{4},
R^{2} = H, R^{1},
(C_{1}-C_{10})alquilo,
C_{2}-C_{10} alquenilo,
C_{2}-C_{10} alquinilo,
C_{6}-C_{22} arilo, SO_{3}^{-}, -COOH,
-halógeno, nitro, benceno anillado,
R_{3} a R_{7} = H,
(C_{1}-C_{10})-alquilo,
C_{2}-C_{10} alquenilo,
C_{2}-C_{10} alquinilo,
C_{6}-C_{22} arilo;
en el que cualquier alquilo, alquenilo,
alquinilo o arilo puede sustituirse por una o más regiones
seleccionadas de un grupo que consta de -halógeno, un grupo de
acoplamiento, -OPO_{3}^{2-}, -SO_{3}^{-}, -COOR^{5},
-CO-NR^{3}R^{4}, -S-R^{6},
-NR^{3}R^{4}, -N^{+}(C_{1}-C_{6}
Alquilo)_{3}, -OR^{5}, -COR^{5},
-NH-CO-NR^{3}R^{4},
-NH-CS-NR^{3}R^{4}, y
-(CH_{2})_{n}-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-NR^{3}R^{4},
-(CH_{2})n-[O-(CH_{2})_{r}]_{s}-OR^{5},
en el que r y s son independientemente el uno del otro un número
entero de 1 a 18 y n es 0 o 1 independientemente de r y s, y en el
que PREL significa precursor de la región emisora de luz.
Preferiblemente, R^{1} es -NR^{3}R^{4} o
-OR^{5}, en el que R^{3} a R^{5} es H,
(C_{1}-C_{10})-alquilo o un
(C_{1}-C_{10})-alquilo
sustituido por un grupo de acoplamiento. El R^{1} preferido es
-N(-etilo)_{2},-O-etilo,
N(-metilo)_{2}, O-metilo o uno de esos
residuos sustituidos por el grupo de acoplamiento.
Preferiblemente, R^{2} es H o -metilo.
En una realización posterior escogida el
compuesto de acuerdo con la presente invención se representa por la
fórmula 2.
en la
que,
R_{1} y R_{1}' independientemente son
residuos como los definidos anteriormente para R^{1},
R_{2} y R_{2}' independientemente son
residuos como los definidos anteriormente para R^{2}, y
PREL es el precursor del grupo emisor de
luz.
En una realización posterior escogida, el
precursor del grupo saliente consta de los elementos estructurales
resumidos en la Fórmula 3.
en la
que,
R_{1} y R_{1}' independientemente son
residuos como los definidos anteriormente para R^{1},
R_{2} y R_{2}' independientemente son
residuos como los definidos anteriormente para R^{2}, y
PREL es el precursor del grupo emisor de luz,
y
Z representa S, O o N-R^{8},y
donde R^{8} es H,
(C_{1}-C_{10})-alquilo,
C_{2}-C_{10} aquenilo,
C_{2}-C_{10} alquinilo,
C_{6}-C_{22} arilo.
En todas las estructuras resumidas en las
Fórmulas 1-3, el átomo de nitrógeno forma parte de
sistema redox, preferiblemente de un sistema aromático oxidable. El
átomo de nitrógeno del precursor del grupo saliente forma parte de
un sistema redox de acuerdo con la presente invención. Con la
oxidación, el nitrógeno del precursor del grupo saliente se oxida
como parte de este sistema redox. El enlace amida entre el precursor
del grupo emisor de luz y el nitrógeno oxidado es muy inestable
químicamente, de modo que el precursor del grupo emisor de luz se
libera fácilmente tras la reacción con el H_{2}O_{2}.
En una realización preferida el precursor del
grupo saliente es un colorante leuco. Más preferible es que dicho
colorante leuco pueda representarse por las estructuras incluidas en
la Fórmula 3. Es preferible seleccionar los grupos salientes de los
colorantes leuco que corresponden a las clases de sustancias
químicas resorufina, oxacina y azul de metileno.
En una realización preferida el precursor de la
región emisora de luz consta de un heterociclo quimioluminogénico.
Se conocen bien en este campo ejemplos de dichos heterociclos
quimioluminogénicos y se encuentran recogidos en el artículo de
revisión de Mayer, A. y Neuenhofer, S. en "Angewandte Chem.
Intern. Ed. Engl". (1994) 1044-1072, Weinheim,
VCH Verlagsgsellschaft mbH.
Como se ha descrito anteriormente, el precursor
de la región emisora de luz se selecciona entre compuestos que
contienen un grupo carbonilo u otro grupo funcional químicamente
equivalente al cual se une el precursor del grupo saliente mediante
un enlace amida. Preferiblemente, el precursor de la región (o
grupo) emisora de luz se selecciona dentro de las siguientes
categorías de compuestos quimioluminiscentes:
4Hbenzo[e][1,3]oxacina,
4,5-dihidrotiazol, luciferina, acridano y colorantes
de acridinio. Naturalmente, el precursor de la región emisora de luz
o señal, de acuerdo con esta invención, no está limitada a dichos
colorantes sino que también incluye derivados quimioluminiscentes de
los mismos.
En los compuestos químicos que constan de un
precursor de la región emisora de luz y un precursor del grupo
saliente, donde un grupo carbonilo u otro grupo químicamente
equivalente del mencionado precursor de la región emisora de luz se
une mediante un enlace amida a un átomo de nitrógeno del precursor
del grupo saliente. El precursor del grupo saliente es,
preferiblemente, un heterociclo quimioluminogénico, que se
selecciona del grupo formado por luciferina, acridinio y
acridano.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto químico que consta de luciferina
o un análogo de la misma como precursor de la región emisora de luz
y un precursor del grupo saliente, donde el grupo carbonilo u otro
grupo químicamente equivalente de dicha luciferina se une mediante
un enlace amida a un átomo de nitrógeno del precursor del grupo
saliente, que se caracteriza, a su vez, en que se transforma en el
grupo saliente tras su oxidación.
En una realización más preferida, el compuesto
químico de acuerdo con la presente invención consta de dos
precursores de la región emisora de luz. Los PREL pueden ser
idénticos, no obstante, también es posible utilizar dos PREL
diferentes. Cada uno de los precursores de la región emisora de luz
se unen al precursor del grupo saliente a través de un enlace amida
oxidable. Es preferible que ambos enlaces entre el grupo saliente y
los precursores del grupo emisor de luz sean iguales. Sin embargo,
en situaciones especiales, p.ej., cuando se utilizan diferentes
sistemas redox, puede ser ventajosa la utilización de estructuras
que constan de dos tipos diferentes de enlace, p.ej., un enlace
éster y un enlace amida.
En compuestos que constan de dos precursores del
grupo emisor de luz, el precursor del grupo saliente se sustituye,
preferentemente, por un grupo fenol. Es aún más preferible que los
dos precursores del grupo emisor de luz se unan a dicho grupo fenol
en posición para.
En las Fórmulas 9 y 10 se muestran ejemplos de
estructuras que constan de dos precursores del grupo emisor de
luz.
\vskip1.000000\baselineskip
En las Fórmulas 9 y 10, R_{2} y R_{3}
representan residuos tal y como se han definido anteriormente y PREL
es el precursor del grupo emisor de luz.
Los compuestos de acuerdo con la presente
invención que constan de un precursor de la región emisora de luz y
de un precursor del grupo saliente representan unas moléculas
marcadoras muy atractivas para el marcaje de biomoléculas. Los
métodos utilizados para unir los marcadores con las biomoléculas han
sufrido una mejora significativa durante los últimos años. Se ofrece
una excelente visión general de dichos métodos en
"Bioconjugation" Aslam, M. y Dent, A. (1998)
216-363, Londres, McMillan Reference y en el
capítulo "Macromolecule conjugation" en "Practice and theory
of enzyme immunoassays" Tijssen (1990), Elsevier, Amsterdam.
A partir de la bibliografía citada anteriormente
(Aslam, supra), se conocen reacciones químicas de
acoplamiento apropiadas. Los compuestos químicos de acuerdo con la
presente invención se diseñan y sintetizan, preferiblemente, para
que consten de un grupo de acoplamiento que sea apropiado para la
reacción química de acoplamiento indicada para la biomolécula objeto
de estudio.
En una realización preferida, el compuesto
químico de acuerdo con la presente invención consta de un precursor
de la región emisora de luz, un precursor del grupo saliente y un
grupo de acoplamiento, donde un grupo carbonilo u otro grupo
funcional equivalente del mencionado precursor de la región emisora
de luz se une mediante un enlace amida a un átomo de nitrógeno del
precursor del grupo saliente, que se caracteriza, a su vez, en que
se transforma en el grupo saliente tras su oxidación.
Así, los compuestos químicos de acuerdo con la
presente invención también contienen, preferiblemente, un grupo de
acoplamiento que puede denominarse Y. El grupo de acoplamiento Y es
un grupo reactivo o un grupo activado que se utiliza para la unión
química del compuesto a la biomolécula. Preferiblemente, el grupo Y
es un grupo ácido carboxílico activado como un halogenuro
carboxílico, un anhídrico carboxílico, una hidrazida carboxílica,
una azida carboxílica o un éster activo como, p.ej.,
N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenilo,
pentafluorofenilo, imidazolilo o éster de
N-hidroxibenzotriazolilo, una amina, una maleimida,
un tio, un grupo para-aminobenzoil o un grupo
fotoactivable, p.ej., una azida. Aún más preferible es que el grupo
Y sea un éster de
N-hidroxi-succinimida.
El grupo de acoplamiento Y se selecciona para
que sea apropiado para la función química de la biomolécula a la
cual se unirá.
Los grupos amino de las biomoléculas (el grupo
-NH_{2} terminal, el grupo NH_{2} de la cadena lateral de la
lisina, así como, los grupos amino de los ácidos diamino
carboxílicos) pueden utilizarse para el acoplamiento químico de un
grupo marcador basado en la "química de las aminas". Buenos
ejemplos de química de las aminas son, entre otros, la reacción de
los grupos amino con los denominados grupos activados como los
ésteres-NHS, otros ésteres activados, cloruros de
ácido y azidas.
Los grupos carboxilo de las biomoléculas (el
grupo COO^{-} terminal, los grupos funcionales carboxi de los
ácidos aspártico y glutámico) se utilizan para el acoplamiento
químico basado en la "química carboxi". Buenos ejemplos de
química carboxi son, entre otros, la activación de dichos grupos
carboxi para transportar los grupos activados antes mencionados.
Así, el acoplamiento a grupos amino del marcador se realiza
fácilmente.
De manera alternativa, los grupos sulfhidrilo de
las biomoléculas (p.ej., los grupos SH libres de la cisteína, o los
grupos -SH que se obtienen de la reducción de los puentes disulfuro)
se utilizan para el acoplamiento químico basado en la "química de
los sulfuros". Buenos ejemplos de la química de los sulfuros son,
entre otros, la reacción de los grupos -SH con grupos maleimido, o
la alquilación con grupos carboxílicos
\alpha-halógeno o por tioéteres.
El grupo hidroxilo de los residuos de tirosina o
de los grupos imidazol de la histidina también pueden utilizarse
para la unión covalente de compuestos de acuerdo con la presente
invención a una biomolécula con la colaboración de, p.ej., grupos
diazonio.
El grupo de acoplamiento puede formar parte
tanto del precursor del grupo emisor de luz como del precursor del
grupo saliente. En términos generales, se acepta que las
biomoléculas de gran tamaño pueden interferir con la emisión de
luminiscencia por parte del grupo quimioluminiscente si dicho grupo
quimioluminiscente y la biomolécula se encuentran muy próximos. Por
tanto, es preferible que el grupo de acoplamiento forme parte del
precursor del grupo saliente y utilizar, preferiblemente, dicho
compuesto para el acoplamiento a la biomolécula. En este caso y tras
la oxidación del precursor del grupo saliente, el precursor de la
región emisora de luz se libera de la biomolécula y ambas moléculas
ya no se encontrarán próximas. Esta característica supone una
ventaja en ensayos para la detección de analitos en una muestra.
En general, los compuestos de acuerdo con la
invención se sintetizan mediante la reacción de una forma activada
del precursor de la región emisora de luz, preferiblemente, un
cloruro de ácido, con el precursor del grupo saliente en su forma
reducida. Las sustancias químicas apropiadas como precursores del
grupo saliente como fenoles o anilinas sustituidas se encuentran
disponibles comercialmente o se pueden sintetizar según
procedimientos estándar. Los colorantes leuco, es decir, los
precursores del grupo saliente, se pueden obtener a partir de la
reducción de colorantes disponibles comercialmente, preferiblemente
mediante la reducción del ditionito sódico. Los colorantes que ya
constan de un grupo de acoplamiento son parejas apropiadas para la
síntesis de compuestos inventivos en el caso de que los grupos de
acoplamiento deban unirse al precursor del grupo saliente. Por
ejemplo, se encuentran disponibles comercial-
mente NHS-ésteres de colorantes de oxacina (p.ej., Evoblue); o se encuentran descritos en la literatura (PE 0 510 668).
mente NHS-ésteres de colorantes de oxacina (p.ej., Evoblue); o se encuentran descritos en la literatura (PE 0 510 668).
El término "biomolécula" incluye moléculas
y sustancias de interés en los campos terapéutico y de diagnóstico.
Una biomolécula, en el sentido que se le otorga en la presente
invención, puede ser cualquier molécula producida de forma natural o
sintética compuesta de moléculas biológicas tales como aminoácidos,
nucleótidos, nucleósidos, lípidos y azúcares. Asimismo, se pueden
utilizar derivados de las mismas que no aparecen de forma natural
como aminoácidos o nucleótidos artificiales o análogos de ácidos
nucleicos como sustitutos de la biomolécula.
En una realización preferida, se selecciona la
biomolécula del grupo formado por polipéptidos, ácidos nucleicos y
fármacos de bajo peso molecular.
Un conjugado entre una biomolécula y un
compuesto químico que consta de un precursor de la región emisora de
luz y un precursor del grupo saliente con las características
descritas en la presente invención, representan una realización
especialmente preferida.
El experto en la materia apreciará rápidamente
que los conjugados entre una biomolécula y los compuestos químicos
descritos en la presente invención suponen una gran ventaja en
ensayos de unión específica para la detección de un analito en una
muestra.
En términos generales, un ensayo de unión
específica se basa en la interacción específica de dos miembros de
una pareja de unión bioafín. Son ejemplos de pares de unión
apropiados en dichas parejas de unión, haptenos o antígenos y los
anticuerpos reactivos a ellos; biotina o análogos de biotina como
amina, biotina, iminobiotina o destiobiotina que se unen a la
biotina o la estreptavidina; azúcares y ácido nucleico de la lectina
o análogos de ácidos nucleicos y sus ácidos nucleicos
complementarios; receptor y ligando, por ejemplo, el receptor de
hormonas esteroideas y la hormona esteroidea, y enzimas y sus
sustratos.
La interacción específica entre los ácidos
nucleicos (o los análogos de ácidos nucleicos) y sus ácidos
nucleicos complementarios en ensayos basados en la detección de la
hibridación entre hebras de ácidos nucleicos y la interacción
específica entre anticuerpos y sus correspondientes antígenos en los
que se basan un amplio abanico de inmunoensayos, representan la
alternativa de mayor preferencia entre las parejas de unión.
La teoría y la práctica de los ensayos de
hibridación de ácidos nucleicos se resumen en libros de texto
relevantes como C. Kessler, "Non-radioactive
Labeling and detection of biomolecules", Springer Verlag, Berlín
Heidelberg (1992). El experto en la materia encontrará todos los
detalles relevantes en el mismo.
Actualmente, los inmunoensayos se utilizan
ampliamente y son de conocimiento general para el experto en la
materia. Los métodos y procedimientos relevantes se encuentran
recogidos en libros de texto relacionados, como
"Bioconjugation" Aslam, M. y Dent, A. (1998)
216-363, Londres, McMillan Reference y "Practice
and theory of enzyme immunoassays" Tijssen (1990), Amsterdam,
Elsevier. También se puede encontrar una revisión exhaustiva en el
artículo de Mayer, A. y Neuenhofer, S. "Angewandte Chem. lntern.
Ed. Engl". (1994) 1063-1068, Weinheim, VCH
Verlagsgesellschaft mbH.
Los compuestos químicos aquí descritos tienen la
característica sorprendente de que el enlace éster o amida entre el
precursor de la región emisora de luz y el precursor del grupo
saliente se vuelve inestable tras la oxidación del precursor del
grupo saliente. De ese modo, la generación de luz, es decir, la
quimioluminiscencia es dependiente de la presencia de oxidantes y
peróxido. Por tanto, es evidente que los compuestos químicos
descritos pueden utilizarse tanto en ensayos para la detección de
peróxido así como para la detección de peroxidasa.
En una realización preferida, los compuestos de
acuerdo con la presente invención se utilizan en un método para la
detección de peróxido.
La peroxidasa puede utilizarse para oxidar el
precursor del grupo saliente, el que tras su oxidación funciona como
grupo saliente. Bajo las condiciones apropiadas de ensayo, la
presencia de peroxidasa puede detectarse mediante la medición de la
luz quimioluminiscente emitida. En una realización preferida, los
compuestos químicos de acuerdo con la siguiente invención se
utilizan en un método de detección basado en la acitividad de la
peroxidasa. Es más preferible la utilización de los compuestos
novedosos para la deteccción de peroxidasa.
En una realización más preferida, la presente
invención se refiere a un método para llevar a cabo la medición de
luminiscencia basada en la utilización de un compuesto de acuerdo
con la presente invención. El método se caracteriza por la presencia
de peróxido que oxida al precursor del grupo saliente, entonces el
precursor del grupo emisor de luz se activa, se emite energía y se
mide.
Los compuestos químicos de acuerdo con la
presente invención no constan de grupos salientes activos. El
precursor del grupo saliente debe ser oxidado y su forma oxidada
actúa como grupo saliente. La oxidación se refiere a la fase
oxidativa que transforma al precursor del grupo saliente en el grupo
saliente. En el caso de grupos salientes
donador-pi-donador esto significa
que los procesos redox ocurren según el tipo Wurster o Weitz
(Huenig, supra).
Se encuentran disponibles diversos mecanismos
para oxidar el sistema aromático del precursor del grupo saliente.
Se seleccionan los oxidantes apropiados dependiendo de la
oxidabilidad del precursor del grupo saliente, por un lado, y del
modo de aplicación, por otro.
En un modo escogido de llevar a cabo un método
de acuerdo a la presente invención, la oxidación se realiza
utilizando peroxidasa.
Asimismo, se prefiere la utilización de
oxidantes químicos apropiados. Para el proceso de medición de
acuerdo con la presente invención, las condiciones para la oxidación
química deben escogerse de modo que garanticen que no se produzca la
destrucción de la molécula emisora de luz (p.ej., que no tenga lugar
la rotura del enlace C-C). Entre los oxidantes
químicos tradicionales se encuentran los siguientes: perborato,
persulfato, DDQ (diciano dicloro quinona), H_{2}O_{2},
BrO_{4}, HNO_{3} diluido, o nitrato (IV) de ceramonio.
En una realización más preferida, la oxidación
se lleva a cabo electroquímicamente.
El precursor de la región emisora de luz se
libera fácilmente tras la oxidación del precursor del grupo
saliente. Con la acción del peróxido o de especies reactivas de
oxígeno como el radical anión superóxido, el precursor de la región
emisora de luz, de acuerdo con el mecanismo ilustrado en la Figura
1, forma con mayor probabilidad un intermediario dioxietano que se
descarboxila para generar un emisor electrónicamente excitado. La
transición al estado fundamental de este emisor ocurre por la
emisión de un fotón (= quimioluminiscencia). La energía (luz), que
se emite de ese modo, se mide mediante procedimientos estándar y con
el equipamiento habitual.
Como se indica, debe estar presente el
H_{2}O_{2} o una especie reactiva del oxígeno como el radical
anión superóxido para la formación del intermediario dioxetanona. El
H_{2}O_{2} se puede añadir directamente o se puede generar
indirectamente, p.ej., mediante la reacción enzimática (glucosa
oxidasa/glucosa). Las especies reactivas de oxígeno se generan
durante la reacción quimioluminiscente a partir del oxígeno o del
H_{2}O_{2}. Como alternativa, se puede generar de forma
intencionada una especie reactiva del oxígeno, p.ej., con el
acoplamiento C-C iniciado por el oxígeno
(indoxilfosfato, US 5 589 328).
Como ya se ha comentado anteriormente, el
precursor del grupo emisor de luz se oxida durante la reacción de
generación de luz, p.ej. el acridano se oxida a acridinio.
Naturalmente, las condiciones de oxidación se deben escoger de
manera que no se produzca la destrucción de la molécula emisora de
luz.
Preferiblemente, el reactivo utilizado para la
oxidación del PREL es el mismo que el utilizado para transformar el
precursor del grupo saliente en el grupo saliente. Es preferible
llevar a cabo la oxidación y la generación de luz mediante la
utilización de H_{2}O_{2} en presencia de peroxidasa.
Las fases de oxidación mencionadas, p.ej., las
catalizadas por enzimas como la POD, se pueden acelerar mediante la
utilización de mediadores o potenciadores.
Los mediadores son compuestos
redox-activos que facilitan la oxidación de un
compuesto mediante la aceleración de los procesos de transferencia
de electrones. El mediador es oxidado por el oxidante y oxida, así,
a los compuestos de acuerdo con la invención, mientras que el
mediador se reduce de nuevo. Los mediadores habituales son
hexocianoferrato (II) y complejos metálicos como el ferroceno. Entre
otros potenciadores que se utilizan en las reacciones de
quimioluminiscencia se encuentras los compuestos químicos como el
yodofenol o el ácido fenil borónico.
La oxidación se lleva a cabo preferiblemente en
presencia de un detergente apropiado que crea un microambiente
hidrófobo alrededor de la cetona heterocíclica emisora de luz. Este
hecho da lugar a un incremento en el redimiento cuántico
quimioluminiscente dado que se reduce el apantallamiento debida a la
interacción con las moléculas de agua. Adicionalmente, se puede unir
covalentemente un fluoróforo apropiado, como la fluoresceína, al
detergente, o alternativamente se puede añadir un fluoróforo a la
mezcla de reacción con el objetivo de tener una transferencia de
energía de la cetona heterocíclica excitada a dicho fluoróforo.
Representa una característica interesante
adicional de los compuestos descritos en la presente invención, el
hecho de que se pueden generar cinéticas de reacción bastante
distintas y se pueden seleccionar los compuestos en función de lo
que se necesite. Este hecho resulta evidente cuando se comparan las
cinéticas de emisión mostradas en las Figuras 3 y 5. Mientras que
una cinética de reacción del tipo incandescente (glow) (reacción
lenta pero de larga duración) es la preferida en aplicaciones como
las técnicas de transferencia, las reacciones de tipo flash (rápidas
pero con picos de elevada intensidad) se prefieren en sistemas de
ensayo de fase líquida como en los inmunoensayos.
Se proporcionan los siguientes ejemplos,
referencias y figuras para ayudar a la comprensión de la presente
invención, cuyo auténtico ámbito de aplicación se expone en las
reivindicaciones anexadas.
Se representan ambas vías posibles. La reacción
de generación de luz, o reacción lumínica (RL) da lugar a la
quimioluminiscencia; mientras que la vía de la reacción oscura, o
proceso oscuro (PO) da lugar a la hidrólisis directa sin
acompañamiento de emisión de luz.
Se representa el marcador
9-[aril]-[4-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil-alquil)-bencenosulfonil]-aminocarbonil)-1-O-metilacridinio;
o trifluorometano sulfato, como se conoce en el campo, para ilustrar
una diferencia fundamental cuando se compara con los compuestos de
acuerdo con la presente invención. El átomo de nitrógeno del enlace
amida es electrónicamente pobre y, por tanto, el enlace amida no es
oxidable en condiciones medias o moderadas. El grupo saliente
sulfonil éster de este compuesto innovador supone una solución de
compromiso entre la estabilidad frente a la hidrólisis y su rápida
liberación bajo las condiciones de medida.
Se representa esta emisión de luz (unidades de
luminiscencia relativa, ULR) con relación al tiempo de medida. La
medición se ha llevado a cabo mediante la adición de soluciones
activadoras apropiadas como se describe en el Ejemplo 2.
Se muestra esquemáticamente las vías químicas de
síntesis para obtener
(3,7-bis-dietilaminofenoxazina-10-il)-[4,5-dihidro-2-(6-hidroxi-45
benzotiazol-2-il)tiazol-4-il]-metanona
(compuesto 7 en la Figura 4). Otros compuestos mostrados en esta
Figura son: 1 = D-luciferina; 2 =
2-(6-terc-butildimetilsililoxibenzotiazol-2-il)-4,5-dihidro
thiazol-4-il carboxilato de
terc-butil dimetilsililo; 3 = cloruro del ácido
2-(6-terc.-butildimetilsililoxi-benzotiazol-2-il)-4,5-dihidro-tiazol-4-il
carboxílico; 4 = oxacina
(3,7-bis-dietilamino-fenoxazinilio);
5 = leuco-oxacina
(N,N,N',N'-tetraetil-l0H-fenoxacina-3,7-diamina);
6 =
(3,7-bis-dietilaminofenoxacina-10-il)-(4,5-dihidro-2-(6-terc.-butil
50
dimetilsililoxi-benzotiazol-2-il)-tiazol-4-il)-metanona.
La medición se ha llevado a cabo como se
describe en el Ejemplo 2.
Se muestran esquemáticamente las rutas químicas
para la síntesis de
(3,7-bis-dietilaminofenoxacin-10-il)-[4,5-dihidro-2-(6-hidroxibenzotiazol-2-il)-5,5-dimetiltiazol-4-il]-metanona
(Estructura 8 de la Figura 6). Otros compuestos mostrados en esta
Figura son: 1 =
2-ciano-6-hidroxi-benzotiazol;
2 = penicilamina; 3 = dimetil luciferina; 4 =
2-(6-terc-butildimetilsililoxibenzotiazol-2-il)-5,5-dimetil-4,5-dihidro
tiazol-4-il carboxilato de
terc-butil dimetilsililo; 5 = cloruro de ácido
2-(6-terc-butildimetilsililoxibenzotiazol-2-il)-5,5-dimetil-4,5-dihidro
tiazol-4-il carboxílico; 6 =
oxacina-(3,7-bis-dietilaminofenoxazinilio);
7 = leuco-oxacina
(N,N,N',N'-tetraetil-10H-fenoxacina-3,7-diamina).
Se muestran las rutas químicas para la síntesis
de
2,5-dimetil-4-hidroxifenilamida
del ácido
[4,5-dihidro-2-(6-hidroxibenzotiazol-2-il)-5,5-dimetiltiazol-4-il]-carboxílico
(4 de la Fig. 7). Otros compuestos mostrados son: cloruro de ácido
2-(6-terc-butildimetilsililoxi-benzotiazol-2-il)-4,5-dihidro-5,5-dimetiltiazol-4-il
carboxílico
1,4-amino-2,5-dimetilfenol
2 y
2,5-dimetil-4-hidrofenilamida
del ácido
2-(6-terc-butildimetil-sililoxibenzotiazol-2-il)-4,5-dihidro-5,5-dimetiltiazol-4-il-carboxílico
3.
Se evaporaron 600 mg de hidrato de ácido
9-acridincarboxílico (núm. Catálogo de Aldrich
24.634-4) a 3 mbar/60ºC durante 3 h. Se mezcló el
residuo seco con 5,0 ml de cloruro de tionilo y se dejó a reflujo
durante 3 h. El cloruro de tionilo se eliminó mediante destilación.
Se utilizó el cloruro de ácido carboxílico restante (aproximadamente
570 mg) sin purificación posterior.
En atmósfera de argón, se disolvieron 500 mg de
perclorato de oxacina (Kodak 11885) en 80 ml de agua saturada de
argón desgasificada. Se añadió ditionito sódico (Merck 6507) hasta
que la solución se decoloró. Entonces, se añadió una solución de 570
mg de cloruro de ácido 9-acridincarboxílico. La
mezcla se agitó con vigor durante 30 min. Se añadieron 100 ml de
agua destilada y 100 ml de cloruro de metileno. La mezcla se
traspasó a un embudo de decantación. Se separó la fase orgánica y se
lavó dos veces con agua. Después de secarla con sulfato sódico y
filtración, se evaporó el disolvente. El residuo se disolvió en una
mezcla hexano/acetato de etilo 6:4 (en una relación 6:4) y se
purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (Merck
1.09385.9025): longitud, 30 cm; altura, 50 cm; diámetro, 2,5 cm;
eluyente, hexano/acetato de etilo 6:4. El eluato se dividió en
fracciones de 20 ml. Las fracciones se analizaron por CCF
(cromatografía en capa fina) (Gel de sílice 60 F254 Merck 1,05735;
hexano/acetato de etilo 6:4). Se escogieron las fracciones que
contenían el producto deseado (en este experimento el producto tiene
un valor Rf de 0,45). Se eliminó el disolvente por evaporación.
Rendimiento: 314 mg.
En atmósfera de argón, se añadieron 67 \mul
(0,59 mmol) de ácido trifluorometansulfónico a una solución de 314
mg (0,59 mmol) de
(3,7-bis-dietilaminofenoxacina-10-il)-acridinio-9-il-metanona
en 50 ml de cloruro de metileno seco. La mezcla se agitó durante 16
h a temperatura ambiente. Se añadieron 200 ml de éter de petróleo
que provoca la precipitación del producto deseado. El precipitado se
filtró mediante filtración al vacío y se lavó con éter de petróleo.
Los cristales ligeramente verdosos se disolvieron en agua y se
filtraron utilizando una jeringa y un filtro (0,45 \mum Minisart
RC 15 Sartorius 17762). El filtrado se liofilizó. El producto
liofilizado se disolvió en acetato de etilo y se analizó por CCF
(cromatografía en capa fina) (Gel de sílice 60 F254 Merck 1,05735;
hexano/acetato de etilo 6:4). El producto presentaba un valor Rf de
0,41. Se confirmó la identidad de la oxacina de acridinio
(3,7-bis-dietilamino-fenoxacina-10-il)-N-metil
acridinio-9-il-metanona)
(M+ = 545,36) mediante MALDI TOF-MS (espectrometría
de masas mediante ionización-desorción por láser
asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo) en
modo positivo.
Las mediciones se llevaron a cabo en un Berthold
Lumat LB953. Se han utilizado dos soluciones activadoras para
producir quimioluminiscencia. La solución activadora 1 permite la
oxidación del precursor del grupo saliente, y la solución activadora
2 promueve la reacción quimioluminiscente.
Solución activadora 1: 300 \mul, 0,5%
H_{2}O_{2}, 0,1 M HNO_{3}
Solución activadora 2: 300 \mul, 0,25 M
NaOH
De acuerdo con el ejemplo 1, la
acridinio-oxacina se diluyó hasta 1x10^{-8} Mol/l
en una solución amortiguadora PBS que contenía 0,1% de Thesit. Se
dispensaron 100 \mul de muestra en un tubo de 5 ml de Sarstedt y
se colocó en el instrumento. La solución activadora 1 se añadió en
la posición -1, y la solución activadora 2 en la posición de medida
del instrumento. La medición se realizó durante 10 s.
La cinética de la emisión de luz para este
compuesto bajo las condiciones especificadas anteriormente se
muestra en la Figura 3.
Se realizaron diluciones seriadas de la
acridinio-oxacina en una solución amortiguadora PBS
que contenía 0,1% de Thesit. Se midió cada muestra tal y como se ha
descrito anteriormente, excepto por el tiempo de medida que fue de
solo 2 s. La señal más pequeña todavía significativamente diferente
al blanco se consideró como el límite de detección.
Límite de detección inferior: 1x10^{-11}
Mol/l.
A partir del máximo de señal y de la cantidad de
colorante utilizado se calculó que el rendimiento cuántico para este
experimento fue de 1,34x10e16ULR/Mol.
Se disuelven 700 mg (2,5 mmmol) de
D-luciferina (Sigma, núm. L 9504) en 50 ml de
tetrahidrofurano bajo atomósfera de argón. Se añaden 830 mg (5,5
mmol) de cloruro de tert.-butildimetilsililo (Aldrich, núm
19,050-0) y posteriormente 1,37 ml (10 mmol) de
trietilamina a temperatura ambiente. Tras unos pocos minutos se
forma un precipitado blanco de cloruro amónico. La solución se deja
en agitación durante toda la noche y en atmósfera de argón y,
entonces, el precipitado se elimina por filtración y el disolvente
se evapora en un rotavapor (temperatura del baño a 40ºC).
El residuo se disuelve en 15 ml de cloruro de
metileno, la solución transparente se enfría hasta -15ºC y, en
atmósfera de argón y agitando vigorosamente, se añade lentamente, en
un periodo de unos pocos minutos, una mezcla de 0,325 ml (3,75 mmol)
de cloruro oxalilo y 10 gotas de dimetil formamida recién destilada.
Se puede observar una ligera emisión de gas durante esa fase. La
mezcla de reacción se agita durante 15 min más a -15ºC y, entonces,
se añaden 85 ml de cloruro de metileno recién destilado.
La solución transparente resultante de cloruro
de ácido (3 de la Figura 4) se utiliza para la reacción posterior
sin más purificación.
Se disuelven 0,53 g (1,25 mmol) de perclorato de
oxacina (Aldrich, núm. 37.009-6) en 100 de agua
destilada y saturada con argón. Bajo un flujo constante de argón, se
añaden 1,5 g de ditionito sódico a la solución azul oscuro y el
recipiente de reacción se cierra de nuevo. Tras algunos minutos, la
solución pasa de ser incolora a tener una coloración ligeramente
amarillenta y se forma un precipitado azul de oxacina reducida
(compuesto 5 de la Figura 4).
La solución orgánica de cloruro de ácido (3 de
la Figura 4) se añade a la suspensión y la mezcla resultante se
agita vigorosamente bajo atmósfera de argón. Tras varios minutos, el
precipitado azul desaparece y la mezcla ligeramente amarillante se
vuelve turbia. El recipiente de reacción se recubre con papel de
aluminio y se deja en atmósfera de argón durante 3 h más. Entonces,
la emulsión se transfiere a un embudo de decantación y se recoge la
fase del cloruro de metileno. Se realizan extracciones de la fase
acuosa con 100 ml de cloruro de metileno y las fracciones orgánicas
combinadas son finalmente evaporadas (temperatura del baño 40ºC). El
crudo restante (1,58 g de un aceite azul) se añade a 5 ml de
tetrahidrofurano y se aplica en una columna de gel de sílice
(Kieselgel 60 de Merck, 3 x 20 cm). El producto se eluye con éter de
petróleo/acetato de etilo 4:1 (v/v), se recogieron y reservaron las
fracciones apropiadas. Se elimina el disolvente y se obtienen
aproximadamente 760 mg de producto enriquecido que se vuelve a
cromatografiar en el mismo sistema.
Finalmente, quedan 140 mg (16%) del conjugado 6
sililado como un aceite amarillo-marronoso.
CCF (Kieselgel 60 F254, éter de petróleo/acetato
de etilo 4:1): Rf 0,35
Se disuelven 140 mg (0,2 mmol) del conjugado
sililado (6 en la Figura 4) en 12 ml de tetrahidrofurano recién
destilado. Se satura la solución con argón y se añaden 104,6 mg (0,4
mmol) de tetrabutilamoniofluoruro monohidrato (Aldrich
núm.24.151-2). Tras agitar durante 1 h en atmósfera
de argón y a temperatura ambiente, se añaden 20 ml de cloruro de
metileno. La mezcla se lava con 20 ml de una solución de cloruro
amónico al 5% y, posteriormente, 20 ml de una solución saturada de
bicarbonato. Se seca la fase orgánica con sulfato sódico y se
evapora. El residuo de elevada viscosidad se disuelve en un volúmen
pequeño de cloruro de metileno y se aplica a una columna de gel de
sílice (Kieselgel H 60, 1,5 x 35 cm). La separación del producto
deseado del tiazol formado al mismo tiempo (8 de la Figura 4)
(ligeramente retrasado) se realiza con éter de petróleo/acetato de
etilo 1:1 (v/v). Las fracciones que contienen el producto se reunen
y evaporan. El conjugado puro (7 de la Figura 4) queda como un
aceite viscoso y casi incoloro tras a su secado a baja presión.
TLC (Kieselgel 60 F254, éter de petróleo/acetato
de etilo 1:1): Rf 0,60
La medición de la luminiscencia se realiza tal y
como se ha descrito en el Ejemplo 2.
En atmósfera de argón, se disolvieron 704 mg (4
mmol) de
2-ciano-6-hidroxibenzotiazol
1 (preparado de acuerdo con PE 0024525), 596 mg (4 mmol) de
D-penicilamina 2 (Aldrich, núm
P40-3) y 276 mg (2 mmol) de carbonato potásico en 6
ml de metanol y 3,2 ml de agua destilada. Mientras se agita la
mezcla se le aplica un reflujo durante 3 h para obtener un líquido
amarillo pálido.
Mediante un rotavapor, se eliminan los
disolventes a presión baja (temperatura del agua del baño 40ºC). La
suspensión amarillo-marronosa resultante se añadió a
100 ml de agua destilada y se ajustó el pH a 2 con ácido clorhídrico
concentrado. El producto deseado precipita y se extrae por
filtración con un embudo de vidrio sinterizado. El residuo se
enjuaga con un pequeño volumen de metanol y se deja caer en un
frasco. Posteriormente, se elimina el metanol con un rotavapor a
baja presión (temperatura del baño de agua 40ºC) para obtener un
sólido amarillo.
TLC (Kieselgel 60 F254, metanol/cloroformo 1:1):
Rf = 0,81
Bajo atmósfera de argón, se disuelven 385 mg
(1,25 mmol) de dimetil-D-luciferin 3
en 50 ml de tetrahidrofurano seco. Se añaden 41,5 mg (2,75 mmol) de
cloruro de terc.-butildimetilsililo (Aldrich, núm.
19.050-0) y, posteriormente, 0,506 ml (5,0 mmol) de
trietilamina a temperatura ambiente. Tras unos pocos minutos se
forma un precipitado blanco de cloruro amónico. La solución se agita
en atmósfera de argón durante toda la noche y, entonces, el
precipitado se filtra y el disolvente se elimina en un rotavapor
(temperatura del agua del baño 40ºC) para obtener
2-(6-terc-butildimetilsililoxibenzotiazol-2-il)-5,5-dimetil-4,5-dihidro
tiazol-4-il carboxilato de
terc.-butil dimetilsililo (estructura 4 de la Figura 6) como un
aceite ligeramente amarillo-marronoso.
Bajo atmósfera de argón, se disuelve el ácido
2-(6-terc.-butildimetilsililoxibenzotiazol-2-il)-4,5-dihidro-5,5-dimetil-4-tiazol
carboxílico en 8 ml de cloruro de metileno seco, la solución
transparente se enfría a -15ºC y una mezcla de 0,162 ml (1,875 mmol)
de cloruro de oxalilo y 500 \mul de dimetil formamida recién
destilada se añade gota a gota a la reacción en agitación vigorosa.
Durante esta fase se puede observar una ligera emisión de luz. La
mezcla de reacción se agita durante 30 minutos más a -15ºC y,
posteriormente, se diluye en cloruro de metileno recién destilado
hasta llegar a un volumen final de 30 ml.
\newpage
La solución transparente resultante de cloruro
de ácido
(6-terc.-butildimetilsililoxibenzotiazol-2-il)-4,5-dihidro-5,5-dimetil-4-tiazol
carboxílico (estructura 5 de la Figura 6) se utiliza en la siguiente
fase sin realizar ninguna purificación posterior.
Se disuelven 265 mg (0,625 mmol) de perclorato
de oxacina (estructura 6 de la Figura 6) (Aldrich, núm.
37.009-6) en 50 ml de agua destilada y saturada con
argón. Bajo un flujo constante de argón, se añaden 30 ml de piridina
y 30 ml de cloruro de metileno. Se añaden 0,75 g adicionales de
ditionito sódico y el recipiente de reacción se cierra de nuevo.
Tras unos pocos minutos, la mezcla de reacción formada en dos fases
se vuelve incolora.
Mientras tanto, la solución de cloruro de ácido
se coloca en un segundo recipiente bajo atmósfera de argón.
La fase orgánica que contiene la
leuco-oxacina (estructura 7 de la Figura 6) se
transfiere al segundo recipiente a través de un tubo de goma fino
(equipamiento HPLC estándar) utilizando una elevada presión de
argón. La mezcla de reacción resultante se agita durante toda la
noche a temperatura ambiente para dar lugar a una solución
azul-verdosa.
Tras eliminar el disolvente, el crudo resultante
se extrae con 5 ml de tetrahidrofurano y se aplica a una columna de
gel de sílice (gel de sílice 60 de Merck, 4,5 x 25 cm). El producto
se eluye con éter de petróleo/acetato de etilo 1:1 (v/v), las
fracciones apropiadas se recogen y reúnen. Se elimina el disolvente
y se obtienen aproximadamente 52 mg de producto enriquecido en forma
de un sólido cristalino azul-verdoso.
El producto se disuelve en 8 ml de
acetonitrilo/acetato de etilo 1:1 (v/v) y se purifica mediante HPLC
preparativa de fase inversa (Waters Delta Pak columna
C-18, 100 A, 15 \mum, 50 x 300 mm). El producto se
eluye con un gradiente de acetonitrilo/agua destilada
(0-60% acetonitrilo; 0,1% ácido trifluoroacético).
Se recogen y reúnen las fracciones apropiadas. Finalmente, se
elimina el disolvente por liofilización para obtener 1,8 mg de un
producto ligeramente verdoso (8 en la Figura 6).
TLC (Kieselgel 60 F254, éter de petróleo/acetato
de etilo 1:1): Rf = 0,44
La solución marrón-rojizo del
cloruro de ácido
dimetil-D-luciferina del ejemplo 4b)
(1 en la Figura 7) se tritura con 412 mg (3 mmol) de
4-amino-2,5-dimetilfenol
(2 de la Figura 7)(Aldrich, núm. 12.649-7) en 10 ml
de piridina/dimetilformamida seca 1:1 (v/v) a -15ºC. Se deja que la
mezcla de reacción alcance temperatura ambiente y se agita durante 2
horas más. Se evapora el disolvente y, el aceite marronoso
resultante se seca a temperatura ambiente con bomba de vacío de
aceite. Se obtienen aproximadamente 760 mg de crudo que se purifica
mediante HPLC preparativa (Waters Delta-Pak
C-18; 100 A; 50x300 mm; 20 15 m; eluyente A: 60%
H_{2}O/40% acetonitrilo + 0,1% TFA; eluyente B: 100% acetonitrilo
+ 0,1% TFA; 0 ->100% B en 150 min). Las fracciones apropiadas se
reúnen y liofilizan. Se obtienen 95 mg de un polvo incoloro.
TLC (Kieselgel 60 F254, éter de petróleo/acetato
de etilo 1:1 v/v): Rf = 0,93
Se disuelven 30 mg de una anilida
O-protegida (3 de la Figura 7) en 3 ml de THF seco y
26,15 mg (0,1 mmol) de fluoruro de tetrabutilamonio monohidrato
(TBAF; Aldrich, núm. 24.151-2) en un 1 ml de THF que
se añaden a la solución anaranjada transparente mientras se agita
bajo atmósfera de argón. El color cambia a rojo oscuro y tras 10
min, se añaden 20 ml de diclorometano. La mezcla de reacción se lava
con 2 x 10 ml cloruro amónico 5% y 2 x bicarbonato saturado. La
solución orgánica se seca con sulfato sódico anhidro y,
posteriormente, el disolvente se elimina con un rotavapor.
El producto se aisla de la mezcla marrón oscuro
mediante HPLC preparativa (Waters Delta-Pak
C-18; 100 A; 50x300 mm; 15 \mum; eluyente A: 80%
H_{2}O/20% acetonitrilo + 0,1% TFA; eluyente B: 100% acetonitrilo
+ 0,1% TFA; 0 -> 80% B en 80 min).
Las fracciones que contienen el producto puro (4
en la Figura 7) se reúnen y liofilizan dando lugar a 1,95 mg de un
polvo anaranjado.
TLC (Kieselgel 60 F254, éter de petróleo/acetato
de etilo 1:1 v/v): Rf = 0,55
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WO 97/33884
WO 01/09372
Claims (10)
1. Compuestos químicos que constan de un
precursor de la región emisora de luz y un precursor del grupo
saliente, en el que un grupo carbonilo u otro grupo funcional
equivalente de dicho precursor de la región emisora de luz se une
mediante un enlace amida a un átomo de nitrógeno del precursor del
grupo saliente, que se caracteriza, a su vez, en que dicho
átomo de nitrógeno del precursor del grupo saliente forma parte de
una forma reducida de un sistema redox
donador-pi-donador en dos fases
también denominado sistema redox reversible en dos fases, en el que
tras la oxidación el precursor del grupo saliente se transforma en
el grupo saliente.
2. El compuesto químico de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado además en que dicho precursor
del grupo saliente se selecciona entre el grupo de
leuco-resorufina, leuco-oxacina y
4-hidroxi-anilina.
3. Los compuestos químicos de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizados
además por la presencia de un precursor de la región emisora de luz
que consta de un heterociclo quimioluminogénico de los grupos
luciferina, acridinio y acridano.
4. El compuestos químico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, cuyo precursor de la
región emisora de luz se caracteriza además por ser la
luciferina.
5. Los compuestos químicos de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, que se
caracterizan además por la presencia de un grupo de
acoplamiento que forma parte del precursor del grupo saliente.
6. Un conjugado que comprende una biomolécula y
de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de
1 a 5.
7. La utilización de un conjugado de acuerdo con
la reivindicación 6 en un ensayo de unión específica para la
detección de un analito en una muestra.
8. La utilización in vitro de un
compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5
o de un conjugado de acuerdo con la reivindicación 6 para la
detección de peróxido.
9. La utilización in vitro de un
compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5
o de un conjugado de acuerdo con la reivindicación 6 para la
detección de peroxidasa.
10. Un método para llevar a cabo la medición de
luminiscencia utilizando un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones de 1 a 5 o un conjugado de acuerdo con la
reivindicación 6, que se caracteriza porque en presencia de
peróxido,
a) el precursor del grupo saliente se oxida,
b) el grupo emisor de la señal se libera,
c) se produce la emisión de luz y
d) la luz emitida en el paso c) se mide.
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