ES2265997T3 - Procedimiento para la preparacion de interleucina-8 y muteinas de interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar antagonistas de receptores de il-8. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de interleucina-8 y muteinas de interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar antagonistas de receptores de il-8. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de IL-8 Y13H en preparaciones de detección sistemática para encontrar antagonistas de IL-8 de bajo y alto peso molecular de los receptores CXCR1 y CXCR2 de IL- 8.
Description
Procedimiento para la preparación de
interleucina-8 y muteínas de
interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar
antagonistas de receptores de IL-8.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación de interleucina-8
(IL-8) y muteínas de interleucina-8
recombinantes y a su uso para encontrar antagonistas de
IL-8 para los receptores CXCR1 y CXCR2 de
IL-8. Especialmente, se describe un procedimiento
para la preparación de IL-8 Y13H,
IL-8 TVR e IL-8 DLQ.
La familia de las quimiocinas abarca citocinas
quimiotácticas para leucocitos con un peso molecular de 8 a 10 kDa.
La estructura tridimensional de muchas quimiocinas es conocida. Las
quimiocinas contienen dos puentes disulfuro. Debido a un motivo
C-X-C o C-C
conservado en la terminación N, se diferencian las subfamilias de
quimiocinas CXC o CC (Baggiolini y col., Advances in
Immunology, 55, 97-179, 1993). Entre las
quimiocinas CXC se cuentan, entre otras,
interleucina-8, proteína 10 inducible por interferón
\gamma (IP-10), factor de plaquetas 4 (PF4), GRO
(oncogén relacionado con el crecimiento); \alpha, \beta,
\gamma-monocinas inducidas mediante interferón
gamma (MIG) y la proteína 78 activadora de neutrófilos epiteliales
(ENA-78).
Además del efecto inflamatorio agudo sobre
granulocitos neutrófilos, se han descrito también para quimiocinas
CXC individuales efectos angiogénicos y angiostáticos. Las
IP-10 y PF4 recombinantes humanas se cuentan entre
las quimiocinas CXC con efecto angiostático. Estas quimiocinas
carecen de una secuencia característica
Glu-Leu-Arg (motivo ELR) en el
extremo N-terminal de la proteína. La
interleucina-8 se cuenta entre las quimiocinas CXC
con motivo ELR que inducen efectos angiogénicos. Las muteínas de
interleucina-8 humanas en las que el motivo ELR
(Glu-Leu-Arg) se sustituye por los
aminoácidos Thr-Val-Arg (TVR) o
Asp-Leu-Asn (DLQ), se caracterizan
por un efecto angiostático (Strieter y col., J. Biol. Chem.
270, 27348-27357, 1995 y Strieter y col., patente de
Estados Unidos 5.871.723).
Schraufstatter Ingrid U. y col. describen en
"The role of Tyr-13 and Lys-15 of
interleukin-8 in the high affinity interaction with
the interleukin-8 receptor type A" (Journal of
Biological Chemistry, vol. 270, nº 18, 1995, páginas
10428-10431, XP002166109, ISSN:
00221-9258) muteínas de
interleucina-8 y su interacción con el receptor de
IL-8. Esta cita no contiene información sobre el uso
de muteínas de IL-8 más débilmente afines en
comparación con IL-8 natural en la detección
sistemática de preparaciones para encontrar antagonistas de bajo y
alto peso molecular de los receptores CXCR1 y CXCR2 de
IL-8.
La preparación recombinante de las muteínas de
interleucina-8 se realizó mediante la expresión de
una fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), la purificación
mediante una matriz de amilosa (New England Biolabs), la escisión
proteolítica de la proteína de fusión y la posterior purificación
fina de la muteína deseada (Strieter y col., J. Biol. Chem.
270, 27348-27357, 1995). Con este procedimiento no
es posible una producción de interleucina-8 y
muteínas de interleucina-8 a escala industrial.
Sorprendentemente, se ha encontrado que es
posible una expresión de interleucina-8 y muteínas
de interleucina-8 con secuencia
N-terminal correcta en vectores de secreción de
levadura con secuencia líder MF\alpha1. La IL-8
así preparada y las muteínas así preparadas se obtienen con mayor
pureza y libres de endotoxinas. Las muteínas TVR y DLQ de
interleucina-8 preparadas son adecuadas para el
tratamiento de enfermedades cancerosas. La muteína Y13H de
interleucina-8 es además adecuada para la
identificación de antagonistas de interleucina-8 de
bajo peso molecular en los receptores CXCR1 y CXCR2.
A continuación, se citan los procedimientos
usados en el transcurso de la clonación, fermentación, purificación
y caracterización bioquímica de las muteínas de
interleucina-8 recombinantes.
Las enzimas usadas (endonucleasas de
restricción, fosfatasa alcalina intestinal bovina y ADN ligasa T4)
se adquirieron en las compañías Boehringer Mannheim y GIBCO/BRL y se
usan según las instrucciones del fabricante.
Se llevaron a cabo los trabajos de clonación
rutinarios como, por ejemplo, el aislamiento de ADN de plásmido a
partir de E. coli (denominado miniprep) y la transformación
de E. coli con ADN de plásmido, según Sambrook y col.
("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, 1989). Como organismo
huésped para transformaciones, se usó la cepa DH5\alpha de E.
coli (GIBCO-BRL). Para el aislamiento de
cantidades mayores de ADN de plásmido, se usaron
Qiagen-Tip (Qiagen). La extracción de fragmentos de
ADN a partir de geles de agarosa se llevó a cabo con ayuda de
Jetsorb según los datos del fabricante (Genomed).
Los cebadores para reacciones de PCR y
secuenciación se adquirieron en la compañía Metabion. Todas las
construcciones de vector se confirmaron mediante secuenciación de
ADN de ciclo FS con ADN polimerasa AmpliTaq con terminadores
marcados con fluorescencia en un secuenciador ABI 373 A (Applied
Biosystems).
Se cultivaron células de levadura, por ejemplo
de la cepa JC34.4D (MAT\alpha, ura3-52, suc2), en
10 ml de YEPD (2% de glucosa, 2% de peptona, 1% de extracto de
levadura Difco) y se recogieron a una D.O. a 600 nm de 0,6 a 0,8. Se
lavaron las células con 5 ml de disolución A (sorbitol 1 M, bicina
10 mM, pH 8,35, 3% de etilenglicol), se resuspendieron en 0,2 ml de
disolución A y se almacenaron a -70ºC.
Se añadieron ADN de plásmido (5 \mug) y ADN
portador (50 \mug de ADN de esperma de arenque) a las células
congeladas. Se descongelaron a continuación las células mediante
agitación durante 5 min a 37ºC. Después de añadir 1,5 ml de
disolución B (40% de PEG 1000, bicina 200 mM, pH 8,35), se incubaron
las células durante 60 min a 30ºC, se lavaron con 1,5 ml de
disolución C (NaCl 0,15 M, bicina 10 mM, pH 8,35) y se
resuspendieron en 100 \mul de disolución C. La siembra se realizó
sobre un medio selectivo con 2% de agar. Se obtuvieron los
transformantes después de una incubación de 3 días a 30ºC.
Medio de precultivo:
| Base nitrogenada de bacto-levadura | 6,7 g/l | |
| Glucosa x H_{2}O | 20 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 6,7 g/l |
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de cultivo principal:
| Glucosa x H_{2}O | 2,0 g/l | |
| Peptona de soja | 25,0 g/l | |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 3,8 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 1,4 g/l | |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 1,0 g/l | |
| Clorhidrato de tiamina | 5,1 mg/l | |
| Inositol | 20 mg/l | |
| Disolución de oligoelementos | 3 ml/l | |
| Disolución de vitaminas | 3 ml/l |
\vskip1.000000\baselineskip
Disolución de alimentación:
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 15,0 g/l | |
| Glucosa x H_{2}O | 1.600 g/l | |
| KH_{2}PO_{4} | 8,7 g/l | |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 11,4 g/l | |
| Clorhidrato de tiamina | 39 mg/l | |
| Inositol | 210 mg/l | |
| Disolución de oligoelementos | 20,4 ml/l | |
| Disolución de vitaminas | 20,4 ml/l |
\vskip1.000000\baselineskip
Disolución de oligoelementos:
| FeCl_{3} x 6 H_{2}O | 13,5 g/l | |
| ZnCl_{2} x 4 H_{2}O | 2,0 g/l | |
| H_{3}BO_{3} | 0,5 g/l | |
| CoCl_{2} x 6 H_{2}O | 2,0 g/l | |
| CuSO_{4} x 5 H_{2}O | 1,9 g/l | |
| Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O | 2,0 g/l | |
| CaCl_{2} x 2 H_{2}O | 1,0 g/l | |
| HCl conc. | 100 ml/l |
\vskip1.000000\baselineskip
Disolución de vitaminas:
| Riboflavina | 0,42 g/l | |
| Ácido pantoténico (sal de Ca) | 5,9 g/l | |
| Ácido nicotínico | 6,1 g/l | |
| Clorhidrato de piridoxina | 1,7 g/l | |
| Biotina | 0,06 g/l | |
| Ácido fólico | 0,04 g/l |
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó 1 ml de suspensión celular de una
conserva funcional como precultivo en 200 ml de medio de precultivo
en un matraz Erlenmeyer de 1 l. Se mantuvieron las conservas
funcionales en nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente
antes de la inoculación. Se incubó el precultivo durante 72 horas en
un agitador (260 rpm) a 28ºC.
Se llevaron a cabo como cultivo principal
fermentaciones alimentadas por lotes en biorreactores de 10 l. Se
inocularon 7 l de medio de cultivo principal con el precultivo. La
duración de la fermentación ascendió a 96 horas.
Temperatura: 28ºC
Número de revoluciones del agitador: 500
rpm.
Ventilación: 10 l/min
pH: 5,5 regulado mediante titulación con
NH_{4}OH 5 N
Presión del espacio de la zona superior: 20
kPa.
Después de 7 horas de tiempo de fermentación, se
inició la alimentación. Se reguló la velocidad de alimentación de
modo que se mantuviera un cociente respiratorio (CR) de 1,1 (CR=
CO_{2} formado/oxígeno consumido). Ante un aumento del CR se
redujo la velocidad de alimentación, ante una reducción se aumentó.
Se siguió el crecimiento de las células mediante la medida de la
densidad óptica. Al final de la fermentación, se separaron las
células mediante centrifugación y se aisló la proteína a partir del
sobrenadante.
Se llevaron a cabo la ultra- y diafiltración
para concentrar y retamponar la disolución de fermentación con un
sistema de la compañía Pall-Filtron (membrana de 5
kDa, tipo Omega, superficie de filtro 100 cm^{2}).
Se llevó a cabo la etapa inicial de purificación
cromatográfica (cromatografía de intercambio aniónico en
Q-Sepharose Big Beads) con un sistema FPLC de la
compañía Amersham-Pharmacia. El tipo de columna
usado fue Amersham-Pharmacia XK 50.
Se llevaron a cabo ambas etapas posteriores de
purificación cromatográfica (cromatografía en fase inversa en
material Vydac C8 o Source 15) con el sistema BioCad de la compañía
Perseptive Biosystems.
Se llevaron a cabo los análisis de secuencia con
un secuenciador de proteínas modelo 473A o 494 (Procise™) de la
compañía Applied Biosystems. Se usó el programa de secuenciación
convencional. El secuenciador, los distintos programas de
secuenciación, así como el sistema de detección de PTH, se describen
con detalle en el manual del usuario (manual del usuario del sistema
de secuenciación de proteína modelo 473A (1989) o "manual del
usuario, sistema de secuenciación de proteína Procise™" (1994),
Applied Biosystems).
Los reactivos para el funcionamiento del
secuenciador y la columna de HPLC para la detección de PTH se
adquirieron en Applied Biosystems.
Los análisis de HPLC se llevaron a cabo con un
sistema HPLC HP1090 o HP1100 de Hewlett Packard. Se usaron columnas
de HPLC RP-18 (250 mm x 4,6 mm, material de 5
\mum, diámetro de poro de 300 angstrom) de Backerbond o Macherey
& Nagel para las separaciones.
La electroforesis capilar modelo
270A-HT era de Applied Biosystems. Generalmente, las
muestras de inyectaron hidrodinámicamente a distintos intervalos de
tiempo. La columna capilar usada (50 \mum x 72 cm) era de Applied
Biosystems.
Se llevaron a cabo los análisis de aminoácidos
con un analizador de aminoácidos LC3000 de Eppendorf Biotronik. Se
usó un programa de separación estándar ligeramente modificado de
Eppendorf/Biotronik. Los programas de separación y la función del
analizador se describen detalladamente en el manual del aparato.
Se determinaron los pesos moleculares con un
sistema MALDI I de Kratos/Shimadzu. Se llevaron a cabo las
electroforesis con SDS con un sistema de electroforesis de
Pharmacia.
Se llevó a cabo la cromatografía de exclusión
molecular con un sistema de HPLC de DIONEX, modelo
DX-500. Se usó una columna GPC Superdex 75 de
Pharmacia.
Como material de partida para la preparación de
interleucina-8 TVR (secuencia 1), sirvió un ADNc de
interleucina-8 humana sintético (BBG44 de British
Biotechnology Products Ltd.), que se clonó después de la inserción
de un sitio de escisión KexII mediante las enzimas de restricción
HindIII y BamHI en el vector pA228 (Apeler y col., patente de EE.UU.
nº 5.707.831). En el vector pES22.9.H resultante, la secuencia de
aprotinina Arg15 está sustituida por la secuencia de
interleucina-8 (secuencia 2).
El intercambio de la secuencia que codifica ELR
en la zona 5' del gen por una secuencia que codifica TVR se efectuó
con ayuda de la técnica de PCR usando el cebador A y B a partir de
ADN del plásmido pES22.9.H.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador A tenía la siguiente secuencia:
5'-GGAAGCTTGGATAAAAGAAGTGCTAAAACTGTCAGATGTCAATGCATAAAG-3'
(secuencia 3). La secuencia de reconocimiento de HindIII está
subrayada y los codones para los aminoácidos TVR están marcados en
negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'- CTTCTGTTCGGAGATTACCG-3'
(secuencia 4). Este cebador se une a la zona de terminador de la
transcripción del vector.
La preparación de PCR contenía aproximadamente
200 ng de ADN del plásmido pES22.9.H, cebador A 0,2 \muM, cebador
B 0,2 \muM, dNTP 200 \muM, tampón de reacción PCR x 1
(Stratagene, Opti-Prime™) y 2,5 U de ADN polimerasa
Taq (Perkin Elmer) en un volumen total de 50 \mul. Las condiciones
del "ciclo" fueron: 3 min a 94ºC, 30 ciclos respectivamente de
1,5 min a 94ºC, 1,5 min a 55ºC y 1,5 min a 72ºC, y una incubación
posterior de 5 min a 72ºC. La preparación de PCR se diluyó 1:4 y se
ligó con el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen). Se
transformaron células TOP10 de E. coli (Invitrogen) con la
preparación de ligamiento. Se identificaron los clones positivos
después de una digestión de restricción con las enzimas HindIII y
BamHI y se secuenciaron varios clones. El clon pIU13.10.P contenía
la secuencia deseada (secuencia 5) y se usó para los trabajos
posteriores.
Se usó el vector basculante de E.
coli/levadura pA202 para la construcción de un vector de
secreción de levadura en el que la secuencia de
interleucina-8 TVR está ligada con la secuencia
prepro del factor alfa de levadura. El vector pA202 porta un gen de
resistencia a la ampicilina (bla) y un gen URA3 como genes
marcadores detectables para E. coli y levadura. Son otros
elementos esenciales del vector los orígenes de replicación Col E1 y
2 \mu (ori). El locus REP3 se encuentra igualmente en esta región.
Un fragmento de EcoRI-HindIII de 1.200 pb de tamaño
porta el promotor MF\alpha1 y la secuencia prepro
N-terminal de la proteína precursora de factor alfa
de levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30,
933-943, 1982). Un fragmento
BamHI-SalI del gen de levadura URA3 funciona como
señal de terminación para la transcripción (Yarger y col., Mol.
Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
Mediante la introducción de un ADNc de
interleucina-8 TVR modificado como fragmento
HindIII-BamHI, se prepara de nuevo el sitio de
reconocimiento para la proteasa KexII
("Lys-Arg") dentro de la secuencia prepro del
factor alfa (documento WO 98/56916).
Se escindió un fragmento de ADN de
aproximadamente 240 pb de tamaño con HindIII y BamHI a partir del
vector pIU13.10.P, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa y se clonó en el vector pA202 cortado y desfosforilado
igualmente con HindIII y BamHI. Mediante esta clonación, se
sustituyó la
DesPro2-Arg15-aprotinina en el
vector pA202 por interleucina-8 TVR. Se
transformaron las células de levadura (JC34.4D) con el vector
pIU11.11.P resultante de la clonación.
Pueden prepararse de modo similar otros vectores
basculantes de E. coli/levadura con distintos promotores
como, por ejemplo, el promotor constitutivo GAPDH o el inducible
GAL10, y conducen igualmente a la secreción de
interleucina-8 TVR.
Además, por supuesto es posible usar vectores
basculantes con otros orígenes de replicación de levadura como, por
ejemplo, el segmento replicante autónomo cromosómico (ars).
Son genes marcadores detectables adecuados,
además del gen URA3, aquellos genes que restituyen a un mutante de
levadura auxotrófico la prototrofia como, por ejemplo, los genes
LEU2, HIS3 o TRP1. Además, pueden usarse por supuesto también genes
cuyos productos confieran resistencia frente a distintos
antibióticos como, por ejemplo, el aminoglucósido G418.
Otras levaduras como, por ejemplo, las levaduras
metilotróficas Pichia pastoris o Hansenula polymorpha,
están en disposición de producir igualmente
interleucina-8 TVR después de transformación con
vectores adecuados.
Como material de partida para la preparación de
interleucina-8 DLQ (secuencia 6) sirvió un ADNc de
interleucina-8 humana sintético (BBG44 de British
Biotechnology Products Ltd.), que se clonó en el vector pA228
(Apeler y col., patente de EE.UU. nº 5.707.831) después de inserción
de un sitio de escisión KexII mediante las enzimas de restricción
HindIII y BamHI. En el vector pES22.9.H resultante, la secuencia de
aprotinina Arg15 está sustituida por la secuencia de
interleucina-8 humana.
El intercambio de la secuencia que codifica ELR
en la zona 5' del gen por una secuencia que codifica DLQ se realizó
con ayuda de la técnica de PCR, usando los cebadores C y B a partir
de ADN del plásmido pES22.9.H. El cebador C tenía la siguiente
secuencia:
5'-GGAAGCTTGGATAAAAGAAGTGCTAAAGATTTGCAATGTCAATGCATAAAG-3'
(secuencia 7)
La secuencia de reconocimiento de HindIII está
subrayada y los codones para los aminoácidos DLQ están marcados en
negrita. El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'-CTTCTGTTCGGAGATTACCG-3'
(secuencia 4). Este cebador se une a la zona de terminador de la
transcripción del vector.
La preparación de PCR contiene aproximadamente
200 ng de ADN del plásmido pES22.9.H, cebador C 0,2 \muM, cebador
B 0,2 \muM, dNTP 200 \muM, tampón de reacción PCR x 1
(Stratagene, Opti-Prime™) y 2,5 U de ADN polimerasa
Taq (Perkin Elmer) en un volumen total de 50 \mul. Las condiciones
de "ciclo" fueron: 3 min a 94ºC, 30 ciclos respectivamente de
1,5 min a 94ºC, 1,5 min a 55ºC y 1,5 min a 72ºC y a continuación una
incubación de 5 min a 72ºC. La preparación de PCR se diluyó 1:4 y se
ligó con el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen). Se
transformaron células TOP10 de E. coli (Invitrogen) con la
preparación de ligamiento. Se identificaron los clones positivos
después de una digestión de restricción con las enzimas HindIII y
BamHI y se secuenciaron varios clones. El clon pIU14.10.P contenía
la secuencia deseada (secuencia 8) y se usó para los trabajos
posteriores.
El vector basculante E. coli/levadura
pA202 se usó para la construcción de un vector de secreción de
levadura en el que la secuencia de interleucina-8
DLQ está ligada con la secuencia prepro del factor alfa de
levadura.
El vector A202 porta un gen de resistencia a
ampicilina (bla) y un gen URA3 como genes marcadores detectables
para E. coli y levadura. Son otros elementos esenciales del
vector los orígenes de replicación Col E1 y 2 \mu (ori). El locus
REP3 se encuentra igualmente en esta región. Un fragmento
EcoRI-HindIII de 1.200 pb de tamaño porta el
promotor MF\alpha1 y la secuencia prepro
N-terminal de la proteína precursora de factor alfa
de levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30,
933-943, 1982). Un fragmento
BamHI-SalI del gen URA3 de levadura funciona como
señal de terminación para la transcripción (Yarger y col., Mol.
Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
Mediante la introducción de un ADNc de
interleucina-8 DLQ modificado como fragmento
HindIII-BamHI, se prepara de nuevo el sitio de
reconocimiento para la proteasa KexII
("Lys-Arg") dentro de la secuencia prepro del
factor alfa (documento WO 98/56916).
Se escindió un fragmento de ADN de
aproximadamente 240 pb de tamaño con HindIII y BamHI a partir del
vector pIU14.10.P, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa y se clonó en el vector pA202 cortado y desfosforilado
igualmente con HindIII y BamHI. Mediante esta clonación, se
sustituyó la
DesPro2-Arg15-aprotinina en el
vector pA202 por interleucina-8 DLQ. Se
transformaron las células de levadura (JC34.4D) con el vector
pIU9.11.P resultante de la clonación.
Pueden prepararse de modo similar otros vectores
basculantes de E. coli/levadura con distintos promotores
como, por ejemplo, el promotor constitutivo GAPDH o el inducible
GAL10, y conducen igualmente a la secreción de
interleucina-8 DLQ. Además, por supuesto es posible
usar también vectores basculantes con otros orígenes de replicación
de levadura como, por ejemplo, el segmento replicante autónomo
cromosómico (ars).
Son genes marcadores detectables adecuados,
además del gen URA3, aquellos genes que restituyen a un mutante de
levadura auxotrófico la prototrofia como, por ejemplo, los genes
LEU2, HIS3 o TRP1. Además, pueden usarse por supuesto también genes
cuyos productos confieran resistencia frente a distintos
antibióticos como, por ejemplo, el aminoglucósido G418.
Otras levaduras como, por ejemplo, las levaduras
metilotróficas Pichia pastoris o Hansenula polymorpha,
están en disposición de producir igualmente
interleucina-8 DLQ después de transformación con
vectores adecuados.
Como material de partida para la preparación de
interleucina-8 Y13H (secuencia 9) sirvió un ADNc de
interleucina-8 humana sintético (BBG44 de British
Biotechnology Products Ltd.), que se clonó después de inserción de
un sitio de corte KexII mediante las enzimas de restricción HindIII
y BamHI en el vector pA228 (Apeler y col, patente de EE.UU. nº
5.707.831). En el vector pES22.9.H resultante está sustituida la
secuencia de aprotinina Arg15 por la secuencia de
interleucina-8 humana.
La introducción de la mutación Y13H en la
secuencia de interleucina-8 se realizó con ayuda de
la técnica de PCR usando los cebadores D y B a partir de ADN del
plásmido pES22.9.H.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador D tenía la siguiente secuencia:
5'-GGAAGCTTGGATAAAAGAAGTGCTAAAGAACTTAGATGTCAAT
GCATAAAGACACATTCCAAACC
TTTCCAC-3' (secuencia 10). La secuencia de reconocimiento de HindIII está subrayada y el codón del intercambio Y13H está marcado en negrita.
TTTCCAC-3' (secuencia 10). La secuencia de reconocimiento de HindIII está subrayada y el codón del intercambio Y13H está marcado en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'-CTTCTGTTCGGAGATTACCG-3'
(secuencia 4). Este cebador se une en la zona de terminador de la
transcripción del vector.
La preparación de PCR contenía aproximadamente
200 ng de ADN del plásmido pES22.9.H, cebador D 0,2 \muM, cebador
B 0,2 \muM, dNTP 200 \muM, tampón de reacción PCR II x 1 (Perkin
Elmer), MgCl_{2} 1 mM y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer)
en un volumen total de 100 l. Las condiciones del "ciclo"
fueron: 3 min a 94ºC, 30 ciclos respectivamente de 1 min a 94ºC, 1
min a 55ºC y 1 min a 72ºC, y a continuación una incubación de 5 min
a 72ºC. Se diluyó la preparación de PCR 1:4 y se ligó con el vector
pCR®2.1-TOPO (Invitrogen). Se transformaron células
TOPO de E. coli (Invitrogen) con la preparación de
ligamiento. Se identificaron los clones positivos después de una
digestión de restricción con la enzima EcoRI y se secuenciaron
varios clones. El clon pIU29.6.P contenía la secuencia deseada
(secuencia 11) y se usó para los trabajos posteriores.
Se usó el vector basculante E.
coli/levadura pA202 para la construcción de un vector de
secreción de levadura en el que se liga la secuencia de
interleucina-8 Y13H con la secuencia prepro de
factor alfa de levadura.
El vector pA202 porta un gen de resistencia a
ampicilina (bla) y un gen URA3 como genes marcadores detectables
para E. coli y levadura. Son elementos esenciales adicionales
del vector los orígenes de replicación Col E1 y 2 \mu (ori). El
locus REP3 se encuentra igualmente en esta región. Un fragmento
EcoRI-HindIII de 1.200 pb de tamaño porta el
promotor MFA\alpha y la secuencia prepro
N-terminal de la proteína precursora de factor alfa
de levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30,
933-943, 1982). Un fragmento
BamHI-SalI del gen URA3 de levadura funciona como
señal de terminación para la transcripción (Yarger y col., Mol.
Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
Mediante la introducción de un ADNc de
interleucina-8 Y13H modificado como fragmento
HindIII-BamHI, se prepara de nuevo el sitio de
reconocimiento para la proteasa KexII
("Lys-Arg") dentro de la secuencia prepro del
factor alfa (documento WO 98/56916).
Se escindió un fragmento de ADN de
aproximadamente 240 pb de tamaño con HindIII y BamHI a partir del
vector pIU29.6.P, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa y se clonó en el vector pA202 igualmente cortado y
desfosforilado con HindIII y BamHI. Mediante esta clonación, se
sustituye la
DesPro2-Arg15-aprotinina en el
vector pA202 por interleucina-8 Y13H. Se
transformaron las células de levadura (JC34.4D) con el vector
pIU16.7.P resultante de esta clonación.
Pueden prepararse de modo similar otros vectores
basculantes de E. coli/levadura con distintos promotores
como, por ejemplo, el promotor constitutivo GAPDH o el inducible
GAL10, y conducen igualmente a la secreción de
interleucina-8 Y13H.
Además, por supuesto es posible usar vectores
basculantes con otros orígenes de replicación de levadura como, por
ejemplo, el segmento replicante autónomo cromosómico (ars).
Son genes marcadores detectables adecuados,
además del gen URA3, aquellos genes que restituyen a un mutante de
levadura auxotrófico la prototrofia como, por ejemplo, los genes
LEU2, HIS3 o TRP1. Además, pueden usarse por supuesto también genes
cuyos productos confieran resistencia frente a distintos
antibióticos como, por ejemplo, el aminoglucósido G418.
Otras levaduras como, por ejemplo, las levaduras
metilotrófica Pichia pastoris o Hansenula polymorpha,
están en disposición de producir igualmente
interleucina-8 Y13H después de transformación con
vectores adecuados.
Se concentraron 10 l de sobrenadante de
fermentación mediante ultrafiltración a través de una membrana de 5
kDa (tipo Omega, compañía Pall-Filtron) (1/7) y a
continuación se retamponó mediante diafiltración en etanolamina 20
mM, pH 9,5 (tampón A). Se aplicó la preparación a una columna de
cromatografía llenada con 40 ml de Q-Sepharose Big
Beads (compañía Amersham-Pharmacia), que se había
equilibrado antes con tampón A. Se lavó la columna con tampón A y a
continuación se eluyó con tampón B (tampón A + NaCl 1 M) en
gradiente por etapas. En la siguiente etapa, se mezcló la pasada en
la que se había detectado la interleucina-8 con TFA
al 0,1% y se bombeó a una columna Vydac C8 de 100 ml (Muder +
Wochele), que se había equilibrado antes con 0,1% de TFA en agua
(tampón C). Después de lavado con tampón C, se realizó la elución en
gradiente lineal con 80% de ACN + 0,1% de TFA (tampón D). (Gradiente
0% de B a 100% de B en 6 volúmenes de columna, velocidad de flujo 20
ml/min, IL-8 y muteína eluyen aproximadamente a 44%
de B). Se combinaron las fracciones en las que se detectó
IL-8, se diluyeron con agua con 20% de ACN y se
liofilizaron. Después de reconstituir el liofilizado con tampón C,
se aplicó la disolución a una columna de fase inversa Source 15 de
100 ml (compañía Amersham-Pharmacia), que se había
equilibrado antes con tampón C. Después de lavar con tampón C, se
realizó la elución en gradiente lineal con tampón D. (Gradiente 0%
de B a 100% de B en 9 volúmenes de columna, velocidad de flujo 27
ml/min, IL-8 y muteínas eluyen aproximadamente a 44%
de B). Se combinaron las fracciones en las que se detectó
IL-8, se diluyeron con agua con 20% de ACN y se
liofilizaron.
Se cargaron 0,5 nmol de muteínas de
interleucina-8 disueltas en agua en una lámina de
secuenciador que se había preincubado con Polybren®. Se secuenciaron
las proteínas con el ciclo de secuenciador normal. Se identificaron
los PTH-aminoácidos mediante HPLC en línea con ayuda
de un patrón de PTH 50 pmol.
Se secuenciaron las muteínas de
interleucina-8 durante 4-20 etapas.
La Fig. 1 muestra las secuencias proteicas determinadas. Son
idénticas a las secuencias clonadas.
Fig.
1
| Muteína de | Secuencia N-terminal determinada |
| interleucina-8 | |
| Muteína de TVR | Ser-Ala-Lys-Thr-Val-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys |
| Muteína de DLQ | Ser-Ala-Lys-Asp-Leu-Gln-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys |
| Muteína de Y13H | Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-His-Ser-Lys- |
El análisis de aminoácidos representa un
parámetro cualitativo y cuantitativo importante para la
caracterización de proteínas. Además del contenido de proteína, se
determina con la estructura primaria conocida el número de
aminoácidos individuales. El análisis de aminoácidos de muteínas de
interleucina-8 está en buena coincidencia con los
valores teóricos de la estructura primar (Tab. 1).
Se disolvieron 100 \mug de muteína de
interleucina-8 en 200 \mul de HCl 6 N y se
hidrolizaron durante 1 h a 166ºC. Se añadió aproximadamente 1 nmol
de muestra al analizador de aminoácidos. Se determinó la cantidad de
aminoácido mediante un patrón de aminoácidos 4 nmol.
\vskip1.000000\baselineskip
| Aminoácido | IL-8 TVR | Valor teórico | IL-8 DLQ | Valor teórico | IL-8 Y13H | Valor teórico |
| CysSO_{3}H+ | 4,00 | 4 | 4,00 | 4 | 4,01 | 4 |
| Asx | 5,18 | 5 | 5,70 | 6 | 5,00 | 5 |
| Thr | 2,85 | 3 | 1,95 | 2 | 2,22 | 2 |
| Ser | 4,07 | 5 | 3,75 | 5 | 4,21 | 5 |
| Glx | 8,71 | 9 | 9,37 | 10 | 9,76 | 10 |
| Gly | 2,16 | 2 | 2,01 | 2 | 2,19 | 2 |
| Ala | 3,00 | 3 | 3,10 | 3 | 3,12 | 3 |
| Val | 5,50 | 6 | 4,70 | 5 | 4,71 | 5 |
| Met | - | - | - | - | - | - |
| Ile | 4,32 | 5 | 4,15 | 5 | 4,33 | 5 |
| Leu | 5,18 | 5 | 5,83 | 6 | 6,02 | 6 |
| Tyr | 1,32 | 1 | 1,41 | 1 | - | - |
| Phe | 3,01 | 3 | 3,00 | 3 | 2,98 | 3 |
| His | 1,84 | 2 | 1,77 | 2 | 2,75 | 3 |
| Lys | 8,58 | 9 | 8,63 | 9 | 8,84 | 9 |
| Arg | 4,64 | 5 | 3,79 | 4 | 4,69 | 5 |
| Pro | 4,17 | 4 | 4,18 | 4 | 4,12 | 4 |
| Trp | n.d. | 1 | n.d. | 1 | n.d. | 1 |
| * La cisteína se determinó según la oxidación del ácido perfórmico. |
Se analizó aproximadamente 1 \mug de muteína
de interleucina-8 con la técnica MALDI. Se usó como
matriz ácido sinapínico. Las proteínas patrón para la calibración de
la masa fueron insulina bovina, citocromo C y melitina.
El peso molecular determinado está a este
respecto en buena coincidencia con el valor teórico de las muteínas
respectivas en el marco de precisión de los procedimientos de
medida. La Tabla 2 muestra los pesos moleculares determinados en
comparación con los valores teóricos.
| Muteína de interleucina-8 | Peso molecular en Da | Peso molecular teórico en Da |
| IL-8 TVR | 8.342 \pm 4 | 8.343 |
| IL-8 DLQ | 8.342 \pm 3 | 8.343 |
| IL-8 Y13H | 8.355 \pm 4 | 8.359 |
| IL-8 natural (forma Met) | 8.521 \pm 4 | 8.517 |
Se analizaron las muteínas de
interleucina-8 TVR, DLQ, Y13H y la forma met de
IL-8 natural mediante electroforesis SDS en
condiciones reductoras y no reductoras. La electroforesis en
gel-SDS se llevó a cabo según las condiciones de
Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970).
Se separaron las muteínas de interleucina-8 en un
gel SDS al 10-20% y se tiñeron mediante azul
brillante de Coomasie R-250 o tinción de plata
(Merril y col., Anal. Biochem. 110, 210-207,
1981). En el caso de tinción con azul de Coomasie, se usaron
aproximadamente 30 \mug y en tinción con plata aproximadamente 5
\mug.
En los geles SDS, las muteínas de
IL-8 y la natural migran como bandas individuales de
aproximadamente 9 kDa.
La electroforesis capilar permite la separación
de péptidos y proteínas debido a su carga en campo eléctrico. La
calidad de la separación depende a este respecto del tampón, del
valor de pH, de la temperatura y de los aditivos usados. Como
capilares se usan las denominadas columnas de "sílice fundida"
con un diámetro interno de 50-100 \mum. Las
muteínas de interleucina-8 se separan en una columna
de "sílice fundida" en campo eléctrico. Se examinaron
aproximadamente 8 ng de muteína de interleucina-8 en
una columna de vidrio (longitud 72 cm, diámetro interno 50 \mum).
Condiciones: intensidad de corriente: 90 \muA, temperatura de
columna: 25ºC, tampón fosfato 100 mM, pH 3,0, detección: 210 nm,
alimentación a presión 3 s.
En el electroforegrama, las muteínas de
interleucina-8 eluyen en forma de un pico principal
con un tiempo de retención de aproximadamente 10 min.
En la cromatografía HPLC de proteínas unidas
químicamente a fases inversas, se llega mediante un efecto de
intercambio hidrófobo de las proteínas a un enlace a la fase usada.
Las proteínas se desplazan correspondientemente a la fuerza de su
enlace a la fase estacionaria de disolventes orgánicos (fase
móvil).
Por esta razón, este procedimiento es un buen
criterio para la evaluación de la pureza de una proteína.
Se purificaron por cromatografía aproximadamente
3 nmol de muteínas de interleucina-8 en una columna
de HPLC Nucleosil RP-18 (material de 5 \mum, 4,6
mm x 250 mm, 300 angstrom de tamaño de poro). Se usó como eluyente
un gradiente de acetonitrilo/TFA. Condiciones: flujo 0,7 ml/min,
temperatura de columna 40ºC, detección 210 nm, disolvente A 0,1% de
TFA, disolvente B 0,1% de TFA/60% de acetonitrilo, gradiente: 0 min
0% de B, 10 min 0% de B, 70 min 100% de B, 80 min 0% de B.
Las muteínas de interleucina-8
eluyen en forma de pico de la fase RP-18 con tiempos
de retención de aproximadamente 52 min (IL-8 TVR),
aproximadamente 53 min (IL-8 DLQ), aproximadamente
52 min (IL-8 natural-Met) y
aproximadamente 52 min (IL-8 Y13H).
Se purificaron por cromatografía aproximadamente
50 \mug de muteínas de interleucina-8 TVR, DLQ e
Y13H mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna
Superdex 75. Se usó como tampón NaCl 600 mM/Na_{2}
HPO_{4} 50 mM, pH 7,0, flujo 0,5 ml/min, detección 215 nm, temperatura ambiente. Como proteínas patrón para la calibración del peso molecular de la columna se usaron albúmina bovina, ovoalbúmina, anhidrasa carbónica, mioglobina, citocromo C, aprotinina y tirosina.
HPO_{4} 50 mM, pH 7,0, flujo 0,5 ml/min, detección 215 nm, temperatura ambiente. Como proteínas patrón para la calibración del peso molecular de la columna se usaron albúmina bovina, ovoalbúmina, anhidrasa carbónica, mioglobina, citocromo C, aprotinina y tirosina.
Las muteínas de interleucina-8
eluyen con un tiempo de retención de aproximadamente 25 minutos.
Esto corresponde a un peso molecular relativo (según la calibración
de la columna con proteínas globulares) de aproximadamente 17 kDa en
disolución. Las muteínas de IL-8 se presentan en la
disolución usada en forma de dímeros.
<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la preparación de
interleucina-8 y muteínas de
interleucina-8 recombinantes
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Proc. para la preparación de
IL-8
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn vers. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagcttgg ataaaagaag tgctaaaact gtcagataaa g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttctgttcg gagattaccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagcttgg ataaaagaag tgctaaagat ttgcaatgtc aatgcataaa g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 244
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (2)
1. Uso de IL-8 Y13H en
preparaciones de detección sistemática para encontrar antagonistas
de IL-8 de bajo y alto peso molecular de los
receptores CXCR1 y CXCR2 de IL-8.
2. Uso de muteínas de IL-8 más
débilmente afines en comparación con IL-8 natural en
preparaciones de detección sistemática para encontrar antagonistas
de IL-8 de bajo y alto peso molecular de los
receptores CXCR1 y CXCR2 de IL-8.
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| WO2001032879A3 (de) | 2001-12-06 |
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