ES2265997T3 - Procedimiento para la preparacion de interleucina-8 y muteinas de interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar antagonistas de receptores de il-8. - Google Patents

Procedimiento para la preparacion de interleucina-8 y muteinas de interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar antagonistas de receptores de il-8. Download PDF

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Abstract

Uso de IL-8 Y13H en preparaciones de detección sistemática para encontrar antagonistas de IL-8 de bajo y alto peso molecular de los receptores CXCR1 y CXCR2 de IL- 8.

Description

Procedimiento para la preparación de interleucina-8 y muteínas de interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar antagonistas de receptores de IL-8.
La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de interleucina-8 (IL-8) y muteínas de interleucina-8 recombinantes y a su uso para encontrar antagonistas de IL-8 para los receptores CXCR1 y CXCR2 de IL-8. Especialmente, se describe un procedimiento para la preparación de IL-8 Y13H, IL-8 TVR e IL-8 DLQ.
La familia de las quimiocinas abarca citocinas quimiotácticas para leucocitos con un peso molecular de 8 a 10 kDa. La estructura tridimensional de muchas quimiocinas es conocida. Las quimiocinas contienen dos puentes disulfuro. Debido a un motivo C-X-C o C-C conservado en la terminación N, se diferencian las subfamilias de quimiocinas CXC o CC (Baggiolini y col., Advances in Immunology, 55, 97-179, 1993). Entre las quimiocinas CXC se cuentan, entre otras, interleucina-8, proteína 10 inducible por interferón \gamma (IP-10), factor de plaquetas 4 (PF4), GRO (oncogén relacionado con el crecimiento); \alpha, \beta, \gamma-monocinas inducidas mediante interferón gamma (MIG) y la proteína 78 activadora de neutrófilos epiteliales (ENA-78).
Además del efecto inflamatorio agudo sobre granulocitos neutrófilos, se han descrito también para quimiocinas CXC individuales efectos angiogénicos y angiostáticos. Las IP-10 y PF4 recombinantes humanas se cuentan entre las quimiocinas CXC con efecto angiostático. Estas quimiocinas carecen de una secuencia característica Glu-Leu-Arg (motivo ELR) en el extremo N-terminal de la proteína. La interleucina-8 se cuenta entre las quimiocinas CXC con motivo ELR que inducen efectos angiogénicos. Las muteínas de interleucina-8 humanas en las que el motivo ELR (Glu-Leu-Arg) se sustituye por los aminoácidos Thr-Val-Arg (TVR) o Asp-Leu-Asn (DLQ), se caracterizan por un efecto angiostático (Strieter y col., J. Biol. Chem. 270, 27348-27357, 1995 y Strieter y col., patente de Estados Unidos 5.871.723).
Schraufstatter Ingrid U. y col. describen en "The role of Tyr-13 and Lys-15 of interleukin-8 in the high affinity interaction with the interleukin-8 receptor type A" (Journal of Biological Chemistry, vol. 270, nº 18, 1995, páginas 10428-10431, XP002166109, ISSN: 00221-9258) muteínas de interleucina-8 y su interacción con el receptor de IL-8. Esta cita no contiene información sobre el uso de muteínas de IL-8 más débilmente afines en comparación con IL-8 natural en la detección sistemática de preparaciones para encontrar antagonistas de bajo y alto peso molecular de los receptores CXCR1 y CXCR2 de IL-8.
La preparación recombinante de las muteínas de interleucina-8 se realizó mediante la expresión de una fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), la purificación mediante una matriz de amilosa (New England Biolabs), la escisión proteolítica de la proteína de fusión y la posterior purificación fina de la muteína deseada (Strieter y col., J. Biol. Chem. 270, 27348-27357, 1995). Con este procedimiento no es posible una producción de interleucina-8 y muteínas de interleucina-8 a escala industrial.
Sorprendentemente, se ha encontrado que es posible una expresión de interleucina-8 y muteínas de interleucina-8 con secuencia N-terminal correcta en vectores de secreción de levadura con secuencia líder MF\alpha1. La IL-8 así preparada y las muteínas así preparadas se obtienen con mayor pureza y libres de endotoxinas. Las muteínas TVR y DLQ de interleucina-8 preparadas son adecuadas para el tratamiento de enfermedades cancerosas. La muteína Y13H de interleucina-8 es además adecuada para la identificación de antagonistas de interleucina-8 de bajo peso molecular en los receptores CXCR1 y CXCR2.
A continuación, se citan los procedimientos usados en el transcurso de la clonación, fermentación, purificación y caracterización bioquímica de las muteínas de interleucina-8 recombinantes.
Procedimientos Enzimas
Las enzimas usadas (endonucleasas de restricción, fosfatasa alcalina intestinal bovina y ADN ligasa T4) se adquirieron en las compañías Boehringer Mannheim y GIBCO/BRL y se usan según las instrucciones del fabricante.
Técnicas de biología molecular
Se llevaron a cabo los trabajos de clonación rutinarios como, por ejemplo, el aislamiento de ADN de plásmido a partir de E. coli (denominado miniprep) y la transformación de E. coli con ADN de plásmido, según Sambrook y col. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, 1989). Como organismo huésped para transformaciones, se usó la cepa DH5\alpha de E. coli (GIBCO-BRL). Para el aislamiento de cantidades mayores de ADN de plásmido, se usaron Qiagen-Tip (Qiagen). La extracción de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa se llevó a cabo con ayuda de Jetsorb según los datos del fabricante (Genomed).
Los cebadores para reacciones de PCR y secuenciación se adquirieron en la compañía Metabion. Todas las construcciones de vector se confirmaron mediante secuenciación de ADN de ciclo FS con ADN polimerasa AmpliTaq con terminadores marcados con fluorescencia en un secuenciador ABI 373 A (Applied Biosystems).
Transformación de Saccharomyces cerevisiae
Se cultivaron células de levadura, por ejemplo de la cepa JC34.4D (MAT\alpha, ura3-52, suc2), en 10 ml de YEPD (2% de glucosa, 2% de peptona, 1% de extracto de levadura Difco) y se recogieron a una D.O. a 600 nm de 0,6 a 0,8. Se lavaron las células con 5 ml de disolución A (sorbitol 1 M, bicina 10 mM, pH 8,35, 3% de etilenglicol), se resuspendieron en 0,2 ml de disolución A y se almacenaron a -70ºC.
Se añadieron ADN de plásmido (5 \mug) y ADN portador (50 \mug de ADN de esperma de arenque) a las células congeladas. Se descongelaron a continuación las células mediante agitación durante 5 min a 37ºC. Después de añadir 1,5 ml de disolución B (40% de PEG 1000, bicina 200 mM, pH 8,35), se incubaron las células durante 60 min a 30ºC, se lavaron con 1,5 ml de disolución C (NaCl 0,15 M, bicina 10 mM, pH 8,35) y se resuspendieron en 100 \mul de disolución C. La siembra se realizó sobre un medio selectivo con 2% de agar. Se obtuvieron los transformantes después de una incubación de 3 días a 30ºC.
Fermentación de las células de levadura Medios nutritivos
Medio de precultivo:
Base nitrogenada de bacto-levadura 6,7 g/l
Glucosa x H_{2}O 20 g/l
KH_{2}PO_{4} 6,7 g/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Medio de cultivo principal:
Glucosa x H_{2}O 2,0 g/l
Peptona de soja 25,0 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4} 3,8 g/l
KH_{2}PO_{4} 1,4 g/l
MgSO_{4} x 7 H_{2}O 1,0 g/l
Clorhidrato de tiamina 5,1 mg/l
Inositol 20 mg/l
Disolución de oligoelementos 3 ml/l
Disolución de vitaminas 3 ml/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Disolución de alimentación:
(NH_{4})_{2}SO_{4} 15,0 g/l
Glucosa x H_{2}O 1.600 g/l
KH_{2}PO_{4} 8,7 g/l
MgSO_{4} x 7 H_{2}O 11,4 g/l
Clorhidrato de tiamina 39 mg/l
Inositol 210 mg/l
Disolución de oligoelementos 20,4 ml/l
Disolución de vitaminas 20,4 ml/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Disolución de oligoelementos:
FeCl_{3} x 6 H_{2}O 13,5 g/l
ZnCl_{2} x 4 H_{2}O 2,0 g/l
H_{3}BO_{3} 0,5 g/l
CoCl_{2} x 6 H_{2}O 2,0 g/l
CuSO_{4} x 5 H_{2}O 1,9 g/l
Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O 2,0 g/l
CaCl_{2} x 2 H_{2}O 1,0 g/l
HCl conc. 100 ml/l 
\vskip1.000000\baselineskip
Disolución de vitaminas:
Riboflavina 0,42 g/l
Ácido pantoténico (sal de Ca) 5,9 g/l
Ácido nicotínico 6,1 g/l
Clorhidrato de piridoxina 1,7 g/l
Biotina 0,06 g/l
Ácido fólico 0,04 g/l 
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Fermentación de precultivo
Se inoculó 1 ml de suspensión celular de una conserva funcional como precultivo en 200 ml de medio de precultivo en un matraz Erlenmeyer de 1 l. Se mantuvieron las conservas funcionales en nitrógeno líquido y se descongelaron inmediatamente antes de la inoculación. Se incubó el precultivo durante 72 horas en un agitador (260 rpm) a 28ºC.
Fermentación de cultivo principal
Se llevaron a cabo como cultivo principal fermentaciones alimentadas por lotes en biorreactores de 10 l. Se inocularon 7 l de medio de cultivo principal con el precultivo. La duración de la fermentación ascendió a 96 horas.
Condiciones de fermentación
Temperatura: 28ºC
Número de revoluciones del agitador: 500 rpm.
Ventilación: 10 l/min
pH: 5,5 regulado mediante titulación con NH_{4}OH 5 N
Presión del espacio de la zona superior: 20 kPa.
Después de 7 horas de tiempo de fermentación, se inició la alimentación. Se reguló la velocidad de alimentación de modo que se mantuviera un cociente respiratorio (CR) de 1,1 (CR= CO_{2} formado/oxígeno consumido). Ante un aumento del CR se redujo la velocidad de alimentación, ante una reducción se aumentó. Se siguió el crecimiento de las células mediante la medida de la densidad óptica. Al final de la fermentación, se separaron las células mediante centrifugación y se aisló la proteína a partir del sobrenadante.
Purificación de muteínas de interleucina-8 Aparatos
Se llevaron a cabo la ultra- y diafiltración para concentrar y retamponar la disolución de fermentación con un sistema de la compañía Pall-Filtron (membrana de 5 kDa, tipo Omega, superficie de filtro 100 cm^{2}).
Se llevó a cabo la etapa inicial de purificación cromatográfica (cromatografía de intercambio aniónico en Q-Sepharose Big Beads) con un sistema FPLC de la compañía Amersham-Pharmacia. El tipo de columna usado fue Amersham-Pharmacia XK 50.
Se llevaron a cabo ambas etapas posteriores de purificación cromatográfica (cromatografía en fase inversa en material Vydac C8 o Source 15) con el sistema BioCad de la compañía Perseptive Biosystems.
Caracterización química de proteínas de muteínas de interleucina-8 recombinantes Aparatos
Se llevaron a cabo los análisis de secuencia con un secuenciador de proteínas modelo 473A o 494 (Procise™) de la compañía Applied Biosystems. Se usó el programa de secuenciación convencional. El secuenciador, los distintos programas de secuenciación, así como el sistema de detección de PTH, se describen con detalle en el manual del usuario (manual del usuario del sistema de secuenciación de proteína modelo 473A (1989) o "manual del usuario, sistema de secuenciación de proteína Procise™" (1994), Applied Biosystems).
Los reactivos para el funcionamiento del secuenciador y la columna de HPLC para la detección de PTH se adquirieron en Applied Biosystems.
Los análisis de HPLC se llevaron a cabo con un sistema HPLC HP1090 o HP1100 de Hewlett Packard. Se usaron columnas de HPLC RP-18 (250 mm x 4,6 mm, material de 5 \mum, diámetro de poro de 300 angstrom) de Backerbond o Macherey & Nagel para las separaciones.
La electroforesis capilar modelo 270A-HT era de Applied Biosystems. Generalmente, las muestras de inyectaron hidrodinámicamente a distintos intervalos de tiempo. La columna capilar usada (50 \mum x 72 cm) era de Applied Biosystems.
Se llevaron a cabo los análisis de aminoácidos con un analizador de aminoácidos LC3000 de Eppendorf Biotronik. Se usó un programa de separación estándar ligeramente modificado de Eppendorf/Biotronik. Los programas de separación y la función del analizador se describen detalladamente en el manual del aparato.
Se determinaron los pesos moleculares con un sistema MALDI I de Kratos/Shimadzu. Se llevaron a cabo las electroforesis con SDS con un sistema de electroforesis de Pharmacia.
Se llevó a cabo la cromatografía de exclusión molecular con un sistema de HPLC de DIONEX, modelo DX-500. Se usó una columna GPC Superdex 75 de Pharmacia.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de un vector de expresión de levadura para la secreción de interleucina-8 TVR
Como material de partida para la preparación de interleucina-8 TVR (secuencia 1), sirvió un ADNc de interleucina-8 humana sintético (BBG44 de British Biotechnology Products Ltd.), que se clonó después de la inserción de un sitio de escisión KexII mediante las enzimas de restricción HindIII y BamHI en el vector pA228 (Apeler y col., patente de EE.UU. nº 5.707.831). En el vector pES22.9.H resultante, la secuencia de aprotinina Arg15 está sustituida por la secuencia de interleucina-8 (secuencia 2).
El intercambio de la secuencia que codifica ELR en la zona 5' del gen por una secuencia que codifica TVR se efectuó con ayuda de la técnica de PCR usando el cebador A y B a partir de ADN del plásmido pES22.9.H.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador A tenía la siguiente secuencia:
5'-GGAAGCTTGGATAAAAGAAGTGCTAAAACTGTCAGATGTCAATGCATAAAG-3' (secuencia 3). La secuencia de reconocimiento de HindIII está subrayada y los codones para los aminoácidos TVR están marcados en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'- CTTCTGTTCGGAGATTACCG-3' (secuencia 4). Este cebador se une a la zona de terminador de la transcripción del vector.
La preparación de PCR contenía aproximadamente 200 ng de ADN del plásmido pES22.9.H, cebador A 0,2 \muM, cebador B 0,2 \muM, dNTP 200 \muM, tampón de reacción PCR x 1 (Stratagene, Opti-Prime™) y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer) en un volumen total de 50 \mul. Las condiciones del "ciclo" fueron: 3 min a 94ºC, 30 ciclos respectivamente de 1,5 min a 94ºC, 1,5 min a 55ºC y 1,5 min a 72ºC, y una incubación posterior de 5 min a 72ºC. La preparación de PCR se diluyó 1:4 y se ligó con el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen). Se transformaron células TOP10 de E. coli (Invitrogen) con la preparación de ligamiento. Se identificaron los clones positivos después de una digestión de restricción con las enzimas HindIII y BamHI y se secuenciaron varios clones. El clon pIU13.10.P contenía la secuencia deseada (secuencia 5) y se usó para los trabajos posteriores.
Se usó el vector basculante de E. coli/levadura pA202 para la construcción de un vector de secreción de levadura en el que la secuencia de interleucina-8 TVR está ligada con la secuencia prepro del factor alfa de levadura. El vector pA202 porta un gen de resistencia a la ampicilina (bla) y un gen URA3 como genes marcadores detectables para E. coli y levadura. Son otros elementos esenciales del vector los orígenes de replicación Col E1 y 2 \mu (ori). El locus REP3 se encuentra igualmente en esta región. Un fragmento de EcoRI-HindIII de 1.200 pb de tamaño porta el promotor MF\alpha1 y la secuencia prepro N-terminal de la proteína precursora de factor alfa de levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982). Un fragmento BamHI-SalI del gen de levadura URA3 funciona como señal de terminación para la transcripción (Yarger y col., Mol. Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
Mediante la introducción de un ADNc de interleucina-8 TVR modificado como fragmento HindIII-BamHI, se prepara de nuevo el sitio de reconocimiento para la proteasa KexII ("Lys-Arg") dentro de la secuencia prepro del factor alfa (documento WO 98/56916).
Se escindió un fragmento de ADN de aproximadamente 240 pb de tamaño con HindIII y BamHI a partir del vector pIU13.10.P, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el vector pA202 cortado y desfosforilado igualmente con HindIII y BamHI. Mediante esta clonación, se sustituyó la DesPro2-Arg15-aprotinina en el vector pA202 por interleucina-8 TVR. Se transformaron las células de levadura (JC34.4D) con el vector pIU11.11.P resultante de la clonación.
Pueden prepararse de modo similar otros vectores basculantes de E. coli/levadura con distintos promotores como, por ejemplo, el promotor constitutivo GAPDH o el inducible GAL10, y conducen igualmente a la secreción de interleucina-8 TVR.
Además, por supuesto es posible usar vectores basculantes con otros orígenes de replicación de levadura como, por ejemplo, el segmento replicante autónomo cromosómico (ars).
Son genes marcadores detectables adecuados, además del gen URA3, aquellos genes que restituyen a un mutante de levadura auxotrófico la prototrofia como, por ejemplo, los genes LEU2, HIS3 o TRP1. Además, pueden usarse por supuesto también genes cuyos productos confieran resistencia frente a distintos antibióticos como, por ejemplo, el aminoglucósido G418.
Otras levaduras como, por ejemplo, las levaduras metilotróficas Pichia pastoris o Hansenula polymorpha, están en disposición de producir igualmente interleucina-8 TVR después de transformación con vectores adecuados.
Ejemplo 2 Preparación de un vector de expresión de levadura para la secreción de interleucina-8 DLQ
Como material de partida para la preparación de interleucina-8 DLQ (secuencia 6) sirvió un ADNc de interleucina-8 humana sintético (BBG44 de British Biotechnology Products Ltd.), que se clonó en el vector pA228 (Apeler y col., patente de EE.UU. nº 5.707.831) después de inserción de un sitio de escisión KexII mediante las enzimas de restricción HindIII y BamHI. En el vector pES22.9.H resultante, la secuencia de aprotinina Arg15 está sustituida por la secuencia de interleucina-8 humana.
El intercambio de la secuencia que codifica ELR en la zona 5' del gen por una secuencia que codifica DLQ se realizó con ayuda de la técnica de PCR, usando los cebadores C y B a partir de ADN del plásmido pES22.9.H. El cebador C tenía la siguiente secuencia:
5'-GGAAGCTTGGATAAAAGAAGTGCTAAAGATTTGCAATGTCAATGCATAAAG-3' (secuencia 7)
La secuencia de reconocimiento de HindIII está subrayada y los codones para los aminoácidos DLQ están marcados en negrita. El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'-CTTCTGTTCGGAGATTACCG-3' (secuencia 4). Este cebador se une a la zona de terminador de la transcripción del vector.
La preparación de PCR contiene aproximadamente 200 ng de ADN del plásmido pES22.9.H, cebador C 0,2 \muM, cebador B 0,2 \muM, dNTP 200 \muM, tampón de reacción PCR x 1 (Stratagene, Opti-Prime™) y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer) en un volumen total de 50 \mul. Las condiciones de "ciclo" fueron: 3 min a 94ºC, 30 ciclos respectivamente de 1,5 min a 94ºC, 1,5 min a 55ºC y 1,5 min a 72ºC y a continuación una incubación de 5 min a 72ºC. La preparación de PCR se diluyó 1:4 y se ligó con el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen). Se transformaron células TOP10 de E. coli (Invitrogen) con la preparación de ligamiento. Se identificaron los clones positivos después de una digestión de restricción con las enzimas HindIII y BamHI y se secuenciaron varios clones. El clon pIU14.10.P contenía la secuencia deseada (secuencia 8) y se usó para los trabajos posteriores.
El vector basculante E. coli/levadura pA202 se usó para la construcción de un vector de secreción de levadura en el que la secuencia de interleucina-8 DLQ está ligada con la secuencia prepro del factor alfa de levadura.
El vector A202 porta un gen de resistencia a ampicilina (bla) y un gen URA3 como genes marcadores detectables para E. coli y levadura. Son otros elementos esenciales del vector los orígenes de replicación Col E1 y 2 \mu (ori). El locus REP3 se encuentra igualmente en esta región. Un fragmento EcoRI-HindIII de 1.200 pb de tamaño porta el promotor MF\alpha1 y la secuencia prepro N-terminal de la proteína precursora de factor alfa de levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982). Un fragmento BamHI-SalI del gen URA3 de levadura funciona como señal de terminación para la transcripción (Yarger y col., Mol. Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
Mediante la introducción de un ADNc de interleucina-8 DLQ modificado como fragmento HindIII-BamHI, se prepara de nuevo el sitio de reconocimiento para la proteasa KexII ("Lys-Arg") dentro de la secuencia prepro del factor alfa (documento WO 98/56916).
Se escindió un fragmento de ADN de aproximadamente 240 pb de tamaño con HindIII y BamHI a partir del vector pIU14.10.P, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el vector pA202 cortado y desfosforilado igualmente con HindIII y BamHI. Mediante esta clonación, se sustituyó la DesPro2-Arg15-aprotinina en el vector pA202 por interleucina-8 DLQ. Se transformaron las células de levadura (JC34.4D) con el vector pIU9.11.P resultante de la clonación.
Pueden prepararse de modo similar otros vectores basculantes de E. coli/levadura con distintos promotores como, por ejemplo, el promotor constitutivo GAPDH o el inducible GAL10, y conducen igualmente a la secreción de interleucina-8 DLQ. Además, por supuesto es posible usar también vectores basculantes con otros orígenes de replicación de levadura como, por ejemplo, el segmento replicante autónomo cromosómico (ars).
Son genes marcadores detectables adecuados, además del gen URA3, aquellos genes que restituyen a un mutante de levadura auxotrófico la prototrofia como, por ejemplo, los genes LEU2, HIS3 o TRP1. Además, pueden usarse por supuesto también genes cuyos productos confieran resistencia frente a distintos antibióticos como, por ejemplo, el aminoglucósido G418.
Otras levaduras como, por ejemplo, las levaduras metilotróficas Pichia pastoris o Hansenula polymorpha, están en disposición de producir igualmente interleucina-8 DLQ después de transformación con vectores adecuados.
Ejemplo 3 Preparación de un vector de expresión de levadura para la secreción de interleucina-8 Y13H
Como material de partida para la preparación de interleucina-8 Y13H (secuencia 9) sirvió un ADNc de interleucina-8 humana sintético (BBG44 de British Biotechnology Products Ltd.), que se clonó después de inserción de un sitio de corte KexII mediante las enzimas de restricción HindIII y BamHI en el vector pA228 (Apeler y col, patente de EE.UU. nº 5.707.831). En el vector pES22.9.H resultante está sustituida la secuencia de aprotinina Arg15 por la secuencia de interleucina-8 humana.
La introducción de la mutación Y13H en la secuencia de interleucina-8 se realizó con ayuda de la técnica de PCR usando los cebadores D y B a partir de ADN del plásmido pES22.9.H.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador D tenía la siguiente secuencia:
5'-GGAAGCTTGGATAAAAGAAGTGCTAAAGAACTTAGATGTCAAT GCATAAAGACACATTCCAAACC
TTTCCAC-3' (secuencia 10). La secuencia de reconocimiento de HindIII está subrayada y el codón del intercambio Y13H está marcado en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'-CTTCTGTTCGGAGATTACCG-3' (secuencia 4). Este cebador se une en la zona de terminador de la transcripción del vector.
La preparación de PCR contenía aproximadamente 200 ng de ADN del plásmido pES22.9.H, cebador D 0,2 \muM, cebador B 0,2 \muM, dNTP 200 \muM, tampón de reacción PCR II x 1 (Perkin Elmer), MgCl_{2} 1 mM y 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer) en un volumen total de 100 l. Las condiciones del "ciclo" fueron: 3 min a 94ºC, 30 ciclos respectivamente de 1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC y 1 min a 72ºC, y a continuación una incubación de 5 min a 72ºC. Se diluyó la preparación de PCR 1:4 y se ligó con el vector pCR®2.1-TOPO (Invitrogen). Se transformaron células TOPO de E. coli (Invitrogen) con la preparación de ligamiento. Se identificaron los clones positivos después de una digestión de restricción con la enzima EcoRI y se secuenciaron varios clones. El clon pIU29.6.P contenía la secuencia deseada (secuencia 11) y se usó para los trabajos posteriores.
Se usó el vector basculante E. coli/levadura pA202 para la construcción de un vector de secreción de levadura en el que se liga la secuencia de interleucina-8 Y13H con la secuencia prepro de factor alfa de levadura.
El vector pA202 porta un gen de resistencia a ampicilina (bla) y un gen URA3 como genes marcadores detectables para E. coli y levadura. Son elementos esenciales adicionales del vector los orígenes de replicación Col E1 y 2 \mu (ori). El locus REP3 se encuentra igualmente en esta región. Un fragmento EcoRI-HindIII de 1.200 pb de tamaño porta el promotor MFA\alpha y la secuencia prepro N-terminal de la proteína precursora de factor alfa de levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982). Un fragmento BamHI-SalI del gen URA3 de levadura funciona como señal de terminación para la transcripción (Yarger y col., Mol. Cell. Biol. 6, 1095-1101, 1986).
Mediante la introducción de un ADNc de interleucina-8 Y13H modificado como fragmento HindIII-BamHI, se prepara de nuevo el sitio de reconocimiento para la proteasa KexII ("Lys-Arg") dentro de la secuencia prepro del factor alfa (documento WO 98/56916).
Se escindió un fragmento de ADN de aproximadamente 240 pb de tamaño con HindIII y BamHI a partir del vector pIU29.6.P, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el vector pA202 igualmente cortado y desfosforilado con HindIII y BamHI. Mediante esta clonación, se sustituye la DesPro2-Arg15-aprotinina en el vector pA202 por interleucina-8 Y13H. Se transformaron las células de levadura (JC34.4D) con el vector pIU16.7.P resultante de esta clonación.
Pueden prepararse de modo similar otros vectores basculantes de E. coli/levadura con distintos promotores como, por ejemplo, el promotor constitutivo GAPDH o el inducible GAL10, y conducen igualmente a la secreción de interleucina-8 Y13H.
Además, por supuesto es posible usar vectores basculantes con otros orígenes de replicación de levadura como, por ejemplo, el segmento replicante autónomo cromosómico (ars).
Son genes marcadores detectables adecuados, además del gen URA3, aquellos genes que restituyen a un mutante de levadura auxotrófico la prototrofia como, por ejemplo, los genes LEU2, HIS3 o TRP1. Además, pueden usarse por supuesto también genes cuyos productos confieran resistencia frente a distintos antibióticos como, por ejemplo, el aminoglucósido G418.
Otras levaduras como, por ejemplo, las levaduras metilotrófica Pichia pastoris o Hansenula polymorpha, están en disposición de producir igualmente interleucina-8 Y13H después de transformación con vectores adecuados.
Ejemplo 4 Purificación de muteínas de interleucina-8 humanas recombinantes
Se concentraron 10 l de sobrenadante de fermentación mediante ultrafiltración a través de una membrana de 5 kDa (tipo Omega, compañía Pall-Filtron) (1/7) y a continuación se retamponó mediante diafiltración en etanolamina 20 mM, pH 9,5 (tampón A). Se aplicó la preparación a una columna de cromatografía llenada con 40 ml de Q-Sepharose Big Beads (compañía Amersham-Pharmacia), que se había equilibrado antes con tampón A. Se lavó la columna con tampón A y a continuación se eluyó con tampón B (tampón A + NaCl 1 M) en gradiente por etapas. En la siguiente etapa, se mezcló la pasada en la que se había detectado la interleucina-8 con TFA al 0,1% y se bombeó a una columna Vydac C8 de 100 ml (Muder + Wochele), que se había equilibrado antes con 0,1% de TFA en agua (tampón C). Después de lavado con tampón C, se realizó la elución en gradiente lineal con 80% de ACN + 0,1% de TFA (tampón D). (Gradiente 0% de B a 100% de B en 6 volúmenes de columna, velocidad de flujo 20 ml/min, IL-8 y muteína eluyen aproximadamente a 44% de B). Se combinaron las fracciones en las que se detectó IL-8, se diluyeron con agua con 20% de ACN y se liofilizaron. Después de reconstituir el liofilizado con tampón C, se aplicó la disolución a una columna de fase inversa Source 15 de 100 ml (compañía Amersham-Pharmacia), que se había equilibrado antes con tampón C. Después de lavar con tampón C, se realizó la elución en gradiente lineal con tampón D. (Gradiente 0% de B a 100% de B en 9 volúmenes de columna, velocidad de flujo 27 ml/min, IL-8 y muteínas eluyen aproximadamente a 44% de B). Se combinaron las fracciones en las que se detectó IL-8, se diluyeron con agua con 20% de ACN y se liofilizaron.
Ejemplo 5 Análisis de secuencia N-terminal
Se cargaron 0,5 nmol de muteínas de interleucina-8 disueltas en agua en una lámina de secuenciador que se había preincubado con Polybren®. Se secuenciaron las proteínas con el ciclo de secuenciador normal. Se identificaron los PTH-aminoácidos mediante HPLC en línea con ayuda de un patrón de PTH 50 pmol.
Se secuenciaron las muteínas de interleucina-8 durante 4-20 etapas. La Fig. 1 muestra las secuencias proteicas determinadas. Son idénticas a las secuencias clonadas.
Fig. 1
Análisis de secuencia de muteínas de interleucina-8
Muteína de Secuencia N-terminal determinada
interleucina-8
Muteína de TVR Ser-Ala-Lys-Thr-Val-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys
Muteína de DLQ Ser-Ala-Lys-Asp-Leu-Gln-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys
Muteína de Y13H Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-His-Ser-Lys-
Ejemplo 6 Análisis de aminoácidos
El análisis de aminoácidos representa un parámetro cualitativo y cuantitativo importante para la caracterización de proteínas. Además del contenido de proteína, se determina con la estructura primaria conocida el número de aminoácidos individuales. El análisis de aminoácidos de muteínas de interleucina-8 está en buena coincidencia con los valores teóricos de la estructura primar (Tab. 1).
Se disolvieron 100 \mug de muteína de interleucina-8 en 200 \mul de HCl 6 N y se hidrolizaron durante 1 h a 166ºC. Se añadió aproximadamente 1 nmol de muestra al analizador de aminoácidos. Se determinó la cantidad de aminoácido mediante un patrón de aminoácidos 4 nmol.
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TABLA 1 Análisis de aminoácidos de muteína IL-8 TVR, DLQ e Y13H. Los números enteros se refieren a Phe= 3, Ala= 3 o Asx= 5
Aminoácido IL-8 TVR Valor teórico IL-8 DLQ Valor teórico IL-8 Y13H Valor teórico
CysSO_{3}H+ 4,00 4 4,00 4 4,01 4
Asx 5,18 5 5,70 6 5,00 5
Thr 2,85 3 1,95 2 2,22 2
Ser 4,07 5 3,75 5 4,21 5
Glx 8,71 9 9,37 10 9,76 10
Gly 2,16 2 2,01 2 2,19 2
Ala 3,00 3 3,10 3 3,12 3
Val 5,50 6 4,70 5 4,71 5
Met - - - - - -
Ile 4,32 5 4,15 5 4,33 5
Leu 5,18 5 5,83 6 6,02 6
Tyr 1,32 1 1,41 1 - -
Phe 3,01 3 3,00 3 2,98 3
His 1,84 2 1,77 2 2,75 3
Lys 8,58 9 8,63 9 8,84 9
Arg 4,64 5 3,79 4 4,69 5
Pro 4,17 4 4,18 4 4,12 4
Trp n.d. 1 n.d. 1 n.d. 1
* La cisteína se determinó según la oxidación del ácido perfórmico.
Ejemplo 7 Determinación del peso molecular
Se analizó aproximadamente 1 \mug de muteína de interleucina-8 con la técnica MALDI. Se usó como matriz ácido sinapínico. Las proteínas patrón para la calibración de la masa fueron insulina bovina, citocromo C y melitina.
El peso molecular determinado está a este respecto en buena coincidencia con el valor teórico de las muteínas respectivas en el marco de precisión de los procedimientos de medida. La Tabla 2 muestra los pesos moleculares determinados en comparación con los valores teóricos.
TABLA 2 Pesos moleculares de las muteínas IL-8 purificadas y de IL-8 natural
Muteína de interleucina-8 Peso molecular en Da Peso molecular teórico en Da
IL-8 TVR 8.342 \pm 4 8.343
IL-8 DLQ 8.342 \pm 3 8.343
IL-8 Y13H 8.355 \pm 4 8.359
IL-8 natural (forma Met) 8.521 \pm 4 8.517
Ejemplo 8 Electroforesis en gel-SDS
Se analizaron las muteínas de interleucina-8 TVR, DLQ, Y13H y la forma met de IL-8 natural mediante electroforesis SDS en condiciones reductoras y no reductoras. La electroforesis en gel-SDS se llevó a cabo según las condiciones de Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970). Se separaron las muteínas de interleucina-8 en un gel SDS al 10-20% y se tiñeron mediante azul brillante de Coomasie R-250 o tinción de plata (Merril y col., Anal. Biochem. 110, 210-207, 1981). En el caso de tinción con azul de Coomasie, se usaron aproximadamente 30 \mug y en tinción con plata aproximadamente 5 \mug.
En los geles SDS, las muteínas de IL-8 y la natural migran como bandas individuales de aproximadamente 9 kDa.
Ejemplo 9 Electroforesis capilar
La electroforesis capilar permite la separación de péptidos y proteínas debido a su carga en campo eléctrico. La calidad de la separación depende a este respecto del tampón, del valor de pH, de la temperatura y de los aditivos usados. Como capilares se usan las denominadas columnas de "sílice fundida" con un diámetro interno de 50-100 \mum. Las muteínas de interleucina-8 se separan en una columna de "sílice fundida" en campo eléctrico. Se examinaron aproximadamente 8 ng de muteína de interleucina-8 en una columna de vidrio (longitud 72 cm, diámetro interno 50 \mum). Condiciones: intensidad de corriente: 90 \muA, temperatura de columna: 25ºC, tampón fosfato 100 mM, pH 3,0, detección: 210 nm, alimentación a presión 3 s.
En el electroforegrama, las muteínas de interleucina-8 eluyen en forma de un pico principal con un tiempo de retención de aproximadamente 10 min.
Ejemplo 10 Cromatografía en fase inversa
En la cromatografía HPLC de proteínas unidas químicamente a fases inversas, se llega mediante un efecto de intercambio hidrófobo de las proteínas a un enlace a la fase usada. Las proteínas se desplazan correspondientemente a la fuerza de su enlace a la fase estacionaria de disolventes orgánicos (fase móvil).
Por esta razón, este procedimiento es un buen criterio para la evaluación de la pureza de una proteína.
Se purificaron por cromatografía aproximadamente 3 nmol de muteínas de interleucina-8 en una columna de HPLC Nucleosil RP-18 (material de 5 \mum, 4,6 mm x 250 mm, 300 angstrom de tamaño de poro). Se usó como eluyente un gradiente de acetonitrilo/TFA. Condiciones: flujo 0,7 ml/min, temperatura de columna 40ºC, detección 210 nm, disolvente A 0,1% de TFA, disolvente B 0,1% de TFA/60% de acetonitrilo, gradiente: 0 min 0% de B, 10 min 0% de B, 70 min 100% de B, 80 min 0% de B.
Las muteínas de interleucina-8 eluyen en forma de pico de la fase RP-18 con tiempos de retención de aproximadamente 52 min (IL-8 TVR), aproximadamente 53 min (IL-8 DLQ), aproximadamente 52 min (IL-8 natural-Met) y aproximadamente 52 min (IL-8 Y13H).
Ejemplo 11 Cromatografía de exclusión molecular
Se purificaron por cromatografía aproximadamente 50 \mug de muteínas de interleucina-8 TVR, DLQ e Y13H mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna Superdex 75. Se usó como tampón NaCl 600 mM/Na_{2}
HPO_{4} 50 mM, pH 7,0, flujo 0,5 ml/min, detección 215 nm, temperatura ambiente. Como proteínas patrón para la calibración del peso molecular de la columna se usaron albúmina bovina, ovoalbúmina, anhidrasa carbónica, mioglobina, citocromo C, aprotinina y tirosina.
Las muteínas de interleucina-8 eluyen con un tiempo de retención de aproximadamente 25 minutos. Esto corresponde a un peso molecular relativo (según la calibración de la columna con proteínas globulares) de aproximadamente 17 kDa en disolución. Las muteínas de IL-8 se presentan en la disolución usada en forma de dímeros.
<110> Bayer AG
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<120> Procedimiento para la preparación de interleucina-8 y muteínas de interleucina-8 recombinantes
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Proc. para la preparación de IL-8
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<140>
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<141>
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<160> 11
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<170> PatentIn vers. 2.0
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<210> 1
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<211> 72
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 1
1 
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<210> 2
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<211> 244
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 2
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2 
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<210> 3
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<211> 51
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaagcttgg ataaaagaag tgctaaaact gtcagataaa g 
\hfill
51 
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<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> humano
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cttctgttcg gagattaccg 
\hfill
20 
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<210> 8
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<400> 11
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8 
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Claims (2)

1. Uso de IL-8 Y13H en preparaciones de detección sistemática para encontrar antagonistas de IL-8 de bajo y alto peso molecular de los receptores CXCR1 y CXCR2 de IL-8.
2. Uso de muteínas de IL-8 más débilmente afines en comparación con IL-8 natural en preparaciones de detección sistemática para encontrar antagonistas de IL-8 de bajo y alto peso molecular de los receptores CXCR1 y CXCR2 de IL-8.
ES00974439T 1999-11-02 2000-10-23 Procedimiento para la preparacion de interleucina-8 y muteinas de interleucina-8 recombinantes y su uso para encontrar antagonistas de receptores de il-8. Expired - Lifetime ES2265997T3 (es)

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