ES2265671T3 - Produccion de proteinas en plantas de alfalfa transgenicas. - Google Patents

Abstract

Un método para la producción estable de una proteína extraíble que comprende: a) crecimiento de al menos un genotipo de alfalfa transformado para que produzca dicha proteína, dicho genotipo: (i) siendo perenne; (ii) exhibiendo un potencial embriogénico de al menos un callo embrionario por 20 discos de hojas u otros tejidos del explante; y (iii) exhibiendo una estabilidad de la concentración proteica del 100% de la proteína extraíble sobre por lo menos 1 hora en extractos hechos de dicho genotipo, dicho genotipo de alfalfa transformada que expresa dicha proteína extraíble; y b) extracción de dicha proteína a partir de tejidos de dicha planta.

Description

Producción de proteínas en plantas de alfalfa transgénicas.

La presente invención se relaciona con la producción de proteínas transgénicas en plantas de alfalfa. Más específicamente esta invención se relaciona con la producción de proteínas multiméricas dentro de plantas de alfalfa transgénicas para emplear en un rango de aplicaciones tales como ensayos de diagnóstico.

Antecedentes de la invención

Las citaciones completas de las referencias aparecen al final de la sección de ejemplos.

El empleo de las proteínas para utilizar en un rango de aplicaciones relacionadas farmacéuticamente es sujeto a los estrictos requerimientos regulatorios establecidos por el estado. Por ejemplo, en el U.S, the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) se publica un conjunto de documentos que perfilan los requerimientos relativos a la producción y el monitoreo de las proteínas producidas transgénicamente (ver fttp://www.fda.gov/cber/cberftp/html), un conjunto de regulaciones similares se relacionan con la producción y el uso de biológicos en Canadá. Los documentos CBER indican que un biológico se produce a partir de una fuente confiable y continua, con el fin de asegurar que se obtiene un producto consistente (ftp://ftp.fda.gov/cber/ptc/ptc_mab.txt). Esto es porque el producto se debe probar extensivamente y verificar previo a su aprobación para emplear, y estar disponible en la misma forma para futuras ventas. Existen sistemas de expresión establecidos adecuadamente para la producción de un biológico incluyendo bancos de células maestros para cultivo celular, bancos de semillas para plantas transgénicas, existencias de semillas de virus para sistemas de expresión transgénica, e implantes de cepas para animales transgénicos. Vectores maestros de semillas stocks se pueden generar por el uso de sistemas de expresión transitorios, con la estabilidad de las construcciones de expresión probadas rutinariamente. Si una proteína tal como un anticuerpo monoclonal debe ser producida a partir de una línea celular, la documentación relativa a la caracterización de la línea celular madre, los protocolos de producción, purificación y control de calidad de células se requieren del banco de células maestro y el banco de células de trabajo. Cualquier cambio en la fabricación o formulación, especialmente si se inician pruebas clínicas, requiere de una extensa re-caracterización de los bancos de células de trabajo y maestro y del producto, ya que estos cambios pueden resultar en cambios significantes de la actividad biológica. Esto se ha indicado dentro del documento CBER "Points to Consider in the Manufacture and Testing Monoclonal Antibody Productos for Human Use" (February, 28, 1997), donde se recomienda que el material empleado en los estudios pre-clínicos sea fabricado utilizando los mismos procedimientos como los empleados o pretendidos para usar en la fabricación de material para pruebas clínicas''. Adicionalmente, si en cualquier escala de arriba debe tener lugar, por ejemplo para estudios de Fase 2, "que la equivalencia de ese producto tendría que ser demostrada... [La cual] puede o no requerir estudios clínicos adicionales" (ftp://ftp.fda.gov/cber/ptc/ptc_mab.txt).

Las plantas han sido utilizadas para la producción de proteínas transgénicas, sin embargo, las mismas consideraciones que aplican para el mantenimiento de líneas celulares maestro como se discutió anteriormente, aplican a la planta equivalente (ver Miele, 1997). Los bancos de semillas para plantas transgénicas requieren amplificación periódica ya que las semillas no pueden ser almacenadas indefinidamente. El almacenamiento de semillas stocks debe reducir el daño genético potencial del trasgen de interés. Cualquier otro factor que pueda afectar el banco de semillas también debe ser controlado incluyendo la contaminación de la semilla por insectos, hongos o bacterias. Adicionalmente, la estabilidad del trasgen deberá ser determinada, así como los niveles del producto de expresión en plantas representativas de un lote de semillas dado, o entre lotes de semillas siguiendo la reamplificación del banco de semillas. Los datos adicionales también pueden ser requeridos para que comparen el producto preparado a partir de diferentes bancos de semillas. Esta última caracterización también aplica al año a las variaciones del año en las semillas stocks cosechados. En general el producto desarrollado requiere el monitoreo constante de las propiedades bioquímicas y biológicas del producto transgénico (Miele, 1997). Cuando estos criterios son acoplados a sistemas de plantas para la producción de proteínas multiméricas el problema se combina, ya que, para producir semillas híbridas capaces de producir proteínas multiméricas, las plantas transgénicas obtenidas a partir de lotes de semillas homólogos, que requieren re-amplificación y mantenimiento como se bosqueja abajo, necesitan ser cruzadas para producir la semilla híbrida final, que nuevamente será mantenida como se define arriba. Claramente una fuente alterna de proteína transgénica que es estable, y resulta en un continuo suministro de proteína sin necesitar del mantenimiento extensivo de los múltiples del banco de semillas se requiere.

La preparación de proteínas transgénicas con plantas se establece adecuadamente dentro de la literatura y varios sistemas de transformación exitosos han sido establecidos. Por ejemplo, las proteínas multiméricas han sido preparadas a través del cruzamiento sexual de la progenie de plantas de tabaco (Hiatt 1990, Hiatt and Pinney, 1992; Ma et al 1995), sin embargo, todas las fuentes de plantas para los datos que han sido empleadas para la producción de la proteína transgénica para aplicaciones farmacéuticas han utilizado plantas anuales. Esta necesita la constante reamplificación y re-verificación del banco de semillas stock según lo descrito arriba. Claramente si una especie de planta perenne se utiliza para la generación de proteínas transgénicas, los costos de mantenimiento global, y la variabilidad lote a lote serían reducidos grandemente. Adicionalmente, si las estructuras vegetativas de la planta perenne se cosechan como una fuente de la proteína transgénica, los requisitos reguladores se reducen aún más. Para asegurar la producción de una fuente perenne de la proteína transgénica muchos factores deben tenerse en cuenta, aquellos relacionados con los requisitos antedichos relativos a la consistencia y fiabilidad del producto derivado a partir de una fuente continua y estable.

Uno de los reactivos más importantes del grupo sanguíneo es el reactivo IgG anti-humano utilizado para la detección de anticuerpos no-aglutinantes. Ratones mAbs con apropiada especificidad IgG anti-humana han sido obtenidos y está reemplazando gradualmente el conejo policlonal IgG anti-humano utilizado tradicionalmente en los reactivos de Coombs (St Laurent et al 1993). Estos mAbs se producen mediante cultivos a gran escala de hibridomas de células B. Mientras que es confiable, este proceso es cotoso debido a la necesidad de equipo sofisticado, de medios de cultivo costosos y del personal entrenado. En comparación con otras aplicaciones de diagnóstico de mAbs, la comercialización para las proteínas empleadas en las pruebas del banco de sangre es altamente competitiva; por lo tanto, los precios para las proteínas son relativamente bajos y

\hbox{la rentabilidad de la 
producción de mAb se ha convertido en un tópico crítico.}

El aislamiento de los clones de cADN que codifican las cadenas livianas y pesadas de mAbs ha permitido la expresión de genes de anticuerpos en varios sistemas heterólogos que incluyen bacteria, hongos, células de insecto, plantas y células de mamífero no-linfoide (Wang et al 1995; Wright et al 1992.). Entre estos sistemas, las plantas aparecen por ser uno de los más prometedores por rentabilidad. Sin embargo, siguiendo la demostración inicial en tabaco, llega a ser importante encontrar plantas de la cosecha en las cuales esta tecnología se podría traer para hacer frente a las demandas actuales para la comerciabilidad. Hiatt et al (WO 96/21012, published July 11, 1996) revela métodos para, y la preparación de inmunoglobulinas terapéuticas ("proteínas de protección"), para emplear contra patógenos mucosales, en plantas. En EP 0 657 538, Galeffi y Natali revela la producción de anticuerpos para usos terapéuticos o de diagnostico que reconoce el oncogén HER-2 presente en tumores de mama y de ovarios. Es importante encontrar cultivos de plantas en los cuales las proteínas recombinantes pueden ser producidas y que pueden afrontar demandas actuales para la comerciabilidad. Estas demandas no incluyen únicamente competitividad de costos de producción, pero también fiabilidad, lo que implica a menos que se pueda establecer suministros estables a largo plazo de la molécula recombinante purificada, los medios de garantizar que la perennidad del material fuente homologado a partir del cual la población clónica se puede derivar debe ser desarrollada. Para hibridomas de células B, la perennidad se asegura mediante el establecimiento de un banco de células maestro, que consiste de alícuotas de células tomadas a partir de combinaciones homogéneas y crío preservadas en nitrógeno líquido. Hiatt (1990) sugiere que la alfalfa, soja, tomate y patata pueden ser alternativas útiles como huéspedes para la propagación de anticuerpos. La alfalfa es una de las plantas de biomasa más barata para producir en agro-ecosistemas corrientes y su perennidad en la mayoría de las condiciones climáticas hace de esta, un cultivo atractivo para la agricultura sostenible. Adicionalmente, la alfalfa (Medicago sativa L.) no requiere siembra y arado anual, y el empleo de tejidos de planta residuales para pienso de animales se establece adecuadamente (Austin y Bingham, 1997). Sin embargo, muchos estudios han examinado el grado de proteólisis en especies de forrajes ensiladas, y se sabe que la proteólisis es más extensa en especies de forrajes de legumbres que en especies de hierbas, con la alfalfa que exhibe el índice y el rango de proteólisis más alto (Jones et al, 1995; Papadopoulos and McKersie, 1983). Adicionalmente, es conocido dentro del oficio que no todas las plantas de alfalfa son perennes, y de las plantas de alfalfa perennes no todas son sensibles a los protocolos de transformación (Desgagnés, 1995).

La estabilidad de las proteínas transgénicas dentro de los tejidos de la planta, y sobre su extracción ha sido de interés en la literatura. Sin embargo, poco se sabe acerca de la estabilidad del anticuerpo en sistemas celulares de plantas (Wongsamuth y Doran, 1997). Muchos trabajadores (Hiatt et al (1989), During et al (1990), Ma et al (1995), Ma y Hein (1995), Schouten (1996)) han observado que las construcciones quiméricas que contienen secuencias de señal para dirigir la inserción co-translacional de las construcciones dentro del retículo endoplasmático incrementan la estabilidad de las construcciones dentro de las plantas transgénicas. En la ausencia de secuencias líder, la proteína transgénica recuperada es muy baja (Hiatt et al, 1989). Es una práctica general incluir inhibidores de proteasa dentro de cócteles de extracción con el fin de maximizar la recuperación de proteína a partir de tejidos de plantas transgénicas. Sin embargo, la producción comercial de proteínas transgénicas a partir de plantas requiere simplicidad. Por ejemplo, Austin y Bingham (1997) revisaron a gran escala protocolos de maceración y extracción de jugos en el sitio de campo con un procedimiento final que tiene lugar en un proceso de la planta muchas horas después. Tales protocolos emplean el uso de agua y maceración mecánica y sería impráctico si la proteólisis dentro del extracto fuera de interés, o si los inhibidores de proteasa fueran requeridos durante la extracción. Esto es especialmente cierto para la aplicación de especies de alfalfa conocidas por exhibir altos índices de proteólisis, especialmente después de la cosecha (Jones et al 1995; Papadopoulos y McKersie 1983).

Un kg de mAb tiene un valor en el mercado actual de \textdollar1, 000,000 a \textdollar10, 000,000. Cuando los costos de producción se estiman por gm de C5-1 producido bajo condiciones de invernadero, incluyendo calentamiento, mano de obra y consumibles para la extracción y purificación, en unos 250 m^{2} con una producción esperada de 100 g por año, el costo por g de C5-1 estaría entre \textdollar500-\textdollar600, no obstante renta un valor de mercado de \textdollar400,000. Tales estimaciones demuestran que las proteínas recombinantes podrían ser producidas rentablemente en plantas, sin embargo, un sistema de plantas apropiado necesita ser establecido. Un aspecto de una modalidad de esta invención se dirige a la determinación de las características requerida para una línea de plantas transgénicas que puede emplearse para producir una proteína transgénica de interés que reúna muchos de los criterios establecidos dentro de las recomendaciones de CBER para un compuesto biológico.

Resumen de la invención

Esta invención se dirige a la producción de proteínas transgénicas en plantas de alfalfa.

En un primer aspecto la invención provee un método para la producción estable de una proteína extraíble que comprende:

a)

cultivo de al menos un genotipo transformado de alfalfa así como la producción de dicha proteína, de dicho genotipo:

(i)

siendo perenne;

(ii)

exhibiendo un potencial embriogénico de al menos un callo embrionario por 20 discos de hojas u otros tejidos del explante; y

(iii)

exhibiendo una estabilidad de concentración de proteína del 100% de la proteína extraíble durante al menos 1 hora en extractos hechos de dicho genotipo.

El citado genotipo transformado de alfalfa que expresa dicha proteína extraíble; y

b)

la extracción de dicha proteína a partir de tejidos de dicha planta.

De acuerdo con una modalidad de la invención la proteína extraíble es un anticuerpo monoclonal. Típicamente, en tales casos, la etapa b) del método anterior comprende el cultivo de una primera planta de alfalfa transformada con un vector que comprende un gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal para producir una primera planta de alfalfa transformada y el cultivo de una segunda planta de alfalfa transformada con un vector que comprende un gen que codifica la cadena liviana de dicho anticuerpo monoclonal para producir una segunda planta de alfalfa transformada. La primera planta de alfalfa transformada y la citada segunda planta de alfalfa transformada luego se pueden cruzar para producir al menos una planta de alfalfa transformada, en donde al menos una planta de alfalfa transformada exprese ambas la cadena pesada y la cadena liviana del anticuerpo monoclonal.

Esta invención también se dirige a las plantas de alfalfa transgénicas capaces de expresar proteínas multiméricas, biológicamente activas.

Aunque la actual invención se ilustra mediante la preparación de un anticuerpo monoclonal C5-1, en la práctica cualquier producto de interés puede ser preparado dentro de la alfalfa transformada siguiendo los protocolos de esta invención. Tiene ventajas utilizar un genotipo apropiado de alfalfa para la expresión de proteínas transgénicas que no han sido reveladas dentro del oficio anterior incluyen la estabilidad de proteínas entre:

1)

tejidos cosechados obtenidos de la planta y sobrantes secos al aire y almacenados antes de la extracción;

2)

extractos cosechados en agua a temperatura ambiente y en la ausencia de estabilizadores, inhibidores de proteasa, soluciones reguladoras, sales, antioxidantes, agentes reductores, estabilizadores u otros aditivos típicamente adicionados a cócteles de extracción para asegurar la estabilidad y actividad de la proteína;

3)

el mismo excedente de la planta repitió cosecha dentro de una estación de cultivo, y entre estaciones de cultivo y dentro

4)

propágulos clonales.

Adicionalmente, como la alfalfa es una planta perenne, capaz de propagación vegetativa, se puede obtener y cosechar material clonal sobre sustanciales a lo largo del tiempo abarcando muchas estaciones de cultivo. Esto asegura una fuente estable de las proteínas de interés dentro de la alfalfa transgénica. Tales características no se encuentran con otras plantas utilizadas típicamente para la producción de proteína transgénica que tienden a ser anuales incluyendo el tabaco, Arabidopsis, soja y maíz. Sin embargo, no todas las variedades de alfalfa son perennes, y muchas de las variedades que son perennes y de alto rendimiento (agronómicamente hablando) se conocen por ser recalcitrantes a los protocolos de transformación.

Esta invención utiliza apropiados genotipos de alfalfa, o propágulos derivados a partir del apropiado genotipo de alfalfa, para la producción de proteínas transgénicas que son útiles en los requisitos de aprobación de la reunión regulatoria para Biológicos. El apropiado genotipo de alfalfa se caracteriza por ser perenne, exhibiendo un potencial embriogénico, es transformable, y no degrada a la proteína transgénica así que la proteína es estable in vivo, en tejidos superficiales secos, así como durante los procedimientos de extracción. Adicionalmente, apropiados propágulos del genotipo de alfalfa incluyen propágulos derivados-clonalmente tales como tallo, o propágulos embrio-derivados.

Breve descripción de los dibujos

Estas y otras características de la invención llegaran a ser más claras a partir de la siguiente descripción en la cual la referencia se hace a los dibujos anexos, en donde:

Figura 1 muestra la expresión de cADNs C5-1 mAb en plantas de alfalfa transgénicas. Se separó, un total de ARN (15 \mug/por senda) aislado a partir de plantas transgénicas y control, sobre geles de agarosa formaldehído 1% y se transfirió sobre unas membranas de nilón Hybond-N. El tamaño de las transcripciones se muestra en kilobases. Los auto radiogramas se producen por exposición a -70ºC por 24 h. Figura 1A, Extractos a partir de plantas transformadas con pGA643-kappa se hibridizaron con una sonda de radiomarcación (600 bp) derivada a partir del cADN kappa. Las sendas 1,2 y 4 a 9 contienen extractos de ARN a partir de transgénicos; la senda 3 contiene ARN de un genotipo 11.9 transformado. Figura 1B, Extractos a partir de plantas transformadas con pGA643-gamma se hibridizaron con el cADN gamma radiomarcador total. Las sendas 1-5 contienen extractos de ARN a partir de transgénicas, la senda 6 contiene ARN a partir del 11.9 no-transformado. Figura 1C Extractos a partir de las plantas de la progenie se hibridizaron con una mezcla de la sonda kappa y la sonda gamma. Las sendas 1-5 y 7 contienen extractos de ARN a partir de transgénicos; la senda 6 contiene ARN a partir del 11.9 no-transformado.

Figura 2 muestra la expresión y el ensamble de los péptidos C5-1 en mono- y dual- plantas de alfalfa transgénicas. Las proteínas se extrajeron sin mercaptoetanol en la presencia de Tris-HCl (50 mM), PMSF (2 mM) y NaCl (150 mM). Se separaron por SDS PAGE y electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa. Los péptidos C5-1 se detectaron en las manchas mediante el uso de un IgG anti-ratón de conejo seguido por un IgG anti-conejo acoplado a una peróxidasa. La actividad de peróxidasa se detectó por quimiluminiscencia utilizando el kit de quimiluminiscencia BM Boehringer Manheim. Senda L: extracto de proteína a partir de una planta paternal que expresa el cADN kappa. Senda H: extracto de proteína a partir de una planta paterna que expresa el cADN gamma. Sendas F1: extractos de proteína a partir de la progenie F1 que expresa los cADN kappa y gamma. Senda Hyb: C5-1 mAb aislado a partir de células hibridoma.

Figura 3 muestra la purificación de C5-1 en la planta. El perfil de elusión, figura 3A, del C5-1 purificado a partir de cromatografía de afinidad de lecho-expandido (matriz STREAMLINE™-rProtein A). Cada fracción que contiene 1.5 mL del eluato a partir del cual se cargaron 20 \muL por senda, Figura 3B y se separó sobre SDS-PAGE en condiciones de no-desnaturalización y se tiño con azul de Coomassie.

Figura 4 muestra un Western blot del C5-1 de la proteína co-extraído en la presencia de hojas de alfalfa o tabaco. Dos gramos de tejido de hojas de alfalfa o tabaco se extrajeron en la presencia de 2 \mug de cultivo transgénico o hibridoma producidos de C5-1. Las extracciones se realizaron a 0ºC con 10 ml de agua, se centrifugaron a 20,000xg y se incubaron a 25ºC por hasta 3 horas antes del análisis Western para determinar la cantidad de C5-1 remanente dentro de la solución del extracto.

Figura 5 muestra el análisis de PAGE y Western blot de proteínas obtenidas a partir de porciones aéreas de una planta de alfalfa transgénica dual que expresa el C5-1 que se cortó y se dejó secar a temperatura ambiente por hasta cinco días. Igual cantidad de tejido cosechado se mantuvo a una humedad relativa del 20% por 0 h, 7 h, 1 día, 2 días, y 5 días antes de la extracción y la determinación de los perfiles de proteínas (figura 5A), y analizando para los niveles de C5-1 utilizando el análisis Western (figura 5B).

Figura 6 muestra la estabilidad de la planta-derivada (\bullet) y el C5-1 hibridoma-derivado (\circ) dentro de ratones sobre un periodo de un mes, siguiendo la inyección intravenosa. La detección se realiza con un ELISA contra IgG humano inmovilizado.

Descripción de la modalidad preferida

La presente invención se dirige a la producción de proteínas dentro de las plantas de alfalfa transgénicas.

De acuerdo con la presente invención, por "gen de interés" se entiende un gen que es capaz de codificar una proteína. Sin embargo, esta definición también aplica a los genes de interés para los cuales los productos traducidos y transcripcionales combinados dirigidos a la producción de una(s) proteína(s) multimérica(s) para utilizar como un biológico, tal como dentro de ensayos serológicos. Un gen de interés puede ser utilizado para transformar la alfalfa utilizando protocolos establecidos (por ejemplo Desgagnés et al, 1995). A pesar de la complejidad del genoma de alfalfa, los atributos adquiridos a través de la transferencia del gen Agrobacterium-mediado son estables y trasmitidos sexualmente siguiendo un patrón Mendeliano simple (Desgagnes et al, 1995). Esta característica es esencial para la producción de proteínas que incluyen proteínas multiméricas. Sin el deseo de limitar el tipo de proteínas que pueden ser producidas utilizando la presente de cualquier manera, un ejemplo de una proteína multimérica puede ser una mAb tal como C5-1. La producción y las propiedades de esta proteína se ilustran abajo.

Por "un promotor" se entiende la región de una secuencia active de ADN en la iniciación y regulación de la expresión de un gen bajo el control de la región promotora, según se entiende típicamente por alguien de habilidad en el oficio. Esta secuencia de ADN, usualmente corriente arriba (5') para la secuencia codificada de un gen estructural, los controles de la expresión de la región codificada mediante el suministro del reconocimiento por polimerasa de ARN y/o otros factores requeridos por la transcripción para iniciar en el sitio correcto.

Existen generalmente dos tipos de promotores, inducible y constitutivo. Un "promotor inducible" es un promotor que es capaz de activar la transcripción directa o indirectamente de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta para un inductor. En la ausencia de un inductor las secuencias de ADN o los genes no serán transcritos. Típicamente el factor de la proteína, que une específicamente para un promotor inducible para activar la transcripción, se presenta en una forma inactiva a partir de la cual luego es directa o indirectamente convertida en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, metabolito, regulador de crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos, o indirectamente a través de la acción de un patógeno o un agente de la enfermedad tal como un virus. Una célula de la planta que contiene un promotor inducible puede ser expuesta por un inductor mediante la aplicación externamente del inductor a la célula o a la planta tal como por vaporización, riego, calentamiento o métodos similares. Además, promotores inducibles incluyen tejidos de promotores específicos que hacen efecto en una manera de tejido específico para regular el gen de interés dentro de tejidos seleccionados de la planta. Los ejemplos de tales promotores de tejido específico incluyen promotores específicos semilla, flor o raíz según son conocidos en el campo.

Por "promotor constitutivo" se entiende un promotor que dirige la expresión de un gen durante todas las partes diversas de una planta y continuamente durante todo el desarrollo de la planta. Ejemplos de conocidos promotores constitutivos incluyen aquellos asociados con el transcrito 35S y el gen nopalina sintasa del Agrobacterium plásmidoTi.

Las construcciones génicas de la presente invención comprenden una región 3' no-traducida. Una región 3' no-traducida se refiere a aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar un procedimiento de mARN o expresión genética. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente por el efecto de la adición de rutas de ácido poliadenilico al final 3' del precursor mARN. Las señales de poliadenilación se reconoce comúnmente mediante la presencia de homología a la forma canónica 5' AATAAA-3' a pesar de que las variaciones no son atípicas. Ejemplos no-limitantes de regiones 3' apropiadas son las regiones 3' no-traducidas transcritas que contienen una señal de poliadenilación del tumor Agrobacterium que induce (Ti) a los genes del plásmido, tales como la nopalina sintasa (No genes) y genes de la planta tales como los genes de proteína de soja almacenada y el gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO).

Las construcciones génicas de la presente invención también puede incluir otros temas regulatorios opcionales tales como mejoradores, ya sea mejoradores de traducción o transcripción, según puedan ser requeridos. Estas regiones de mejoramiento son conocidas por personas expertas en el oficio, y pueden incluir, por ejemplo, la región de mejoramiento de la región regulatoria 35S, así como otros mejoradores obtenidos a partir de otras regiones regulatorias, y/o el codón de inciación ATG y las secuencias adyacentes. El codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación para asegurar la traducción de la secuencia total. Las señales del control de traducción y los codones de iniciación pueden ser a partir de una variedad de orígenes, natural y sintética. Las regiones de iniciación de traducción pueden estar provistas de la fuente de la región de iniciación transcripcional, o a partir del gen estructural. La secuencia también puede ser modificada a partir del promotor seleccionado para expresar el gen, y puede ser específicamente modificado para incrementar la traducción del mARN.

Para ayudar en la identificación de las células de planta transformadas, las construcciones de esta invención adicionalmente pueden ser manipuladas para incluir marcadores genéticos de la planta. Marcadores genéticos útiles incluyen, pero no limitan a, enzimas las cuales suministran resistencia a un antibiótico tal como gentamicina, higromicina, kanamimicina, y similares. De manera análoga, son útiles las enzimas que proporcionan la producción de un compuesto identificable por cambio de color tal como GUS (\beta-glucuronidasa), o por luminiscencia, tal como luciferasa.

Los métodos de la regeneración de todas las plantas a partir de células de plantas son conocidas en el oficio, y el método de obtención de plantas transformadas y regeneradas no es crítica para esta invención. En general, las células de plantas transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tales como antibióticos, donde los marcadores genéticos se utilizan para facilitar la identificación de células de plantas transformadas. Una vez que el callo se forma, la formación del embrión o de los brotes puede ser estimulada por el empleo de las hormonas de plantas apropiadas de acuerdo con métodos conocidos y los brotes transferidos al medio enraizado para la regeneración de las plantas. Las plantas luego pueden ser usadas para establecer generaciones repetitivas, ya sea semillas o utilizando técnicas de propagación vegetativa.

Las construcciones de la presente invención pueden ser introducidas dentro de las células de la planta utilizando los plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación de ADN directo, micro-inyección, electroporación, etc. Para revisión de tales técnicas ver por ejemplo Weissbach y Weissbach (1988) y Geierson y Corey (1988). La presente invención además incluye un vector apropiado que comprende la construcción del gen quimérico.

y regiones 5' relacionadas y 3' reguladoras involucradas en la expresión de dicha construcción del gen

Por "línea de alfalfa apropiada" o "genotipo de alfalfa apropiado" se entiende un genotipo o línea de alfalfa que es perenne, exhibe un potencial embriogénico (por ejemplo al menos 1 callo embriogénico por 20 discos de hoja u otros tejidos del explante), es transformable, y en el cual las proteínas transgénicas son estables siguiendo el criterio de estabilidad como se discute a través de este documento (ver también Ejemplo 3). No todos los genotipos de alfalfa o las líneas son perennes, y es conocido que muchos genotipos o líneas de alfalfa perennes son no-embriogénicos y no-transformables, o que estas propiedades pueden cambiar sobre la transformación (Desgagnes, 1995). Aún cuando las plantas de alfalfa aparecen deseables como una planta huésped debido a las ventajas descritas temprano, las plantas de alfalfa se conocen por exhibir una alta actividad de proteasa. En el hecho de las especies de forraje caracterizadas, forrajes de legumbres exhiben un grado de proteólisis más alto que en las especies de hierba, y la alfalfa exhibe el índice y el rango de proteólisis más alto de los forrajes de legumbres (Jones et al. 1995). Adicionalmente, se ha demostrado que las proteínas transgénicas en otras especies de plantas, tales como tabaco se degradan con facilidad por la actividad proteolítica endógena (por ejemplo Hiatt et al, 1989). Cuando se consideran estos dos factores en combinación, es totalmente inesperado que genotipos de alfalfa apropiados podrían ser aislados exhibiendo la propiedad de garantizar la estabilidad de la proteína transgénica. Por consiguiente, es importante determinar si alguna actividad proteolítica dentro de un genotipo de alfalfa adecuado está dirigida a una proteína transgénica de interés que se produce dentro de la planta. Con el fin de asegurar la actividad proteolítica aceptable, ciertos estándares mínimos se obtendrían. Estos estándares mínimos variarán según se requiera por las aplicaciones de las proteínas transgénicas de interés. Por ejemplo, si grandes cantidades de la proteína transgénica se requieren, la proteína sería estable en extractos acuosos, preferiblemente en la ausencia de cualquier componente adicionado tales como inhibidores de proteasa, u otros reactivos típicamente adicionados a las soluciones de extracción. También podría ser requerido que la proteína transgénica sea estable en el secado y tejidos cosechados secos, permitiendo cosechar la planta a gran
escala.

Genotipos o líneas de alfalfa adecuados se obtienen por selección de una librería de plantas de alfalfa para determinar aquellas que son perennes, luego de la selección estos genotipos o líneas seleccionados por el potencial embriogénico, seguidos por la selección de los genotipos o líneas por transformabilidad. Entonces estas plantas se transforman utilizando una proteína de interés y la estabilidad de la proteína en extractos crudos y se determina dentro de tejidos aéreos secos. Luego este es, opcionalmente, seguido por la etapa de verificación de la utilidad de la proteína transgénica para usar como un Biológico. Para los propósitos de la ilustración de la presente invención, un genotipo de alfalfa embriogénico, 11.9, se caracterizó, sin embargo otros genotipos también podrían haber sido empleados. Este genotipo se estableció por ser perenne, embriogénico, transformable, y como se indica abajo, exhibe actividad proteolítica insignificante contra las proteínas transgénicas. Sin embargo, debe ser entendido que este genotipo considerado como un ejemplo de genotipos o líneas de alfalfa posibles que podrían ser seleccionadas utilizando los criterios de arriba y su genotipo no quiere ser limitante en consideración a la aplicación del método de selección, o plantas obtenidas como un resultado de este protocolo de selección.

Con el fin de explorar los métodos rentables para la preparación de proteínas de interés que pueden ser usadas en reactivos, se consideró, la producción de proteínas transgénicas dentro de un genotipo o línea de alfalfa. Como el C5-1 mAb tiene comprobada su utilidad en serología de células rojas, las cadenas pesadas y livianas de C5-1 se clonaron a partir de una librería de cADNs de células hibridoma y colocadas bajo el control del promotor 35S antes de la transformación de plantas de alfalfa (ver Ejemplo 1). Sin embargo, debe ser entendido que esta mAb, y el uso del promotor 35S se proporcionan como un ejemplo de una construcción génica quimérica y una proteína que puede ser empleada y producida dentro de un genotipo o línea de alfalfa adecuada, respectivamente, y de ninguna manera, este ejemplo tiene la intención de ser limitante.

La expresión de C5-1 dentro de plantas de alfalfa transgénicas adecuadas se determina por medio de un análisis Northern (Figura 1) y Western (Figura 5) los que confirman que el gen era expresado en tejidos transgénicos. La mAb expresado transgénicamente fue estable en tejidos aéreos que se secaron a temperatura ambiente o bajo condiciones de campo durante un período de varios días según se determinó por Western blots de tejidos extraídos (Ejemplo 3, Figura 5). También esta mAb fue estable cuando se co-extrajo en la presencia de hojas de alfalfa, mientras la co-extracción de C5-1 con hojas de tabaco fue significativamente baja (Ejemplo 3, Figura 4). También se observaron resultados similares cuando otros anticuerpos se co-extraídos con alfalfa y se incubaron durante periodos de tiempo (ver Ejemplo 3, Tablas 1 y 2). Adicionalmente, el C5-1 derivado de la planta mostró la misma estabilidad como el C5-1 derivado de hibridoma cuando se inyecta vía intravenosa en ratones (Figura 6), indicando que un grado similar de protección se obtiene debido a la glicosilación con derivado de planta como es para la proteína derivada de hibridoma. Estas propiedades son importantes si la producción y la cosecha de las proteínas de interés a gran escala deben ser consideradas utilizando alfalfa, ya que tales procedimientos típicamente exponen tejidos cosechados a largos periodos de secado al aire y protocolos simples de extracción acuosa.

Estructuras vegetativas de algunas variedades de alfalfa son conocidas por exhibir bajos niveles de taninos (Morris y Robbins 1997). Sin desear ser unido por teoría, el mejoramiento de la estabilidad de proteínas dentro de extractos de tejidos de estas alfalfas puede ser un resultado de los niveles reducidos de fenólicos y taninos. Estas propiedades han sido encontradas para limitar el uso de alfalfa como un cultivo de forraje y las iniciativas se encaminan a incrementar el nivel de fenólicos dentro de esta planta con el fin de incrementar su eficacia como un pienso (Morris y Robbins 1997), sin embargo, estas propiedades pueden ser benéficas para los propósitos revelados por esta invención.

La purificación de C5-1 de la planta utilizando la cromatografía de afinidad del extracto crudo clarificado revelado bajo tinción con azul de Coomassie, para que la preparación final fuera libre de contaminantes (ver el Ejemplo 2). Es un avance significante de las metodologías reportadas previamente (por ejemplo During et al 1990). No había tampoco una pérdida evidente de C5-1 durante el proceso de purificación y de esa manera la producción a partir del C5-1 de la planta para C5-1 purificado, se estimó en más del 70%.

La inmunoreactividad del C5-1 derivado de planta purificado fue similar a su equivalente a partir de células hibridoma cuando se analizaron por ELISA y por ensayos de hemoaglutinación estandarizados. A pesar de que existen muchos tipos de ensamble en extractos crudos, el procedimiento de purificación revelado produce una forma H2L2 que es indistinguible en términos de respuestas de reactividad en pruebas serológicas como C5-1 derivado de hibridoma. Esto indica que el C5-1 de la planta podría utilizarse como una proteína de diagnóstico tan eficientemente como el C5-1 derivado de hibridoma.

Para la licencia de una proteína basada en mAb, las agencias reguladoras requieren que el material vivo empleado para la producción de mAb debe ser estable, para asegurar que la calidad y la producción de la molécula activa biológicamente no varía durante el tiempo (www.fda.gov/ cber/cberftp/html; Miele, 1997). La estabilidad del C5-1 entre los propágulos de la planta se examinó por la determinación de la concentración del C5-1 dentro de los regenerantes obtenidos a partir de dos genotipos de la progenie F 1 y la comparando estos niveles para aquellos dentro del material madre (ver Ejemplo 3). Estos resultados indican que las concentraciones del C5-1 dentro del tejido de la planta permanecen constantes entre los propágulos y aquellos tales como las líneas de alfalfa transgénica aparecen por ser una fuente estable de C5-1 mAb. Los genotipos con alto potencial embriogénico similar al 11.9 pueden ser inducidos in vitro para producir propágulos clonales en altos índices. Los propágulos pueden ser traídos en latencia, desecados a un contenido de agua del 15-20%, recubierto con un endosperma artificial y se almacenaron a -80ºC (McKersie and Bowley, 1993). Este material clonal puede ser conservado por años sin pérdidas significantes del potencial de germinación y de esta manera constituye un banco de células a partir del cual material idéntico al material vivo inicial puede ser recuperado para iniciar un nuevo ciclo de producción. También se contempla que otras fuentes de propágulos clonales, como serían conocidas por algún experto en el oficio, pueden usarse para la propagación continuada de un genotipo de alfalfa adecuado. Otras fuentes pueden incluir, pero no limitan a, embrión, tallo, u otras estructuras vegetativas capaces de ser propagadas.

Adicionalmente, como la alfalfa es una planta perenne y capaz de la propagación vegetativa, el material clonal se puede obtener y cosechar directamente a partir del campo sobre longitudes de tiempo sustanciales abarcando muchas estaciones de cultivo. Esto significa que una planta puede ser cosechada durante un periodo de 10 años o más. Esta capacidad regenerativa y la disponibilidad renovable del mismo material stock asegura una fuente consistente de las proteínas de interés dentro de la alfalfa transgénica. Tales capacidades y características no se encuentran dentro de otras plantas típicamente empleadas para la producción de proteínas transgénicas tales como tabaco, Arabidopsis, soja, maíz, o muchos genotipos o líneas de alfalfa.

La producción a gran escala del C5-1 mAb en alfalfa transgénica como aplicación comercial de la estrategia de planticuerpos es muy prometedora dado que esta representa una opción económica comparada a muchos sistemas heterólogos que incluyen otras plantas. Adicionalmente, el uso de un adecuado genotipo de alfalfa proporciona la habilidad para minimizar costos para la caracterización y el mantenimiento de poblaciones de bancos de células según se requiere para la aprobación y pruebas clínicas de Biológicos. También, la purificación del C5-1 mAb a partir de la alfalfa transgénica es similar a su purificación a partir del sobrenadante de hibridoma.

A la escala de campo, los soportes maduros de alfalfa contienen entre 1-3 x 10^{6} plantas individuales por hectárea; este establece el costo de producción estimado de propágulos clonales a ca \textdollar8,000. De acuerdo con nuestra valoración del contenido de anticuerpos en la alfalfa transgénica propagada (0.13-1.0% del total de proteínas solubles), la producción de una hectárea por año será de 500-1000 g. La alfalfa es un cultivo perenne y el rendimiento del campo para esta planta puede mantenerse por 3-4 años. Esto traería unos costos de producción de la materia prima de \textdollar3,000 por kg de mAb en una explotación a campo abierto. Los costos de producción de un kg de C5-1 mAb mediante cultivo celular de hibridoma convencional (aproximadamente 50 mg de C5-1 mAb/L) se estima aproximadamente 2 millones de dólares. Aún si la producción de anticuerpos de cultivos de hibridomas se incrementa por un factor de 20-40, los costos reducidos (aproximadamente 750,000 \textdollar/kg) serían significativamente más altos que el C5-1 derivado de
planta.

No hay hasta ahora reportes sobre la purificación a gran escala de mAbs a partir de una planta transgénica. Previos reportes sobre la purificación del mAbs derivado de planta mostraron que la purificación hacia la homogeneidad requiere de manipulaciones sofisticadas previo, y después de una cromatografía de afinidad (During et al 1990). El crecimiento en escala del proceso de purificación de esta invención se facilitó mediante el uso de cromatografía de adsorción de lecho expandido. Esta tecnología produce un péptido purificado a partir de un gran volumen de extractos purificados clarificados bruscamente dentro de un marco de tiempo reducido, y parece así abrir nuevos acercamientos a la reducción de los costos de purificación a partir de extractos coloidales.

Por otra parte, el reactivo Coombs se prepara con el sobrenadante no-purificado a partir de hibrodomas de cultivos celulares y de esta manera las preparaciones de plantas purificadas parcialmente podrían ser apropiadas para este diagnóstico si se observa la estabilidad prolongada a 4ºC.

Ejemplos

El siguiente método se derivó por la selección de un genotipo o línea de alfalfa apropiado para utilizar en la producción de una proteína transgénica de interés. Diferentes etapas de este método se describen en más detalle en los subsiguientes ejemplos. Este método involucra:

(a)

selección de una librería de genotipos de alfalfa para determinar genotipos o líneas que son perennes;

(b)

selección de los genotipos seleccionados o las líneas identificadas en (a) para potencial embriogénico;

(c)

selección de los genotipos seleccionados o las líneas identificadas en (b) para transformabilidad:

(d)

selección de los genotipos seleccionados o las líneas identificadas en (c) para la estabilidad de la proteína transgénica.

Material vegetal

Basado en la selección de una alfalfa perenne con potencial embriogénico, y transformabilidad, hemos identificado el genotipo 11.9 que se aisló a partir de una línea de reproducción comercial (Desganes et al, 1995). Además con el fin de asegurar la aplicabilidad de una planta seleccionada como un resultado del criterio de arriba, los experimentos se llevaron a cabo utilizando este genotipo como un sistema modelo para ilustrar la conveniencia de la presente invención. Sin embargo, el uso de este genotipo no debe ser considerado limitante de ninguna manera. El uso del 11.9 es por el propósito de ilustrar el protocolo de selección, y las propiedades de una planta seleccionada con propiedades deseables. Debe ser entendido que el protocolo de selección antedicho puede ser utilizado para la selección de otro genotipo o línea de alfalfas.

Cepas Bacterianas, vector binario

La cepa E. coli DH5\alpha se utilizó para la clonación de ADN. Las transformaciones de la planta se llevaron a cabo utilizando una cepa octopina desarmada de Agrobacterium tumefaciens (LBA4404). El vector de expresión binario de la planta pGA643 se empleo para la transferencia de ADN (An et al 1988).

Selección de líneas celulares del hibridoma C5-1

La líneas celulares del hibridoma se prepararon por fusión de células de mieloma de ratón SP2/0 con células de bazo de ratones Balb/c hiper-inmunizados con IgG humano. La línea celular del hibridoma C5-1 se seleccionó con base a la reactividad del sobrenadante contra glóbulos rojos sensibilizados débilmente según lo descrito previamente (St Laurent, et al. 1993).

Aislamiento de cADNs, sub-clonación y construcciones de ADN

Los cADNs de cadenas pesadas (H) y livianas (L) se clonaron a partir de una librería de cADNs célula hibridoma. Después de la adición de sitios de restricción apropiados los cADNs de longitud completa, incluyendo las secuencias líder no-traducidas 5' se subclonaron en pGA643 bajo el control transcripcional del promotor 35S para producir pGA643-gamma y pGA643-kappa. Estos cADNs están disponibles en Canadian Red Cross Society, Transfusion Dept., Sainte-Foy, Quebec.

Transformación, selección e intercruzamiento de la planta

pGA643-gamma y pGA643-kappa se introdujeron en A. tumefaciens y el T-ADN se transfirió dentro del genotipo 11.9 según lo descrito (Desgagnes et al 1995). Las plantas transgénicas que expresan los mARNs para las cadenas kappa y gamma se entrecruzaron sin emasculación. La progenie se seccionó por hibridización Northern y los dobles-transgénicos se analizaron por contenido de IgG mediante Western blotting.

Aislamiento de ARN y análisis Northern blot

El ARN total se aisló a partir de hojas de alfalfa transgénica y control según lo descrito (de Vries et al 1988). El ARN total (15 \mug/senda) se fraccionó sobre geles de agarosa 1% -formaldehído y se transfirió a membranas de Hybond-N-nilón. Las hibridizaciones se realizaron utilizando sondas de 32P-marcador que consisten de un fragmento EcoRI\Hinc II de 0.6 kb a partir del cADN kappa o la cadena gamma de cADN total.

Extracción e inmunodetección de proteínas

Un gramo de tejido de hojas se homogenizo en 5 mL de solución reguladora de extracción (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, SDS 1%, \beta-mercaptoetanol 1%,) y arena de mar. El tejido homogenizado se filtró a través de una capa de Miracloth y se aclaro por centrifugación (20,000 g, 20 min). Para los estudios de estabilidad, las homogenizaciones y las clarificaciones se realizaron en agua destilada y los extractos llevaron a neutralidad mediante la adición de 25 \mug de NaOH por g de hoja fresca en peso durante la homogenización. Para los estudios en condiciones non-reducidas, las extracciones se realizaron en Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM y PMSF 2 mM. Los extractos se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa. El bloqueo de la membrana y la detección de la actividad de la peróxidasa conjugada se realizaron con el kit de quimiluminiscencia BM de Boehringer Manheim según lo descrito por el fabricante. La primera incubación se realizó con un anticuerpo de conejo anti-ratón (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) a 4ºC. El rompimiento de los enlaces disulfuros en el IgG recombinante se realizó trayendo la muestra a 0.4% \beta-mercaptoetanol con o sin ascorbato de sodio 10 mM y calentando a 100ºC por 5 min.

Purificación y caracterización de la mAb de la planta

Veinte g del tejido de hoja se homogenizaron en 100 mL de solución reguladora de extracción A (Tris-base 50 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, PMSF 6 mM). El tejido homogenizado se filtró y se clarificó según lo descrito arriba. El sobrenadante se filtró sobre un filtro de papel Whatman y se aplicó a una columna de afinidad preparada mediante IgG humano acoplado a CNBr-Sepharosa (Sigma). La columna se lavó con PBS y el anticuerpo se eluyó con una solución reguladora de glicina (100 mM, pH 2.3). Las fracciones que contienen el anticuerpo se colectaron, neutralizaron con Tris-HCl 0.1 M (pH 7.0) y se dializaron contra PBS. La cantidad de C5-1 purificado de la planta y las proteínas presentes en los extractos se midieron según lo descrito (Bradford, 1976).

Ensayo de Hemoaglutinación

La reactividad del C5-1 mAb de la planta frente glóbulos rojos sensibilizados se estudio empleando la técnica de tubo de giratorio (Issit, 1985). Los glóbulos rojos humanos Rh (o)-positivos se sensibilizaron por incubación con un reactivo anti-Rh (D) humano y se lavaron con PBS. Se adicionaron cuarenta \muL de una suspensión de glóbulos rojos sensibilizados al 2% (v/v en PBS) a 40 \muL de C5-1 mAb a una concentración conocida en un tubo de ensayo de vidrio. Los tubos se mezclaron y centrifugaron por 20 seg a 500 g siguiendo una incubación de 5 min a temperatura ambiente. El agrado de aglutinación se estimó visualmente. El título es el recíproco de la última dilución dando una reacción de aglutinación positiva.

ELISA

Los pozos de las microplacas (Costar) se recubrieron durante la noche con IgG human o anti-ratón de cabra diluido a 5 \mug/mL en una solución reguladora de carbonato (100 mM, pH 9.6). El bloqueo se hizo con PBS que contiene caseina 0.25% (PBS-caseina). Los extractos de la planta se prepararon según lo descrito previamente para la purificación por afinidad y se aplicaron directamente en los pozos siguiendo la dilución en PBS-caseina (1/10 y 1/100) a las placas cubiertas. Después de la incubación, las placas se lavaron y el enlace de C5-1 se reveló empleando un conjugado de IgG-peroxidasa anti-ratón de cabra (Jackson Imm.Res.Lab). La enzima conjugada se reveló con el sustrato ortofenilendiamina (Gibco BRL). La densidad óptica a 490 nm se midió sobre un lector de microplaca (Dynatech MR 5000, Alexandria, Va., USA).

Ejemplo 1

Con el fin de ilustrar la utilidad de alfalfa en la expresión de proteínas, incluyendo proteínas multiméricas tales como mAbs, una mAb de alta afinidad se seleccionó (C5-1) a partir de una librería de mAbs IgG anti-humano murine de alta afinidad (St Laurent et al 1993). El C5-1 mAb dio una reactividad similar a los reactivos policlonales de conejo comerciales cuando se prueban con los glóbulos rojos sensibilizadas débilmente con anticuerpos de grupo sanguíneo.

Integración y expresión de trasgenes en alfalfa

Los cADNs que codifican las cadenas ligera y pesada de C5-1 se transfirieron en las plantas de alfalfa siguiendo el protocolo de Desgagnés et al (1995). Quince y 25 plantas se obtuvieron para la cadena kappa y gamma respectivamente. Los niveles de mARN de las cadenas kappa y gamma se monitorearon por hibridización Northern. Las sondas hibridizan específicamente al mARNs de aproximadamente 1.25 kbp para la cadena kappa (Figura 1A) y 1.75 kbp para la cadena gamma (Figura 1B). Comparado con cADNs de murine, Los mARNs derivados de alfalfa fueron aproximadamente 250 bp más largos, indicando que en ambos casos se empleó la señal de poliadenilación del gen 7. Siete fuera de 29 plantas F1 analizadas se encontraron para expresar las cadenas H y L de cADNs simultáneamente. La figura 1C muestra las variaciones obtenidas en la expresión de cADNs kappa y gamma en plantas de la progenie F1 elegidas aleatoriamente.

Expresión y ensamble de las cadenas H y L del C5-1 mAb en la progenie F1

Las plantas de la progenie F1 escogidas al azar que exhiben expresión simultánea de las cadenas H y L de cADNs se analizaron para la presencia de las subunidades correspondientes por inmunodetección. Esta selección inicial demostró que todos contuvieron ambas cadenas del péptido mAb (datos no mostrados). Análisis posteriores de uno de estos dobles-transgénicos en comparación con las plantas madre correspondientes muestran que los mono-transgénicos que expresan la cadena L del cADN no acumulan cantidades significantes del péptido correspondiente, aquellos monotransgénicos que expresan la cadena H del cADN conteniendo únicamente un dímero de la cadena H, y que los doble-transgénicos a partir de la progenie F1 contuvieron cinco tipos de ensamble, con pesos moleculares que corresponden a los complejos H2L2, H2L, H2, HL y H (Figura 2). El peso molecular del IgG de la planta ensamblada completamente (H2L2) fue similar a ese del derivado de hibridoma C5-1 mAb. Con el fin de romper los enlaces disulfuro, la muestras se trajeron a \beta-mercaptoetanol 0.4%. En estas condiciones, todo el material inmunoreactivo se precipitó bajo un calentamiento a 100ºC. Sin embargo, cuando el ascorbato se adicionó, las dos subunidades integrantes permanecieron en solución y se separaron sobre geles de SDS-acrilamida. La separación en condiciones completamente desnaturalizadas mostró que las subuindades integrantes del derivado de la planta C5-1 son idénticas en tamaño a estas del derivado de hibridoma C5-1 (datos no presentados).

Ejemplo 2

Purificación por afinidad

El contenido del péptido y la estabilidad del C5-1 mAb derivado de alfalfa. La purificación por afinidad se utilizó para recuperar el C5-1 mAb a partir de extractos de hojas de plantas de alfalfa transgénicas (Figura 3A). Las medidas cuantitativas utilizando extractos de hojas a partir de plantas doble-transgénicas F1 individuales indican que el nivel del anticuerpo de C5-1 oscila desde 0.13 a 1.0% de la proteína soluble total. El análisis de SDS-PAGE de la proteína purificada bajo condiciones reducidas (Figura 3B) mostró que las dos cadenas se detectan por tinción con azul Coomassie y que tienen la misma movilidad como sus homólogos a partir de las células hibridoma. Estos resultados sugieren que el C5-1 derivado de planta se protege por glicosilación en la misma extensión como el C5-1 producido por las células hibridoma.

Ejemplo 3

Estabilidad de proteínas transgénicas producidas en, y extraídas a partir de, alfalfa

La proteólisis de IgGs recombinante se ha demostrado para ocurrir en Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana (Hiatt et al, 1989; Ma et al 1994). Aunque IgGs no-truncados se sintetizaron en plantas con un péptido señalador que estimula el reconocimiento en la matriz extracelular inerte (De Wilde et al 1996), se ha observado que el IgGs puede ser degradado por proteasas endógenas bajo la extracción (Hiatt et al (1989), During et al (1990), Ma et al (1995), Ma y Hein (1995), Schouten (1996)). Como esta invención se dirige a la preparación de proteínas multiméricas o sencillas, tales como el C5-1 mAb, en alfalfa, se examinó la estabilidad de tales productos.

1) Estabilidad de proteína dentro de extractos de alfalfa, comparada con extractos de tabaco

Con el fin de establecer si las proteínas son o no estables dentro de los extractos crudos de tejidos de alfalfa, derivado de planta, o derivado de hibridoma, C5-1 se co-extrajo en la presencia de hojas de alfalfa (genotipo 11.9) en agua, y dejadas para incubar por hasta 5 días a 25ºC. Durante este periodo de incubación se retiraron alícuotas así que los niveles de C5-1 podrían ser determinados utilizando análisis Western. La mAb, sin consideración de la fuente fue estable en los extractos de alfalfa preparados en agua. Los datos para las primeras 3 horas de este ejemplo se presentan, sin embargo, en el mismo grado de estabilidad al observado después de un periodo de incubación de 5 días. Adicionalmente las mAb's fueron estables cuando se prepararon en la Figura 4 en una variedad de soluciones reguladoras (datos no mostrados). También se muestra en la Figura 4 el resultado del mismo experimento, aquel de la co-extracción de C5-1 en la presencia de tejidos de tabaco. Puede ser visto que los niveles del C5-1 incubado en la presencia de extractos de tabaco disminuyen en cierto tiempo y no son detectables después de un periodo de incubación de tres horas. Por consiguiente, no hay necesidad de adicionar sales de solución reguladora, antioxidantes, agentes reductores, estabilizadores, inhibidores de proteasa o similares como son adicionados típicamente al medio de extracción con el fin de estabilizar la proteína transgénica de interés, tales como el ejemplar mAb, C5-1 para la extracción de proteínas transgénicas a partir de alfalfa.

La estabilidad de proteínas en extractos de alfalfa además fue investigada utilizando anticuerpos monoclonales (25F5, mAb humano), y policlonales (hISG, inmunoglobulina humana) co-extraídos con alfalfa en la ausencia de solución reguladora según se perfiló anteriormente (ver Tabla 1). Los resultados indican que hay una cantidad significante de proteína inmunológicamente detectable después de 4 días de incubación dentro de los extractos de alfalfa almacenados a temperatura ambiente.

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TABLA 1 Estabilidad de las proteínas co-cosechadas con, e incubadas dentro de extractos de alfalfa

Tiempo después de	C5-1	2 5F5	hISG
la extracción	(\mug/ml)	(\mug/ml)	(\mug/ml)
0	5.2 \pm 0.9	3.4 \pm 0.2	7.7 \pm 0.9
2 h	4.9 \pm 0.7	3.9 \pm 0.5	7.1 \pm 0.8
6 h	4.1 \pm 0.2	4.0 \pm 0.5	6.0 \pm 0.6
1 d	4.6 \pm 0.5	0.8	5.6 \pm 0.3
4 d	4.3 \pm 0.1	0.75 \pm 0.03	3.4 \pm 0.1
12 d	0.58 \pm 0.07	0.18 \pm 0.02	1.8 \pm 0.1

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2) Estabilidad de la proteína recombinante durante la extracción a partir de plantas de alfalfa transgénicas

La estabilidad de C5-1 transgénico en extractos crudos también fue demostrada por la homogenización de las hojas de doble-transgénicos en agua pura. Tales extractos de hojas tienen una pequeña pero significante capacidad reguladora que se establece a ca 0.4 unidades de pH (entre pH 6.5 y pH 8.5) por mol de NaOH en extractos que contienen 100g de hojas frescas. Los resultados mostraron que estos extractos pueden mantenerse a temperatura ambiente sin cambios significantes en el pH por al menos dos horas. Solo agua fue un buen extractante para C5-1 transgénico como soluciones reguladoras que contienen inhibidores de proteasa (solución reguladora A), y C5-1 remanente 100% estable a temperatura ambiente por al menos dos horas dentro de este sistema de extracción mínimo (Tabla 2).

TABLA 2 Estabilidad del C5-1 de la planta en extractos de proteína crudos

Tiempo después de la	Total de proteínas	C5-1*
extracción	(mg/g)	(\mug/mL)
Control	2.21	2.40
Control	2.21	2.40
0 hora	2.47	2.45
1 hora	2.32	2.45
2 horas	2.24	2.62
* Determinado por ELISA específico-IgG murine

3) Estabilidad de la proteína dentro de tejidos de plantas cosechados

Determinar si el secado de una porción de alfalfa aérea tiene cualquier efecto sobre los niveles de C5-1 y/o la habilidad para extraer C5-1 a partir de tejidos aéreos transgénicos sintéticos, un doble- transgénico se cosecho y dejo secar a 25ºC, humedad relativa del 20% por hasta 30 días. Al final de este periodo de secado, el contenido de agua del material de hojas se bajo el 20%, el cual sería el nivel observado bajo condiciones de campo. Cantidades iguales del material de hojas se cosecharon durante este periodo de secado, se extrajeron y los niveles de C5-1 se determinaron empleando un análisis Western. Como se puede ver en la Figura 5, la cual muestra los datos durante los primeros 5 días, No se observó disminución en la cantidad de la proteína extraíble transgénica a partir del secado, o las hojas de alfalfa secas. El mismo resultado se observó después del secado por 30 días cuando las plantas se cosecharon y mantuvieron bajo condiciones de campo.

4) Estabilidad del C5-1 después de la administración a ratones

Cantidades iguales de alfalfa-, o C5-1 derivado de hibridoma se administró vía intravenosa a ratones y la ocurrencia de la proteína se determinó dentro de las muestras de plasma obtenido durante un periodo de 28 días. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 6. La vida media de la proteína C5-1 administrada en los ratones fue la misma tanto para el hibridoma como para la proteína derivada de la planta. Esto sugiere que el C5-1 derivado de planta se protege por la glicosilación a una extensión similar así como en la proteína derivada de hibridoma. Siguiendo una pérdida del 50% de la proteína inyectada durante un periodo de 5 días, la proteína remanente disminuye un 25% adicionalmente durante el próximo periodo de 20 días. Al final del periodo de evaluación, el 25% de la proteína administrada inicialmente fue detectable en los ratones.

5) Estabilidad de la proteína dentro de los propágulos de alfalfa

Con el fin de establecer la estabilidad de la expresión de las proteínas transgénicas dentro de los propágulos de alfalfa transgénica, 15 plantas de dos genotipos derivados de la progenie F1 se examinaron para determinar la concentración del C5-1 dentro del tejido de hojas. Los propágulos se prepararon mediante la inducción de la formación de raíz sobre secciones del tallo internodal. Quince de las plantas regeneradas a partir de los dos genotipos se analizaron para determinar el contenido de C5-1 y comparados con los niveles de C5-1 dentro del material madre. Los datos presentados en la Tabla 3 muestran los resultados de tal experimento e indican que los niveles de C5-1 permanecen constantes entre aquellos observados dentro de los materiales madre y propagados.

TABLA 3 Estabilidad de C5-1 extraíble entre Generaciones

Genotipo 2		Genotipo 3
Material inicial*		Material inicial
14.4 \mug/g hoja		14.4 \mug/g hoja
1:21.2 \mug/g		16:13.4 \mug/g
2:17.9 \mug/g		17:18.2 \mug/g
3:16.9 \mug/g		18:19.7 \mug/g
4:18.5 \mug/g		19:15.1 \mug/g
5:17.8 \mug/g		20:14.5 \mug/g
6:15.0 \mug/g		21:15.6 \mug/g
7:16.1 \mug/g		22:14.6 \mug/g

TABLA 3 (continuación)

Genotipo 2		Genotipo 3
Material inicial*		Material inicial
14.4 \mug/g hoja		14.4 \mug/g hoja
8:14.4 \mug/g		23:12.4 \mug/g
9:21.8 \mug/g		24:15.6 \mug/g
10:14.2 \mug/g		25:17.5 \mug/g
11:18.4 \mug/g		26:17.4 \mug/g
12:18.2 \mug/g		27:18.0 \mug/g
13:17.3 \mug/g		28:16.8 \mug/g
14:15.1 \mug/g		29:17.2 \mug/g
15:12.7 \mug/g		30:14.6 \mug/g
17.0 \pm 2.53 \mug/g		16.0 \pm 1.99 \mug/g
*El valor inicial de 14.4 ha sido determinado en un experimento previo

Ejemplo 4

Antígeno-enlace y actividades de hemoaglutinación

El C5-1 mAb derivado de planta además se probo para su capacidad de enlace del antígeno utilizando una prueba de ELISA. Para esta prueba se empelaron, diluciones seriales del extracto de hojas a partir de las plantas que producen el C5-1. La Tabla 4A presenta los valores de densidades ópticas obtenidas con la dilución 1/10 de las muestras. Los resultados mostraron que el C5-1 mAb de la planta se reconoce por los anticuerpos IgG anti-ratón que sugieren que la conformación total del anticuerpo producido de la planta es el de un IgG. Adicionalmente el C5-1 de la planta específicamente reconoce el IgG humano indicando el correcto plegado de las cadenas H y L para formar el sitio del enlace del antígeno. La experimentación preliminar indica que el extracto de C5-1 de la planta podría específicamente aglutinar los glóbulos rojos sensibilizados con IgG humano. Una caracterización más completa se realizó sobre el material de afinidad-purificación en paralelo con el derivado de hibridoma C5-1 mAb. Los resultados (Tabla 4B) mostraron que el derivado de planta C5-1 mAb específicamente aglutina RBC humano anti-D-sensibilizado dando una reacción completa (4+) a 6 \mug/mL, la que es similar a aquella observada con C5-1 mAb derivado del
hibridoma.

El ensayo de ELISA con IgG anti-murine como un recubrimiento del anticuerpo también se utilizó para determinar la reactividad de transgénicos madre. La Tabla 5A muestra que no se detectó señal en los L-monotransgénicos, y que una señal se detectó en plantas que contienen las cadenas H. Estos resultados se utilizaron para determinar la cantidad de material inmunoreactivo en extractos crudos. Cantidades conocidas del material reactivo crudo luego fueron probadas para actividades específicas en pozos cubiertos con IgGs humanos (Tabla 5B). Este segundo experimento mostró que las cadenas pesadas solas no pueden reaccionar con IgGs humanos. También esto muestra que la planta H2L2 tiene una actividad específica similar a aquella del C5-1 a partir de células hibridoma. La verdadera afinidad del anticuerpo derivado de planta para su antígeno se comparó a aquella del anticuerpo derivado de hibridoma mediante la medida de las constantes de disociación en equilibrio. El KDs fue de 4.7 x 10^{-10} y 4.6 x 10^{-10} M para el C5-1 de la planta- y derivado de hibridoma respectivamente.

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TABLA 4 Reactividad del C5-1 mAb derivado de la planta. (A) ensayo ELISA; (B) Hemoaglutinación

A)	Densidad Óptica a 490 nm
	Anticuerpos inmovilizados
Material probado	anti-ratón de cabra	IgG Humano
Extracto de planta control (1/10)	0.000 \pm 0.000	0.000 \pm 0.000
Extracto de planta Transgénica (1/10)	0.243 \pm 0.007	0.531 \pm 0.014
Sobrenadante hibridoma C5-1 (1/10)	0.414 \pm 0.034	0.643 \pm 0.035

TABLA 4 (continuación)

B)	Fuerza de Hemoaglutinación
Muestra	RBC no-recubierto	RBC Anti-D-cubierto
Ninguno	-	-
Reactivo control IgG anti-humano	-	++++
C5-1 Hibridoma (6 \mug/mL)	-	++++
C5-1 Planta (6 \mug/mL)	-	++++

Ejemplo 5

Purificación a gran escala del C5-1 de la planta

Trescientos gramos de material de la planta se homogenizó en 1.2 L de una solución reguladora de extracción que contiene borato 50 mM y NaCl 4 M a pH 9.0. El tejido homogenizado se clarificó a través de filtración en una tela de quesería. Este tejido homogenizado luego se cargo directamente por flujo ascendente sobre un lecho expandido de Streamline rProtein A matrix (Pharmacia). La carga se realizó a 4ºC a una rata de flujo de 7 mL/min. La columna se lavó con 250 mL de la solución reguladora de extracción y se eluyó con citrato de sodio 50 mM, fosfato de sodio 50 mM y NaCl 300 mM a pH 3.0. Las fracciones (1.5 mL) se recuperaron e inmediatamente se neutralizaron con 100 \muL de Tris 1.5 M a pH 8.8.

El lecho de adsorción expandido (STREAMLINE™ r Proteína A) se escogió para permitir la carga de extractos de planta parcialmente clarificados que contienen material coloidal a un rata de flujo alta. Utilizando esta tecnología, el C5-1 de la planta se purificó a partir de un extracto de la planta crudo no-clarificado como un péptido único según se muestra por tinción de Coomassie sobre geles de SDS-PAGE (Fig 3B).

TABLA 5 Inmunoreactividad (A) y actividad específica (OD por 100 ng) (B) plantas madre transgénicas y F1

A)
Extracto	Densidad Óptica	\mug/mL
\hskip0,5cm IgG a partir de células hibridoma	0.376 \pm 0.008	0.28*
\hskip0,5cm L (1/1)	0.000 --
\hskip0,5cm H (1/4)	0.560 \pm 0.049	0.10 \pm 0.01**
\hskip0,5cm HL (F1,1/6)	0.328 \pm 0.027	0.25 \pm 0.02
B)
Extracto	Densidad Óptica	Actividad específica
\hskip0,5cm IgG a partir de células hibridoma	0.332 \pm 0.032	0.235 \pm 0.020
\hskip0,5cm L (1/1)	0.000	--
\hskip0,5cm H (1/4)	0.000	--
B)
Extracto	Densidad Óptica	Actividad específica
\hskip0,5cm HL (F1, 1/32)	0.334 \pm 0.011	0.267 \pm 0.080
*A partir de una fracción purificada a 0.28 \mug/mL
**Calculado en base a la estructura de H_{2}L_{2}

Referencias

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Claims (12)

1. Un método para la producción estable de una proteína extraíble que comprende:

a) crecimiento de al menos un genotipo de alfalfa transformado para que produzca dicha proteína, dicho genotipo:

(i)

siendo perenne;

(ii)

exhibiendo un potencial embriogénico de al menos un callo embrionario por 20 discos de hojas u otros tejidos del explante; y

(iii)

exhibiendo una estabilidad de la concentración proteica del 100% de la proteína extraíble sobre por lo menos 1 hora en extractos hechos de dicho genotipo, dicho genotipo de alfalfa transformada que expresa dicha proteína extraíble; y

b) extracción de dicha proteína a partir de tejidos de dicha planta.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de la extracción que comprende la cosecha de las porciones aéreas de la dicha o al menos una planta de alfalfa transformada a partir de al menos una progenie transformada de planta de alfalfa producida a partir de un propágulo de dicha o de al menos una planta de alfalfa transformada.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dichas porciones aéreas de al menos una planta de alfalfa transformada o de al menos dicha progenie transformada de planta de alfalfa se dejan cultivar otra vez.

4. El método de la reivindicación 2, en donde dicho propágulo es un propágulo derivado de un tallo.

5. El método de la reivindicación 2, en donde dicho propágulo es un propágulo derivado de un embrión.

6. El método de la reivindicación 1, en donde dicha proteína es un anticuerpo monoclonal, y en donde el paso b) comprende el cultivo de una planta de alfalfa transformada primero con un vector que comprende un gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo monoclonal para producir una primera planta de alfalfa transformada y el cultivo de una segunda planta de alfalfa transformada con un vector que comprende un gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo monoclonal para producir una segunda planta de alfalfa transformada y luego se cruza dicha primera planta de alfalfa transformada y la dicha segunda planta de alfalfa transformada para producir al menos dicha planta de alfalfa transformada, en donde al menos dicha planta de alfalfa transformada expresa ambas la cadena pesada y la cadena ligera de dicho anticuerpo monoclonal.

7. El método de las reivindicaciones 1-6, que comprende además la purificación de dicha proteína después de dicha etapa de extracción.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicha etapa de purificación de dicha proteína se realiza utilizando la cromatografía de afinidad.

9. El método de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho genotipo de alfalfa transformada se deriva del genotipo 11.9 de alfalfa.

10. El método de la reivindicaciones 1-9, en donde la etapa de extracción se conduce sin la adición de inhibidores de proteasa, antioxidantes, agentes reductores de estabilizadores.

11. El método de las reivindicaciones 1-10, en donde la etapa de extracción se conduce en agua.

12. El método de las reivindicaciones 2-11, que comprende además el secado de las porciones aéreas cosechadas después de dicho cultivo, y antes del citado paso de extracción.