ES2263218T3 - Ensayos para detectar moduladores de la funcion del citoesqueleto. - Google Patents
Ensayos para detectar moduladores de la funcion del citoesqueleto.Info
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Abstract
Un procedimiento para identificar un compuesto principal terapéutico que module la actividad del sistema citoesquelético, comprendiendo dicho procedimiento: i) proporcionar una mezcla de ensayo que comprende un primer componente de un sistema citoesquelético y un segundo componente de un sistema citoesquelético, donde dicho primer componente y dicho segundo componente se unen específicamente entre sí; ii) poner en contacto dicha mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo a explorar para la capacidad de inhibir o potenciar la unión entre dicho primer componente y dicho segundo componente; iii)detectar un cambio en el acoplamiento entre la hidrólisis de ATP y la generación de fuerza; donde dicho cambio indica que dicho compuesto modula la actividad de un sistema citoesquelético, donde dicho primer y segundo componentes se seleccionan entre el grupo constituido por polímeros citoesqueléticos, proteínas motoras y proteínas de unión a polímeros citoesqueléticos; y iv) ensayar dicho compuesto deensayo sobre una diversidad de ATPasas.
Description
Ensayos para detectar moduladores de la función
del citoesqueleto.
Esta invención se refiere a ensayos para
identificar compuestos que modulan la actividad de un sistema
citoesquelético (por ejemplo, un sistema actina/miosina, un sistema
de tubulina, etc.).
El citoesqueleto constituye una gran familia de
proteínas que están implicadas en muchos procesos críticos de la
biología, tales como el cromosoma y división celular, movilidad
celular y transporte intracelular. Vale y Kreis (1993) Guidebook
to the Cytoskeletal and Motor Proteins Nueva York: Oxford
University Press; Alberts y col. (1994) Molecular Biology
of the Cell, (789-858). Se han encontrado
proteínas del citoesqueleto en todas las células y están implicadas
en la patogénesis de un gran intervalo de enfermedades clínicas. El
citoesqueleto incluye un conjunto de proteínas poliméricas,
microtúbulos, actina, filamentos intermedios, y septinas, así como
una amplia diversidad de proteínas que se unen a estos polímeros
(proteínas de interacción con polímeros). Algunas de estas
proteínas de interacción con polímeros son motores moleculares
(miosinas, quinesinas, dineínas) (Goldstein (1993) Ann. Rev.
Genetics 27: 319-351; Mooseker y Cheney (1995)
Ann. Rev. Cell. Biol. 11: 633-675) que son
esenciales para transportar material en las células (por ejemplo,
movimiento cromosómico durante la metafase), para la contracción
muscular y para la migración celular. Otros grupos de proteínas (por
ejemplo, vinculina, talina y alfa-actinina) se unen
a diferentes filamentos, conectan el citoesqueleto con la membrana
plasmática, controlan el ensamblaje y desensamblaje de los polímeros
citoesqueléticos, y moderan la organización de los polímeros en las
células.
Dado el papel central del citoesqueleto en la
división celular, migración celular, inflamación y ciclos de vida
de hongos/parásitos, es un sistema fértil para el descubrimiento de
fármacos. Aunque se sabe mucho acerca de las propiedades
moleculares y estructurales de los componentes del citoesqueleto, se
sabe relativamente poco acerca de cómo manipular de manera eficaz
la estructura y función del citoesqueleto. Dicha manipulación
requiere el descubrimiento y desarrollo de compuestos específicos
que puedan alterar de manera predecible y segura la estructura y
función del citoesqueleto. Sin embargo, actualmente, las dianas de
fármacos en el citoesqueleto han estado relativamente sin explotar.
Estudios previos se han dirigido a fármacos que interaccionan con
los polímeros del citoesqueleto propiamente dichos (por ejemplo,
taxol y vincristina), y hacia ensayos de movilidad. Turner y
col. (1996) Anal. Biochem. 242 (1): 20-5;
Gittes y col. (1996) Biophys. J. 70 (1):
418-29; Shirakawa y col. (1995) J. Exp.
Biol. 198: 1809-15; Winkelmann y col.
(1995) Biophys. J. 68: 2444-53; Winkelmann
y col. (1995) Biophys. J. 68: 72S. En general, los
estudios sobre la polimerización y movilidad fueron estudios de
investigación preliminares realizados en un esfuerzo por definir los
mecanismos existentes de estas acciones. Aunque el sistema del
citoesqueleto se ha caracterizado en algún grado, los estudios no
se han centrado en las interacciones de unión de los polímeros tales
como microtúbulos y la actina con diversas proteínas de unión a
polímeros tales como motores moleculares con un objetivo específico
de identificar y caracterizar moduladores de dichas interacciones
que pudieran tener relevancia biofarmacéutica y bioagrícola. En
particular, aún existe la necesidad en la técnica de identificar
compuestos que puedan usarse para manipular el sistema
citoesquelético, particularmente con respecto a modificar las
características de unión de los componentes del citoesqueleto a
otro. En particular, hay una necesidad en la técnica de identificar
compuestos que modulen las interacciones de unión del citoesqueleto
que puedan usarse como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico, así
como compuestos que puedan usarse en el campo bioagrícola (por
ejemplo, como pesticidas). Se observa que no se ha dirigido casi
ningún esfuerzo a descubrir agentes (por ejemplo, fármacos)
dirigidos a proteínas del citoesqueleto que se unan a los
diferentes filamentos y que se espera que proporcionen dianas de
mayor especificidad y por lo tanto proporcionen menos efectos
secundarios no deseados cuando se dirigen con diversos
moduladores.
La invención en este documento proporciona
procedimientos convenientes y rápidos para identificar compuestos
previamente no conocidos para modular la función del citoesqueleto.
En particular, esta invención proporciona procedimientos de ensayo
que incluyen procedimientos para medir las interacciones de unión
entre polímeros del citoesqueleto y proteínas de unión a polímeros
del citoesqueleto que pueden aplicarse a la exploración de alto
rendimiento para identificar moléculas pequeñas que modifican esta
interacción. Los procedimientos descritos en este documento
incluyen procedimientos que proporcionan alta sensibilidad y pueden
usarse en mezclas complejas, incluyendo, aunque sin limitación,
extractos celulares brutos.
La presente invención se define en las
reivindicaciones y proporciona un procedimiento para identificar y
caracterizar compuestos que modulan la unión de dos componentes del
citoesqueleto. Los procedimientos son rápidos, convenientes y
sensibles. Preferiblemente, el procedimiento se usa para identificar
compuestos principales que pueden usarse como agentes terapéuticos
o de diagnóstico, o que pueden usarse en el campo agrícola.
En una realización, esta invención proporciona
un ensayo de alto rendimiento (exploración eficaz de múltiples
muestras), procedimientos para ensayar múltiples agentes de ensayo
(por ejemplo, composiciones y/o compuestos) para su capacidad de
modular la función del citoesqueleto. Los procedimientos
generalmente implican adherir un primer componente del
citoesqueleto a un soporte sólido; poner en contacto este primer
componente con un segundo componente del citoesqueleto que tiene
afinidad por dicho primer componente del citoesqueleto, en una
mezcla de reacción (por ejemplo, acuosa); poner adicionalmente en
contacto la mezcla de reacción con una o más, preferiblemente
múltiples composiciones de ensayo para determinar su capacidad de
modular la afinidad de unión del primer y segundo componentes del
citoesqueleto, y detectar cambios en la afinidad de unión del
segundo componente del citoesqueleto al primer componente del
citoesqueleto a una concentración de ensayo y a una concentración
de control (por ejemplo, concentración cero) de dichas composiciones
de ensayo; donde dicha detección no implica detectar el movimiento
activo de los componentes del citoesqueleto. Se describe la
detección por procedimientos ópticos incluyendo, aunque sin
limitación, microscopía de reflexión interna total o microscopía
confocal.
Los ensayos de la invención pueden adaptarse a
una amplia diversidad de soportes sólidos, incluyendo, aunque sin
limitación, vidrio, superficies de plástico, superficies metálicas o
superficies minerales (por ejemplo, cuarzo o mica). Estos ensayos
son ideales para explorar con muy alto rendimiento fármacos que
alteren las interacciones entre polímeros del citoesqueleto y sus
proteínas de interacción. Los ensayos pueden aplicarse de manera
ventajosa a un formato de placa de 96 pocillos (o mayor).
En este documento se describen procedimientos en
los que el primer componente del citoesqueleto se adhiere
indirectamente al soporte sólido, si necesita estar de un modo
orientado (véase a continuación); donde el primer componente del
citoesqueleto se adhiere indirectamente al soporte sólido uniéndose
a un motor molecular inactivado que está unido al soporte, donde el
primer componente del citoesqueleto forma múltiples series en un
soporte integrado único, donde el segundo componente está marcado
con una molécula informadora, particularmente un fluoróforo tal
como GFP. Cuando se detecta la fluorescencia, en una realización
preferida, el procedimiento de detección es microscopía de
reflexión interna total. Los ensayos pueden detectar la unión en
presencia de un polímero citoesquelético, de un monómero de un
polímero citoesquelético, o un motor molecular. En realizaciones
preferidas, la proporción señal a ruido es al menos aproximadamente
2 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces. La
densidad del primer componente del citoesqueleto en el soporte
sólido es al menos 2 polímeros/50 \mum^{2}, la concentración
del primer componente del citoesqueleto es al menos 2
ng/\mum^{2} y/o el rendimiento es al menos aproximadamente una
muestra/minuto.
Se describen adicionalmente procedimientos para
identificar un compuesto principal (por ejemplo, terapéutico o
bioagrícola) que module la actividad de un sistema citoesquelético.
En esta realización, los procedimientos implican preferiblemente
proporcionar una mezcla de ensayo que comprende un primer componente
de un sistema de microtúbulos y un segundo componente de un sistema
citoesquelético, donde dicho primer componente y dicho segundo
componente tienen afinidad el uno por el otro; poner en contacto la
mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo a explorar para la
capacidad de modular la unión entre el primer componente y el
segundo componente; detectar una diferencia en la especificidad de
unión o avidez del primer componente por el segundo componente, a
una concentración de ensayo y a una concentración de control de
dicho compuesto a explorar, donde dicha detección no implica
detectar movimiento activo de un componente de dicho sistema
citoesquelético, y donde la diferencia en la especificidad de unión
o avidez o afinidad del primer componente por el segundo componente
identifica un compuesto que modula la actividad de un sistema
citoesquelético.
En realizaciones particularmente preferidas, el
primer y segundo componente se seleccionan entre el grupo
constituido por polímeros citoesqueléticos, proteínas motoras y
proteínas de unión a polímeros citoesquelético. El primer y segundo
componentes preferidos pueden ser componentes de un sistema
actina/miosina, un sistema de tubulina, o un sistema de filamentos
intermedios. El primer y segundo componentes citoesqueléticos
preferidos incluyen pares de unión seleccionados de la Tabla 1. La
mezcla de reacción puede incluir un lisado celular. Los
procedimientos pueden implicar adicionalmente registrar la identidad
de un compuesto de ensayo que tiene un efecto significativo sobre
la unión del primer componente al segundo componente en una base de
datos de compuestos principales terapéuticos o bioagrícolas. La
inclusión en la base de datos puede requerir que el compuesto de
ensayo provoque al menos un cambio del 10% en la afinidad de unión o
avidez entre el primer y segundo componente. El ensayo puede
incluir opcional y adicionalmente poner en contacto una célula con
un compuesto de ensayo cuya identidad se registra en dicha base de
datos; y detectar la inhibición en el crecimiento o proliferación
de la célula. En los ensayos descritos en este documento, el primer
componente puede marcarse con un marcador (por ejemplo, un marcador
fluorescente). Cuando el marcador produce una señal óptica, la
detección es preferiblemente por un procedimiento óptico (por
ejemplo, microscopía).
Los procedimientos de ensayo descritos en este
documento son muy adecuados para la exploración de alto rendimiento.
Por lo tanto, en realizaciones preferidas, se exploran
simultáneamente al menos 50 compuestos de ensayo. De forma similar,
al menos dos diferentes pares de primer componente y segundo
componente pueden ensayarse simultáneamente. Los compuestos de
ensayo pueden ser miembros de una biblioteca combinatoria. En muchos
ensayos, el primer o segundo componentes citoesqueléticos o dichos
segundos componentes están unidos a un soporte sólido.
Esta invención proporciona procedimientos para
identificar un compuesto principal terapéutico que modula la
actividad de un sistema citoesquelético, donde los procedimientos
implican proporcionar una mezcla de ensayo que comprende un primer
componente de un sistema citoesquelético y un segundo componente de
un sistema citoesquelético, donde el primer y segundo componentes
se unen específicamente entre sí; poner en contacto la mezcla de
reacción con un compuesto de ensayo a explorar para la capacidad de
inhibir o potenciar la unión entre el primer y segundo componente;
y detectar un cambio en el acoplamiento entre la hidrólisis de ATP y
al generación de fuerza; donde dicho cambio indica que dicho
compuesto modula la actividad de un sistema citoesquelético. En una
realización particularmente preferida, el primer y segundo
componentes no son ambos tubulina ni ambos actina ni ambos la
proteína tau, sin embargo, uno de los dos componentes puede ser
tubulina, actina o la proteína tau.
Adicionalmente se describe un procedimiento que
comprende la etapa de proporcionar al menos una mezcla de ensayo
que comprende un primer componente de un sistema citoesquelético y
un segundo componente de un sistema citoesquelético, donde el
primer componente y el segundo componente tienen afinidad (por
ejemplo, se unen específicamente a) el uno por el otro. Esta
realización comprende adicionalmente la etapa de poner en contacto
la mezcla de ensayo con al menos un compuesto de ensayo a explorar
para la capacidad de modular la unión entre el primer componente y
el segundo componente. También se incluye en esta realización la
etapa de detectar una diferencia en la especificidad de unión o
avidez del primer componente por el segundo componente, a una
concentración de ensayo y a una concentración de control del
compuesto a explorar. Una diferencia en la especificidad de unión o
avidez indica la presencia de un compuesto que modula la actividad
de un sistema citoesquelético.
En una realización de acuerdo con la presente
invención, el primer y segundo componentes se seleccionan entre un
grupo constituido por polímeros citoesqueléticos tales como
microtúbulos, filamentos de actina e intermedios, proteínas motoras
tales como quinesina, dineína y miosina y proteínas de unión a
polímeros tales como Op18, proteína tau o proteínas asociadas a
microtúbulos (MAP). En una realización proporcionada en este
documento, donde uno de dichos componentes citoesqueléticos es un
polímero citoesquelético, el otro componente citoesquelético no es
el mismo polímero. En otra realización de este documento, cuando un
componente citoesquelético es una proteína tau, el otro componente
citoesquelético no es la misma proteína tau.
La mezcla de ensayo descrita de acuerdo con la
invención puede comprender un lisado celular. Puede proporcionarse
una única mezcla de ensayo o una pluralidad de mezclas de ensayo.
Puede proporcionarse un único compuesto de ensayo para cada mezcla
de ensayo, o puede proporcionarse más de un compuesto de ensayo para
cada mezcla de ensayo. Cuando se proporciona una pluralidad de
mezclas de ensayo, una o más mezclas de ensayo pueden comprender un
compuesto de ensayo que difiere del compuesto de ensayo de otra
mezcla de ensayo.
De acuerdo con la invención proporcionada en
este documento, uno de los componentes del sistema citoesquelético
puede adherirse directa o indirectamente a un soporte sólido. Como
alternativa, los componentes pueden estar en solución.
En una realización, al menos uno del primer o
segundo componentes citoesqueléticos está marcado. El marcador
puede seleccionarse entre una amplia diversidad de moléculas
informadoras. Las moléculas informadoras incluyen fluoróforos,
proteínas fluorescentes, y marcadores de epítopes.
La detección de la afinidad de unión, avidez o
especificidad puede conseguirse por procedimientos ópticos
incluyendo, aunque sin limitación, lectores de placa y microscopía.
Los procedimientos microscópicos preferidos incluyen microscopía
confocal o de reflexión interna total. En una realización, se usa
citometría de flujo. Como alternativa, el procedimiento de
detección puede ser por un procedimiento de detección de actividad
enzimática, por ejemplo, un ensayo de ATPasa. Como alternativa, el
procedimiento de detección puede ser determinando las interacciones
proteicas, es decir, un sistema doble híbrido.
En una realización preferida, la diferencia en
la especificidad de unión, afinidad o avidez detectada es del 10% o
superior en cada dirección de la de la concentración de ensayo. En
otra realización, la diferencia de la del compuesto de ensayo es
del 20%, 40%, 60% u 80% o superior en cada dirección. En una
realización alternativa, la diferencia de la del compuesto de
ensayo es del 100%, 200%, 300%, 500%, 800%, o 1000% o superior. En
una realización proporcionada en este documento, la concentración
de control del compuesto de ensayo es la ausencia del compuesto de
ensayo a explorar.
Los compuestos a explorar pueden seleccionarse
entre varios orígenes. Los compuestos de ensayo incluyen, aunque
sin limitación, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides,
sacáridos, ácidos nucleicos (ADN y ARN), y moléculas orgánicas
pequeñas. Los compuestos pueden ser de una biblioteca de fuentes de
productos sintéticos o naturales y pueden ser de una biblioteca
creada usando técnicas combinatorias. Preferiblemente, el compuesto
de ensayo es una molécula pequeña. La molécula pequeña es
preferiblemente de 4 kilodalton (kd) o menos. En otra realización,
el compuesto es de menos de 3 kd, 2 kd o 1 kd. En otra realización,
el compuesto es de menos de 800 dalton (D), 500 D, 300 D o 200 D.
En otra realización en la que ambos de dichos componentes están en
solución, un procedimiento preferido excluye nucleótidos sencillos
como compuesto a explorar. Como alternativa, esta realización
excluye moléculas que puedan hidrolizarse por uno de los componentes
citoesqueléticos para proporcionar energía química. Otra
realización preferida excluye anticuerpos, particularmente los
previamente conocidos en la técnica, que se unen a componentes
citoesqueléticos. Otra realización excluye inositol fosfatos.
"Composición de ensayo" (usado de manera
intercambiable en este documento con "agente candidato" y
"compuesto de ensayo" y "agente de ensayo") se refiere a
una molécula o composición elemento cuyo efecto sobre la interacción
entre dos o más componentes citoesqueléticos se desea ensayar. La
"composición de ensayo" puede ser cualquier molécula o mezcla
de moléculas, opcionalmente en un vehículo adecuado.
Las expresiones "aislado",
"purificado" o "biológicamente puro" se refieren a un
material que está sustancial o esencialmente libre de componentes
que normalmente lo acompañan, como se encuentra en su estado
natural.
Los términos "polipéptido", "péptido"
y "proteína" se usan de manera intercambiable en este documento
para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos
se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos
de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de
origen natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos
de origen natural.
La expresión "proteína de fusión" se
refiere a una proteína (polipéptido) compuesta de dos polipéptidos
que, cuando generalmente están no unidos en estado natural, están
unidos por sus respectivos extremos amino y carboxilo a través de
un enlace peptídico para formar un único polipéptido continuo. Se
apreciará que los dos componentes polipeptídicos pueden unirse
directamente o unirse a través de un engarce/espaciador
peptídico.
"Función citoesquelética" se refiere a los
papeles biológicos del citoesqueleto: proporcionar organización
estructural (por ejemplo, microvilli, huso mitótico) y mediar los
acontecimientos de movimiento en la célula (por ejemplo,
contracción muscular, anillo mitótico contráctil; movimiento de
pseudópodos, deformaciones de la superficie celular activa,
formación de vesículas y transporte). La actividad citoesquelética
sugiere implicación en la función citoesquelética. La actividad
citoesquelética incluye la interacción de unión de dos componentes
citoesqueléticos.
"Motor molecular" es una molécula
citoesquelética que utiliza energía química para producir una fuerza
mecánica, y maneja las propiedades móviles del citoesqueleto.
"Componente citoesquelético" indica
cualquier molécula que se encuentra en asociación con el
citoesqueleto celular, que juega un papel en el mantenimiento o
regulación de la integridad estructural del citoesqueleto, o que
media o regula los acontecimientos móviles mediados por el
citoesqueleto. Esta expresión incluye polímeros citoesqueléticos y
monómeros de los mismos (por ejemplo, filamentos de actina,
microtúbulos, filamentos de miosina, filamentos de 100 A o
intermedios), motores moleculares, y proteínas reguladoras asociadas
con el citoesqueleto (por ejemplo, tropomiosina,
alfa-actinina).
"Polímero citoesquelético" se refiere a
homo y heteropolímeros que forman parte del citoesqueleto celular
(por ejemplo, filamentos de actina, microtúbulos, filamentos de
miosina, etc.).
"Sistema citoesquelético" se refiere a un
conjunto de componentes citoesqueléticos que incluyen monómeros de
polímeros citoesqueléticos que típicamente se encuentran asociados
entre sí in vivo.
"Un monómero de un polímero
citoesquelético" se refiere a una subunidad monomérica de un
polímero citoesquelético, tal como las subunidades alfa y beta
tubulina de los microtúbulos, la subunidad G-actina
de filamentos de actina, el monómero de filamentos intermedios, y
las subunidades de miosina de filamentos de miosina.
Un "sistema actina/miosina" se refiere a un
conjunto de componentes citoesqueléticos, incluyendo monómeros,
típicamente asociados con actina y/o miosina in vivo. Dichos
componentes incluyen, aunque sin limitación, actina, miosina,
proteínas de unión a actina (por ejemplo, ABP-50,
ABP-120, ABP-280), factor de
despolimerización de la actina (ADF),
\alpha-actininas, actobindina, actolinquina,
anexinas, caldesmonas, calponina, proteínas de sellado, cofilina,
coronina, proteínas c, dematinas, depactina, distrofina, ezrina,
fascina, fimbrina, gCap39, gelsolinas, hisactofilina, insertina,
MARCKS, miomesina y proteína m, nebulina, proteína de unión a
actina nuclear (NAB), paramiosina, ponticulina, profilinas,
proteínas 4.1, radixina, m-creatina quinasa
sarcomérica, severina, proteínas de reticulación de actina pequeñas,
espectrinas, tenuína, timosina \beta4 (T\beta4), titina,
tropomodulina, tropomiosinas, troponinas, villina, proteína de unión
a vitamina D/Gc (DBP/Gc), inhibidor de 25 kDa de la polimerización
de la actina (IAP 25 kDa) y proteína de 43 kDa (véase, por ejemplo,
Kreis y Vale (1995) Guidebook to the cytoskeletal and motor
proteins. Oxford University Press, Oxford, Reino Unido).
Un "sistema de tubulina" se refiere a un
conjunto componentes citoesqueléticos, incluyendo monómeros,
típicamente asociados con tubulina in vivo. Dichos
componentes incluyen, aunque sin limitación, tubulina, chartinas,
MAP1A, MAP1B/MAP5, MAP2, MAP3, MAP4 (MAP-U), MARPS,
pericentrina, proteínas de las proyecciones radiales, motores de
microtúbulos, STOP, sincolina, tau, \alpha/\beta tubulina,
\gamma-tubulina, tirosina ligasa de tubulina
(TTL), tubulina carboxipeptidasa (TCP), X-MAP, MAP
205K y similares (véase, por ejemplo, Keris y Vale (1995)
Guidebook to the cytoskeletal and motor proteins. Oxford
University Press, Oxford, Reino Unido).
Un "sistema de filamentos intermedios" se
refiere a un conjunto de componentes citoesqueléticos, incluyendo
monómeros, típicamente asociados con los filamentos intermedios
in vivo. Dichos componentes incluyen, aunque sin limitación,
filamentos intermedios, citoqueratinas, desmina, epinemina,
filagrinas, filensina, GFAP, \alpha-internexina,
laminas, nestina, proteínas del triplete de neurofilamentos (por
ejemplo, NF-L, NF-M,
NF-H), paranemina, periferina, plectina, sinemina,
vimentina, y similares (véase, por ejemplo, Keris y Vale (1995)
Guidebook to the cytoskeletal and motor proteins. Oxford
University Press, Oxford, Reino Unido).
"Soporte sólido" significa cualquier
superficie sólida, tal como una perla o vidrio plano, una membrana
flexible o rígida, una superficie plástica, metálica o mineral (por
ejemplo, cuarzo o mica), a la que puede adherirse una molécula. El
soporte sólido puede ser plano o puede tener una forma simple o
compleja. La superficie a la que se adhiere la molécula puede ser
una superficie externa o una superficie interna del soporte sólido.
Particularmente, cuando la superficie es porosa, la molécula
probablemente se une a una superficie interna.
"Adherido a" o "unido a" un soporte
sólido indica que uno de dichos primer o segundo componentes
citoesqueléticos está fijado directa o indirectamente al sustrato
sólido y que más del 95% del primer componente citoesquelético
permanece asociado con el soporte sólido al menos hasta que se han
completado todas las manipulaciones y el nivel de unión se ha
evaluado.
"Adherido o unido en un modo orientado"
significa que esencialmente todos los componentes citoesqueléticos
individuales que se unen al soporte sólido lo hacen en algún sitio o
dominio definido del componente citoesquelético, tal como un
segundo sitio de la molécula (por ejemplo, un dominio catalítico)
puede interaccionar libremente con moléculas.
"Espacialmente ordenado para formar series
distintas" significa que el componente o componentes
citoesqueléticos que se adhieren al soporte sólido se disponen en
patrones precisos, tales como filas de puntos, o filas de cuadrados,
o líneas.
"Modular" significa aumentar o disminuir
(por ejemplo, la afinidad de unión, y/o avidez y/o especificidad)
con relación a una concentración de control o ensayo. En una
realización, la diferencia en la especificidad de unión, o
afinidad, o avidez detectada es de al menos el 10%, o
alternativamente al menos el 20%, o alternativamente al menos el
40%, o alternativamente al menos el 60% o alternativamente al menos
el 80% en cada dirección (aumentado o disminuido). En una
realización alternativa, la diferencia en la afinidad o avidez del
compuesto de control de la de ensayo es del 100%, 200%, 300%, 500%,
800%, o 1000% o superior.
"Especificidad de unión" se refiere al
grado en el que una primera molécula se une a una segunda molécula
en relación a si la primera molécula también se unirá a otras
moléculas (tercera, cuarta, etc.). La especificidad de unión puede
determinarse por un ensayo de unión in vitro de acuerdo con
técnicas convencionales conocidas en la técnica. En una realización
preferida, la expresión "especificidad de unión" o "se une
específicamente a" o cuando se hace referencia al componente
citoesquelético se refiere a una reacción de unión que es
determinante de la presencia de la proteína o en presencia de una
población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos.
Por tanto, en condiciones de ensayo indicadas, una molécula
específica (por ejemplo, un anticuerpo específico para un
componente citoesquelético) se une a un componente citoesquelético
particular y no se une en una cantidad significativa a otras
proteínas presentes en la muestra.
La expresión "que tiene afinidad por" en el
contexto de un primer componente citoesquelético que tiene afinidad
por un segundo componente citoesquelético se refiere a la tendencia
del primer y segundo componentes citoesqueléticos de asociarse
entre sí in vivo. La asociación puede ser permanente o
transitoria y típicamente se caracteriza por un cambio en una o más
propiedades físicas y/o químicas de uno o ambos componentes. En
algunas realizaciones preferidas, los componentes que tienen
afinidad el uno por el otro se unen específicamente entre sí.
"Avidez de unión" como se usa en este
documento es la fuerza de las interacciones entre componentes
multivalentes. Las determinaciones de la avidez de unión se conocen
en la técnica, como se describe en la página 124 en Kuby (1992)
Immunology, W. H. Freeman and Company, Nueva York.
"Afinidad de unión" como se usa en este
documento se refiere a la fuerza de la suma de las interacciones no
covalentes totales entre dos moléculas. Las determinaciones de la
afinidad de unión son conocidas en la técnica como se describe en
las páginas 122-124 en Kuby (1992)
Immunology, W. H. Freeman and Company, Nueva
York.
York.
"Movimiento activo" es el movimiento que
requiere y utiliza energía química (en oposición al movimiento
Browniano, dispersión pasiva, etc.).
"Molécula informadora" indica una molécula
que puede detectarse visualmente (por ejemplo, porque tiene color,
o genera un producto con color, o emite fluorescencia) o por el uso
de un detector que detecta propiedades de la molécula informadora
(por ejemplo, radiactividad, campo magnético, etc.). En una
realización, las moléculas informadoras permiten la detección de la
interacción de dos moléculas. Las moléculas informadoras incluyen
marcadores (incluyendo ligandos) que permiten la detección, tal como
un radiomarcador, fluoróforos, quimioluminiscencia, biotina,
estreptavidina, digoxigenina, anti-digoxigenina,
azúcares, lectinas, antígenos, y conjugados enzimáticos. La
molécula informadora puede ser una proteína que puede usarse como
marcador directo o indirecto, es decir, proteína fluorescente verde
(GFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente
amarilla (YFP), proteína fluorescente roja (RFP), luciferasa,
\beta-galactosidasa, todos disponibles en el
mercado, es decir, Clontech, Inc. Además, una realización utiliza
moléculas que cambian su fluorescencia o actividad después del
cambio en la unión.
En una realización, "detectar la unión"
significa evaluar la cantidad de un segundo componente dado que se
une a un primer componente dado en presencia y ausencia de una
composición de ensayo. Este procedimiento generalmente implica la
capacidad de evaluar la cantidad del segundo componente asociado con
una cantidad fijada conocida del primer componente a intervalos
seleccionados después de poner en contacto el primer y segundo
componentes. Esto puede conseguirse uniendo al segundo componente
una molécula o grupo funcional que pueda visualizarse o medirse
(por ejemplo, un resto fluorescente, un átomo radiactivo, una
biotina que pueda detectarse usando avidina marcada) o usando
ligandos que se unen específicamente al segundo componente. El nivel
de unión se detecta cuantitativamente.
"Un compuesto que se une tanto al soporte
sólido como al primer componente citoesquelético" se refiere a un
compuesto que se une al sustrato esencialmente de forma
irreversible, preferiblemente a través de un enlace covalente o a
través de una unión multivalente, y al primer componente
citoesquelético con alta afinidad (una K_{D} eficaz = al menos
10^{-8}, preferiblemente al menos 10^{-10}, más preferiblemente
al menos 10^{-12}). "K_{D} eficaz" se refiere a
situaciones en las que hay múltiples sitios de unión entre dos
componentes citoesqueléticos; la unión de múltiples sitios, cada
uno de los cuales tiene afinidad inferir, proporciona unión con una
afinidad eficaz global que hace que la afinidad de unión de la
interacción entre los dos componentes parezca superior de lo que
es.
Un "agente terapéutico" como se usa en este
documento se refiere a un compuesto que se cree que es capaz de
modular el sistema citoesquelético in vivo que puede tener
aplicación en enfermedades tanto humanas como animales. La
modulación del sistema citoesquelético sería deseable en varias
afecciones incluyendo aunque sin limitación: estimulación anormal
de células endoteliales (por ejemplo, aterosclerosis), tumores
sólidos y hematopoyéticos y metástasis tumoral, tumores benignos,
por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas,
granulomas piogénicos, malfunciones vasculares, curación anormal de
heridas, trastornos inflamatorios e inmunes tales como Artritis
Reumatoide, enfermedad de Bechet, gota o artritis gotosa,
angiogénesis anormal que acompaña a: artritis reumatoide,
psoriasis, retinopatía diabética, y otras enfermedades angiogénicas
oculares tales como degeneración macular, rechazo de injerto de la
córnea, sobrecrecimiento de la córnea, glaucoma, síndrome de Osler
Webber, enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión,
isquemia cardiaca y disfunción sistólica y diastólica y
enfermedades fúngicas tales como aspergilosis, candidiasis y
enfermedades fúngicas tópicas tales como tinea pedis.
Un "agente de diagnóstico" como se usa en
este documento es un compuesto que ayuda a la identificación y
caracterización de un estado de salud o patológico. El agente de
diagnóstico puede usarse en ensayos convencionales como se sabe en
la técnica.
Un "compuesto bioagrícola" como se usa en
este documento se refiere a un compuesto químico o biológico que
tiene utilidad en la agricultura y funciones para la protección de
comida envasada o cultivos de fibra o mejora del rendimiento. Por
ejemplo, uno de dichos compuestos puede servir como herbicida para
controlar selectivamente las malas hierbas, como un fungicida para
controlar el brote de enfermedades vegetales, como un insecticida
para protegerse de y destruir plagas de insectos y ácaros. Además,
uno de dichos componentes puede demostrar utilidad en el
tratamiento de semillas para mejorar el medio de crecimiento de una
semilla en germinación, plántula o planta joven como regulador
vegetal o activador.
La expresión "acoplamiento entre hidrólisis de
ATP y generación de fuerza" se refiere al hecho de que muchos
motores moleculares son ATPasas eficaces que hidrolizan ATP en ADP
para proporcionar energía para la generación de fuerza. La
actividad ATPasa del motor a menudo está drásticamente aumentada
cuando el motor se une a otro componente citoesquelético tal como
un microtúbulo. Una alteración en la relación entre la unión del
motor o la generación de fuerza y la hidrólisis de ATP es un cambio
en "el acoplamiento entre la hidrólisis de ATP y la generación de
fuerza".
Se entiende que las definiciones que se aplican
al sistema citoesquelético se aplican a realizaciones que se
refieren a componentes específicos del sistema citoesquelético.
La Figura 1 muestra diagramas de diferentes
quimeras quinesina-GFP.
La Figura 2 ilustra interacciones de unión entre
motores fluorescentes (proteína fluorescente verde fusionada a
quinesina (K560-GFP), Ncd (Ncd-GPP)
o una quimera motora (NK-1-GFP)) y
polímeros de microtúbulos. Las interacciones de unión se muestran
en ATP (un estado de baja afinidad) y sin nucleótido (un estado de
alta afinidad). Se realizó la formación de imágenes usando
microscopía de reflexión interna total. Las diferencias en la unión
motora fluorescente al microtúbulo unido a la superficie pueden
detectarse y cuantificarse por intensidad de fluorescencia.
En este documento se proporcionan ensayos para
el propósito de identificar compuestos que modulan el sistema
citoesquelético, como se define en las reivindicaciones. En
realizaciones preferidas, los ensayos exploran de manera eficaz e
identifican agentes que aumentan o disminuyen interacciones que
suceden normalmente entre componentes del sistema citoesquelético
(por ejemplo, interacciones actina/miosina, etc.). Un descubrimiento
de esta invención fue que las interacciones de los componentes
citoesqueléticos, en una realización particularmente preferida, las
interacciones de proteínas motoras/de rastreo y accesorias
proporcionan nuevas dianas para explorar compuestos que son útiles
como agentes terapéuticos animales, agentes bioagrícolas, y
similares. A diferencia de los ensayos para agentes que se dirigen
a moléculas altamente conservadas (por ejemplo, tubulina), en
realizaciones preferidas, los ensayos de esta invención identifican
agentes que se dirigen específicamente a moléculas relativamente
variables (por ejemplo, proteínas motoras y/o accesorias) y
proporcionan de este modo un medio para modular la actividad
citoesquelética con una especificidad (por ejemplo, especificidad
de especie y/o tejido) hasta ahora desconocida. Como se describe con
más detalle a continuación, los ensayos proporcionan el uso
adecuado de varios componentes citoesqueléticos y formatos de ensayo
diferentes. Además, puede ensayarse cualquier compuesto rápida y
eficazmente.
Los procedimientos de ensayo de esta invención
generalmente implican identificar interacciones de unión entre uno
o más agentes de ensayo y un componente de un sistema
citoesquelético, o, más preferiblemente, identificar el efecto de
uno o más agentes de ensayo sobre las interacciones de unión entre
dos (o más) componentes de un sistema citoesquelético. Los ensayos
pueden realizarse en solución o en fase sólida, como ensayos
individuales o en modalidades altamente paralelas (por ejemplo,
alto rendimiento), y con agentes de ensayo sencillos o
múltiples.
Se describe en este documento una diversidad de
diferentes ensayos para detectar compuestos y composiciones capaces
de unirse a un componente citoesquelético y de modular la unión de
un segundo componente citoesquelético a un primer componente
citoesquelético. Para una descripción general de diferentes formatos
para ensayos de unión, incluyendo ensayos de unión competitiva y
ensayos de unión directa, véase Basic and Clinical
Immunology, 7ª Edición (D. Stites y A. Terr, ed.) (1991);
Enzyme Imunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton,
Florida (1980); y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays",
en P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, B. V. Amsterdam
(1985).
En ensayos de unión directa se ensaya la
capacidad de una o más composiciones de ensayo de unirse a un
componente citoesquelético (por ejemplo, actina, miosina,
quinesina, tubulina, etc.) incluyendo, aunque sin limitación, los
componentes identificados en la Tabla 1. Los ensayos de unión simple
son bien conocidos por los especialistas en la técnica. En una
realización, la composición de ensayo (agente) o el componente
citoesquelético está marcado, el componente y el agente se ponen en
contacto entre sí y se detecta y/o cuantifica la asociación del
resto marcado (componente o agente) con el otro compañero de unión
(componente citoesquelético cuando el agente de ensayo está marcado
y el agente de ensayo cuando el componente citoesquelético está
marcado). Como alternativa, tanto el componente citoesquelético
como el agente de ensayo pueden estar ambos marcados y la
asociación de los marcadores indica después la unión. El uso de
marcadores fluorescentes capaces de transferir energía de
resonancia de fluorescencia (FRET) facilita enormemente la detección
de dicha asociación (por ejemplo, la fluorescencia de los
marcadores típicamente se inactiva cuando se ponen próximos entre
sí, véase, por ejemplo, Stryer (1978) Ann. Rev. Biochem.,
47: 819-846).
Los ensayos de unión directa también pueden
realizarse en fase sólida donde el agente o agentes de ensayo o el
componente citoesquelético se inmoviliza en un soporte sólido.
Cuando el componente citoesquelético se inmoviliza, se pone en
contacto con el agente o agentes de ensayo (opcionalmente marcado) y
a la inversa cuando el agente o agentes de ensayo se inmovilizan,
se ponen en contacto con el componente o componentes
citoesqueléticos (opcionalmente marcados). Después de retirar por
lavado el agente de ensayo y/o componente citoesquelético no unido,
los complejos de agente de ensayo/componente citoesquelético unidos
restantes indican la unión del agente o agentes de ensayo con el
componente citoesquelético. Cuando el agente de ensayo o componente
citoesquelético no inmovilizado está marcado, la detección del
marcador asociado con el soporte sólido proporciona una medida de
la unión del agente de ensayo/componente citoesquelético. Los
sistemas de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia
(FRET) son adecuados para su uso también en fase sólida.
Ni el agente de ensayo ni el componente
citoesquelético tienen que estar marcados antes del ensayo. Un
marcador aplicado posteriormente "indirecto" (por ejemplo, un
anticuerpo marcado específico para el componente citoesquelético o
agente o agentes de ensayo) puede usarse para detectar el agente de
ensayo/componente citoesquelético en el complejo de agente de
ensayo/componente citoesquelético.
Se apreciará que ni el agente de ensayo ni el
componente citoesquelético tienen que estar marcados en los
ensayos. Se conocen otros medios para detectar la formación de
complejo por los especialistas en la técnica (por ejemplo,
electroforesis, centrifugación en gradiente de densidad, etc.).
En "ensayos de inhibición de dos
componentes", el agente o agentes de ensayo se ensayan para su
capacidad de alterar la afinidad de unión, especificidad o avidez
entre dos (o más) componentes de un sistema citoesquelético. En
términos generales, uno o ambos componentes de un sistema
citoesquelético (o de dos sistemas citoesqueléticos diferentes) se
ponen en contacto con un agente de ensayo. La afinidad de unión o
avidez de los dos componentes se compara con el mismo ensayo
realizado a una diferente concentración (control) del agente de
ensayo. Una diferencia en la afinidad de unión, especificidad o
avidez de los dos componentes citoesqueléticos indica que el agente
de ensayo ejerce una función citoesquelética.
El agente "de ensayo" puede ponerse en
contacto con uno o ambos componentes de un sistema citoesquelético
antes de poner en contacto entre sí los dos componentes, en el mismo
momento, o después de que los dos componentes se hayan dejado que
contacten entre sí.
Es bien conocida una amplia diversidad de
ensayos adecuados para detectar el efecto de un agente o agentes de
ensayo en la unión de dos componentes de sistemas biológicos para
los especialistas en la técnica. En realizaciones preferidas,
dichos ensayos son "competitivos" en un formato en el que el
agente de ensayo se explora para la capacidad de competir con un
segundo componente citoesquelético por sitios de unión específica
en un primer componente citoesquelético y alterar de este modo la
unión entre los dos componentes citoesqueléticos. Sin embargo, se
reconoce que el agente de ensayo no tiene que unirse a ninguno de
los componentes citoesqueléticos para provocar cambios (en la
conformación o la constitución química de uno o ambos componentes
citoesqueléticos y alterar de este modo la interacción de unión).
Independientemente del mecanismo específico de acción del agente de
ensayo, los ensayos descritos a continuación están generalmente
diseñados para revelar alteraciones en la especificidad de unión,
afinidad o avidez de los componentes citoesqueléticos.
En una realización preferida, el agente o
agentes de ensayo se ensayan en relación al ensayo de control. El
ensayo de control puede contener el agente o agentes de ensayo a una
concentración diferente o uno o más agente o agentes de ensayo
particulares pueden estar ausentes del ensayo de control. Una
diferencia (preferiblemente una diferencia estadísticamente
significativa) en la unión del componente citoesquelético entre los
ensayos de ensayo y de control indica que el agente de ensayo tiene
un efecto sobre la función del citoesqueleto. Un aumento o
disminución en la unión en al menos un 10%, más preferiblemente en
al menos un 20%, mucho más preferiblemente en al menos un 50%, 80%,
90% o más se prefiere para registrar un resultado positivo (que
indica la actividad del agente de ensayo) en un ensayo.
En otra realización más, uno de los componentes
citoesqueléticos tiene un resto detectable unido al mismo, es
decir, fluorescencia, que cambia en intensidad, espectro o
polarización después de la diferente unión al mismo, es decir, la
fluorescencia cambia después de que se una al mismo un segundo
agente. En otra realización más, un conjugado tal como una
fosfatasa se usa de modo que la unión se mide después de la adición
del sustrato sobre el que la enzima puede actuar. Además, se
entiende que pueden usarse perlas magnéticas y similares.
En una realización alternativa, la afinidad de
unión entre el primer componente citoesquelético y un segundo
componente citoesquelético se determina en presencia y ausencia de
un agente de ensayo. Una diferencia en la afinidad de unión indica
la identificación de un compuesto que modula el sistema
citoesquelético. La invención también proporciona la identificación
de un compuesto que modula la unión de un componente citoesquelético
a otro componente citoesquelético.
En ensayos "competitivos" el agente de
ensayo se ensaya poniendo en contacto el agente con uno de los dos
o ambos componentes de un sistema citoesquelético (un primer
componente, por ejemplo, un motor, y un segundo componente, por
ejemplo un "rastro") que típicamente se asocian juntos. El
efecto del agente de ensayo en el sistema citoesquelético después
se ensaya evaluando la cantidad de segundo componente
citoesquelético asociado con el primer componente citoesquelético.
Cuando el agente de ensayo realmente compite con el mismo por la
unión a uno o más componentes citoesqueléticos o inhibe de otro modo
la unión, se disminuye la cantidad de un segundo componente
citoesquelético asociado con el primer componente citoesquelético
con relación a un ensayo de control que tiene una concentración
inferior del agente de ensayo particular o carece de cualquier
agente de ensayo.
A la inversa, los agentes de ensayo
"agonistas" pueden aumentar la afinidad de unión, avidez o
especificidad de los dos componentes citoesqueléticos. En este
caso, un aumento de la cantidad de un segundo componente
citoesquelético asociado con el primer componente citoesquelético
aumenta con relación al ensayo de control que tiene una
concentración inferior del agente de ensayo particular o que carece
de cualquier agente de ensayo.
La cantidad de inhibición o estimulación de la
unión de un componente citoesquelético por el compuesto de ensayo
depende de las condiciones del ensayo de unión y de las
concentraciones de componentes citoesqueléticos, y el agente o
agentes de ensayo usados. En condiciones de ensayo específicas, se
dice que un agente de ensayo es capaz de inhibir o potenciar la
unión de un segundo componente citoesquelético con un primer
componente citoesquelético si la cantidad del segundo componente
citoesquelético unido disminuye o aumenta, respectivamente, en una
cantidad estadísticamente significativa. Un aumento o disminución en
la unión en al menos un 10%, más preferiblemente, en al menos un
20%, mucho más preferiblemente en al menos un 50%, 80%, 90% o más se
prefiere para registrar un resultado positivo (que indica la
actividad del agente de ensayo) en un ensayo.
Como se ha indicado anteriormente, los
especialistas en la técnica entienden que para influir en la unión
entre dos componentes citoesqueléticos, el componente de ensayo no
tiene que competir con los componentes citoesqueléticos por un
sitio de unión específica. Por lo tanto, en una realización en este
documento, el modulador puede inducir un cambio en la conformación
del sitio de unión de modo que aumente o disminuya la unión.
Como se ha indicado anteriormente, los ensayos
pueden realizarse en solución o en fase sólida. En un ensayo en
fase sólida preferido, uno de los componentes citoesqueléticos se
une a un soporte sólido. El segundo componente citoesquelético
después se pone en contacto con el primer componente citoesquelético
antes o después de que se exponga uno o ambos componentes (se
pongan en contacto con) el agente o agentes de ensayo. Después de
una etapa de lavado apropiada, se ensaya la cantidad de componente
citoesquelético unido, por ejemplo, como se describe a
continuación.
La cantidad de unión del segundo componente
citoesquelético con el primer componente citoesquelético puede
evaluarse marcando directamente el segundo componente con un resto
detectable, o detectando la unión de un ligando marcado que se une
específicamente al segundo componente citoesquelético. Puede usarse
una amplia diversidad de marcadores. El componente puede marcarse
por uno cualquiera de varios procedimientos. Tradicionalmente, se
usa un marcador radiactivo (^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o
^{32}P). Los marcadores no radiactivos incluyen fluoróforos,
agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos. La elección del
marcador depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de
conjugación con el compuesto, requisitos de estabilidad e
instrumentos disponibles. Un fluoróforo preferido es una proteína
fluorescente (por ejemplo, GFP). Para una revisión de diversos
sistemas de marcaje o productores de señales que pueden usarse,
véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.391.904.
Como se ha indicado anteriormente, los sistemas
de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET)
también pueden usarse para ensayar las interacciones
proteína-proteína. En ensayos basados en FRET, ambos
componentes (por ejemplo, ambos componentes citoesqueléticos) se
marcan con marcadores fluorescentes. Los espectros de absorción y
emisión de los marcadores se seleccionan de modo que un marcador
emita a una longitud de onda a la que otro absorbe. Cuando los
marcadores se ponen en proximidad entre sí (por ejemplo, uniendo
los dos componentes citoesqueléticos entre sí) se inactivan
disminuyendo de este modo la fluorescencia de la mezcla. FRET es
una técnica potente para medir las asociaciones
proteína-proteína y se ha usado previamente para
medir la polimerización de actina monomérica en un polímero (Taylor
y col. (1981) J. Cell Biol., 89:
362-367) y el desensamblaje de los filamentos de
actina por corte (Yamamoto y col. (1982) J. Cell
Biol., 95: 711-719), pero no se ha usado para
explorar agentes que modulen las interacciones de componentes
citoesqueléticos.
Otros ensayos pueden detectar cambios en la
polarización de la fluorescencia.
En otra realización más, la unión de los dos
componentes del sistema citoesquelético puede detectarse por el uso
de cristales líquidos. Los cristales líquidos se han usado para
amplificar y transducir la unión mediada por receptor de proteínas
en superficies en resultados ópticos. Pueden diseñarse superficies
espontáneamente organizadas de modo que un primer componente
citoesquelético, después de la unión con un segundo componente
citoesquelético (por ejemplo, microtúbulos) albergado en estas
superficies, desencadene cambios en las orientaciones de películas
de 1 a 20 micrómetros de espesor de cristales líquidos mantenido,
que se corresponde de este modo a una reorientación de
\sim10^{5} a 10^{6} mesógenos por proteína. Los cambios
inducidos por la unión en la intensidad de la luz transmitida a
través del cristal líquido se observan fácilmente a ojo y pueden
amplificarse adicionalmente usando superficies diseñadas para que el
reconocimiento proteína-ligando provoque cristales
líquidos nemáticos retorcidos en no retorcidos (véase, por ejemplo,
Gupta y col. (1998) Science, 279:
2077-2080). Este enfoque para la detección de unión
ligando-receptor no requiere el marcaje del analito,
no requiere el uso de aparatos electroanalíticos, proporciona una
resolución espacial de micrómetros, y es suficientemente simple
para ser útil en ensayos bioquímicos y formación de imágenes de
bibliotecas químicas espacialmente resueltas.
De acuerdo con la presente invención se usa un
ensayo de ATPasa para identificar agentes que modulan la unión de
componentes citoesqueléticos. Por ejemplo, los motores moleculares
son ATPasas eficaces que hidrolizan ATP en ADP para proporcionar
energía para la generación de fuerza. La actividad ATPasa del motor
a menudo aumenta drásticamente cuando el motor se une a otro
componente citoesquelético tal como un microtúbulo. Examinando la
hidrólisis del ATP de un motor molecular en presencia de
concentraciones variables de compuestos de ensayo que pueden
ejercer la unión entre dos componentes citoesqueléticos, puede
cuantificarse la unión, identificando de este modo agentes que
modulan la unión. Este ensayo no se ha hecho para identificar
moduladores de unión.
Uno de dichos ensayos de ATPasa se describe en
los siguientes ejemplos. En una realización preferida, el ensayo de
actividad ATPasa utiliza PCA (ácido perclórico) 0,3 M y reactivo
verde malaquita (molibdato II sódico 8,27 mM, oxalato de verde
malaquita 0,33 mM y Tritón X-100 0,8 mM). Para
realizar el ensayo, se inactivan 10 \mul de la reacción en 90
\mul de PCA 0,3 M frío. Se usan patrones de fosfato de modo que
los datos pueden convertirse en fosfato inorgánico mM liberado.
Cuando se han inactivado todas las reacciones y
patrones en PCA, se añaden 100 \mul de reactivo verde malaquita a
los pocillos relevantes en, por ejemplo, una placa de
microtitulación. La mezcla se desarrolla durante
10-15 minutos y la placa se lee a una absorbancia
de 650 nm. Si se usan patrones de fosfato, las lecturas de
absorbancia pueden convertirse a Pi mM y representarse en el
tiempo.
En otra realización más, se usan interacciones
proteína-proteína. Por ejemplo, puede usarse un
sistema doble híbrido como se conoce en la técnica. El sistema
doble híbrido es un procedimiento usado para identificar y clonar
genes para proteínas que interaccionan con una proteína de interés.
En resumen, el sistema indica una interacción
proteína-proteína por la reconstitución de la
función GAL4, que es detectable y sólo sucede cuando interaccionan
las proteínas. Este sistema y metodologías generales con respecto a
la transformación de levaduras con vectores expresables se
describen en Cheng-Ting y col. (1991)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582,
Fields y Song (1989) Nature, 340: 245-246, y
Chevray y Nathans, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
5789-5793.
Aunque puede utilizarse cada mezcla de ensayo
para ensayar el efecto de un único agente de ensayo, se reconocerá
que también pueden explorarse múltiples agentes de ensayo en una
única mezcla de ensayo. En dicha realización de ensayo
multi-agente, dos o más, preferiblemente 4 o más,
más preferiblemente 16 o más y mucho más preferiblemente 32, 64,
128, 256, o incluso 512 o más agentes se exploran en una única
mezcla de reacción de ensayo. Un resultado positivo en ese ensayo
indica que uno o más de los agentes combinados son moduladores de la
función del citoesqueleto. En este caso, en una realización
preferida, el procedimiento se repite cuando los agentes candidatos
se separan para identificar el modulador individualmente, o para
verificar que los agentes funcionan en conjunto para proporcionar
la diferencia en la especificidad de unión, afinidad o avidez. Por
tanto, por ejemplo, un ensayo originalmente procesado con 16
agentes de ensayo puede volver a procesarse como cuatro ensayos
conteniendo cada uno cuatro de los 16 agentes de ensayo originales.
De nuevo, esos ensayos que resultan positivos pueden dividirse y
volver a procesarse hasta que el agente o agentes responsables del
resultado positivo del ensayo se identifiquen.
También se observa que pueden ensayarse
múltiples agentes de ensayo juntos para identificar agentes que
tienen un efecto aditivo o incluso sinérgico sobre el sistema
citoesquelético, o a la inversa, para identificar el agente o
agentes de ensayo que tienen efectos antagonistas sobre el sistema
citoesquelético.
En una realización, el procedimiento comprende
adicionalmente la etapa de introducir la identidad de un compuesto
de ensayo que se ha identificado que modula la actividad de un
sistema citoesquelético de acuerdo con la presente invención en una
base de datos de compuestos principales terapéuticos, de diagnóstico
o bioagrícolas. En algunos casos, puede ser deseable realizar
ensayos adicionales sobre los compuestos que se han identificado en
este documento. Por ejemplo, puede evaluarse adicionalmente la
actividad de los compuestos identificados en áreas distintas de su
capacidad de modular la unión. Por ejemplo, puede evaluarse su
capacidad de afectar al crecimiento o proliferación de las células,
particularmente células tumorales, migración de vesículas, mitosis,
congregación, movimiento de filamentos, movilidad, etc.
En una realización, los ensayos de la presente
invención ofrecen la ventaja de que pueden procesarse muchas
mezclas en un corto periodo de tiempo. Por ejemplo, pueden usarse
placas que tienen 96 o tantos pocillos como estén disponibles en el
mercado. Además, los componentes citoesqueléticos pueden unirse a
soportes sólidos y ordenarse espacialmente para formar series
distintas, tales como filas de puntos o cuadrados, o líneas. Esto,
acoplado a máquinas de ensayo y lectura, con protectores
sofisticados aumenta enormemente la eficacia de la realización de
cada ensayo y detección y cuantificación de los resultados. Es
posible con tecnologías actuales producir de manera eficaz grandes
cantidades (10^{6} o más) péptidos que tengan secuencias
específicas y ordenarlos en distintas posiciones en un chip, y
después detectar la fluorescencia asociada con cada posición del
chip. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.143.854;
Publicaciones PCT Nº WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 93/09668; y
Fodor y col. (1991) Science, 251, 767-77.
Convencionalmente, se generan nuevas entidades
químicas con propiedades útiles (por ejemplo, inhibición de las
interacciones de las colas de miosina) identificando un compuesto
químico (llamado un "compuesto principal") con alguna
propiedad o actividad deseable, creando variantes del compuesto
principal, y evaluando la propiedad y actividad de esos compuestos
variantes. Sin embargo, la tendencia actual es acortar la escala de
tiempo para todos los aspectos de descubrimiento de fármacos. A
causa de la capacidad para ensayar grandes cantidades rápida y
eficazmente, los procedimientos de exploración de alto rendimiento
(HTS) están reemplazando a los procedimientos de identificación de
compuestos principales convencionales.
En una realización preferida, los procedimientos
de exploración de alto rendimiento implican proporcionar una
biblioteca que contiene una gran cantidad de compuestos (compuestos
de ensayo) que tienen potencialmente la actividad deseada. Dichas
"bibliotecas químicas combinatorias" se exploran después en uno
o más ensayos, como se describe en este documento, para identificar
esos miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas
particulares) que presentan una actividad característica deseada
(por ejemplo, terapéutica o bioagrícola). Los compuestos
identificados de este modo pueden servir como "compuestos
principales" convencionales o pueden usarse en sí mismos como
agentes terapéuticos o bioagrícolas potenciales o reales.
Cualquiera de los ensayos para los compuestos y
composiciones de ensayo descritos en este documento son susceptibles
de exploración de alto rendimiento. Estos ensayos detectan la
inhibición de la actividad característica del componente
citoesquelético, o la inhibición de o unión a un receptor u otra
molécula de transducción que interacciona con el componente
citoesquelético.
Los ensayos de alto rendimiento para la
presencia, ausencia o cuantificación de ácidos nucleicos
particulares o productos proteicos son bien conocidos por los
especialistas en la técnica. Los ensayos de unión son igualmente
bien conocidos. Por tanto, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos
5.559.410 describe procedimientos de exploración de alto
rendimiento para proteínas, la Patente de Estados Unidos 5.585.639
describe procedimientos de exploración de alto rendimiento para la
unión de ácidos nucleicos (es decir, en series), mientras que las
Patentes de Estados Unidos 5.576.220 y 5.541.061 describen
procedimientos para explorar la unión ligando/anticuerpo.
Además, los sistemas de exploración de alto
rendimiento están disponibles en el mercado (véase, por ejemplo,
Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH;
Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA; Precision Systemas, Inc.,
Natick MA, etc.). Estos sistemas típicamente automatizan los
procedimientos completos que incluyen el pipeteado de todas las
muestras y reactivos, el suministro de líquidos, incubaciones
programadas, y lecturas finales de la microplaca en el detector o
detectores apropiados para el ensayo. Estos sistemas configurables
proporcionan un alto rendimiento y comienzo rápido así como un alto
grado de flexibilidad y adaptabilidad. Los fabricantes de dichos
sistemas proporcionan protocolos detallados para los diversos
ensayos de alto rendimiento. Por tanto, por ejemplo, Zymark Corp.
proporciona folletos técnicos que describen sistemas de exploración
para detectar la modulación de la transcripción génica, unión de
ligandos, y similares.
En una realización preferida de esta invención,
la proporción señal a ruido es relativamente alta (la señal es al
menos aproximadamente 4 veces, preferiblemente aproximadamente 10
veces, y más preferiblemente aproximadamente 100 veces por encima
del fondo). Cuando el primer componente citoesquelético en el
soporte sólido es un polímero (por ejemplo, actina F o
microtúbulo), la densidad es al menos 2, preferiblemente al menos
10, más preferiblemente al menos 100, mucho más preferiblemente al
menos 1000 polímeros por 50 \mum^{2}, donde la longitud media
del polímero es 1 \mum. La concentración del componente
citoesquelético es al menos 10, preferiblemente al menos 100 y más
preferiblemente al menos 100 ng/\mum^{2}. La proporción de alto
rendimiento deseado tiene un promedio de al menos aproximadamente
uno, preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más
preferiblemente al menos aproximadamente 100 diferentes agentes de
ensayo/minuto.
La cantidad e identidad de componentes
citoesqueléticos que se han identificado hasta ahora son muchos, y
demasiado numerosos como para enumerarse completamente en este
documento. Puede encontrarse una lista parcial en las siguientes
referencias: Vale y Kreis (1993) Guidebook to the Cytoskeletal
and Motor Proteins Nueva York: Oxford University Press;
Goldstein (1993), Ann. Rev. Genetics 27:
319-351; Mooseker y Cheney (1995) Annu. Rev.
Cell Biol. 11: 633-675; Burridge y col. (1996),
Ann. Rev. Cell Dev. biol. 12: 463-519. Son de
especial interés los componentes asociados con el sistema de
filamentos de actina (por ejemplo, actina, miosina, tropomiosina,
\alpha-actinina, timosina, profilina, espectrina,
anquirina, fimbrina, filamina, vinculina, villina, gelsolina,
severina), con el sistema de microtúbulos (alfa y beta tubulina,
dineína, quinesina, MAPS, tau), y con los filamentos intermedios
(queratinas, vimentina, proteínas de neurofilamentos, laminas,
desmina). Aunque los ensayos de la invención a menudo se centrarán
en las interacciones entre componentes citoesqueléticos del mismo
subsistema de filamentos (por ejemplo, actina y proteínas de unión a
actina), debe observarse que los diferentes sistemas de filamentos
están integrados y que algunos componentes unen más de un sistema y
por lo tanto pueden utilizarse componentes de dos sistemas
diferentes en un ensayo de esta invención.
En una realización preferida en este documento,
el primer y segundo componentes se seleccionan de los pares
mostrados en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Factor de Despolimerización de la Actina/Cofilina | Actina |
| Aducina | Actina |
| Alfa actininas | Actina |
| Alfa catenina | Actina |
| Anexinas | Actina |
| Proteína Cólica de Poliposis Adenomatosa | Tubulina/Microtúbulos |
| Arp 2/3 | Actina |
| Dineína del Axonema | Tubulina/Microtúbulos |
| Quinesina Bipolar | Tubulina/Microtúbulos |
| BPAG1 | Filamentos Intermedios |
| Caldesmona | Actina |
| Proteína de Sellado | Actina |
| Miosina del Músculo Cardiaco | Actina |
| CENP-E | Bub1 |
| CENP-E | CENP-F |
| Centrosomina | Tubulina/Microtúbulos |
| Cromoquinesina | Tubulina/Microtúbulos |
| CLIP-170 | Tubulina/Microtúbulos |
| Coronita | Actina |
| Cortexilinas | Actina |
| Quinesina del Dominio Motor C-terminal | Tubulina/Microtúbulos |
| Dineína Citoplásmica | Tubulina/Microtúbulos |
| Miosina II Citoplásmica | Actina |
| Complejo Dinactina | Dineína |
| Distrofina/Utrofina | Actina |
| Proteínas ERM: Ezrina, Radixina y Moesina | Actina |
| Filagrinas | Filamentos Intermedios |
| Gamma Tubulina | Tubulina/Microtúbulos |
| Gelsolinas | Actina |
| Quinesina Heterotrimérica | Tubulina/Microtúbulos |
| IFAP 300 | Filamentos Intermedios |
| Quinesina del Dominio Motor Interno | Tubulina/Microtúbulos |
| Katanina | Tubulina/Microtúbulos |
| MAP1A | Tubulina/Microtúbulos |
| MAP1B-MAP5 | Tubulina/Microtúbulos |
| MAP2 | Tubulina/Microtúbulos |
| MAP4 | Tubulina/Microtúbulos |
| MARCKS | Actina |
| Proteína Quinasas MARK | Tubulina/Microtúbulos |
| Quinesina Mitótica | Tubulina/Microtúbulos |
| Quinesina Monomérica | Tubulina/Microtúbulos |
| Quinasas de la Cadena Pesada de la Miosina | Miosiona |
| Miosina I | Actina |
| Miosina IX | Actina |
| Quinasas de la Cadena Ligera de la Miosina | Cadenas Ligeras de la Miosina |
| Miosina V | Actina |
| Miosina VII | Actina |
| NuMa | Tubulina/Microtúbulos |
| Op 18/Estatmina | Tubulina/Microtúbulos |
| Pericentrina | Tubulina/Microtúbulos |
| Plectina | Filamentos Intermedios |
| Profilina | Actina |
| Proteína 4.1 | Actina |
| Severina | Actina |
| Miosina del Músculo Liso | Actina |
| Espectrinas | Actina |
| STOPS | Tubulina/Microtúbulos |
| Sincolina | Tubulina/Microtúbulos |
| Talina | Actina |
| Proteína Tau | Tubulina/Microtúbulos |
| Tensina | Actina |
| Timosina beta 4 | Actina |
| Tropomodulina | Actina |
| Tropomiosina | Actina |
| Troponinas | Actina |
| VASP | Actina |
| Villina | Actina |
| Vimentina | Filamentos Intermedios |
| Vinculina | Actina |
| WASP | Actina |
| XMAP215/TOG | Tubulina/Microtúbulos |
| ZW10 | Dinamitina |
| ZW10 | Rough Deal |
| Actoforina | Actina |
| Zixina | Actina |
| Merlina | Actina |
| Desmoplaquina | Vimentina |
| Ocludina - 1 de la Zónula | Actina/Espectrina |
| Depactina | Actina |
| Anquirina | Filamentos Intermedios/Espectrina |
| ADNasa | Actina |
| Filamina/Plastina | Actina |
| Fimbrina | Actina |
| ActA | Actina |
| KIF | Tubulina/Microtúbulos |
| ABP-120 | Actina |
| EB1 | Tubulina/Microtúbulos |
| KIFs | Tubulina/Microtúbulos |
| Cdc42 | Actina |
En una realización alternativa proporcionada en
este documento, el primer componente difiere del segundo componente.
Por "difiere", esto incluye realizaciones en las que los
componentes son iguales salvo por una modificación química de uno
pero no del otro. Además, si los dos componentes pertenecen a la
misma clase de componentes citoesqueléticos, es decir, ambas son
quinesinas, pero se distinguen entre sí en base a su secuencia de
aminoácidos, se considera que difieren entre sí.
Los componentes citoesqueléticos de esta
invención pueden expresarse de manera recombinante usando
procedimientos convencionales bien conocidos por los especialistas
en la técnica. Como alternativa, los componentes citoesqueléticos
pueden obtenerse por purificación a partir de fuentes naturales como
se explica a continuación.
En general, los componentes citoesqueléticos de
esta invención pueden purificarse a una pureza sustancial de
fuentes naturales y recombinantes por protocolos conocidos usando
técnicas convencionales (Vale y Kreis (1993), Guidebook to the
Cytoskeletal and Motor Proteins Nueva York: Oxford University
Press), incluyendo extracción diferencial, precipitación selectiva
con sustancias tales como sulfato amónico, cromatografía en
columna, procedimientos de inmunopurificación, y otros. Véase, por
ejemplo, Scopes (1982) Protein Purification: Principles and
Practice, Springer-Verlag: Nueva York. Por
ejemplo, pueden purificarse proteínas citoesqueléticas y
polipéptidos producidos por tecnología de ADN recombinante por una
combinación de lisis celular (por ejemplo, sonicación) y
cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación con un anticuerpo
específico en componentes citoesqueléticos. Para productos de
fusión, la digestión posterior de la proteína de fusión con una
enzima proteolítica apropiada libera el polipéptido deseado. Las
proteínas después pueden purificarse adicionalmente por técnicas de
química proteica convencionales.
Los ensayos de la presente invención también
apoyan el uso de componentes citoesqueléticos no purificados (por
ejemplo, lisados celulares). Cuando está presente un lisado celular,
el lisado puede estar en forma de cualquier tipo celular (por
ejemplo, procariota, eucariota, vertebrado, invertebrado y mamífero,
etc.). Cuando se usan preparaciones no purificadas, la detección de
la interacción de componentes citoesqueléticos preferiblemente
implica el uso de sistemas de detección específicos para al menos
uno de los componentes citoesqueléticos estudiados.
En una realización, el componente
citoesquelético y/o el agente o agentes de ensayo están marcados.
Los marcadores detectables adecuados para su uso en los ensayos de
esta invención incluyen cualquier composición detectable por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos,
eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la
presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo,
Dynabeads^{TM}), colorantes fluorescentes (por ejemplo,
isotiocianato de fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína
fluorescente verde, y similares), radiomarcadores (por ejemplo,
^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P), enzimas (por
ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina y otras
tales como las usadas habitualmente en un ELISA), y marcadores
colorimétricos tales como perlas de oro coloidal o vidrio o plástico
coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
Las patentes que muestran el uso de dichos marcadores incluyen las
Patentes de Estados Unidos 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350;
3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241.
Los medios para detectar dichos marcadores son
bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por tanto, por
ejemplo, pueden detectarse radiomarcadores usando películas
fotográficas o contadores de escintilación, los marcadores
fluorescentes pueden detectarse usando un fotodetector para detectar
la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos típicamente se
detectan proporcionando un sustrato a la enzima y detectando el
producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el
sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente
visualizando el marcador coloreado.
El marcador puede acoplarse directa o
indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se ha indicado
anteriormente, puede usarse una amplia diversidad de marcadores,
dependiendo la elección del marcador de la sensibilidad necesaria,
facilidad de conjugación del compuesto, requisitos de estabilidad,
instrumentos disponibles, y previsiones de disposición.
Los marcadores no radiactivos a menudo se unen
por medios indirectos. Generalmente, una molécula ligando (por
ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. El ligando
después se une a una molécula anti-ligando (por
ejemplo, estreptavidina) que es detectable de manera inherente o se
une covalentemente a un sistema señal, tal como una enzima
detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto
quimioluminiscente. Pueden usarse varios ligandos y
anti-ligandos. Cuando un ligando tiene un
anti-ligando natural, por ejemplo, biotina,
tiroxina, y cortisol, éste puede usarse junto con los
anti-ligandos marcados, de origen natural. Como
alternativa, puede usarse cualquier compuesto hapténico o
antigénico en combinación con un anticuerpo.
Las moléculas también pueden conjugarse
directamente con compuestos que generan señales, por ejemplo, por
conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como
marcadores serán principalmente hidrolasas, particularmente
fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas,
particularmente peroxidasas. Los componentes fluorescentes incluyen
fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo,
umbeliferona, etc., y proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP).
Los compuestos quimioluminiscentes incluyen, aunque sin limitación,
luciferina, y 2,3-dihidroftalazindionas, por
ejemplo, luminol. Para una revisión de diversos sistemas de marcaje
y productores de señal que pueden usarse, véase la Patente de
Estados Unidos Nº 4.391.904.
Como se ha indicado anteriormente en una
realización, los ensayos de esta invención se realizan en fase
sólida (por ejemplo, con un agente de ensayo o un componente
citoesquelético unido a un soporte sólido). El "soporte
sólido" puede fabricarse de cualquier material al que pueda
adherirse una molécula, que sea compatible con las condiciones y
soluciones para realizar los ensayos de unión. Los ejemplos incluyen
vidrio, metales, plástico, o minerales (por ejemplo, mica o cuarzo)
con forma de perlas o planos. Los soportes pueden ser relativamente
rígidos, en forma de hojas o membranas deformables, o fabricados en
dispositivos de ensayo útiles (por ejemplo, placa de
microtitulación (por ejemplo, PVC, polipropileno, o poliestireno),
un tubo de ensayo (vidrio o plástico), una varilla (por ejemplo,
vidrio, PVC, polipropileno, poliestireno, látex, y similares), un
tubo de microcentrífuga) y similares. Un soporte preferido es
aminosilano, que se unirá a moléculas cargadas negativamente. Otro
soporte preferido es silicatos en capas, un grupo de minerales de
sílice laminados que incluyen, aunque sin limitación: vermiculita,
montmorilonita, bentonita, hectorita, fluorohectorita, hidroxil
hectorita, fluoroflogopita de boro, hidroxilflogopita de boro, mica
y similares. Las micas preferidas son las que pueden fracturarse
para producir una superficie blanda, más preferiblemente una
superficie atómicamente blanda.
Puede emplearse una amplia diversidad de
polímeros orgánicos e inorgánicos, tanto naturales como sintéticos,
como material para la superficie sólida. Los polímeros ilustrativos
incluyen polietileno, polipropileno,
poli(4-metilbuteno), poliestireno,
polimetacrilato, poli(etilentereftlato), rayón, nylon,
poli(butirato de vinilo), difluoruro de polivinilideno
(PVDF), siliconas, poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa,
nitrocelulosa, y similares. Otros materiales que pueden emplearse
incluyen papel, vidrios, cerámicas, metales, metaloides, materiales
semiconductores, cementos o similares. Además, pueden usarse
sustancias que forman geles, tales como proteínas (por ejemplo,
gelatinas), lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas.
También son adecuados polímeros que forman varias fases acuosas,
tales como dextranos, polialquilenglicoles o tensioactivos, tales
como fosfolípidos, sales de alquilamonio de cadena larga
(12-24 átomos de carbono) y similares. Cuando la
superficie sólida es porosa, pueden emplearse diversos tamaños de
poro dependiendo de la naturaleza del sistema.
En la preparación de la superficie, puede
emplearse una pluralidad de diferentes materiales, por ejemplo,
como laminados, para obtener diversas propiedades. Por ejemplo,
pueden usarse revestimientos proteicos, tales como gelatina para
evitar la unión no específica, simplificar la conjugación covalente,
potenciar la detección de la señal o similares.
Si se desea la unión covalente entre un
compuesto y la superficie, la superficie habitualmente será
polifuncional o capaz de ser polifuncional. Los grupos funcionales
que pueden estar presentes en la superficie y usarse para la unión
pueden incluir ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos
ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y
similares.
Como se ha indicado anteriormente, en ensayos
preferidos en fase sólida se une el agente de ensayo y/o un
componente citoesquelético a un soporte sólido. El modo de unir una
amplia diversidad de compuestos a diversas superficies es bien
conocido y está ampliamente ilustrado en la bibliografía (véase, por
ejemplo, Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press,
Nueva York, 1978, y Cuatrecasas, (1970) J. Biol. Chem. 245
3059). La adhesión de un componente citoesquelético, y/o un agente
de ensayo, al soporte sólido puede ser directa (es decir, el
componente citoesquelético y/o el agente o agentes de ensayo se
ponen en contacto directamente con el soporte sólido) o indirecta
mediante un engarce (es decir, el engarce es un compuesto o
compuestos particulares unidos al soporte, y el componente
citoesquelético y/o el agente o agentes de ensayo se unen a este
compuesto o compuestos en lugar de al soporte sólido).
El procedimiento para unir moléculas biológicas,
u otras moléculas a soportes sólidos es bien conocido por los
especialistas en la técnica. Por ejemplo, se han inmovilizado
compuestos covalentemente (por ejemplo, utilizando grupos tiol
reactivos únicos de restos de cisteína, Colliuod y col.
(1993) Bioconjugate Chem. 4, 528-536)), o no
covalentemente pero específicamente (por ejemplo, mediante
anticuerpos inmovilizados (Schuhmann y col. (1991) Adv.
Mater. 3: 388-391; Lu y col. (1995)
Anal. Chem. 67: 83-87), el sistema
biotina/estreptavidina (Iwane y col. (1991) Biophys.
Biochem. Res. Comm. 230: 76-80), películas de
Langmuir-Blodgett de quelación de metales (Ng y
col. (1995) Langmuir 11: 4048-4055;
Schmitt y col. (1996) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:
317-320; Frey y col. (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93: 4937-4941; Kubalek y
col. (1994) J. Struc. Biol, 113:
117-123) y monocapas autoensambladas de quelación de
metales (Sigal y col. (1996) Analytical Chem., 68:
490-497) para la unión de proteínas de fusión con
polihistidina.
Manipulando el soporte sólido y el modo de unión
del componente citoesquelético al soporte, es posible controlar la
orientación del componente citoesquelético. Por ejemplo, la
solicitud de patente en trámite junto con la presente titulada
``Reversible Immovilization of Arginine-tagged
Moieties on a Silicate Surface, USSN 60/057.929, presentada el 4 de
septiembre de 1997, PCT/US98/\underline{\hskip2cm} describe el uso
de una cola de arginina para unir proteínas citoesqueléticas a una
película de mica.
Por tanto, por ejemplo, cuando se desea unir una
molécula de miosina a una superficie de un modo que deje las colas
de miosina libres de interaccionar con otras moléculas, puede
añadirse un marcador (por ejemplo, poliarginina o poliglutamato,
partícula magnética, etc.) a la molécula de miosina en una posición
particular en la secuencia de miosina (por ejemplo, cerca de la
cabeza de miosina de modo que, cuando la molécula de miosina se une
a una superficie (por ejemplo, una superficie de silicato por medio
de un marcador de arginina, una superficie que contiene hierro por
medio de un marcador magnético, un metal (por ejemplo, reactivo
IMAC) por medio de un marcador de histidina, etc.), la cola queda
libre. Un sitio preferido para colocar dicho marcador de unión es
en el bucle dos de la cabeza de miosina, un bucle externo flexible
en el dominio de unión a actina. Otros sitios incluyen el extremo
carboxi terminal de la miosina. Otras proteínas citoesqueléticas,
tales como quinesina, pueden modificarse de manera similar para
añadir un marcador de arginina a los bucles externos o al extremo
carboxi o amino terminal.
Si se usa poliglutamato, el marcador comprende
como mínimo 3-4, preferiblemente 6-8
y más preferiblemente 10-15 restos de glutamato.
Las proteínas marcadas con una cola de poliglutamato se unirán
preferiblemente a una superficie cargada positivamente,
preferiblemente aminosilano. De manera similar al marcador de
arginina, el marcador de poliglutamato puede usarse para orientar
el componente citoesquelético marcado, como se ha descrito
anteriormente. Es también posible purificar las moléculas marcadas
con poliglutamato en columnas de intercambio aniónico
regulares.
En una realización, la invención implica unir
proteínas de interacción con polímeros a una superficie revestida
con polímeros. La alta adsorción de polímeros se consigue acortando
primero los polímeros a tamaños pequeños (por ejemplo,
aproximadamente 1 \mum o menos) y después adsorbiéndolos sobre
superficies revestidas con proteínas motoras inactivadas que se
unen fuertemente al polímero. Una proteína motora puede inactivarse
mutando el "dominio motor" de modo que la hidrólisis de la
energía química para producir la fuerza mecánica puede no suceder
más. La unión no
específica se minimiza por la absorción posterior de una proteína vehículo (por ejemplo, albúmina de suero bovino).
específica se minimiza por la absorción posterior de una proteína vehículo (por ejemplo, albúmina de suero bovino).
En una realización, se marcan las proteínas de
interacción con polímeros (por ejemplo, marcadas fluorescentemente),
químicamente o por fusión genética a una proteína fluorescente (por
ejemplo, GFP). También es posible el ensayo inverso en el que la
proteína de interacción con el polímero se adsorbe sobre la
superficie y se emplea un polímero marcado fluorescentemente. Si
sucede una interacción de unión, se elimina la proteína fluorescente
de la solución y se acumula en la superficie. Se hace una lectura
cuantitativa de la fluorescencia en la superficie, por ejemplo, por
reflexión interna total, que excita selectivamente moléculas
fluorescentes en la superficie y no en la
solución.
solución.
Los materiales y procedimientos de esta
invención son particularmente útiles para analizar los efectos de
moléculas biológicas sobre interacciones citoesqueléticas. Los
compuestos de ensayo adecuados en los procedimientos de esta
invención incluyen, aunque si limitación, proteínas, glicoproteínas,
anticuerpos, sacáridos, lípidos, nucleótidos, análogos de
nucleótidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, ácidos
peptidonucleicos, etc.), y moléculas orgánicas, particularmente
moléculas orgánicas pequeñas.
Los agentes candidatos incluyen numerosas clases
químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas,
preferiblemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso
molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2.500 dalton.
Los agentes candidatos preferiblemente comprenden grupos funcionales
adecuados para la interacción estructural con proteínas,
particularmente enlaces de hidrógeno, y típicamente incluyen al
menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo,
preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales.
Los agentes candidatos a menudo comprenden estructuras cíclicas de
carbono o heterocíclicas y/o estructura aromáticas o poliaromáticas
sustituidas con uno o más de los anteriores grupos funcionales. Los
agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas que
incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas,
pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de
los mismos.
Los agentes candidatos se obtienen de una amplia
diversidad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos
sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos
medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia
diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la
expresión de oligonucleótidos aleatorios. Como alternativa, están
disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de
extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales o se producen
fácilmente. Adicionalmente, se modifican fácilmente bibliotecas y
compuestos producidos de manera natural o sintética a través de
medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes
farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas
dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación,
esterificación, amidificación, para producir análogos
estructurales.
En una realización proporcionada en este
documento, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. La
proteína puede estar compuesta de aminoácidos de origen natural y
enlaces peptídicos, o estructuras peptidomiméticas sintéticas. Por
ejemplo, la homofenilalanina, citrulina y norleucina se consideran
aminoácidos para los propósitos de la invención. "Aminoácido"
también incluye restos de iminoácidos tales como prolina e
hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden ser de configuración
(R) o (S). En la realización preferida, los aminoácidos están en
configuración (S) o L. Si se usan cadenas laterales de origen no
natural, pueden usarse sustituyentes no aminoacídicos, por ejemplo,
para evitar o retardar las degradaciones in vivo.
En otra realización, los agentes bioactivos
candidatos son proteínas de origen natural o fragmentos de proteínas
de origen natural. Por tanto, por ejemplo, pueden usarse extractos
celulares que contienen proteínas, o digestiones aleatorias o
dirigidas de los extractos celulares proteicos. En una realización,
las bibliotecas son de proteínas bacterianas, fúngicas, virales, y
de mamífero, siendo preferidas las últimas, y siendo especialmente
preferidas las proteínas humanas.
En una realización, los agentes candidatos son
péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 aminoácidos,
siendo preferidos de aproximadamente 5 a 20 aminoácidos, y siendo
particularmente preferidos de aproximadamente 7 a aproximadamente
15. Los péptidos pueden ser digestiones de proteínas de origen
natural como se ha indicado anteriormente, péptidos aleatorios, o
péptidos aleatorios. Por "aleatorizados" o equivalentes
gramaticales en este documento se entiende que cada ácido nucleico
y péptido consta de nucleótidos esencialmente aleatorios y
aminoácidos, respectivamente. Como estos péptidos aleatorios
generalmente (o ácidos nucleicos, analizado a continuación) se
sintetizan químicamente, pueden incorporar cualquier nucleótido o
aminoácido en cualquier posición. El procedimiento sintético puede
diseñarse para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados,
para permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles
combinaciones sobre la longitud de la secuencia, formando de este
modo una biblioteca de agentes proteicos bioactivos candidatos
aleatorizados.
En una realización, la biblioteca está
completamente aleatorizada, sin preferencias de secuencia o
constantes en ninguna posición. En una realización preferida, la
biblioteca está sesgada. Es decir, algunas posiciones en la
secuencia se mantienen constantes, o se seleccionan entre una
cantidad de posibilidades limitada. Por ejemplo, en una realización
preferida, los nucleótidos o restos de aminoácidos se aleatorizan en
una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrófobos, restos
hidrófilos, restos estéricamente polarizados (pequeños o grandes),
hacia la creación de cisteínas, para entrecruzamientos, prolinas
para dominios SH-3, serinas, treoninas, tirosinas o
histidinas para sitios de fosforilación, etc., o a purinas, etc.
En otra realización, los agentes candidatos son
ácidos nucleicos. Por "ácido nucleico" u "oligonucleótido"
o equivalentes gramaticales en este documento se entiende al menos
dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. Un ácido nucleico
de la presente invención es preferiblemente monocatenario o
bicatenario y generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque
en algunos casos, como se indica a continuación, se incluyen
análogos de ácidos nucleicos que pueden tener estructuras
alternativas, que comprenden, por ejemplo, fosforamida (Beaucage
y col. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925) y referencias
en el mismo; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl y col.
(1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger y col. (1986)
Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai y col. (1984)
Chem. Lett. 805, Letsinger y col. (1988) J. Am.
Chem. Soc. 110: 4470; y Pauwels y col. (1986) Chemica
Scripta 26: 141 9), fosforotioato (Mag y col. (1991) Nucleic
Acids Res. 19: 1437; y Patente de Estados Unidos Nº 5.644.048),
fosforoditioato (Briu y col. (1989) J. Am. Chem. Soc.
111: 2321), enlaces O-metilfosforoamidita (véase
Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical
Approach, Oxford University Press), y estructuras y enlaces de
ácidos peptidonucleicos (véase Egholm (1992) J. Am. Chem.
Soc. 114: 1895; Meier y col. (1992) Chem. Int. Ed.
Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature, 365: 566; Carlsson
y col. (1996) Nature 380: 207). Otros ácidos
nucleicos análogos incluyen aquellos con estructuras positivas
(Denpcy y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
6097; estructuras no iónicas (Patentes de Estados Unidos Nº
5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew.
(1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger y col.
(1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger y col.
(1994) Nucleoside & Nucleotide 13: 1597; Capítulos 2 y 3,
ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in
Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker
y col. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.
4: 395; Jeffs y col. (1994) J. Biomolecular NMR 34:
17; Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) y estructuras sin
ribosa, incluyendo las descritas en las Patentes de Estados Unidos
Nº 5.235.033 y 5.034.506, y los Capítulos 6 y 7, ASC Symposium
Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense
Research, Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos
que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen
en la definición de ácidos nucleicos (véase Jenkins y col.
(1995), Chem. Soc. Rev. págs. 169-176). Se
describen varios análogos de ácidos nucleicos en Rawls, C & E
News 2 de junio de 1997 página 35. Estas modificaciones de la
estructura ribosa-fosfato pueden hacerse para
facilitar la adición de restos adicionales tales como marcadores, o
para aumentar la estabilidad y semivida de dichas moléculas en
medios fisiológicos.
Además, pueden prepararse mezclas de ácidos
nucleicos y análogos de origen natural. Como alternativa, pueden
prepararse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos, y
mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural. Los
ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, según se
especifique, o contener partes de secuencia tanto bicatenaria como
monocatenaria. El ácido nucleico puede ser ADN, genómico y ADNc,
ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico contiene cualquier
combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y
cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina,
citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina,
isoguanina, etc.
Como se ha descrito anteriormente en líneas
generales para proteínas, los agentes candidatos de ácidos nucleicos
pueden ser ácidos nucleicos de origen natural, ácidos nucleicos
aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "polarizados". Por
ejemplo, pueden usarse digestiones de genomas procariotas o
eucariotas como se ha indicado anteriormente para proteínas.
En una realización preferida, los agentes
bioactivos candidatos son restos químicos orgánicos, una amplia
diversidad de los cuales está disponible en la bibliografía.
En una realización preferida, el agente
candidato es una molécula pequeña. La molécula pequeña es
preferiblemente de 4 kilodalton (kd) o menos. En otra realización,
el compuesto es de menos de 3 kd, 2 kd o 1 kd. En otra realización,
el compuesto es de menos de 800 dalton (D), 500 D, 300 D o 200 D.
Como alternativa, la molécula pequeña es de aproximadamente 75 D a
100 D, o como alternativa, de 100 D a aproximadamente 200 D.
Como se ha indicado anteriormente, la
composición o composiciones de ensayo pueden proporcionarse como
miembros de una "biblioteca" o "conjunto" de compuestos.
Dichos conjuntos o bibliotecas pueden producirse simplemente
combinando dos o más diferentes composiciones de ensayo. Sin
embargo, para explorar de manera eficaz una amplia cantidad de
diferentes composiciones de ensayo, las bibliotecas preferidas
contienen una gran cantidad de diferentes composiciones. Por tanto,
la producción de bibliotecas a menudo utiliza técnicas de síntesis
química combinatoria para producir una "biblioteca química
combinatoria". Una biblioteca química combinatoria es un
conjunto de diversos compuestos químicos generados por síntesis
química o síntesis biológica combinando varios "componentes
básicos" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, se forma una
biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de
polipéptidos combinando una serie de componentes básicos químicos
llamados aminoácidos en cada modo posible para una longitud de
compuesto dada (es decir, la cantidad de aminoácidos en un
compuesto polipeptídico). Pueden sintetizarse millones de compuestos
químicos a través de dicha mezcla combinatoria de componentes
básicos químicos (Gallop y col. (1994) 37 (9):
1233-1250).
Dichas bibliotecas químicas existen en
continuidad entre dos objetivos funcionales. Se usan bibliotecas
"de amplia exploración" para explorar rápidamente un amplio
intervalo de diversos agentes. Por tanto, las bibliotecas "de
amplia exploración" se caracterizan por un tamaño de biblioteca
grande, una amplia diversidad estructural, sin objetivo estructural
específico y típicamente se sintetizan utilizando una amplia
cantidad de diferentes "componentes básicos". Al otro lado del
espectro, se usan bibliotecas para "formación de análogos
químicos" para proporcionar sujetos para explorar una amplia
diversidad de análogos químicos relacionados. Las bibliotecas de
formación de análogos químicos típicamente son de un tamaño de
biblioteca moderado, muestran una diversidad estructural
relativamente estrecha, contienen un repertorio relativamente
limitado de componentes básicos, típicamente se sintetizan usando
un orden específico de combinación de componentes básicos.
La preparación y exploración de bibliotecas
químicas combinatorias es bien conocida por los especialistas en la
técnica (véase, por ejemplo, Gorden y Kerwin (1998) Combinatorial
Chemistry and Molecular Diversity in Drug Discovery, John Wiley
& Sons, Inc. N.Y.). Dichas bibliotecas químicas combinatorias
incluyen, aunque sin limitación, bibliotecas peptídicas (véase, por
ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.410.175, Furka (1991) Int.
J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493, Houghton y
col. (1991) Nature, 354: 84-88). La síntesis
peptídica es de ningún modo el único enfoque previsto y pretendido
para su uso con la presente invención. También pueden usarse otras
químicas para generar bibliotecas de diversidad química. Dichas
químicas incluyen, aunque sin limitación: peptoides (Publicación
PCT Nº WO 91/19735, 26 de diciembre de 1991), péptidos codificados
(Publicación PCT WO 93/20242, 14 de octubre de 1993),
bio-oligómeros aleatorios (Publicación PCT WO
92/00091, 9 de enero 1992), benzodiazepinas (Patente de Estados
Unidos 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas,
benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y col. (1993) Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913), polipéptidos
vinílogos (Hagihara y col. (1992) J. Amer. Chem. Soc.
114: 6568), peptidomiméticos no peptídicos con una estructura
\beta-D-Glucosa (Hirschmann y
col., (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:
9217-9218), sintetizados orgánicos análogos de
bibliotecas de pequeños compuestos (Chen y col. (1994) J.
Amer. Chem. Soc. 116: 2661), oligocarbamatos (Cho, y
col., (1993) Science 261: 1303), y/o peptidil fosfonatos
(Campbell y col., (1994) J. Org. Chem. 59: 658;
Gordon y col., (1994) J. Med. Chem. 37: 1385),
bibliotecas de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Strategene,
Corp.), bibliotecas de ácidos peptidonucleicos (véase, por ejemplo,
Patente de Estados Unidos 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos
(véase, por ejemplo, Vaughn y col. (1996) Nature
Biotechnology, 14 (3): 309-314), y
PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véase, por ejemplo,
Liang y col. (1996) Science, 274:
1520-1522, y Patente de Estados Unidos 5.593.853), y
bibliotecas de pequeñas moléculas orgánicas (véase, por ejemplo,
benzodiazepinas: Baum (1993) C&EN, 18 de enero, página
33; isoprenoides: Patente de Estados Unidos 5.569.588;
tiazolidinonas y metatiazanonas: Patente de Estados Unidos
5.549.974; pirrolidinas: Patentes de Estados Unidos 5.525.735 y
5.519.134; compuestos morfolino: Patente de Estados Unidos
5.506.337; benzodiazepinas: 5.288.514; y similares).
Están disponibles en el mercado dispositivos
para la preparación de bibliotecas combinatorias (véase, por
ejemplo, 357 MPS, 390 NWS, Advanced Chem Tech, Louisville KY;
Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A Applied Biosystems, Foster City,
CA; 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA).
También se han desarrollado varios sistemas
robóticos bien conocidos para químicas en fase de solución. Estos
sistemas incluyen estaciones de trabajo automáticas como el aparato
de síntesis automática desarrollado por Takeda Chemical Industries,
LTD. (Osaka, Japón) y muchos sistemas robóticos que utilizan brazos
robóticos (Zymate 11, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca,
Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif) que imitan las
operaciones sintéticas manuales realizadas por un químico.
Cualquiera de los dispositivos anteriores es adecuado para su uso
con la presente invención. La naturaleza y ejecución de
modificaciones a estos dispositivos (si los hay) de modo que puedan
funcionar como se analiza en este documento será evidente para
especialistas en la técnica. Además, están disponibles en el
mercado en sí mismas numerosas bibliotecas combinatorias (véase,
por ejemplo, Com-Genex, Princeton, N. J., Asinex,
Moscú, Ru, Tfipos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscú, RU,
3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,
etc.).
Puede incluirse una diversidad de reactivos
diferentes en los ensayos de exploración. Éstos incluyen reactivos
como sales, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes,
etc. que pueden usarse para facilitar la óptima unión
proteína-proteína y/o reducir las interacciones no
específicas o de fondo. También pueden usarse reactivos que mejoran
de otro modo la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de
proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes
anti-microbianos, etc. La mezcla de componentes
puede añadirse en cualquier orden que proporcione la unión
necesaria.
En ciertas circunstancias, puede ser necesario
detectar la presencia y concentración de ciertos compuestos en
soluciones y en mezclas complejas antes de realizar los ensayos de
unión descritos anteriormente. Un modo para hacer esto es por el
uso de electroforesis. Un segundo medio es obtener anticuerpos
policlonales y monoclonales usando procedimientos conocidos por los
especialistas en la técnica, y realizar inmunoensayos (véase, por
ejemplo, Coligan (1991), Current Protocols in Immunology,
Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989), Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY; Stites y
col. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange
Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en el
mismo; Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y
Milstein (1975) Nature, 256: 495-497).
Dichas técnicas incluyen preparación de
anticuerpos por selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de
anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares (véase, Huse
y col. (1989), Science, 246:
1275-1281; y Ward y col. (1989),
Nature, 341: 544-546). Por ejemplo, para
producir antisueros, se aisla un antígeno particular o un fragmento
del mismo como se describe en este documento. Por ejemplo, se
produce una proteína recombinante en una línea celular
transformada. Se inmuniza una cepa de ratones o conejos de la misma
estirpe con el componente usando un adyuvante convencional, tal
como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización
convencional. Como alternativa, puede usarse un péptido sintético
derivado del antígeno y conjugado con una proteína vehículo como
inmunógeno. Se recogen los sueros policlonales y se titulan frente
al inmunógeno en un inmunoensayo. Los antisueros policlonales con
un título de 10^{4} o superior se seleccionan y ensayan para su
reactividad cruzada contra componentes citoesqueléticos y
composiciones de ensayo o incluso otros componentes citoesqueléticos
y composiciones de ensayo, usando un inmunoensayo de unión
competitiva. Los anticuerpos monoclonales y policlonales
específicos y antisueros habitualmente se unirán con una K_{D} de
aproximadamente 0,1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente
1 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 0,1 \muM o
mejor, y mucho más preferiblemente 0,01 \muM o mejor.
Pueden usarse varios inmunógenos para producir
anticuerpos específicamente reactivos con componentes
citoesqueléticos y composiciones de ensayo. La proteína
recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de
anticuerpos monoclonales o policlonales. También puede usarse una
proteína de origen natural en forma pura o impura. También pueden
usarse péptidos sintéticos preparados usando los componentes
citoesqueléticos y secuencias de las composiciones de ensayo
descritas en este documento como inmunógeno para la producción de
anticuerpos contra la proteína. La proteína recombinante puede
expresarse en células eucariotas o procariotas como se ha descrito
anteriormente, y purificarse como se ha descrito en líneas
generales anteriormente. El producto después se inyecta en un
animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos
monoclonales o policlonales, para el uso posterior en inmunoensayos
para medir el componente citoesquelético.
Los procedimientos para la producción de
anticuerpos policlonales son conocidos por los especialistas en la
técnica. En resumen, se mezcla un inmunógeno, preferiblemente un
componente citoesquelético purificado, con un adyuvante y se
inmunizan los animales. La respuesta inmune del animal contra la
preparación inmunogénica se controla tomando muestras sanguíneas de
ensayo y determinando el título de reactividad contra los
componentes citoesqueléticos y composiciones de ensayo. Cuando se
obtienen títulos apropiadamente altos de anticuerpos contra el
inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. El
fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer los
anticuerpos reactivos contra un componente citoesquelético puede
hacerse si se desea. (Véase Harlow y Lane, supra).
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por
diversas técnicas familiares para los especialistas en la técnica.
En resumen, se inmortalizan células esplénicas de un animal
inmunizado con un antígeno deseado, habitualmente por fusión con
una célula de mieloma (Véase, Kohler y Milstein (1976) Eur. J.
Immunol. 6: 511-519). Los procedimientos
alternativos de inmortalización incluyen transformación con Virus
Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros procedimientos bien
conocidos en la técnica. Se exploran colonias que surgen de células
inmortalizadas únicas para la producción de anticuerpos de la
especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y puede
potenciarse el rendimiento de los anticuerpos monoclonales
producidos por dichas células por diversas técnicas, incluyendo
inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Como
alternativa, pueden aislarse secuencias de ADN que codifican un
anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo explorando
una biblioteca de ADN de células B humanas de acuerdo con el
protocolo general descrito por Huse y col. (1989)
Science 246: 1275-1281.
Puede medirse un antígeno particular por una
diversidad de procedimientos de inmunoensayo. Para una revisión de
los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en general, véase
Basic and Clinical Immunology, 7ª Edición (D. Stites y A.
Terr ed.) 1991. Además, los inmunoensayos de la presente invención
pueden realizarse en cualquiera de varias configuraciones, que se
revisan de manera amplia en Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio,
ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); "Practice and Theory
of Enzyme Immunoassays," P, Tijssen, Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers
B.V. Amsterdam (1985); y Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory
Manual, supra.
Los inmunoensayos para componentes
citoesqueléticos y agentes de ensayo de la presente invención pueden
usar un antisuero policlonal surgido contra el componente
citoesquelético o agente de ensayo o un fragmento del mismo. Este
antisuero se selecciona para que tenga una baja reactividad cruzada
contra otras proteínas (componentes no citoesqueléticos y
composiciones de ensayo o componentes citoesqueléticos y
composiciones de ensayo) y se retira cualquier reactividad cruzada
por inmunoabsorción antes de su uso en el inmunoensayo.
Para producir antisueros para su uso en un
inmunoensayo, se aisla el componente citoesquelético como se ha
descrito en este documento. Por ejemplo, se produce una proteína
recombinante en una línea celular transformada. Se inmuniza una
cepa de ratones de la misma estirpe tal como balb/c con el
componente citoesquelético seleccionado usando un adyuvante
convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de
inmunización de ratones convencional. Como alternativa, puede
usarse un péptido sintético derivado de las secuencias descritas en
este documento y conjugado con una proteína vehículo como
inmunógeno. Se recogen los sueros policlonales y se titulan frente
a la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo, un
inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un
soporte sólido. Se seleccionan los antisueros policlonales con un
título de 10^{4} o superior y se ensayan para su reactividad
cruzada contra componentes no citoesqueléticos y composiciones de
ensayo, usando un inmunoensayo de unión competitiva tal como el
descrito en Harlow y Lane, supra, en las páginas
570-573.
Pueden usarse inmunoensayos en formato de unión
competitiva para las determinaciones de reactividad cruzada. Por
ejemplo, puede inmovilizarse el antígeno en un soporte sólido. Se
añaden proteínas (otros componentes citoesqueléticos y
composiciones de ensayo, o componentes no citoesqueléticos y
composiciones de ensayo) al ensayo que compiten por la unión de los
antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas
anteriores de competir por la unión de los antisueros a la proteína
inmovilizada se compara con la proteína. Se calcula el porcentaje
de reactividad cruzada para las anteriores proteínas, usando
cálculos convencionales. Se seleccionan y combinan los antisueros
con una reactividad cruzada de menos del 10% con cada una de las
proteínas enumeradas anteriormente. Los anticuerpos con reactividad
cruzada se retiran opcionalmente de los antisueros combinados por
inmunoabsorción con las proteínas enumeradas anteriormente.
Los antisueros inmunoabsorbidos y combinados
después se usan en un inmunoensayo de unión competitiva como se ha
descrito anteriormente para comparar una segunda proteína con la
proteína inmunogénica, componentes citoesqueléticos y composiciones
de ensayo. Para hacer esta comparación, cada una de las dos
proteínas se ensaya en un amplio intervalo de concentraciones y se
determina la cantidad de cada proteína necesaria para inhibir el
50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada.
La presencia del polipéptido deseado (incluyendo
péptido, transcrito, o producto de digestión enzimática) en una
muestra también puede detectarse y cuantificarse usando análisis de
transferencia de Western. La técnica generalmente comprende separar
los productos de muestra por electroforesis en gel en base al peso
molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido
adecuado (tal como filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o
filtro de nylon derivatizado), e incubar la muestra con anticuerpos
de marcaje que se unen específicamente a la proteína analito. Los
anticuerpos de marcaje se unen específicamente al analito en el
soporte sólido. Estos anticuerpos se marcan directamente, o como
alternativa se detectan posteriormente usando agentes de marcaje
tales como anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de oveja
anti-ratón marcados en los que el anticuerpo contra
un analito es un anticuerpo murino) que se une específicamente al
anticuerpo de marcaje.
En una realización, los ensayos de esta
invención están facilitados por el uso de bases de datos para
registrar los resultados del ensayo. De forma particular con el uso
de sistemas de exploración a gran escala (por ejemplo, exploración
de bibliotecas combinatorias) el manejo de los datos puede llegar a
ser una cuestión significativa. Por ejemplo, todos los hexapéptidos
naturales se han sintetizado en un único experimento combinatorio
que produjo aproximadamente 64 millones de moléculas diferentes.
Procedimientos automáticos de recuperación de información pueden
ayudar al mantenimiento y manejo de una fracción incluso pequeña de
la información obtenida explorando dicha biblioteca, por ejemplo,
una base de datos informática.
Dicha base de datos es útil para una diversidad
de funciones, incluyendo, aunque sin limitación, registro de
bibliotecas, presentación de bibliotecas o resultados,
especificación de bibliotecas y/o resultados, documentación, y
recuperación de datos y análisis de datos exploratorios. La función
de registro de una base de datos proporciona un
registro/inscripción de mezclas combinatorias y resultados de
ensayos para proteger la información del propietario de un modo
análogo a la inscripción/protección de sustancias tangibles de un
propietario. Las funciones de presentación de bibliotecas y
resultados de ensayo proporcionan un medio eficaz para revisar y/o
categorizar datos de ensayo relevantes. Cuando los ensayos utilizan
mezclas combinatorias complejas para agentes de ensayo, la base de
datos es útil para la especificación/descripción de bibliotecas. La
base de datos también proporciona documentación de los resultados
de ensayo y la capacidad de recuperarlos rápidamente,
correlacionarlos (o análisis estadístico), y evaluar los datos de
ensayo.
Por tanto, en algunas realizaciones preferidas,
los ensayos de esta invención implican adicionalmente introducir el
agente o agentes de ensayo identificados como positivos (es decir,
que tienen un efecto sobre la actividad citoesquelética) en una
base de datos de compuestos "positivos" y más preferiblemente
en una base de datos de compuestos principales, terapéuticos o
bioagrícolas.
La base de datos puede ser cualquier medio
adecuado para registrar y recuperar información generada por los
ensayos de esta invención. Dichas bases de datos incluyen, aunque
sin limitación, sistemas de registro manuales y de indexado (por
ejemplo, sistemas de indexado en tarjeta con información binaria).
Sin embargo, las bases de datos son mucho más útiles cuando los
datos en la misma pueden recuperarse y manipularse fácil y
rápidamente (por ejemplo, almacenarse, clasificarse, analizarse,
y/u organizarse de otro modo). Por tanto, en una realización
preferida, la firma de las bases de datos de esta invención es mucho
más preferiblemente "automática", por ejemplo, bases de datos
electrónicas (por ejemplo, basadas en ordenadores). La base de datos
puede estar presente en un sistema informático "autónomo"
individual, o un componente de o distribuido a lo largo de múltiples
"nodos" (procesadores) en un sistema informático distribuido.
Los sistemas informáticos para su uso en el almacenamiento y
manipulación de bases de datos son bien conocidos por los
especialistas en la técnica e incluyen, aunque sin limitación,
"sistemas informáticos personales", sistemas de procesador
central, nodos distribuidos en Internet o intranet, datos o bases
de datos almacenadas en un hardware especializado (por ejemplo, en
microchips), y similares.
Se describen adicionalmente en este documento
kits para la práctica de los procedimientos de ensayo descritos en
este documento. Los kits comprenden preferiblemente uno o más
recipientes que contienen uno o más de los componentes de ensayo
descritos en este documento. Dichos componentes incluyen, aunque sin
limitación, uno o más componentes citoesqueléticos, uno o más
agentes de ensayo, soportes sólidos (por ejemplo, placas de
microtitulación) con uno o más componentes unidos, tampones,
marcadores, y otros reactivos como se ha descrito en este
documento.
Los kits pueden incluir opcionalmente materiales
de instrucciones que contienen directrices (es decir, protocolos)
para realizar cualquiera de los ensayos descritos en este documento.
Aunque los materiales de instrucciones típicamente comprenden
materiales escritos o impresos no se limitan a ello. Se contempla
por esta invención cualquier medio capaz de almacenar dichas
instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Dichos medios
incluyen, aunque sin limitación, medios de almacenamiento
electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos,
chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), y similares. Dichos
medios pueden incluir direcciones de sitios de internet que
proporcionan dichos materiales de instrucciones.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para
ilustrar, pero no limitar la invención reivindicada, que se define
en las reivindicaciones.
Ejemplo
1
Para observar la unión de una única molécula
motora, se prepararon fusiones motor-GFP. Estudios
previos han demostrado que moléculas GFP sencillas (la variante
Ser65Thr) puede detectarse por microscopía TIR (Pierce y
col., 1997, Nature 388: 388). Para la quinesina de tipo
silvestre y la quimera NK-1, se fusionó GFP al
resto 560 C-terminal. En el caso de Ncd, se fusionó
GFP al resto 236 N-terminal, que conserva 3/4 partes
del tallo de superenrollamiento de Ncd y el dominio motor completo
pero carece del dominio N-terminal que sujeta los
microtúbulos (Chandra y col. (1993) J. Biol. Chem.
268: 9005-9013). Este procedimiento de fusión de
GFP es ventajoso en comparación con la modificación con colorante
fluorescente, que tiende a inactivar el dominio catalítico Ncd. El
análisis de intensidad hidrodinámica y de una única mancha de
fluorescencia indicó que K560-GFP y
Ncd-GFP son dímeros en condiciones de ensayo.
Usando proteína fluorescente verde fusionada al
polímero, la proteína de unión, este ensayo puede realizarse en
extractos celulares brutos. Las quimeras GFP proporcionan dos
ventajas. Primero, esto alivia la necesidad de purificar la
proteína que interacciona con polímeros hasta homogeneidad antes de
realizar el ensayo de unión. En muchos casos, la purificación y
marcaje fluorescente de muchas proteínas es demasiado difícil,
debido a sus cantidades limitadas en células. Segundo, el esfuerzo
para explorar el fármaco puede realizarse en el medio proteico de
un extracto de células enteras. Esto es ventajoso, ya que está
presente una mezcla compleja de moléculas competidoras para el
fármaco.
Se clonó una construcción de quinesina
convencional humana que comprende los restos 1-560
con una cola C terminal de 6 histidinas (6xHis) en pET17B (Novagen,
Inc.). La quimera NK-1 se construyó realizando PCR
sobre la construcción GST-MC1 (Chandra y
col., 1993, J. Biol. Chem. 268:
9005-9013) con el oligo 5' correspondiente a los
aminoácidos 348-359 y el oligo 3' correspondiente a
los aminoácidos 656-657 para generar el producto 1
de PCR (que codifica los aminoácidos 348-667). Se
realizó una segunda reacción de PCR sobre el vector
K560-6xHis anterior usando un oligo 5' que
corresponde a los aminoácidos 323-333 y un oligo 3'
que corresponde al aminoácido 7 y que se extiende 14 p.b. en el
promotor del vector para generar un producto de 3,9 kb (producto 2
de PCR) que incluía secuencias de quinesina N y C terminales así
como la secuencia del vector que está interviniendo. Los productos
1 y 2 se trataron con fosfatasa alcalina y el fragmento Klenow de
polimerasa para asegurar unos extremos romos. Los dos productos de
PCR después se ligaron y se introdujeron por transformación en
células DH5\alpha. La unión C-terminal del
producto ligado tuvo una deleción de pares de bases que después se
reparó por mutagénesis por PCR. La quimera reparada después se
subclonó entre los sitios Nde1 (aminoácido 1) y Mun1 (aminoácido
407) en el vector K560-6xHis pET17B para eliminar
cualquier error inducido por PCR en el vector. NK-2
se generó por la misma estrategia que se ha indicado anteriormente
con la excepción de que el oligo 5' para el producto 1 de PCR
correspondía a los aminoácidos 49-60 y el
oligonucleótido 3' para el producto 2 de PCR correspondía a los
aminoácidos 48-37. La construcción
NK-3 se generó por el Stratagene QuikChange
(Stratagene, Inc.) usando oligonucleótidos que sustituyeron la
secuencia Ncd L11 (aminoácidos 586-597) para la
secuencia L11 de quinesina (aminoácidos 237-252) en
el vector K560-6xHis pET17B. El resto de la
clonación fue como se describe en Woehlke y col. (1997),
Cell 90: 207-216. Todas las regiones
codificantes se confirmaron por secuenciación de ADN.
Para las proteínas de fusión de GFP (véase Fig.
1), se usó PCR para introducir: un sitio Nd1 5' y un sitio Kpn1 3'
en el aminoácido 560 de la quinesina omnipresente humana y
NK-1, y 2) un sitio Kpn1 5' y una cola 6xHis 3' más
un sitio Xho1 en el mutante S65T de GFP (de R. Tsien (UCSD)).
Después, se fusionaron K560 y NK-1 a GFP en el
sitio Kpn1 introducido (que añade una secuencia engarce
Gly-Thr) y se clonó en pET17b entre los sitios Nde1
y Xho1. Para preparar la fusión de Ncd-GFP, se
añadió un sitio Kpn1 5' y un sitio Xho1 3' a Ncd aminoácidos
237-700, y un sitio Nhe1 5' más una cola 6xHis y un
sitio Kpn1 3' a GFP (otra vez añadiendo una secuencia engarce
Gly-Thr) mediante PCR. Estos productos se unieron
entre sí en los sitios Nhe1-Xho1 de pET17b. Todas
las secuencias obtenidas por PCR se confirmaron por secuenciación de
ADN.
Las construcciones se transformaron en la cepa
BL21(DE3) de E. coli, se hicieron crecer en
TPM-ampicilina (20 g/l de triptona, 15 g/l de
extracto de levaduras, 8 g/l de NaCl, glucosa 10 mM, 2 g/l de
Na_{2}HPO_{4}, 1 g/l de KH_{2}PO_{4} y 100 \mug/ml de
ampicilina) a 24ºC a una D.O._{600} de 1-2, y
después se indujo la expresión de proteínas durante
9-14 horas con IPTG 0,2 mM. Las células se lisaron
por prensa French (0,8 MPa) en NaPO_{4} 50 mM, imidazol 20 mM,
NaCl 250 mM, MgCl_{2} 1 mM, ATP 0,5 mM,
P-mercaptoetanol 10 mM (\betaME), leupeptina (1
\mug/ml), pepstatina (1 \mug/ml), quimiostatina (1 \mug/ml),
aprotinina (1 \mug/ml), y 0,25 mg/ml de Pefabloc (Boehringer
Mannheim) (50 ml de tampón por 2 l de cultivo). El sobrenadante de
una centrifugación 28.000 x g de 30 minutos se recogió y se incubó
con resina Ni-NTA (Qiagen, Inc.) durante 1 h a 4ºC
(1-2,5 ml de resina por 50 ml de sobrenadante). La
mezcla después se transfirió a una columna desechable, y la resina
se lavó con 50 ml de NaPO_{4} 50 mM (pH 6), NaCl 250 mM,
MgCl_{2} 1 mM, ATP 0,1 mM y \betaME 10 mM. Las proteínas se
eluyeron con NaPO_{4} 50 mM, imidazol-Cl 50 mM,
NaCl 250 mM, MgCl_{2} 1 mM, ATP 0,1 mM y \betaME 10 mM (pH
7,2). Las fracciones del pico después se diluyeron 5 veces en tampón
de columna suplementado con NaCl 50 mM y se purificaron
adicionalmente por cromatografía en mono-Q. Las
proteínas de fusión K560-GFP y
NK-1-GFP se purificaron por
cromatografía en mono-Q con elución a NaCl 0,35 M y
16 ml de un gradiente 0,2-1,0 M en NaPipes 25 mM
(pH 6,8; K560-GFP) o NaPO_{4} 10 mM (pH, 7,2;
NK-1-GFP) con MgCl_{2} 2 M, EGTA
1 mM, DTT 1 mM y ATP 0,1 mM. Se purificó adicionalmente
Ncd-GFP por cromatografía en mono-S
con elución a NaCl 0,3 M en 30 ml de un gradiente de NaCl
0,1-1,1 mM en NaPO_{4} 10 mM (pH
7-2), MgCl_{2} 2 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM y ATP
0,1 mM. Las proteínas de fusión motor-GFP después se
sometieron a una etapa de purificación por afinidad por
microtúbulos adicional incubando con microtúbulos y AMPPNP 1 mM,
centrifugando el complejo motor-microtúbulo y
liberando el motor activo del microtúbulo con MgATP 5
mM/KCl 200 mM.
mM/KCl 200 mM.
Para todas las preparaciones, se añadió sacarosa
al 10-20% a las fracciones del pico antes de
congelar y almacenar en nitrógeno líquido. Las concentraciones de
proteína se calcularon procesando la quinesina junto con una curva
patrón de BSA en un gel de SDS poliacrilamida, tinción con
Coomassie, captura de la imagen en el gel con una cámara ccd, y
después midiendo las densidades ópticas usando el programa
informático NIH Image.
Los motores del pico de las fracciones con
mono-Q se adsorbieron sobre superficies de vidrio de
células de flujo de microscopio a concentraciones de
0,5-10 \muM. Para las proteínas de fusión
motor-GFP, primero se adsorbieron anticuerpos
policlonales anti-GFP purificados por afinidad sobre
la superficie de vidrio, se lavó la célula de flujo con tampón, y
después se dejó que los motores se unieran a la superficie revestida
con anticuerpo. Se añadió un tampón que contenía NaMOPS 15 mM (pH
7), NaCl 50 mM, taxol 20 \muM, 10 \mug/ml de microtúbulos
marcados con rodamina (Hyman y col. 1990, Meth, Enzym.
196: 303-319), ATP 1 mM, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 2
mM, DTT 1 mM, 2 mg/ml de caseína, y un sistema de eliminación de
oxígeno compuesto por glucosa 22 mM,
P-mercaptoetanol al 0,5%, 0,2 mg/ml de glucosa
oxidasa, y 36 \mug/ml de catalasa (Harada y col., 1990,
J. Mol. Biol. 216: 49-69). La unión también
se observó en los tampones de fuerza iónica inferior empleados en
los ensayos de movilidad por fluorescencia molecular sencilla.
Los microtúbulos de polaridad marcada (Hyman
(1991) J. Cell Sci. Supp. 14: 125-127) se
prepararon polimerizando primero microtúbulos cortos de
rodamina-tubulina y GMPCPP 0,5 mM (un análogo de GTP
no hidrolizable). Estos microtúbulos marcados de forma brillante
después se usaron como semillas para polimerizar un segmento de
microtúbulo débilmente marcado con 0,1 mg/ml de tubulina marcada
con rodamina, 1,5 mg/ml de tubulina no marcada, y 1,5 mg/ml de
tubulina modificada con NEM (Hyman y col. 1990, Meth.
Enzym. 196: 303-319) que inhibe el crecimiento
del extremo menor. Se usaron microtúbulos con polaridad marcada.
Para el ensayo de fluorescencia molecular
sencilla, se diluyeron proteínas motor-GFP a una
concentración de 1-50 nM en un tampón que contenía
ATP 1 mM, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, 7,5 mg/ml de albúmina de suero
bovino (BSA) como proteína vehículo, y el sistema de eliminación de
oxígeno descrito anteriormente. La quinesina-GFP se
ensayó de manera convencional en la solución anterior con KPipes 12
mM (pH 6,9). También se usó una diversidad de condiciones de
tampón, incluyendo KPipes 12 mM (pH 6,8), KMOPS 12 mM (pH 7), KMOPS
50 mM (pH 7), KMOPS 50 mM (pH 7) con NaCl 50 mM.
Se iluminaron los microtúbulos marcados con
rodamina con una lámpara de mercurio de 100 W y se formaron imágenes
por microscopía por epifluorescencia usando un objetivo 60x, 1.4
N.A. (Olympus, Inc.). La imagen se proyectó en una cámara de
objetivo intensificado con silicio (Hamamatsu, Inc.) y después se
registró en una cinta SVHS.
Para la formación de imágenes de fluorescencia
de una sola molécula, se dispusieron en gotas 4 \mul de la mezcla
de ensayo descrita anteriormente sobre un portaobjetos de cuarzo
limpio, se cubrió con un cubreobjetos de 12 ml, se precintó con
cemento de goma, y se formaron imágenes en un microscopio de banco
óptico TIR de bajo fondo construido por los autores (Pierce y Vale,
1997). En resumen, se usó un láser de iones argón a 488 nm y 5 mW
para excitar GFP, y se puso en funcionamiento un láser HeNe a 0,4 mW
para excitar los axonemas de erizo de mar (preparados como se ha
descrito por Gibbons y Fronk (1979), J. Biol. Chem. 254:
187-196) y se marcaron con tinte Cy5 (Vale y
col. 1996, Nature 380, 451-453). La
iluminación láser se pasó a través de una serie de placas X/4 para
producir luz polarizada circular y se centró por lentes de 25 cm a
un ángulo apropiado a través de un prisma para producir una
reflexión interna total e iluminación del campo evanescente de un
área de 30 x 400 mm en la muestra (Funatsu y col., 1995,
Nature 374: 555-559). La fluorescencia se
recogió por un objetivo Nikon PlanApo 100/1.4, alineado, se pasó a
través de un espejo dicrómico diseñado para el cliente y filtros de
barrera y se centró en una cámara CCD acoplada a un tubo
intensificador SR UB Gen3+ seleccionado de Stanford Photonics Inc.
Los datos se registraron en una cinta de vídeo después de la
potenciación del contraste por un procesador de imágenes
Argus-20 (Hamamatsu Photonics, Inc.). El
comportamiento de la fluorescencia de la única molécula GFP se
describe en otras partes (Pierce y col., 1997, Nature
388: 388).
Cuando se combinó K560-GFP con
los microtúbulos del axonema y ATP, pudieron observarse fácilmente
manchas fluorescentes individuales que se unen al axonema, como se
ha mostrado previamente (Pierce y col., 1997, Nature
388: 388). Por el contrario, a
NK-1-GFP y Ncd-GFP
10 nM, las manchas fluorescentes no se asociaron con los axonemas a
niveles mayores del de fondo, lo que indica que las asociaciones de
los microtúbulos deben ser muy transitorias. La capacidad de
Ncd-GFP y NK-1-GFP
de unirse a los microtúbulos de este modo se demostró induciendo un
estado de unión de los microtúbulos fuerte eliminando el ATP, que
provocó la asociación de la mayoría de las moléculas fluorescentes
con el axonema.
El procedimiento anterior implica iluminación
superficial selectiva y la visión sin retirar la proteína libre en
solución. Sin embargo, usando una etapa adicional de retirar
físicamente la solución, puede hacerse una lectura de la
fluorescencia de la superficie usando un fluorímetro
convencional.
Ejemplo
2
Este ejemplo describe la unión específica de
proteínas con colas de poliarginina a superficies de mica cargadas
negativamente atómicamente planas. Las colas de poliarginina se
expresaron como proteínas de fusión. Se muestra en este documento
que las proteínas con colas de arginina (por ejemplo, hexaarginina)
se unen a la mica mediante la cola Arg en base al intercambio
iónico de cationes de potasio de origen natural. Se observó sólo la
unión no específica con la proteína de control que está libre de la
cola Arg. Esta nueva tecnología facilita la orientación uniforme y
específica de proteínas inmovilizadas en un sustrato convencional
usado para muchas aplicaciones relacionadas con superficies.
Se obtuvo mica moscovita de Provac
(Liechtenstein). El plásmido pGFPuv era de Clontech (Palo Alto, CA)
y el vector pET28a(+) era de Novagen (Madison, WI). Los otros
reactivos eran de Sigma Chemical (St. Louis, MO) y de calidad
altamente disponible. Se usó agua ultrapura con una resistencia de
18 Nffcm para todos los tampones acuosos (purificado por pases a
través de un sistema de purificación Milli-Q).
Para la adición de seis restos de histidina al
extremo N-terminal de GFP, se diseñaron dos
cebadores de oligodesoxirribonucleótidos: uno que corresponde a la
parte N-terminal del gen de GFP
(5'-GGA ATT CCA TAT GAG TAA AGG AGA AGA ACT TTT
C-3', denominado cebador Nº 1, SEC. ID Nº: 1) y un
segundo que corresponde a la parte C-terminal
(5'-GAC CGG CGC TCA GTT GGA ATT
C-3', denominado cebador Nº 2, Sec. ID Nº: 2). Estos
oligodesoxirribonucleótidos se usaron para PCR con 20 ng de pGFPuv
linealizado como molde. Los fragmentos amplificados, digeridos con
Nde1 y BamH1, se ligaron con el vector de expresión linealizado
pET28a(+). El plásmido pGFPH6 resultante se usó para la
transformación de E. coli BL21 (DE3). Se siguieron protocolos
convencionales para el manejo del ADN y la transformación
bacteriana (Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory Press).
Para introducir una cola de seis restos de
arginina en la parte N o C-terminal de GFP, se usó
el mismo procedimiento con los siguientes
oligodesoxirribonucleótidos: (cebador Nº 2) y 5'-GGA
ATT CCA TAT GCG CCG TCG CCG TCG CCG TAT GAG TAA AGG AGA AGA ACT TTT
C-3' para GFPH6R6, (cebador Nº 1) y
5'-TTG GAA TTC ATT AGC GAC GGC GAC GGC GAC GCG CGG
TGC CTT TGT AGA GCT CAT CCA TG-3' para GFPR6. El
procedimiento de PCR y clonación se realizó como se ha descrito
anteriormente. Los plásmidos resultantes pGFPH6R6 y pGFPR6 se usaron
para transformar E. coli BL21 (DE3).
Todas las proteínas expresadas llevan una cola
codificada por el vector de una secuencia
hexa-histidina para la purificación por
cromatografía de afinidad por quelados de metal en una matriz
Ni^{2+}/NTA (Qiagen, Santa Clarita, CA). Las células se hicieron
crecer a 37ºC agitando en medio LB que contenía 25 mg/ml de
Kanamicina. A una DO_{600} de 0,8 las células se indujeron con
IPTG 1 mM, y 5 h después, se recogieron por centrifugación a 6000 x
g durante 10 minutos. Las células se lisaron por adición de lisozima
a una concentración de 100 mg/ml y 10% (v/v) de Triton
X-100 al 1% en Tris-HCl 50 mM pH
7,5, KCl 50 mM, EDTA 1 mM. Después de la incubación durante 30
minutos en hielo, se añadió MgCl_{2} a una concentración final de
40 mM. El ADN liberado se digirió añadiendo 0,2 mg/ml de ADNasa por
ml de lisado. El lisado se incubó durante 15 minutos en hielo y
después se centrifugó a 30.000 x g durante 40 min. El sobrenadante
transparente se dializó frente a tampón que contenía Hepes/NaOH 10
mM pH 7,4, NaCl 50 mM, y después se aplicó a una columna de
Ni^{2+}/NTA. Las proteínas débilmente se eluyeron con imidazol 10
mM pH 8,0. Las proteínas con colas his se eluyeron con imidazol 500
mM en el caso de GFPH6 con imidazol 500 mM, NaCl 500 mM para todas
las demás variantes (la cola Arg provocó una interacción iónica
fuerte con la matriz Ni^{2+}/NTA). Las proteínas eluídas se
dializaron contra tampón que contenía Hepes/NaOH 10 mM pH 7,4, NaCl
50 mM, glicerol al 50% y se almacenaron a -20ºC. La pureza de las
proteínas recombinantes se estimó por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida y se descubrió que era mayor del
95%.
Se cortaron hojas de mica en trozos de 5 x 5 cm
y se escindieron justo inmediatamente antes de su uso. Se aplicaron
gotas de soluciones proteicas (GFPH6, GFPR6, GFPH6R6) a una
concentración de 10 mg/ml sobre las superficies hidrófilas
previamente no expuestas provocando 2 películas acuosas de
aproximadamente 4 cm^{2} de tamaño. Después de incubación durante
5 minutos, las hojas de mica se lavaron con 10 ml de agua. Las
partes centrales, de 1 cm^{2} de tamaño, se cortaron después para
asegurar que no había contaminantes en los bordes que pudieran
falsificar los análisis posteriores. Para cada dato puntual se
analizaron cuatro superficies y se hizo un promedio de las
lecturas. Estas superficies, almacenadas por separado en tubos
Eppendorf, se sometieron después a etapas de lavado consecutivas de
un minuto con 400 ml de tampón Hepes/NaOH 10 mM pH 7,4 que contenía
concentraciones en aumento de sal con diferentes cationes mono y
divalentes (50, 125, 250 mM, Na^{+}, K^{+}, Mg^{2+}). Para la
cuantificación de GFP activa, absorbida, los eluídos se recogieron
por separado y se analizaron por medida de la fluorescencia a 509 nm
(excitación a 395 nm) usando un espectrofotómetro SLM8000 (Aminc,
Silver Spring, MD) y GFP de concentraciones conocidas como
patrón.
La determinación cualitativa de GFP inmovilizada
se realizó con espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS)
usando exploraciones finas N1s normalizadas contra los picos Si2s
correspondientes, un elemento que no sucede en proteínas. Para este
propósito, las proteínas adsorbidas se lavaron con las mismas
soluciones de contenido salino que se han mencionado anteriormente
(sin tampón) y finalmente se aclararon con agua ultrapura y se
secaron bajo una corriente de nitrógeno. Esto aseguró que los
espectros XPS no estaban dominados por las sales cristalizadas.
Se realizó XPS en un espectrómetro XPS Surface
Science Modelo 150 con una fuente AlK\alpha (1486 eV), un
monocromador de cuarzo, analizador hemisférico y un detector
multicanal. Una rejilla de níquel, colocada directamente por encima
de las muestras, y un neutralizador de cargas se usó para evitar los
artefactos debido a los efectos de carga. Los espectros se
acumularon en un ángulo de toma de 35'' y una aceptación angular de
30'', con un tamaño de mancha de 250 x 1000 \mum a una presión a
menos de 1 x 10 ^{-8} Torr. Los picos N1s mostrados en este
ejemplo se normalizaron contra Si2s y se corrigieron para la
cantidad de exploraciones y los factores de sensibilidad
atómica.
Los resultados muestran que sólo aproximadamente
1 pmol de la GFPH6 libre de colas Arg permaneció unida después de
un lavado exhaustivo con Hepes/NaOH 10 mM, pH 7,4. Por el contrario,
aproximadamente 3 pmol de GFP con colas Arg permaneció unida
después de este lavado. Esencialmente todas las GFPH6 libres de
colas Arg se retiraron de la superficie por etapas de lavado
consecutivas con concentraciones en aumento de NaCl. Por el
contrario, sólo aproximadamente el 50% de las dos variantes de GFP
que comprendían colas de hexaarginina (GFPR6H6 y GFPR6) se
retiraron con NaCl. La liberación completa podría conseguirse por
elución con tampón de lavado que contiene arginina. Es probable que
esta proteína liberable de arginina estuviera exclusivamente unida
mediante su cola Arg, mientras que la liberada en las etapas de
lavado con NaCl procedía principalmente de la unión electrostática
de las proteínas a la superficie mediante otros grupos cargados en
la proteína.
Ejemplo
3
La esponja Adocia (Haliclona) sp.
(Colección Nº 95-100) se recogió en Palau, Western
Caroline Islands, y se congeló rápidamente. La esponja congelada
(225 g) se hizo en dados y se remojó en una mezcla de diclorometano
(300 ml) y metanol (1 l) durante 24 h. Los sólidos se retiraron por
filtración y la solución se redujo en volumen a 300 ml y se extrajo
con diclorometano (2 x 200 ml).
La fase acuosa se liofilizó para producir un
polvo amarillo pálido. El polvo (1,0 g) se sometió a cromatografía
dos veces en una columna C18 Sep-Pak en fase
inversa, usando un gradiente de MeOH al 30% en H_{2}O a metanol
al 100% (MeOH) como eluyente, para obtener fracciones puras que
contienen adociasulfato-1 y
adociasulfato-2 y una fracción mixta que contiene
adociasulfatos. La fracción mixta se separó por HPLC en fase inversa
usando 1:1 de MeOH-H_{2}O como eluyente. Las
fracciones puras se combinaron para obtener
adociasulfato-1 (13,5 mg),
adociasulfato-2 (14,1 mg) y
adociasulfato-3 (3,3 mg).
Se adsorbió TI-\gamma (un
miembro de la superfamilia de las quinesinas del hongo
Thermomyces lanuginosus) a un cubreobjetos de vidrio y se
suplementó con una mezcla de microtúbulos, Mg-ATP 2
mM, y extractos de esponja en DMSO (concentración final al 5%). La
movilidad se valoró visualmente en un microscopio Zeiss Axioplan
ajustado para DIC y equipado con un videoprocesador Argus 10
(Hamamatsu).
Todas las medidas cinéticas y de unión se
realizaron en un fragmento de la cadena pesada de quinesina de
Drosophila expresada en sistemas bacterianos que contiene
los aminoácidos 5-351 de la proteína de tipo
silvestre y una cola de hexahistidina en el extremo
C-terminal. La proteína se purificó de la fracción
soluble de células bacterianas inducidas por IPTG por una única
ronda de cromatografía de afinidad en
Ni-NTA-agarosa (Qiagen), se
concentró por microfiltración, y se congeló en pequeñas alícuotas en
nitrógeno líquido.
Las medidas de velocidad inicial se hicieron a
temperatura ambiente usando un ensayo de verde malaquita
(Geladopoulos y col. (1991) Anal. Biochem., 192:
112-116) modificado para trabajar en placas de
microtitulación de 96 pocillos y se registró en un lector de placa
a 650 nm. La dependencia de la concentración de ATP y la velocidad
ATPasa basal se determinaron por un ensayo enzimático acoplado con
piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa controlando los cambios
en la absorbancia a 340 nm. Los patrones fosfato (650
\muM-7 \muM) se incluyeron con cada lectura.
El porcentaje de ADP liberado de la enzima se
determinó por los procedimientos de Hackney (véase, por ejemplo,
Hackney (1994) J. Biol. Chem., 2690:
16508-16511). En resumen, se preincubó quinesina 80
\muM con \alpha^{32}-PATP a temperatura
ambiente durante 15 minutos y después se almacenó en hielo. Se
diluyeron alícuotas de 1 \mul de esa mezcla en 100 \mul de
"mezcla de rastreo" que contenía 0,5 mg/ml de piruvato quinasa,
fosfoenolpiruvato 2 mM, y concentraciones variables de
adociasulfato. A diferentes momentos puntuales se inactivaron
alícuotas de 5 \mul de la mezcla de rastreo en 100 \mul de HCV
1 M/ATP 1 mM/ADP 1 mM. La cantidad de ADP que llegó a estar
accesible a la piruvato quinasa y se convirtió en ATP se determinó
por una cromatografía en capa fina sobre
PEI-celulosa seguido por cuantificación con un
phosphoimager.
Inicialmente se ensayaron extractos de 268
esponjas marinas para su capacidad de alterar el comportamiento
normal de microtúbulos en un ensayo de movilidad sin motor. Este
procedimiento de exploración permitió la distinción inmediata entre
sustancias que afectaban al movimiento de los microtúbulos y
aquellas que causaban la despolimerización de los microtúbulos o
ruptura. Después se ensayaron los extractos activos de la
exploración inicial para la inhibición de la ATPasa de la quinesina
estimulada por microtúbulos.
Los candidatos más prometedores eran extractos
de la esponja Adocia sp. En el ensayo de movilidad,
estos extractos alteraron la unión de los microtúbulos a la
superficie revestida con quinesina, y el movimiento se anuló
totalmente. La ATPasa de la quinesina estimulada por los
microtúbulos también se inhibió completamente.
Se identificaron y aislaron tres compuestos
activos en el extracto. Estos compuestos específicos se mencionan
en este documento como adociasulfatos mientras que los compuestos
genéricos se mencionan como compuestos Adocia o inhibidores de
quinesina Adocia. La estructura de los compuestos Adocia o
adociasulfatos no se parece a la de los nucleótidos trifosfato.
Esto indica que las estructuras Adocia son diferentes de los
inhibidores de quinesina conocidos. Además, se cree que el espectro
de actividad de los compuestos Adocia es más estrecho que el de los
nucleótidos trifosfato o análogos de los mismos.
Para investigar adicionalmente la especificidad,
se ensayó un adociasulfato sobre una diversidad de ATPasas usando
el ensayo de actividad ATPasa descrito anteriormente. De las
ensayadas, las únicas enzimas que se inhibieron sustancialmente por
adociasulfatos son miembros de la superfamilia de quinesina (Tabla
2).
| Enzima | C50 |
| ATPasa de riñón de conejo | > 136 \muM* |
| Apirasa | > 136 \muM* |
| Miosina II (EDTA)^{A} | 75 \muM |
| CENP-E | 10 \muM^{D} |
| K5-351^{B} | 2 \muM^{E} |
| Enzima | C50 |
| K411^{C} | 2 \muM^{E} |
| TI-\gamma | 2 \muM^{E} |
| ncd | - |
| miosina | - |
| piruvato quinasa | - |
| * la enzima no se inhibió en un 50% a la concentración de inhibidor más alta usada de 136 mM; | |
| ^{A} EDTA activó ATPasa; | |
| ^{B} Construcción que contiene los aminoácidos 5-351 de la quinesina de Drosophila; | |
| ^{C} Construcción que contiene los primeros 411 aminoácidos de la quinesina de Drosophila; | |
| ^{D} a tubulina 6 mM; | |
| ^{E} a tubulina 2 mM; |
El comportamiento observado en el ensayo de
movilidad indicó que los adociasulfatos impiden la unión de los
microtúbulos al motor. Esto se ensayó realizando un ensayo de
cosedimentación de quinesina-microtúbulos en
presencia de un análogo de ATP no hidrolizable,
AMP-PNP, con o sin adociasulfato. La adición de
adociasulfato eliminó la unión de quinesina a los microtúbulos en
estas condiciones.
La consideración del ciclo mecanoquímico de la
quinesina sugiere que el efecto sobre la unión de los microtúbulos
podría inducirse observando la quinesina en un estado de unión débil
que se parece al intermedio quinesina-ADP por la
unión de adociasulfato en el bolsillo del nucleótido, o impidiendo
directamente el sitio de unión a microtúbulos. Las medidas de
cinética en estado estacionario demostraron que la inhibición
inducida por adociasulfato es competitiva con microtúbulos, y
podría invertirse totalmente por concentraciones altas de
microtúbulos.
Por el contrario, la variación de la
concentración de ATP no tuvo efecto sobre la forma global de las
curvas cinéticas. La V_{máx} disminuyó progresivamente a
concentraciones de adociasulfato mayores. Se obtiene un argumento
adicional contra la unión de adociasulfato en el bolsillo de
nucleótidos de la ausencia de un efecto inhibidor de la velocidad
basal, no estimulada por microtúbulos de las ATPasas de quinesina.
Si el adociasulfato impedía la unión de nucleótidos, o bloqueaba la
enzima en un estado unido a nucleótidos particular, la renovación
del ATP en ausencia de microtúbulos debe disminuir. Sin embargo,
concentraciones de hasta 136 \muM de adociasulfato (la más alta
ensayada) no inhibió la velocidad ATPasa basal.
La unión de microtúbulos a quinesina indujo una
estimulación de 1.000 veces la velocidad ATPasa basal, debida
principalmente a la liberación acelerada de ADP. Se ensayó si la
unión de adociasulfato a la quinesina podía imitar el efecto del
microtúbulo examinando la liberación de ADP de quinesina en
presencia de concentraciones variables de adociasulfato. En su
lugar, se observaron brotes de liberación de ADP y su magnitud se
correlacionó positivamente con la concentración de adociasulfato.
La concentración de adociasulfato al 50% del brote máximo es mucho
mayor que la K; determinado en ensayos de competición de
microtúbulos en estado estacionario. Esta discrepancia puede
reflejar las diferentes afinidades por adociasulfato en diferentes
estados de nucleótidos de la quinesina. Las medidas cinéticas en
estado estacionario de K_{i} reflejan la afinidad del estado de
unión más fuerte del ciclo completo, que incluye varios intermedios
quinesina-nucleótido (K-ATP,
K-ADP-Pi, K-ADP,
etc).
Por el contrario, el experimento de liberación
de ADP con adociasulfato implicó sólo un estado,
K-ADP. Es intrigante que el estado también tenga la
afinidad más baja por el microtúbulo. Fue inicialmente sorprendente
que el adociasulfato no estimulara la ATPasa basal de quinesina
aunque indujo la liberación de ADP. Sin embargo, durante las
medidas cinéticas en estado estacionario, cada molécula de quinesina
de una cabeza debe experimentar varios ciclos de
acoplamiento-desacoplamiento a las unidades de
microtúbulos. Por el contrario, AS supuestamente permanece unido a
través de renovaciones enzimáticas múltiples. El equivalente
fisiológico de dicho estado sería una molécula de quinesina
permanentemente acoplada a un dímero de tubulina único, un estado
para el que no existen datos cinéticos. Sin embargo, si la unión
del adociasulfato a la quinesina se parece a la unión de
microtúbulos, la asociación inicial debe dar como resultado un brote
de liberación de ADP como se observó.
Aunque la anterior invención se ha descrito con
algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de
claridad de entendimiento, será obvio que pueden practicarse ciertos
cambios y modificaciones en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (11)
1. Un procedimiento para identificar un
compuesto principal terapéutico que module la actividad del sistema
citoesquelético, comprendiendo dicho procedimiento:
i) proporcionar una mezcla de ensayo que
comprende un primer componente de un sistema citoesquelético y un
segundo componente de un sistema citoesquelético, donde dicho primer
componente y dicho segundo componente se unen específicamente entre
sí;
ii) poner en contacto dicha mezcla de ensayo con
un compuesto de ensayo a explorar para la capacidad de inhibir o
potenciar la unión entre dicho primer componente y dicho segundo
componente;
iii) detectar un cambio en el acoplamiento entre
la hidrólisis de ATP y la generación de fuerza; donde dicho cambio
indica que dicho compuesto modula la actividad de un sistema
citoesquelético, donde dicho primer y segundo componentes se
seleccionan entre el grupo constituido por polímeros
citoesqueléticos, proteínas motoras y proteínas de unión a polímeros
citoesqueléticos; y
iv) ensayar dicho compuesto de ensayo sobre una
diversidad de ATPasas.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho primer y segundo componentes son componentes de un
sistema de microtúbulos.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho primer y segundo componentes son componentes de un
sistema de actina/miosina.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicha mezcla de ensayo comprende un lisado celular.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho primer y segundo componentes se seleccionan entre el
grupo constituido por un par de unión seleccionado de la Tabla
1.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se exploran simultáneamente al menos 50 compuestos de
ensayo.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que se ensayan simultáneamente al menos dos diferentes pares de
primer componente y segundo componente.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dichos compuestos de ensayo son miembros de una biblioteca
combinatoria.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que dichos compuestos de ensayo son miembros de una biblioteca de
productos sintéticos o naturales.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho compuesto que se identifica es un agente terapéutico
principal para una enfermedad animal o humana.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho compuesto que se identifica es un agente de diagnóstico
principal.
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