ES2262448B1 - Peptidos lineales antimicrobianos. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a nuevos péptidos lineales que presentan actividad antimicrobiana. Dichos péptidos están formados por 11 aminoácidos, y tienen el grupo amino del aminoácido que constituye el extremo N-terminal sin derivatizar o funcionalizado con el grupo acetilo, p-toluensulfonilo, bencilo o benzoilo. El aminoácido que constituye el extremo C-terminal de dichos péptidos está en forma de carboxamida. La invención describe la síntesis y la utilización de los mencionados péptidos como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas para plantas. También se refiere a composiciones que comprenden dichos péptidos y un agente auxiliar, y a un método para prevenir y tratar infecciones y enfermedades de plantas causadas por bacterias patógenas.
Description
Péptidos lineales antimicrobianos.
La presente invención se refiere a péptidos
lineales que presentan propiedades antimicrobianas, que son
particularmente eficaces frente a bacterias patógenas de las
plantas, y se pueden emplear en composiciones fitosanitarias.
Las bacterias fitopatógenas son responsables de
pérdidas de gran importancia económica en producción vegetal. Entre
ellas se destacan, por ejemplo, las bacteriosis causadas por las
bacterias Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae, y
Xanthomonas vesicatoria.
Actualmente en Europa solamente están
autorizados algunos productos para la protección de las plantas
contra enfermedades bacterianas basados principalmente en derivados
cúpricos con una eficacia de control insuficiente.
Antibióticos, como kasugamicina o
estreptomicina, que hasta hace pocos años estaban autorizados en
algunos países, en la actualidad no están autorizados en Europa.
Los antibióticos estreptomicina y tetraciclina sí que están
autorizados en países como los EE.UU., pero en numerosos casos se
ha puesto de manifiesto la aparición de cepas resistentes del
patógeno que hacen su uso inefectivo, o que pueden suponer un
riesgo de transferencia de dicha resistencia a otras bacterias
patógenas. En el caso de las micosis causadas por hongos
fitopatógenos, si bien existen materias activas disponibles, se
requieren continuamente nuevos fungicidas, en parte por la aparición
de resistencias con una cierta frecuencia.
Además, muchos de los compuestos antibacterianos
conocidos más efectivos presentan una persistencia en el medio
ambiente que no es deseable.
En los últimos años se ha intensificado la
preparación de nuevos tipos de antibióticos que puedan evitar la
resistencia de las bacterias. Entre ellos destacan compuestos
aislados de la propia naturaleza, por ejemplo los péptidos, que
están presentes en plantas y animales, y algunos de los cuales
presentan propiedades antimicrobianas.
Las cecropinas son péptidos antimicrobianos
presentes en la hemolinfa de la mariposa Hyalophora cecropia
como respuesta a una infección bacteriana. En particular la
cecropina A es un péptido lineal formado por 37 aminoácidos, que
presenta una potente actividad lítica contra bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas. Sin
embargo, existen reticencias para su empleo en aplicaciones
fitosanitarias dado su elevado coste de producción, al tener una
longitud considerable, y su baja estabilidad frente a la degradación
por proteasas.
En Ali et al, Mol.
Plant-Microbe Interact., 2000, 13,
847-859 se describe un péptido activo frente a
algunas bacterias patógenas de las plantas como son Erwinia
carotovora subsp. carotovora, y Erwinia carotovora
subsp. atroseptica. Se trata de un undecapéptido preparado
por primera vez por Cavallarin et al, Mol.
Plant-Microbe Interact., 1998, 11,
218-227, que está formado por la secuencia de
aminoácidos
Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu,
y que el aminoácido del extremo C-terminal presenta
un grupo carboxamida. Dicho péptido es un péptido híbrido formado
por fragmentos de los péptidos de origen natural cecropina A y
melitina. Concretamente está constituido por los aminoácidos
2-8 de cecropina A y 6-9 de
melitina.
No se ha descrito la aplicación de dicho
undecapéptido frente a otras bacterias fitopatógenas como
Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas
syringae, que son particularmente relevantes porque afectan
plantas que son de gran importancia económica, y contra las que
hasta el momento los métodos utilizados para combatirlas son poco
efectivos.
Por ello, subsiste la necesidad de disponer de
nuevos compuestos antimicrobianos que presenten una buena eficacia
frente a bacterias patógenas de las plantas, en particular, frente a
las bacterias Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, o
Pseudomonas syringae.
Los autores de la presente invención han
desarrollado nuevos péptidos que resultan de fácil preparación y
que presentan una elevada eficacia para inhibir el crecimiento de
bacterias patógenas de las plantas, además presentan baja
citotoxicidad en células eucariotas, y una buena estabilidad a la
degradación por proteasas.
El objeto de la presente invención es
proporcionar péptidos lineales que presentan propiedades
antimicrobianas.
Forma también parte del objeto de la invención
la utilización de dichos péptidos como agentes antimicrobianos.
También es objeto de la invención una
composición fitosanitaria que comprende los péptidos de la
invención y un agente auxiliar.
Otro objeto de la invención es un método para
prevenir y tratar infecciones y enfermedades de las plantas
causadas por bacterias.
El objeto de la presente invención es
proporcionar péptidos lineales que responden a la fórmula general
(I):
(I)X_{1}-X_{2}-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-X_{3}-Leu-NH_{2}
en
donde
X_{1} es hidrógeno, acetilo,
p-toluensulfonilo, bencilo, o benzoílo,
X_{2} es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y
X_{3} es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp,
con la condición de que el péptido
en donde X_{1} es hidrógeno, X_{2} es Trp, y X_{3} es Val se
excluye
expresamente.
En la fórmula general, cuando X_{1} es
hidrógeno se representa como H, el grupo acetilo se representa como
Ac, el grupo p-toluensulfonilo como Ts, el grupo bencilo
como Bn, y el grupo benzoílo como Bz.
Las abreviaturas empleadas para los aminoácidos
en esta descripción siguen la normativa de la Comisión para la
Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, según se
describe en el libro Biochemical Nomenclature and Related
Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, Londres [ISBN
1-85578-005-4]. De
esta forma Leu es L-leucina, Lys significa
L-lisina, Ile es L-isoleucina, Phe
es L-fenilalanina, Tyr es
L-tirosina, Trp es L-triptófano, y
Val es
L-valina.
L-valina.
De acuerdo con dicha normativa los péptidos se
representan con las abreviaturas de los aminoácidos que los
componen unidos por guiones, que representan los enlaces peptídicos.
Así por ejemplo el péptido denominado glicilglicilglicina se
simboliza como Gly-Gly-Gly. Esto
requiere la modificación del símbolo Gly para la glicina,
H_{2}N-CH_{2}-COOH, de tres
formas distintas:
- (i)
- "Gly-" significa H_{2}N-CH_{2}-CO-
- (ii)
- "-Gly-" significa HN-CH_{2}-CO-, y
- (iii)
- "-Gly" significa HN-CH_{2}-COOH
Así, cuando el guión se coloca a la derecha del
símbolo, caso (i), indica que se ha eliminado el grupo OH del grupo
carboxílico del aminoácido, y cuando se coloca a la izquierda del
símbolo, caso (iii), indica que se ha eliminado un átomo de
hidrógeno del grupo amino del aminoácido; en el caso (ii) ambas
modificaciones se aplican a un mismo símbolo.
El aminoácido Gly- constituye el extremo
N-terminal del péptido, y el aminoácido -Gly
constituye el extremo C-terminal del péptido.
Como se puede apreciar a partir de la fórmula
general (I), todos los péptidos de la invención tienen el
aminoácido Leu del extremo C-terminal en forma de
carboxamida, representado como -Leu-NH_{2}.
El aminoácido que constituye el extremo
N-terminal de los péptidos de la invención puede
mantener su grupo amino sin derivatizar, o bien el mismo puede
estar funcionalizado con un grupo acetilo, p-toluensulfonilo,
benzoílo o bencilo, tal como se expresa en la fórmula general
(I).
En el caso de que dicho grupo amino no esté
derivatizado, es decir, cuando X, es hidrógeno, en esta descripción
se considera que el símbolo H-X- es equivalente al
símbolo X-, que es la forma adoptada por la IUPAC en el caso (i) ya
mencionado.
Las estructuras de los péptidos de la invención
se definen de acuerdo con la fórmula general (I).
Otra forma de definir la estructura de los
péptidos de la invención consiste en emplear las secuencias de
aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y especificando además la
funcionalización que presentan en el extremo
N-terminal y en el extremo
C-terminal del péptido. Como ya se ha indicado,
todos los péptidos de la invención tienen el aminoácido que forma el
extremo C-terminal en forma de carboxamida.
Las mencionadas secuencias presentan los
aminoácidos que se muestran en la Tabla I:
La secuencia denominada SEQ_ID_NO:15 corresponde
a la secuencia del péptido descrito por Cavallarin et al,
Mol. Plant-Microbe Interact., 1998, 11,
218-227, cuyo derivado carboxamida en el extremo
C-terminal de la secuencia se encuentra
expresamente excluido de esta invención.
Entre los péptidos de la invención que resultan
ser preferidos, se encuentran los péptidos definidos por las
secuencias SEQ-ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 14, y
SEQ_ID_NO: 16 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del
extremo C-terminal en forma de grupo
carboxamida.
Dentro de este grupo son especialmente
preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 6 a
SEQ_ID_NO: 11, SEQ_ID_NO: 13, SEQ_ID_NO: 16, SEQ_ID_NO: 18 a
SEQ_ID_NO: 22, y SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del
extremo C-terminal en forma de grupo
carboxamida.
Particularmente preferidos son los péptidos
definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 6 y SEQ_ID_NO: 16, y que
tienen el aminoácido del extremo C-terminal en
forma de grupo carboxamida. El último de estos dos péptidos
preferidos tiene la estructura:
H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Phe-Leu-NH_{2},
correspondiente a la fórmula general (I) donde X_{1} es H, X_{2}
es Lys, y X_{3} es Phe.
También resultan ser preferidos los péptidos
definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y que
tienen el aminoácido del extremo N-terminal
funcionalizado con el grupo acetilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Dentro de este grupo, resulta especialmente
preferido el péptido definido por la secuencia SEQ_ID_NO: 16, que
tiene el aminoácido del extremo N-terminal
funcionalizado con el grupo acetilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dicho
péptido tiene la estructura
Ac-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Phe-Leu-NH_{2},
correspondiente a la fórmula general (I) donde X_{1} es acetilo
(Ac), X_{2} es Lys, y X_{3} es Phe.
También son preferidos los péptidos definidos
por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el
aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado
con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Dentro de este grupo son particularmente
preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1,
6, 11 y 16, y que tienen el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo
p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Resulta más preferido el péptido definido por la
secuencia SEQ_ID_NO: 1, y que tiene el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo
p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dicho
péptido tiene la estructura
Ts-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-Leu-NH_{2},
correspondiente a la fórmula general (I) donde X_{1} es
p-toluensulfonilo (Ts), X_{2} es Lys, y X_{3} es Lys.
También son preferidos los péptidos definidos
por las secuencias de aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y
que tienen el aminoácido del extremo N-terminal
funcionalizado con el grupo bencilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Dentro de este grupo es especialmente preferido
el péptido definido por la secuencia SEQ_ID_NO: 15, y que tiene el
aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado
con el grupo bencilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dicho
péptido tiene la estructura
Bn-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-NH_{2},
correspondiente a la fórmula general (I) donde X_{1} es bencilo
(Bn), X_{2} es Trp, y X_{3} es Val.
También son preferidos los péptidos definidos
por las secuencias de aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y
que tienen el aminoácido del extremo N-terminal
funcionalizado con el grupo benzoílo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Dentro de este grupo, son especialmente
preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1,
y SEQ_ID_NO: 11, y que tienen el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y
el aminoácido del extremo C-terminal en forma de
grupo carboxamida. Resulta más preferido el primero de dichos
péptidos que tiene la estructura
Bz-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-Leu-NH_{2},
correspondiente a la fórmula general (I) donde X_{1} es benzoílo
(Bz), X_{2} es Lys, y X_{3} es Lys.
Los péptidos descritos en la invención están
formados por 11 aminoácidos que los hace apropiados para ser
preparados empleando los procedimientos habituales de síntesis de
péptidos en fase sólida, descritos por R.B. Merrifield, J. Am.
Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154.
Entre ellos se puede mencionar el que emplea
como soporte sólido la resina 4-metilbencidrilamina
(MBHA) funcionalizada con grupos amino. Sobre dicho soporte sólido
se llevan a cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los
diferentes aminoácidos que integran el péptido.
Dicho procedimiento es bien conocido por el
experto en la materia y se encuentra descrito, por ejemplo, en S.A.
Kates, F. Albericio Eds., Solid-Phase Synthesis. A
practical guide, Marcel Dekker, New York, 2000 [ISBN:
0-8247-0359-6], o en
K. Burguess Eds., Solid-Phase Organic Synthesis,
Wiley, John & Sons, New York, 1999 [ISBN: 0471318256].
Cuando se emplea la resina MBHA como soporte
sólido, habitualmente se incorpora a dicha resina un espaciador
bifuncional sensible al medio ácido, que permite el desanclaje en
condiciones suaves del péptido una vez sintetiza-
do.
do.
Por ejemplo un espaciador bifuncional apropiado
es el Fmoc-Rink-Linker (número CAS:
145469-56-3) comercializado por la
empresa Senn Chemicals (Suiza).
Dicho espaciador, una vez se ha unido a través
de su grupo carboxílico al grupo amino de la resina MBHA, y se ha
eliminado el grupo protector Fmoc, presenta un grupo amino libre que
permite el anclaje de un aminoácido que tenga un grupo carboxílico
libre.
En el mercado se puede adquirir la resina
Fmoc-Rink-MBHA en la empresa Senn
Chemicals, que ya tiene incorporado el espaciador mencionado.
Un procedimiento para la preparación de los
péptidos de la invención puede ser por ejemplo el que se describe a
continuación.
En dicho procedimiento se utiliza la química del
grupo Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) como
protector del grupo \alpha-amino de los
aminoácidos que se emplean para preparar los péptidos de la
invención.
Para la protección de la cadena lateral de la
lisina (Lys) y del triptófano (Trp) se ha empleado el grupo
terc-butiloxicarbonilo (Boc). Para la protección de la
cadena lateral de la tirosina (Tyr) se ha empleado el grupo
terc-butilo (t-Bu).
En la primera etapa se procede a la eliminación
del grupo protector Fmoc, presente en el grupo amino del espaciador
bifuncional. A continuación se procede al anclaje del aminoácido
leucina, que también tiene el grupo \alpha-amino
protegido por el grupo Fmoc.
Antes de proceder al nuevo acoplamiento se
elimina el grupo protector Fmoc de la leucina anclada en la
resina.
El ciclo de
acoplamiento-desprotección se repite hasta completar
la estructura del péptido.
La incorporación de los dos últimos aminoácidos
del péptido se realiza habitualmente mediante 2 o 3 acoplamientos
sucesivos con el fin de completar la reacción de acoplamiento del
aminoácido con el péptido anclado en la resina.
La escisión del péptido del soporte sólido se
realiza en condiciones ácidas, al mismo tiempo que se eliminan los
grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos que
forman el péptido.
Tras un proceso convencional de aislamiento, los
péptidos de la invención se obtienen con una buena pureza,
habitualmente superior al 90%, determinada por HPLC, en forma de
sólidos pulverulentos, y se caracterizan por espectrometría de
masas (ESI-MS).
Sorprendentemente se ha comprobado que los
péptidos de la invención presentan una actividad antimicrobiana,
que es particularmente efectiva frente a microorganismos patógenos
de las plantas como son las bacterias Erwinia amylovora,
Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
Forma parte del objeto de la invención la
utilización de los péptidos de la invención para la preparación de
una composición antimicrobiana.
Preferiblemente los péptidos de la invención se
utilizan como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas
de las plantas.
Preferiblemente las bacterias fitopatógenas se
seleccionan entre el grupo formado por Erwinia amylovora,
Xan- thomonas vesicatoria, y Pseudomonas
syringae.
Entre los péptidos de la invención que resultan
ser preferidos para ser utilizados como agentes antimicrobianos
frente a bacterias patógenas de las plantas, se encuentran los
péptidos preferidos mencionados anteriormente en este mismo
apartado.
Las bacterias mencionadas resultan ser
indicadores apropiados para determinar la actividad antimicrobiana
de compuestos que son susceptibles de ser empleados para combatir
infecciones y enfermedades causadas por bacterias en plantas.
Erwinia amylovora es una bacteria Gram
negativa que causa la enfermedad conocida como fuego bacteriano que
afecta a las plantas de la familia de las rosáceas, entre las que
se encuentran árboles frutales de gran importancia económica como
son el manzano y el peral, y plantas ornamentales como el serbal, el
espino, y el mostajo. En Europa está catalogada como una bacteria
de cuarentena en agricultura. El fuego bacteriano puede afectar a
prácticamente todos los órganos de la planta y con frecuencia
implica la muerte de los árboles o arbustos enfermos. Actualmente no
hay métodos efectivos para el control del fuego bacteriano y es
necesario combinar distintas medidas encaminadas a eliminar o
reducir el inóculo.
Xanthomonas vesicatoria es una bacteria
Gram negativa que provoca la enfermedad denominada mancha bacteriana
en plantas de la familia de las solanáceas que tienen una gran
importancia económica como son el tomate y el pimiento. Esta
enfermedad afecta a hojas, tallos y frutos provocando su marchitez
o muerte.
Pseudomonas syringae es una bacteria Gram
negativa que causa un gran número de enfermedades denominadas
necrosis bacterianas en plantas de cultivos hortícolas y leñosos
como frutales. La patogenicidad de P. syringae reside en
muchos casos en su actividad nucleadora del hielo (INA+) que
potencia los daños por helada, y la producción de diversas
fitotoxinas como las siringomicinas.
Preferiblemente las plantas que se pueden tratar
con los péptidos de la invención se seleccionan entre el grupo
formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas
ornamentales.
Entre los árboles frutales se pueden mencionar
los de pepita (manzano, peral), y hueso (melocotonero,
albaricoquero, ciruelo, cerezo) y el platanero.
Entre las plantas hortícolas se encuentran las
solanáceas (tomate, pimiento, patata) y cucurbitáceas (melón,
sandía).
Ejemplos de plantas ornamentales son serbal,
clavel, espino albar y mostajo.
También forma parte del objeto de la invención
una composición fitosanitaria que comprende
- un péptido lineal que responde a la fórmula
general (I):
(I)X_{1}-X_{2}-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-X_{3}-Leu-NH_{2}
- en donde
- X_{1} es hidrógeno, acetilo, p-toluensulfonilo, bencilo, o benzoílo,
- X_{2} es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y
- X_{3} es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp,
- con la condición de que el péptido en donde X_{1} es hidrógeno, X_{2} es Trp, y X_{3} es Val se excluye expresamente, y
- un agente auxiliar.
Entre los péptidos de la invención que resultan
ser preferidos para formar parte de dichas composiciones
fitosanitarias, se encuentran los péptidos mencionados como
preferidos en el apartado anterior denominado Péptidos.
Las composiciones fitosanitarias de la invención
presentan buenas propiedades antimicrobianas frente a bacterias
patógenas de las plantas.
Habitualmente, en las composiciones
antimicrobianas se combinan varios principios activos para obtener
una mayor eficacia o un espectro más amplio de actuación. En este
caso, las composiciones fitosanitarias de la invención también
pueden comprender otros agentes antibacterianos para conseguir
mayor eficacia antimicrobiana, como por ejemplo la combinación de
varios péptidos de la invención, o su combinación con otras materias
activas distintas.
Los péptidos de la invención también se pueden
combinar con agentes antifúngicos, y así desplegar una acción
antimicrobiana más amplia.
La cantidad de péptido que forma parte de la
composición fitosanitaria puede ser variable en función de factores
tales como el tipo de planta, la concentración de las bacterias
patógenas en la planta, la extensión de la enfermedad, etc. La
concentración efectiva del péptido se puede determinar y ajustar
fácilmente mediante métodos de rutina bien conocidos por el experto
en la materia. Habitualmente la concentración efectiva del péptido
se encuentra comprendida entre 0,01 y 0,5 g/l.
El agente auxiliar que acompaña los péptidos de
la invención en dichas composiciones fitosanitarias puede tener
varias funciones, como por ejemplo, facilitar la dosificación del
péptido, proporcionar un producto fácilmente manipulable, mejorar
el mojado de las plantas con la composición fitosanitaria.
Dicho agente auxiliar puede ser seleccionado
entre el grupo formado por: disolventes, diluyentes, cargas inertes,
agentes tensioactivos humectantes, agentes tamponantes, agentes
dispersantes, agentes antiapelmazantes, lubricantes, filtros de la
radiación ultravioleta, y/o mezclas de los mismos.
Preferiblemente el agente auxiliar se selecciona
entre el grupo formado por disolventes, tensioactivos, agentes
tamponantes, filtros de la radiación ultravioleta y/o sus
mezclas.
Más preferiblemente el disolvente es agua.
Las composiciones pueden presentarse en forma
líquida o en forma sólida. Por ejemplo, en el caso de formulaciones
líquidas, la composición de la invención puede presentarse en forma
de una composición diluida lista para ser empleada, o bien en forma
de una composición concentrada, que requiere su dilución antes de
ser usada, habitualmente con agua.
En el caso de composiciones líquidas acuosas, la
presencia de agentes tensioactivos humectantes facilita el mojado
de las plantas cuando se pulverizan con dicha composición.
Una ventaja de los péptidos de la invención es
que se pueden disolver en agua con facilidad, y se pueden formular
generalmente como disoluciones acuosas sin necesidad de emplear
disolventes orgánicos adicionales.
Las composiciones en forma sólida pueden ser en
forma de gránulos, o polvos, en las que los péptidos de la invención
se mezclan con cargas inertes finamente divididas como, por
ejemplo, caolín, tierra de diatomeas, dolomita, carbonato cálcico,
o talco. También pueden presentarse en forma de polvos o gránulos
dispersables, que comprenden un agente humectante para facilitar la
dispersión de los mismos en el líquido.
También forma parte del objeto de la invención
un método para prevenir y tratar infecciones y enfermedades de
plantas causadas por bacterias que comprende poner en contacto la
planta con una composición fitosanitaria que incluye los péptidos de
la invención.
En el método de la invención la composición
fitosanitaria se puede aplicar de forma preventiva a las plantas
para evitar la aparición de las infecciones y enfermedades causadas
por bacterias. El tratamiento preventivo tiene su base en que los
péptidos de la invención inhiben el crecimiento de bacterias
patógenas de las plantas.
En el método de la invención, la composición
fitosanitaria también se puede emplear para tratar dichas
infecciones y enfermedades una vez se ha detectado su presencia en
las plantas, ya que los péptidos de la invención inhiben el
crecimiento de las bacterias causantes de dichas infecciones y
enfermedades.
En esta descripción el término infección se
refiere a la invasión y destrucción de un órgano, por ejemplo,
hojas, flores, o frutos, por parte de los microorganismos
patógenos. Por tanto, se trata de un proceso localizado. En cambio,
el término enfermedad se refiere a un proceso que afecta a la
planta, dando lugar a síntomas.
Preferiblemente el método de la invención se
emplea para prevenir y tratar infecciones y enfermedades provocadas
por bacterias patógenas de las plantas seleccionadas entre el grupo
formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y
Pseudomonas syringae.
Preferiblemente las plantas que se pueden tratar
con los péptidos de la invención se seleccionan entre el grupo
formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas
ornamentales.
En el método de la invención, la composición se
puede poner en contacto con las partes de las plantas seleccionadas
entre el grupo formado por semillas, raíces, tallos, hojas, o
frutos, o con el suelo o cualquier medio de crecimiento que rodee
las raíces de las plantas.
En el método de la invención, la composición
fitosanitaria se puede poner en contacto con la planta por
cualquier técnica convencional, entre las que destacan, la
pulverización, la inmersión o el riego.
Por ejemplo se puede preparar una disolución
acuosa de los péptidos de la invención y proceder a la pulverización
de las partes de la planta afectadas o susceptibles de ser
afectadas. Si se trata de los frutos de un árbol frutal, por
ejemplo, también se puede realizar el tratamiento de los mismos por
pulverización o por inmersión antes de su cosecha o en
post-cosecha.
El tratamiento de las raíces puede llevarse a
cabo por ejemplo empleando una composición sólida en la que los
péptidos se encuentran dispersos en una carga inerte, o por
pulverización con la mencionada disolución acuosa, o mediante su
aplicación por riego.
La actividad antimicrobiana de los péptidos de
la invención frente a bacterias patógenas para plantas se ha
evaluado mediante la determinación de la concentración de péptido
mínima necesaria para inhibir el crecimiento de los
microorganismos. Habitualmente dicha concentración se denomina
concentración inhibitoria mínima (CIM).
Este tipo de ensayos es habitual en
microbiología y es bien conocido por el experto en la materia. Una
descripción de la metodología empleada se encuentra por ejemplo en
M. J. Pelczar Jr, E. C. S. Chan, N. R. Krieg, Microbiology:
Concepts and Applications. New York: McGraw-Hill,
1997.
Para evaluar dicho efecto antimicrobiano de los
péptidos de la invención se emplearon las siguientes cepas de
bacterias patógenas: Erwinia amylovora PMV6076 (INRA,
Angers, Francia), Xanthomonas vesicatoria
2133-2 (IVIA, Valencia, España), y Pseudomonas
syringae pv. syringae EPS94 (IN-TEA,
Universitat de Girona, España).
Se ha comprobado que las composiciones que
comprenden los péptidos de la invención disueltos en agua a
concentraciones comprendidas entre 2,5 y 7,5 \muM son efectivas
para inhibir el crecimiento de bacterias como Erwinia amylovora,
Xanthomonas vesicatoria, y/o Pseudomonas syringae.
Estos resultados demuestran la eficacia de la
actividad antimicrobiana de los péptidos de la invención, ya que en
Avrahami et al, Biochemistry, 2001, 40,
12591-12603, se describe que una concentración
inhibitoria mínima inferior a 50 \muM es considerada como
significativa.
Los péptidos de la invención son más efectivos
frente a dichas bacterias que el péptido descrito por Cavallarin
et al, definido por la secuencia SEQ_ID_NO:15 y que tiene el
extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida, ya
que este péptido presenta unas concentraciones inhibitorias mínimas
superiores a 7,5 \muM, cuando se ensaya frente a las bacterias
Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas
syringae.
La actividad hemolítica de los péptidos es un
indicador de la toxicidad en células eucariotas, y una
característica que generalmente se determina para aquellos
compuestos que pueden llegar a entrar en contacto con el cuerpo
humano. Este sería el caso si frutas u hortalizas tratadas con los
péptidos de la invención contuvieran restos de los mismos y fuesen
consumidos por las personas, o al ser manipulados por operarios
durante su aplicación o preparación.
La mencionada actividad hemolítica se ha
evaluado mediante la determinación de la liberación de hemoglobina
que se produce al poner en contacto una solución de dichos péptidos
en tampón de TRIS con suspensiones de eritrocitos al 5% en
volumen/volumen procedentes de sangre humana fresca. El resultado
de dicha determinación se expresa como el porcentaje de hemólisis
que se produce para una concentración conocida de péptido. Una
descripción de la metodología empleada para la determinación de la
actividad hemolítica se encuentra en Oren et al,
Biochemistry, 2000, 39, 6103-6114, y en Raguse
et al, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124,
12774-12785.
Se ha comprobado que la gran mayoría de los
péptidos de la invención presentan una actividad hemolítica
significativa a una concentración que resulta ser entre diez y cien
veces superior a la concentración a la que son activos para inhibir
el crecimiento de bacterias patógenas de las plantas.
La estabilidad de los péptidos a la degradación
por proteasas es una característica que permite evaluar que los
péptidos se encuentren inalterados en el entorno de la planta
durante un tiempo de vida medio razonable. Los péptidos pueden ser
degradados tanto por proteasas presentes en el tejido de las plantas
como en microorganismos epífitos.
La estabilidad de los péptidos a la degradación
por proteasas se ha evaluado mediante el tratamiento de soluciones
de los péptidos en tampón TRIS con Proteinasa K
(Sigma-Aldrich), y la monitorización de su
degradación por HPLC a diferentes intervalos de tiempo. La
degradación se expresa como el porcentaje de péptido degradado
después de un intervalo de tiempo determinado calculado a partir de
la disminución del área del pico del péptido nativo por HPLC. Una
descripción de la metodología empleada para la determinación de la
estabilidad a proteasas se encuentra en Rozek et al,
Biochemistry, 2003, 42, 14130-14138.
Se ha comprobado que algunos péptidos de la
invención son más estables a la degradación por proteasas que el
péptido descrito por Cavallarin et al.
A continuación, a los efectos de completar de
forma suficiente la anterior descripción, se exponen los siguientes
ejemplos.
En los ejemplos que siguen se emplean las
siguientes abreviaciones: Ac: acetilo; Ac_{2}O: anhídrido
acético; Bn: benzilo; Boc: terc-butiloxicarbonilo;
t-Bu: terc-butilo; Bz: benzoílo; CIM:
concentración inhibitoria mínima; DIEA:
N,N-diisopropiletilamina; DMF:
N,N-dimetilformamida; EDTA, ácido
etilendiaminotetracético; ESI-MS: espectrometría de
masas con ionización por electrospray; Fmoc:
9-fluorenilmetoxicarbonilo; HBTU: hexafluorofosfato
de N-óxido de
N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metilen]-N-metilmetanaminio;
HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; LB: Luria Bertani;
MBHA: 4-metilbencidrilamina; NMP:
N-metilpirrolidona; TFA: ácido trifluoroacético;
TIS: triisopropilsilano; TRIS:
tris(hidroximetil)aminometano; Ts:
p-toluensulfonilo; TSB: Trypticase Soy Broth; UV:
ultravioleta.
Los productos
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Val-OH, la resina
Fmoc-Rink-MBHA funcionalizada con
grupos amino, y HBTU, se obtuvieron de Senn Chemicals. Los
productos cloruro de bencilo, cloruro de benzoílo, ácido
trifluoroacético, N-metilpirrolidona, y TIS se
obtuvieron de Aldrich. Los productos cloruro de tosilo, piperidina
y DIEA se obtuvieron de
Fluka.
Fluka.
Las siguientes indicaciones sobre el
procedimiento para la preparación de los péptidos son de carácter
general:
- -
- Se emplearon aminoácidos que tienen el grupo \alpha-amino protegido con el grupo Fmoc.
- -
- Para la protección de la cadena lateral de la lisina y del triptófano se empleó el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc). Para la protección de la cadena lateral de la tirosina se empleó el grupo terc-butilo (t-Bu).
- -
- Las reacciones se llevaron a cabo en jeringas de 2 o 5 ml que tenían incorporado un filtro microporoso de polipropileno.
- -
- Todas las transformaciones y lavados se llevaron a cabo a 25ºC, a no ser que se indique lo contrario.
- -
- El análisis por HPLC se llevó a cabo con un flujo de 1,0 ml/min empleando una columna de fase reversa Kromasil (4,6 x 40 mm; tamaño de partículas de 3,5 \mum). Se emplearon gradientes lineales con TFA acuoso al 0,1% y TFA en acetonitrilo al 0,1%, con una relación comprendida entre 0,98:0,02 y 0,98:0,1 durante un período de tiempo de 7 minutos con detección UV a una longitud de onda de 220 nm.
- -
- Los espectros ESI-MS fueron adquiridos empleando un instrumento quadrupolo Navigator; operando en el modo positivo de iones (ES+) con un voltaje en la muestra de 30 kV.
- -
- Todas las relaciones entre los disolventes son volumen/volumen, a no ser que se especifique otro tipo de proporción.
En una jeringa de 2 ml de capacidad, equipada
con un filtro microporoso en la parte inferior, se colocaron 30 mg
de resina Fmoc-Rink-MBHA con una
funcionalización de 0,66 mmol/g, equivalentes a 19,8 \mumoles de
grupos amino, y se llenó la jeringa con disolvente para
hinchar-lavar la resina de acuerdo con la siguiente
secuencia: CH_{2}Cl_{2} (1 x 20 min) y DMF (1 x 20 min). La
expresión CH_{2}Cl_{2} (1 x 20 min) se refiere a que se realizó
1 lavado de 20 minutos con cloruro de metileno. Después de cada
etapa de lavado se eliminó el disolvente mediante un filtrador de
vacío múltiple (Vac Man Laboratory Vacuum Manifold de Promega
Distribuidora).
Después de hinchar-lavar la
resina, ésta se trató con una mezcla de piperidina y DMF (3:7, 1 x
2 min y 1 x 10 min) para eliminar el grupo Fmoc presente en el
grupo amino del espaciador bifuncional, y, a continuación, se lavó
con DMF (6 x 1 min).
Seguidamente la resina se trató con 21 mg de
Fmoc-Leu-OH (59 \mumoles), 22 mg
de HBTU (59 \mumoles) y 11 \mul de DIEA (63 \mumoles) en 0,1
ml de DMF. Después de 4 h se lavó la resina con DMF (6 x 1 min) y
se comprobó que el test de ninhidrina era negativo (Kaiser et
al, Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598).
La eliminación del grupo Fmoc y los lavados
subsiguientes se realizaron como ya se ha descrito
anteriormente.
El ciclo de
acoplamiento-desprotección se repitió para los
siguientes cuatro aminoácidos protegidos con el grupo
N^{\alpha}-Fmoc:
Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Leu-OH y
Fmoc-Ile-OH. En cada etapa se
procedió al lavado con DMF (6 x 1 min).
A partir del quinto aminoácido incorporado,
tanto la eliminación del grupo Fmoc, los ciclos
acoplamiento-desprotección como los correspondientes
lavados se realizaron de la misma manera substituyendo en estos
casos la DMF por NMP. Los seis últimos aminoácidos se incorporaron
protegidos con el grupo N^{\alpha}-Fmoc:
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH y
Fmoc-Leu-OH. Para la incorporación
de los dos últimos aminoácidos se realizaron 2-3
acoplamientos sucesivos para obtener un test de ninhidrina
negativo.
Después de eliminar el grupo Fmoc del último
aminoácido acoplado, como ya se ha descrito anteriormente, se lavó
la resina con NMP (6 x 1 min) y CH_{2}Cl_{2} (6 x 1 min), y se
obtuvo el péptido lineal unido a la resina,
H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA.
A continuación se escindió el péptido de la resina mediante un
tratamiento con 1 ml de una mezcla de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5)
durante 2 horas. Se recogieron los filtrados en un vial mediante una
presión positiva de nitrógeno. La resina se lavó con una mezcla de
TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5, 2 x 0,5 ml). Los filtrados se
combinaron y se evaporaron casi a sequedad bajo una corriente de
nitrógeno hasta obtener un aceite. Dicho aceite se precipitó con
éter dietílico, se centrifugó, y el éter se decantó. Este proceso
se repitió 3 o 4 veces. Finalmente, el producto sólido obtenido se
disolvió en agua, y se liofilizó.
Se obtuvo un sólido pulverulento que tenía una
pureza superior al 90% analizada por HPLC (tiempo de retención 4,39
minutos), y su estructura se confirmó por
ESI-MS.
La síntesis de este péptido también se llevó a
cabo a mayor escala utilizando 200 mg de resina
Fmoc-Rink-MBHA con una
funcionalización de 0,66 mmol/g, equivalentes a 132 \mumoles de
grupos amino, utilizando el procedimiento descrito en este mismo
Ejemplo 1.
La peptidilresina
H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA
obtenida en el Ejemplo 1, se trató con 0,2 ml de una mezcla de
anhídrido acético (Ac_{2}O), piridina y CH_{2}Cl_{2} (1:1:1)
durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, la resina se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de la
resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1. La pureza del péptido obtenido fue superior al 90% determinada
por HPLC (tiempo de retención 4,59 minutos), y su estructura se
confirmó por ESI-MS.
La peptidilresina
H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA
obtenida en el Ejemplo 1, se trató con cloruro de
p-toluensulfonilo (TsCl) (792 \mumoles) y DIEA (1,58
mmoles) en 0,2 ml de una mezcla de CH_{2}Cl_{2} y NMP (9:1)
durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, la resina se
lavó con NMP (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de la
resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1. La pureza del péptido obtenido fue superior al 90% determinada
por HPLC (tiempo de retención 4,89 minutos), y su estructura se
confirmó por ESI-MS.
La peptidilresina
H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA
obtenida en el Ejemplo 1, se trató con cloruro de benzoílo (BzCl)
(792 \mumoles) y DIEA (1,58 mmoles) en 0,2 ml de una mezcla de
CH_{2}Cl_{2} y NMP (9:1) durante 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, la resina se lavó con NMP (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de la
resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1. La pureza del péptido obtenido fue superior al 90% determinada
por HPLC (tiempo de retención 5,00 minutos), y su estructura se
confirmó por ESI-MS.
La peptidilresina
H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA
obtenida en el Ejemplo 1, se trató con bromuro de bencilo (BnBr)
(792 \mumoles) y DIEA (1,58 mmoles) en 0,2 ml de una mezcla de
CH_{2}Cl_{2} y NMP (9:1) durante 48 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, la resina se lavó con NMP (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de la
resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
1. La pureza del péptido obtenido fue superior al 90% determinada
por HPLC (tiempo de retención 4,73 minutos), y su estructura se
confirmó por ESI-MS.
Se diseñó una quimioteca para la obtención de
125 péptidos, que responden a la fórmula general (I):
(I)X_{1}-X_{2}-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-X_{3}-Leu-NH_{2}
en
donde
X_{1} es hidrógeno, acetilo,
p-toluensulfonilo, bencilo, o benzoílo,
X_{2} es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y
X_{3} es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp,
con la condición de que el péptido
en donde X_{1} es hidrógeno, X_{2} es Trp, y X_{3} es Val, se
excluye expresamente de los péptidos de la
invención.
En cinco jeringas de 5 ml de capacidad,
etiquetadas adecuadamente y equipadas con un filtro microporoso en
la parte inferior, se colocaron 350 mg de resina
Fmoc-Rink-MBHA con una
funcionalización de 0,66 mmol/g, equivalentes a 231 \mumoles de
grupos amino. Las jeringas se llenaron con disolvente para
hinchar-lavar la resina de acuerdo con la siguiente
secuencia: CH_{2}Cl_{2} (1 x 20 min) y DMF (1 x 20 min).
Después de cada etapa de lavado se eliminó el disolvente mediante
un filtrador de vacío múltiple (Vac Man Laboratory Vacuum Manifold
de Promega Distribuidora).
Después de hinchar-lavar las
resinas, éstas se trataron con una mezcla de piperidina y DMF (3:7,
1 x 2 min y 1 x 10 min) para eliminar el grupo Fmoc presente en el
grupo amino del espaciador bifuncional, y, a continuación, se
lavaron con DMF (6 x 1 min).
Seguidamente las cinco resinas se trataron con
245 mg de Fmoc-Leu-OH (693
\mumoles), 263 mg de HBTU (693 \mumoles) y 121 \mul de DIEA
(693 \mumoles) en 0,8 ml de DMF. Después de 4 h se lavaron las
resinas con DMF (6 x 1 min) y se comprobó que el test de ninhidrina
era negativo (Kaiser et al, Anal. Biochem., 1970, 34,
595-598).
A continuación se eliminó el grupo Fmoc y se
realizaron los lavados correspondientes tal y como se ha descrito
anteriormente. Seguidamente se acopló a cada resina el aminoácido
X_{3} correspondiente:
Fmoc-Val-OH,
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Tyr(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH o
Fmoc-Lys(Boc)-OH, siguiendo
el procedimiento empleado para acoplar el aminoácido protegido
Fmoc-Leu-OH.
La eliminación del grupo Fmoc y los lavados
subsiguientes se realizaron como ya se ha descrito
anteriormente.
El ciclo de
acoplamiento-desprotección se repitió para los
siguientes tres aminoácidos. De esta manera se acoplaron
secuencialmente:
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Leu-OH y
Fmoc-Ile-OH. Estos acoplamientos se
realizaron para cada una de las cinco resinas. En cada etapa se
procedió al lavado con DMF (6 x 1 min).
A partir del quinto aminoácido incorporado la
eliminación del grupo Fmoc, los ciclos
acoplamiento-desprotección y los lavados
correspondientes se realizaron de la misma manera substituyendo en
estos casos el uso de DMF por el de NMP. Siguiendo este
procedimiento se acoplaron a cada una de las cinco resinas de
manera secuencial dos residuos de
Fmoc-Lys(Boc)-OH, uno de
Fmoc-Phe-OH y uno de
Fmoc-Leu-OH. En cada etapa se
procedió al lavado con NMP (6 x 1 min). Para la incorporación del
décimo residuo fue necesario un doble acoplamiento para obtener un
test de ninhidrina negativo.
Una vez acoplado el décimo residuo, cada una de
las peptidilresinas confinadas en las cinco jeringas, se dividió en
cinco fracciones. Las 25 fracciones obtenidas, correspondientes a
aproximadamente 46 \mumoles de peptidilresina cada una, se
colocaron en 25 jeringas de 2 ml de capacidad, etiquetadas
adecuadamente y equipadas con un filtro microporoso en la parte
inferior. A continuación se eliminó el grupo Fmoc y se realizaron
los lavados correspondientes tal y como se ha descrito
anteriormente. A cada una de las cinco fracciones de resina que
llevan incorporado el mismo aminoácido X_{3} se acopló el residuo
X_{2} correspondiente:
Fmoc-Trp(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc) o
Fmoc-Leu-OH. Los acoplamientos se
realizaron utilizando 138 \mumoles del aminoácido
Na-Fmoc protegido correspondiente, 138 \mumoles de
HBTU y 138 \mumoles de DIEA en 0,3 ml de NMP. Para la
incorporación de estos aminoácidos fue necesario realizar un doble
acoplamiento para obtener un test de ninhidrina negativo.
A continuación cada una de las 25 fracciones
anteriores se dividió en cinco fracciones iguales. Las 125
fracciones de resina obtenidas, correspondientes a aproximadamente
9,2 \mumoles de peptidilresina, se colocaron en 125 jeringas de 2
ml de capacidad, etiquetadas adecuadamente y equipadas con un filtro
microporoso en la parte inferior. A continuación se eliminó el
grupo Fmoc y se realizaron los lavados correspondientes tal y como
ya se ha descrito anteriormente.
Cuatro de las cinco fracciones de resina
obtenidas a partir de cada una de las 25 fracciones anteriores se
derivatizaron en el extremo N-terminal por
acetilación, tosilación, benzoilación o bencilación,
respectivamente.
La acetilación se realizó por tratamiento con
0,2 ml de una mezcla de Ac_{2}O, piridina y CH_{2}Cl_{2}
(1:1:1) durante 1 h a temperatura ambiente.
La tosilación se llevó a cabo por tratamiento
con TsCl (368 \mumoles) y DIEA (736 \mumoles) en 0,2 ml de una
mezcla de CH_{2}Cl_{2} y NMP (9:1) durante 1 h a temperatura
ambiente.
La benzoilación se realizó por tratamiento con
BzCl (368 \mumoles) y DIEA (736 \mumoles) en 0,2 ml de una
mezcla de CH_{2}Cl_{2} y NMP (9:1) durante 1 h a temperatura
ambiente.
La bencilación se llevó a cabo por tratamiento
con BnBr (368 \mumoles) y DIEA (736 \mumoles) en 0,2 ml de una
mezcla de CH_{2}Cl_{2} y NMP (9:1) durante 48 h a temperatura
ambiente.
Posteriormente a estos tratamientos las resinas
se lavaron con NMP (6 x 1 min).
Finalmente, se procedió a la escisión de los 125
péptidos de la resina en la correspondiente jeringa y al aislamiento
de cada uno de ellos siguiendo el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1.
Los péptidos obtenidos se analizaron por HPLC y
se confirmó su estructura por ESI-MS. En todos los
casos se obtuvo una pureza superior al 90%.
El efecto antimicrobiano de los péptidos de la
invención se determinó frente a las siguientes cepas de bacterias
patógenas: Erwinia amylovora PMV6076 (INRA, Angers,
Francia), Xanthomonas vesicatoria 2133-2
(IVIA, Valencia, España), y Pseudomonas syringae pv.
syringae EPS94 (IN-TEA, Universitat de
Girona, España).
Todas las bacterias se conservaron a una
temperatura de -80ºC en medio Luria-Bertani (LB)
complementado con glicerina al 20% en volumen/volumen.
Las suspensiones de E. amylovora PMV6076
y P. syringae pv. syringae EPS94 se obtuvieron
después de un crecimiento de 24 horas a 25ºC, y la muestra de X.
vesicatoria 2133-2 se obtuvo después de la
incubación durante 48 horas a 25ºC en agar LB. En todos los casos se
resuspendieron en agua estéril para obtener una suspensión ajustada
a una absorbancia de 0,2 a 600 nm, que correspondía aproximadamente
a 10^{8} unidades formadoras de colonias/ml.
Para determinar la concentración inhibitoria
mínima (CIM), los péptidos se solubilizaron en agua estéril
milli-Q hasta una concentración final de 1000
\muM y se filtraron a través de un filtro de 0,22 \mum de
poro.
Se realizaron diluciones de los péptidos de la
invención para obtener soluciones a las concentraciones 750, 500,
250, 200, 150, 125, 100, 75, 50 y 25 \muM.
Se mezclaron 20 \mul de cada dilución con 20
\mul de la suspensión del indicador bacteriano correspondiente, y
160 \mul de medio líquido TSB (Tripticase Soy Broth), hasta un
volumen total de 200 \mul en cada pocillo de una microplaca. Así
las concentraciones efectivas a las que se sometían las
suspensiones de bacterias fueron 75, 50, 25, 20, 15, 12,5, 10, 7,5,
5 y 2,5 \muM.
Se llevaron a cabo dos réplicas para cada cepa,
concentración y péptido en ensayo.
Los controles positivos contenían agua en lugar
de péptido, y los controles negativos contenían los péptidos sin la
suspensión bacteriana.
El crecimiento microbiano se determinó
automáticamente mediante la medida de la densidad óptica a 600 nm
empleando el Microbiology Analyser Bioscreen C (Labsystems).
Las microplacas se incubaron a 25ºC durante 48
horas con una agitación de 20 segundos antes de la medida de la
absorbancia cada hora. Cada experimento se realizó dos veces.
Como CIM se tomó la concentración de péptido más
baja a la que no se producía crecimiento bacteriano al final del
experimento.
En la Tabla II se presenta el rango de
concentraciones entre las que se encuentra la CIM, expresada en
\muM, después de 48 h de incubación a 25ºC, para diferentes
péptidos de la invención frente a las bacterias Erwinia
amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas
syringae. Los péptidos de la Tabla II se identifican con los
parámetros X_{1}, X_{2} y X_{3} que figuran en la fórmula
general (I). Además, la Tabla II incluye el número de referencia con
relación a la quimioteca preparada en el Ejemplo 6. En la Tabla II
se incluyen como Ejemplo comparativo los resultados
correspondientes al péptido descrito por Cavallarin et al,
que no forma parte de la invención:
| Ref. | X_{1} | X_{2} | X_{3} | P. syringae | X. vesicatoria | E. amylovora |
| Ejemplo comparativo | H | Trp | Val | >7,5 | >7,5 | >7,5 |
| BP017 | H | Lys | Trp | 5-7.5 | 5-7.5 | >7.5 |
| BP100 | H | Lys | Tyr | 2.5-5 | 5-7.5 | 2.5-5 |
| BP095 | H | Tyr | Tyr | 5-7.5 | 2.5-5 | 5-7.5 |
| BP105 | H | Leu | Tyr | 5-7.5 | 2.5-5 | 5 |
| BP090 | H | Phe | Tyr | 5-7.5 | 2.5-5 | 5-7.5 |
| BP020 | H | Trp | Tyr | 2,5-5 | 2,5-5 | 2,5-5 |
| BP015 | H | Lys | Val | 2,5-5 | >7,5 | 5-7,5 |
| BP033 | H | Leu | Val | 5-7,5 | >7,5 | 5-7,5 |
| BP076 | H | Lys | Phe | 2,5-5 | 2,5-5 | 2,5-5 |
| BP081 | H | Leu | Phe | 2,5-5 | <2,5 | 2,5-5 |
| BP066 | H | Phe | Phe | 5-7,5 | 2,5-5 | 2,5-5 |
| BP019 | H | Trp | Phe | 5-7,5 | 2,5-5 | 5-7,5 |
| BP052 | H | Lys | Trp | 5 | 2,5-5 | 2,5-5 |
| BP047 | H | Tyr | Trp | 5-7,5 | 2,5-5 | 5-7,5 |
| BP018 | H | Trp | Trp | 5-7,5 | 2,5 | 5-7,5 |
| BP120 | Ac | Tyr | Lys | 5-7,5 | 5-7,5 | >7,5 |
| BP101 | Ac | Lys | Tyr | 5-7,5 | 2,5 | >7,5 |
| BP029 | Ac | Lys | Val | 5-7,5 | 7,5 | 5-7,5 |
| BP077 | Ac | Lys | Phe | 5-7,5 | <2,5 | 5-7,5 |
| BP053 | Ac | Lys | Trp | 5-7,5 | 2,5-5 | >7,5 |
| BP038 | Ac | Trp | Trp | >7,5 | <2,5 | >7,5 |
| BP125 | Ts | Lys | Lys | 2,5-5 | 2,5-5 | >7,5 |
| BP121 | Ts | Tyr | Lys | 2,5-5 | 2,5-5 | >7,5 |
| BP102 | Ts | Lys | Tyr | 2,5-5 | <2,5 | 5-7,5 |
| BP097 | Ts | Tyr | Tyr | >7,5 | <2,5 | >7,5 |
| BP030 | Ts | Lys | Val | 5-7,5 | 5-7,5 | 5-7,5 |
| BP078 | Ts | Lys | Phe | 5-7,5 | <2,5 | 5-7,5 |
| Ref. | X_{1} | X_{2} | X_{3} | P. syringae | X. vesicatoria | E. amylovora |
| BP054 | Ts | Lys | Trp | 5-7,5 | <2,5 | >7,5 |
| BP059 | Ts | Leu | Trp | >7,5 | 2,5 | >7,5 |
| BP011 | Bn | Trp | Val | 5-7,5 | 2,5-5 | 5-7,5 |
| BP126 | Bz | Lys | Lys | 2,5-5 | 2,5-5 | 5-7,5 |
| BP122 | Bz | Tyr | Lys | 5-7,5 | 2,5-5 | >7,5 |
| BP103 | Bz | Lys | Tyr | 5-7,5 | <2,5 | 7,5 |
| BP031 | Bz | Lys | Val | 5-7,5 | <2,5 | 2,5-5 |
| BP010 | Bz | Trp | Val | >7,5 | <2,5 | >7,5 |
| BP055 | Bz | Lys | Trp | >7,5 | <2,5 | >7,5 |
Se puede comprobar que los péptidos de la
invención presentan una buena eficacia para inhibir el crecimiento
de las bacterias Pseudomonas syringae, Xanthomonas
vesicatoria, y/o Erwinia amylovora.
Además la eficacia de los péptidos de la
invención es superior a la del péptido ya conocido, cuyos
resultados se presentan en la primera fila de la tabla anterior
bajo la denominación de Ejemplo comparativo.
La actividad hemolítica de los péptidos de la
invención se evaluó mediante la determinación de la liberación de
hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de los
péptidos con una suspensión de eritrocitos al 5% en volumen
procedentes de sangre humana fresca.
La sangre se recogió asépticamente empleando un
sistema Vacutainer® K2E (Belliver, Gran Bretaña) con EDTA, y se
almacenó a 4ºC durante un período inferior a 2 horas.
La sangre se centrifugó a 6.000 g durante 5
minutos para separar los eritrocitos. Éstos se lavaron tres veces
con tampón TRIS (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,2), y se
suspendieron en tampón TRIS hasta obtener una suspensión que
contenía un 10% en volumen de eritrocitos.
Los péptidos se solubilizaron en tampón TRIS
hasta una concentración final 100, 300, y 500 \muM.
Se emplearon tres réplicas para cada péptido y
concentración.
Se mezclaron 65 \mul de la suspensión de
eritrocitos al 10% en volumen con 65 \mul de la solución de
péptido en cada pocillo de una placa de 96 pocillos
Micro-Amp® (Applied Biosystems, EE.UU.) (5% en
volumen de eritrocitos), y se incubó la mezcla durante 1 h a 37ºC
bajo agitación. De este modo las suspensiones de eritrocitos se
sometieron a concentraciones de péptidos de 50, 150, y 250
\muM.
A continuación se centrifugaron las placas a
3.500 g durante 10 minutos, y se transfirieron alícuotas de 80
\mul del sobrenadante a microplacas de 100 pocillos (Bioscreen),
que se diluyeron con 80 \mul de agua milli-Q.
El grado de hemólisis se determinó a partir de
la absorbancia a 540 nm con un lector de placas Bioscreen.
El control positivo de hemólisis completa se
determinó en una solución de tampón TRIS que contenía melitina 200
\muM (Sigma-Aldrich, España).
El porcentaje de hemólisis (H) se determinó
empleando la ecuación:
\vskip1.000000\baselineskip
H =
100x[(Op-Ob)/(Om-Ob)]
\newpage
donde Op era la densidad óptica
medida para una concentración de péptido determinada, Ob era la
densidad óptica de la solución tampón, y Om era la densidad óptica
para el control positivo con
melitina.
La Tabla III presenta los resultados de
actividad hemolítica, expresada corno el porcentaje de hemólisis
calculado según la ecuación anterior, para concentraciones de
péptidos de la invención correspondientes a 50, 150 y 250 \muM.
Los péptidos de la Tabla III se identifican con los parámetros
X_{1}, X_{2}, y X_{3} que figuran en la fórmula general (I).
Además la Tabla III incluye el número de referencia con relación a
la quimioteca preparada en el Ejemplo 6:
| Ref. | X_{1} | X_{2} | X_{3} | % Hemólisis | % Hemólisis | % Hemólisis |
| 50 \muM | 150 \muM | 250 \muM | ||||
| BP119 | H | Tyr | Lys | 4 | 19 | 45 |
| BP100 | H | Lys | Tyr | 3 | 22 | 43 |
| BP095 | H | Tyr | Tyr | 7 | 50 | 76 |
| BP105 | H | Leu | Tyr | 14 | 91 | 90 |
| BP090 | H | Phe | Tyr | 11 | 57 | 84 |
| BP020 | H | Trp | Tyr | 78 | 77 | 72 |
| BP015 | H | Lys | Val | 0 | 16 | 45 |
| BP033 | H | Leu | Val | 4 | 38 | 68 |
| BP076 | H | Lys | Phe | 3 | 34 | 65 |
| BP081 | H | Leu | Phe | 10 | 65 | 88 |
| BP066 | H | Phe | Phe | 9 | 63 | 89 |
| BP019 | H | Trp | Phe | 57 | 94 | 100 |
| BP128 | H | Leu | Lys | 2 | 31 | 66 |
| BP052 | H | Lys | Trp | 51 | 84 | 79 |
| BP047 | H | Tyr | Trp | 81 | 76 | 82 |
| BP018 | H | Trp | Trp | 78 | 68 | 74 |
| BP124 | Ac | Lys | Lys | 1 | 5 | 23 |
| BP101 | Ac | Lys | Tyr | 4 | 31 | 62 |
| BP096 | Ac | Tyr | Tyr | 47 | 86 | 85 |
| BP077 | Ac | Lys | Phe | 6 | 40 | 81 |
| BP053 | Ac | Lys | Trp | 60 | 82 | 85 |
| BP038 | Ac | Trp | Trp | 80 | 86 | 80 |
| BP125 | Ts | Lys | Lys | 2 | 8 | 23 |
| BP121 | Ts | Tyr | Lys | 22 | 81 | 86 |
| BP102 | Ts | Lys | Tyr | 39 | 79 | 80 |
| BP097 | Ts | Tyr | Tyr | 83 | 81 | 88 |
| Ref. | X_{1} | X_{2} | X_{3} | % Hemólisis | % Hemólisis | % Hemólisis |
| 50 \muM | 150 \muM | 250 \muM | ||||
| BP030 | Ts | Lys | Val | 25 | 70 | 80 |
| BP078 | Ts | Lys | Phe | 40 | 85 | 95 |
| BP126 | Bz | Lys | Lys | 2 | 14 | 24 |
| BP122 | Bz | Tyr | Lys | 32 | 78 | 96 |
| BP103 | Bz | Lys | Tyr | 42 | 83 | 80 |
| BP031 | Bz | Lys | Val | 34 | 71 | 76 |
| BP010 | Bz | Trp | Val | 77 | 77 | 76 |
| BP011 | Bn | Trp | Val | 81 | 96 | 100 |
En todos los casos se observa que la
concentración en la que se llegaría a producir una hemólisis
significativa es entre 10 y 100 veces superior a la concentración
en la que los péptidos de la invención presentan actividad
antimicrobiana.
La estabilidad de los péptidos de la invención a
la degradación por proteasas se determinó mediante un ensayo de
digestión del péptido por Proteinasa K
(Sigma-Aldrich Corporation, Madrid, España).
Se empleó una disolución de 50 \mug/ml de
péptido y de 1 \mug/ml de Proteinasa K en tampón TRIS 100 mM a pH
7,6, a temperatura ambiente.
El progreso de la escisión del péptido se
determinó cromatográficamente a tiempos comprendidos entre 5 y 45
minutos. Para ello se empleó una columna C_{18} de fase reversa
(Kromasil, 4,6 x 40 mm; 3,5 \mum de tamaño de partícula), y
gradientes lineales de TFA acuoso al 0,1% y TFA en acetonitrilo al
0,1% desde 0,98:0,02 a 0:1 durante 7 min realizando la detección
mediante absorbancia en el ultravioleta a 220 nm.
La Tabla IV presenta los resultados de
estabilidad a la degradación por proteasas, expresada como el
porcentaje de degradación de cada péptido a los 45 minutos. Los
péptidos de la Tabla IV se identifican con los parámetros X_{1},
X_{2}, y X_{3} que figuran en la fórmula general (I). Además la
Tabla IV incluye el número de referencia con relación a la
quimioteca preparada en el Ejemplo 6. En la Tabla IV se incluyen
como Ejemplo comparativo los resultados correspondientes al péptido
descrito por Cavallarin et al, que no forma parte de la
invención:
| Ref. | X_{1} | X_{2} | X_{3} | % Degradación en 45 minutos |
| Ejemplo comparativo | H | Trp | Val | 100 |
| BP008 | Ac | Trp | Val | 100 |
| BP077 | Ac | Lys | Phe | 84 |
| BP009 | Ts | Trp | Val | 100 |
| BP125 | Ts | Lys | Lys | 67 |
| BP010 | Bz | Trp | Val | 100 |
| BP126 | Bz | Lys | Lys | 53 |
| Ref. | X_{1} | X_{2} | X_{3} | % Degradación en 45 minutos |
| BP015 | H | Lys | Val | 100 |
| BP019 | H | Trp | Phe | 87 |
| BP020 | H | Trp | Tyr | 85 |
| BP033 | H | Leu | Val | 100 |
| BP076 | H | Lys | Phe | 49 |
| BP100 | H | Lys | Tyr | 60 |
Se puede observar que algunos péptidos de la
invención son más estables frente a la degradación por proteasas
que el péptido descrito por Cavallarin et al (Ejemplo
comparativo). En particular, los péptidos correspondientes a la
fórmula general (I) donde X_{1} es hidrógeno, X_{2} es Lys, y
X_{3} es Phe, o X_{1} es benzoílo, X_{2} es Lys y X_{3} es
Lys, resultan ser dos veces más estables que el péptido del Ejemplo
comparativo.
Claims (27)
1. Péptidos lineales caracterizados
porque responden a la fórmula general (I):
(I)X_{1}-X_{2}-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Leu-Lys-X_{3}-Leu-NH_{2}
en
donde
X_{1} es hidrógeno, acetilo,
p-toluensulfonilo, bencilo, o benzoílo,
X_{2} es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y
X_{3} es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp,
con la condición de que el péptido
en donde X_{1} es hidrógeno, X_{2} es Trp, y X_{3} es Val, se
excluye
expresamente.
2. Péptidos según la reivindicación 1
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ-ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 14, y SEQ_ID_NO: 16 a
SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
3. Péptidos según la reivindicación 2
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 6 a SEQ_ID_NO: 11, SEQ_ID_NO: 13, SEQ_ID_NO: 16,
SEQ_ID_NO: 18 a SEQ_ID_NO: 22, y SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el
aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo
carboxamida.
4. Péptidos según la reivindicación 3
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 6 y SEQ_ID_NO: 16, y porque tienen el aminoácido del
extremo C-terminal en forma de grupo
carboxamida.
5. Péptidos según la reivindicación 1
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del
extremo N-terminal funcionalizado con el grupo
acetilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en
forma de grupo carboxamida.
6. Péptido según la reivindicación 5
caracterizado porque está definido por la secuencia
SEQ_ID_NO: 16, y porque tiene el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo acetilo, y el
aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo
carboxamida.
7. Péptidos según la reivindicación 1
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del
extremo N-terminal funcionalizado con el grupo
p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
8. Péptidos según la reivindicación 7
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 1, 6, 11 y 16, y porque tienen el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo
p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
9. Péptido según la reivindicación 8
caracterizado porque está definido por la secuencia
SEQ_ID_NO: 1, y porque tiene el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo
p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo
C-terminal en forma de grupo carboxamida.
10. Péptidos según la reivindicación 1
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del
extremo N-terminal funcionalizado con el grupo
bencilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en
forma de grupo carboxamida.
11. Péptido según la reivindicación 10
caracterizado porque está definido por la secuencia
SEQ_ID_NO: 15, y porque tiene el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo bencilo, y el
aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo
carboxamida.
12. Péptidos según la reivindicación 1
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del
extremo N-terminal funcionalizado con el grupo
benzoílo, y el aminoácido del extremo C-terminal en
forma de grupo carboxamida.
13. Péptidos según la reivindicación 12
caracterizados porque están definidos por las secuencias
SEQ_ID_NO: 1, y SEQ_ID_NO: 11, y porque tienen el aminoácido del
extremo N-terminal funcionalizado con el grupo
benzoílo, y el aminoácido del extremo C-terminal en
forma de grupo carboxamida.
14. Péptido según la reivindicación 13
caracterizado porque está definido por la secuencia
SEQ_ID_NO: 1, y porque tiene el aminoácido del extremo
N-terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y
el aminoácido del extremo C-terminal en forma de
grupo carboxamida.
15. Utilización de los péptidos según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14 para la preparación de una
composición antimicrobiana.
16. Utilización según la reivindicación 15 como
agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de las
plantas.
17. Utilización según la reivindicación 16
caracterizada porque las bacterias patógenas de las plantas
se seleccionan entre el grupo formado por Erwinia amylovora,
Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
18. Utilización según las reivindicaciones 16 o
17 caracterizada porque las plantas se seleccionan entre el
grupo formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas
ornamentales.
19. Composición fitosanitaria que comprende un
péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un
agente auxiliar.
20. Composición según la reivindicación 19
caracterizada porque el péptido se encuentra a una
concentración comprendida entre 0,01 y 0,5 g/l.
21. Composición según las reivindicaciones 19 o
20 caracterizada porque el agente auxiliar se selecciona
entre el grupo formado por disolventes, tensioactivos, agentes
tamponantes, filtros de la radiación ultravioleta y/o sus
mezclas.
22. Composición según la reivindicación 21
caracterizada porque el disolvente es agua.
23. Método para prevenir y tratar infecciones y
enfermedades de plantas causadas por bacterias que comprende poner
en contacto la planta con una composición fitosanitaria según
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22.
24. Método según la reivindicación 23
caracterizado porque las bacterias se seleccionan entre el
grupo formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria,
y Pseudomonas syringae.
25. Método según las reivindicaciones 23 o 24
caracterizado porque las plantas se seleccionan entre el
grupo formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas
ornamentales.
26. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 25 caracterizado porque la composición
se pone en contacto con las partes de las plantas seleccionadas
entre el grupo formado por semillas, raíces, tallos, hojas, o
frutos, o con el suelo o cualquier medio de crecimiento que rodee
las raíces de las plantas.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26 caracterizado porque la composición
fitosanitaria se pone en contacto con la planta por pulverización,
inmersión o riego.
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