ES2260899T3

ES2260899T3 - Proteinasa svphi-8 humana especifica de testiculos.

Info

Publication number: ES2260899T3
Application number: ES99902177T
Authority: ES
Inventors: Douglas Pat Cerretti
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2019-01-12
Also published as: EP1045914A1; ATE320496T1; EP1045914B8; NZ506277A; AU750038B2; CA2317838A1; IL137265A0; DK1045914T3; DE69930370D1; AU2221999A; DE69930370T2; EP1045914B1; WO1999036549A1; PT1045914E; JP2002508969A; CY1105287T1

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo compuesto por: (a) la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos 595-1191 de SEC ID Nº 1; (c) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2; (d) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 199- 137 de la SEC ID Nº 2; (e) una molécula de ácido nucleico que hibrida con cualquier cadena de un ADN bicatenario desnaturalizado que comprende el ácido nucleico de (a), (b), (c), o (d) en condiciones de rigurosidad moderada en formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado de 60ºC, 0, 5XSSC, SDS al 0, 1%, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tienen al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y que tiene actividad proteinasa; y (f) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento del polipéptido de la SEC ID Nº 2 que tiene actividad proteinasa.

Description

Proteinasa SVPHI-8 humana específica de testículos.

Campo de la invención

La invención se refiere a polipéptidos SVPHI-8 purificados y aislados, los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, procesos para la producción de formas recombinantes de dichos polipéptidos, anticuerpos generados contra estos polipéptidos, péptidos fragmentados obtenidos a partir de estos polipéptidos, el uso de dichos polipéptidos y péptidos fragmentados como marcadores de peso molecular, el uso de dichos polipéptidos y péptidos fragmentados como controles para la fragmentación de péptidos, el uso de dichos ácidos nucleicos, polipéptidos, y anticuerpos como marcadores celulares y de tejido, y kits que comprenden estos reactivos.

Antecedentes de la invención

El descubrimiento e identificación de proteínas está a la vanguardia de la biología molecular y bioquímica modernas. La identificación de la estructura primaria, o secuencia, de una proteína muestra es la culminación de un arduo proceso de experimentación. A fin de identificar una proteína muestra desconocida, el investigador puede contar con la comparación de la proteína muestra desconocida con péptidos conocidos usando diversas técnicas conocidas para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las proteínas se analizan de forma rutinaria usando técnicas tales como electroforesis, cromatografía de sedimentación y espectrometría de masas.

La comparación de una muestra de proteína desconocida con polipéptidos de peso molecular conocido permite una determinación del peso molecular aparente de la muestra de proteína desconocida (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6ª ed. 1991)). Los patrones de peso molecular de proteínas están disponibles en el mercado para ayudar en la estimación de pesos moleculares de muestras de proteína desconocidas (New England Biolabs Inc. Catalog: 130-131, 1995; J. L. Hartley, Patente de Estados Unidos Nº 5.449.758). Sin embargo, los patrones de peso molecular pueden no corresponder de forma suficientemente estrecha en tamaño con la muestra de proteína desconocida para permitir una estimación exacta del peso molecular aparente.

La dificultad de la estimación del peso molecular se agrava en el caso de proteínas que se someten a fragmentación por medios químicos o enzimáticos (A.L. Lehninger, Biochemistry 106-108 (Worth Books, 2ª ed. 1981)). La fragmentación química se puede conseguir por incubación de una proteína con un producto químico, tal como bromuro de cianógeno, que conduce a la escisión del péptido unido al extremo carboxilo de restos metionina (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255, 1967). La fragmentación enzimática de una proteína se puede conseguir por incubación de una proteína con una proteasa, que escinde en múltiples restos de aminoácido (D: W: Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977). La fragmentación enzimática de una proteína se puede conseguir también por incubación de una proteína con una proteasa, tal como proteasa I de Achromobacter (F. Sakiyama y A. Nakata, Patente de Estados Unidos Nº 5.248.599; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T. Masaka et al., Biochim. Biophys. Acta 660:51-55, 1981), que conduce a la escisión del péptido unido en el extremo carboxilo de los restos de lisina. Los pesos moleculares de los péptidos fragmentados pueden cubrir un gran intervalo de pesos moleculares y los péptidos pueden ser numerosos. También se pueden conseguir variaciones en el grado de fragmentación (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977).

La naturaleza única de la composición de una proteína con respecto a sus aminoácidos constituyentes específicos da como resultado un emplazamiento único de los sitios de escisión en la proteína. La fragmentación específica de una proteína por escisión química o enzimática da como resultado una "huella peptídica" única (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977; M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980). Por consiguiente, la escisión en sitios específicos da como resultado la fragmentación reproducible de una proteína dada en péptidos de pesos moleculares precisos. Además, estos péptidos poseen características de carga únicas que determinan el pH isoeléctrico del péptido. Estas características únicas pueden explotarse usando una diversidad de técnicas electroforéticas y otras técnicas (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6ª ed.
1991)).

Cuando se obtiene una huella peptídica de una proteína desconocida, esta se puede comparar con una base de datos de proteínas conocidas para ayudar a la identificación de la proteína desconocida (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5011-5015, 1993; B. Thiede et al., Electophoresis 1996, 17:588-599, 1996). Está disponible una diversidad de programas informáticos para un especialista en la técnica vía Internet para facilitar dichas comparaciones, tales como MultiIdent (dirección de Internet: www.expasy.ch/sprot/multiident.htlm), PeptideSearch (dirección de Internet: www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearchForm.htlm), y ProFound (dirección de Internet: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.htlm). Estos programas permiten al usuario especificar el agente de escisión y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados en una tolerancia designada. Los programas comparan estos pesos moleculares con bases de datos de proteínas para ayudar en la aclaración de la identidad de la proteína muestra. Se requiere la información exacta concerniente al número de péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de esas proteínas para la identificación exacta. Por lo tanto, el aumento de la exactitud en la determinación del número de péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de esos péptidos debe dar como resultado un éxito potenciado en la identificación de proteínas desconocidas.

La fragmentación de proteínas se emplea además para la producción de fragmentos para análisis de la composición de aminoácidos y secuenciación de proteínas (P. Mastudiara, J. Biol Chem. 262:10035-10038, 1987; C. Eckerskorn et al., Electrophoresis 1988, 9:830-838, 1988), particularmente la producción de fragmentos de proteínas con un extremo N "bloqueado". Además, la fragmentación de proteínas puede usarse en la preparación de péptidos para espectrometría de masas (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5011-5015, 1993; B. Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17:588-599, 1996), para inmunización, para selección de afinidad (R. A. Brown, Patente de Estados Unidos Nº 5.151.412), para determinación de sitios de modificación (por ejemplo fosforilación), para la generación de compuestos biológicos activos (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 300-301 (Prentice Hall, 6ª ed. 1991)), y para diferenciación de proteínas homólogas (M. Brown et al., J. Gen: Virol. 50:309-316, 1980).

El número de acceso AF0229900 de la base de datos EMBL es una entrada de la base de datos EMBL que describe la secuencia denominada ADAM 21, un polipéptido que no muestra función proteasa, que comparte un 99,8% de identidad en un tramo de 1626 pares de bases con la SEC ID Nº 1 de la presente invención.

En vista del continuo interés en la investigación de proteínas y la aclaración de la estructura y propiedades de las proteínas, existe una necesidad en la técnica de polipéptidos adecuados para uso en estudios de fragmentación de péptidos y en medidas del peso molecular.

Sumario de la invención

La invención ayuda a satisfacer esta necesidad en la técnica. La invención abarca una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo compuesto por:

(a) la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de los nucleótidos 595-1191 de la SEC ID Nº 1;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2;

(d) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 199-397 de la SEC ID Nº 2;

(e) una molécula de ácido nucleico que hibrida con cualquier cadena de un ADN bicatenario desnaturalizado que comprende el ácido nucleico de (a), (b), (c), o (d) en condiciones de rigurosidad moderada en formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado de 60ºC, 0,5XSSC, SDS al 0,1%, donde dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y que tiene actividad proteinasa; y

(f) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento del polipéptido de la SEC ID Nº 2 que tiene actividad proteinasa.

Por lo tanto, la invención abarca una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1 y una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico complementarias a estas secuencias. Por tanto, la invención incluye moléculas de ácido nucleico bicatenarias que comprenden la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1 y moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2. La invención abarca moléculas de ácido nucleico tanto monocatenarias como bicatenarias de ARN y ADN de SVPH1-8. Estás moléculas pueden usarse para detectar variantes de ARN y ADN de SVPH1-8 tanto monocatenarias como bicatenarias abarcadas por la invención. Una sonda de ADN bicatenario permite la detección de moléculas de ácido nucleico equivalentes a cualquier cadena de la molécula de ácido nucleico. La invención abarca moléculas de ácido nucleico aisladas que hibridan con un ADN desnaturalizado bicatenario que comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1 o una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 en condiciones de rigurosidad moderada en formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado de 60ºC, 0,5XSSC,
SDS al 0,1%.

La invención además abarca moléculas aisladas de ácido nucleico obtenidas por mutagénesis in vitro de la SEC ID Nº 1. La mutagénesis in vitro incluiría numerosas técnicas conocidas en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria, y síntesis in vitro de ácido nucleico. La invención también abarca moléculas aisladas de ácido nucleico degeneradas de la SEC ID Nº 1 como resultado del código genético, moléculas aisladas de ácido nucleico que son variantes alélicas del ADN de SVPH1-8 humano, o una especie homóloga del ADN de SVPH1-8. La invención también abarca vectores recombinantes que dirigen la expresión de estas moléculas de ácido nucleico y células hospedadoras transformadas o transfectadas con estos vectores.

La invención también abarca polipéptidos aislados codificados por estas moléculas de ácido nucleico, incluyendo polipéptidos aislados que tienen un peso molecular de aproximadamente 81 kD como se determina por SDS-PAGE y polipéptidos aislados en forma no glicosilada. La invención abarca anticuerpos policlonales o monoclonales aislados que se unen a estos polipéptidos. La invención además abarca métodos para la producción de polipéptidos SVPH1-8 que incluyen cultivar una célula hospedadora en condiciones que promueven la expresión y recuperar el polipéptido del medio de cultivo. Especialmente, la invención abarca la expresión de polipéptidos SVPH1-8 en células de bacterias, levaduras, plantas y animales.

Además, la invención abarca ensayos que utilizan polipéptidos SVPH1-8 para seleccionar inhibidores potenciales de actividad asociada con moléculas de contra-estructura de polipéptidos SVPH1-8, y modos para usar polipéptidos SVPH1-8 como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas por moléculas de contra-estructura de polipéptidos SVPH1-8. Además, los métodos para usar polipéptidos SVPH1-8 en el diseño de inhibidores de los mismos son también un aspecto de la invención.

La invención también abarca los péptidos fragmentados producidos de polipéptidos SVPH1-8 por tratamiento químico o enzimático. Además, formas de marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 y péptidos fragmentados del mismo, en los que al menos uno de los sitios necesarios para la fragmentación por medios químicos o enzimáticos ha mutado, son un aspecto de esta invención.

Se prefiere un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por:

(a) los aminoácidos 1-26 de la SEC ID Nº 2;

(b) los aminoácidos 1-397 de la SEC ID Nº 2;

(c) los aminoácidos 1-501 de la SEC ID Nº 2;

(d) los aminoácidos 1-680 de la SEC ID Nº 2;

(e) los aminoácidos 2-76 de la SEC ID Nº 2;

(f) los aminoácidos 27-198 de la SEC ID Nº 2;

(g) los aminoácidos 27-245 de la SEC ID Nº 2;

(h) los aminoácidos 27-397 de la SEC ID Nº 2;

(i) los aminoácidos 27-501 de la SEC ID Nº 2;

(j) los aminoácidos 27-680 de la SEC ID Nº 2;

(k) los aminoácidos 172-245 de la SEC ID Nº 2;

(l) los aminoácidos 199-397 de la SEC ID Nº 2;

(m) los aminoácidos 199-501 de la SEC ID Nº 2;

(n) los aminoácidos 199-680 de la SEC ID Nº 2; y

(o) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 que tiene actividad proteinasa;

(p) una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% de identidad con los aminoácidos 1-26 de la SEC ID Nº 2; y

(q) una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% de identidad con los aminoácidos 2-76 de la SEC ID Nº 2; y

un polipéptido aislado que tiene un 80% de identidad de aminoácidos con el polipéptido de la SEC ID Nº 2 y que tiene actividad proteasa.

La invención también abarca un método para la visualización de marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos usando electroforesis. La invención además incluye un método para usar marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos como marcadores de peso molecular que permiten la estimación del peso molecular de una proteína o de una muestra de proteína fragmentada. La invención abarca además métodos para usar polipéptidos SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos como marcadores, que ayudan en la determinación del punto isoeléctrico de una proteína muestra. La invención también abarca métodos para usar polipéptidos SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos como controles para establecer el alcance de la fragmentación de una muestra de proteína.

La invención abarca además kits para ayudar en la determinación del peso molecular de una proteína muestra utilizando marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8, péptidos fragmentados de los mismos, y formas de marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8, en las que al menos uno de los sitios necesarios para la fragmentación por medios químicos o enzimáticos ha mutado.

La invención abarca además métodos para usar ácidos nucleicos de SVPH1-8, polipéptidos, y anticuerpos como marcadores celulares y tisulares en la identificación y purificación de células que expresan SVPH1-8.

Descripción detallada de la invención

Se ha aislado un ADNc que codifica el polipéptido SVPH1-8 humano y se describe en la SEC ID Nº 1.

100

Por análisis de transferencia de Northern usando una sonda de ácido nucleico de SVPH1-8, se detectó expresión de ARN de SVPH1-8 sólo en los testículos. Por lo tanto, la expresión de SVPH1-8 puede usarse como marcador para células y tejido de los testículos.

Este descubrimiento del ADNc que codifica polipéptidos SVPH1-8 humanos permite la construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos SVPH1-8; células hospedadoras transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; proteinasa SVPH1-8 humana biológicamente activa y marcadores de peso molecular de SVPH1-8 en forma de proteínas aisladas y purificadas; y anticuerpos inmunorreactivos con polipéptidos SVPH1-8.

El ADN de SVPH1-8 (SEC ID Nº 1) codifica el polipéptido SVPH1-8 (SEC ID Nº 2):

102

El polipéptido SVPH1-8 (SEC ID Nº 2) tiene todas las estructuras de dominio conservado encontradas en adamalisinas de mamífero (ADAMS): secuencia señal (aminoácidos 1-26 de la SEC ID Nº 2), dominio pro (aminoácidos 27-198 de la SEC ID Nº 2), dominio catalítico incluyendo los tres restos His conservados (aminoácidos 199-397 de la SEC ID Nº 2), dominio disintegrina (aminoácidos 398-501 de la SEC ID Nº 2), dominio rico en Cys (aminoácidos 502-680 de la SEC ID Nº 2), dominio transmembrana (aminoácidos 681-707 de la SEC ID Nº 2), y un dominio citoplásmico (aminoácidos 708-722 de la SEC ID Nº 2).

Las ADAMS 1-6 se han implicado en fertilización y/o espermatogénesis (Barrer, H.L., Perry, A.C., Jones, R., y Hall, L., Biochim Biophys Acta, 1218, 429-31, 1994; Blobel, C.P., Wolfsberg, T.G., Turck, C.W., Myles, D.G., Primakoff, P., y White, J.M., Nature, 356, 248-252, 1992; Evans, J.P., Schultz, R.M., y Kopf, G.S., J. Cell Sci, 108, 3267-3278, 1995; Perry, A.C., Barker, H.L., Jones, R., y Hall., L., Biochim Biophsy Acta, 1207, 134-137, 1994; Perry, A.C., Gichuhi, P.M., Jones, R., y Hall, L., Biochem J., 307, 843-850, 1995; Perry, A.C., Jones, R., y Hall, L., Biochem J., 312, 239-244, 1995; Wolfsberg, T.G., Bazan, J.F., Blobel, C.P., Mules, D.G., Primakoff, P., y White, J.M., Proc Natl Acad Sci USA, 90, 10783-10787, 1993; y Wolfsberg, T.G., Straight, P.D., Gerena, R.L., Huovila, A.P., Primakoff, P., Myles, D.G., y White, J.M., Dev Biol, 169, 378-383, 1995). El descubrimiento de que SVPH1-8 se expresa específicamente en los testículos por análisis de Northern también implica a este miembro de la familia en la fertilización y/o espermatogénesis. Además, aunque se ha descubierto que la ADAM1 es necesaria para la fusión del esperma y el óvulo, los seres humanos no tienen una forma activa de este gen. Por lo tanto SVPH1-8 puede ser el equivalente humano. El dominio catalítico de SVPH1-8 es necesario para la actividad biológica. Un inhibidor proteinasa del dominio catalítico inhibiría la actividad de SVPH1-26 y sería útil como método de control de la natalidad. Además, un inhibidor del dominio disintegrina de SVPH1-26 puede afectar a la fertilización.

La proteinasa SVPH1-8 es un miembro de la familia de proteasas del veneno de serpiente, y es homóloga de la proteína TACE. TACE es una proteinasa necesaria para el desprendimiento de las proteínas de membrana incluyendo TNF\alpha, p80 TNFR, p60TNFR, L-selectina, IL-1R tipo II, y proteína precursora \beta-amiloide. La proteinasa SVPH1-8 también muestra homología con fertilina-\alpha, que es necesaria para la unión del esperma al óvulo; meltrina-\alpha, que es necesaria para la fusión de mioblastos en las células del músculo; reprolisina, que escinde proteína mielina básica; y kuzbanian, que es un homólogo en Drosophila de reprolisina, y es necesaria para neurogénesis y extensión axónica. La actividad proteinasa de SVPH1-8 está probablemente implicada en el desprendimiento de las proteínas de membrana.

La actividad proteasa puede estar implicada en la fusión esperma/óvulo. Por lo tanto, un inhibidor puede ser un agente contraceptivo. Se ha descubierto que el dominio disintegrina de algunos homólogos se une a integrina. El dominio disintegrina de fertilina-\alpha y meltrina-\alpha se han implicado en la fusión esperma/óvulo y en la fusión de mioblastos, respectivamente. Usando el dominio disintegrina de SVPH1-8 en una exploración, se pudieron descubrir inhibidores de la fusión celular que son útiles como agentes contraceptivos.

En una realización de esta invención, la expresión de polipéptidos SVPH1-8 recombinantes se puede conseguir utilizando la fusión de secuencias que codifican polipéptidos SVPH1-8 con secuencias que codifican otro polipéptido para ayudar en la purificación de polipéptidos SVPH1-8. Un ejemplo de dicha fusión es una fusión de secuencias que codifican un polipéptido SVPH1-8 con secuencias que codifican el producto del gen malE del vector pMAL-c2 de New Englad Biolabs, Inc. Dicha fusión permite la purificación por afinidad de la proteína de fusión, así como la separación de la porción de proteína de unión a maltosa de la proteína de fusión del polipéptido SVPH1-8 después de la purificación. Se entiende, por supuesto, que pueden usarse muchos vectores y técnicas diferentes para la expresión y purificación de polipéptidos SVPH1-8 y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

La inserción de ADN que codifica el polipéptido SVPH1-8 en el vector pMAL-c2 puede conseguirse de diversas maneras usando técnicas conocidas de biología molecular. La construcción preferida de la inserción contiene un codón de terminación contiguo al codón carboxilo terminal del polipéptido SVPH1-8. Además, la construcción preferida de la inserción da como resultado la fusión del extremo amino del polipéptido SVPH1-8 directamente con el extremo carboxilo del sitio de escisión del Factor Xa en el vector pMAL-c2. Se puede generar un fragmento de ADN por PCR usando ADN de SVPH1-8 como ADN molde y dos oligonucleótidos cebadores. El uso de los oligonucleótidos cebadores genera un fragmento de ADN de extremos romos que puede aislarse por medios convencionales. Este producto de PCR puede ligarse junto con pMAL-p2 (digerido con la endonucleasa de restricción Xmn I) usando medios convencionales. Los clones positivos pueden identificarse por medios convencionales. La inducción de la expresión y la purificación de la proteína de fusión pueden realizarse según las instrucciones del fabricante. Esta construcción facilita una precisa separación del polipéptido SVPH1-8 de la proteína de unión a maltosa fusionada utilizando un sencillo tratamiento con proteasa según las instrucciones del fabricante. De esta manera, se puede obtener el polipéptido SVPH1-8 purificado. Además, dicho vector construido puede modificarse fácilmente usando técnicas conocidas de biología molecular para generar proteínas de fusión adicionales.

Otra realización preferida de la invención es el uso de polipéptidos SVPH1-8 como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de una proteína muestra por electroforesis en gel. Un marcador de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 aislado y purificado de acuerdo con la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 80.766 Dalton en ausencia de glicosilación. El polipéptido SVPH1-8, junto con una proteína muestra, puede resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales (U.K. Laemmli, Nature 227:680-685, 1970) en dos carriles distintos de un gel que contiene dodecil sulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 6-20%. Las proteínas en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. El marcador de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 puede usarse como marcador de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína muestra. La secuencia única de aminoácidos de SVPH1-8 (SEC ID Nº 2) especifica un peso molecular de aproximadamente 80.766 Dalton. Por lo tanto, el marcador de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 sirve particularmente bien como marcador de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de proteínas muestra que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 80.766 Dalton. El uso de este polipéptido marcador de peso molecular permite una exactitud aumentada en la determinación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 80.766 Dalton. Se entiende, por supuesto, que pueden usarse muchas técnicas diferentes para la determinación del peso molecular de una proteína muestra usando polipéptidos SVPH1-8 y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

Otra realización preferida de la invención es el uso de marcadores de peso molecular de péptidos SVPH1-8 fragmentados, generados por fragmentación química del polipéptido SVPH1-8, como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de una proteína muestra por electroforesis en gel. El polipéptido SVPH1-8 aislado y purificado puede tratarse con bromuro de cianógeno en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación del marcador de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de los restos de metionina en el polipéptido SVPH1-8 (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255, 1967). Debido a la secuencia única de aminoácidos del polipéptido SVPH1-8, la fragmentación de marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 con bromuro de cianógeno genera un único conjunto de marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado. La distribución de los restos de metionina determina el número de aminoácidos en cada péptido y la composición única de aminoácidos de cada péptido determina su peso molecular.

El conjunto único de marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado generado por tratamiento del polipéptido SVPH1-8 con bromuro de cianógeno comprende 14 péptidos fragmentados de al menos 10 aminoácidos de tamaño. El péptido codificado por los aminoácidos 2-76 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 8.205 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 77-171 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 10.865 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 172-245 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 8.568 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 246-269 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.809 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 270-297 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.253 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 298-349 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 5.537 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 350-365 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.902 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 366-384 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.240 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 385-405 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.355 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 406-458 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 5.747 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 459-599 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 16.175 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 600-641 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 4.426 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 642-705 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 6.898 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 706-722 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.847 Dalton.

Por lo tanto, la escisión del polipéptido SVPH1-8 por tratamiento químico con bromuro de cianógeno genera un único conjunto de marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado. La secuencia de aminoácidos única y conocida de estos péptidos SVPH1-8 fragmentados permite la determinación del peso molecular de estos marcadores de peso molecular de péptido fragmentado. En este caso particular, los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado tienen pesos moleculares de aproximadamente 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; y 1.847 Dalton.

Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado, junto con una proteína muestra, pueden resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos carriles distintos de un gel que contiene dodecil sulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Las proteínas en el gel se pueden visualizar usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína muestra. La secuencia única de aminoácidos de SVPH1-8 especifica un peso molecular de aproximadamente 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; y 1.847 Dalton para los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado. Por lo tanto, los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de las proteínas muestra que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; ó 1.847 Dalton. Por consiguiente, el uso de estos marcadores de peso molecular de péptido fragmentado permite una exactitud aumentada en la determinación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; ó 1.847 Dalton.

En una realización adicional, la proteína muestra y el polipéptido SVPH1-8 pueden tratarse de forma simultánea, pero por separado, con bromuro de cianógeno en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación de la proteína muestra y del polipéptido SVPH1-8 por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de los restos de metionina en la proteína muestra y en el polipéptido SVPH1-8. Como se ha descrito anteriormente, los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado generados por escisión del polipéptido SVPH1-8 con bromuro de cianógeno tienen pesos moleculares de aproximadamente 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; ó 1.847 Dalton.

Los péptidos fragmentados tanto del polipéptido SVPH1-8 como de la proteína muestra pueden resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos carriles distintos de un gel que contiene dodecil sulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Los péptidos fragmentados en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de las proteínas fragmentadas obtenidas de la proteína muestra. Como se ha analizado anteriormente, los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; ó 1.847 Dalton. Por consiguiente, el uso de estos marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado permite una exactitud aumentada en la determinación del peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 8.205; 10.865; 8.568; 2.809; 3.253; 5.573; 1.902; 2.240; 2.355; 5.747; 16.175; 4.426; 6.898; ó 1.847 Dalton. El grado de fragmentación del polipéptido SVPH1-8 se usa además como control para determinar las condiciones esperadas para la completa fragmentación de la proteína muestra. Se entiende, por supuesto, que podrían usarse muchos compuestos químicos para fragmentar polipéptidos SVPH1-8 y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

En otra realización, se pueden generar conjuntos únicos de marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado a partir de polipéptido SVPH1-8 usando enzimas que escinden el polipéptido en restos de aminoácido específicos. Debido a la naturaleza única de la secuencia de aminoácidos del polipéptido SVPH1-8, la escisión en diferentes restos de aminoácido dará como resultado la generación de diferentes conjuntos de marcadores de peso molecular de péptido fragmentado.

Un polipéptido SVPH1-8 aislado y purificado puede tratarse con proteasa I de Achromobacter en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación del polipéptido SVPH1-8 por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de los restos de lisina en el polipéptido SVPH1-8 (T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:51-55, 1981). Debido a la secuencia única del polipéptido SVPH1-8, la fragmentación de marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 con proteasa I de Achromobacter genera un conjunto única de marcadores de peso molecular de SVPH1-8 fragmentado. La distribución de los restos de lisina determina la cantidad de aminoácidos en cada péptido y la composición única de aminoácidos de cada péptido determina su peso molecular.

El conjunto único de marcadores de peso molecular de SVPH1-8 fragmentado generado por tratamiento de polipéptido SVPH1-8 con proteasa I de Achromobacter comprende 20 péptidos fragmentados de al menos 10 aminoácidos de tamaño. La generación de 20 péptidos fragmentados con este tratamiento enzimático del polipéptido SVPH1-8, comparado con la generación de 14 péptidos fragmentados con tratamiento con bromuro de cianógeno del polipéptido SVPH1-8, ilustra claramente que los tamaños de los marcadores de peso molecular de péptido fragmentado variarán dependiendo del tratamiento de fragmentación utilizado para fragmentar el polipéptido SVPH1-8. Tanto el tamaño como la cantidad de estos fragmentos están impuestos por la secuencia de aminoácidos del polipéptido SVPH1-8. Por consiguiente, la cantidad de péptidos fragmentados variará también en dependiendo del tratamiento de fragmentación utilizado para fragmentar el polipéptido SVPH1-8.

El péptido codificado por los aminoácidos 1-47 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 5.130 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 57-71 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.665 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 81-137 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 6.451 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 138-160 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.702 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 161-178 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.023 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 179-198 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.316 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 199-230 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.794 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 231-283 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 6.173 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 284-300 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.966 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 301-374 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 8.112 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 375-385 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.325 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 386-407 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.468 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 408-453 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 4.882 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 457-505 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 5.629 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 506-520 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.855 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 532-552 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.308 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 553-608 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 6.474 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 624-642 de SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.061 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 649-679 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.314 Dalton. El péptido codificado por los aminoácidos 680-714 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.877 Dalton.

Por lo tanto, la escisión del polipéptido SVPH1-8 por tratamiento enzimático con proteasa I de Achromobacter genera un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado. La secuencia de aminoácidos única y conocida de estos péptidos fragmentados permite la determinación del peso molecular de estos marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado. En este caso particular, estos marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado tienen pesos moleculares de aproximadamente 5.130; 1.665; 6.451; 2.702; 2.023; 2.316; 3.794; 6.173; 1.996; 8.112; 1.325; 2.468; 4.882; 5.629; 1.855; 2.308; 6.474; 2.061; 3.314; y 3.877 Dalton.

Una vez más, los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado, junto con una proteína muestra, pueden resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos carriles distintos de un gel que contiene dodecil sulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Las proteínas en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína muestra. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 5.130; 1.665; 6.451; 2.702; 2.023; 2.316; 3.794; 6.173; 1.996; 8.112; 1.325; 2.468; 4.882; 5.629; 1.855; 2.308; 6.474; 2.061; 3.314; y 3.877 Dalton. El uso de estos marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado permite una exactitud aumentada en la determinación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 5.130; 1.665; 6.451; 2.702; 2.023; 2.316; 3.794; 6.173; 1.996; 8.112; 1.325; 2.468; 4.882; 5.629; 1.855; 2.308; 6.474; 2.061; 3.314; y 3.877 Dalton.

En otra realización, la proteína muestra y el polipéptido SVPH1-8 pueden tratarse simultáneamente, pero por separado, con proteasa I de Achromobacter en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación de la proteína muestra y el polipéptido SVPH1-8 por hidrólisis específica del extremo carboxilo de los restos de lisina en la proteína muestra y el polipéptido SVPH1-8. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado y los péptidos fragmentados obtenidos de la proteína muestra se resuelven por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos carriles distintas de un gel que contiene dodecil sulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Los péptidos fragmentados en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína muestra. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 5.130; 1.665; 6.451; 2.702; 2.023; 2.316; 3.794; 6.173; 1.996; 8.112; 1.325; 2.468; 4.882; 5.629; 1.855; 2.308; 6.474; 2.061; 3.314; y 3.877 Dalton. El uso de estos marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado permite una exactitud aumentada en la determinación del peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 5.130; 1.665; 6.451; 2.702; 2.023; 2.316; 3.794; 6.173; 1.996; 8.112; 1.325; 2.468; 4.882; 5.629; 1.855; 2.308; 6.474; 2.061; 3.314; y 3.877 Dalton. El grado de fragmentación del polipéptido SVPH1-8 se usa además como control para determinar las condiciones esperadas para la completa fragmentación de la proteína muestra. Se entiende, por supuesto, que podrían usarse muchas enzimas para fragmentar polipéptidos SVPH1-8 y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

En otra realización, se pueden generar anticuerpos monoclonales y policlonales contra polipéptidos SVPH1-8. A ratones Balb/c se les puede inyectar en dos ocasiones a intervalos de 3 semanas 10 \mug de polipéptido SVPH1-8 aislado y purificado o péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos SVPH1-8 en presencia de adyuvante RIBI (RIBI Corp., Hamilton, Montana). Después se ensayan los sueros de ratón por técnica dot blot convencional o captura de anticuerpos (ABC) para determinar qué animal es el mejor para fusionar. Tres semanas después, se da a los ratones un refuerzo intravenoso de 3 \mug de polipéptido o péptidos SVPH1-8, suspendidos en PBS estéril. Tres días después, se sacrifican los ratones y las células esplénicas se fusionan con células de mieloma Ag8.653 (ATCC) siguiendo los protocolos establecidos. En resumen, las células Ag8.653 se lavan varias veces en medios libres de suero y se fusionan con células esplénicas de ratón en una proporción de tres células esplénicas a una célula de mieloma. El agente de fusión es PEG al 50%: DMSO al 10% (Sigma). El producto de fusión se coloca en veinte placas de 96 pocillos de fondo plano (Corning) que contienen medios DMEM suplementado con HAT y se le permite crecer durante ocho días. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se recogen y se añaden a una placa de 96 pocillos durante 60 minutos que se cubre primero con Ig de cabra anti-ratón. Después de los lavados, se añaden a cada pocillo el polipéptido o péptidos ^{125}I-SVPH1-8, se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente, y se lavan cuatro veces. Los pocillos positivos se detectan posteriormente por autorradiografía a -70ºC usando película Kodak X-Omat S. Los clones positivos se pueden hacer crecer en cultivo en masa y los sobrenadantes se purifican posteriormente sobre una columna de Proteína A (Pharmacia). Se entiende, por supuesto, que se pueden usar muchas técnicas para generar anticuerpos contra polipéptidos SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

En otra realización, los anticuerpos generados contra SVPH1-8 y péptidos fragmentados del mismo pueden usarse en combinación con polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado para potenciar la exactitud en el uso de estos marcadores de peso molecular para determinar el peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de una proteína muestra. El polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado pueden mezclarse con un exceso molar de una proteína muestra y la mezcla puede resolverse por electroforesis bidimensional por medios convencionales. Los polipéptidos pueden transferirse a una membrana de unión de proteínas adecuada, tal como nitrocelulosa, por medios convencionales.

Los polipéptidos en la membrana se pueden visualizar usando dos métodos diferentes que permiten una distinción entre la proteína muestra y los marcadores de peso molecular. El polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado pueden visualizarse usando anticuerpos generados contra estos marcadores y técnicas de inmunotransferencia convencionales. Esta detección se realiza en condiciones convencionales que no dan como resultado la detección de la proteína muestra. Se entiende que puede no ser posible generar anticuerpos contra todos los fragmentos del polipéptido SVPH1-8, puesto que los péptidos pequeños pueden no contener epítopes inmunogénicos. Se entiende además que no todos los anticuerpos funcionaran en este ensayo; sin embargo, los anticuerpos que son capaces de unir polipéptidos y fragmentos SVPH1-8 pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales.

La proteína muestra se visualiza usando un procedimiento de tinción convencional. El exceso molar de proteína muestra a polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado es tal que el procedimiento de tinción convencional detecta de forma predominante la proteína muestra. El nivel de polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado es tal como para permitir poca o ninguna detección de estos marcadores por el método de tinción convencional. El exceso molar preferido de proteína muestra a marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 está entre 2 y 100.000 veces. Más preferiblemente, el exceso molar preferido de proteína muestra a marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 está entre 100 y 1.000 veces.

El polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado pueden usarse como marcadores de peso molecular y punto isoeléctrico en la estimación del peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de la proteína muestra. El polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular y punto isoeléctrico para la estimación del peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de proteínas muestra que tienen pesos moleculares aparentes y puntos isoeléctricos cercanos a los del polipéptido SVPH1-8 o los marcadores de peso molecular de péptido fragmentado. La capacidad para disolver simultáneamente el polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado y la proteína muestra en condiciones idénticas permite una exactitud aumentada en la determinación del peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de la proteína muestra. Esto es de particular interés en técnicas, tales como electroforesis bidimensional, donde la naturaleza del procedimiento impone que cualquier marcador debe resolverse simultáneamente con la proteína muestra.

En otra realización, el polipéptido SVPH1-8 o marcadores de peso molecular de péptido fragmentado pueden usarse como marcadores de peso molecular y punto isoeléctrico en la estimación del peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de péptidos fragmentados obtenidos por tratamiento de una proteína muestra con un agente de escisión. Se entiende, por supuesto, que se pueden usar muchas técnicas para la determinación del peso molecular y el punto isoeléctrico de una proteína muestra y péptidos fragmentados de la misma usando marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 y péptidos fragmentados del mismo y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

Los marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 abarcados por la invención pueden tener pesos moleculares variables, dependiendo de la célula hospedadora en la que se expresan.

La glicosilación de marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 y fragmentos peptídicos de los mismos en diversos tipos de células puede dar como resultado variaciones del peso molecular de estos marcadores, dependiendo del grado de modificación. El tamaño de los marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 puede ser más heterogéneo con fragmentos de polipéptido SVPH1-8 obtenidos de la porción extracelular del polipéptido. Se pueden obtener marcadores de peso molecular uniforme usando polipéptidos obtenidos completamente de las regiones transmenbrana y citoplásmica, pretratando con N-glicanasa para eliminar la glicosilación, o expresando los polipéptidos en hospedadores bacterianos.

La interacción entre SVPH1-8 y su contra-estructura posibilita seleccionar pequeñas moléculas que impiden la asociación SVPH1-8/contra-estructura de SVPH1-8 e inhiben la actividad de SVPH1-8 o de su contra-estructura. Por ejemplo, el sistema doble hídrido de levaduras desarrollado en SUNY (descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.283.173 para Fields et al.) puede usarse para seleccionar inhibidores de SVPH1-8 de la siguiente manera. SVPH1-8 y su contra-estructura, o porciones de los mismos responsables de su interacción, pueden fusionarse al dominio de unión del ADN de Gal4 y al dominio de activación transcripcional de Gal4, respectivamente, e introducirse en una cadena que depende de la actividad de Gal4 para crecer en placas que carecen de histidina. Los compuestos que evitan el crecimiento pueden explorarse para identificar inhibidores de IL-1. Como alternativa, la exploración puede modificarse de modo que la interacción SVPH1-8/contra-estructura de SVPH1-8 inhiba el crecimiento, de modo que la inhibición de la interacción permita que se produzca crecimiento. Otro enfoque in vitro de la selección para la inhibición de SVPH1-8 podría ser inmovilizar uno de los componentes (SVPH1-8 o su contra-estructura) en pocillos de una placa de microtitulación, y acoplar un indicador fácilmente detectado al otro componente. Un inhibidor de la interacción se identifica por la ausencia del indicador detectable en el pocillo.

Además, los polipéptidos SVPH1-8 de acuerdo con la invención son útiles para el diseño en base a la estructura de inhibidor de SVPH1-8. Dicho diseño comprendería las etapas de determinar la estructura tridimensional de dicho polipéptido SVPH1-8, analizar la estructura tridimensional para los posibles sitios de unión de sustratos, sintetizar una molécula que incorpora un sitio reactivo previsible, y determinar la actividad inhibidora de la molécula.

Los anticuerpos inmunorreactivos con polipéptidos SVPH1-8, y en particular, anticuerpos monoclonales contra polipéptidos SVPH1-8, se hacen ahora disponibles a través de la invención. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para inhibir la actividad del polipéptido SVPH1-8 in vivo y para detectar la presencia de polipéptido SVPH1-8 en una muestra.

Como se usa en este documento, la expresión "polipéptidos SVPH1-8" se refiere a un género de polipéptidos que además abarca proteínas que tienen la secuencia de los aminoácidos 1-722 de la SEC ID Nº 2, así como las proteínas que tienen un alto grado de similitud (al menos un 90% de identidad) con dicha secuencia de aminoácidos y cuyas proteínas son biológicamente activas. Además, polipéptidos SVPH1-8 se refiere a los productos génicos de los nucleótidos 1-2169 de la SEC ID Nº 1.

El polipéptido SVPH1-8 aislado y purificado de acuerdo con la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 80.766 Dalton en ausencia de glicosilación. Se entiende que el peso molecular de los polipéptidos SVPH1-8 puede variarse fusionando secuencias de péptidos adicionales a los extremos tanto amino como carboxilo terminales de polipéptidos SVPH1-8. La fusión de secuencias de péptidos adicionales a los extremos amino y carboxilo terminales de polipéptidos SVPH1-8 puede usarse para potenciar la expresión de polipéptidos SVPH1-8 o ayudar en la purificación de la proteína.

Se entiende que las fusiones de secuencias de péptidos adicionales a los extremos amino y carboxilo terminales de polipéptidos SVPH1-8 alterará algunos, pero habitualmente no todos, los péptidos fragmentados de polipéptidos SVPH1-8 generados por tratamiento enzimático o químico.

Se entiende que se pueden introducir mutaciones en polipéptidos SVPH1-8 usando técnicas de rutina y conocidas de biología molecular. Se entiende además que una mutación puede diseñarse para eliminar un sitio de escisión proteolítica por una enzima específica o un sitio de escisión por un procedimiento de fragmentación específico inducido químicamente. Se entiende además que la eliminación del sitio alterará la huella peptídica de los polipéptidos SVPH1-8 después de la fragmentación con el procedimiento enzimático o químico específico.

La expresión "aislado y purificado" como se usa en este documento, significa que los marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 o fragmentos de los mismos están básicamente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como producto de purificación del cultivo de células hospedadoras recombinantes o como un producto purificado de una fuente no recombinante. La expresión "sustancialmente purificado" como se usa en este documento, se refiere a una mezcla que contiene marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 o fragmentos de los mismos y está básicamente libre de asociación con otras proteínas o polipéptidos, excepto por la presencia de proteínas conocidas que pueden retirarse usando un anticuerpo específico, y cuyos polipéptidos SVPH1-8 sustancialmente purificados o fragmentos de los mismos pueden usarse como marcadores de peso molecular. El término "purificado" se refiere a la forma "aislada y purificada" de polipéptidos SVPH1-8 o a la forma "sustancialmente purificada" de polipéptidos SVPH1-8, como se describen ambas en este documento.

Una "secuencia de nucleótidos" se refiere a una molécula polinucleotídica en forma de componente individual o como componente de una construcción de ácido nucleico mayor, que se ha obtenido de ADN o ARN aislado al menos una vez en una forma sustancialmente pura (es decir, libre de materiales endógenos contaminantes) y en una cantidad o concentración que permite la identificación, manipulación, y recuperación de las secuencias de nucleótidos de sus componentes por métodos bioquímicos convencionales (tales como los expuestos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Dichas secuencias se proporcionan preferiblemente en forma de una fase de lectura abierta ininterrumpida por secuencias internas no traducidas, o intrones, que están presentes típicamente en genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en posición 5' o 3' respecto a una fase de lectura abierta, donde las mismas no impiden la manipulación o expresión de la región codificante.

Una "variante" del polipéptido SVPH1-8 como se denomina en este documento significa un polipéptido sustancialmente homólogo a los polipéptidos SVPH1-8 nativos, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la de los polipéptidos SVPH1-8 nativos (humanos, murinos u otras especies de mamíferos) por causa de una o más deleciones, inserciones y sustituciones. La secuencia de aminoácido variante es preferiblemente al menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido SVPH1-8 nativo, más preferiblemente al menos un 90% idéntica. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, comparando información de la secuencia usando el programa de ordenador GAP, versión 6 descrito por Deverux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387,1984) y disponible en University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), según la revisión de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Los parámetros preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación en peso de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, según lo descrito por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reseach Foundation, páginas 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada signo en cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos finales.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de forma conservativa, que significa que un resto de aminoácido dado se remplaza por un resto que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu, o Ala por algún otro, o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras de tales sustituciones conservativas, por ejemplo, sustituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas. La invención también abarca variantes de SVPH1-8 de origen natural. Ejemplos de dichas variantes son proteínas como resultado de acontecimientos alternos de corte y empalme de ARNm o de escisión proteolítica de los polipéptidos SVPH1-8. Las variaciones atribuibles a proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C después de la expresión en diferentes tipos de células hospedadoras, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos SVPH1-8 (generalmente de los aminoácidos terminales 1-5).

Como se ha expuesto anteriormente, la invención proporciona polipéptidos SVPH1-8 aislados y purificados, u homogéneos, tanto recombinantes como no recombinantes. Las variantes y derivados de los polipéptidos SVPH1-8 nativos que pueden usarse como marcadores de peso molecular pueden obtenerse por mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos SVPH1-8 nativos. Las alteraciones de la secuencia nativa de aminoácidos pueden conseguirse por cualquiera de varios métodos convencionales. Las mutaciones pueden introducirse en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que posibilitan el ligamiento a fragmentos de la secuencia nativa. Después del ligamiento, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.

Como alternativa, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótido para proporcionar un gen alterado en el que los codones predeterminados pueden alterarse por sustitución, deleción o inserción. Métodos ejemplares de realización de las alteraciones expuestas anteriormente se describen por Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (Bio Techniques, Enero 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); y Patentes de Estados Unidos Nº 4.518.584 y 4.737.462, todas las cuales se incorporan como referencia.

Los polipéptidos SVPH1-8 pueden modificarse para crear derivados de polipéptido SVPH1-8 formando conjugados covalentes o de agregación con otras restos químicos, tales como grupos glicosilo, grupos polietilengicol (PEG), lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Pueden preparase derivados covalentes de polipéptidos SVPH1-8 uniendo los restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos del polipéptido SVH1-8 o en el extremo N o extremo C de un polipéptido SVPH1-8 o el dominio extracelular del mismo. Otros derivados de polipéptidos SVPH1-8 en el alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o de agregación de polipéptidos SVPH1-8 o fragmentos peptídicos con otras proteínas o polipéptidos, tal como por síntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia de polipéptido señal o líder (por ejemplo el líder del factor-\alpha de Saccharomyces) en el extremo N de un polipéptido SVPH1-8. El péptido señal o líder dirige de forma co-traduccional o post-traduccional la transferencia del conjugado de su sitio de síntesis a un sitio dentro o fuera de la membrana celular o la pared celular.

Los conjugados de polipéptidos SVPH1-8 pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de polipéptidos SVPH1-8. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poli-Hys o péptidos de identificación antigénica descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204,
1988.

La invención además incluye polipéptidos SVPH1-8 con o sin glicosilación de patrón nativo asociada. Los polipéptidos SVPH1-8 expresados en sistemas de expresión de levaduras o mamíferos (por ejemplo, células COS-1 o COS-7) pueden ser similares a o significativamente diferentes de un polipéptido SVPH1-8 nativo en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos SVPH1-8 en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas. Los grupos glicosilo pueden retirarse por métodos convencionales, en particular los que utilizan glicopeptidasa. En general, los polipéptidos SVPH1-8 glicosilados pueden incubarse con un exceso molar de glicopeptidasa (Boehringer Mannheim).

La invención abarca construcciones de ADN equivalentes que codifican diversas adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias terminales o internas. Por ejemplo, sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular del polipéptido SVPH1-8 pueden modificarse para impedir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo carbohidrato reducido en sistemas de expresión en mamíferos y levaduras. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucariotas se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las sustituciones, adiciones, o deleciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes evitarán la unión de restos carbohidrato en la cadena lateral de Asn. La alteración de un solo nucleótido, elegido de modo que Asn se remplace por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosolación en proteínas incluyen los descritos en Patente de Estados Unidos 5.071.972 y el documento EP 276.846, incorporados por la presente como referencia.

En otro ejemplo, pueden alterarse secuencias que codifican restos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica para provocar que los restos de Cys se delecionen o remplacen por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después de la renaturalización. Otros equivalentes se preparan por modificación de restos de aminoácidos adyacentes dibásicos para potenciar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad proteasa KEX2. El documento EP 212.914 analiza el uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan delecionando, añadiendo, o sustituyendo restos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la existencia de estos restos básicos adyacentes. Los emparejamientos Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a la escisión por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservativo y preferido para inactivar sitios KEX2.

La invención abarca además fragmentos aislados y oligonucleótidos obtenidos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1, incluyendo los nucleótidos 1-78, 79-594, 595-1191, 1192-1503, 1504-2040, 2041-2121, y 2122-2166. La invención también abarca polipéptidos codificados por estos fragmentos y oligonucleótidos.

Las secuencias de ácido nucleico en el alcance de la invención incluyen secuencias de ADN y ARN aisladas que hibridan con las secuencias de nucleótidos de SVPH1-8 nativas descritas en este documento en condiciones de rigurosidad moderada o estricta, y que codifica polipéptidos SVPH1-8. Como se usa en este documento, condiciones de rigurosidad moderada, como se sabe por los especialistas en la técnica, y como se define por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1, páginas 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), incluyen el uso de una solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de formamida al 50%, 6X SSC a 42ºC (u otra solución de hibridación similar, tal como solución de Stark, en formamida al 50% a 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC, 0,5X SSC, SDS al 0,1%. Las condiciones de alta rigurosidad se definen como condiciones de hibridación como anteriormente, y con lavado a 68ºC, 0,2X SSC, SDS al 0,1%. El especialista en la técnica se dará cuenta de que la temperatura y concentración salina de la solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.

Debido a la conocida degeneración del código genético, en la que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de lo mostrado en la SEC ID Nº 1 y aún codificar un polipéptido SVPH1-8 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2. Dichas secuencias de ADN variantes pueden ser el resultado de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que se producen durante la amplificación por PCR), o pueden ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

La invención por tanto proporciona secuencias de ADN aisladas equivalentes que codifican polipéptidos SPVH1-8, seleccionados de: (a) ADN obtenido de la región codificante de un gen SVPH1-8 nativo de mamífero; (b) ADNc que comprende la secuencia de los nucleótidos 1-2169 de la SEC ID Nº: 1; (c) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada y que codifica polipéptidos SVPH1-8; y (d) ADN que está degenerado como resultado del código genético en un ADN definido en (a), (b) o (c) y que codifica polipéptidos SVPH1-8. La invención abarca polipéptidos SVPH1-8 codificados por dichas secuencias equivalentes de ADN.

El ADN que es equivalente a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1 hibridará en condiciones moderadamente rigurosas con la secuencia de ADN nativo bicatenario que codifica polipéptidos que comprenden secuencias de los aminoácidos 1-722 de la SEC ID Nº 2. Los ejemplos de polipéptidos SVPH1-8 codificados por dicho ADN, incluyen, aunque sin limitación fragmentos de polipéptido SVPH1-8 y polipéptidos SVPH1-8 que comprenden un sitio o sitios de N-glicosilación inactivados, un sitio o sitios de procesamiento con proteasa inactivados, o una sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas, como se ha descrito anteriormente. Los polipéptidos SVPH1-8 codificados por ADN obtenido de otras especies de mamíferos, en las que el ADN hibridará con el complemento del ADN de la SEC ID Nº 1 también se abarcan.

Las proteínas de unión a polipéptido SVPH1-8, tales como los anticuerpos anti-polipéptido SVPH1-8 de la invención, pueden unirse a una fase sólida tal como una matriz de columna de cromatografía o un sustrato similar adecuado para identificar, separar, o purificar células que expresan polipéptidos SVPH1-8 en su superficie. Por ejemplo, la expresión de SVPH1-8 en los testículos indica que se podrían usar anticuerpos anti-polipéptido SVPH1-8 para identificar, separar, o purificar células testiculares usando técnicas convencionales. La adherencia de las proteínas de unión a polipéptido SVPH1-8 a una superficie de contacto de una fase sólida puede realizarse por cualquier medio, por ejemplo, se pueden recubrir microesferas magnéticas con proteínas de unión a polipéptido SVPH1-8 y mantenerlas en el vaso de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células se ponen en contacto con fase sólida que tiene proteínas de unión a polipéptidos SVPH1-8 en su interior. Las células que tienen polipéptidos SVPH1-8 en su superficie se unen a las proteínas de unión a polipéptido SVPH1-8 fijadas y las células no unidas se retiran por lavado. Este método de unión por afinidad es útil para purificar, seleccionar o separar dichas células que expresan polipéptidos SVPH1-8 de la solución. Los métodos para liberar células seleccionadas de forma positiva de la fase sólida se conocen en la técnica y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Dichas enzimas son preferiblemente no tóxicas y no dañinas para las células y se dirigen preferiblemente para escindir la pareja de unión de la superficie celular.

Como alternativa, mezclas de células que se sospecha que contienen células que expresan polipéptido SVPH1-8 pueden incubarse primero con una proteína de unión a polipéptido SVPH1-8 biotinilada. Los periodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar la unión suficiente a polipéptidos SVPH1-8. La mezcla resultante se pasa después a través de una columna compactada con perlas recubiertas con avidina, en la que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión a las perlas de las células de unión a polipéptido SVPH1-8. El uso de perlas recubiertas con avidina se conoce en la técnica. Véase Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realiza usando métodos convencionales.

En los métodos descritos anteriormente, las proteínas de unión a polipéptido SVPH1-8 adecuadas son anticuerpos anti-polipéptido SVPH1-8, y otras proteínas que son capaces de unirse con alta afinidad a polipéptidos SVPH1-8. Una proteína de unión a polipéptido SVPH1-8 preferida es un anticuerpo monoclonal anti-polipéptido SVPH1-8.

Los polipéptidos SVPH1-8 pueden existir en forma de oligómeros, tales como dímeros o trímeros unidos covalentemente o no covalentemente. Los oligómeros pueden unirse por enlaces disulfuro formados entre restos de cisteína en diferentes polipéptidos SVPH1-8. En una realización de la invención, se crea un dímero de polipéptido SVPH1-8 fusionando polipéptidos SVPH1-8 a la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG1) de manera que no impida la actividad biológica de los polipéptidos SVPH1-8. El polipéptido Fc se fusiona preferiblemente al extremo C de un polipéptido SVPH1-8 soluble (que comprende sólo el dominio extracelular). La preparación general de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos obtenidos de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Birn et al. (Nature 344:677, 1990), incorporada por la presente como referencia. Una fusión de genes que codifica la proteína de fusión polipéptido SVPH1-8:Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. A las proteínas de fusión polipéptido SVPH1-8:Fc se les permite ensamblarse de forma muy parecida a moléculas de anticuerpo, mediante lo cual forman enlaces disulfuro entre polipéptidos Fc, produciendo polipéptidos SVPH1-8 divalentes. Si las proteínas de fusión se preparan tanto con cadenas pesadas como con ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero de polipéptido SVPH1-8 con tantas como cuatro regiones extracelulares de polipéptido SVPH1-8. Como alternativa, se pueden unir dos dominios de polipéptido SVPH1-8 solubles con un enlazador de péptidos.

Los vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica polipéptidos SVPH1-8 puede preparase usando métodos bien conocidos. Los vectores de expresión incluyen una secuencia de ADN de SVPH1-8 unida de manera operativa a secuencias de nucleótidos reguladoras de la transcripción o la traducción adecuadas, tales como las obtenidas de un gen de mamífero, microbiano, viral, o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, o potenciadores, un sitio de unión a ARNm ribosómico y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están "unidas de manera operativa" cuando la secuencia reguladora se refiere de forma funcional a la secuencia de ADN de SVPH1-8. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está unida de manera operativa a una secuencia de ADN de SVPH1-8 si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN de SVPH1-8. La capacidad de replicarse en las células hospedadoras deseadas, habitualmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección por el que se identifican los transformantes puede incorporarse adicionalmente en el vector de expresión.

Además, pueden incorporarse secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no están asociados de forma natural con polipéptidos SVPH1-8 en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de ADN para un péptido señal (líder de secreción) puede fusionarse en fase a la secuencia de nucleótidos de SVPH1-8 de modo que el polipéptido SVPH1-8 se traduce inicialmente como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células hospedadoras deseadas potencia la secreción extracelular del polipéptido SVPH1-8. El péptido señal puede escindirse del polipéptido SVPH1-8 después de la secreción del polipéptido SVPH1-8 de la célula.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos SVPH1-8 incluyen células procariotas, levaduras, o de eucariotas superiores. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y de mamífero se describen, por ejemplo, en Powels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). Se podrían emplear también sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos SVPH1-8 usando ARN obtenidos de construcciones de ADN descritas en este documento.

Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células hospedadoras procariotas adecuadas para transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies diferentes en los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula hospedadora procariota, tal como E. coli, un polipéptido SVPH1-8 puede incluir un resto de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariota. La Met N-terminal puede escindirse del polipéptido SVPH1-8 recombinante expresado.

Los vectores de expresión para su uso en células hospedadoras procariotas comprenden generalmente uno o más genes marcadores de selección fenotípica. Un gen marcador de selección fenotípica es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que satisface un requisito autótrofo. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células hospedadoras procariotas incluyen los obtenidos de plásmidos disponibles en el mercado tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y por lo tanto proporciona medios sencillos para identificar células transformadas. Para construir un vector de expresión usando pBR322, se insertan un promotor apropiado y una secuencia de ADN de SVPH1-8 en el vector pBR322. Otros vectores disponibles en el mercado incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos). Otros vectores disponibles en el mercado incluyen los que se diseñan específicamente para la expresión de proteínas; estos incluirían vectores pMAL-p2 y pMal-c2 que se usan para la expresión de proteínas fusionadas a la proteína de unión a maltosa (New England Biolabs, Beverly, MA, Estados Unidos)

Las secuencias promotoras comúnmente usadas para vectores de expresión en células hospedadoras procariotas incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y PE-A-36776), y promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, página 412, 1982). Un sistema de expresión en células hospedadoras procariotas particularmente útil emplea un promotor del fago \lambda P_{L} y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la American Type Culture Collection, que incorporan derivados de promotor \lambda P_{L}, incluyen el plásmido pHUB2 (residente en cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

El ADN de SVPH1-8 puede clonarse en fase en los múltiples sitios de clonación de un vector de expresión bacteriano habitual. Idealmente el vector contendría un promotor inducible cadena arriba del sitio de clonación, de modo que la adición de un inductor conduzca a producción de alto nivel de la proteína recombinante en un tiempo que elija el investigador. Para algunas proteínas, los niveles de expresión se pueden reforzar por incorporación de codones que codifican un compañero de fusión (tal como hexahistidina) entre el promotor y el gen de interés. El "plásmido de expresión" resultante puede propagarse en una diversidad de cepas de E. coli.

Para la expresión de la proteína recombinante, las células bacterianas se propagan en medio de crecimiento hasta alcanzar una densidad óptica pre-determinada. La expresión de la proteína recombinante se induce después, por ejemplo por adición de IPTG (isopropil-b-D-tiogalactopiranósido), que activa la expresión de proteínas a partir de plásmidos que contienen un operador/promotor lac. Después de la inducción (típicamente durante 1-4 horas), las células se recogen sedimentando en una centrífuga, por ejemplo a 5.000 x G durante 20 minutos a 4ºC.

Para recuperar la proteína expresada, las células sedimentadas se pueden resuspender en diez volúmenes de Tris-HCl 50 mM (pH 8)/NaCl 1 M y después pasarse dos o tres veces a través de una prensa French. La mayoría de las proteínas recombinantes altamente expresadas forman agregados insolubles conocidos como cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión pueden purificarse de las proteínas solubles sedimentando en una centrífuga a 5.000 x G durante 20 minutos, 4ºC. El sedimento de cuerpos de inclusión se lava con Tris-HCl 50 mM (pH 8)/Triton X-100 al 1% y después se disuelve en Tris-HCl 50 mM (pH 8)/urea 8 M/DDT 0,1 M. Cualquier material que no pueda disolverse se elimina por centrifugación (10.000 x G durante 20 minutos, 20ºC). La proteína de interés será, en la mayoría de los casos, la proteína más abundante en el sobrenadante aclarado resultante. Esta proteína se puede "replegar" en la conformación activa por diálisis frente a Tris-HCl 50 mM (pH 8)/CaCl 5 mM/Zn(OAc) 5 mM/GSSG 1 mM/GSH 0,1 mM. Después de replegarse, se puede realizar la purificación por una diversidad de métodos cromatográficos tales como intercambio iónico o filtración en gel. En algunos protocolos, la purificación inicial puede realizarse antes del replegado. Como ejemplo, pueden purificarse proteínas de fusión marcadas con hexahistidina parcialmente en Níquel inmovilizado.

Aunque el proceso de purificación y replegado precedente asume que la proteína se recupera mejor a partir de cuerpos de inclusión, los especialistas en la técnica de purificación de proteínas apreciarán que muchas proteínas recombinantes se purifican mejor desde la fracción soluble de lisados celulares. En estos casos, a menudo no es necesario el replegado, y la purificación se puede realizar directamente por métodos cromatográficos convencionales.

Los polipéptidos SVPH1-8 pueden expresarse de forma alternativa en células hospedadores de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levaduras, tales como Pichia, K. lactis, o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2\mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, y un gen marcador de selección. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levaduras incluyen, entre otros, promotores para matalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980), u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991); y van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Otra alternativa es el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Los vectores lanzadera replicables tanto en levaduras como en E. coli pueden construirse insertando secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levaduras descritos anteriormente.

La secuencia líder del factor-\alpha de levaduras puede emplearse para dirigir la secreción de un polipéptido SVPH1-8. La secuencia líder del factor-\alpha se inserta a menudo entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US 81:5330, 1984; Patente de Estados Unidos 4.546.082; y documento EP 324.274. Los especialistas en la técnica conocen otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes a partir de levaduras hospedadoras. Una secuencia líder se puede modificar cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los especialistas en la técnica conocen los protocolos de transformación de levaduras. Uno de dichos protocolos se describe en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo está compuesto por base nitrogenada de levadura al 0,67%, ácidos casamino al 0,5%, glucosa al 2%, 10 \mug/ml de adenina, y 20 \mug/ml de uracilo.

Las células hospedadoras de levadura transformadas por vectores que contienen la secuencia promotora de ADH2 pueden hacerse crecer para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de medio rico es uno compuesto por extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al 1% suplementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La falta de represión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio.

Los sistemas de cultivo de células hospedadoras de mamífero o insecto pueden también emplearse para expresar polipéptidos SVPH1-8 recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se revisan por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen mamífero. Ejemplos de líneas adecuadas de células hospedadoras de mamífero incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hamster chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) obtenida de la línea celular CVI de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan et al. (EMBO J. 10:2821,
1991).

Se han descrito métodos establecidos para introducir ADN en células de mamífero (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, páginas 15-69). Los protocolos adicionales que usan reactivos disponibles en el mercado, tales como Lipofectamina (Gibco/BRL) o Lipofectamina-Plus, pueden usarse para transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987). Adicionalmente, puede usarse electroporación para transfectar células de mamífero usando procedimientos convencionales, tales como los de Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La selección de transformantes estables se puede realizar usando la resistencia a fármacos citotóxicos como método de selección. Kaufman et al., Meth. In Enzymology 185:487-511, 1990, describe varios programas de selección, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa hospedadora adecuada para selección por DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). Un plásmido que expresa el ADNc de DHFR puede introducirse en la cepa DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores de selección que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen ADNc que confieren resistencia a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que albergan el vector pueden seleccionarse en base a la resistencia a estos compuestos.

Las secuencias de control transcipcional y traduccional para vectores de expresión de células hospedadoras de mamífero pueden extirparse de los genomas virales. Las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras comúnmente usadas se obtienen de poliomavirus, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN obtenidas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotores temprano y tardío, sitios de potenciación, de corte y empalme y de poliadenilación pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de genes estructurales en una célula hospedadora de mamífero. Los promotores temprano y tardío virales son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral en forma de fragmento, que puede también contener un origen viral de replicación (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). Se pueden usar también fragmentos de SV40 más grandes o más pequeños, dado que se incluye la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio Bgl I localizado en el origen viral de SV40 del sitio de replicación.

Las secuencias de control adicionales que mostraron mejorar la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión en mamíferos incluyen elementos tales como el elemento secuencia que aumenta la expresión de la (EASE) obtenido de células CHO (Morris et al., Animal Cell Technology, 1977, páginas 529-534) y el líder tripartito (TPL) y ARN del gen VA de adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982). Las secuencia de sitio interno de entrada de ribosomas (IRES) de origen viral permiten a los ARNm dicistrónicos se traduzcan de forma eficaz (Oh y Sarnow, Current Opinión in Genetics and Developement 3:295-300, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24:2697-2700, 1996). La expresión de un ADNc heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguida por el gen para un marcador de selección (por ejemplo DHFR) ha demostrado mejorar la transfectabilidad del hospedador y la expresión del ADNc heterólogo (Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). Vectores de expresión ejemplares que emplean ARNm dicistrónicos son pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques 22:150-161, 1997, y p2A5I descrito por Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, páginas 529-534.

Un vector útil de alta expresión, pCAVNOT, se ha descrito por Mosley et al., Cell 59:335-348, 1989. Otros vectores de expresión para su uso en células hospedadoras de mamífero pueden construirse como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para expresión de alto nivel estable de ADNc de mamíferos en células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse sustancialmente como se describe por Cosman et al., (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. Se describen vectores adicionales de expresión útiles en mamíferos en el documento EP-A-0367566, y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, incorporada como referencia en este documento. Los vectores pueden obtenerse a partir de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa, se puede añadir una secuencia señal heteróloga, tal como la secuencia señal para IL-7 descrita en la Patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de IL-2 descrita en Cosman et al., Nature 312:768 (1984); el péptido señal de IL-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor tipo I de IL-1 descrito en la Patente de Estados Unidos 4.968.607; y el péptido señal del receptor tipo H de IL-1 descrito en el documento EP 460.846.

Un marcador de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 aislado y purificado de acuerdo con la invención puede producirse por sistemas de expresión recombinante como se ha descrito anteriormente o purificarse de células de origen natural. Los polipéptidos SVPH1-8 pueden purificarse adecuadamente, como se indica por una sola banda de proteína después de análisis por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Un proceso para producir polipéptidos SVPH1-8 comprende cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido SVPH1-8 en condiciones suficientes para promover la expresión del polipéptido SVPH1-8. El polipéptido SVPH1-8 se recupera después del medio de cultivo o de extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como sabe el especialista en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células hospedadoras empleadas y si la proteína recombinante se secreta o no en el medio de cultivo. Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo primero puede concentrarse usando un filtro de concentración de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltrado Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren grupos sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo u otros grupos alifáticos colgantes), para purificar adicionalmente polipéptidos SVPH1-8. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones se conocen bien y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y purificada.

Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de unión a un polipéptido SVPH1-8, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos SVPH1-8, para purificar por afinidad polipéptidos SVPH1-8 expresados. Los polipéptidos SVPH1-8 pueden retirarse de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución de alto contenido salino y después se dializa en un tampón de bajo contenido salino para su uso o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada.

La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano se aisla usualmente por alteración inicial de las células hospedadoras, centrifugación, extracción de los sedimentos celulares si es un polipéptido insoluble, o del fluido sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguida de una o más etapas de concentración, eliminación de sales, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía por exclusión de tamaño. Finalmente, puede emplearse RP-HPLC para las etapas de purificación finales. Las células microbianas pueden alterarse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o uso de agentes de lisis celular.

Las células hospedadoras de levaduras transformadas se emplean preferiblemente para expresar polipéptidos
SVPH1-8 en forma de polipéptido secretado para simplificar la purificación. Los polipéptidos recombinantes secretados a parir de una fermentación de célula hospedadora de levaduras pueden purificarse por métodos análogos a los descritos por Urdal et al., (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. describen dos etapas de HPLC en fase inversa secuenciales para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Los marcadores de peso molecular de polipéptido SVPH1-8 pueden analizarse por métodos incluyendo sedimentación, electroforesis en gel, cromatografía y espectrometría de masas. Los polipéptidos SVPH1-8 pueden servir de marcadores de peso molecular usando dichas técnicas de análisis para ayudar en la determinación del peso molecular de una proteína muestra. Una determinación del peso molecular de la proteína muestra ayuda en la identificación de la proteína muestra.

Los polipéptidos SVPH1-8 pueden someterse a fragmentación en péptidos por medios químicos y enzimáticos. La fragmentación química incluye el uso de bromuro de cianógeno para escindir en condiciones neutras o ácidas tales que esta escisión específica se produce en restos de metionina (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255, 1967). Esto puede además incluir etapas adicionales, tales como una etapa de carboximetilación para convertir restos de cisteína en especies no reactivas. La fragmentación enzimática incluye el uso de una proteasa tal como una Asparaginilendopeptidasa, Arginilendopeptidasa, proteasa I de Achromobacter, tripsina, proteasa V8 de Staphylococcus aureus, Endoproteinasa Asp-N, o Endoproteinasa Lys-C en condiciones convencionales para dar como resultado la escisión en restos de aminoácidos específicos. La Asparaginilendopeptidasa puede escindir de forma específica en el extremo carboxilo de los restos de arginina presentes en los polipéptidos SVPH1-8. La proteasa I de Achromobacter puede escindir de forma específica en el extremo carboxilo de los restos de lisina presentes en los polipéptidos SVPH1-8 (Sakiyama y Nakata, Patente de Estados Unidos Nº 5.248.599; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T. Masaki et al., Biocim. Biophys Acta 660:51-55, 1981). La tripsina puede escindir de forma específica en el extremo carboxilo de los restos de arginina y lisina presentes en los polipéptidos SVPH1-8. La proteasa V8 de Staphylococcus aureus puede escindir de forma específica en el extremo carboxilo de los restos de ácido aspártico y glutámico presentes en los polipéptidos SVPH1-8 (D. W. Cleveland, J. Biol. Chem. 3:1102-1106, 1977). La endoproteinasa Asp-N puede escindir de forma específica en el extremo amino de los restos asparagina presentes en los polipéptidos SVPH1-8. La endoproteinasa Lys-C puede escindir de forma específica en el extremo carboxilo de los restos lisina presentes en los polipéptidos SVPH1-8. Otros tratamientos enzimáticos y químicos pueden usarse de igual forma para fragmentar de forma específica polipéptidos SVPH1-8 en un único conjunto de marcadores de peso molecular de péptido
específico.

Los péptidos fragmentados resultantes pueden analizarse por métodos que incluyen sedimentación, electroforesis, cromatografía, y espectrometría de masas. Los péptidos fragmentados obtenidos de polipéptidos SVPH1-8 pueden servir como marcadores de peso molecular usando dichas técnicas de análisis para ayudar en la determinación del peso molecular de una proteína muestra. Dicha determinación del peso molecular ayuda en la identificación de la proteína muestra. Los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado son preferiblemente de un tamaño entre 10 y 721 aminoácidos. Más preferiblemente, los marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado son de un tamaño entre 10 y 100 aminoácidos. Incluso son más preferibles marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado de tamaño entre 10 y 50 aminoácidos y especialmente de tamaño entre 10 y 35 aminoácidos. Los más preferibles son marcadores de peso molecular de péptido SVPH1-8 fragmentado de tamaño entre 10 y 20 aminoácidos.

Además, los análisis de la fragmentación progresiva de polipéptidos SVPH1-8 en péptidos específicos (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977), tales como alterando el tiempo y la temperatura de la reacción de fragmentación, puede usarse como control para la extensión de la escisión de una proteína muestra. Por ejemplo, la escisión de la misma cantidad de polipéptido SVPH1-8 y proteína muestra en idénticas condiciones puede permitir una comparación directa de la extensión de la fragmentación. Las condiciones que dan como resultado la completa fragmentación del polipéptido SVPH1-8 pueden dar como resultado también la completa fragmentación de la proteína muestra.

Además, los polipéptidos SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos poseen características de carga únicas y, por lo tanto, pueden servir como marcadores específicos para ayudar en la determinación del punto isoeléctrico de una proteína muestra o un péptido fragmentado usando técnicas tales como enfoque isoeléctrico. La técnica de enfoque isoeléctrico puede además combinarse con otras técnicas tales como electroforesis en gel para separar una proteína de forma simultánea en base a peso molecular y carga. Un ejemplo de dicha combinación es el de electroforesis bi-dimensional (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisims 76-77 (Prentice Hall, 6ª ed. 1991)). Los polipéptidos SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos pueden usarse en dichos análisis como marcadores para ayudar en la determinación tanto del punto isoeléctrico como del peso molecular de una proteína muestra o péptido fragmentado.

Los kits para ayudar en la determinación del peso molecular aparente y punto isoeléctrico de una proteína muestra pueden reunirse a partir de polipéptidos SVPH1-8 y péptidos fragmentados de los mismos. Los kits también sirven para evaluar el grado de fragmentación de una proteína muestra. Los constituyentes de dichos kits pueden variarse, pero típicamente contienen polipéptidos SVPH1-8 y marcadores de peso molecular de péptido fragmentado. Además, dichos kits pueden contener polipéptidos SVPH1-8 en los que se ha retirado un sitio necesario para la fragmentación. Además, los kits pueden contener reactivos para la escisión específica de SVPH1-8 y la proteína muestra por escisión química o enzimática. Los kits pueden contener además anticuerpos dirigidos contra polipéptidos SVPH1-8 o fragmentos de los mismos.

Pueden hacerse de acuerdo con la invención oligonucleótidos antisentido o con sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una única cadena (ARN o ADN) capaz de unirse a una secuencia de ARNm SVPH1-8 diana (formando una triple hélice). Los oligonucleótidos antisentido o con sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante de ADNc de SVPH1-8 (SEC ID Nº 1). Dicho fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótido antisentido o con sentido, en base a una secuencia de ADNc para una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48:26559, 1988 y van der Krol et al., Biotechniques 6:958, 1988.

La unión de los oligonucleótidos antisentido o con sentido a secuencias de ácido nucleico diana da como resultado la formación de complejos que bloquean la traducción (ARN) o la transcripción (ADN) por uno de varios medios, incluyendo la degradación potenciada de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o la traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido por tanto pueden usarse para bloquear la expresión de polipéptidos SVPH1-8. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido además comprenden oligonucleótidos que tienen estructuras azúcar-fosfodiester modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como los descritos en el documento WO91/06629) y en los que dichos enlaces azúcar son resistentes a nucleasa endógena. Dichos oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática), pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a secuencias de nucleótidos diana. Otros ejemplos de oligonucleótidos con sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que están unidos covalentemente con restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otras restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico diana, tal como poli-(L-lisina). Más aún, agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes de complejos metálicos pueden unirse a los oligonucleótidos con sentido o antisentido para modificar
las características de unión del oligonucleótido antisentido o con sentido para la secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos antisentido o con sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o usando vectores de transferencia de genes tales como un virus Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido se introducen preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana por inserción del oligonucleótido antisentido o con sentido en un vector retroviral adecuado, después poniendo en contacto la célula con el vector retroviral que contiene la secuencia insertada, in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, aunque sin limitación, el retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus obtenido de M-MuLV), o los vectores de doble copia denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase solicitud PCT US 90/02656).

Los oligonucleótidos con sentido o antisentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana por formación de un conjugado con una molécula de unión a un ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión a un ligando adecuadas incluyen, aunque sin limitación, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no impide sustancialmente la capacidad de la molécula de unión al ligando de unirse a su correspondiente molécula o receptor, o de bloquear la entrada del oligonucleótido con sentido o antisentido o de su versión conjugada en la célula.

Como alternativa, un oligonucleótido con sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia diana de ácido nucleico por formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido con sentido o antisentido-lípido se disocia preferiblemente en la célula por una lipasa endógena.

Los polipéptidos SVPH1-8 aislados y purificados o un fragmento de los mismos pueden ellos mismos ser útiles como un agente terapéutico en la inhibición de la señalización de IL-1 y TNF. Los polipéptidos SVPH1-8 se introducen en el ambiente intracelular por medios bien conocidos, tales como encerrando la proteína en liposomas o acoplándola con un anticuerpo monoclonal dirigido a un tipo celular específico.

El ADN de SVPH1-8, los polipéptidos SVPH1-8, y los anticuerpos contra polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse como reactivos en una diversidad de protocolos de investigación. Una muestra de dichos protocolos de investigación se da en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).

Por ejemplo, estos reactivos pueden servir como marcadores para expresiones de ARN o proteínas en células o tejidos específicos. La expresión de ARN de SVPH1-8 sólo en testículos indica que la expresión de ARN de SVPH1-8 y polipéptidos en líneas celulares obtenidas en testículos o en tejidos testiculares puede detectarse directamente con los reactivos de la invención. Por lo tanto, estos reactivos pueden usarse como marcadores para expresión específica de células o tejidos. Dichos marcadores pueden usarse en la detección y purificación de tipos celulares específicos y en el análisis de diversas enfermedades asociadas con los testículos (Schmoll et al., Semin Oncol 25:174-185, 1998. Wahren et al., J. Natl. Cancer Inst 58:489-98; 1977; Beckstead, J.H., Am J. Surg Pathol 7:341-9, 1983; Burke et al., Mod Pathol 1:475-479, 1988; Rajpert-De Meyts et al., Int J. Androl 17:85-92, 1994; Mead et al., J. Clin Oncol 10:85-94, 1992). En una realización, la identificación de células testiculares en biopsias testiculares por los reactivos de la invención puede facilitar la detección y prognosis de cánceres testiculares. Por ejemplo, las células de los testículos pueden detectarse usando sondas de ácido nucleico de SVPH1-8 usando técnicas convencionales incluyendo transferencias de Northern e hibridación in situ de ARN (revisada en Jin et al., J. Clin Lab Anal 11:2-9, 1997; McNicol et al, J Pathol 182: 250-261, 1997; Luke et al., Cell Vis 5:49-53, 1998). Se entiende, por supuesto, que pueden usarse muchas técnicas diferentes para la identificación y purificación de células que expresan SVPH1-8 y que esta realización no limita de ninguna manera el alcance de la invención.

De forma similar, estos reactivos pueden usarse para investigar la expresión constitutiva y transitoria de ARN o polipéptidos SVPH1-8. El ADN de SVPH1-8 puede usarse para determinar la localización cromosómica del ADN de SVPH1-8 y para mapear genes en relación con esta localización cromosómica. El ADN de SVPH1-8 puede usarse también para examinar la heterogeneidad genética y la heredabilidad a través del uso de técnicas tales como huella genética, así como para identificar riesgos asociados con trastornos genéticos. El ADN de SVPH1-8 puede usarse además para identificar genes adicionales relacionados con ADN de SVPH1-8 y para estableces árboles evolutivos en base a las comparaciones de secuencias. El ADN y los polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse para seleccionar esos genes o proteínas que son homólogos a ADN y a polipéptidos SVPH1-8, a través de procedimientos de exploración positiva tales como transferencia de Southern o inmunotransferencia y a través de procesos de exploración negativa tales como sustracción.

La proteinasa SVPH1-8 puede usarse como reactivo en análisis con otras proteinasas para comparar la especificidad del sustrato y la actividad de las proteinasas. Se pueden generar proteinasas quiméricas cambiando fragmentos de proteinasa SVPH1-8 con otras proteinasas. Dichas proteinasas quiméricas pueden analizarse con respecto a la actividad y especificidad alteradas.

La actividad proteinasa de SVPH1-8 puede usarse como un aditivo detergente para la retirada de tinciones que tienen un componente proteico, similar al uso de proteasas descrito en Patente de Estados Unidos Nº 5.599.400 y Patente de Estados Unidos Nº 5.650.315. La composición detergente puede contener otros constituyentes detergentes conocidos, tales como tensioactivos, potenciadotes de espuma, cargas, estabilizadores de enzimas blanqueantes con cloro, otras enzimas proteolíticas, bactericidas, tintes, perfumes, diluyentes, disolventes, y otros ingredientes convencionales. La composición detergente preferiblemente comprende entre el 0,001% al 10% de proteinasa SVPH1-8. La proteinasa SVPH1-8 puede incluirse en una composición detergente o puede combinarse con otros constituyentes en el momento del uso como aditivo. El detergente aditivo puede formularse en forma de líquido, polvo, granulado, suspensión u otra forma convencional de aditivo detergente.

Los polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse también como un reactivo para identificar (a) cualquier proteína que regula el polipéptido SVPH1-8, y (b) otras proteínas con que puede interactuar. Los polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse uniendo una proteína recombinante a una matriz de afinidad, o usándolos como cebo en el sistema doble-híbrido.

Cuando se usa como agentes terapéuticos, los polipéptidos SVPH1-8 pueden formularse en composiciones farmacéuticas de acuerdo con métodos conocidos. Los polipéptidos SVPH1-8 pueden combinarse en una mezcla, con el material activo en exclusividad o con otros materiales activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente activos (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (por ejemplo, Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos. Vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co. Además, dichas composiciones pueden contener polipéptidos SVPH1-8 complejados con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o incorporarse en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo, y tasa de aclarado in vivo de los polipéptidos SVPH1-8.

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En un aspecto de la invención los polipéptidos SVPH1-8 y péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de SVPH1-8, pueden utilizarse para preparar anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos SVPH1-8. El término "anticuerpos" se supone que incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos tales como F(ab')2, y fragmentos de Fab, así como cualquier compañero de unión producido de forma recombinante. Los anticuerpos se definen de unión específica si se unen a polipéptidos SVPH1-8 con un K_{a} mayor o igual a aproximadamente 10^{7} M^{-1}. Las afinidades de los compañeros de unión o anticuerpos pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949).

Los anticuerpos policlonales pueden generarse fácilmente a partir de varias fuentes, por ejemplo, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, o ratas usando procedimientos que se conocen bien en la técnica. En general, los polipéptidos SVPH1-8 purificados o un péptido basado en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos SVPH1-8 que esté conjugado de forma apropiada, se administra al animal hospedador típicamente a través de inyección parenteral. La inmunogenicidad de los polipéptidos SVPH1-8 puede potenciarse a través del uso de un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de inmunizaciones de refuerzo, se recogen pequeñas muestras de suero y se ensayan para reactividad a polipéptidos SVPH1-8. Los ejemplos de diversos ensayos útiles para dicha determinación incluyen los descritos en: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; así como procedimientos tales como inmunoelectroforesis contracorriente (CIEP), radioinmunoensayo, radio-inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos dot blot, y ensayos tipo sándwich, véanse Patentes de Estados Unidos Nº 4.376.110 y 4.486.530.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse fácilmente usando procedimientos bien conocidos, véanse por ejemplo, los procedimientos descritos en Patentes de Estados Unidos Nº RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439, y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds), 1980. En resumen, a los animales hospedadores, tales como ratones se les inyecta por vía intraperitoneal al menos una vez, y preferiblemente al menos dos a intervalos de aproximadamente 3 semanas, polipéptidos SVPH1-8 aislados y purificados o polipéptidos SVPH1-8 conjugados, opcionalmente en presencia de un adyuvante. Los sueros de ratón se ensayan después por técnica dot blot convencional o captura de anticuerpo (ABC) para determinar qué animal es mejor para fusionar. Aproximadamente dos o tres semanas después, a los ratones se les da un refuerzo intravenoso de polipéptidos SVPH1-8 o polipéptidos SVPH1-8 conjugados. Después se sacrifican los ratones y las células esplénicas se fusionan con células de mieloma disponibles en el mercado, tales como Ag8.653 (ATCC), siguiendo protocolos establecidos. En resumen, las células de mieloma se lavan varias veces en medios y se fusionan con células esplénicas de ratón en una proporción de tres células esplénicas a una célula de mieloma. El agente de fusión puede ser cualquier agente adecuado usado en la técnica, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). La fusión se deposita en placas que contienen medios que permiten el crecimiento selectivo de las células fusionadas. Las células fusionadas pueden dejarse crecer durante aproximadamente ocho días. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se recogen y se añaden a una placa que se recubrió primero con Ig de cabra anti-ratón. Después de los lavados se añade un marcador, tal como, polipéptidos ^{125}I-SVPH1-8 a cada pocillo seguido por incubación. Los pocillos positivos pueden detectarse posteriormente por autorradiografía. Los clones positivos pueden hacer crecer en cultivo en masa y los sobrenadantes se purifican posteriormente en una columna de Proteína A (Pharmacia).

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden producirse usando técnicas alternativas, tales como las descritas por Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990), que se incorpora en este documento como referencia. De forma similar, las parejas de unión pueden construirse usando técnicas de ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo de unión específica. Dicha técnica se describe en Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989).

Otros tipos de "anticuerpos" pueden producirse usando la información proporcionada en este documento junto con el grado de conocimiento en la técnica. Por ejemplo, la invención también abarca anticuerpos que se han diseñado para contener elementos de anticuerpos humanos que son capaces de unirse específicamente a polipéptidos SVPH1-8.

Una vez aislados y purificados, los anticuerpos contra polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse para detectar la presencia de polipéptidos SVPH1-8 en una muestra usando protocolos de ensayo establecidos. Por ejemplo, los anticuerpos contra polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse para detectar o purificar células que expresan SVPH1-8, tales como células de testículos, por técnicas convencionales. Además, los anticuerpos de la invención pueden usarse terapéuticamente para unirse a polipéptidos SVPH1-8 e inhibir su actividad in vivo.

Los polipéptidos SVPH1-8 de acuerdo con la invención facilitarán el descubrimiento de inhibidores de polipéptidos SVPH1-8. El uso de un polipéptido SVPH1-8 purificado en la selección de inhibidores potenciales de los mismos es importante y puede eliminar o reducir la posibilidad de reacciones con contaminantes que interfieran.

Además, los polipéptidos SVPH1-8 pueden usarse para el diseño basado en estructura de inhibidores de polipéptidos SVPH1-8. Dicho diseño basado en estructura también se conoce como "diseño racional del fármaco". Los polipéptidos SVPH1-8 pueden analizarse de forma tridimensional por, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear o formación de modelos por homología, todos los cuales son métodos bien conocidos. La invención también abarca el uso de la información estructural del polipéptido SVPH1-8 en sistemas de software de formación de modelos moleculares para ayudar en el diseño de inhibidor y en la interacción inhibidor-polipéptido SVPH1-8. Dicha formación de modelos y diseño de fármacos ayudada por ordenador puede utilizar información tal como análisis de la conformación química, potencial electrostático de las moléculas, plegamiento de las proteínas, etc. Por ejemplo, la mayoría del diseño de inhibidores específicos de clase de metaloproteasas se ha centrado en intentos de quelar o unir el átomo de cinc catalítico. Los inhibidores sintéticos se diseñan usualmente para contener una mezcla cargada negativamente a la que se unen un conjunto de grupos diferentes diseñados para encajar en los bolsillos específicos de la proteasa particular. Un método particular de la invención comprende analizar la estructura tridimensional de los polipéptidos SVPH1-8 para posibles sitios de unión a sustratos, sintetizar una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo previsible, y ensayar la nueva molécula como se ha descrito anteriormente.

La memoria descriptiva se entiende más completamente a la luz de lo expuesto en las referencias citadas en la memoria descriptiva. Las realizaciones en la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de realizaciones de la invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. El especialista en la técnica reconoce que la invención reivindicada abarca muchas otras realizaciones.

<110> Cerretti, Douglas P.

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<120> ADN y Polipéptidos SVPH1-8

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<130> 03260.0050-00304

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<140>

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<141>

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<150> 60/071.505

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<151> 14-01-1998

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2169

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 722

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

4

5

6

7

Claims

1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo compuesto por:

(a) la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1;

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos 595-1191 de SEC ID Nº 1;

(d) una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 199-137 de la SEC ID Nº 2;

(e) una molécula de ácido nucleico que hibrida con cualquier cadena de un ADN bicatenario desnaturalizado que comprende el ácido nucleico de (a), (b), (c), o (d) en condiciones de rigurosidad moderada en formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado de 60ºC, 0,5XSSC, SDS al 0,1%, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos que tienen al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y que tiene actividad proteinasa; y

2. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Un polipéptido aislado codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

4. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 3 que tiene un peso molecular de aproximadamente 81 kD según lo determinado por SDS-PAGE.

5. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polipéptido no está glicosilado.

6. Un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido de la reivindicación 3.

7. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. Una célula hospedadora transfectada o transducida con el vector de la reivindicación 2.

9. Un método para la producción de polipéptido SVPH1-8 que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 8 en condiciones que promueven la expresión de dicho polipéptido.

10. El método de la reivindicación 9, que además comprende recuperar el polipéptido.

11. Un método para detectar células de los testículos que comprende:

incubar células con una sonda que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1;

lavar dichas células para retirar la sonda no unida; y

detectar células a las que se unió dicha sonda.

12. Un método para detectar células de los testículos que comprende:

incubar células con un anticuerpo de la reivindicación 6;

lavar dichas células para retirar el anticuerpo no unido; y

detectar células a las que se unió dicho anticuerpo.

13. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por:

(a) aminoácidos 1-26 de la SEC ID Nº 2;

(b) aminoácidos 1-397 de la SEC ID Nº 2;

(c) aminoácidos 1-501 de la SEC ID Nº 2;

(d) aminoácidos 1-680 de la SEC ID Nº 2;

(e) aminoácidos 2-76 de la SEC ID Nº 2;

(f) aminoácidos 27-198 de la SEC ID Nº 2;

(g) aminoácidos 27-245 de la SEC ID Nº 2;

(h) aminoácidos 27-397 de la SEC ID Nº 2;

(i) aminoácidos 27-501 de la SEC ID Nº 2;

(j) aminoácidos 27-680 de la SEC ID Nº 2;

(k) aminoácidos 172-245 de la SEC ID Nº 2;

(l) aminoácidos 199-397 de la SEC ID Nº 2;

(m) aminoácidos 199-501 de la SEC ID Nº 2;

(n) aminoácidos 199-680 de la SEC ID Nº 2; y

(o) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 que tiene actividad proteinasa.

14. Un polipéptido aislado que tiene un 80% de identidad de aminoácidos con el polipéptido de la SEC ID Nº 2 y que tiene actividad proteasa.

15. Un polipéptido producido de acuerdo con el método de la reivindicación 9.

16. Un método para seleccionar inhibidores de actividad del polipéptido SVPH1-8 que comprende:

(A) poner en contacto una contra-estructura de SVPH1-8 con un polipéptido de la reivindicación 3 ó 15 en presencia y ausencia de un inhibidor de compuesto de ensayo, y

(B) comparar el nivel de complejos formados en presencia y ausencia de dicho compuesto de ensayo, en el que un nivel más bajo de complejos en presencia de dicha muestra de ensayo es indicativo de la presencia de un inhibidor en dicha muestra de ensayo.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicho método es un ensayo doble híbrido de levaduras.

18. Un método de diseño basado en la estructura de un inhibidor de SVPH1-8 que comprende:

a) determinar la estructura tridimensional de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 3, 13, ó 15; y

b) sintetizar un inhibidor de SVPH1-8.