ES2259114T3 - Anticuerpo monoclonal inhibidor contra la proteasa activadora del factor vii de coagulacion sanguinea. - Google Patents

Anticuerpo monoclonal inhibidor contra la proteasa activadora del factor vii de coagulacion sanguinea.

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ES2259114T3
ES2259114T3 ES03000857T ES03000857T ES2259114T3 ES 2259114 T3 ES2259114 T3 ES 2259114T3 ES 03000857 T ES03000857 T ES 03000857T ES 03000857 T ES03000857 T ES 03000857T ES 2259114 T3 ES2259114 T3 ES 2259114T3
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Abstract

Anticuerpo monoclonal contra FSAP, caracterizado porque inhibe la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea (FSAP), y su proenzima, mediante fijación específica a FSAP y a su proenzima.

Description

Anticuerpo monoclonal inhibidor contra la proteasa activadora del factor VII de coagulación sanguínea.
Objeto de la invención es un anticuerpo monoclonal que inhibe específicamente la proteasa activadora del Factor VII, o su proenzima, sin afectar, no obstante, a las propiedades proteolíticas de otras proteasas.
Se sabe que las proteasas desempeñan una función decisiva en el organismo sobre la liberación de enzimas activas a partir de sus precursores, las proenzimas. Adicionalmente, las proteasas tienen, no obstante, también la propiedad de volver a degradar enzimas activadas, de manera que éstas pierden nuevamente su efecto al cabo de un corto período de tiempo. Por lo tanto, para la elaboración de preparaciones farmacéuticas estabilizadas es necesario, a menudo, inhibir la actividad de proteasas especiales.
La estabilización contra la degradación provocada por proteasas representa, por consiguiente, una tarea importante también en preparados farmacéuticos que contienen factores de coagulación sanguínea, con el fin de garantizar también la eficacia de este tipo de preparados, en especial, después de un almacenamiento prolongado.
El sistema de coagulación sanguínea comprende dos vías de activación diferentes, en forma de cascada, de los factores de coagulación presentes en el plasma. En función del mecanismo desencadenante, se prefiere la vía endógena o la exógena para iniciar la coagulación.
En una lesión tisular, se expone en la superficie, como iniciador de la vía de coagulación exógena, la tromboplastina ("tissue factor", TF). Sobre la tromboplastina depositada en la membrana se fija el Factor de coagulación VII (FVII), al igual que FVII activado (FVIIa) circulante. Este complejo de TF-FVIIa conduce, en presencia de iones calcio y lípidos, a la fijación del FX, el cual se convierte en su forma activada (FXa) por proteólisis limitada. A través de la activación de protrombina en trombina, el FXa da lugar, por otra parte, a la formación de fibrina y, en último término, a la oclusión de la herida.
FVIIa se encuentra presente en muy reducidas concentraciones en el plasma del hombre sano. Hasta ahora, es poco lo que se conoce sobre la causa y origen del FVIIa que circula en sangre. Las trazas de tromboplastina, expresada o liberada en el transcurso de la degradación celular, podrían jugar un papel en este contexto.
En la memoria de publicación alemana 199 03 693 se da a conocer una proteasa activadora de FVII, que se designa también como FSAP (siglas alemanas de Proteasa Activadora del Factor Siete). Debido a esta propiedad, la FSAP puede acelerar la coagulación sanguínea y encontrar aplicación como producto farmacéutico en complicaciones de tipo hemorrágico.
La FSAP se presenta en el plasma sanguíneo en forma de proenzima (FSAP de cadena única, scFSAP en sus siglas en inglés). Mediante procedimientos cromatográficos conocidos, se puede obtener principalmente sólo la forma activada, de cadena doble, de la proteasa (FSAP de cadena doble, tcFSAP en sus siglas en inglés), dado que la proenzima se activa durante la preparación. Esta activación se puede producir por otras proteasas tales como la uroquinasa, pero también aparece de forma autocatalítica. La FSAP activada se puede auto-inactivar de forma proteolítica. Por esta razón, es especialmente difícil la preparación de scFSAP, si bien tampoco resulta sencilla la preparación de tcFSAP intacta. En las memorias de publicación alemanas 139 37 218 y 139 37 219 se han descrito procedimientos optimizados para la preparación de FSAP. En este sentido, un paso importante del procedimiento es la inmuno-adsorción sobre anticuerpos monoclonales acoplados a la matriz, y condiciones especiales para estabilizar el eluato. Sin embargo, también en la inmuno-adsorción se debe tomar la precaución de trabajar lo más rápidamente posible para evitar incluso la aparición de cantidades reducidas de tcFSAP. Lo mejor, en el caso de esta preparación, es utilizar, en lugar de inhibidores polivalentes de la proteinasa tales como aprotinina, inhibidor de la esterasa C1 o antiplasmina \alpha-2, anticuerpos monoclonales específicos que sólo impiden o disminuyen la activación o auto-activación de FSAP.
Objeto de la invención, por lo tanto, es un anticuerpo monoclonal contra FSAP, que inhibe la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea, o su proenzima. Para esto resulta especialmente apropiado el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533. Si se agrega un anticuerpo monoclonal de este tipo a la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea, o a su proenzima, se produce la inhibición de las mismas. Una preparación de Factor VII, que contiene el anticuerpo monoclonal anteriormente mencionado, se estabiliza por la inhibición de la proteasa activadora del Factor VII y de su proenzima.
El anticuerpo según la invención se puede utilizar también en aplicaciones preparativas y analíticas. Concretamente, por la memoria de publicación alemana 199 03 693 se sabe que la FSAP tiene la propiedad de inactivar, de forma dependiente de la concentración de la proteasa y de la duración de la incubación, los Factores de coagulación sanguínea VIII/VIIIa y V/Va en el transcurso de una incubación. Si se inhibe la acción de FSAP mediante la adición del anticuerpo según la invención, los mencionados factores de coagulación sanguínea quedan protegidos contra la degradación proteolítica. También es posible estabilizar soluciones de fibrinógeno por medio de la adición del anticuerpo según la invención.
El anticuerpo inhibitorio según la invención abre, así mismo, posibilidades de aplicación diagnósticas al ser posible determinar, mediante la inhibición selectiva de la FSAP tras su adición a una solución que contiene proteasas, si la acción proteolítica se puede atribuir a la FSAP o a otras proteasas. Este procedimiento se puede usar, en particular, en todos los sistemas de ensayo que se basan en la actividad de FSAP, por ejemplo, la separación de sustratos cromógenos, por FSAP activada, o por la medición de la actividad amidolítica de la uroquinasa activada por FSAP.
Adicionalmente, surgen posibilidades de aplicación profiláctica o terapéutica del anticuerpo inhibitorio según la invención en determinadas enfermedades. De esta forma, mediante un incremento del contenido de FSAP en plasma, se pueden incrementar las propiedades procoagulantes de la sangre y, por consiguiente, el riesgo de trombosis. A través de la administración de un anticuerpo inhibitorio, resulta posible reducir la capacidad de coagulación de la sangre y lograr, de esta forma, un descenso del riesgo de trombosis.
En la memoria de publicación alemana 199 03 693 se menciona, igualmente, la especial actividad fibrinolítica de preparaciones farmacéuticas que contienen la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea. Por lo tanto, la proteasa se puede utilizar también para el tratamiento de enfermedades causadas por trombos que contienen fibrina. De aquí se deduce que la FSAP, a concentraciones más elevadas, puede desencadenar o reforzar una tendencia a sufrir hemorragias, que se puede evitar o reducir mediante un anticuerpo monoclonal inhibitorio. De esta manera, se pueden inhibir también influencias negativas sobre la cicatrización o la aparición de cáncer.
Las múltiples posibilidades de aplicación descritas de un anticuerpo monoclonal inhibitorio contra la FSAP se alcanzan gracias a que el anticuerpo impide la activación de scFSAP y, por consiguiente, a la imposibilidad de que se forme tcFSAP. Puesto que muchas de las propiedades conocidas hasta ahora de la FSAP están mediadas por la tcFSAP, resulta suficiente la inhibición de la tcFSAP para bloquear los efectos de la FSAP.
Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal obtenido, según la invención, a partir de las células de hibridoma DSM ACC 2533, inhibe de manera muy eficaz la actividad de la tcFSAP, así como también la auto-activación de la scFSAP. Evidentemente, este anticuerpo monoclonal se debe humanizar antes de su aplicación clínica como preparado profiláctico o terapéutico. Estos procedimientos son conocidos en general y no es necesario describirlos detalladamente en este documento.
Por otra parte, en la solicitud de patente alemana 100 52 319.6 se ha descrito ya que, además de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea (FSAP), en 5 hasta 10% de todos los donantes de sangre analizados en relación con la activación de la scuPA, aparece un mutante inactivo de FSAP, cuya secuencia de aminoácidos muestra, en la posición de aminoácido 393, un intercambio Glu/Gln y un intercambio Gly/Glu. Este "polimorfismo de nucleótido único" (= SNP, en sus siglas en inglés) se asocia con una reducción de la activación de los activadores del pro-plasminógeno y, con ella, un potencial fibrinolítico reducido, así como un incremento del riesgo de trombosis. Para disminuir este riesgo, la solicitud de patente europea 01 115 691.6 propone la administración de FSAP de tipo salvaje.
La presente invención ofrece ahora la posibilidad adicional de inducir la inhibición de la FSAP y de los mutantes mediante la administración de un anticuerpo monoclonal inhibitorio, a través de lo que se reduce el potencial trombótico o trombo-embólico. Por otra parte, se pueden utilizar mutantes de FSAP, cuyas propiedades activadoras de FVII se encuentran reducidas y, por lo tanto, muestran un incremento de su capacidad fibrinolítica, para el tratamiento de la tendencia potencialmente incrementada a las hemorragias debida a la administración de un anticuerpo monoclonal inhibitorio.
La línea celular de hibridoma DSM ACC 2533 se ha identificado y preparado de la forma siguiente: se inmunizaron 3 ratones con FSAP. Se fusionaron las células esplénicas de un ratón con la línea celular de mieloma de ratón SP2/0-Ag 14, usando polietilenglicol 4.000 como reactivo de fusión. Las células se distribuyeron sobre placas de cultivo de 24 pocillos. Como medio para la selección se empleó Medio de Eagle modificado por Dulbecco, con suero bovino fetal al 10% y HAT. Después de aproximadamente 2 semanas, los clones celulares en crecimiento se transfirieron a las cavidades de una placa de cultivo de 48 pocillos, y se codificaron. A partir de 1.728 clones celulares crecidos, se analizó en el sobrenadante, por medio de ELISA, la presencia de IgG de ratón. Con ayuda de FSAP inmovilizada, se investigó la especificidad de los sobrenadantes positivos para IgG de ratón. De los clones analizados, se identificaron 108 como específicos para FSAP. En experimentos adicionales, se encontró la propiedad inhibitoria del anticuerpo monoclonal de la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533. El anticuerpo es del tipo IgG1.
El anticuerpo monoclonal de la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533 inhibe la actividad proteolítica de tcFSAP. En consecuencia, inhibe no sólo la capacidad de activar la FSAP, el Factor VII o la pro-uroquinasa, sino que impide, igualmente, la auto-activación de FSAP.
La invención se explicará más detalladamente mediante los ejemplos siguientes:
Ejemplo 1 Investigación de los efectos del anticuerpo monoclonal de DSM ACC 2533 sobre la (auto-)activación de scFSAP
La recalcificación de plasma citrado da lugar a la activación de la coagulación y, por último, a la formación de un coágulo de fibrina. Bajo estas circunstancias, la scFSAP no se activa o sólo de hace de forma fuertemente retardada. Mediante la simulación de los denominados activadores de contacto o superficies reactivas, mediante la adición de sulfato de dextrano, se activa la scFSAP también en el medio plasmático. Esto se puede representar de forma muy gráfica por medio de análisis de SDS-PAGE y transferencia de western. Con este fin, la muestra recalcificada y mezclada con sulfato de dextrano se incuba durante diferentes períodos de tiempo y, a continuación, se somete a la llamada precipitación de euglobulina, conocida por los especialistas, para poder llevar a cabo de manera óptima la subsiguiente SDS-PAGE. De este modo, se reduce la concentración de proteínas de las muestras y se evita el ensuciamiento de los patrones de bandas. Las muestras obtenidas de esta forma se mezclan con un medio reductor para identificar más fácilmente las cadenas pesadas y ligeras de tcFSAP, formadas por la activación de scFSAP. Tras la transferencia del patrón de bandas obtenido por SDS-PAGE a nitrocelulosa (transferencia), se utilizan los anticuerpos monoclonales DSM ACC 2453 y DSM ACC 2454 en su forma marcada, descritos en la solicitud de patente alemana 100 36 641.4, para la detección de las dos bandas de tcFSAP.
Como resultado de este análisis experimental, se reconoce la desaparición de scFSAP en la transferencia y el incremento de las dos cadenas de tcFSAP. Eventualmente, sin embargo, puede hacerse visible también sólo la cadena pesada, dado que la cadena ligera de tcFSAP contiene el centro activo de FSAP, que reacciona durante el período de incubación del plasma con las correspondientes proteínas inhibitorias, tales como el inhibidor de la esterasa C1 o la antiplasmina \alpha-2 y, finalmente, el anticuerpo monoclonal de detección la reconoce peor como complejo (cuasi-covalente).
Si las muestras de plasma anteriormente descritas se mezclan con el anticuerpo monoclonal obtenido de DSM ACC 2533, y se procede a la detección de la activación de scFSAP de la forma antes descrita, al contrario que en los controles (exentos del citado anticuerpo monoclonal, o con un anticuerpo monoclonal no inhibitorio), no se produce la separación de las bandas de alto peso molecular (forma de cadena única) y, en consonancia, no aparece(n) la(s) cadena(s)
pesada (y ligera) de la tcFSAP. El anticuerpo monoclonal de la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533 se ha fijado, por tanto, a scFSAP y evita, de esta forma, la activación de la scFSAP.
La titulación de este efecto demuestra que el citado anticuerpo es un anticuerpo monoclonal altamente potente para la inhibición de la activación de scFSAP. Ya en cantidades equimolares con respecto a FSAP, se produce una reducción importante de la activación, lo que convierte este anticuerpo monoclonal inhibitorio en un muy valioso agente coadyuvante diagnóstico y preparativo. La elevada eficacia ante concentraciones relativamente reducidas hace que el uso potencial de este anticuerpo monoclonal sea una opción atractiva en su aplicación humana.
Ejemplo 2 Inhibición de tcFSAP activa a través del anticuerpo monoclonal inhibitorio de la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533
Como se describe en la solicitud de patente alemana 199 03 693, es posible analizar la actividad de FSAP en diferentes sistemas de ensayo. Además de la activación de proenzimas del activador de plasminógeno o del FVII, con la correspondiente aceleración de la coagulación, se puede estudiar, por ejemplo, también la velocidad de inactivación de FV, FBI, FIX o del fibrinógeno. Se han analizado las propiedades inhibitorias del anticuerpo monoclonal inhibitorio según la invención en estos sistemas de ensayo.
Como resultado, cabe afirmar que el anticuerpo monoclonal inhibitorio de la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533 inhibe, de manera potente, la actividad de tcFSAP frente a los factores de coagulación sanguínea anteriormente mencionados. Esto es válido también para scFSAP, cuya activación en tcFSAP y, por consiguiente, su conversión en la forma amidolíticamente activa, resultan inhibidas, como se demuestra en el anterior Ejemplo 1.

Claims (16)

1. Anticuerpo monoclonal contra FSAP, caracterizado porque inhibe la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea (FSAP), y su proenzima, mediante fijación específica a FSAP y a su proenzima.
2. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, caracterizado porque lo produce la línea celular de hibridoma DSM ACC 2533.
3. Línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo según la reivindicación 1.
4. Línea celular de hibridoma según la reivindicación 3, caracterizada porque es la línea celular de hibridoma depositada con el número de acceso DSM ACC 2533.
5. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, caracterizado porque su fijación a FSAP resulta inhibida por el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.
6. Anticuerpo de cadena única, caracterizado porque posee la especificidad de fijación del anticuerpo según la reivindicación 2.
7. Anticuerpo según la reivindicación 6, caracterizado porque se fija a una proteína portadora, preferentemente albúmina de suero humano o transferrina humana.
8. Anticuerpo humanizado, caracterizado porque posee la capacidad de fijación del anticuerpo según la reivindicación 2.
9. Preparación de FSAP y/o de proenzima de FSAP, caracterizada porque contiene un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, que inhibe la proteasa activadora del Factor VII y su proenzima.
10. Preparación de Factor VII, caracterizada porque contiene un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, que inhibe la proteasa activadora del Factor VII y su proenzima.
11. Preparación estabilizada de Factor V, Factor VIII o fibrinógeno, caracterizada porque está protegida contra la degradación proteolítica causada por la proteasa activadora del Factor VII, a través de la inhibición de dicha proteasa por medio de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
12. Preparación farmacéutica, caracterizada porque contiene un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
13. Preparación farmacéutica según la reivindicación 12, dirigida a reducir la capacidad de coagulación de la sangre, caracterizada porque contiene un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
14. Procedimiento para determinar la actividad de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación sanguínea, caracterizado porque se estabiliza la cantidad de proteasas contenidas en la muestra a analizar, mediante la adición de una cantidad suficiente de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, y sólo entonces se mide la actividad amidolítica remanente.
15. Procedimiento para preparar FSAP o la proenzima de FSAP, caracterizado porque se utiliza como inmuno-adsorbente el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2.
16. Procedimiento para preparar FSAP o la proenzima de FSAP, caracterizado porque se agrega el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2 al material de partida desde el que se obtendrá la FSAP.
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