ES2258396A1

ES2258396A1 - Nueva estructura de soporte polimerica 3d para la regeneracion de tejidos y su tecnica de preparacion.

Info

Publication number: ES2258396A1
Application number: ES200500179A
Authority: ES
Inventors: Laura Santos Esteve
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2005-02-01
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2025-02-01
Also published as: ES2258396B1; WO2006082270A1

Abstract

Nueva estructura de soporte polimérica 3D para la regeneración de tejidos, cuya estructura porosa es la inversa o "negativo" de un porógeno tridimensional o "template" resultante de la sinterización de mallas superpuestas de fibras de nylon, caracterizada por una red ortogonal regular (figura 3) de poros y canales cilíndricos de tamaño uniforme y limpios de porógeno residual, alienados e interconectados entre sí, con una porosidad variable por encima del 75 %, y con un diámetro de poro y canal también variable, en orden de magnitud {mi}m. Esta nueva estructura de soporte polimérica, que se obtiene por infiltración y polimerización en el template del material de reticulación, eliminación del porógeno por lixiviación y secado final de la matriz porosa resultante, es estable química y mecánicamente, encontrando especial aplicación en la regeneración o reparación de tejidos humanos o de animales.

Description

Nueva estructura de soporte polimérica 3D para la regeneración de tejidos y su técnica de preparación.

La presente invención se refiere a una nueva estructura de soporte polimérica tridimensional (3D) para la regeneración de tejidos, con alto grado de porosidad y regularidad estructural, y su técnica de preparación.

Este nuevo soporte para ingeniería tisular fabricado en base a polímeros biocompatibles se caracteriza por presentar una arquitectura porosa tridimensional altamente regular y con alto grado de porosidad, manifestada por una red ortogonal de poros y canales completamente interconectados, libres de porógeno residual, resultando estable química y mecánicamente para el fin a que se destina.

Las idóneas características estructurales de las estructuras de soporte desarrolladas se consiguen por una novedosa y barata técnica, fundamentada en la utilización de un porógeno tridimensional o template producido a partir de mallas sinterizadas de fibras de nylon u otro polímero similar, que hace que la matriz resultante de la infiltración y polimerización del material de reticulación sea la estructura inversa o negativo del template, de ahí la regularidad geométrica de poros y canales interconectados. Como ejemplo representativo de cómo este método puede ser aplicado, se va a describir la fabricación de una estructura de soporte hecho de metacrilato de metilo MMA.

Estas arquitecturas se han caracterizado mediante microscopía electrónica de barrido, porosimetría y propiedades dinámico-mecánicas.

Los resultados han demostrado la viabilidad de la técnica para preparar estructuras macroporosas y microporosas, idóneas para ser utilizadas en ingeniería tisular o de tejidos, dentro de lo que es el campo técnico de la biotecnología, donde la invención encuentra aplicaciones, tanto ex vivo como in vivo, sirviendo de estructuras para apoyar y aumentar la eficacia de los cultivos de células in vitro, o como soportes donde pueden crecer células vivas y fibras biológicas, mejorando la bio-integración y el anclaje del material en el tejido fino del anfitrión.

Estado de la técnica

La Ingeniería de Tejidos, o ingeniería tisular, es un campo interdisciplinario que combina ciencias de la ingeniería y de la vida para desarrollar las técnicas que permiten la renovación, el mantenimiento o la mejora de los tejidos y órganos vivos. Su objetivo fundamental es la creación de un tejido natural con la capacidad de restablecer la función de un órgano o tejido perdido, que el organismo no ha podido regenerar en condiciones fisiológicas. Con ello se aspira a poder dar solución a las limitaciones actuales: baja cantidad de donantes, rechazos, etc.

La ingeniería tisular necesita de estructuras de soporte (scaffolds en inglés) para el crecimiento celular y como ayuda física para dirigir la formación del nuevo tejido. La mayoría de las técnicas empleadas utilizan las estructuras de soporte poliméricas tridimensionales (3D), compuestas por polímeros naturales o sintéticos.

Las estructuras de soporte poliméricas presentan una arquitectura interna compleja, con canales y poros que proporcionan lugar para el asentamiento y proliferación de las células, en base a un material biocompatible, que sirva de señal biomolecular para promover la regeneración del tejido fino en el lugar del implante, y también biodegradable, para que el soporte se degrade en un cierto plazo después del implante, siendo finalmente sustituido por el tejido fino nuevamente formado.

Idealmente, una estructura de soporte polimérica para ingeniería tisular debe tener las siguientes características: 1) presentar propiedades superficiales adecuadas para permitir el anclaje celular, que facilite la adhesión, proliferación y diferenciación de las células, 2) debe ser biocompatible, 3) altamente poroso, con una gran superficie o relación área/volumen, formando una red de poros de tamaño uniforme e interconectados para facilitar tanto el crecimiento celular, al permitir que se desarrollen las células a través de toda la red, como la entrada y salida de nutrientes y productos de deshecho, y 4) debe poseer suficiente resistencia mecánica para soportar cualquier tensión in vivo.

Este último requisito es difícil de conjugar con la elevada porosidad en volumen del material, de ahí que sea necesario emplear matrices poliméricas de propiedades especiales o reforzadas, especialmente si el polímero es un hidrogel.

El diseño de las estructuras de soporte poliméricas depende de las aplicaciones consideradas, pero en todo caso deben conseguirse estructuras dotadas de las señaladas características necesarias para su correcta función. El conseguirlo con éxito está condicionado fundamentalmente por dos factores: por los materiales empleados, tanto para el porógeno, que es el molde utilizado, como para el polímero de reticulación, que es infiltrado en el porógeno para constituir la estructura de soporte; y, como segundo factor, por la arquitectura estructural, externa e interna, del material soporte conformado, manifestada básicamente por el grado de porosidad (fracción superficie/volumen) y por la geometría y tamaño de los poros, contando siempre además con que las estructuras de soporte deben ser fácilmente procesables en formas tridimensionales 3D.

Los materiales utilizados en el sistema porogéncico o porógeno, pueden ser granos de poli(metil metacrilato) y poli(etil metacrilato), poliamida 6,6 y las fibras y mallas del poli(acrilonitrilo).

En cuanto a las estructuras de soporte, estas pueden basarse en polímeros hidrofílicos, hidrofóbicos o hidrogeles, o una combinación de ellos en la forma de copolímeros o de redes interpenetradas de polímero, que son elastómeros o rígidas a la temperatura del cuerpo, y que poseen una estructura porosa de tamaño y topología característicos controlables.

Los polímeros basados en el ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y sus copolímeros (PLGA) son los polímeros biocompatibles más ampliamente investigados para las estructuras de soporte de la ingeniería tisular y para los bioimplantes (Rothen-Weinhold et al. 1999; Stancari et al. 2000) y dispositivos de reparto controlado y libre de nutrientes (Putney, 1999). Actualmente se están investigando combinaciones de estos polímeros con hidroxiapatila (FLA) como dispositivos de fijación al hueso en cirugía ortopédica, craneofacial, maxilofacial y reconstructiva (Furukawa et al. 2000). Polianhídridos, poliortoésteres, policaprolactonas, polifumaratos, policarbonatos, y cristales bioactivos (Stamboulis et al. 2002) entre una multitud de otros biomateriales sintéticos están siendo investigados para las estructuras de soporte de la ingeniería tisular y también el reparto controlado de nutrientes.

Monómeros de acrílico y metacrílico también son utilizados como material constitutivo de las estructuras de soporte.

En base a esta amplia gama de materiales poliméricos, se han desarrollado diversas técnicas para el diseño estructural de las estructuras de soporte 3D para la ingeniería de implantación de tejidos, entre las que cabe destacar: a) Phase separation, b) Gas foaming, c) Fiber bonding, d) Photolithography, e) Solid free form (SFF), f) Solvent casting in combination with particle leaching, entre otras.

Sin embargo, ninguna de estas técnicas ha logrado conseguir un modelo de arquitectura tridimensional idóneo para que las estructuras de soporte puedan cumplir con su fin de la forma deseada, incluso utilizando equipos de alto coste, por las razones que a continuación se comentan.

Así, mediante la conocida técnica de separación de fases (phase separation) se pueden obtener estructuras porosas fácilmente ajustando parámetros termodinámicos y cinéticos, pero, debido a la complejidad de las variables implicadas en el proceso, la estructura porosa no puede ser controlada fácilmente. Además es difícil obtener grandes poros y pueden exhibir falta de interconexión.

El espumado gaseoso (gas foaming) tiene la ventaja del procesado a temperatura ambiente, pero produce una capa externa no porosa, y una mezcla de poros abiertos y cerrados en el centro de la estructura de soporte, dejando incompleta la interconectividad. La desventaja principal del método es que da lugar a menudo a una estructura celular no conectada dentro de la estructura de soporte.

La técnica del entrecruzamiento de fibras (fiber bonding) proporciona una gran superficie para la adhesión de células y la rápida difusión de nutrientes, a favor del crecimiento y supervivencia celular. Sin embargo a estas estructuras de soporte, como las formadas por firmes redes de fibras de ácido poliglicólico (PGA), carecen de la estabilidad estructural necesaria. Además, la técnica no se presta a un fácil e independiente control de la porosidad y

\hbox{del tamaño del
poro.}

La fotolitografía (photolithography) también se ha empleado para el diseño de estructuras de soporte, permitiendo obtener disposiciones estructurales con gran precisión, aunque no siempre es requerida. En cualquier caso, el inconveniente de esta técnica estriba en el alto coste del equipo necesario para aplicarla.

Los métodos de fabricación de estructuras de soporte de SFF (sólidos de forma libre o Solid free form) proporcionan un control excelente sobre la forma externa, geometría e interconectividad interna de los poros, pero ofrecen una resolución limitada a escala micrométrica, además el tamaño mínimo de los poros globales es de 100 \mum. Asimismo, requiere una complicada corrección del diseño de la estructura de soporte debido a la contracción anisótropa durante la fabricación, y un equipamiento algo costoso.

Por último, el colado de sólidos en combinación de lixiviado (solvent casting in combination with particle leaching), que implica la fundición/vaciado de una mezcla de monómeros y de la solución del iniciador y de un porógeno en un molde, la polimerización, seguida del lixiviado para extraer el porógeno con el disolvente apropiado para generar los poros, es un método barato, pero todavía tiene que superar algunas desventajas para encontrar aplicaciones en ingeniería, principalmente el problema de los restos de porógeno, formas de poro irregulares y una insuficiente interconectividad, entre otros.

A la vista de todas estas dificultades, el objetivo de la presente invención es presentar un nuevo modelo de estructuras de soporte porosas de arquitectura 3D para la ingeniería de tejidos, con unas características estructurales sin parangón para cumplir con su finalidad, conseguido por una técnica, también reivindicada como de propia invención, que es sencilla y barata, y que supera los problemas de las técnicas antes mencionadas.

La nueva técnica se basa en utilizar un porógeno tridimensional o template obtenido a partir de mallas sinterizadas de fibras de nylon, aunque también puede ser creado utilizando mallas sinterizadas de otros materiales poliméricos de características similares al nylon o poliamiadas, de modo que la estructura de soporte que resulte de la infiltración y polimerización del material de constitución en dicho template sea la estructura inversa o negativo del mismo, la cual presenta una regularidad geométrica de poros y canales interconectados hasta ahora no conseguida.

Estructuras de soporte 3D para ingeniería de tejidos utilizando nylon se encuentran divulgadas en patentes anteriores, caso, por ejemplo de las patentes norteamericanas con números de publicación US5736372, US6596296, US5266480 o US6471993, entre otras, que obtienen el producto por algunas de las técnicas arriba comentadas, pero la diferencia es que en todas ellas se utiliza el nylon como estructura de soporte, cuando el material que a continuación se reivindica es un negativo que no tiene porqué estar constituido de nylon, porque lo que realmente es de invención es su estructura tridimensional, de geometría idónea, creada a partir de una técnica distinta.

La invención

La nueva estructura de soporte polimérica 3D para la regeneración de tejidos desarrollada está constituida por un polímero biocompatible de tipo hidrófobo, rígido o flexible, o de tipo hidrófilo rígido, o una combinación de ambos tipos de polímeros en la forma de copolimeros o redes interpenetradas de polímero, más un agente entrecuzador, y está caracterizada por ser la estructura inversa o "negativo" de un porógeno tridimensional o "template", resultante de la sinterización de mallas superpuestas de fibras poliamidas sintéticas o nylon, u otro material polimérico similar, y que es eliminado tras la polimerización del material de reticulación sobre el mismo, presentando una red tridimensional regular de poros y canales cilíndricos ortogonales de tamaño uniforme y limpios de porógeno residual, alienados e interconectados transversalmente a través de una sucesión de capas paralelas uniformemente distribuidas, prácticamente superponibles, con una porosidad variable por encima del 75% (fracción de volumen de poros), dependiendo de las condiciones de presión y temperatura del proceso de sinterización, y con un diámetro de poro y canal que puede variar en orden de magnitud \mum para cada matriz obtenida, según sea el material polimérico utilizado en la obtención del porógeno tridimensional.

La estructura soporte resultante es bastante estable, incluso durante el lixiviado del porógeno, y puede obtenerse con diferentes grados de porosidad y de tamaño de canales, dependiendo del material porogénico utilizado y de las condiciones de sinterización del mismo para obtener el témplate. Además, la estructura puede producirse en diferentes combinaciones de materiales poliméricos, ajustando así la relación de comportamiento hidrófilo/hidrófobo de la estructura de soporte. De hecho, la estructura se ha obtenido en base a copolímeros de diversas composiciones (pEA-co-pHEMA)e IPN's.

En una realización preferida, el material porogénico del template tridimensional es tejido de nylon 6,6, y el material de reticulación constitutivo de la matriz porosa resultante es metacrilato de metilo (MMA, 99%), junto con dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA, 98%) como agente entrecruzador, lo que conduce a una estructura de soporte con 80% de porosidad y un diámetro medio de poro y canal de 72 \pm 6 \mum.

El método por el cual se obtiene este nuevo soporte de estructura porosa para la ingeniería tisular, consiste básicamente en crear un template utilizando mallas sinterizadas de fibras de nylon u otro polímero equivalente, como estructura tridimensional de material porogénico, template que es eliminado tras la polimerización de la matriz. De esta manera la estructura de soporte resultante posee la estructura inversa del template, que es una estructura con poros y canales cilíndricos ortogonales uniformemente distribuidos e interconectados, con un nivel de porosidad o relación superficie/volumen entorno al 80%.

En concreto, la técnica de preparación de la nueva estructura de soporte polimérica 3D, comprende las siguientes etapas:

La primera y fundamental es la preparación de la malla de porógeno tridimensional, mediante el apilado y, en su caso, prensado, de capas rectangulares de telas de fibra de nylon u otro polímero equivalente, para ser sometidas a sinterización isoterma y a presión en horno eléctrico, resultando una malla tridimensional estable, con un tamaño reticular que depende de la presión, temperatura y tiempo empleado durante el proceso de sinterización. Así, para el nylon 6,6 utilizado como material porogénico, un template ideal se consigue mediante el apilado de ocho capas de telas de fibra de esa poliamida y su sinterización isoterma a 220ºC durante diez minutos, siendo necesario un desbastado final para eliminar irregularidades.

No obstante, cuando el material utilizado como porógeno son fibras de poli(acrilonitrilo), la preparación de la malla tridimensional o template no se realiza por sinterización térmica, sino que el apilado de telas de fibra de dicho material se somete a presión en atmósfera de un disolvente adecuado, como, por ejemplo, dimetilformamida.

Obtenido el sistema porogénico tridimensional o template, se procede a la infiltración en el mismo del material polimérico constitutivo de la matriz estructural, utilizando un molde de cristal de tamaño adecuado, tras lo cual se somete al sistema a polimerización en atmósfera de nitrógeno. Cuando el material polimérico es metacrilato de metilo (MMA), junto con dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA) como agente entrecruzador y azo-bis-isobutironitrilo (AZBN) como iniciador, se realiza polimerización a 65ºC en baño termostático y atmósfera de nitrógeno durante 30 minutos, y después a 65ºC en horno durante 4 horas y a 75ºC durante las 24 horas siguientes.

Tras la polimerización, se procede a la eliminación del porógeno por lixiviación en ácido nítrico como agente extractor, y posterior lavado en etanol.

Finalmente, la matriz porosa resultante es sometida a un secado en dos etapas: primero al aire durante 24 horas y después a vacío a temperatura adecuada durante 48 horas, obteniéndose la estructura de soporte polimérica 3D, de estructura inversa a la del templete utilizado como porógeno, que es conservado en un desecador, quedando listo para su caracterización y utilización.

Esta nueva técnica permite obtener de forma económica estructuras de soporte que, como se ha visto, presentan formas y ordenamientos de poro altamente regulares, con una interconexión completa, dando lugar a estructuras mecánicamente estables sin residuos del porógeno.

Se resuelve así un problema que estaba pendiente, ya que si bien se tenían caracterizados materiales poliméricos más o menos idóneos para las estructuras de soporte, con propiedades superficiales adecuadas, biocompatibles y biodegradables, el factor más importante para que estos soportes estructurales puedan cumplir con su finalidad en ingeniería tisular, que es la alta porosidad requerida, con redes de poros y canales interconectados de forma regular, no estaba del todo resuelto, habiendo quedado ahora plenamente satisfecho por las características estructurales del nuevo soporte conseguido. Además, los costes del procedimiento son muchos más baratos que los de las técnicas que permiten obtener estructuras aceptables, como la photolithography o el Solid free form (SFF), ya comenta-
das.

Haciendo una breve referencia a los dibujos se pueden apreciar tales características estructurales idóneas de las estructuras de soporte presentadas.

La figura 1 es una micrografía SEM (microscopia de barrido del electrón estándar) del templete o porógeno tridimensional formado por los tejidos de nylon sinterizados, que sirve como plantilla de arquitectura para formación de la estructura de soporte polimérica, que es la clave de su estructura singular. La figura 2 es una micrografía SEM de la superficie frontal de la estructura de soporte de metacrilato de metilo (PMMA) formada.

La figura 3 es una ampliación de la misma muestra que muestra en detalle los canales paralelos y los poros de interconexión normales.

Las figuras 4 y 5 corresponden a micrografías SEM de la superficie lateral (sección transversal) de la estructura de soporte de metacrilato de metilo (PMMA), la 4 en una vista general y la 5 en detalle ampliado, donde se demuestra la ausencia del porógeno residual en la red de poros y canales interconectados.

En todas estas micrografías se observa que la regularidad del nuevo soporte es absoluta, dentro de un sistema tridimensional ortogonal. Además, las propiedades mecánicas no se quedan atrás, como demuestran los gráficos de las figuras 6 y 7, que son una comparativa de propiedades mecánicas del soporte poroso obtenido de metacrilato de metilo frente al grueso del mismo, sin tratamiento.

El gráfico de la figura 6 representa la variación del módulo de almacenamiento dinámico E' en función de la temperatura a 1 Hz para el metacrilato de metilo, tanto a granel, no poroso (línea de círculos), como en la arquitectura porosa de la estructura de soporte formada (línea de cuadrados), mientras que el de la figura 7 representa la tangente de pérdidas dinámico-mecánicas Tan \delta como una función de la temperatura a 1 Hz para el metacrilato de metilo, tanto a granel, no poroso (línea de círculos), como en la arquitectura porosa de la estructura de soporte formada (línea de cuadrados).

Modo de realización

Un ejemplo de la técnica de preparación de la nueva estructura de soporte polimérica 3D objeto de esta invención, no limitativo de la misma, en tanto que, como arriba se ha señalado, puede jugarse con diferentes tipos de materiales poliméricos de partida y bajo diferentes condiciones de sinterización del porógeno, se expone a continuación.

Como material porogénico se elige tejido de poliamida 6,6 (nylon 6,6), y como material de reticulación de la estructura de soporte, metacrilato de metilo (MMA, 99%) y dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA, 98%), este último como agente entrecruzador, empleando azo-bis-isobutironitrilo (AZBN) como iniciador.

Ácido nítrico del 60% (para análisis), etanol del 99,7% (calidad/grado de síntesis), agua destilada, n-octano del 99% de pureza (\rho_{n-octano} = 0,7 g/cm^{3}), también son necesaria.

Con estos materiales y productos de partida, las etapas son las siguientes:

1. Preparación de la malla de porógeno tridimensional

Se apilan ocho capas rectangulares de telas de fibra de nylon y se sinterizan mediante un proceso isotermo a 220ºC durante diez minutos en un horno eléctrico.

Para sinterizar las telas de dos dimensiones a una malla tridimensional se probaron programas a diversas temperaturas. Por debajo de 200ºC las muestras de nylon no fueron sinterizadas y por encima de 235ºC las muestras se fundían, debido a la temperatura a la que se funde el nylon.

El tratamiento de calor a 220ºC del programa de sinterización describió una consistente fijación entre las láminas de tela apiladas, probablemente debido a un proceso que implicaba la fusión de pequeños cristales y la recristalización de fibras individuales en contacto unas con otras. Esto se aprecia en el pequeño pico de fusión endotérmico entre 230 y 240ºC, previo a la zona de fusión del material (máximo de la endoterma de fusión 260ºC) que es característico de una fracción de pequeños cristales, creada probablemente en el paso isotermo del tratamiento, puesto que el endotherm está ausente en el termograma de la tela natural. Así se obtiene una malla tridimensional de material porogénico estable, con una red de canales y poros verdaderamente conectada, tal y como se aprecia en la micrografía SEM de la figura 1.

2. Fabricación de la estructura de soporte

La malla tridimensional sinterizada se coloca entre dos placas de cristal cubiertas con una película del celofán y selladas con espaciadores de goma. Se mezclan en un cubilete las cantidades apropiadas de MMA, agente entrecruzador EGDMA (1% en peso) y AZBN como iniciador libre-radical termal (0,2% en peso). La mezcla líquida y homogénea de monómero, iniciador y agente entrecruzador se vierte en el molde de cristal donde se encuentra la malla de nylon. La polimerización se realiza a 65ºC en un baño termostático durante 30 minutos, en atmósfera de nitrógeno. Entonces, se coloca el molde en un horno a 65ºC durante cuatro horas seguidas de un aumento de la temperatura a 75ºC durante 24 horas.

Una vez concluido el proceso de polimerización, la muestra se extrae del molde y se enarena en una máquina pulidora.

Para eliminar el porógeno, la muestra es sumergida a temperatura ambiente durante 5 días en ácido nítrico para disolver la malla de nylon, lavándose a continuación el material en un extractor de Soxhlet, usando el etanol como solvente durante 48 horas, para extraer sustancias de bajo peso molecular y quitar los restos de ácido nítrico.

Por último, la muestra es secada en condiciones ambientales durante un día, permitiendo que se encoja lentamente, pero evitando que se enrolle o flexione al principio del secado, para finalmente, secar al vacío a 120ºC durante 48 horas. La estructura de soporte resultante es almacenada en un desecador hasta su caracterización.

Después del lixiviado con ácido nítrico de la malla de porógeno, la estructura de soporte muestra ya su estructura porosa característica, mediante una red ortogonal de poros y canales interconectados, pero debe ser sometido a una última fase de secado para extraer sustancias de bajo peso molecular y quitar los restos de ácido. La estructura final de la estructura de soporte se ve claramente en las figuras 2 a 4.

La figura 2 muestra la superficie exterior de la estructura de soporte, apreciándose su estructura altamente regular, con una ordenación de poros idénticos en un montaje ortogonal de canales cilíndricos. La Figura 3 es una ampliación de la misma muestra. Los puntos circulares más oscuros son las interconexiones transversales entre las capas, las cuales están uniformemente distribuidas en la matriz, con una forma regular, casi superponibles. El diámetro medio es de 67 \pm 5 \mum.

Las figuras 4 y 5 muestran vistas laterales de la estructura de soporte. La inspección profunda dentro de las muestras demuestra la ausencia del porógeno residual. En la figura 4 se puede observar el detalle de la superficie externa, en la parte izquierda de la imagen, donde de nuevo se aprecia la alta regularidad. Los diámetros de los canales del poro de la estructura de soporte fueron medidos en la vista ampliada de la sección transversal de la figura 5. El diámetro medio es de 72 \pm 6 \mum.

3. Caracterización de las estructuras de soporte

Las estructuras de soporte resultantes del nuevo procedimiento descrito fueron caracterizadas mediante microscopia electrónica de barrido (SEM); también fueron medidas las características mecánicas y la porosidad.

Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Las medidas de DSC fueron llevadas sobre las muestras de la tela de nylon en un instrumento Pyris 1 (Perkin Elmer). La temperatura de fusión y de transición vítrea, T_{g}, del nylon comercial fue determinada en exploraciones que consistían en el calentamiento de 25ºC a 280ºC con un índice calentamiento de 10ºC/min. Para determinar cambios posibles en el nylon inicial durante el proceso de la fabricación del template, las muestras fueron medidas calentándolas de 25ºC a 220ºC a 10ºC/min, seguido por un paso isotermo de 220ºC durante 10 minutos. El paso siguiente fue el enfriamiento desde esa temperatura a 25ºC a 10ºC/min, seguido por otro paso isotermo de 25ºC durante un minuto, y finalmente un calentamiento de 25ºC a 280ºC a 10ºC/min. Todas las medidas fueron repetidas tres
veces.

Análisis mediante microscopia electrónica de barrido (SEM)

La microscopia electrónica de barrido (JEOL JSM6300) fue utilizada a 10 KV para estudiar la morfología de las muestras. Para este propósito las muestras fueron cortadas transversalmente con una hoja de afeitar caliente. Las muestras fueron recubiertas previamente con oro usando un sputter coater (Baltec Sed 005).

Todas las dimensiones fueron medidas con respecto a la barra de la escala en cada micrográfo de SEM, usando las herramientas de imagen del programa.

Determinación de la porosidad

La porosidad fue determinada con la medida de la densidad aparente de la estructura de soporte. Para ello, se utilizó agua destilada como relleno de la estructura porosa. La muestra seca fue pesada y colocada en un tubo de cristal conectado a una bomba de vacío, y llenado de agua destilada antes de quitar el vacío. Entonces la matriz llenada de agua fue pesada otra vez y la porosidad calculada como:

\Pi(%)=\frac{V_{p}}{V_{t}}\cdot 100 = \frac{\frac{m_{l}}{\rho_{l}}}{\frac{m_{l}}{\rho_{l}}+ \frac{m_{m}}{\rho_{m}}}\cdot 100

donde \pi es la porosidad, v_{p} y v_{t} son el volumen ocupado por los poros y el volumen de la matriz, respectivamente, \rho_{1} es la densidad del líquido, \rho_{m} es la densidad del material de relleno (PMMA en este caso), m_{1} y m_{m} son la masa líquida (mojada) y la masa seca de la matriz respectivamente.

La densidad de la malla entrecruzada no porosa seca de PMMA fue determinada pesando las muestras en el aire (m_{a}) y en n-octano (m_{o}), y aplicando la expresión siguiente:

\rho_{PMMAentrecuzado} = \rho_{n-octano}\cdot\frac{m_{a}}{m_{a}+m_{o}}

Se utilizaron para las medidas una balanza Mettler Toledo AX205 con sensibilidad de 0,00001 g y un kit para la determinación de densidad para los balances de AT/AX.

La porosidad de la estructura de soporte fue determinada según lo descrito arriba, la ecuación (1), con un valor de \rho_{PMMAentrecruzado} = 1,18 g/cm^{3} determinado mediante la ecuación (2). Se obtuvo así una porosidad media de la estructura de soporte del 80%.

Todas las muestras eran fáciles de manipular y físicamente estables.

Propiedades dinámico-mecánicas

Las muestras de PMMA a granel y de las arquitecturas porosas se cortan en barras y se miden en un instrumento DMS210 (Seiko) desde 30ºC hasta 250ºC, a una velocidad de calentamiento de 2 grados/min y una frecuencia de 1Hz.

Las características mecánicas de las estructuras de soporte dependen de la porosidad. La Figura 6 (Paper inventor) compara el módulo dinámico E' de una estructura de soporte con el del grueso de PMMA, es decir, con una matriz no porosa de este polímero, obtenida por el mismo procedimiento pero sin infiltración en template. El efecto de la porosidad es un cambio vertical de la curva, que corresponde a una disminución de los módulos de goma y vítreo de la estructura de soporte por un factor de diez en comparación con los módulos a granel. Esto es debido a la disminución del área eficaz de la sección transversal debido a la porosidad. Es notable, sin embargo, que la estructura porosa conserva el resto de las características mecánicas del material a granel, que no es alterada por el proceso de producción: la caída del módulo en la región de la transición vidrio-goma está prácticamente igual que en el material a granel, al igual que también la temperatura de la transición vítrea. Esto se puede ver más claramente en la Figura 7 (Paper inventor), donde se representa el factor de la tangente de pérdida \delta. Allí la coincidencia en la temperatura y la intensidad de la transición principal es evidente para ambos materiales. La dispersión de los datos de E' y tan \delta después de la transición vítrea son unas características previstas de la medida en las estructuras porosas debidas probablemente a los factores tales como adhesión más pobre en las abrazaderas del aparato.

Aplicación industrial

Las estructuras de soporte desarrolladas mediante la nueva técnica descrita, con características estructurales notablemente mejoradas, encuentran perfecta aplicación en ingeniería tisular, en la fabricación de las estructuras soporte para la regeneración o reparación de tejidos humanos o de animales.

Las arquitecturas porosas tridimensionales objeto de la industria biotecnológica y que a continuación se pasan a reivindicar formalmente, son de utilidad en aplicaciones médicas tales como soportes físicos para cultivos celulares, anillo soporte para prótesis de cornea, regeneración de nervios, cultivo de condrocitos y sistemas de liberación controlada de fármacos, entre otras. También podrían encontrar uso en otras áreas en las cuales la morfología del poro puede desempeñar un papel esencial, tal como en membranas y filtros.

Claims

1. Nueva estructura de soporte polimérica 3D para la regeneración de tejidos, constituido por un polímero biocompatible de tipo hidrófobo, rígido o flexible, o de tipo hidrófilo rígido, o un hidrogel, o una combinación de estos tipos de polímeros en la forma de copolímeros o redes interpenetradas de polímero, más un agente entrecuzador, caracterizado esencialmente por ser la estructura inversa o "negativo" de un porógeno tridimensional o "template" (figura 1) resultante de la sinterización de mallas superpuestas de fibras poliamidas sintéticas o nylon, u otro material polimérico similar, y que es eliminado tras la polimerización del material de reticulación sobre el mismo, presentando esta nueva estructura soporte una red tridimensional regular (figuras 2 a 5) de poros y canales cilíndricos ortogonales de tamaño uniforme y limpios de porógeno residual, alienados e interconectados transversalmente a través de una sucesión de capas paralelas uniformemente distribuidas (figuras 4 y 5), prácticamente superponibles, con una porosidad variable por encima del 75% (fracción de volumen de poros), dependiendo de las condiciones de presión y temperatura del proceso de sinterización, y con un diámetro de poro y canal que puede variar en orden de magnitud \mum para cada matriz obtenida, según sea el material polimérico utilizado en la obtención del porógeno tridimensional.

2. Nueva estructura de soporte polimérica 3D para la regeneración de tejidos, según reivindicación 1, en el que el material porogénico del template tridimensional es tejido de nylon 6,6, y el material de reticulación es metacrilato de metilo (MMA, 99%), junto con dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA, 98%) como agente entrecruzador, presentando la estructura un grado de porosidad del 80% y un diámetro medio de poro y canal de 72 \pm 6 \mum.

3. Técnica de preparación de la nueva estructura de soporte polimérica tridimensional de la primera reivindicación, caracterizada porque comprende las siguientes etapas: i) Preparación de la malla de porógeno tridimensional, mediante apilado de capas de telas de fibras de nylon u material polimérico equivalente, y sinterización isoterma y a presión de las mismas en horno eléctrico, resultando una malla tridimensional o template estable, con un tamaño reticular que depende de la presión, temperatura y tiempo empleado durante el proceso de sinterización, ii) infiltración en el template obtenido del material polimérico constitutivo de la matriz estructura, y posterior polimerización en atmósfera de nitrógeno, iii) eliminación del porógeno por lixiviación como agente extractor y posterior lavado en etanol, y iv) secado de la matriz porosa resultante al aire durante 24 horas y después a vacío a temperatura adecuada durante 48 horas.

4. Técnica de preparación de la nueva estructura de soporte polimérica tridimensional de la primera reivindicación, según reivindicación anterior, caracterizada porque cuando el material utilizado como porógeno son fibras de poli(acrilonitrilo), la preparación de la malla tridimensional o template se realiza a presión en atmósfera de un disolvente adecuado, como, por ejemplo, dimetilformamida.

5. Técnica de preparación de la nueva estructura de soporte polimérica tridimensional de la segunda reivindicación, constituido por una matriz porosa de metacrilato de metilo MMA y dimetacrilato de etilenglicol EGDA, como negativo de un porógeno tridimensional en base a nylon 6,6, caracterizada porque comprende las siguientes etapas: i) Preparación de la malla de porógeno tridimensional, mediante apilado de ocho capas rectangulares de telas de fibras de nylon 6,6, y sinterización isoterma a 220ºC y a presión durante diez minutos en horno eléctrico, con debastado del template resultante para eliminar las irregularidades, ii) infiltración en el template de una mezcla de metacrilato de metilo MMA, dimetacrilato de etilenglicol EGDMA (1% en peso) como agente entrecruzador, y azo-bis-isobutironitrilo AZBN (0,2% en peso) como iniciador, y posterior polimerización a 65ºC en baño termostático y atmósfera de nitrógeno durante 30 minutos, y después a 65ºC en horno durante 4 horas y a 75ºC durante las 24 horas siguientes, iii) eliminación del porógeno por lixiviación en ácido nítrico como agente extractor y posterior lavado en etanol, y iv) secado de la matriz porosa resultante al aire durante 24 horas y después a vacío a temperatura de 120ºC durante 48 horas.