ES2258100T3 - Promotores para la expresion de genes en cariopsides de plantas. - Google Patents
Promotores para la expresion de genes en cariopsides de plantas.Info
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Abstract
Molécula de ácido nucleico con la función de un promotor específico para cariópsides, que a) comprende la secuencia de ácido nucleico definida por los nucleótidos 1-4.683 de la Seq ID No. 1; b) comprende uno o varios elementos de secuencias, seleccionados entre el conjunto que consiste en Seq ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 5, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7, Seq ID No. 8, Seq ID No. 9 y Seq ID No. 10; c) comprende una parte funcional de la secuencia de ácido nucleico mencionada en a); y/o d) comprende una secuencia, que es idéntica a una de las secuencias de ácido nucleico mencionadas en a) en aproximadamente un 60-99 %, de manera preferida en aproximadamente un 75-99 %, en particular en aproximadamente un 90-99 % y de manera muy especialmente preferida en aproximadamente un 95-99 %.
Description
Promotores para la expresión de genes en
cariópsides de plantas.
El presente invento se refiere a promotores que
permiten una expresión o supresión de genes, específica para
cariópsides, en plantas modificadas genéticamente, a procedimientos
para la expresión o supresión de genes, específica para tejidos en
plantas, a casetes de expresión, a vectores recombinantes y a
células anfitrionas, que contienen tales promotores, a células de
plantas transgénicas, transformadas con los mencionados promotores,
y a plantas transgénicas, así como a procedimientos para la
producción de tales células de plantas y tales plantas.
A continuación se citan documentos del estado de
la técnica, cuyo contenido divulgativo es con esto parte de esta
solicitud por su referencia.
El empleo de plantas, que habían modificadas en
su material hereditario con ayuda de procedimientos de tecnología
genética, se ha manifestado como ventajoso en muchos sectores de la
agricultura, con el fin de transferir determinadas propiedades a
plantas útiles. Las metas predominantes son, por una parte, la
protección de las plantas y, por otra parte, un aumento de la
calidad y del rendimiento de cosecha de las plantas y
respectivamente de los productos, que se pueden cosechar.
Se conocen numerosos procedimientos para la
modificación genética de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas
(compárense, entre otras, las citas de Gasser y Fraley, Science 244
(1989), 1293-1299; Potrykus, Ann. Rev. Plant. Mol.
Biol. Plant. Physiol. 42 (1991), 205-225; y Newell,
Mol. Biotechnol. (2000); 16(1) 53-65).
Con frecuencia, éstos se basan en la
transferencia de construcciones génicas, que en la mayor casos
representan unas combinaciones de determinadas regiones
codificadoras de genes estructurales con regiones de promotores, así
como con terminadores de la transcripción de los mismos, o de otros
genes estructurales (p.ej. heterólo-
gos).
gos).
La puesta a disposición de promotores es de gran
importancia, en conexión con la expresión de genes estructurales,
para la producción de plantas transgénicas, puesto que la
especificidad de un promotor es decisiva para establecer en qué
momento, en qué tipos de tejidos, en qué condiciones fisiológicas y
con cuánta intensidad es expresado un gen transferido en una planta
modificada.
Para dominar estos diferentes principios para la
modificación genética de plantas es necesario, por lo tanto, poner a
disposición genes que deben ser regulados de una manera diversa,
bajo el control de correspondientes promo-
tores.
tores.
La iniciación y la regulación de la transcripción
están sujetas al segmento de ADN, designado como promotor, de un
gen. Por regla general, las secuencias de promotores están situadas
en la región flanqueadora de 5' de un gen transcrito. Elementos
individuales de un promotor (p.ej. intensificadores de la
transcripción) pueden estar localizados también en la región
flanqueadora en 3' o dentro de secuencias de intrones de un gen
(Kuhlemeier (1992) Plant Mol. Biol. 19: 1-14;
Luehrsen (1994) The Maize Handbook [El manual del maíz],
636-638).
La expresión controlada de transgenes es de gran
utilidad, por ejemplo, para la introducción de propiedades de
resistencia o para la modificación de procesos metabólicos en
plantas. Si un transgén o su producto génico debe intervenir en
rutas metabólicas definidas de una planta, p.ej. debe producir una
nueva sustancia constitutiva, o debe proteger a ésta con respecto de
la infestación por patógenos, su expresión controlada en el espacio
y/o en el tiempo es posible solamente mediando utilización de un
promotor inducible y/o específico para un tejido y/o específico para
el desarrollo. Tan sólo de esta manera se hace posible la producción
planificada de sustancias constitutivas deseadas en un definido
estadio de desarrollo o dentro de un tejido determinado de la
planta. P.ej. para la aplicación de la tecnología antisentido, en la
que se debe impedir la expresión de genes propios de las plantas, es
ventajoso el empleo de promotores específicos para ciertos tejidos
y/o para el desarrollo con respecto a una expresión independiente de
ciertos tejidos y/o del desarrollo, cuando p.ej. el efecto
antisentido aparece exactamente en el estadio de desarrollo, o
respectivamente en el tejido, en el que también es expresado el gen
propio de las
plantas.
plantas.
Ya se conocen un gran número de promotores, que
pueden controlar y regular la expresión de genes transferidos o
genes estructurales en plantas. El promotor utilizado con la máxima
frecuencia es el promotor 35S de CaMV (Franck y colaboradores, Cell
1 (1980), 285-294), que conduce a una expresión
constitutiva del gen introducido.
Con frecuencia, se emplean también promotores
inducibles, por ejemplo para la inducción por lesiones (documento de
solicitud de patente alemana
DE-A-3843628), la inducción química
(Ward y colaboradores, Plant Molec. Biol. 22 (1993),
361-366) o la inducción por luz (Fluhr y
colaboradores, Science 232 (1986), 1106-1112).
La utilización de los promotores constitutivos
frecuentemente descritos (p.ej. el 35S) está vinculada en
determinadas circunstancias con ciertas desventajas. Unos
promotores, que dan lugar a una expresión constitutiva de los genes
controlados por ellos, se pueden emplear por ejemplo para la
producción de plantas tolerantes para herbicidas y resistentes a
patógenos, pero tienen sin embargo la desventaja de que los
productos de los genes controlados por ellos se presentan en todas
las partes de la planta, lo cual puede ser indeseado, p.ej. cuando
las plantas deben servir para la alimentación y nutrición. Un
aspecto negativo de la expresión de un transgén independiente de
tejidos y/o del desarrollo puede consistir, además de esto, en un
efecto indeseado sobre el desarrollo de las plantas. Los promotores
inducibles están vinculados igualmente con desventajas en la
aplicación, puesto que las condiciones de inducción, en el caso de
plantas utilizadas en agricultura en un terreno al aire libre, son
típicamente controlables con
dificultades.
dificultades.
También se describió la utilización de promotores
específicos para ciertas células y ciertos tejidos: promotores
específicos para células de cierre (documento
DE-A-4207358), específicos para
semillas, tubérculos y frutos (recopilados en la cita de Edwards y
Coruzzi, Annu. Rev. Genet. 24 (1990), 275-303;
documento DE-A-3843627), específicos
para leptomas (Schmülling y colaboradores, Plant Cell 1 (1989),
665-670), específicos para nudosidades de raíces
(documento DE-A-3702497) o
específicos para meristemos (Ito y colaboradores, Plant Mol. Biol.
24 (1994),
863-878).
863-878).
Los promotores, que regulan la expresión de genes
en la cariópside, son conocidos hasta ahora en un número limitado.
Para dominar determinados principios de la modificación genética de
plantas, es por lo tanto necesario poner a disposición sistemas
alternativos de promotores para la expresión de genes en la
cariópside, que sean regulados de una manera diferente en
comparación con los promotores conocidos.
A partir de diferentes especies de plantas ya se
aislaron genes de la biosíntesis de almidón, cuyos productos génicos
son expresados específicamente en el tejido de almacenamiento de la
cariópside, pero no en tejidos vegetativos, p.ej. en
correspondientes genes y respectivamente clones de ADNc de la GBSS
I. A éstos pertenece el locus waxy [ceroso] de maíz (Klösgen
y colaboradores (1986) Mol. Gen. Genet. 203:
237-244), así como de cebada (Rohde y colaboradores
(1988) Nucleic Acid Research 16, nº 14: 7185-7186),
de arroz (Wang y colaboradores (1990) Nucleic Acid Research 18:
5898), de patata (van der Leij y colaboradores (1991) Mol. Gen.
Genet. 228: 240-248), de guisante (Dry y
colaboradores (1992) Plant J. 2: 193-202), de
mandioca (Salehuzzaman y colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 20:
947-962), de mijo (Hsingh y colaboradores (1995)
banco de datos del EMBL, nº de acceso U23954) y de remolacha
azucarera (Schneider y colaboradores (1999) Mol. Gen. Genet 262:
515-524). La clonación y la caracterización de un
gen de la sintasa I de almidón procedente de trigo, fueron descritas
por Li y colaboradores (1999, Theor. Appl. Genet. 98:
1208-1216).
A los productos génicos, que son expresados
específicamente en la cariópside, pertenece también la sintasa de
almidón del tipo II (sslI). Correspondientes genes fueron aislados a
partir de maíz (zSslIa y zSslIb; Harn y colaboradores (1998) Plant
Mol. Biol. 37: 639-649), de guisante (Dry y
colaboradores (1992) Plant J. 2: 193-202), de patata
(Edwards y colaboradores (1995) Plant J. 8: 282-294)
y de boniato (Ham y colaboradores (1998) nº de acceso AF068834).
Para el trigo se establece la siguiente
situación: Se aislaron y secuenciaron clones de ADNc (ADN
cromosomal) tanto para el gen waxy como también para el gen
de sslI. En total, se aislaron 3 diferentes clones de ADNc para la
gbss1 procedente de trigo (Clark y colaboradores (1991) Plant Mol.
Biol. 16: 1099-1101; Ainsworth y colaboradores
(1993) Plant Mol. Biol. 22: 67-82 (Block (1997)
"Isolierung. Charakterisierung und Expressionsanalysen von
Stärkesynthase-Genen aus Weizen [Aislamiento,
caracterización y análisis de la expresión de genes de sintasas de
almidón procedentes de trigo" (Triticum aestivum L.),
tesis doctoral, Universidad de Hamburgo).
Además de esto, se han aislado también secuencias
codificadoras de una sintasa de almidón del tipo II (sslI) a partir
de un banco de ADNc, que es específico para cariópsides, y se
comprobó su expresión específica para cariópsides. En análisis según
Northern se mostró que los transcritos de la GBSS I (Block (1997),
tesis doctoral, Universidad de Hamburgo, Facultad de Biología) y de
la sslI (Walter (200), tesis doctoral de la Universidad de Hamburgo,
Facultad de Biología, documento de solicitud de patente
internacional WO 97/45545, banco de datos del EMBL nº de acceso
U66377) aparecen en estadios tempranos del desarrollo de la
cariópside, pero no en un tejido asimilador de hojas. Para la sslI
se pudieron mostrar, además de esto, transcritos en el endospermo y
en el pericarpio.
Tres secuencias de ADNc de la sslI de trigo
(T. aestivum L. cv. (variedad cultivar) "Wyuna";
wSslI-A1, wSslI-B1,
wSslI-D1) fueron aisladas además a partir de un
banco de ADNc específico para el endospermo (Li y colaboradores,
(1999) Plant Phys. 120: 1147-1155). Mediante
análisis por PCR (de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena
de la polimerasa) se asoció con cada uno de los tres genes un genoma
del trigo hexaploide. En análisis por transferencia de borrón
Western se pudo mostrar que la proteína de 100 kDa
(SGP-B1) se presenta en estadios tempranos del
desarrollo del endospermo tanto fijada a granos de almidón, como
también en forma soluble. Entretanto se han descrito el aislamiento
y la caracterización de otros clones de ADNc de la sslI (Triticum
aestivum L. cv. "Fielder", Ss2a-1,
Ss2a-2, Ss2a-3) (Gao & Chibbar
(2000) Genome 43: 768-775).
Un clon de ADNc de una sintasa de almidón del
tipo II (GBSS II), fijada a granos de almidón, que no se expresa en
el endospermo, sino solamente en hojas y en el pericarpio de trigo,
se pudo aislar hace poco tiempo (Vrinten & Nakamura (2000) Plant
Physiol. 122: 255-263). Elementos reguladores
específicos de la aleurona de trigo se pudieron obtener a partir del
gen W1 de la proteína de transferencia de lípidos (Ltp) (documento
de patente de los EE.UU. US 6.013.862). En un trigo diploide
(Triticum monococcum L.) Denyer y colaboradores (1995, Planta
196: 256-265) habían identificado varias isoformas
de la sintasa de almidón (GBSS y SS). Además, en el plano de las
proteínas se describió una isoforma, con un tamaño de 56 kDa, de una
GBSS (Fujita & Taira (1998, Planta 207:
125-132). Esta isoforma se puede detectar en el
pericarpio, la aleurona y el embrión de cariópsides no
maduras.
maduras.
Además, se conocen estructuras y secuencias de
enzimas de ramificación y de desramificación (documento WO 99/14314)
así como secuencias EST de trigo Durum (Anderson y colaboradores
(2000), banco de datos del NCBI, nº de acceso BE428407).
Mientras que entretanto se aislaron tres genes
estructurales waxy homólogos, que están situados en los
cromosomas 7A, 4A y 7D del trigo hexaploide (Murai y colaboradores
(1999) Gene 234: 71-79), hasta ahora se desconocen
las secuencias de promotores de este y otros clones genómicos de
trigo. Se conocen solamente las regiones flanqueadoras en 5' de la
GBSS I de cebada (banco de genes GenBank nº de acceso X07931), de
hierba becerra (banco de genes GenBank nº de acceso AJ006294), de
arroz (banco de genes GenBank nº de acceso AB008794, AB008795), de
patata (banco de genes GenBank nº de acceso X58453) y de maíz (banco
de genes GenBank nº de acce-
so X03935).
so X03935).
El documento W0 00/66745 divulga que la expresión
de ARNm (mensajero) de la sslI de trigo es, con distancia, la más
elevada en hojas.
Para la resolución de planteamientos de problemas
complejos en conexión con la expresión de genes en organismos
modificados genéticamente, es necesario por lo tanto poder escoger
entre diferentes sistemas de promotores con especificidad diversa.
El presente invento presta una contribución para esto.
El presente invento se basa por consiguiente en
la misión de poner a disposición agentes que hagan posible una
expresión planificada de genes, específica para cariópsides, en
plantas modificadas genéticamente, preferiblemente en plantas
monocotiledóneas.
Mediante el empleo de los agentes conformes al
invento, es decir de las moléculas de ácidos nucleicos, los
vectores, las células o las plantas conformes al invento, se hace
posible una intervención definida, específica para un tejido y/o
para el desarrollo, en el metabolismo vegetal, p.ej. en la
biosíntesis de almidones, grasas o proteínas de almacenamiento. o
también el aprovechamiento de la cariópside como órgano de
almacenamiento o síntesis para sustancias de reserva (p.ej.
poliglucanos, almidones, ácidos grasos, grasas, proteínas de
almacenamiento eventualmente modificadas o materiales sintéticos
biopoliméricos).
Bajo el control de las moléculas de ácidos
nucleicos, y respectivamente de las secuencias de promotores,
conformes al invento se pueden expresar por consiguiente genes, en
particular durante el desarrollo de granos de cereales, de una
manera específica y en un momento temprano, en la cariópside.
Mediante las secuencias de promotores conformes
al invento se pueden suprimir, además de esto, genes, en particular
durante el desarrollo de los granos de cereales, de una manera
específica y en un momento temprano en la cariópside, mediante las
denominadas estrategias "gene silencing" [silenciadoras de
genes] (de cosupresión). Ciertas estrategias de cosupresión mediando
empleo de promotores se han descrito detalladamente por Vaucheret y
colaboradores (Vaucheret y colaboradores, 1998, 16(6),
651-659). En particular, se ha de hacer por
consiguiente parte de esta solicitud por su referencia el párrafo de
"transcriptional trans inactivation" [desactivación en trans
de la transcripción] en la página 652 del artículo de Vaucheret y
colaboradores, que describe especialmente estrategias de
cosupresión, para las que son apropiados los promotores conformes al
invento, en particular los que se pueden designar allí como de
"ectopic trans-inactivation" [desactivación
ectópica en trans] (Matzke y colaboradores, 1994, Mol. Gen. Genet.
244, 219-229). De tal manera, los promotores
conformes al invento se pueden utilizar para suprimir la expresión
génica de genes arbitrarios, que están bajo el control de un
promotor, que es accesible como diana para la cosupresión mediante
los promotores conformes al invento. Eventualmente, ya es suficiente
para esto un segmento de secuencia con una longitud de sólo
aproximadamente 90 pb (pares de bases).
Los promotores conformes al invento hacen
posibles por consiguiente modificaciones deliberadas del almidón de
almacenamiento. Con el fin de hacer posible, además de esto, una
utilización lo más variada y múltiple que sea posible de un almidón
para diferentes necesidades industriales, es deseable poner a
disposición plantas que sinteticen almidones con unas propiedades
definidas. Así, p.ej. propiedades decisivas para la industria
elaboradora, tales como la solubilidad, el comportamiento de
engrudamiento, la tendencia a la retrogradación, la viscosidad y
capacidad de formación de complejos, se determinan mediante la
relación de amilosa y amilopectina entre ellas, el grado de
ramificación de la amilopectina y la derivatización de los
polímeros. Una modificación deliberada de tales propiedades
reemplaza a costosos procedimientos para la separación de amilosa y
amilopectina o la costosa modificación química de un almidón.
Una posibilidad limitada de obtener plantas con
un almidón de almacenamiento modificado, consiste en la aplicación
de clásicos métodos de cultivación. Mediante cruce de mutantes que
aparecen espontáneamente, se consiguió por ejemplo la producción de
un trigo ceroso = "waxy" (exento de amilosa) (Nakamura y
colaboradores (1995) Mol. Gen. Genet. 248: 253-259).
A causa del carácter poliploide del trigo para panificación,
comercialmente importante, no se pueden reconocer con facilidad
mutaciones, que conciernen a la estructura del almidón, puesto que
ellas son compensadas por alelos intactos. La aplicación de métodos
clásicos de cultivación se manifiesta por lo tanto como difícil.
Además, solamente se puede recurrir a actividades enzimáticas ya
existentes. Nuevas actividades, que hasta ahora no se identificaron
en plantas, o que se identificaron en plantas (u otros organismos),
que no se pueden cruzar con la planta diana, tampoco se pueden
elaborar con ayuda de procedimientos de culti-
vación.
vación.
Una alternativa a los métodos clásicos de
cultivación consiste en la modificación deliberada de plantas
productoras de almidón mediante procedimientos de tecnología
genética. Una premisa para esto es, sin embargo, junto a la
identificación y el aislamiento de genes, cuyos productos génicos
participan en la síntesis de almidones y/o en la modificación de
almidones, el empleo de promotores específicos, que median en una
expresión, específica para un tejido y/o para el desarrollo, de los
genes controlados por ellos en los tejidos que forman almidones.
Además, mediante el empleo de las secuencias de
promotores conformes al invento se pueden integrar en el genoma de
plantas unos genes que confieren al endospermo de un cereal una
función modificada como tejido de almacenamiento, p.ej. para el
almacenamiento de sustancias de almacenamiento que no se pueden
asociar con los
almidones.
almidones.
Los problemas planteados por estas misiones se
resuelven, conforme al invento, mediante las formas de realización
caracterizadas en las reivindicaciones de esta patente.
Dentro del marco del presente invento se encontró
que, de manera sorprendente, un promotor, tal como se define
seguidamente, produce una expresión específica para cariópsides de
una secuencia de nucleótidos, codificadora, controlada por él, en
plantas.
Una alternativa a los métodos clásicos de
cultivación consiste en la modificación deliberada de plantas
productoras de almidón mediante procedimientos de tecnología
genética. Una premisa para esto es, sin embargo, junto a la
identificación y el aislamiento de genes, cuyos productos génicos
participan en la síntesis de almidones y/o en la modificación de
almidones, el empleo de promotores específicos, que median en una
expresión, específica para un tejido y/o para el desarrollo, de los
genes controlados por ellos en los tejidos que forman almidones.
Además, mediante el empleo de las secuencias de
promotores conformes al invento se pueden integrar en el genoma de
plantas unos genes que confieren al endospermo de un cereal una
función modificada como tejido de almacenamiento, p.ej. para el
almacenamiento de sustancias de almacenamiento que no se pueden
asociar con los
almidones.
almidones.
Los problemas planteados por estas misiones se
resuelven, conforme al invento, mediante las formas de realización
caracterizadas en las reivindicaciones de esta patente.
Dentro del marco del presente invento se encontró
que, de manera sorprendente, un promotor, tal como se define
seguidamente, produce una expresión específica para cariópsides de
una secuencia de nucleótidos, codificadora, controlada por él, en
plantas.
Por consiguiente, el presente invento se refiere
a una molécula de ácido nucleico con la función de un promotor
específico para cariópsides, que
a) comprende la secuencia de ácido nucleico que
es definida por los nucleótidos 1-4.683 de la Seq ID
No. 1, de modo correspondiente a la depositada a través de DSM 14224
(plásmido p 15/G);
b) comprende uno o varios elementos de
secuencias, que se seleccionan entre el conjunto que consiste
en:
\vskip1.000000\baselineskip
- i)
- (Seq ID No. 2);
- ii)
- (Seq ID No. 3);
- iii)
- (Seq ID No. 4);
- iv)
- (Seq ID No. 5);
- v)
- (Seq ID No. 6);
- vi)
- (Seq ID No. 7);
- vii)
- (Seq ID No. 8);
- viii)
- (Seq ID No. 9) y
- ix)
- (Seq ID No. 10);
\newpage
c) comprende una parte funcional de la secuencia
de ácido nucleico mencionada en a);
d) comprende una secuencia que se híbrida con por
lo menos una de las secuencias de ácidos nucleicos que se mencionan
en a) y/o b); y/o
e) comprende una secuencia que es idéntica a una
de las secuencias de ácidos nucleicos que se mencionan en a) en por
lo menos un 60%, preferiblemente en por lo menos un 75%, en
particular en por lo menos un 90% y de modo muy especialmente
preferido en por lo menos un 95%.
\vskip1.000000\baselineskip
La Seq ID No. 1 es como sigue:
Además, es objeto del presente invento una
molécula de ácido nucleico con la función de un promotor específico
para cariópsides, que
- a)
- comprende uno o varios elementos de secuencias, que se seleccionan entre el conjunto que consiste en
- i)
- ii)
- iii)
- iv)
- v)
- vi)
- vii)
\newpage
- viii)
- ix)
- así
- como
- b)
- comprende una parte funcional de la Seq ID No. 1, preferiblemente uno o varios elementos de secuencias tomados del conjunto que consiste en los nucleótidos de las posiciones 1-72, 78-194, 200-402, 409-579, 588-734, 743-837, 852-865, 872-940, 948-957, 962-1.113, 1.120-1.180, 1.186-1.218, 1.227-1.330, 1.336-1.538, 1.545-1.567, 1.574-1.589, 1.597-2.015, 2.021-2.043, 2.052-2.087, 2.096-2.276, 2.292-2.320, 2.336-2.352, 2.361-2.470, 2.478-2.531, 2.540-2.602, 2.609-2.712, 2.721-2.786, 2.794-2.870, 2.883-2.937, 2.943-2.979, 2.986-3.048, 3.056-3.073, 3.080-3.098, 3.106-3.133, 3.142-3.155, 3.163-3.197, 3.205-3.289, 3.302, 3.311-3.317, 3.318-3.405, 3.414-3.446, 3.453-3.533,3.541-3.570, 3.578-3.617, 3.625-3.750, 3.757-3.978, 3.988-4.031, 4.038-4.109, 4.116-4.145, 4.153-4.173, 4.180-4.294, 4.301-4.419, 4.427-4.449, 4.456-4.466, 4.474-4.480, y 4.489-4.683 de la Seq ID No. 1.
Dentro del marco del presente invento se utilizan
como sinónimos los conceptos de "molécula de ácido nucleico
conforme al invento" y "promotor conforme al invento".
En una forma preferida de realización, los
promotores conformes al invento son los de genes de plantas,
preferiblemente de plantas monocotiledóneas, o se derivan de tales
genes. En otra forma preferida de realización, los promotores
conformes al invento son apropiados para la expresión o supresión de
genes en organismos modificados genéticamente, de manera preferida
en plantas, algas o levaduras modificadas genéticamente,
especialmente en plantas monocotiledóneas modificadas genéticamente,
y en particular para la expresión o supresión de genes de sintasas
de almidón en los mencionados organismos modificados genéticamente.
Los promotores conformes al invento pueden proceder en tal caso de
genes de plantas, se pueden obtener a partir de algas o levaduras,
pueden ser modificados mediante técnicas de ADN recombinante y/o se
pueden preparar de una manera sintética.
Los promotores conformes al invento se pueden
modificar p.ej. combinándolos con otros elementos reguladores en
cis. Así, los promotores conformes al invento se pueden
combinar adicionalmente con elementos intensificadores (del inglés
enhancers), con el fin de reforzar la expresión de la
correspondiente molécula de ácido nucleico, pero sin influir sobre
su expresión específica para un tejido. También se pueden combinar
entre ellos elementos en cis de los promotores aislados
(véase más adelante) asimismo para formar unidades reguladoras.
Una medida de la actividad de un promotor es por
ejemplo la tasa de expresión averiguada para un determinado gen
marcador, que está bajo el control regulador del promotor conforme
al invento. Ejemplos de apropiados genes marcadores son el gen de la
\beta-glucuronidasa (gus) procedente de E.
coli (Jefferson (1987) Plant Molecular Biology Reporter Vol. 5
(4): 387-405) o el gen de la proteína de
fluorescencia verde (gfp de green fluorescence protein) (Baulcombe y
colaboradores, Plant J. 7 (16) (1993), 1045-1053).
La especificidad para ciertos órganos y respectivamente tejidos se
puede determinar fácilmente mediante comparación de las tasas de
expresión para los mencionados genes marcadores, que se han
averiguado en tejidos y respectivamente órganos individuales de la
planta. Unas partes funcionales de la secuencia de promotor conforme
al invento comprenden, dentro del marco del presente invento, tanto
variantes presentes en la naturaleza, como también secuencias de
nucleótidos artificiales, p.ej. obtenidas por mutagénesis o síntesis
química.
En conexión con el presente invento se entiende
por un "promotor" una secuencia de ADN que comprende la parte
reguladora de un gen, preferiblemente de un gen estructural. Por la
"parte reguladora" de un gen se entiende la parte que determina
las condiciones de expresión del gen. La parte reguladora posee unos
motivos de secuencias, con los que pasan a interactuar factores de
transcripción y polimerasa(s) de ARN, y que inician la
transcripción de la parte codificadora del gen. Además de esto, la
parte reguladora puede comprender uno o varios elementos reguladores
positivos, los denominados "intensificadores". Ésta puede
contener adicionalmente, o en su lugar,sin embargo también elementos
reguladores negativos, los denominados "silenciadores". Por un
"gen estructural" se entiende por lo general una unidad
genética a base de una parte reguladora y de una parte codificadora,
cuyo producto génico es por lo general una proteína. La información
para la secuencia primaria de aminoácidos del producto génico está
contenida en la parte codificadora del gen estructural, mientras que
la parte reguladora determina cuándo, en qué tejidos, en qué
condiciones fisiológicas y en qué cantidades se forma el transcrito
de la parte codificadora, después de cuya disposición previa es
sintetizado el producto génico.
Por el concepto de "específico para
cariópsides" se entiende, dentro del marco del presente invento,
el hecho de que un gen puesto bajo el control de un promotor
conforme al invento es expresado en la cariópside, es decir en el
endospermo, el pericarpio, la aleurona, el embrión, y/o el escutelo,
preferiblemente en un momento temprano, es decir antes que 15 dap
(dap = días después de la fructificación), preferiblemente antes que
10 dap, de manera especialmente preferida antes que 6 dap . Para la
mencionada "expresión temprana" sirve en el sentido del
presente invento un limite inferior para el momento de expresión de
preferiblemente 5 dap, de manera especialmente preferida de 3 dap,
en particular de 2 dap y de manera muy especialmente preferida de 1
dap. Especialmente, la especificidad para cariópsides se presenta,
en el marco del presente invento, cuando el promotor conforme al
invento favorece la expresión de un gen en la cariópside,
preferiblemente en el endospermo central de almidón, en comparación
con otros tejidos, tales como p.ej. hojas o raíces maduras, y en la
cariópside produce una elevación importante, es decir por lo menos
de 2 a 5 veces mayor, preferiblemente de 5 a 10 veces mayor, en
particular de 10 a 100 mayor, o más alta.
En conexión con el presente invento, la
especificidad para cariópsides se puede analizar p.ej. mediante
experimentos por genes reporteros. Para el ensayo de una secuencia
de promotor aislada con el fin de determinar su actividad como
promotor en una cariópside, el promotor se puede unir
operativamente, por ejemplo en una casete de expresión y
respectivamente en un vector para la transformación de plantas, con
un gen reportero, tal como p.ej. el gen de la
\beta-glucuronidasa procedente de E. coli.
Esta construcción es utilizada entonces para la transformación de
plantas. A continuación, la expresión de la
\beta-glucuronidasa en la cariópside es
determinada en comparación con otros tejidos, tales como p.ej. hojas
o raíces maduras, tal como se describe p.ej. en la cita de Martín y
colaboradores (The GUS Reporter System as a Tool to Study Plant Gene
Expression, In: GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of
Gene Expression [El sistema de reportero de GUS como herramienta
para la estudiar la expresión de genes de plantas, en: Protocolos de
GUS, uso del gen de GUS como un reportero de la expresión de
genes], Academic Press (1992), 23-43).
El concepto de "cariópside" es habitual para
un experto en la especialidad y abarca en particular el pericarpio y
el endospermo. Puestos que estos tejidos atraviesan un desarrollo
dinámico, p.ej. el desarrollo del endospermo en diferentes tipos de
células o tejidos se correlaciona con diversas actividades
bioquímicas, de un modo condicionado por una expresión génica
diferencial. Como complemento se remitirá a la cita de Olsen y
colaboradores (Olsen y colaboradores, 1999, Trends in Plant Science
4 (7), 253-257).
El promotor conforme al invento permite una
expresión génica, específica para cariópsides, de una secuencia de
nucleótidos codificadora, controlada por él. Este constituye una
interesante alternativa a los conocidos promotores específicos para
el endospermo, puesto que es activo en un momento muy temprano en la
cariópside, es decir <15 dap, preferiblemente <10 dap, en
particular <6 dap (dap = días después de la fecundación). Con
ayuda del promotor conforme al invento se puede regular
efectivamente de modo especial la expresión de genes, cuyos
productos génicos participan en el metabolismo de almidones en
plantas monocotiledóneas y en particular en trigo.
Numerosas y variadas posibilidades de utilización
están a disposición, además de esto, para los promotores conformes
al invento. Por ejemplo, se hace posible la producción de plantas
transgénicas, que, a causa de un metabolismo modificado en la
cariópside, tienen una composición de sustancias almacenadas, que ha
sido modificada cualitativa y/o cuantitativamente en su tejido de
almacenamiento, es decir en el grano de un cereal.
Junto al promotor, que tiene toda la secuencia
definida por los nucleótidos 1 a 4.683 de la SEQ ID No. 1, y
respectivamente la secuencia depositada correspondientemente a
través de DSM 14224, el presente invento se refiere también a
promotores, que tienen una parte funcional de esta secuencia y que
producen en plantas una expresión específica para cariópsides de una
secuencia de nucleótidos, codificadora, controlada por ellos.
Por una "parte funcional" del promotor
conforme al invento se entienden dentro del marco del presente
invento aquellas secuencias, que no comprenden la secuencia completa
del promotor tal como se define por los nucleótidos
1-4.683 de SEQ ID No. 1, y que respectivamente se ha
depositado a través de DSM 14224, sino que se han acortado. A pesar
del acortamiento, una "parte funcional del promotor conforme al
invento" tiene la especificidad para cariópsides, conforme al
invento. Secuencias que contienen una parte funcional del promotor
conforme al invento de la Seq. ID No. 1, tienen preferiblemente uno
o varios de los segmentos seguidamente enumerados de la SEQ ID No.
1: 1-72, 78-194,
200-402, 409-579,
588-734, 743-837,
852-865, 872-940,
948-957, 962-1.113,
1.120-1.180, 1.186-1.218,
1.227-1.330, 1.336-1.538,
1.545-1.567, 1.574-1.589,
1.597-2.015, 2.021-2.043,
2.052-2.087, 2.096-2.276,
2.292-2.320, 2.336-2.352,
2.361-2.470, 2.478-2.531,
2.540-2.602, 2.609-2.712,
2.721-2.786, 2.794-2.870,
2.883-2.937, 2.943-2.979,
2.986-3.048, 3.056-3.073,
3.080-3.098, 3.106-3.133,
3.142-3.155,
3.163-3.197, 3.205-3.289, 3.302, 3.311-3.317, 3.318-3.405, 3.414-3.446, 3.453-3.533, 3.541-3.570, 3.578-3.617,
3.625-3.750, 3.757-3.978, 3.988-4.031, 4.038-4.109, 4.116-4.145, 4.153-4.173, 4.180-4.294, 4.301-4.419, 4.427-4.449, 4.456-4.466, 4.474-4.480 y 4.489-4.683. Las cifras indicadas significan las posiciones de nucleótidos en la Seq ID No. 1.
3.163-3.197, 3.205-3.289, 3.302, 3.311-3.317, 3.318-3.405, 3.414-3.446, 3.453-3.533, 3.541-3.570, 3.578-3.617,
3.625-3.750, 3.757-3.978, 3.988-4.031, 4.038-4.109, 4.116-4.145, 4.153-4.173, 4.180-4.294, 4.301-4.419, 4.427-4.449, 4.456-4.466, 4.474-4.480 y 4.489-4.683. Las cifras indicadas significan las posiciones de nucleótidos en la Seq ID No. 1.
Por una "parte funcional" de la secuencia de
promotor conforme al invento se entienden en particular también unas
mutaciones naturales o artificiales de una secuencia de promotor
obtenible originalmente, que tienen las características conformes al
invento. El concepto de "mutación" comprende en este caso la
sustitución, la adición, la deleción, la permuta y/o la inserción de
uno o varios nucleótidos y respectivamente motivos de nucleótidos,
en particular de los denominados "elementos en cis"
(véase más adelante). La finalidad de tales modificaciones puede ser
p.ej. la producción de fragmentos, la introducción o la
transposición de motivos conocidos de nucleótidos, tales como p.ej.
sitios de corte por restricción o elementos en cis. Por
consiguiente, se abarcan por el presente invento por ejemplo también
aquellas secuencias de nucleótidos, que son obtenibles mediante
modificación de la secuencia de promotor definida por los
nucleótidos 1-4.683 de la Seq ID No. 1 y
respectivamente la depositada a través de DSM 14224, y que tienen
características estructurales y funcionales que son esenciales
conforme al invento.
Las "partes funcionales" de la secuencia de
promotor conforme al invento comprenden también aquellas variantes
de promotores, cuya actividad promotora, comparada con la del
promotor no modificado, es decir obtenible de un modo natural (de
tipo salvaje), se ha debilitado o reforzado.
En particular, se entienden por una "parte
funcional" de la secuencia de promotor conforme al invento las
regiones identificables mediante un análisis por deleción (compárese
la parte de Ejemplos), preferiblemente los segmentos de secuencias
2.241-4.683; 2.637-4.683;
3.569-4.683; 4.071-4.683;
4.151-4.683 y 4.403-4.683 de la Seq
ID No. 1.
En principio, la actividad de un promotor de
polimerasa II de ARN eucariótico se debe a la cooperación sinérgica
de diferentes factores activos en trans (moléculas de fijan
un ADN, tales como proteínas u hormonas), que se fijan a los
diferentes elementos de ADN reguladores en cis ("elementos
en cis") presentes en el promotor, por regla general
regiones de ADN con una longitud de aproximadamente
10-20 nucleótidos. Estos factores interactúan
directa o indirectamente con factores individuales o múltiples de la
maquinaria de transcripción basal, lo cual a fin de cuentas conduce
a la formación de un complejo previo a la iniciación en la
proximidad del sitio de comienzo de la transcripción (Drapkin y
colaboradores, Current Opinión in Cell Biology 5 (1993),
469-476). Se puede partir de una constitución
modular de promotores de la polimerasa II de ARN eucariótico,
determinando los elementos en cis (módulos), como componentes
parciales del promotor, en particular la actividad de éste (Tjian y
Maniatis, Cell 77 (994),
5-8).
5-8).
Subdominios individuales del promotor conforme al
invento, que median potencialmente en una especificidad para
tejidos, se pueden identificar por ejemplo mediante fusión con una
casete de gen reportero de promotor mínimo. Por un promotor mínimo
se entiende una secuencia de ADN, que comprende una caja TATA, que
se encuentra aproximadamente a 20 hasta 30 pares de bases secuencia
arriba del sitio de comienzo de la transcripción, o una secuencia de
iniciador (Smale y Baltimore, Cell 57 (1989),
103-113; Zawel y Reinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. 44
(1993), 67-108; Conaway y Conaway, Annu. Rev.
Biochem 62 (1993), 161-190). Ejemplos de promotores
mínimos son el promotor \Delta35S desde -63 hasta +8 (Frohberg,
tesis doctoral en la Universidad Libre de Berlín, Facultad de
Biología (1994), el promotor mínimo de la patatina ClassI desde -332
hasta +14 así como el promotor mínimo de PetE desde -176 hasta +4
(Pwee y colaboradores, Plant J. 3 (1993),
437-449).
Además, subdominios y respectivamente elementos
en cis del promotor conforme al invento se pueden identificar
también mediante análisis por deleción y respectivamente mutagénesis
(Kawagoe y colaboradores, Plant J 5(6) (1994),
885-890). El ensayo en cuanto a la funcionalidad de
uno de tales subdominios o elementos en cis del promotor se
puede efectuar in planta (en la planta) mediante la detección
de la actividad de un gen reportero en células transformadas de una
manera estable.
En otra forma de realización, el presente invento
se refiere por lo tanto en particular a modificaciones de Seq ID No.
1, que se han obtenido por dimerización o multimerización de
subdominios, y respectivamente elementos en cis de SEQ ID No.
1, en particular de la secuencia de nucleótidos
1-4.683 de la Seq ID No. 1.
En otra forma de realización adicional del
invento, la elevación de la actividad del promotor, en comparación
con el tipo salvaje, se consigue mediante la combinación del
promotor conforme al invento con uno o varios intensificadores. En
la bibliografía se han descrito diferentes elementos
intensificadores, que por regla general producen una elevación de la
expresión que es específica para tejidos, siendo determinada la
especificidad para tejidos, por lo general, mediante los
intensificadores en cada caso utilizados (Benfey y colaboradores,
Science 250 (1990), 959-966; Benfey y colaboradores,
EMBO J. 8 (1989), 2195-2202; Chen y colaboradores,
EMBO J 7, (1988), 297-302; Simpson y colaboradores,
Nature 323 (1986), 551-554).
Además de esto, existen también elementos
intensificadores, tales como p.ej. el intensificador de PetE (Sandhu
y colaboradores, Plant Mol. Biol. 37 (1998),
885-896), que no actúan de un modo específico para
ciertos tejidos y por consiguiente se pueden disponer, como
elementos reforzadores cuantitativos, delante del promotor conforme
al invento, con el fin de elevar la tasa de expresión del gen
controlado en la cariópside, sin modificar la especificidad para
tejidos del promotor conforme al invento.
Además, se pueden utilizar también los elementos
intensificadores sintéticos conocidos para un experto en la
especialidad, que se derivan por ejemplo de intensificadores
presentes en la naturaleza, y/o que se obtienen por una combinación
de elementos intensificadores.
Asimismo, el presente invento se refiere también
a promotores, que tienen una secuencia de nucleótidos, que se
hibridan con la secuencia de nucleótidos definida por los
nucleótidos 1-4.683 de la SEQ ID No. 1 y
respectivamente depositada a través de DSM 14224, preferiblemente en
condiciones rigurosas, y que ejercen en plantas una influencia
específica para cariópsides sobre la expresión de una secuencia de
nucleótidos codificadora, controlada por ellos.
La expresión "condiciones rigurosas"
significan en este contexto por ejemplo unas condiciones de
hibridación, tal como se describen en la obra de Sambrook y
colaboradores (Molecular Cloning, a Laboratory Manual [Clonación
molecular, un manual de laboratorio], 2ª edición (1989), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). En particular, una
hibridación rigurosa tiene lugar en las siguientes condiciones:
tampón de hibridación: 2 x SSC; 10x solución de Denhardt (Fikoll 400
+ PEG + BSA; relación 1:1:1); SDS al 0,1%, EDTA 5 mM;
Na_{2}HPO_{4} 50 mM; 250 \mug/ml de ADN de esperma de arenque,
50 \mug/ml de ARNt (ARN transportador) o un tampón de fosfato de
sodio 0,25 M, de pH 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 7%, temperatura de
hibridación T = 65 a 68ºC; tampón de lavado 0,2 x SSC; SDS al 0,1%;
temperatura de lavado T = de 65 a 68ºC.
Preferiblemente, tales promotores tienen una
identidad entre secuencias de por lo menos 30%, de manera
especialmente preferida de por lo menos 40%, de manera muy preferida
de por lo menos 50%, de manera especialmente preferida de por lo
menos 60%, de manera preferida en particular de por lo menos 70%, de
manera muy especialmente preferida de por lo menos 80%, de manera
muy especialmente preferida de por lo menos 90% y en particular de
manera preferida muy especialmente de por lo menos 95%, con respecto
a los nucleótidos 1-4.683 de la Seq ID No. 1 o de
partes funcionales de la misma conformes al invento.
El grado de la identidad entre secuencias con el
promotor conforme al invento se puede determinar mediante una usual
comparación entre secuencias con los nucleótidos
1-4.683 de la SEQ ID No. 1. Cuando dos secuencias
que se han de comparar tienen una longitud distinta, entonces la
identidad entre secuencias se refiere preferiblemente a la porción
porcentual de los radicales de nucleótidos de la secuencia más
corta, que son idénticos a los radicales de nucleótidos de la
secuencia más larga. La identidad entre secuencias se puede
determinar usualmente mediante utilización de ciertos programas de
ordenador, tales como p.ej. el programa Bestfit (Wisconsin Sequence
Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group,
University Research Park, 575 ScienDrive Madison, WI 53711). El
Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman,
Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489,
con el fin de determinar el segmento que tiene la máxima identidad
entre secuencias. En el caso de la utilización del Bestfit o de otro
programa de alineación de secuencias para la determinación de si una
secuencia determinada es idéntica por ejemplo en un 95% a una
secuencia de referencia del presente invento, los parámetros se
ajustan preferiblemente de una manera tal que se calcula la
proporción porcentual de la identidad a lo largo de toda la longitud
de la secuencia de referencia y que están permitidas unas lagunas de
homología ("gaps" = intersticio) de hasta 5% del número total
de los nucleótidos, en la secuencia de referencia. En el caso de la
utilización del Bestfit se pueden dejar los denominados parámetros
opcionales en sus valores previamente ajustados ("default" =
por omisión). Las desviaciones, que aparecen al realizar la
comparación de una secuencia dada con las secuencias del invento
antes descritas, pueden ser causadas por ejemplo por adición,
deleción, sustitución, inserción o recombinación. Las secuencias de
promotores que, como antes se ha descrito, se hibridan con los
nucleótidos 1-4.683 de la SEQ ID No. 1 y
respectivamente de la correspondiente secuencia de nucleótidos
depositada a través de DSM 14224, proceden preferiblemente de
organismos vegetales, de manera preferida de plantas superiores, de
manera especialmente preferida de plantas monocotiledóneas, de
manera preferida en particular de gramíneas, y de manera muy
especialmente preferida de plantas del género
Triticum.
Triticum.
Además, el presente invento se refiere también a
promotores, que tienen una parte funcional de estas secuencias, y
que dan lugar en plantas a una expresión específica para cariópsides
de una secuencia de nucleótidos, codificadora, controlada por ellos,
y que comprenden una o varias de las secuencias seleccionadas entre
el conjunto que consiste en los nucleótidos 1-4.683
de las Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq
ID No. 5, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7, Seq ID No. 8, Seq ID No. 9 y
Seq ID No. 10.
El presente invento se refiere además a casetes
de expresión, que contienen uno o varios de los promotores conformes
al invento. Por el concepto de "casete de expresión" se
entiende en este contexto la combinación de un promotor conforme al
invento con una secuencia de ácido nucleico que se ha de expresar.
Esta secuencia de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una
secuencia que codifica un polipéptido, p.ej. un gen, que puede estar
unido con el promotor en una orientación del mismo sentido o
antisentido. La secuencia de ácido nucleico puede codificar también
un ARN no traducible, por ejemplo un ARN antisentido o una ribozima.
Estas secuencias de ácidos nucleicos se pueden usar en vinculación
con el promotor conforme al invento, con el fin de producir plantas
con un fenotipo modificado.
Las casetes de expresión conformes al invento
pueden contener además una secuencia de terminación de la
transcripción situada secuencia abajo del extremo 3' de la secuencia
de ácido nucleico unida con el promotor. Como una "secuencia de
terminación de la transcripción" se entiende en este contexto una
secuencia de ADN, que está localizada junto al extremo 3' de un
segmento codificador de un gen y que está en situación de provocar
la terminación de la transcripción y eventualmente la síntesis de
una cola de poli-A. Un ejemplo de una de tales
secuencias de terminación es el gen de la sintasa de octopina. Otras
más son bien conocidas para un experto en la especialidad. Además,
el presente invento se refiere a un vector, que contiene uno o
varios promotores y respectivamente casetes de expresión conformes
al invento.
En otra forma de realización adicionalmente
preferida, el promotor está unido en el vector conforme al invento
con sitios de corte por restricción y respectivamente con un
poliengarzador, que permiten una integración de secuencias
arbitrarias situadas secuencia abajo del promotor. En este contexto
se entiende como un "poliengarzador" una secuencia de ADN que
contiene secuencias de reconocimiento de por lo menos tres enzimas
de restricción, preferiblemente de 5 o más enzimas de
restricción.
En una forma especialmente preferida de
realización, el vector conforme al invento contiene adicionalmente
una secuencia para la terminación de la transcripción, por ejemplo
la del gen de sintasa de octopina, situada secuencia abajo del
promotor y respectivamente del poliengarzador.
Por consiguiente, el presente invento se refiere
asimismo a vectores, que contienen una o varias casetes de expresión
conformes al invento. Eventualmente, los vectores conformes al
invento contienen unos marcadores de selección, que son apropiados
para identificar con facilidad, y eventualmente seleccionar después
de la transformación, células, que contienen los vectores conformes
al invento.
En una forma preferida de realización, los
vectores conformes al invento son apropiados para la transformación
de células de plantas y de manera especialmente preferida para la
integración de un ADN ajeno (p.ej. transgenes) en el genoma vegetal.
Un ejemplo de tales vectores son vectores binarios, que en parte son
obtenibles comercialmente.
Además, el presente invento se refiere a células
anfitrionas, que están modificadas genéticamente con una molécula de
ácido nucleico conforme al invento y respectivamente con un promotor
conforme al invento, con una casete de expresión conforme al invento
o con un vector conforme al invento, en particular células de
plantas o células de microbios, p.ej. del género
Agrobacterium.
El concepto de "modificada genéticamente"
significa en este contexto el hecho de que la célula anfitriona
contiene un promotor conforme al invento, una casete de expresión
conforme al invento o un vector conforme al invento, que se ha
integrado preferiblemente de una manera estable en el genoma de la
célula anfitriona, y que el promotor y respectivamente la casete de
expresión, o bien se había incorporado en la célula anfitriona o
previamente se había incorporado como ADN ajeno en una precursora de
esta célula. Las células anfitrionas conformes al invento pueden ser
por lo tanto por sí mismas el producto inmediato de una
transformación en el sentido del presente invento, o pueden proceder
de aquellas células, que contienen un promotor conforme al invento o
una casete de expresión conforme al invento. Como células
anfitrionas entran en cuestión tanto células procarióticas, en
particular de bacterias, como también células eucarióticas. Las
células eucarióticas pueden ser de origen vegetal, pero pueden
proceder también de hongos, en particular del género
Saccharomyces.
En otra forma de realización adicional, el
invento se refiere a la utilización de vectores conformes al
invento, de casetes de expresión conformes al invento o de células
anfitrionas conformes al invento, en particular del género
Agrobacterium, para la transformación de plantas y de
células, tejidos o partes de plantas.
En una forma de realización especialmente
preferida, las células anfitrionas conformes al invento son células
de plantas, que en lo sucesivo se designan como "células de
plantas transgénicas".
Además, el presente invento se refiere también a
plantas que contienen células de plantas conformes al invento. Éstas
pueden pertenecer fundamentalmente a cualquier especie, género,
familia, orden y respectivamente clase de plantas que sean
aprovechables industrialmente. Éstas pueden ser plantas tanto
monocotiledóneas como también dicotiledóneas. Preferiblemente, las
plantas conformes al invento son plantas útiles, es decir plantas
que presentan interés para la economía agrícola, la economía
forestal y/o la economía de jardinería. Se prefieren en este
contexto plantas útiles agrícolas, en particular especies de
cereales tales como p.ej. trigo, avena, cebada, centeno, maíz,
arroz, hierbas forrajeras y de prados (tales como p.ej. alfalfa,
trébol blanco o rojo), en particular trigo.
En otra forma de realización adicional, el
presente invento se refiere también a procedimientos para la
producción de células de plantas, y de plantas, transgénicas,
caracterizado porque células, tejidos o partes de plantas o
protoplastos se transforman con una molécula de ácido nucleico
conforme al invento, con un vector conforme al invento, con una
casete de expresión conforme al invento o eventualmente con una
célula anfitriona conforme al invento, preferiblemente con un
microorganismo, las células, los tejidos, las partes de plantas o
los protoplastos, que se han transformado, se cultivan en un medio
de crecimiento, y en el caso de la producción de plantas
transgénicas se regeneran plantas a partir de ellos/ellas.
En otra forma de realización adicional, el
invento se refiere a la utilización de vectores, casetes de
expresión o eventualmente células anfitrionas, conformes al invento,
para la producción de células anfitrionas transgénicas, en
particular de células de plantas, y de plantas, transgénicas.
En otra forma de realización adicional, el
invento se refiere a un procedimiento para la expresión de genes,
específica para cariópsides, en plantas, en el que una o varias de
las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se
integra(n) directamente o mediante uno o varios de los
vectores, las casetes de expresión o las células anfitrionas
conformes al invento, de una manera estable en el genoma de una
célula de planta, y a partir de la mencionada célula de planta se
regenera una planta.
En otra forma de realización adicional, el
invento se refiere a un procedimiento para la supresión de genes,
específica para cariópsides en plantas, en el que una o varias de
las moléculas de ácidos nucleicos conformes al invento se
integra(n) directamente o mediante uno o varios de los
vectores, las casetes de expresión o las células anfitrionas
conformes al invento, de una manera estable en el genoma de una
célula de plantas, y a partir de la mencionada célula de plantas se
regenera una planta, preferiblemente mediante una supresión
concomitante (cosupresión).
Las plantas conformes al invento se pueden
producir de acuerdo con procedimientos que son conocidos por un
experto en la especialidad, p.ej. mediante transformación de células
o tejidos de plantas y regeneración de plantas enteras a partir de
las células transformadas y respectivamente del tejido.
Para la introducción de un ADN en una célula
anfitriona vegetal están a disposición fundamentalmente un gran
número de técnicas de trabajo de biología molecular. Estas técnicas
comprenden la transformación de células de plantas con un
ADN-T (ADN transferido) mediando utilización de
Agrobacteium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes
como agente de transformación, la fusión de protoplastos, la
inyección, la electroporación de ADN, la incorporación de los ADN
mediante el principio biolístico, etc.
Al realizar la inyección, la electroporación y la
transformación mediante un método biolístico (utilizando un
"particle gun" = cañón de partículas) de ADN en células de
plantas, no se establece de por sí ningún requisito especial en
cuanto a los plásmidos utilizados. Se pueden utilizar plásmidos
sencillos, tales como p.ej. derivados de pUC. Sin embargo, si a
partir de células transformadas de este modo se deben regenerar
plantas enteras, entonces se necesita p.ej. la presencia de un gen
marcador seleccionable.
Dependiendo del método de introducción de genes
deseados en la célula vegetal, pueden ser necesarias otras
secuencias de ADN adicionales. Si p.ej. para la transformación de la
célula vegetal se utiliza el plásmido Ti o Ri, entonces por lo menos
la delimitación derecha, pero con frecuencia las delimitaciones
derecha e izquierda, del ADN-T de los plásmidos Ti y
Ri como región de flanco, se debe(n) unir con los genes que
se han de introducir.
Si para la transformación se utilizan
agrobacterias, el ADN que se ha de introducir debe ser clonado en
plásmidos especiales, y concretamente o bien en un vector intermedio
o en un vector binario. Los vectores intermedios pueden ser
integrados, por causa de secuencias, que son homólogas con respecto
a secuencias existentes en el ADN-T, mediante una
recombinación homóloga en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias.
Éste contiene además la región vir, que es necesaria para la
transferencia del ADN-T. Unos vectores intermedios
no se pueden replicar en agrobacterias. Mediante un plásmido
cooperante se puede transferir (por conjugación) el vector
intermedio a Agrobacterium tumefaciens. Unos vectores
binarios pueden replicarse tanto en E. coli como también en
agrobacterias. Éstos contienen un gen marcador de selección y un
engarzador o poliengarzador, que son enmarcados por las regiones
límites derecha e izquierda del ADN-T. Ellos se
pueden transformar directamente en el seno de las agrobacterias
(Holsters y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 163(1978),
181-187). La agrobacteria, que sirve como célula
anfitriona, debe contener un plásmido, que lleve una región
vir. La región vir es necesaria para la transferencia
del ADN-T a la célula de planta.
Puede estar presente una cantidad adicional de
ADN-T. La agrobacteria transformada de tal manera se
utiliza para la transformación de células de plantas.
La utilización de un ADN-T para
la transformación de células de plantas se ha investigado
intensamente y se ha descrito de manera suficiente en el documento
EP 120.516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System [El sistema
de vector binario de plantas] Offsetdrukkerij Kanters B.V.
Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley y colaboradores, Crit. Rev.
Plant. Sci. 4, 1-46 y An y colaboradores EMBO J. 4
(1985), 277-287.
Para la transferencia del ADN a la célula de
planta, se pueden cultivar concomitantemente explantes de plantas,
convenientemente con Agrobacteium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes. A partir del material infectado de
plantas (p.ej. trozos de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero
también protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión)
se pueden regenerar entonces de nuevo plantas enteras en un medio
apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la
selección de células transformadas. Las plantas obtenidas de esta
manera se pueden investigar entonces en cuanto a la presencia del
ADN introducido. Se conocen otras posibilidades para la introducción
de un ADN ajeno mediando utilización del procedimiento biolístico o
mediante transformación de protoplastos (compárese p.ej. la cita de
Willmitzer, L., 1993 Transgenic Plants. In: Biotechnology, A
Multi-Volume Comprehensive Treatise [Plantas
transgénicas, en: Biotecnología, Un tratado amplio de múltiples
volúmenes (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, coordinadores
de edición), volumen 2, 627-659, VCH
Weinheim-Nueva
York-Basilea-Cambridge).
Entretanto se están transformando plantas
monocotiledóneas de una manera rutinaria mediante el principio
biolístico y mediante agrobacterias (Komari y colaboradores, (1998);
Advances in cereal gene transfer [Avances en la transferencia de
genes en cereales]; Current Opinión in Plant Biotechnology 1,
páginas 161 y siguientes.; Bilang y colaboradores (1999),
Transformation of Cereals [Transformación de cereales], Genetic
Engineering, 12 páginas 113-148 coordinador de
edición: JK Setlow, Kluwer Academic/Plenum Publisher, Nueva
York).
Otros métodos apropiados son la recepción de ADN
en protoplastos, inducida por medios eléctricos o químicos, la
electroporación de células parcialmente permeabilizadas, la
macroinyección de ADN en inflorescencias, la microinyección de ADN
en microsporas y pro-embriones, la recepción de ADN
mediante polen en germinación y la recepción de un ADN en un embrión
mediante hinchamiento (acerca de la recopilación: Potrykus, Physiol.
Plant (1990), 269-273).
Además, el presente invento se refiere a un
material de reproducción y a un material cosechado de plantas
conformes al invento, que contienen células de plantas conformes al
invento.
El concepto de "material de reproducción"
comprende, en el sentido del presente invento, aquellos componentes
de la planta que son apropiados para la generación de una
descendencia por una vía vegetativa o generativa. Para la
reproducción vegetativa son apropiados, por ejemplo, plantones,
cultivos de callos, rizomas, cepellones de raíces o tubérculos. Otro
material de reproducción comprende por ejemplo frutas, semillas,
arbolitos nacidos de semillas, protoplastos, cultivos celulares,
etc. Preferiblemente, en el caso del material de reproducción se
trata de tubérculos o semillas.
Además, el presente invento se refiere a la
utilización de los promotores conformes al invento, o de los
promotores identificados mediante el procedimiento conforme al
invento, para la expresión, específica para cariópsides, de
transgenes en células de plantas o en plantas.
Además, el presente invento se refiere a la
utilización de los promotores conformes al invento, o de los
promotores identificados mediante el procedimiento conforme al
invento, para la cosupresión, específica para cariópsides, de genes
o transgenes en células de plantas o en plantas.
El concepto de "transgén" significa en este
caso una secuencia de ADN introducida artificialmente en una planta,
que contiene una o varias de las moléculas de ácido nucleico
conformes al invento.
Estas y otras formas de realización son
divulgadas para un experto en la especialidad mediante la memoria
descriptiva y los Ejemplos del presente invento. Una bibliografía
más amplia acerca de uno/una de los métodos, de los agentes y de las
aplicaciones que antes se han señalado, y que se necesitan en el
sentido del presente invento, se conoce para el experto en la
especialidad a partir del estado de la técnica. Para esta finalidad
se recomiendan, entre otros, bancos públicos de datos (p.ej.
"Medline", que eventualmente está a disposición a través del
Internet, p.ej. bajo la dirección
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Otros bancos de
datos y otras direcciones son habituales para un experto en la
especialidad y se pueden obtener eventualmente del Internet, p.ej.
bajo la dirección http://www.lycos.com. Una recopilación sobre
fuentes e informaciones acerca de patentes y respectivamente de
solicitudes de patentes en la biotecnología se ofrece en la cita de
Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Para la descripción más detallada del invento,
uno de los promotores conformes al invento se representa mediante
SEQ ID No. 1, que consiste en 4.683 bases de la secuencia genómica
del subclón p15/G aislado de la sslI, tal como se ha depositado a
través de DSM 14224.
La SEQ ID No. 1 representa la secuencia de ADN
del subclón genómico p15/G de la sslI (tamaño del inserto: 5.057
pares de bases). Los nucleótidos 1-4.683 de Seq ID
No. 1 corresponden a la región del gen que flanquea a 5', es decir
al promotor de sslI. El subclón p15/G contiene además 374 bases del
gen estructural de la SslI (posiciones desde 4.684 hasta 5.057). Un
intrón con una longitud de 91 bases está situado en las posiciones
4.948 hasta 5.038.
El clon de ADNc aislado de la sslI (Walter
(2000), tesis doctoral de la Universidad de Hamburgo, Facultad de
Biología, documento WO 97/45545 y respectivamente banco de datos de
EMBL U66377) muestra con la secuencia genómica reseñada en SEQ ID
No. 1 en la región no traducida en 5' (posiciones desde 4.512 hasta
4.863) una homología de 83,7%. En el primer exón (posiciones
4.684-4.947) existe con respecto de esta secuencia
de ADNc una identidad entre secuencias de 92,6%. La región no
traducida en 5' y el primer exón de la secuencia reseñada en SEQ ID
No. 1 (posiciones 4.596-4.947) es idéntica a los
primeros 352 pb (pares de bases) de un clon de ADNc, publicado por
Li y colaboradores (Theor. Appl. Genet., (1999), 98:
1208-1216) de una sslI, WSSIIA y a los primeros 318
pb del clon de ADNc wss2a-2 (AJ269503) publicado por
Gao y colaboradores (2000, sitio mencionado).
La región de ADN flanqueadora de 5' del clon
genómico aislado (SEQ ID No. 1, es decir los nucleótidos
1-4.683 de Seq. ID No. 1), se comparó mediante
investigaciones en bancos de datos con secuencias ya publicadas. En
el caso de la región de promotor de un gen de la sslI se trata de
una secuencia hasta ahora desconocida.
Además, la secuencia de ADN situada flanqueando a
5' con respecto al codón de iniciación (SEQ ID No. 1, los
nucleótidos 1-4.6 83) se escudriñó en el banco de
datos PLACE (http.//www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/, Web
Signal Scan Program) para descubrir motivos de ADN con homología
entre secuencias con respecto a elementos reguladores en cis
conocidos. En el promotor de sslI (es decir los nucleótidos
1-4.683 de la Seq. ID No. 1, como se depositó a
través de DSM 14224) se identificaron los siguientes elementos de
ADN reguladores en cis específicos para el endospermo y
respectivamente para las semillas:
\vskip1.000000\baselineskip
| Elemento -300 (gliadina, glutenina; T. aestivum) | Posición 941 (+) | TGHAAARK |
| Posición 3.134 (+) | TGHAAARK | |
| Posición 3.406 (+) | TGHAAARK | |
| Posición 580 (-) TGHAAARK | ||
| Motivo -300 (zeína; Z. mais) | Posición 4.467 (+) | TGTAAAG |
| Motivo de napina (Albúmina 2S; B. napus) | Posición 3.311 (-) | TACACAT |
| Elemento (CA)_{n} (napA; B. napus) | Posición 2.285 (+) | CNAACAC |
| Posición 2.714 (-) | CNAACAC | |
| Posición 4.420 (+) | CNAACAC | |
| Caja ACGT (Glu-B1, O. sativa) | Posición 2.193 (+) | GTACGTG |
| Posición 2.477 (+) | GTACGTG | |
| Caja de amilasa (\alpha-amilasa, T. aestivum) | Posición 3.534 (+) | TAACARA |
| Elemento CGACG (amilasa, O. sativa) | Posición 195 (+) | CGACG |
| Posición 957 (+) | CGACG | |
| Posición 1.181 (+) CGACG | ||
| Posición 2.321 (+) | CGACG | |
| Posición 1.331 (-) | CGACG | |
| Posición 2.015 (-) | CGACG | |
| Posición 2.277 (-) | CGACG | |
| Posición 4.481 (-) | CGACG | |
| Caja E (napA; B. napus) (= caja G) | Posición 72 (+) | CACGTG |
| Posición 866 (+) | CANNTG | |
| Posición 1.568 (+) | CANNTG | |
| Posición 1.594 (+) | CANNTG | |
| Posición 2.603 (+) | CANNTG | |
| Posición 2.980 (+) | CANNTG | |
| Posición 3.290 (+) | CANNTG | |
| Posición 3.447 (+) | CANNTG | |
| Posición 3.751 (+) | CANNTG | |
| Posición 4.032 (+) | CANNTG | |
| Posición 4.110 (+) | CANNTG | |
| Posición 4.174 (+) | CANNTG | |
| Posición 4.295 (+) | CACGTG | |
| (= caja G) | ||
| Repetición RY (Gy2; V. faba) | Posición 2.353 (+) | CATGCATG |
| Posición 2.353 (+) CATGCAT | ||
| Posición 2.532 (+) | CATGCAT | |
| Posición 2.354 (-) | CATGCAT | |
| Posición 2.471 (-) | CATGCAT | |
| Posición 4.146 (+) | CATGCAT |
(Continuación)
| Repetición RY (legumina; G. max) | Posición 2.088 (+) | CATGCAY |
| Repetición RY (napA; B. napus) | Posición 733 (-) | CATGCA |
| Posición 2.355 (-) | CATGCA | |
| Posición 2.472 (-) | CATGCA | |
| Posición 2.601 (-) | CATGCA | |
| Motivo SEF1 (globulina 7S ; G. max) | Posición 2.871 (+) | ATATTTAWW |
| Posición 3.108 (+) | ATATTTAWW | |
| Posición 2.938 (-) | ATATTTAWW | |
| Motivo SEF3 (globulina 7S ; G. max) | Posición 403 (+) | AACCCA |
| Posición 1.114 (-) | AACCCA | |
| Motivo SEF4 (globulina 7S ; G. max) | Posición 845 (+) | RTTTTTR |
| Posición 2.787 (+) | RTTTTTR | |
| Posición 838 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.047 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.156 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.274 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.785 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 2.876 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.049 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.099 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.113 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.198 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.306 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.571 (-) | RTTTTTR | |
| Posición 3.681 (-) | RTTTTTR |
Homologías entre secuencias con respecto a
elementos, que participan en una expresión génica regulada por
azúcares, se encontraron en las siguientes posiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
| Caja ACGTA (\alpha-amilasa; O. sativa) | Posición 4.450(+) | TACGTA |
| Elemento CGACG (AMY3; O. sativa) | Posición 195 (+) | CGACG |
| Posición 957 (+) | CGACG | |
| Posición 1.181 (+) | CGACG | |
| Posición 2.321 (+) | CGACG | |
| Posición 1.331 (-) | CGACG | |
| Posición 2.015 (-) | CGACG | |
| Posición 2.277 (-) | CGACG | |
| Posición 4.481 (-) | CGACG | |
| Posición 4.484 (-) | CGACG | |
| Posición 4.688 (-) | CGACG | |
| SURE1 (Sbe2.2; A. thaliana) | Posición 3.979 (+) | AACAGAAAA |
Homologías entre secuencias con respecto a
elementos de ADN, que participan en una expresión génica regulada
hormonalmente por ABA o GA, se encontraron en las siguientes
posiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
| ABRE (rd22, A. thaliana) | Posición 71 (+) | RYACGTGGY |
| ABRE Motivo A (Osem; O. sativa) | Posición 2.478 (+) | TACGTGTC |
| ABRE (Em, T. aestivum) | Posición 1.219 (+) | ACGTSSSC |
| Posición 1.179 (-) | ACGTSSSC | |
| Posición 2.044 (-) | ACGTSSSC |
(Continuación)
| EMBP1 (Em, T. aestivum) | Posición 72 (+) | CACGTGGC |
| Caja de pirimidina (EBP-1; H. vulgare) | Posición 3.459 (-) | TTTTTTCC |
| Posición 3.479 (-) | TTTTTTCC | |
| Posición 3.608 (-) | TTTTTTCC | |
| Motivo DPBF (Dc3; D. carota) | Posición 4.463 (-) | ACACNNG |
| LTRE (cor15a; A. thaliana) | Posición 956 (+) | CCGAC |
| Posición 1.772 (+) | CCGAC | |
| Posición 2.143 (+) | CCGAC | |
| Posición 2.222 (+) | CCGAC | |
| Posición 2.320 (+) | CCGAC | |
| Posición 87 (-) | CCGAC | |
| Posición 397 (-) | CCGAC | |
| Posición 780 (-) | CCGAC | |
| Posición 1.214 (-) | CCGAC | |
| Posición 4.689 (-) | CCGAC |
Homologías entre secuencias con respecto a
elementos, que participan en una expresión génica regulada
hormonalmente mediante una auxina y respectivamente etileno, se
encontraron en las siguientes posiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
| Motivo ASF-1 (35S; CaMV) | Posición 192 (+) | TGACG |
| Posición 775 (+) | TGACG | |
| Posición 819 (+) | TGACG | |
| Posición 2.150 (+) | TGACG | |
| Posición 3.694 (+) | TGACG | |
| Posición 16 (-) | TGACG | |
| Posición 1.406 (-) | TGACG | |
| Posición 1.803 (-) | TGACG | |
| Posición 4.029 (-) | TGACG | |
| Posición 4.046 (-) | TGACG | |
| Respuesta f. a auxina (ARF; A. thaliana) | Posición 1.539 (-) | TGTCTC |
| MotivoNtBBF1 (rolB; A. rhizogenes) | Posición 3.702 (+) | ACTTTA |
| Etileno RE (E4; L. esculentum) | Posición 3.270 (+) | AWTTCAAA |
Homologías entre secuencias con respecto a
elementos de ADN que se presentan para una expresión génica regulada
por luz o temperatura, se encontraron en las siguientes
posiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
| Caja I (monocotiledóneas y dicotiledóneas) | Posición 2.883 (+) | GATAA |
| Posición 463 (-) | GATAA | |
| Posición 2.907 (-) | GATAA | |
| Posición 3.065 (-) | GATAA | |
| Posición 3.804 (-) | GATAA | |
| Posición 3.920 (-) | GATAA | |
| Posición 3.920 (-) | GATAA | |
| Posición 4.087 (-) | GATAA | |
| LTRE-1 (blt4.9; H. vulgare) | Posición 179 (-) | CCGAAA |
| LTRE (lti; A. thaliana) | Posición 2.221 (+) | ACCGACA |
(Continuación)
| LTRE (cor15a; A. thaliana) | Posición 956 (+) | CCGAC |
| Posición 1.772 (+) | CCGAC | |
| Posición 2.143 (+) | CCGAC | |
| Posición 2.222 (+) | CCGAC | |
| Posición 2.320 (+) | CCGAC | |
| Posición 4.689 (+) | CCGAC | |
| Posición 87 (-) | CCGAC | |
| Posición 397 (-) | CCGAC | |
| Posición 780 (-) | CCGAC | |
| Posición 1214 (-) | CCGAC |
Junto a los descritos motivos de secuencias se
encontraron en el promotor homologías con respecto a motivos de ADN
para factores de transcripción generales (p.ej. consenso de GT1,
cajas G, cajas DOF, motivos GATA, cajas Myb y Myc; para información
véase el banco de datos PLACE), así como cajas T y elementos ARS
(Gasser S.M. y colaboradores (1989) Intnatl. Rev. Cyto. 119:
57-96).
El promotor sslI reseñado dentro de SEQ ID No. 1,
tiene además de esto motivos de secuencias hasta ahora no descritos.
A éstos pertenece un motivo con la secuencia
5'-AAAAATGT-3', que en total aparece
nueve veces en la región desde 3.009 hasta 3.329 de la secuencia
reseñada dentro de SEQ ID No. 1 (posiciones: 3.009, 3.030, 3.114,
3.157, 3.177, 3.199, 3.275, 3.307, 3.321). Al contrario que este
motivo, el elemento -300, también denominado caja de prolamina;
tiene el motivo de secuencia
5'-TTGTAAAG-3' y está localizado a
aproximadamente 300 nucleótidos desde el punto de partida de la
transcripción en promotores de hordeínas (cebada), gliadinas y
gluteninas de LMW (trigo), así como de
\alpha-zeínas (maíz) (Forde y colaboradores (1985)
Nucleic Acid Research 13: 7327-7339, Mena y
colaboradores (1998) Plant J. 16: 53-62).
Unos cortos motivos de secuencias, que se repiten
directamente, se encuentran en la posición 4.221
(TCTA)_{4}, en la posición 2.304 (GCCT)_{3} y en
la posición 2.364 (GCT)_{3}. Una repetición directa de la
secuencia AAAAATGTAAT
CAAGCATTT se encuentra en las posiciones 3.199 y 3.275. En la región no traducida en 5', directamente delante del comienzo de la traducción (posición 4.671 en SEQ ID No. 1, se encuentra una secuencia rica en GC (CCCGGCCGCC), que también se presenta en la región no traducida en 5' del clon de ADNc de zSSlIa de maíz, delante del comienzo de la traducción (banco de genes GenBank nº de acceso AFO19296; Ham y colaboradores (1998) Plant Mol. Biol. 37: 639-649).
CAAGCATTT se encuentra en las posiciones 3.199 y 3.275. En la región no traducida en 5', directamente delante del comienzo de la traducción (posición 4.671 en SEQ ID No. 1, se encuentra una secuencia rica en GC (CCCGGCCGCC), que también se presenta en la región no traducida en 5' del clon de ADNc de zSSlIa de maíz, delante del comienzo de la traducción (banco de genes GenBank nº de acceso AFO19296; Ham y colaboradores (1998) Plant Mol. Biol. 37: 639-649).
El subclon genómico p8/C de la sslI, divulgado en
la solicitud de patente alemana DE 10032379.0 y depositado a través
de DSM 13397, constituye un fragmento de la secuencia SEQ ID No. 1.
Por lo tanto, el contenido del documento DE100323791 es expresamente
parte de esta solicitud de patente por su referencia.
La molécula de ácido nucleico SEQ ID No. 1
conforme al invento se depositó en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares) en Braunschweig, Alemania de
acuerdo con el convenio de Budapest mediante un ADN de plásmido:
El 6 de Abril de 2001, se efectuó el depósito del
plásmido p15/G que contenía la SEQ ID No. 1 bajo el número de
depósito DSM 14224 en la DESMZ.
Para la clonación en cepas bacterianas de E.
coli se utilizaron los vectores pBlueskript®II SK(+/-) y
respectivamente los vectores fagémidos KS(+/-) Stratagene GmbH,
Heidelberg, Alemania) y el vector de clonación Lambda Fix®II/XhoI
(Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemania).
Para los vectores Blueskript se utilizaron las
cepas DH5\alpha de E. coli (Life Technologies, Eggenstein,
Alemania) y Epicurian Coli SURE® (Stratagene GmbH, Heidelberg,
Alemania). Para los vectores de bacteriófagos se utilizó la cepa
XL1-Blue MRA de Epicurian Coli (Stratagene).
Acerca de técnicas fundamentales de trabajo de
biología molecular o composiciones ilustrativas de tampones, se
remitirá a la obra de Sambrook y colaboradores ((1989), Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbour
Laboratory Press).
Los siguientes Ejemplos explican el invento pero
sin limitarlo en ningún aspecto.
Para la producción de los bancos genómicos de
trigo se aisló un ADN total a partir de gérmenes etiolados de
Triticum aestivum L. cv. "Florida". Para la cultivación de
gérmenes etiolados estériles se incubaron cariópsides maduras
durante 20 min con NaOCl al 1%, Mucasol® al 0,1% (v/v) (Merz &
Co., Frankfurt, Alemania) y a continuación se lavaron 3 veces con
agua bidestilada. Las cariópsides se colocaron sobre un medio MS
estéril (Murashige & Skoog (1962), Physiol. Plant. 15:
473-479) al que se había añadido 0,3% (p/v =
peso/volumen) de GELRITE® (Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe,
Alemania) para su consolidación. El crecimiento se efectuó a 26ºC en
la oscuridad. Catorce días después de la siembra en placas, los
gérmenes se cortaron y se congelaron en nitrógeno líquido.
La digestión parcial de los ADN genómicos se
efectuó con las enzimas de restricción BamH I y respectivamente
Sau3A 1 (Life Technologies, Eggenstein, Alemania). Para esto, se
restringieron 3 partes alícuotas, en cada caso de 100 \mug, de un
ADN genómico con 150 \mul del correspondiente tampón de
restricción en un volumen total de 1,5 ml y con 12,5 unidades, 6,25
unidades o respectivamente 3,125 unidades de la enzima de
restricción BamH 1, o respectivamente 1,56 unidades, 0,78 unidades y
respectivamente 0,39 unidades de Sau3A 1, durante 1 h a 37ºC. Partes
alícuotas del ADN parcialmente restringido se analizaron a
continuación mediante una electroforesis en gel en cuanto al grado
de restricción. Las enzimas de restricción fueron eliminadas desde
las tandas mediante una extracción en una sola vez con una mezcla de
fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (25:24:1, v/v) y extracción
con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1, v/v). A
continuación se añadió sacarosa a cada una de las tandas, hasta
llegar a una concentración final de 10% (p/v).
El fraccionamiento por tamaños de los ADN
parcialmente restringidos se efectuó en un gradiente continuo de
sacarosa (de 10-40% p/v) (Sambrook y colaboradores
(1989)). Las partes alícuotas de las moléculas de ADN parcialmente
restringidas fueron calentadas a 68ºC durante 10 min antes de haber
cargado en cada caso 15 ml de un gradiente de sacarosa, y luego se
enfriaron a 20ºC. La centrifugación de los gradientes se efectuó
durante 24 h, a 20ºC y 22.000 rpm (Beckman, Rotor SW 40). Después de
la centrifugación, los tubitos individuales de centrifuga fueron
perforados en el fondo y se recogieron cada vez 500 \mul de partes
alícuotas. De las fracciones individuales se separaron 30 \mul en
un gel de agarosa al 0,5% y se determinó en las fracciones
individuales la distribución de tamaños de los ADN. Las fracciones,
que contenían un ADN genómico de aproximadamente 4,0 kb (kilobases)
y mayores, se reunieron. La sacarosa procedente de las muestras se
eliminó mediante diálisis frente a un tampón de Tris/EDTA (10 mM/1
mM). A continuación las muestras se concentraron por evaporación con
2-butanol y el ADN se precipitó a partir de las
muestras con 2 partes en volumen de EtOH (99,8%)/acetato de amonio 2
M (concentración final) a la temperatura ambiente (TA).
Para el relleno de los extremos 3' de los ADN
parcialmente restringidos, 20 \mug de los ADN restringidos con
BamH I y respectivamente Sau3A I se incubaron con dATP 1 mM, dGTP 1
mM (Roche, Mannheim), 6 \mul de un tampón de reacción 10x Pfu y 10
unidades de polimerasa de ADN Pfu natural (polimerasa de ADN con
actividad "proof-reading" (de lectura y
corrección de pruebas); Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemania) en un
volumen final de 60 \mul. La reacción se llevó a cabo a 72ºC
durante 1 h 30 min. A continuación se efectuaron una extracción con
una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico así como una
extracción con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico, y
seguidamente se realizó una precipitación del ADN con 1/10 volúmenes
de NaAc 3 M y 2,5 partes en volumen de EtOH (absoluto).
Un ADN genómico restringido con BamH I y
respectivamente Sau3A I se ligó en el vector de clonación Lambda
Fix® II/Xho I de acuerdo con las indicaciones del fabricante
(Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemania). La tanda de ligación
contenía: 1 \mul del vector Lambda Fix® II, 0,4 \mug de un ADN
genómico restringido con BamH I y respectivamente Sau3A I, 0,5
\mul de 10x tampón de ligación, 2 unidades Weiss de ligasa de ADN
T4 (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemania),
Weiss y colaboradores (1968) J. Biol. Chem.
243:4543-4555) en un volumen final de 5 \mul.
Para el empaquetamiento de los fagos Lambda se
utilizó el estuche de empaquetamiento in vitro "Gigapack®
II Gold" de la entidad Stratagene (Stratagene GmbH, Heidelberg,
Alemania) y se siguieron las indicaciones del fabricante. De las
tandas de ligación se añadió en cada caso 1 \mul a las tandas de
envasado y a continuación se siguieron las indicaciones del
fabricante.
Para la reproducción de fagos se utilizó la cepa
bacteriana de E. coli XL1-Blue MRA (P2) . Las
bacterias se cultivaron en un medio LB con MgSO_{4} 10 mM, maltosa
al 0,2% (p/v) hasta llegar a una densidad óptica DO_{600} = 0,5 a
37ºC y 180 rpm. A continuación, las bacterias fueron sedimentadas a
2.000 rpm durante 10 min a 4ºC y el material sobrenadante se
desechó. El sedimento con bacterias se volvió a suspender en
MgSO_{4} 10 mM y la densidad de bacterias se ajustó a DO_{600} =
0,5.
Para la reproducción de fagos, se mezclaron en
cada caso 1 \mul de las tandas de empaquetamiento a partir de las
tandas originales y respectivamente de una dilución a 1:10 de las
tandas originales, con 200 \mul de una suspensión de bacterias
(DO_{600} = 0,5) y se incubaron a 37ºC durante 15 min. A
continuación, las tandas individuales se mezclaron con 3 ml de
agarosa de TOP (48ºC) y se sembraron en placas sobre un medio sólido
de NZY de acuerdo con las indicaciones del fabricante (véase más
arriba en vectores Partial Fill-in Lambda Fix®
II/Xho I, Stratagene). Las placas se incubaron durante
aproximadamente 16 h a 33ºC.
Los títulos de fagos de los bancos genómicos de
Sau3A I y respectivamente BamH I se determinaron mediante recuento
de las calvas de fagos. Para los bancos primarios de Sau3A I y
respectivamente BamH I se determinaron unos títulos de fagos de 2,2
x 10^{7} pfu/ml y respectivamente 1,4 x 10^{7} pfu/ml. Para la
determinación de los tamaños medios de los insertos se amplificaron
de cada banco 10 clones de fagos individuales, se aislaron los ADN
de fagos (Sambrook y colaboradores, 1989) y se determinaron los
tamaños de los insertos después de una digestión por restricción y
de una separación por electroforesis en gel. El tamaño medio de los
insertos es de aproximadamente 15,0 kb para el banco de BamH I y
respectivamente de 15,6 kb para el banco de Sau3A I.
Para la producción de bancos genómicos
amplificados, representativos, se sembraron en placas
aproximadamente 4,5 millones de pfu (de plaque forming units =
unidades formadoras de calvas) de cada banco. La amplificación se
efectuó de acuerdo con las indicaciones del fabricante (Stratagene).
El título de fagos de los bancos amplificados fue de 6,3 x 10^{9}
pfu/ml (banco de BamHI) y respectivamente de 2,0 x 10^{9} pfu/ml
(banco de Sau3A I).
La identificación y el aislamiento de clones de
fagos, cuyos insertos genómicos llevan secuencias de los genes de la
sslI, se efectuaron a través de una hibridación de calvas de
colonias. Para el examen minucioso de los bancos genómicos se
sembraron en placas en cada caso aproximadamente 500.000 fagos de
cada banco. La siembra en placas de los fagos y la retirada de las
placas se efectuaron de acuerdo con protocolos clásicos (Sambrook y
colaboradores, 1989, Manual de Stratagene Lambda Fix® II). Como
sonda específica para genes se empleó un fragmento de ADN con un
tamaño de 709 pb de un clon de ADNc de una sslI (documento WO
97/45545 A1, banco de datos EMBL U66377, Walter (2000), tesis
doctoral de la Universidad de Hamburgo, Facultad de Biología,
posiciones 1.264-
1.973).
1.973).
La sonda de sslI se amplificó con cebadores
específicos para ciertas secuencias por medio de una reacción de PCR
a partir de un clon de ADNc de sslI aislado. La marcación del
producto de amplificación con un tamaño de 709 pb (posiciones
1.264-1.972 del ADNc de sslI) se efectuó durante la
reacción de PCR mediante la incorporación de
DIG-dUTPs (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).
La tanda de reacción de PCR se componía de la
siguiente manera:
10 \mul de un tampón para PCR (10 veces mayor,
sin Mg; Life Technologies)
3 \mul de MgCl_{2} (50 mM; Life
Technologies),
7 \mul de DIG dUTPs (1nmol/\mul; (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim).
en cada caso 8 \mul de dATP, dCTP y dGTP (cada
vez 2,5 mM)
5 \mul de dTTP (2,5 mM)
5 \mul del cebador LW2 (10 pmol/\mul)
5 \mul del cebador LW9 (10 pmol/\mul)
10 ng de un molde (clon de ADNc de la sslI)
0,5 \mul de la polimerasa Taq (5 U/\mul; de
Life Technologies)
hasta 100 \mul de H_{2}O bidestilada.
Las condiciones para la PCR fueron las
siguientes:
96ºC durante 5 min,
96ºC durante 1 min,
58ºC durante 1 min,
72ºC durante 1 min (IV. \rightarrow II. 29
bucles)
72ºC durante 5 min.
Las secuencias de los cebadores específicos para
sslI para la amplificación de la sonda de PCR eran:
| LW2: | 5'-CTGCTGGACAGGATATGGAA-3' | (SEQ ID No. 11) |
| LW9: | 5'-TCGCGCTGCAGGGCCTCCTT-3' | (SEQ ID No. 12) |
La hibridación previa de los filtros se efectuó
en 5 x SSC, 3% de reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim),
dodecilsulfato de Na (SDS) al 0,2%,
N-lauril-sarcosina al 0,1% y 30
\mug/ml de ADN de esperma de arenque a 65ºC en un baño de agua. La
hibridación de las sondas de ADN marcadas con DIG (6 ng/ml de
solución de hibridación) se efectuó durante una noche a 65ºC en el
tampón de hibridación patrón descrito.
Todas las demás etapas de la reacción de
quimioluminiscencia con CSPD® se efectuaron de acuerdo con las
indicaciones del fabricante (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Alemania).
Las calvas positivas se separaron por punción y
se aislaron individualmente a través de otras dos rondas de
amplificación y de hibridación en filtros de calvas. Los ADN de los
fagos positivos aislados se purificaron mediante el estuche Qiagen®
Lambda (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), se cortaron con diferentes
enzimas de restricción y se analizaron después de una electroforesis
en gel de agarosa en hibridaciones según Southern con la sonda
arriba descrita.
Clones de fagos positivos del banco genómico se
identificaron con la sonda específica antes mencionada (709 pb). Los
insertos genómicos de los clones de fagos positivos se cortaron en
fragmentos más cortos con diferentes enzimas de restricción y
respectivamente combinaciones de enzimas de restricción. Los
subfragmentos resultantes se clonaron en vectores bacterianos
(vectores fagémidos pBlueskript® II SK(+/-) y respectivamente
KS(+/-); Stratagene GmbH, Heidelberg, Alemania).
A través de hibridaciones según Southern se
efectuó el aislamiento de subclones específicos para la sslI, con
elementos reguladores situados secuencia arriba de 5'. Para esto, se
produjo otra sonda marcada con digoxigenina, que se encuentra en la
región 5' más exterior de la secuencia de ADNc de la sslI. La sonda
se extiende desde la región no traducida en 5' del clon de ADNc de
la sslI hasta llegar al primer exón (posiciones
1-218 del ADNc de la sslI, tomado del documento
WO97/45545 A1). El fragmento se recortó a partir del ADNc de la sslI
(en Blueskript® SKII) por medio de una digestión por restricción con
SmaI y después de la separación se aisló por medio de una
electroforesis en gel de agarosa. La marcación del fragmento SmaI se
efectuó a través de un "random priming" [cebado aleatorio] con
el estuche de marcación de ADN con DIG de acuerdo con las
indicaciones del fabricante (Roche Diagnostics GbmH, Mannheim,
Alemania).
Después de una digestión del clon de fagos 15 con
la enzima XbaI se identificó un subclón con 4.682 pares de bases,
situado flanqueando en 5' a su gen estructural (p15/G, SEQ ID No. 1
tal como se depositó el 6.4.2001 en la DSZM en Braunschweig con el
número DSM 14224). La digestión con SacI dio como resultado un
subclón con 2.462 pares de bases situado flanqueando en 5' al gen
estructural, que corresponde al clon p8/C, depositado en la DSZM
Braunschweig, Alemania con el número DSM 13397 (correspondiente a
SEQ ID No. 2 tomada de la solicitud de patente alemana DE
10032379.0). El subclón 15/G se secuenció totalmente y se utilizó
para la clonación de vectores de ensayo de promotores.
Para realizar la secuenciación de los clones
genómicos de la sslI se encargó a la entidad SeqLab (Göttingen,
Alemania)
La capacidad funcional de la región de ADN
flanqueadora de 5' señalada en SEQ ID No. 1 se comprobó en análisis
de expresión transitorios y estables. Como gen reportero se utilizó
el gen de la \beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson
(1987) Plant Molecular Biology Reporter 5 (4):
387-405). Se clonaron vectores de ensayo de
promotores, en los que está situada la región codificadora del gen
de gus (de uidA) bajo el control de la región de ADN flanqueadora de
5' reseñada en SEQ ID No. 1 (los nucleótidos
1-4.683). La clonación se efectuó como una fusión
por transcripción. Primeramente se recortó el gen de uidA, a través
de una digestión parcial, juntamente con el terminador nos
procedente del vector pCal-GUS (gen de uidA bajo el
control del promotor CAMV 35S; Chris Warren, Universidad de
Stanford, sin publicar) y se clonó detrás del sitio de clonación
múltiple de pBluescript (Stratagene). El vector sin promotor
(uidA-nos), así producido, se utilizó para las
ulteriores clonaciones.
También la secuencia directora no traducida en 5'
de ARNm puede tener una influencia sobre la expresión, específica
para un tejido, de un gen (Rouster y colaboradores (1998) Plant J.
15 (3): 435-40). Los vectores de ensayo de
promotores clonados contienen, por lo tanto, esta región del gen de
sslI. En la estrategia de clonación escogida, el codón de iniciación
de traducción de la \beta-glucuronidasa está
situado junto a la posición del codón de iniciación del gen de
sslI.
La clonación de un vector de ensayo de promotores
de sslI mediante fusión por transcripción del promotor de sslI con
el gen reportero de uidA se llevó a cabo con el método de "empalme
por prolongación con solapamiento" [Splicing by Overlap
Extensión] (Horton (1997) Methods in Molecular Biology volumen 67:
PCR Cloning Protocols (14): 141149, White Humana Press Inc.).
Primeramente se clonó para esto un fragmento con
un tamaño de 2.499 pb del subclon genómico p15/g de sslI a través de
una digestión por restricción con SacI (posición 2.241) y con SmaI
(posición 4.740) dentro del plásmido sin promotor
uidA-nos.
La producción de productos intermedios para el
método del empalme por prolongación con solapamiento se efectuó
mediante empleo de los siguientes pares de cebadores (análogamente
al documento DE 10032379.0):
a) Reacción de amplificación con el subclón
genómico de sslI como matriz:
| SOE-A | 5'-TCACGTGGATTCTGCAACCTC-3' | (SEQ ID No. 13) |
| SOE-B | 5'-CAGGACGGACCATGGCGGCGGCCGGGAT-3' | (SEQ ID No. 14) |
b) Reacción de amplificación con el plásmido
pCalGUS como matriz:
| SOE-C | 5'-CGCCGCCATGGTCCGTCCTGTAGAAACCC-3' | (SEQ ID No. 15) |
| SOE-D | 5'-GTGATGTCAGCGTTGAACTGC-3' | (SEQ ID No. 16) |
Las reacciones se efectuaron según Horton
(Methods in Molecular Biology [Métodos en biología molecular (1997)
volumen 67: PCR Cloning Protocols (14): 141149, White Humana Press
Inc.), las condiciones para la PCR eran:
- I.
- 94ºC, durante 90 s (segundos),
- II.
- 94ºC, durante 1 min (minuto),
- III.
- 64ºC durante 1 min,
- IV.
- 72ºC durante 1 min (IV. \rightarrow II. 20 bucles)
- V.
- 72ºC durante 3 min.
La amplificación del producto de la PCR para la
clonación se efectuó con las secuencias de cebadores
SOE-A y SOE-D. Como matriz sirvieron
los productos intermedios producidos. El tratamiento de la tanda de
reacción se efectuó según Horton (Methods in Molecular Biology
(1997) volumen 67: PCR Cloning Protocols (14): 141149, White Humana
Presss Inc.), las condiciones para la reacción de PCR eran:
- I.
- 96ºC, durante 2 min,
- II.
- 94ºC, durante 1 min.,
- III.
- 68ºC durante 2 min.,
- IV.
- 72ºC durante 2 min (IV. \rightarrow II 25 bucles),
- V
- 72ºC durante 10 min.
La clonación del resultante producto de PCR entre
el promotor de sslI y el gen de uidA se efectuó después de una
digestión por restricción con las enzimas Not I (sitio de corte en
el promotor de sslI, posición 4.402) y Bal I (sitio de corte en el
gen de uidA).
La construcción de ensayo del promotor de sslI,
así resultante, lleva 2.443 pb situados flanqueando en 5' al gen de
sslI (-2,45 sslI/GUS). Mediante la ligación de los 2.340 pb
distantes que faltan del promotor de sslI (fragmento con SacI
procedente de 15/G) dentro del sitio de corte con SacI de la
construcción -2,45 sslI/GUS se produjo la construcción -4,68/GUS,
que lleva la totalidad de la región descrita dentro de SEQ ID No. 1
(nucleótidos 1-4.683) situada flanqueando en 5' al
gen de sslI.
La región con una longitud de 2.443 pb de la
construcción -2,45 sslI/GUS se acortó adicionalmente a continuación
mediante deleciones. Las deleciones se llevaron a cabo mediante
restricciones con diferentes enzimas de restricción, con lo que se
eliminaron en el promotor regiones con los elementos de ADN
descritos. En total se clonaron las siguientes construcciones de
ensayo del promotor de sslI:
- -
- 4,68 sslI/GUS
- -
- 2,45 sslI/GUS (restricción con SacI en la posición 2.241, SEQ ID No.1);
- -
- 2,05 sslI/GUS (restricción con KpnI en la posición 2.637, SEQ ID No. 1)
- -
- 1,11 sslI/GUS (restricción con SpeI en la posición 3.567, SEQ ID No. 1);
- -
- 0,61 sslI/GUS (restricción con HindIII en la posición 4.071, SEQ ID No. 1);
- -
- 0,53 sslI/GUS (restricción con SphI en la posición 4.151, SEQ ID No. 1) y
- -
- 0,28 sslI/GUS (restricción con NotI en la posición 4.403, SEQ ID No. 1);
La capacidad funcional de las construcciones
aisladas de promotores se comprobaron en análisis transitorios por
expresión. Los ensayos se llevaron a cabo con los vectores de ensayo
de promotores de sslI, obtenidos a partir del Ejemplo 5, y sus
construcciones por deleción.
Los análisis transitorios por expresión se
efectuaron después de una transformación biolística de diferentes
tejidos (cariópsides, embriones, hojas, raíces) de trigo. La
transformación de embriones, hojas y raíces se llevó a cabo según
Becker y colaboradores (Plant J. (1994) 5 (2):
229-307), mientras que la transformación biolística
del endospermo de cariópsides se efectuó de manera modificada según
Mena y colaboradores (Plant J. (1998) 16 (1),
53-62). La detección de la actividad del gen
reportero se efectuó mediante detección histoquímica de la actividad
de GUS (Jefferson (1987) Plant Molecular Biology Reporter Vol. 5
(4): 387-405). Los experimentos con cariópsides de
trigo con una edad de 10-30 días (dap), cortados
longitudinal y transversalmente mostraron que el promotor sslI
conduce a una expresión del gen reportero en el endospermo de
almidón de la cariópside. En otros tejidos (pericarpio, hojas,
raíces) no se pudo detectar ninguna actividad de GUS.
Las siguientes construcciones por deleción del
promotor sslI se manifestaron como capaces de funcionar en análisis
transitorios por expresión:
- -
- 4,68 sslI/GUS
- -
- 2,45 sslI/GUS (restricción con SacI en la posición 2241, SEQ ID No. 1),
- -
- 2,05 sslI/GUS (restricción con KpnI en la posición 2637, SEQ ID No. 1),
- -
- 1,11 sslI/GUS (restricción con SpeI en la posición 3567, SEQ ID No. 1),
- -
- 0,61 sslI/GUS (restricción con HindIII en la posición 4071, SEQ ID No. 1),
La construcción -0,28 sslI/GUS (restricción con
NotI en la posición 4.403; SEQ ID No. 1) no mostró por el contrario
ninguna actividad del gen reportero de GUS.
Los resultados de análisis transitorios de una
construcción de gen reportero y de promotor no corresponden siempre
al modelo de expresión después de una integración estable en el
genoma de la planta. Además de esto, los resultados de análisis
transitorios por expresión después de un disparo con
microproyectiles pudo variar grandemente a causa de la variabilidad
de las células afectadas. Por lo tanto, se llevaron a cabo análisis
adicionales acerca de la especificidad para tejidos de los
promotores aislados en plantas transformadas establemente.
Para la generación de plantas de trigo
transformadas establemente se utilizaron el vector de ensayo de
promotor descrito en el ejemplo 5 -4,68 sslI/GUS y las
construcciones por deleción -2,45 sslI/GUS y -0,61 sslI/GUS también
descritas allí.
\newpage
La producción de las plantas transgénicas se
efectuó según el método de Becker y colaboradores (Plant J. (1994) 5
(2): 229-307). Como marcador de selección se empleó
el plásmido p35S-PAT portador de resistencia a
fosfinotricina (que contiene el gen de pat, Aventis CropScience
GmbH, Frankfurt).
El análisis funcional de los fragmentos de
promotores de sslI se efectuó después de la regeneración de las
plantas transgénicas y de la detección de una integración estable y
completa de las construcciones de ensayo en el genoma de trigo a
través de análisis según Southern.
La actividad del gen reportero en las plantas
transgénicas regeneradas se investigó a través de una detección
histoquímica de GUS. Se analizaron diferentes tejidos de las plantas
transgénicas (hojas, raíces, endospermo, embrión, polen). Una
actividad de gen reportero se pudo comprobar exclusivamente en las
cariópsides de las plantas transgénicas. En éstas se mostró la
actividad de GUS localizada en el endospermo central de almidón. En
el embrión, en la aleurona y en la región que rodea al embrión, no
se detectó por el contrario ninguna actividad de GUS. Tampoco en el
tejido asimilador de las hojas, ni tampoco en las raíces ni en el
polen, se pudo detectar ninguna actividad de gen reportero.
Los 4.683 pb que flanquean en 5' al gen de sslI,
descritos dentro de SEQ ID No. 1, muestran en los análisis
funcionales realizados una expresión del transgén, que es específica
para un tejido, exclusivamente en el endospermo de almidón de las
cariópsides. También los fragmentos delecionados (suprimidos) del
promotor aislado (posiciones desde 2.241 hasta 4.683, y
respectivamente desde 4.071 hasta 4.683) median adicionalmente en
una expresión del transgén que es específica para un tejido.
Claims (16)
1. Molécula de ácido nucleico con la función de
un promotor específico para cariópsides, que
- a)
- comprende la secuencia de ácido nucleico definida por los nucleótidos 1-4.683 de la Seq ID No. 1;
- b)
- comprende uno o varios elementos de secuencias, seleccionados entre el conjunto que consiste en Seq ID No. 2, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 5, Seq ID No. 6, Seq ID No. 7, Seq ID No. 8, Seq ID No. 9 y Seq ID No. 10;
- c)
- comprende una parte funcional de la secuencia de ácido nucleico mencionada en a); y/o
- d)
- comprende una secuencia, que es idéntica a una de las secuencias de ácido nucleico mencionadas en a) en aproximadamente un 60-99%, de manera preferida en aproximadamente un 75-99%, en particular en aproximadamente un 90-99% y de manera muy especialmente preferida en aproximadamente un 95-99%.
2. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 1, que es un promotor activo en plantas
monocotiledóneas.
3. Casete de expresión que contiene una molécula
de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-2.
4. Vector que contiene una molécula de ácido
nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-2 o una casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 3.
5. Vector de acuerdo con la reivindicación 4, que
es apropiado para la transformación de células de plantas.
6. Célula anfitriona, que está modificada
genéticamente con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una
de las reivindicaciones 1-2, con una casete de
expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o con un vector de
acuerdo con una de las reivindicaciones 4-5.
7. Célula anfitriona de acuerdo con la
reivindicación 6, que es una célula procariótica o eucariótica.
8. Célula anfitriona de acuerdo con la
reivindicación 6, que es una célula de plantas.
9. Planta, que contiene células de plantas de
acuerdo con la reivindicación 8.
10. Material de reproducción o material cosechado
de plantas de acuerdo con la reivindicación 9, que contiene células
de plantas de acuerdo con la reivindicación 8.
11. Procedimiento para la producción de células
de plantas transgénicas de acuerdo con la reivindicación 8, en el
que células, tejidos o partes de plantas o protoplastos se
transforman con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1-2, con un vector de acuerdo
con una de las reivindicaciones 4-5, con una casete
de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o con una célula
anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6, y las células, los
tejidos, las partes de plantas o los protoplastos se cultivan en un
medio de crecimiento.
12. Procedimiento para la producción de plantas
transgénicas de acuerdo con la reivindicación 9, en el que células,
tejidos o partes de plantas o protoplastos se transforman con una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-2, con un vector de acuerdo con
una de las reivindicaciones 4-5, con una casete de
expresión de acuerdo con la reivindicación 3 o con una célula
anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6, las células, los
tejidos, las partes de plantas o los protoplastos se cultivan en un
medio de crecimiento, y a partir de las células de plantas obtenidas
se regeneran plantas enteras.
13. Utilización de una molécula de ácido nucleico
de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2 para
la expresión específica para cariópsides de genes en plantas
modificadas genéticamente.
14. Utilización de una molécula de ácido nucleico
de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2 para
la supresión específica para cariópsides de genes en plantas
modificadas genéticamente.
15. Procedimiento para la expresión de genes,
específica para cariópsides en plantas, en el que una molécula de
ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-2 se integra establemente en el genoma de una
célula de plantas, y a partir de la mencionada célula de plantas se
regenera una planta.
16. Procedimiento para la supresión de genes,
específica para cariópsides en plantas, en el que una molécula de
ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones
1-2 se integra establemente en el genoma de una
célula de plantas, y a partir de la mencionada célula de plantas se
regenera una planta.
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