ES2257861T5

ES2257861T5 - Procedimiento de producción viral

Info

Publication number: ES2257861T5
Application number: ES99921681.5T
Authority: ES
Inventors: Daniel D. Giroux; Ann M. Goudreau; Muralidhara Ramachandra; Paul W. Shabram
Original assignee: Canji Inc
Current assignee: Canji Inc
Priority date: 1998-05-04
Filing date: 1999-05-04
Publication date: 2017-03-23
Anticipated expiration: 2019-05-04
Also published as: EP1657309A1; EP1078095B1; DE69930250D1; DE69930250T2; EP1078095B2; ES2257861T3; JP2013165736A; EP1657309A8; US5994134A; CA2328084A1; AU3882399A; JP2009297044A; EP1078095A1; CA2328084C; DE69930250T3; WO1999057297A1; ATE319844T1; JP2002513583A

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de produccion viral Antecedentes de la invencion

Una variedad de productos de la terapia genica in vivo en desarrollo se basa en la administracion de un transgen terapeutico mediante vectores virales recombinantes. Un vehfculo comun para la administracion de los trangenes son los adenovirus recombinantes, por lo general los deficientes en la replicacion en cualquier otra celula diferente de la lfnea celular de empaquetamiento especffica. Estas lfneas celulares de empaquetamiento especfficas expresan ciertos genes adenovirales necesarios para la replicacion de los virus que se han suprimido en el virus deficiente. Para la produccion de adenovirus que contienen deleciones en la region E1, la lfnea celular utilizada mas comunmente es la lfnea celular 293. La produccion del adenovirus deficiente en la replicacion en las celulas 293 es diffcil porque es diffcil que la lfnea celular crezca. Por ejemplo, las celulas 293 requieren la union a un sustrato y parecen diferenciarse a una confluencia elevada. Otra limitacion es que los adenovirus deficientes en la replicacion no replican como los virus de tipo salvaje. Mientras la produccion de virus especffica para el adenovirus de tipo salvaje en las celulas 293 es de aproximadamente 80.000 a 100.000 partfculas por celula, el adenovirus deficiente en la replicacion E1 produce tfpicamente solo de 1.000 a 2.000 partfculas por celula. Las estimaciones basadas en las evaluaciones actuales de los regfmenes de dosificacion y en el tamano del mercado terapeutico, han indicado que sera necesaria la produccion anual de aproximadamente 1018 partfculas para satisfacer la demanda de algunos productos de terapia genica. Por lo tanto se requieren mejoras en la produccion de adenovirus recombinantes a niveles que satisfagan el mercado anticipado de los productos de terapia genica adenoviral para hacer que esta tecnologfa sea factible comercialmente.

La presente invencion describe un procedimiento basado en un microvehfculo para la produccion de vectores virales en lfneas celulares de empaquetamiento que dependen del anclaje, lo que permite una produccion eficaz en el coste de productos de la terapia genica adenoviral suficiente para satisfacer la demanda de mercado proyectada. La presente invencion describe un procedimiento de produccion escalable que produce mas de 2 x 1015 partfculas virales en un biorreactor de 5 litros. Este procedimiento es completamente escalable para la obtencion de las 1018 partfculas proyectadas por ano con un biorreactor tan pequeno como columnas de purificacion de 100 litros y de 5 litros.

Sumario de la invencion

La presente invencion se dirige a un procedimiento para la produccion de vectores virales recombinantes a tftulos elevados que incorporan una variedad de progresos importantes de la tecnica. El procedimiento de la presente invencion incorpora las caracterfsticas multiples que proporcionan la produccion incrementada de virus, particularmente los virus que codifican los transgenes exogenos. El procedimiento ilustrado especfficamente describe un procedimiento para la produccion de medio libre de suero de tftulo elevado de los adenovirus defectuosos en la replicacion recombinante que contienen un transgen exogeno. La presente invencion proporciona procedimientos para la preparacion de microvehfculos, procedimientos para la siembra de biorreactores a una densidad celular elevada, para incrementar la infectividad de las celulas productoras a los virus, procedimientos para incrementar el rendimiento de producto a traves de la sincronizacion del ciclo celular de las celulas productoras y procedimientos para minimizar los efectos perjudiciales de los genes transgenicos. La presente invencion proporciona ademas celulas productoras preparadas mediante el procedimiento de la presente invencion. La presente invencion proporciona ademas los virus producidos segun el procedimiento.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 es una representacion fotografica de los microvehfculos recubiertos con celulas examinadas bajo microscopio optico. El panel A representa los microvehfculos confluentes que poseen aproximadamente 106 celulas/ml o un promedio aproximadamente de 23 celulas por microvehfculo. El panel B demuestra los resultados de la superconcentracion de las celulas en los microvehfculos de aproximadamente 107 celulas/ml o un promedio de aproximadamente 230 celulas por microvehfculo.

La Figura 2 es una representacion grafica de los niveles de produccion de partfculas virales de ACN53 producidas mediante el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 a 5 en la presente memoria. El eje vertical representa el numero total de partfculas virales en el biorreactor. El eje horizontal representa el tiempo posterior a la infeccion en horas. En este ejemplo 5 x 106 celulas/ml se infectaron con los virus resultando en la produccion de aproximadamente 12.800 partfculas virales ACN53 por celula.

La Figura 3 es una representacion grafica de la produccion del virus ACN-Rb110 sustancialmente tal como se describe en los Ejemplos 1 a 5 de la presente memoria. El eje vertical representa el numero total de partfculas virales. El eje horizontal representa el tiempo posterior a la infeccion en horas. Estos datos demuestran la produccion de aproximadamente 39.000 partfculas virales ACN-Rb110 por celula.

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Descripcion detallada de la invencion

La produccion de virus mediante el cultivo de celulas de mamffero depende de una variedad de factores. Segun se describe a continuacion, se puede utilizar una variedad de tecnicas para mejorar la produccion de virus dentro de una celula productora dada, tales como la sincronizacion de las celulas productoras, el aumento de la infectividad de las celulas productoras y la supresion de los efectos de los trangenes durante el cultivo. Aunque es teoricamente factible producir grandes cantidades de partfculas virales mediante la expansion de la escala de la instalacion de la produccion o mediante la repeticion de procedimientos de bajo rendimiento, estos factores se combinan para vencer la utilidad comercial de tales enfoques. En consecuencia, la eficacia total del procedimiento en un volumen dado depende, en gran parte, de la concentracion de celulas que se pueden mantener eficazmente en un volumen dado del medio. Si uno puede conseguir una concentracion elevada de celulas productoras viables en un volumen dado, combinada con una produccion elevada de virus intracelulares, se mejora la eficacia total del procedimiento para hacer que el procedimiento sea economico.

I. Alcanzar una densidad celular elevada en un reactor basado en un microvehiculo:

La presente invencion proporciona un procedimiento para la obtencion de una densidad celular superior a 5 x 106 celulas productoras/ml en un procedimiento de biorreactor basado en un microvehiculo para la produccion de un virus en una celula productora, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) preparar un cultivo de celulas productoras unidas a microvehiculos en los que la proporcion de celulas productoras a microvehiculos sea de 10 celulas/microvehfculo.

b) sembrar el biorreactor con una cantidad de microvehiculos recubiertos con celulas productoras preparadas en la etapa (a) hasta una densidad superior a aproximadamente 6 gramos (basado en el peso seco del microvehiculo) de los microvehiculos recubiertos de celulas productoras por litro de volumen del medio de biorreactor; y

c) cultivar las celulas productoras en el biorreactor bajo condiciones de perfusion en un medio que contiene suero hasta una densidad superior a 100 celulas/microvehfculo, en el que el virus producido por el procedimiento es seleccionado de entre baculoviridiae, parvoviridae, picornaviridiae, herpesviridae, poxiviridae, o adenoviridiae.

Biorreactor:

El termino “biorreactor” se refiere a un dispositivo para el cultivo celular que contiene un recipiente en el que se mantiene el cultivo celular. El diseno del biorreactor deberfa asegurar la esterilidad y proporcionar confinamiento de la celula productora y del virus construidos geneticamente. Se dispone comercialmente de una variedad de biorreactores para el cultivo de celulas productoras dependientes del anclaje y de cultivos en suspension y son bien conocidos por los expertos en la materia y se pueden adaptar facilmente a la forma de realizacion de la presente invencion. Los biorreactores estan provistos preferentemente de un sistema de agitacion para mantener el contenido uniformemente mezclado y para facilitar la transferencia de oxfgeno. Preferentemente, el biorreactor comprende sensores que permiten la monitorizacion y manipulacion de tantos parametros de proceso como sea posible (temperatura, pH, oxfgeno disuelto) de forma que estos parametros se puedan mantener dentro de los intervalos optimos para el crecimiento celular. En una forma de realizacion preferida de la presente invencion un biorreactor contiene un aparato para oxigenar el medio que esta separado del lecho del microvehiculo. Un biorreactor util preferido en la forma de realizacion de la presente invencion es el biorreactor CelliGen Plus® provisto del rotor Cell- Lift® para una cizalladura baja y una oxigenacion elevada en los cultivos de microvehiculos disponibles comercialmente en New Brunswick Scientific Company, Inc., 44 Talmadge Road, Edison, New Jersey, USA, 088184005. Se pueden utilizar ciertas modificaciones, tales como el tubo de sedimentacion celular o la columna decantadora, para facilitar la manipulacion del cultivo (disponible comercialmente en New Brunswick Scientific).

Virus y vectores virales

Los terminos virus y vector(es) se utilizan de forma intercambiable en la presente memoria. Los terminos “partfculas” o “partfculas virales” se refieren a viriones o envueltas en los que se empaqueta el genoma viral. Los virus que se van a producir segun la forma de realizacion de la presente invencion incluyen virus de ADN y ARN envueltos o no envueltos modificados recombinantemente, preferentemente seleccionados de entre baculoviridae, parvoviridae, picornoviridae, herpesviridae, poxviridae, adenoviridae o picornaviridae. Los virus pueden ser virus que estan presentes en la naturaleza o sus genomas virales se pueden modificar mediante tecnicas de ADN recombinantes para incluir la expresion de transgenes exogenos y se pueden construir para ser deficientes en la replicacion, replicar condicionalmente o replicar competentemente. Los vectores hfbridos que explotan elementos ventajosos de cada una de las propiedades del vector genitor (ver, por ejemplo, Feng, et al., (1997) Nature Biotechnology 15:866870) se pueden producir asimismo mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. Los sistemas de vector mfnimo en los que el esqueleto viral contiene solo las secuencias necesarias para el empaquetamiento del

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vector viral y pueden incluir opcionalmente un casete de expresion transgenico se pueden producir asimismo segun la forma de realizacion de la presente invencion. La presente invencion es particularmente util en la preparacion de los virus que se derivan de genomas adenovirales y virales adeno-asociados. En la forma de realizacion mas preferida de la presente invencion, los vectores que se van a producir son vectores no competentes en la replicacion derivados del genoma de adenovirus humano. En la forma de realizacion mas preferida de la presente invencion, los vectores que se van a producir son vectores deficientes en la replicacion o adenovirales replicantes condicionalmente. En la forma de realizacion mas preferida de la presente invencion segun se ejemplifica en la presente memoria, los vectores que se van a producir son vectores adenovirales deficientes en la replicacion (E1 defectuoso/suprimido) que codifican un casete de expresion para el gen supresor de tumor exogeno en una celula infectada por el vector.

Los vectores virales replicantes condicionalmente se utilizan para la obtencion de una expresion selectiva en tipos de celulas particulares mientras evitan una infeccion adversa de amplio espectro. Ejemplos de vectores replicantes condicionalmente se describen en Bischoff, et al., (1996) Science 274:373-376; Pennisi, E. (1996) Science 274:342343; Russell, S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8):1165-1171. Ademas, el genoma viral se puede modificar para incluir los promotores inducibles que logran la replicacion o expresion del transgen solo bajo ciertas condiciones. Se conocen en la literatura cientffica ejemplos de promotores inducibles (ver, por ejemplo, Yoshida y Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; lida, et al., (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al., (1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al., (1997) Mol. Cel. Biol. 17(9):5097-5105; y Dreher, et al., (1997) J. Biol. Chem. 272(46):29364-29371. El transgen puede asimismo estar bajo control de una region promotora especffica de tejido que permita la expresion del transgen solo en tipos de celulas particulares.

Puede ser valioso en algunos casos utilizar virus que efectuen la expresion del transgen en un tipo de celula particular. Ciertos vectores presentan un tropismo natural para ciertos tipos de tejido. Por ejemplo, los vectores derivados del genero herpesviridae han mostrado que poseen una infeccion preferencial de las celulas neuronales. Ejemplos de vectores herpesviridae modificados recombinantemente se describen en la patente US n° 5.328.688 publicada el 12 de julio de 1994. La especificidad del tipo celular o la eleccion del tipo celular se puede conseguir asimismo en vectores derivados de virus que poseen de forma caracterfstica infectividades amplias mediante la modificacion de las protefnas de envuelta virales. Por ejemplo, la eleccion celular se ha conseguido con vectores de adenovirus mediante la modificacion selectiva de la protuberancia y fibra del genoma viral que codifican las secuencias para la obtencion de la expresion de los dominios de protuberancia y fibra modificados que poseen una interaccion especffica con receptores de superficie celular unicos. Ejemplos de tales modificaciones se describen en Wickham, et al., (1997) J. Virol. 71(11):8221-8229 (incorporacion de peptidos RGD en protefnas de fibra adenovirales); Arnberg, et al., (1997) Virology 227:239-244 (modificacion de los genes de fibra adenovirales para la obtencion de tropismo en el ojo y en el tracto genital); Harris y Lemoine (1996) TIG 12(10):400-405; Stevenson, et al., (1997) J. Virol. 71(6):4782-4790; Michael, et al., (1995) Gene Therapy 2:660-668 (incorporacion de un fragmento de peptido liberador de gastrina en la protefna de la fibra del adenovirus); y Ohno, et al., (1997) Nature Biotechnology 15:763-767 (incorporacion del dominio de union de la protefna A-IgG en el virus Sindbis). Se han logrado otros procedimientos de eleccion especffica celular mediante la conjugacion de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para las protefnas de la envoltura (ver, por ejemplo, Michael, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:68666869, Watkins, et al., (1997) Gene Therapy 4:1004-1012; Douglas, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:15741578. De forma alternativa, las mitades particulares se pueden conjugar con la superficie viral para la obtencion de la eleccion (ver, por ejemplo, Nilson, et al., (1996) Gene Therapy 3:280-286 (conjugacion de EGF con protefnas retrovirales). Estos vectores modificados recombinantemente se pueden producir segun la forma de realizacion de la presente invencion.

En la forma de realizacion preferida de la presente invencion, el virus que se va a producir se deriva del genero adenoviridae. Los virus particularmente preferidos se derivan del adenovirus humano del tipo 2 o del tipo 5. Tales virus son preferentemente deficientes en la replicacion mediante modificaciones o supresiones en las regiones codificadoras E1a y/o E1b. Se prefieren otras modificaciones en el genoma viral para la obtencion de caracterfsticas de expresion particulares o para permitir la administracion repetitiva o disminuir la respuesta inmune. Son mas preferidos los adenovirus recombinantes que poseen deleciones completas o parciales de la region codificadora E4, que retienen opcionalmente E4orf6 y E4orf6/7. La secuencia codificadora E3 se puede suprimir pero es preferible retenerla. En particular, se prefiere que la region operadora promotora de E3 se modifique para incrementar la expresion de E3 para la obtencion de un perfil inmunologico favorable para los vectores terapeuticos. Mas preferidos son los vectores de tipo 5 adenovirales humanos que contienen una secuencia de ADN que codifica p53 bajo el control de la region promotora del citomegalovirus y la secuencia gufa tripartita que posee E3 bajo control del promotor CMV y la delecion de las regiones codificadoras E4 mientras retienen E4orf6 y E4orf6/7. En una forma de realizacion mas preferida de la presente invencion segun se ejemplifica en la presente memoria, el vector es ACN53, segun se describe en Wills, et al., (1994) Human Gene Therapy 5:1079-1088.

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Celulas productoras:

El termino “celula productora” se utiliza en la presente memoria para describir una linea celular de empaquetamiento viral que depende del anclaje. Las celulas dependientes del anclaje, o cultivos derivados de las mismas, son las que creceran, sobreviviran, o mantendran la funcion optimamente cuando se unan a una superficie tal como vidrio o plastico. La utilizacion de este termino no implica que las celulas sean normales o que sean o no transformadas neoplasicamente. Dependiendo de la naturaleza del virus que se va a propagar, el genoma de la linea celular se puede modificar para complementar deleciones en el genoma viral utilizado como vector. Cuando el vector es competente en la replicacion, cualquiera de las lineas celulares que dependen del anclaje comunmente utilizadas para el cultivo de celulas de mamifero se pueden utilizar como lineas celulares de empaquetamiento viral. Ejemplos de tales lineas celulares dependientes del anclaje comunmente utilizadas como lineas celulares de empaquetamiento de vector viral son HeLa o celulas 293 (Graham y Smiley (1997) J. Gen. Virol. 36:59-72), y celulas PERC.6 (segun se ha descrito en la publicacion del documento WO/97/00326, serie de solicitud n° PCT/NL96/00244).

En algunas aplicaciones, particularmente cuando el virus se va a utilizar para aplicaciones de la terapia genica, es preferible que el vector sea deficiente en la replicacion (o defectuoso en la replicacion) para evitar la proliferacion no controlada del virus en el individuo que se va a tratar. En tales circunstancias, se seleccionan las lineas celulares de mamifero que se hayan construido, mediante modificacion del genoma de celulas productoras para codificar funciones virales esenciales o mediante la coinfeccion de la celula productora con un virus auxiliar, para expresar las protefnas que complementan el efecto de las secuencias suprimidas del genoma viral.

En el caso en que el virus que se va a producir sea un adenovirus recombinante que produce deficiencia en la replicacion mediante la supresion de las funciones E1a y/o E1b se prefiere particularmente la linea celular 293 debido a su habilidad para complementar la funcion E1a y E1b adenoviral. Sin embargo, las celulas 293 se pueden utilizar asimismo para la expresion de los adenovirus replicantes de forma competente o condicional en la replicacion. Ejemplos de otras lineas celulares que se pueden utilizar para la produccion de adenovirus defectuosos E1 son las celulas PERC.6 (disponibles en IntroGene, b.v., P.O. Box 2048, Leiden, Holanda) que codifican E1 en trans y se ha demostrado que poseen una union excelente a una superficie de microvehfculo.

Transgenes:

Los vectores recombinantes que se van a producir mediante los procedimientos de la presente invencion pueden contener opcionalmente un casete de expresion de transgen. El termino “casete de expresion” se utiliza en la presente memoria para definir una secuencia de nucleotido (ADN o ARN) que contiene elementos reguladores y una secuencia codificadora de transgen de forma que efectue la expresion del transgen en la celula objetivo. Los elementos reguladores incluyen promotores, potenciadores, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc. El termino “transgen” comprende no solo la secuencia que codifica las protefnas de tipo salvaje y las variaciones alelicas sino tambien las secuencias de protefnas homologas de otros organismos, ademas de cualquier mutacion o truncamiento, las mismas que expresan la misma funcion esencialmente como la secuencia de polinucleotido o protefna de tipo salvaje. Los ejemplos de transgenes que se pueden incluir en tales vectores incluyen genes supresores de tumores, inhibidores de cinasa dependientes de la ciclina, genes citotoxicos, genes citostaticos, genes proapoptoticos, genes activadores de profarmaco, antfgenos especfficos de tumores, o secuencias hfbridas. La expresion “genes supresores de tumores (TSG)” se refiere a los genes que cuando se expresan en una celula objetivo, son capaces de suprimir el fenotipo neoplasico. Ejemplos de antfgenos especfficos de tumores incluyen MART1 y gp100 (Zhai, et al., (1997) J. immunotherapy 20:15-25). Ejemplos de genes supresores de tumores incluyen el gen Rb de retinoblastoma y sus variantes Rb110 y Rb56, el gen MmAC-1 , el gen p53, el gen DCC, el gen NF-1, los genes erbA y erbB, p33 y p73. La expresion “inhibidores de cinasa dependiente de ciclina” comprende los genes p27kip, p57kip2, p15ink4b, p18ink4c, p19ink4d, p16ink4a y p21sdi-1. El termino “genes citotoxicos” se refiere a los genes que se disenan para poseer un efecto toxico en la celula objetivo, solos o en conjuncion con los agentes qufmicos exogenos (por ejemplo, genes activadores de profarmaco). Ejemplos de tales genes citotoxicos incluyen secuencias de ADN que codifican los dominios citotoxicos de la ricina, de la difteria, o de la exotoxina pseudomonas ademas del gen de adenovirus E311.6, adenovirus E1a. Ejemplos de genes activadores de profarmaco incluyen los genes de cinasa timidina y citosina desaminasa. Los genes proapoptoticos incluyen los genes p53 y de la ruta p53 (por ejemplo, bax, bid, caspasas, citocromo c, etc) y adenovirus E4orf4. Ejemplos de otros transgenes terapeuticos que se pueden incluir en los vectores que se van a producir mediante la forma de realizacion de la presente invencion incluyen interferones (alfa, beta, gamma y consenso), protefnas de fusion de a2b E2F-Rb de interferon, interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-10), dopamina, serotonina, GABA, ACTH y NGF.

Microvehfculo(s):

La mayorfa de celulas animales utilizadas en la produccion de virus dependen del anclaje y requieren la union a una superficie para un crecimiento optimo. En 1967 Van Wezel describio la utilizacion de partfculas pequenas (0,2 mm), microvehfculos, para el crecimiento de celulas que dependfan del anclaje. Estos microvehfculos se suspenden en el medio de cultivo mediante agitacion suave de forma que se obtenga un entorno homogeneo. Puesto que las celulas se localizan sobre la superficie, estan sometidas a tension mecanica y se deben tomar precauciones para evitar el

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cizallamiento de las celulas de la superficie durante el cultivo. Los granulos macroporosos en los que las celulas que dependen del anclaje tienen la posibilidad de utilizar la superficie interior se pueden utilizar asimismo para reducir la posibilidad que las fuerzas de cizalladura puedan romper las celulas que se van a cultivar. Sin embargo, tales microvehfculos limitan el area de superficie disponible para la infeccion viral de forma que se deberfan ajustar los parametros de infeccion viral. Los microvehfculos se han realizado en materiales sinteticos diferentes que incluyen dextrano. La union celular a estos microvehfculos cargados esta mediada por atracciones ionicas. Muchos tipos de celulas poseen una protefna de superficie celular, fibronectina, que posee una union bioespecffica con la gelatina facilitando la utilizacion de los microvehfculos recubiertos de gelatina. Una ventaja de la utilizacion de la gelatina es su susceptibilidad a la degradacion con enzimas proteolfticas, lo que permite la liberacion de las celulas desde los microvehfculos con casi 100% de viabilidad mediante la disolucion de la matriz de gelatina con tripsina.

En la forma de realizacion preferida de la presente invencion, los microvehfculos son microvehfculos Cytodex® disponibles comercialmente en Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia. Los microvehfculos Cytodex® se basan en los granulos de dextrano reticulados. Los granulos son transparentes, esfericos e hidratados y se sustituyen con grupos cargados positivamente. Los microvehfculos poseen un diametro medio de aproximadamente 200 mm y una densidad de 1,03 g/cm3. Se ha derivatizado Cytodex® para formar tres tipos; Cytodex® 3 esta recubierto con colageno. En la forma de realizacion preferida de la presente invencion segun se muestra a tftulo de ejemplo en la presente memoria, el microvehfculo es Cytodex® 1.

Union de las celulas a la superficie del microvehfculo:

Se produce un cultivo de celulas productoras unidas a microvehfculos cuando los microvehfculos se ponen en contacto con las celulas productoras en un medio que contiene suero y se someten a las condiciones que permiten el crecimiento. Las celulas crecen en presencia de los microvehfculos y producen nuevas celulas hijas, que se transfieren a la superficie del microvehfculo expuesta mediante la agitacion del cultivo. Tras la finalizacion del procedimiento descrito, las celulas se concentran hasta una densidad elevada superior a 100 celulas por microvehfculo. Esta concentracion elevada de celulas en el microvehfculo facilita el nivel elevado de produccion del virus.

Se puede utilizar una variedad de procedimientos para la obtencion de una densidad celular elevada y facilitar la union de celulas hijas a los microvehfculos. Las condiciones se deberfan disenar para asegurar la transferencia eficaz de las celulas hijas a la superficie del microvehfculo sin sacar la celula genitora de las superficies del microvehfculo. En la situacion en la que existe una cantidad inicial baja de celulas productoras, las celulas se pueden microtriturar a partir de los microvehfculos pasando los microvehfculos recubiertos a traves de un orificio a una presion baja (aproximadamente 20 psi). Las celulas separadas se pueden utilizar a continuacion para sembrar uniformemente un numero superior de microvehfculos. De forma alternativa, uno puede sembrar el biorreactor directamente con una gran cantidad de celulas. Alternativamente, uno puede introducir los microvehfculos en un matraz que contiene el medio. Los microvehfculos se hundiran hacia el fondo del matraz y las celulas se introducen en el matraz que se hundiran y se uniran asimismo a la superficie del microvehfculo. La agitacion ligera facilita el procedimiento de union. La concentracion de las celulas sobre la superficie de los microvehfculos se puede determinar facilmente mediante microscopfa optica.

A medida que el cultivo celular se expande, es necesario monitorizar y controlar los parametros de cultivo tales como la concentracion de oxfgeno disuelto, pH, temperatura y agitacion. El pH se deberfa monitorizar mediante el procedimiento de crecimiento celular para asegurar las condiciones optimas para la replicacion celular. A medida que las celulas crecen, los metabolitos se liberan en el medio, un procedimiento que puede cambiar el pH del medio. Por lo tanto, el pH del medio se deberfa monitorizar atentamente y ajustar mediante la adicion de una base o de un acido para mantener un pH relativamente constante. El pH preciso que facilita el crecimiento optimo variara algo con la lfnea celular particular, pero generalmente esta en el intervalo del pH fisiologico. Se prefiere que para las celulas 293 el pH para el cultivo celular se mantenga en el intervalo de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 9, mas preferentemente desde aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 8, mas preferentemente desde aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente 7,5, mas preferentemente de aproximadamente pH 7,2.

La temperatura es otro parametro ffsico que se va a monitorizar y a controlar. La temperatura en el cultivo celular se deberfa estabilizar asimismo a la temperatura del crecimiento optimo de la lfnea celular para la obtencion de una densidad celular elevada. Las celulas de mamffero poseen una temperatura optima para el crecimiento. Si crece a una temperatura inferior a la minima, el crecimiento celular sucede lentamente. Por otro lado, si la temperatura de crecimiento es demasiado elevada, puede producirse la muerte celular. En la forma de realizacion preferida de la presente invencion, cuando la lfnea celular productora es la lfnea celular 293, la temperatura se deberfa mantener aproximadamente por debajo de 40°C, mas preferentemente en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 38°C, mas preferentemente a aproximadamente 37°C.

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Siembra:

El termino “siembra” segun se describe en la presente memoria describe la introduccion de las celulas productoras en el volumen de lecho del microvehfculo. Los microvehfculos recubiertos preparados segun el Ejemplo 1, a continuacion, se introducen despues en el biorreactor. El biorreactor se “siembra” con una cantidad de microvehfculos recubiertos de aproximadamente 6 gramos (basado en el peso seco del microvehfculo) de microvehfculos recubiertos por litro de volumen del biorreactor. Esto es sustancialmente mayor que el volumen recomendado para la siembra de microvehfculos en un volumen dado. La convencion en la tecnica es que los microvehfculos recubiertos no deberfan ocupar un volumen superior a aproximadamente 5% del recipiente/volumen del medio, es decir, aproximadamente 2 gramos (basado en el peso seco del microvehfculo) de microvehfculos recubiertos por litro del medio/volumen del recipiente. En la forma de realizacion de la presente invencion, es aproximadamente 10 gramos (basado en el peso seco del microvehfculo) el volumen de microvehfculos recubiertos depositados lo que comprende aproximadamente 20% del volumen del recipiente. Esta concentracion elevada de microvehfculos contribuye a una densidad celular elevada en el cultivo final del virus recombinante e incrementa el rendimiento viral. Para la obtencion de rendimientos elevados en la forma de realizacion de la presente invencion, la concentracion de los microvehfculos recubiertos deberfa ser aproximadamente de 6 a 25 gramos (basado en el peso seco del microvehfculo) por litro del volumen de reaccion, preferentemente de 6 a 15 gramos, y mas preferentemente aproximadamente 10 gramos (basado en el peso seco del microvehfculo) por litro de volumen de reaccion.

Celulas que crecen en el medio que contiene suero hasta una densidad celular elevada:

Las celulas crecen a continuacion en el biorreactor bajo condiciones de perfusion. El cultivo de celulas de mamffero bajo condiciones de perfusion es bien conocido en la tecnica. Sin embargo, se deberfa indicar que ciertos parametros se deberfan optimizar para la obtencion de un crecimiento celular maximo. Por ejemplo, es necesario monitorizar el contenido de oxfgeno durante todo el cultivo. A causa de que el oxfgeno es soluble en agua de forma moderada (8,4 mg/l a 25°C), se debe suministrar continuamente al cultivo en crecimiento en forma de aire esterilizado o de oxfgeno puro. La concentracion de oxfgeno disuelto se deberfa mantener en el intervalo de aproximadamente 5% a aproximadamente 200%, preferentemente desde 50% a aproximadamente 120%, mas preferentemente a aproximadamente 100%. La concentracion de oxfgeno disuelto se define segun el punto en el que el 100% de oxfgeno disuelto representa la concentracion de oxfgeno disuelto en el medio en equilibrio con el aire. La concentracion de oxfgeno se puede medir por medios convencionales tales como las sondas de monitorizacion de oxfgeno disuelto disponibles comercialmente en Instech Laboratories, Inc. 5209 Militia Hill Road, Plymouth Meeting PA 19462-1216 o en Lazar Research Laboratories, Los Angeles, CA.

La agitacion adecuada del cultivo del biorreactor es esencial para asegurar un suministro adecuado de nutrientes y para prevenir la acumulacion de metabolitos toxicos dentro del biorreactor. La agitacion del medio afecta asimismo a la velocidad de transferencia del oxfgeno. La agitacion excesiva puede causar dano mecanico a las celulas de mamffero. Se deberfa evitar la espuma ya que el burbujeo asociado con el proceso de la espuma puede generar suficientes fuerzas de cizalladura dentro del cultivo para resultar en el desplazamiento de las celulas de la superficie del microvehfculo o lisis de las celulas. Por lo tanto, se debe mantener un equilibrio entre la necesidad de proporcionar un buen mezclado y la necesidad de evitar el dano celular. En la forma de realizacion preferida de la presente invencion, segun se muestra a tftulo de ejemplo en la presente memoria, se mantiene una agitacion aproximadamente de 70 rpm utilizando un biorreactor CelliGen Plus de 5 litros. Para minimizar el espumado, el medio se separa de las celulas y se oxigena antes de la reintroduccion a las celulas mediante la utilizacion de un dispositivo de burbujeo en el biorreactor.

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II. Produccion de particulas virales en la linea celular de empaquetamiento:

El procedimiento de la presente invencion proporciona ademas un procedimiento para la produccion de una poblacion de celulas productoras que contienen una concentracion elevada de particulas virales en un biorreactor basado en un microvehiculo en un medio libre de suero, comprendiendo dicho procedimiento el proceso descrito anteriormente y que comprende ademas las etapas siguientes:

d) eliminar el medio que contiene el suero;

e) sincronizar las celulas productoras en la fase G1;

f) infectar las celulas productoras con un virus;

g) cultivar las celulas bajo condiciones que permitan la replicacion viral hasta que se consiga un punto maximo.

Para preparar el biorreactor para la introduccion de medio libre de suero, en primer lugar se permite que cese la agitacion en el biorreactor. Los granulos del microvehiculo a continuacion precipitaran en la suspension y sedimentaran en el fondo del volumen del reactor, lo que permite que se drene el medio que contiene el suero. A continuacion se lavan los granulos con medio libre de suero para minimizar el porcentaje del medio que contiene el suero. El lavado se lleva a cabo mediante la restitucion de la suspension del microvehiculo a su volumen original con medio libre de suero y logrando la suspension completa de los microvehfculos mediante la agitacion suficiente. Este medio se drena a continuacion segun se ha descrito anteriormente. Esta etapa de lavado se puede repetir para la obtencion de la eliminacion maxima del medio que contiene el suero.

Se anade a las celulas el medio libre de suero en una cantidad suficiente para sustentar el cultivo celular durante la infeccion. El medio libre de suero se define como el medio de crecimiento para el cultivo celular animal sustancialmente libre de suero derivado de animal. El medio libre de suero se conoce bien en la tecnica (ver, por ejemplo, Freshney, R.I. Culture of Mammalian Cells, 1983, pags. 76-77. Alan R. Liss Company, Nueva York). El medio libre de suero simple se puede complementar con factores adicionales suficientes para posibilitar el crecimiento de las celulas. De forma alternativa, el medio libre de suero completo suficiente para sustentar el crecimiento de las celulas de mamffero esta disponible comercialmente a partir de una variedad de suministradores comerciales. Ejemplos de medio libre de suero preferidos incluyen medio libre de suero JRH Ex-Cell 525 (numero de catalogo 61129-79P), medio libre de suero CellGro (disponible comercialmente en Gibco-BRL Life Sciences, Gaitherburg Maryland, USA), medio libre de suero HyClone (#A-1111 -L) disponible comercialmente en HyClone.

Aditivos del medio:

El medio libre de suero se complementa frecuentemente con una o mas hormonas tales como la insulina, la transferrina, el factor de crecimiento epidermico, la hidrocortisona, etc. El medio libre de suero se puede potenciar asimismo con agentes adicionales para facilitar el crecimiento de las celulas y puede depender de la linea celular utilizada en el virus que se va a producir. Por ejemplo, el medio se puede potenciar con TGF-beta o agentes que sobrerregulen el factor de crecimiento de transformacion endogeno (TGF)-beta en la celula. Alternativamente, se pueden anadir al cultivo agentes que sobrerregulan o estabilizan los receptores de union virales, tales como las integrinas avp3 y avp5, para mejorar la eficacia de la infeccion. En la forma de realizacion mas preferida de la presente invencion segun se muestra a tftulo de ejemplo en la presente memoria, el medio libre de suero es el medio Eagle modificado de Dulbecco Biowhittaker #12-604-F (DMEM) que contiene 1% de CMF-1 (Applied Nutrient Sciences, Sorrento Valley, CA).

Supresion de los transgenes perjudiciales:

En el caso en que el virus recombinante utilice un promotor muy fuerte (por ejemplo CMV) para la expresion del transgen, la produccion de protefna recombinante empezara a competir con las fuentes necesarias para la replicacion viral optima. En consecuencia, puede ser ventajoso anadir elementos al medio libre de suero que infrarregulen o inhiban el promotor transgenico. Por ejemplo, cuando el promotor transgenico es el promotor temprano de citomegalovirus (CMV), se pueden anadir elementos tales como la neuramidasa o la tunicamicina para suprimir el promotor CMV durante el cultivo.

En segundo lugar, se conoce que los transgenes terapeuticos particulares pueden poseer un efecto negativo sobre la celula productora. Por ejemplo, los genes supresores de tumores tales como p53 se sabe que inducen la apoptosis en celulas normales con dosificacion celular suficiente. En consecuencia, los virus que expresan tales transgenes son particularmente diffciles de cultivar en una densidad elevada. Por ejemplo, una comparacion de los rendimientos a partir de la forma de realizacion de la presente invencion representada en las figuras 2 y 3 demuestra el rendimiento viral significativamente inferior como resultado de la expresion del gen supresor del tumor p53. La presente invencion proporciona un procedimiento para minimizar el efecto negativo de un transgen toxico a la celula productora mediante la adicion de un agente al medio de cultivo en una concentracion suficiente para inhibir el

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promotor que impulsa el transgen. El agente que se va anadir dependera del promotor utilizado para impulsar la expresion de transgen pero no debena interferir materialmente con la expresion de genes virales esenciales para la replicacion viral. Por ejemplo, el promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus es un promotor utilizado comunmente para impulsar la expresion del transgen. Este promotor contiene sitios de union para el factor de transcripcion NF-kB y requiere la forma activada de NF-kB para su actividad. Ver, por ejemplo, Bellas, et al., (1995) J. Clinical Investigations 96: 2521-27 y Loser, et al., (1998) J. Virology 72:180-190. En presencia de compuestos que inhiben la activacion de NF-kB, tales como N-acetil-L-cistema o pentoxifilina, la actividad del promotor CMV se puede reprimir a niveles de fondo (Bellas, et al. supra). De este modo la represion transitoria del promotor CMV mediante la adicion de tales agentes a los cultivos durante la fase de produccion de los virus recombinantes, que codifican los transgenes citotoxicos/citostaticos que impulsan el promotor CMV, mejorara el rendimiento de tales virus. Las concentraciones eficaces de N-acetil-L-cistema y pentoxifilina son aproximadamente de 10 a 30 mM y de 0,5 a 3,0 mM, respectivamente. De forma similar, los inhibidores de la actividad de NF-kB son utiles para evitar la expresion de transgen en situaciones en las que el VIH-1-LTR se utiliza para impulsar la expresion del transgen (Mhashilkar, et al., J. Virology 71:6486-6494). Se conocen en la tecnica ejemplos de agentes capaces de suprimir la accion de otros promotores y sus intervalos de concentracion eficaces y se pueden sustituir en la forma de realizacion de la presente invencion.

En el caso en que el transgen citotoxico/citostatico este bajo el control de un promotor activo en solo (o principalmente) un tipo de celula particular, se prefiere que se utilice una lmea celular productora en la que este inactivo el promotor espedfico de la celula (o del tejido). Por ejemplo, cuando el promotor es activo solo en celulas de tngado (ver, por ejemplo, promotor a-fetoprotema (Huber et al., PNAS 88:8039-8043)) la lmea celular productora preferentemente no se deriva de una lmea celular de hfgado. Ademas, en el caso de los promotores inducibles segun se han descrito anteriormente, se prefiere que se mantengan las condiciones de cultivo (composicion qmmica, temperatura, etc) de forma que se evite la expresion del transgen a partir del promotor inducible.

Sera evidente para los expertos en la materia que el procedimiento anterior para suprimir el efecto del transgen se pueda aplicar a cualquier procedimiento para el cultivo de celula eucariotica incluyendo pero no limitandose al cultivo basado en microvehmulo, cultivo en suspension, cultivo giratorio, y el denominado cultivo de celulas en “botella en rotacion”.

Sincronizacion:

Para la obtencion de un rendimiento maximo, se prefiere que las celulas se sincronicen en la fase G1 con el virus recombinante antes de la infeccion. Manteniendo las celulas en la fase G1, se preparan optimamente para ser empujadas a la fase S, en la que en primer lugar ocurre la smtesis de acido nucleico. Sincronizando las celulas, uno consigue el pico de la produccion viral intracelular. En ausencia de la sincronizacion, la subpoblacion de celulas productoras avanzadas en el ciclo celular experimental la lisis celular viral antes del punto de cosecha optimo. Estos viriones, que se arrojan al sobrenadante del biorreactor, se perderan tras el cultivo celular. De forma similar, las celulas que se quedan atras en la fase G1 no alcanzaran las concentraciones virales optimas en el tiempo de la cosecha.

De forma alternativa, otro mecanismo para mejorar la produccion de virus mediante la sincronizacion de las celulas productoras es la estabilidad del virus o la infeccion posterior de ADN viral no encapsidada. Se ha mostrado, por ejemplo, que los retrovirus poseen una vida media de 4 a 6 horas posteriores a la infeccion y que las velocidades de infeccion mas elevadas se observan cuando las celulas se sincronizan. Andreadis, et al., (1997) J. Virol. 71:7541-8: Andreadis, et al., (1998) Biotechnology and Bioengineering 58:272-281; Andreadis, et al., (1996) J. Theor. Biol. 182:1-20.

Se pueden utilizar una variedad de medios para sincronizar las celulas en la fase G1. Mantener las celulas productoras en el medio libre de suero sincronizara las celulas en la fase G0/G1. Optimamente, uno mantiene las celulas en el medio libre de suero durante aproximadamente un tercio del ciclo celular (aproximadamente 6 a 8 horas) para sincronizar completamente las celulas. De forma alternativa, se pueden anadir agentes que sincronicen las celulas. Ejemplos de tales agentes incluyen la TGF-beta que produce la detencion del ciclo celular en la interfase G1/S. De forma similar, los inhibidores de la fosfatidilinositol 3-cinasa (por ejemplo, la wortmanina y la LY294002 (Eli Lilly and Company)) bloquearan las celulas en la fase G1. Bacqueville, et al., (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 244:630-636. Ademas, los inhibidores de proteosoma tales como la lactacistina y/o la N-carbobenzoxi-L-leucil-L- leucil-L-norvalinal han demostrado que inducen la detencion del ciclo celular en las fases G1 y G2 del ciclo celular. Mutomba, et al., (1997) Mol. Biochem. Parisitol. 90:491-504. Ejemplos de otros compuestos que se pueden anadir para sincronizar las celulas incluyen mimosina y afidicolina (Oncogene (1997) 15(22)2749-2753), quercetina (Shen y Webber (1997) Oncol. Res. 9:597-602), epirrubicina (Hedenfalk, et al., (1997) Cytometry 29(4):321-327) y lovastatina (Molecular and Cellular Biology (1985) 6(9):1197-1213).

Sera evidente para los expertos en la materia que el procedimiento anterior para incrementar el rendimiento mediante la sincronizacion de las celulas se puede aplicar a cualquier procedimiento para el cultivo celular eucariotico pero no se limita al cultivo basado en microvehmulo, cultivo en suspension, cultivo giratorio, y el denominado cultivo de celulas en “botella en rotacion”.

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Infeccion de la linea celular productora con el virus:

En las celulas que se han infectado mediante copias multiples de un virus determinado, las actividades necesarias para la replicacion viral y el empaquetamiento de virion son cooperativas. De este modo, se prefiere que las condiciones se ajusten tal que exista una probabilidad significativa de que las celulas productoras se infecten de forma multiplicada con el virus. Un ejemplo de una condicion que aumenta la produccion del virus en las celulas productoras es una concentracion incrementada de virus en la fase de infeccion. Sin embargo, es posible que el numero total de infecciones virales por celula productora se pueda exagerar, resultando en efectos toxicos para las celulas. En consecuencia, se deberfa procurar mantener las infecciones en la concentracion de virus del intervalo de 106 a 1010, preferentemente 109, viriones por ml.

Los agentes qufmicos se pueden utilizar asimismo para aumentar la infectividad de la linea celular productora. Por ejemplo, la presente invencion proporciona un procedimiento para aumentar la infectividad de las lineas celulares productoras para la infectividad viral mediante la inclusion de un inhibidor de calpaina. Ejemplos de inhibidores de calpaina utiles en la forma de realizacion de la presente invencion incluyen el inhibidor de calpaina 1 (conocido asimismo como N-acetil-leucil-leucil-norleucinal, disponible comercialmente en Boehringer Mannheim). Se observo que el inhibidor de calpaina 1 incrementaba la infectividad de las lineas celulares productoras al adenovirus recombinante.

III. Cultivo, cosecha, lisis y purificacion:

Durante la fase en la que se procede a la replicacion viral, el biorreactor se alimenta continuamente con medio complementado libre de suero. La concentracion de oxfgeno se deberfa mantener a un nivel de aproximadamente 50% a aproximadamente 120% de oxfgeno disuelto, preferentemente aproximadamente 100% de oxfgeno disuelto. Para maximizar la concentracion intracelular de partfculas virales, se deberfa monitorizar la acumulacion de partfculas de virus dentro de las celulas. En el procedimiento preferido, se determina la concentracion viral mediante HPLC utilizando una columna Resource Q® segun se describe en el Ejemplo 7 de la presente memoria. Cuando el nivel de partfculas virales empieza a estancarse, se detiene el biorreactor y se cosechan las celulas.

La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para la produccion de partfculas virales intactas que comprende las etapas (a) a (g) anteriores y comprende ademas las etapas siguientes:

h) cosechar las celulas;

i) lisar las celulas productoras;

j) aislar las partfculas virales;

k) purificar las partfculas virales intactas.

Cuando se optimiza la concentracion de partfculas virales segun se ha determinado anteriormente, los contenidos enteros del biorreactor se eliminan y se regulan para mantener un pH de aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente 8,5. En este punto las celulas se pueden congelar para su almacenamiento a -70°C.

Lisis y purificacion:

Cuando se desea aislar las partfculas virales a partir de las celulas productoras, se lisan las celulas, utilizando una variedad de medios bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las celulas de mamffero se pueden lisar bajo condiciones de presion baja (100 a 200 psi de presion diferencial) o procedimientos de congelacion-deshielo convencionales. Se elimina el ADN/ARN libre exogeno mediante la degradacion con ADNasa/ARNasa. Las partfculas virales se purifican a continuacion por medios conocidos en la tecnica. Se pueden utilizar los procedimientos cromatograficos o de centrifugacion de gradiente de densidad diferencial. En la forma de realizacion preferida de la presente invencion, el virus se purifica mediante cromatograffa de columna sustancialmente segun el procedimiento de Huyghe et al., (1995) Human Gene Therapy 6:1403-1416 segun se ha descrito en la solicitud de patente US n° 08/400.793 en tramite, presentada el 7 de marzo de 1995.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparacion de microvehfculos:

Los granulos de microvehfculo Cytodex 1 se prepararon mediante hinchamiento e hidratacion en PBS. El PBS para este procedimiento se preparo mediante una dilucion 1:10 de salino regulado con fosfato 10x (PBS) en agua Milli-Q (pH 7,5). Se anadieron 10 gramos de granulos de microvehfculo de Cytodex 1 a una botella de 500 ml limpia. Se anadieron aproximadamente 300 a 400 mililitros de PBS a la botella y los contenidos se agitaron hasta que los microvehfculos se hidrataron y se suspendieron completamente (aproximadamente 3 minutos). Se dejaron sedimentar los microvehfculos durante aproximadamente 10 minutos. Se elimino el PBS mediante aspiracion. El

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procedimiento de lavado se repitio dos veces.

Se resuspendieron los microvehnculos en un volumen final de 300 ml de PBS. Los microvefnculos se esterilizaron en un autoclave durante 30 minutos a 250°F. La botella que contema los microvefnculos esteriles se transfirio a una campana de laboratorio de flujo laminar. Se elimino el PBS mediante aspiracion y se lavaron los granulos una vez como se habfa hecho anteriormente con PBS esteril. Los microvefnculos se lavaron a continuacion una vez mas en DMEM esteril que contema 10% de suero bovino fetal (FBS). Se resuspendieron los microvefnculos a un volumen final de 300 ml con DMEM esteril que contema 10% de FBS.

Ejemplo 2. preparacion de las celulas 293 gt:

Se colocaron 10 ml de DMEM esteril que contema 10% de FBS en un tubo conico de 15 ml. Se obtuvo un vial de celulas 293 GT que contema aproximadamente 5 x 106 celulas a partir del almacenamiento en nitrogeno lfquido y se descongelaron en un bano de agua a 37°C. Se lavo el exterior del vial en isopropanol al 70% y se abrio en una campana de laboratorio de flujo laminar. Los contenidos del vial se transfirieron al tubo que contema el medio. El tubo se centrifugo a continuacion a 1.000 rpm en una centnfuga Beckman TJ6 durante aproximadamente 5 minutos. El sobrenadante se elimino a continuacion mediante aspiracion y se resuspendio el sedimento en 10 ml de medio. A continuacion se transfirio la suspension a un matraz T-225 y se incubo a 37°C durante aproximadamente 50 horas. Las celulas se dejaron crecer hasta aproximadamente un 50 a 90% de confluencia segun se determino mediante microscopfa optica.

Tras alcanzar la confluencia suficiente, se elimino el medio de los matraces y se pipetearon suavemente 10 a 30 ml de PBS junto con la parte superior de los matraces. A continuacion los matraces se dejaron tumbados, recubriendo las celulas con PBS. Se elimino el PBS de los matraces y se anadieron 10 ml de solucion de tripsina al 0,05% (tripsina 0,05%, EDTA 0,53 mM disponible comercialmente en GibcoBRL segun n° de catalogo 25300-054). El matraz se balanceo suavemente para asegurar que la solucion de tripsina cubna la monocapa. Despues de aproximadamente 45 segundos, cada matraz se sacudio fuertemente hasta que las celulas se separaron completamente del matraz. Inmediatamente, se anadieron 20 ml de medio completo a cada matraz. Los contenidos del matraz se agruparon via centrifugacion (1.000 rpm en una centnfuga Beckman TJ6 durante aproximadamente 5 minutos). El sobrenadante se decanto a partir del tubo de centnfuga, se trituro y las celulas se agruparon utilizando el medio completo. El contaje celular se determino utilizando un hemocitometro Reichert Bright-Line (Buffalo, NY).

El cultivo se dividio en cuatro matraces T-225 (aproximadamente 5 x 106 celulas por matraz). Se pipetearon 10 ml de suspension en cada uno de los matraces que se iban a sembrar. Se anadio el medio completo a cada uno de los matraces hasta un volumen de 50 ml. Se incubaron las celulas a 37°C en una atmosfera de dioxido de carbono humidificada al 7%. A continuacion las celulas se expandieron utilizando el procedimiento anterior en 20 matraces T- 225. Este procedimiento se repitio hasta que se preparo una cantidad de celulas suficiente para sembrar los microvelmculos, aproximadamente 6,5 x 108 celulas.

Ejemplo 3. Siembra de los microvehfculos

Se suspendieron aproximadamente 6,5 x 108 celulas 293 humanas, preparadas sustancialmente tal como se describe en el Ejemplo 2 anteriormente, en 5 litros de medio Eagle modificado de Dulbecco Biowhitakker # 12-604-F (DMEM), medio que contiene suero (disponible comercialmente en Biowhitakker, Inc., Walkersville, MD) y en 50 gramos de microveh^culos preparados sustancialmente tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior. La mezcla anterior se agito bien por turbulencia durante un periodo de aproximadamente 2 minutos. A continuacion la mezcla entera se sifoneo en un recipiente de cultivo limpio esterilizado de un biorreactor de 5 litros CelliGen Plus® provisto de un rotor Cell-Lift (obtenido de New Brunswick Scientific Company, Inc., 44, Talmadge Road, Edison, New Jersey, USA, 08818-4005).

Las celulas se cultivaron a continuacion a una temperatura de 37°C, manteniendo una concentracion de oxfgeno disuelto de aproximadamente 100%. Se monitorizo la concentracion de oxfgeno disuelto y se mantuvo mediante la utilizacion de una sonda de oxfgeno disuelto unida a un controlador (parte del biorreactor CelliGen Plus) de forma que el oxfgeno disuelto se mantuvo a aproximadamente 100% mediante burbujeo con aire, CO2, O2 o N2 segun fuera lo apropiado. El cultivo se mantuvo bajo presion atmosferica y a un pH de aproximadamente 7,2. El recipiente se agita a una velocidad que depende del volumen del recipiente del biorreactor y puede estar en el intervalo de aproximadamente 15 a 200 rpm. Para el biorreactor de 5 litros utilizado en la presente memoria, la velocidad de agitacion se mantuvo aproximadamente a 70 rpm. Las celulas se cultivaron hasta que la densidad celular alcanzo el nivel deseado (8 a 10 x 106 celulas por mililitro o aproximadamente 230 celulas por microveh^culo). Se puede determinar asimismo la densidad celular mediante la velocidad de consumo de oxfgeno, que es proporcional a la concentracion celular. Despues de aproximadamente 3 dfas de incubacion, el recipiente de reaccion se alimento continuamente con el medio a la velocidad de aproximadamente 0,5 litros por dfa por 1 x 106 celulas. El medio gastado se elimino via una columna de decantacion. Las celulas se dejaron cultivar durante un periodo de aproximadamente 14 dfas.

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Para determinar el numero de celulas por mililitro, se incremento la agitacion a 100 rpm y se extrajo rapidamente una muestra de 5 ml utilizando una jeringa esteril. Los contenidos de la jeringa se transfirieron a continuacion a un tubo conico de 15 ml. Cuando sedimentaron los microvehfculos, se elimino el sobrenadante mediante aspiracion y se sustituyo con un volumen identico de solucion de tripsina al 0,25 % (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM, disponible comercialmente en GibcoBRL segun n° de catalogo 25200-056). El tubo se tapo y se incubo en un bano de agua a 37°C durante aproximadamente 5 minutos (o hasta que las celulas consiguieron un aspecto erizado sobre los microvehfculos). A continuacion el tubo se sometio a turbulencia durante 20 segundos y tan pronto como los microvehfculos empezaron a sedimentar (aproximadamente 1 minuto) se extrajo una muestra de la capa de microvehfculo anterior para el contaje mediante el hemocitometro.

Ejemplo 4. Intercambio de medio

Una vez que las celulas consiguieron la densidad deseada, se desconectaron el controlador de temperatura, el agitador y la perfusion y se dejaron sedimentar los microvehfculos. Una vez que los microvehfculos sedimentaron, se elimino el medio mediante sifon. El reactor se lleno con 5 litros de DMEM (sin suero o aditivos, Biowhitakker). La agitacion se conecto de forma suficiente para romper la torta microvehfculo/celula (aproximadamente 150 rpm) durante aproximadamente 3 minutos. Se paro la agitacion y se dejaron sedimentar los microvehfculos recubiertos. Este procedimiento se repitio dos veces. A continuacion se lleno el reactor con 5 litros de DMEM que contenfa 1% de CMF-1 (Applied Nutrient Sciences, Sorrento Valley, CA). La agitacion se restituyo para romper la torta de celulas y a continuacion se fijo a 70 rpm para mantener la suspension de los microvehfculos recubiertos. El controlador de temperatura se conecto para mantener una temperatura de 37°C.

Ejemplo 5. Infeccion de la linea celular de empaquetamiento 293 con adenovirus recombinante (ACN53).

Se anadieron 5 x 1012 partfculas de adenovirus recombinante (ACN53 descrito en Wills, et al., (1994) Human Gene Therapy) al recipiente de cultivo preparado en el Ejemplo 4 anterior. Se restituyo la perfusion segun el Ejemplo 3 anterior. Despues de aproximadamente 20 horas de incubacion, se muestreo el recipiente de reaccion para la concentracion de virus. Esto se consiguio aumentando la agitacion a 100 rpm y extrayendo rapidamente una muestra de 5 ml utilizando una jeringa esteril. Los contenidos de la jeringa se transfirieron a continuacion a un tubo conico de 15 ml. Se anadieron 0,5 ml de un regulador HSM (Hepes 50 mM, sacarosa 3%, MgCh 2 mM, NaCl 150 mM y beta-ciclodextrina 5%, pH 7,5). El tubo se congelo a continuacion en nitrogeno lfquido y se descongelo rapidamente en un bano de agua a 10°C. Esto procedimiento de congelacion-deshielo se repitio dos veces. Los tubos se centrifugaron a 3.000 rpm en una centrffuga Beckman TJ6 durante aproximadamente 5 minutos. Se extrajo una muestra de sobrenadante y se determino mediante el ensayo de Resource Q® segun se ha descrito por Shabram, et al., (1996-7) Human Gene Therapy. Este procedimiento se repitio periodicamente (aproximadamente cada 2 horas) hasta que se determino que la concentracion viral empezaba a caer (es decir, se consiguio la concentracion viral optima). Los resultados se presentan en datos que se presentan en la Tabla 1 a continuacion y se proporciona una representacion grafica de los datos en la Figura 2 de los dibujos anexos.

Tabla 1. Produccion de ACN53 en celulas 293 GT

Horas posteriores a la infeccion: PN/ml PN total

24: 1,12 x 10'IU 5,58 x 10™

32: 2,67 x 10'IU 1,33 x 1014

38: 4,61 x 10™ 2,30 x 1014

46: 4,34 x 10™ 2,17 x 1014

47: 4,36 x 10™ 2,18 x 1014

48,5: 4,62 x 10™ 2,31 x 1014

49,5: 6,38 x 10™ 3,19 x 1014

50,5: 5,23 x 10™ 2,61 x 1014

51,5: 5,02 x 10™ 2,51 x 1014

52,75: 5,77 x 10™ 2,89 x 1014

53,75: 5,74 x 10™ 2,87 x 1014

54,75: 5,15 x 10™ 2,57 x 1014

Segun se puede ver en los datos presentados anteriormente, la concentracion viral optima para ACN53 se consigue aproximadamente 50 horas despues de la infeccion, aunque esto variara con las construcciones individuales. Los contenidos del recipiente se trasladaron a recipientes de congelacion seguros y se mezclaron con 10 a 20% de regulador HSM y se congelaron.

Ejemplo 6. Cosecha y lisis de las celulas infectadas:

Se lisaron los contenidos completos que contenfan las celulas mediante un procedimiento repetido de congelacion/deshielo. Se congelaron los contenidos en un congelador a -80°C y se descongelaron en un bano de

agua a temperatura ambiente. El virus se purifico sustancialmente segun el procedimiento de Huyghe et al., (1995) Human Gene Therapy 6: 1043-1416.

Ejemplo 7. Produccion de ACN-Rb110

5

Se repitio el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 a 5 excepto por el hecho de que se utilizo un adenovirus recombinante que expresa la protefna de retinoblastoma p110 (ACNRb110) para infectar las celulas 293. La construccion del adenovirus ACNRB110 se describe en Smith, et al., (1997) Circulation 96:1899-1905. La densidad celular en el tiempo de la infeccion fue 1,0 x 107 celulas/ml. Los resultados del cultivo infectado se presentan en la 10 Figura 3 de los dibujos anexos. En este ejemplo, se consiguio una concentracion viral de aproximadamente 39.000 partfculas virales por celula.

Ejemplo 8. Mejora de la concentracion viral de ACN-p53 viral utilizando N-acetil-L-cistefna

15 Se prepara un cultivo de celulas productoras 293 sustancialmente segun lo descrito en los ejemplos 1 a 4 anteriores. Las celulas se infectan con adenovirus ACN53 segun se describe en el Ejemplo 5. Sin embargo, el procedimiento del Ejemplo 5 se modifica mediante la adicion de N-acetil-L-cistefna a una concentracion final de aproximadamente 10 a 30 mM en el medio de cultivo para inhibir el promotor CMV. Las celulas se cultivan y se cosechan sustancialmente segun lo descrito en los Ejemplos 5 y 6. La concentracion intracelular mejorada de las partfculas 20 virales resulta de la inhibicion de la expresion del transgen p53.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la obtencion de una densidad celular superior a 5 x 106 celulas productoras/ml en un procedimiento de biorreactor basado en un microvefuculo de dextrano reticulado para la produccion de un virus en una celula productora, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) preparar un cultivo de celulas productoras unidas a los microvefuculos de dextrano reticulados, en el que la proporcion de celulas productoras con respecto a los microvefuculos es de 10 celulas/microvefuculo,

b) sembrar el biorreactor con una cantidad de microvefuculos recubiertos de celulas productoras preparados en la etapa (a) hasta una densidad superior a aproximadamente 6 gramos (basada en el peso seco del microvefuculo) de microvefuculos recubiertos de celulas productoras por litro de volumen del medio del biorreactor; y

c) cultivar las celulas productoras en el biorreactor bajo condiciones de perfusion en un medio que contiene suero hasta una densidad superior a 100 celulas/microvefnculo, en el que el virus producido por el procedimiento es seleccionado de entre baculoviridiae, parvoviridae, picornaviridiae, herpesviridae, poxiviridae, o adenoviridiae.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la celula productora es una celula 293.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, en el que el virus es un adenovirus.
4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, en el que el virus es un adenovirus defectuoso en la replicacion derivado

del genoma de adenovirus de tipo 5.
5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que el adenovirus defectuoso en la replicacion ademas comprende un casete de expresion para un transgen exogeno.
6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el transgen exogeno es seleccionado de entre el grupo constituido por genes supresores de tumores, genes citotoxicos, genes citostaticos, genes proapoptoticos o genes activadores de profarmaco.
7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que el transgen exogeno es un gen supresor de tumor.
8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que el gen supresor de tumor es p53.
9. Procedimiento para la produccion de una poblacion de celulas productoras, que contienen un tttulo elevado de partfculas virales en un biorreactor basado en un microvefuculo en un medio libre de suero, comprendiendo dicho procedimiento el procedimiento segun la reivindicacion 1, que ademas comprende las etapas siguientes:

d) eliminar el medio que contiene suero,

e) sincronizar las celulas productoras en la fase G1;

f) infectar las celulas productoras con un virus;

g) cultivar las celulas bajo condiciones que permitan la replicacion viral hasta que se alcance un punto maximo.
10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que la celula productora es una celula 293.
11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que la sincronizacion celular se consigue manteniendo las celulas en un medio sin suero durante mas de aproximadamente un tercio de un ciclo celular.
12. Procedimiento segun la reivindicacion 11, en el que el virus es un adenovirus.
13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que el virus es un adenovirus defectuoso en la replicacion derivado del genoma de adenovirus de tipo 5.
14. Procedimiento segun la reivindicacion 13, en el que el adenovirus defectuoso en la replicacion ademas comprende un casete de expresion para un transgen exogeno.
15. Procedimiento segun la reivindicacion 14, en el que el transgen exogeno es seleccionado de entre el grupo constituido por genes supresores de tumores, genes citotoxicos, genes citostaticos, genes proapoptoticos, o genes activadores de profarmaco.
16. Procedimiento para la produccion de virus segun el procedimiento de la reivindicacion 9, que ademas comprende las etapas siguientes:

5 h) cosechar las celulas;

i) lisar las celulas productoras;

j) aislar las partfculas virales de la celula lisada; y

10

k) purificar las partfculas virales intactas.