ES2250224T3 - Compuestos halogenos de sulfamato, fosfonato, tiofosfonato, sulfonato y sulfonamida como inhibidores de sulfatasa esteoride. - Google Patents

Compuestos halogenos de sulfamato, fosfonato, tiofosfonato, sulfonato y sulfonamida como inhibidores de sulfatasa esteoride.

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ES2250224T3 ES00985490T ES00985490T ES2250224T3 ES 2250224 T3 ES2250224 T3 ES 2250224T3 ES 00985490 T ES00985490 T ES 00985490T ES 00985490 T ES00985490 T ES 00985490T ES 2250224 T3 ES2250224 T3 ES 2250224T3
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Abstract

Compuesto que presenta una estructura anular esteroidea y con la fórmula siguiente: en la que Rh1 es un grupo halo; Rh2 es un grupo halo opcional; Rs es un grupo sulfamato; y en la que la estructura de anillo esteroideo se selecciona de entre: estrona, 4-OH-estrona, 6á-OH-estrona, 7á-OH-estrona, 16á- OH-estrona, 16â-OH-estrona, 17-desoxiestrona, 4-OH-17â- estradiol, 6á-OH-17â-estradiol, 7á-OH-17â-estradiol, 4-OH-17á- estradiol, 6á-OH-17á-estradiol, 7á-OH-17á-estradiol, 16á-OH- 17á-estradiol, 16á-OH-17â-estradiol, 16â-OH-17á-estradiol, 16â-OH-17â-estradiol, 17á-estradiol, 17â-estradiol, 17á- etinil-17â-estradiol, 17â-etinil-17á-estradiol, 17- desoxiestradiol, estriol, 4-OH-estriol, 6á-OH-estriol, 7á-OH- estriol y 17-desoxiestriol.

Description

Compuestos halogenados de sulfamato, fosfonato, tiofosfonato, sulfonato y sulfonamida como inhibidores de la sulfatasa esteroide.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto.
En particular, la presente invención se refiere a un compuesto y a una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto. La presente invención se refiere asimismo a la utilización del compuesto o composición en aplicaciones terapéuticas.
Antecedentes de la invención
Existen pruebas que sugieren que los estrógenos son los principales mitógenos implicados en la estimulación del crecimiento de los tumores en los tejidos endocrino-dependientes, tales como las mamas y el endometrio. Aunque las concentraciones en plasma de estrógenos son similares en mujeres con o sin cáncer de mama, los niveles de estrona y de estradiol en los tumores de mama son significativamente más elevados que en el tejido o en la sangre de las mamas normales. La síntesis in situ de estrógeno se cree que presenta una contribución considerable a los niveles elevados de estrógenos en los tumores y, por lo tanto, los inhibidores, en particular los inhibidores específicos, de la biosíntesis de estrógenos resultan potencialmente valiosos para el tratamiento de los tumores endocrino-dependientes.
A lo largo de las últimas dos décadas, ha habido un interés considerable en el desarrollo de inhibidores de la ruta de la aromatasa, que convierte el precursor de los andrógenos androstenediona en estrona. Sin embargo, en la actualidad se disponen de pruebas que demuestran que la ruta de la estrona sulfatasa (E1-STS), es decir la hidrólisis del sulfato de estrona en estrona (E1S en E1), y no la ruta de la aromatasa, es la fuente principal de estrógeno en los tumores de mama. Esta teoría se ve apoyada por una reducción modesta de la concentración en plasma de los estrógenos en mujeres postmenopáusicas con cáncer de mama que han sido tratadas con inhibidores de aromatasa, tales como la aminoglutetimida y la 4-hidroxiandrostenediona, y también por el hecho de que la concentración en plasma de E1S en estos pacientes tratados con inhibidor de aromatasa sigue siendo relativamente elevada. La larga vida media de E1S en sangre (10 a 12 horas) en comparación con la de los estrógenos no conjugados (20 minutos) y los niveles elevados de actividad de sulfatasa esteroide en el hígado y en tejidos de mama normales y cancerosos también apoyan esta teoría.
La patente PCT/GB92/01587 da a conocer nuevos inhibidores de la sulfatasa esteroide y composiciones farmacéuticas que la contienen para la utilización en el tratamiento de los tumores dependientes de estrona, especialmente del cáncer de mama. Estos inhibidores de la sulfatasa esteroide son ésteres de sulfamato, tales como N,N-dimetil estrona-3-sulfamato y, preferentemente, estrona-3-sulfamato (también conocido como "EMATE").
El EMATE (3-O-sulfamato de 2-metoxiestrona), que es un análogo del 3-O-sulfamato de estrona, presenta la estructura siguiente:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Se conoce que EMATE es un potente inhibidor de E1-STS, debido a que muestra una inhibición superior al 99% de la actividad de E1-STS en células MCF-7 intactas a una concentración de 0,1 mM. El EMATE también inhibe el enzima E1-STS de una manera dependiente del tiempo y de la concentración, indicando que actúa como inactivador activo dirigido. Aunque EMATE se diseñó originalmente para la inhibición de E1-STS, también inhibe la dehidroepiandrosterona sulfatasa (DHA-STS), que es un enzima que se cree que presenta un papel crucial en la regulación de la biosíntesis del esteroide estrogénico androstenediol. Además, en la actualidad se dispone de evidencia que sugiere que el androstenediol podría ser de incluso mayor importancia como promotor del crecimiento del tumor de mama. EMATE también es activo in vivo, ya que resulta una inhibición casi completa de las actividades de E1-STS en el hígado de rata (del 99%) y de la DHA-STS (del 99%) al administrarlo oralmente o subcutáneamente. Además, se ha demostrado que EMATE presenta un efecto potenciador de la memoria en ratas. Los estudios realizados en ratones sugieren que existe una asociación entre la actividad de DHA-STS y la regulación de parte de la respuesta inmunológica. Se cree que ello podría producirse también en el ser humano. El átomo puente O del grupo sulfamato en EMATE es importante para la actividad inhibitoria. De esta manera, cuando se sustituye el átomo 3-O por otros heteroátomos, por ejemplo en 3-N-sulfamato de estrona y en 3-S-sulfamato de estrona, estos análogos son inactivadores más débiles no dependientes del tiempo.
Aunque con EMATE puede alcanzarse una potencia óptima de inhibición de E1-STS, es posible que se libere la estrona durante la inhibición de la sulfatasa, y que EMATE y su congénere estradiol presenten actividad estrogénica.
Ahmed et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 254(3):811-5, 27 de enero de 1999) informan de un estudio acerca de la relación estructura-actividad de los inhibidores esteroideos y no esteroideos de STS.
La presente invención pretende proporcionar nuevos compuestos adecuados para la inhibición de E1-STS, además de otras aplicaciones terapéuticas.
Aspectos sumarios de la presente invención
La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento de que determinados compuestos halogenados podrían utilizarse como inhibidores efectivos de la sulfatasa esteroide.
Los compuestos halogenados de la presente invención pueden comprender otros sustituyentes. Estos otros sustituyentes pueden, por ejemplo, incrementar adicionalmente la actividad de los compuestos de la presente invención y/o incrementar su estabilidad (ex vivo y/o in vivo).
Aspectos detallados de la presente invención
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona la reivindicación 1.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto de acuerdo con la invención para su utilización en medicina.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con la presente invención opcionalmente mezclado con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un compuesto de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para la utilización en la terapia de una condición o enfermedad asociada con STS.
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un compuesto de acuerdo con la presente invención en la preparación de un medicamento para la utilización en la terapia de una condición o enfermedad asociada con niveles adversos de STS.
A fines de una referencia más sencilla, los aspectos indicados anteriormente y aspectos adicionales de la presente invención se exponen a continuación bajo los títulos de los apartados correspondientes. Sin embargo, las enseñanzas contenidas en cada apartado no se encuentran necesariamente limitadas a cada apartado particular.
Aspectos preferentes
En una forma de realización, los compuestos de la presente invención resultan útiles para el tratamiento del cáncer de mama.
Dos compuestos preferidos son: 2-yodo-EMATE y 2-bromo-EMATE.
Algunas ventajas
Una ventaja crucial de la presente invención es que los compuestos sulfamato de la presente invención pueden actuar como inhibidores de STS.
Otra ventaja de los compuestos de la presente invención es que pueden resultar potentes in vivo.
Algunos de los compuestos de la presente invención pueden ser compuestos no estrogénicos. En la presente memoria, el término "no estrogénico" se refiere a que muestra una actividad estrogénica nula o sustancialmente nula.
Otra ventaja es que algunos de los compuestos pueden no estar metabolizados en compuestos que muestren o induzcan actividad hormonal.
Algunos de los compuestos de la presente invención también resultan ventajosos en el sentido de que pueden ser oralmente activos.
Algunos de los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles para el tratamiento del cáncer, tal como el cáncer de mama, así como (o alternativamente) para condiciones no cancerosas, tal como la prevención de enfermedades autoinmunológicas, particularmente cuando puede resultar necesaria la administración de fármacos desde una edad temprana.
De esta manera, se cree que algunos de los compuestos de la presente invención también presentan usos terapéuticos aparte del tratamiento de los cánceres endocrino-dependientes, tal como el tratamiento de las enfermedades autoinmunológicas.
Sulfatasa esteroide
La sulfatasa esteroide (que en ocasiones se denomina sulfatasa esteroide o esteril sulfatasa, o en forma abreviada, "STS") hidroliza varios esteroides sulfatados, tales como el sulfato de estrona, el sulfato de dehidroepiandrosterona y el sulfato de colesterol. Se ha asignado a STS el número de enzima EC 3.1.6.2.
STS ha sido ya clonado y expresado. Por ejemplo, ver Stein et al. (J. Biol. Chem. 264:13865-13872, 1989) y Yen et al. (Cell 49:443-454, 1987).
STS es un enzima que se ha implicado en varias condiciones de enfermedad.
Por ejemplo, algunos trabajadores han descubierto que una deficiencia total de STS produce ictiosis. De acuerdo con algunos trabajadores, la deficiencia en STS es bastante prevalente en Japón. Los mismos trabajadores (Sakura et al., J. Inherit. Metab. Dis. 20(6):807-10, diciembre de 1997) han informado de que algunas enfermedades alérgicas, tales como el asma bronquial, la rinitis alérgica o la dermatitis atópica, pueden encontrarse asociadas a la deficiencia en sulfatasa esteroide.
Además de que los estados de enfermedad sean provocados por una ausencia total de actividad de STS, un nivel incrementado de actividad de STS también puede producir condiciones de enfermedad. Por ejemplo, tal como se ha indicado anteriormente, existen pruebas categóricas que apoyan la existencia de un papel de STS en el crecimiento y metástasis del cáncer de mama.
También se ha implicado el STS en otras condiciones de enfermedad. Por ejemplo, Le Roy et al. (Behav. Genet. 29(2):131-6, marzo de 1999) han determinado que podría existir una correlación genética entre la concentración de sulfatasa esteroide y el inicio del comportamiento de ataque en ratones. Los autores concluyen que la sulfatación de los esteroides podría ser el motor principal de una red compleja, que incluye genes que se ha demostrado mediante mutagénesis que se encuentran implicados en el comportamiento de agresión.
Inhibición de STS
Se cree que algunas condiciones de enfermedad asociadas con la actividad de STS se deben a la conversión de una estrona sulfatada no activa en una estrona no sulfatada activa. En las condiciones de enfermedad asociadas con la actividad de STS, resultaría deseable inhibir la actividad de STS.
En la presente memoria, el término "inhibe" incluye "reduce" y/o "elimina" y/o "enmascara" y/o "impide" la acción perjudicial de STS.
Inhibidor de STS
Según la presente invención, el compuesto de la presente invención es capaz de actuar como un inhibidor de STS.
En la presente memoria, el término "inhibidor" tal como se utiliza en la presente memoria con respecto al compuesto de la presente invención, se refiere a un compuesto que puede inhibir la actividad de STS, tal como reduciendo y/o eliminando y/o enmascarando y/o impidiendo la acción perjudicial de STS. El inhibidor de STS puede actuar como un antagonista.
La capacidad de los compuestos de inhibir la actividad de la estrona sulfatasa pueden evaluarse utilizando células de cáncer de mama MCF-7 intactas o microsomas placentarios. Además, puede utilizarse un modelo animal. Se presentan detalles sobre los protocolos de ensayo adecuados en las secciones siguientes. Debe indicarse que podrían utilizarse otros ensayos para determinar la actividad de STS y, de esta manera, la inhibición de STS. Por ejemplo, también puede hacerse referencia a las enseñanzas contenidas en la patente WO nº A-99/50453.
Preferentemente, para algunas aplicaciones, el compuesto se caracteriza además porque si el grupo sulfamato se sustituye con un grupo sulfato para formar un derivado sulfato, el derivado sulfato sería hidrolizable con un enzima que presentase actividad de sulfatasa esteroide (E.C. 3.1.6.2), es decir, al incubarlo con sulfatasa esteroide EC 3.1.6.2. a pH 7,4 y a 37ºC.
En una forma de realización preferida, si el grupo sulfamato del compuesto se sustituye con un grupo sulfato para formar un compuesto sulfato, el compuesto sulfato sería hidrolizable por un enzima con actividad de sulfatasa esteroide (E.C. 3.1.6.2) y proporcionaría un valor de Km inferior a 200 mmolar, preferentemente inferior a 150 mmolar, preferentemente inferior a 100 mmolar, preferentemente inferior a 75 mmolar, preferentemente inferior a 50 mmolar, al incubarlo con sulfatasa esteroide E.C. 3.1.6.2 a pH 7,4 y a 37ºC.
En una forma de realización preferida, el compuesto de la presente invención no es hidrolizable con un enzima que presenta actividad de sulfatasa esteroide (E.C. 3.1.6.2).
Para algunas aplicaciones, preferentemente el compuesto de la presente invención presenta una selectividad de por lo menos aproximadamente 100 veces para una diana deseada (por ejemplo STS), preferentemente de por lo menos aproximadamente 150 veces para la diana deseada, preferentemente de por lo menos aproximadamente 200 veces para la diana deseada, preferentemente de por lo menos aproximadamente 250 veces para la diana deseada, preferentemente de por lo menos aproximadamente 300 veces para la diana deseada, preferentemente de por lo menos aproximadamente 350 veces para la diana deseada.
Debe indicarse que el compuesto de la presente invención puede presentar otras propiedades beneficiosas además de, o alternativamente a, su capacidad de inhibición de la actividad de STS.
Grupo sulfamato
El término "sulfamato" tal como se utiliza en la presente memoria incluye un éster de ácido sulfámico, o un éster de un derivado N-sustituido de ácido sulfámico, o una sal de los mismos.
Se hace referencia al compuesto de la presente invención como compuesto sulfamato.
Típicamente, el grupo sulfamato presenta la fórmula siguiente:
(R_{1})(R_{2})N-S(O)(O)-O-
en la que preferentemente R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente de entre H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo, o combinaciones de los mismos, o conjuntamente representan alquileno, en el que el alquilo o cicloalquilo o alquenilo o cada uno de ellos contiene opcionalmente uno o más heteroátomos o heterogrupos.
Cuando se encuentran sustituidos, los compuestos N-sustituidos de la presente invención pueden contener uno o dos sustituyentes N-alquilo, N-alquenilo, N-cicloalquilo o N-arilo, que preferentemente contienen, o que contiene cada uno de ellos, un máximo de 10 átomos de carbono. En el caso de que R_{1} y/o R_{2} sean alquilo, las especies preferentes son aquéllas en las que R_{1} y R_{2} se seleccionan, cada uno de manera independiente, de entre los grupos alquilo inferiores que contienen 1 a 6 átomos de carbono, es decir, metilo, etilo, propilo, etc. R_{1} y R_{2} pueden ser ambos metilo. En el caso de que R_{1} y/o R_{2} sean arilo, las especies típicas son fenilo y tolilo (PhCH_{3}; o). En el caso de que R_{1} y R_{2} representen cicloalquilo, las especies típicas son ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc. Cuando se encuentran unidos entre sí, R_{1} y R_{2} típicamente representan un grupo alquileno que proporciona una cadena de 4 a 6 átomos de carbono, opcionalmente interrumpida con uno o más heteroátomos o heterogrupos, por ejemplo para proporcionar un heterociclo de 5 elementos, por ejemplo morfolino, pirrolidino o piperidino.
De entre las especies alquilo, cicloalquilo, alquenilo o arilo se incluyen grupos sustituidos que contienen como sustituyente en los mismos uno o más grupos que no interfieren con la actividad inhibitoria de sulfatasa del compuesto en cuestión. Entre los sustituyentes ejemplares que no interfieren se incluyen hidroxi, amino, halo, alcoxi, alquilo y arilo.
En algunas formas de realización preferidas, por lo menos uno de entre R_{1} y R_{2} es H.
En algunas formas de realización preferidas adicionales, cada uno de entre R_{1} y R_{2} es H.
Ensayo para determinar la actividad de STS con células cancerosas (Protocolo 1) Inhibición de la actividad de sulfatasa esteroide en células MCF-7
Se midió la actividad de sulfatasa esteroide in vitro utilizando células MCF-7 intactas de cáncer de mama humano. Esta línea celular dependiente de hormona se utiliza ampliamente para estudiar el control del crecimiento del cáncer de mama humano. Posee una actividad significativa de sulfatasa esteroide (MacIndoe et al., Endocrinology 123:1281-1287, 1988; Purohit y Reed, Int. J. Cancer 50:901-905, 1992), y se encuentra disponible en los Estados Unidos en la American Type Culture Collection (ATCC) y en el Reino Unido (por ejemplo en The Imperial Cancer Research Fund).
Las células se mantuvieron en medio mínimo esencial (MME) (Flow Laboratories, Irvine, Escocia) que contenía HEPES 20 mM, suero de feto bovino al 5%, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales y bicarbonato sódico al 0,075%. Se sembraron hasta 30 réplicas de matraces de 25 cm^{2} de cultivo de tejido con aproximadamente 1 x 10^{5} células/matraz utilizando el medio anteriormente indicado. Las células se cultivaron hasta el 80% de confluencia y el medio se cambió cada tres días.
Se lavaron monocapas intactas de células MCF-7 en matraces de 25 cm^{2} de cultivo de tejido con solución salina equilibrada de Earle (EBSS procedente de ICN Flow, High Wycombe, Reino Unido) y se incubaron durante 3 a 4 horas a 37ºC con 5 pmol (7 x 10^{5} dpm) 3-sulfato de [6,7-^{3}H]estrona (actividad específica: 60 Ci/mmoles, procedente de New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) en MEM libre de suero (2,5 ml) junto con 3-sulfamato de estrona (11 concentraciones: 0; 1 fM; 0,01 pM; 0,1 pM; 1 pM; 0,01 nM; 0,1 nM; 1 nM; 0,01 mM; 0,1 mM; 1 mM). Tras la incubación, cada matraz se enfrió y el medio (1 ml) se pipeteó en tubos separados que contenían [^{14}C]estrona (7 x 10^{3} dpm) (actividad específica: 97 Ci/mmoles, procedente de Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, Reino Unido). La mezcla se agitó uniformemente durante 30 segundos con tolueno (5 ml). Los experimentos demostraron que este tratamiento eliminaba de la fase acuosa >90% de la [^{14}C]-estrona y <0,1% del 3-sulfato de [^{3}H]-estrona. Una parte (2 ml) de la fase orgánica se recogió, se sometió a evaporación y se determinó mediante espectrometría de centelleo el contenido de ^{3}H y de ^{14}H del residuo. Se calculó la masa hidrolizada de 3-sulfato de estrona a partir de los contajes de ^{3}H obtenidos (corregidos para los volúmenes de medio y de la fase orgánica utilizada, y para la recuperación de la [^{14}C]-estrona añadida) y de la actividad específica del sustrato. Cada grupo de experimentos incluía incubaciones de microsomas preparadas a partir de placenta humana positiva para sulfatasa (control positivo) y matraces sin células (con el fin de evaluar la hidrólisis no enzimática aparente del sustrato). Se determinó el número de núcleos celulares por matraz utilizando un contador Coulter tras tratar las grupo de experimentos para evaluar el estado de las membranas celulares y su viabilidad utilizando el procedimiento de exclusión con azul tripán (Phillips, H.J. (1973), en: Tissue culture and applications, [eds: Kruse, D.F. y Patterson, M.K.], páginas 406-408; Academic Press, New York).
Los resultados para la actividad de sulfatasa esteroide se expresan como medias \pm 1 S.D. del total de producto (estrona + estradiol) formado durante el periodo de incubación (20 horas) calculado para 10^{6} células y para valores que mostraban significancia estadística, como porcentaje de reducción (inhibición) de las incubaciones que no contenían 3-sulfamato de estrona. Se utilizaron pruebas t de Student no apareadas para analizar la significancia estadística de los resultados.
Ensayo para determinar la actividad de STS con microsomas placentarios (Protocolo 2) Inhibición de la actividad de sulfatasa esteroide en los microsomas placentarios
Se cortaron con tijeras en trozos pequeños placentas humanas que eran positivas para la sulfatasa procedentes de embarazos a término y se lavaron una vez con tampón fosfato frío (pH 7,4, 50 mM), seguidamente se resuspendieron en tampón fosfato frío (5 ml/g tejido). La homogenización se llevó a cabo con un homogeneizador Ultra-Turrax, utilizando tres centrifugaciones de 10 segundos separadas por periodos de enfriamiento en hielo de 2 minutos. Se separaron los núcleos y residuos celulares mediante centrifugación (4ºC) a 2000xg durante 30 minutos y partes (2 ml) del sobrenadante se almacenaron a 20ºC. La concentración de proteína de los sobrenadantes se determinó mediante el procedimiento de Bradford (Anal. Biochem. 72:248-254, 1976).
Se llevaron a cabo incubaciones (1 ml) utilizando una concentración de proteína de 100 mg/ml, concentración de sustrato de 20 mM de 3-sulfato de [6,7-^{3}H]-estrona (actividad específica: 60 Ci/mmol, procedente de New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) y un periodo de incubación de 20 minutos a 37ºC. En caso necesario, se utilizaron ocho concentraciones de los compuestos: 0 (es decir, un control); 0,05 mM; 0,1 mM; 0,2 mM; 0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM; 1,0 mM. Tras la incubación, se enfrió cada muestra y el medio (1 ml) se pipeteó en tubos separados que contenían [^{14}C]-estrona (7 x 10^{3} dpm) (actividad específica: 97 Ci/mmol, procedente de Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). La mezcla se agitó uniformemente durante 30 segundos con tolueno (5 ml). Unos experimentos han demostrado que mediante este tratamiento se elimina de la fase acuosa >90% de la [^{14}C]-estrona y <0,1% del 3-sulfato de [^{3}H]-estrona. Una parte (2 ml) de la fase orgánica se separó, se sometió a evaporación y se determinó el contenido de ^{3}H y de ^{14}C del residuo mediante espectrometría de centelleo. Se calculó la masa de 3-sulfato de estrona hidrolizada a partir de los contajes de ^{3}H obtenidos (corregidos para los volúmenes de medio y de fase orgánica utilizada, y para la recuperación de [^{14}C]-estrona añadida) y de la actividad específica del
sustrato.
Modelo de ensayo animal para determinar la actividad de STS (Protocolo 3) Inhibición de la actividad de sulfatasa de estrona in vivo
Los compuestos de la presente invención pueden estudiarse utilizando un modelo animal, en particular en ratas ovariectomizadas. En este modelo, los compuestos que son estrogénicos estimulan el crecimiento uterino.
El compuesto (0,1 mg/kg/día durante cinco días) se administró oralmente a ratas, recibiendo otro grupo de animales únicamente vehículo (propilenglicol). Al final del estudio se recogieron muestras de tejido hepático y se ensayó la actividad de sulfatasa de estrona utilizando la sulfato de ^{3}H-estrona como sustrato, tal como se ha descrito anteriormente (ver la patente PCT/GB95/02638).
Modelo de ensayo animal para determinar la actividad estrogénica (Protocolo 4) Ausencia de estrogenicidad in vivo
Los compuestos de la presente invención pueden estudiarse utilizando un modelo animal, en particular en ratas ovariectomizadas. En este modelo, los compuestos que son estrogénicos estimulan el crecimiento uterino.
El compuesto (0,1 mg/kg/día durante cinco días) se administró oralmente a ratas, mientras que otro grupo de animales recibió únicamente vehículo (propilenglicol). Al final del estudio se extirparon los úteros y se pesaron, expresando los resultados como (peso uterino/peso corporal total) x 100.
Los compuestos que no presentaban un efecto significativo sobre el crecimiento uterino no eran estrogénicos.
Terapia
Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como agentes terapéuticos, es decir, en aplicaciones terapéuticas.
El término "terapia" incluye los efectos curativos, los efectos de alivio y los efectos profilácticos.
La terapia puede aplicarse a seres humanos o a animales, preferentemente a animales hembra.
Composiciones farmacéuticas
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende un compuesto de acuerdo con la presente invención y opcionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable (incluyendo las combinaciones de los mismos).
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para el uso humano o animal y para la medicina humana y veterinaria, y típicamente comprenden uno o más de entre un diluyente, un portador o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para el uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro eds, 1985). La elección de portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía deseada de administración y a la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como portador, o además del portador, un excipiente o un diluyente, cualquier ligante o ligantes adecuados, cualquier lubricante o lubricantes, cualquier agente o agentes de suspensión, cualquier agente o agentes de recubrimiento y cualquier agente o agentes solubilizantes.
Pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, pigmentos e incluso agentes saborizantes en la composición farmacéutica. Entre los ejemplos de conservantes se incluyen benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También pueden utilizarse antioxidantes y agentes de suspensión.
Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación, según el sistema de administración. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para la administración con una minibomba o por vía mucosa, por ejemplo utilizando un pulverizador nasal o aerosol para la inhalación, o una solución ingerible, o por vía parenteral, en la que la composición se formula en forma inyectable para la administración, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, la formulación puede diseñarse para la administración por ambas vías.
En el caso de que el agente deba administrarse por vía mucosa a través de la mucosa gastrointestinal, debe ser capaz de conservarse en estado estable durante el tránsito por el tracto gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente a la degradación proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos detergentes de la bilis.
En caso apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inhalación, en forma de supositorio o de pesario, tópicamente en forma de loción, solución, crema, pomada o polvos secos, mediante la utilización de un parche cutáneo, oralmente en forma de tabletas que contienen excipientes, tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos, sea solos o en mezclas con excipientes, o en forma de jarabes, soluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o pueden inyectarse parenteralmente, por ejemplo por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse mejor en forma de solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para preparar una solución isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de tabletas o pastillas que pueden formularse de manera convencional.
Combinación farmacéutica
El compuesto de la presente invención puede utilizarse en combinación con uno o más agentes activos adicionales, tales como uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales.
Por ejemplo, los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en combinación con otros inhibidores de STS y/o con otros inhibidores, tales como un inhibidor de aromatasa (tal como, por ejemplo, 4-hidroxiandrostenediona (4-OHA)) y/o con esteroides, tales como los esterneuroesteroides de origen natural sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS) y sulfato de pregnenolona (PS) y/o otros compuestos orgánicos estructuralmente similares.
Adicionalmente o alternativamente, el compuesto de la presente invención puede utilizarse en combinación con un modificador de la respuesta biológica.
La expresión "modificador de la respuesta biológica" (MRB) incluye citoquinas, inmunomoduladores, factores del crecimiento, factores reguladores de la hematopoyesis, factores estimulantes del crecimiento de colonias, factores quimotácticos, hemolíticos y trombolíticos, receptores de superficie celular, ligandos, moléculas de adhesión a leucocitos, anticuerpos monoclonales, vacunas preventivas y terapéuticas, hormonas, componentes de la matriz extracelular, fibronectina, etc. Para algunas aplicaciones, preferentemente el modificador de la respuesta biológica es una citoquina. Entre los ejemplos de citoquinas se incluyen: las interleuquinas (IL), tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19; factores de necrosis tumoral (TNF), tales como TNF-\alpha, interferón alfa, beta y gamma, TGF-\beta. Para algunas aplicaciones, la citoquina preferentemente es un factor de necrosis tumoral (TNF). Para algunas aplicaciones, el TNF puede ser cualquier tipo de TNF, tal como TNF-\alpha, TNF-\beta, incluyendo derivados o mezclas de los mismos. Más preferentemente, la citoquina es TNF-\alpha. Pueden encontrarse enseñanzas sobre TNF en la técnica, tal como la patente WO nº A-98/08870 y WO nº A-98/13348.
Administración
Típicamente, un médico determinará la dosis que resultará más adecuada para un sujeto individual, y variará dependiendo de la edad, peso y respuesta del paciente particular. Las dosis indicadas después constituyen ejemplos del caso medio. Evidentemente pueden existir casos individuales que requieran intervalos de dosis más altas o más bajas.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse mediante inyección directa. La composición puede formularse para la administración parenteral, mucosal, intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular o transdérmica. Según necesidad, el agente puede administrarse a una dosis comprendida entre 0,01 y 30 mg/kg de peso corporal, tal como entre 0,1 y 10 mg/kg, más preferentemente entre 0,1 y 1 mg/kg de peso corporal.
A título de ejemplo adicional, los agentes de la presente invención pueden administrarse de acuerdo con un régimen de 1 a 4 veces al día, preferentemente de una o dos veces al día. El nivel específico de dosis y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente particular puede variarse y dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico utilizado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción del compuesto, la edad, el peso corporal, el estado general salud, el sexo, la dieta, el modo y momento de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la severidad de la condición particular y el huésped sometido a terapia.
Aparte de los modos típicos de administración (indicados anteriormente), el término "administrado" también incluye la administración mediante técnicas tales como la transfección mediada por lípidos, los liposomas, los inmunoliposomas, la lipofectina, los anfóteros catiónicos faciales (CFAs) y las combinaciones de los mismos. Las vías para dichos mecanismos de administración incluyen, pero sin limitarse a ellos, las vías mucosal, nasal, oral, parenteral, gastrointestinal, tópica o sublingual.
El término "administrado" incluye, aunque sin limitarse a ellos, la administración por vía mucosal, por ejemplo con un pulverizador nasal o aerosol para la inhalación, o como solución ingerible; una vía parenteral en la que la administración sea mediante una forma inyectable, tal como, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.
De esta manera, para la administración farmacéutica, los inhibidores de STS de la presente invención pueden formularse de cualquier manera adecuada utilizando técnicas de formulación farmacéutica convencionales y portadores, adyuvantes, excipientes y diluyentes farmacéuticos, etc. y habitualmente para la administración parenteral. Las dosis efectivas aproximadas pueden encontrarse comprendidas en el intervalo entre 1 y 1.000 mg/día, tal como entre 10 y 900 mg/día o incluso entre 100 y 800 mg/día, dependiendo de las actividades individuales de los compuestos en cuestión y para un paciente de peso corporal medio (70 kg). Las dosis más habituales para los compuestos preferentes y más activos se encontrarán comprendidas en el intervalo entre 200 y 800 mg/día, más preferentemente entre 200 y 500 mg/día, con la mayor preferencia entre 200 y 250 mg/día. Pueden administrarse en regímenes de dosis única, regímenes de dosis partida y/o en regímenes de dosis múltiples de varios días de duración. Para la administración oral pueden formularse como tabletas, cápsulas, solución o suspensión que contiene entre 100 y 500 mg de compuesto por dosis unitaria. Alternativamente y preferentemente los compuestos se formulan para la administración parenteral en un portador parenteralmente administrable adecuado y proporcionando tasas de dosificación diaria única comprendidas en el intervalo entre 200 y 800 mg, preferentemente entre 200 y 500, más preferentemente entre 200 y 250 mg. Estas dosis diarias efectivas, sin embargo, variarán dependiendo de la actividad inherente del ingrediente activo y del peso corporal del paciente, encontrándose estas variaciones al alcance de los conocimientos y criterio del
médico.
Ciclo celular
Los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en el procedimiento de tratamiento de un trastorno del ciclo celular.
Tal como se discute en "Molecular Cell Biology", 3ª edición, Lodish et al., páginas 177-181, las diferentes células eucarióticas pueden crecer y dividirse a tasas bastante diferentes. Las células de levadura, por ejemplo, pueden dividirse cada 120 minutos, y las primeras divisiones de las células embriónicas en los huevos fertilizados de los erizos de mar y de los insectos se producen en tan sólo 1.530 minutos debido a que una célula grande preexistente ya se encuentra subdividida. Sin embargo, la mayor parte de las células vegetales y animales en crecimiento tardan 10 a 20 horas en doblarse en número, y algunas se duplican a una tasa mucho más lenta. Muchas células en la edad adulta, tales como las células nerviosas y las células de músculo estriado, no se dividen en absoluto; otras, tales como los fibroblastos, que ayudan en la cicatrización de las heridas, crecen según la demanda, aunque si no hay demanda, permanecen quiescentes.
Sin embargo, cada una de las células eucarióticas que se divide debe encontrarse preparada para donar la misma cantidad de material genético a dos células hijas. La síntesis de ADN en los eucariotas no se produce durante todo el ciclo de división celular sino que se restringe a una parte del mismo previamente a la división celular.
La relación entre la síntesis de ADN eucariótico y la división celular se ha analizado en detalle en cultivos de células de mamífero en los que todas las células eran capaces de crecer y dividirse. En contraste con las bacterias, se ha descubierto que las células eucarióticas dedican únicamente una parte de su tiempo a la síntesis de ADN, y que la completan horas antes de la división celular (mitosis). De esta manera, existe un hueco de tiempo después de la síntesis del ADN y antes de la división celular; se ha encontrado otro hueco de tiempo después de la división y antes de la siguiente ronda de síntesis de ADN. Este análisis condujo a la conclusión de que el ciclo celular eucariótico consiste en una etapa M (mitótica), una etapa G_{1} (el primer hueco), la etapa S (síntesis de ADN), una etapa G_{2} (el segundo hueco) y nuevamente M. Las etapas entre mitosis (G_{1}, S y G_{2}) se conocen colectivamente como "interfase".
Muchas células que no se dividen en los tejidos (por ejemplo todos los fibroblastos quiescentes) suspenden el ciclo después de la mitosis e inmediatamente antes de la síntesis de ADN; estas células "en reposo" se dice que han salido del ciclo celular y que se encuentran en el estado G_{0}.
Resulta posible identificar células cuando se encuentran en una de las tres etapas de la interfase del ciclo celular mediante la utilización de un separador de células activado por fluorescencia (FACS) con el fin de medir su contenido relativo de ADN; una célula que se encuentre en G_{1} (antes de la síntesis de ADN) presenta una cantidad definida x de ADN; durante S (replicación del ADN) presenta entre x y 2x; y cuando se encuentra en G_{2} (o en M) presenta 2x de ADN.
Las etapas de la mitosis y de la citoquinesis en una célula animal son las siguientes.
(a)
Interfase. La etapa G_{2} de la interfase es inmediatamente anterior al inicio de la mitosis. El ADN cromosómico ya se ha replicado y se ha unido a proteínas durante la etapa S, pero los cromosomas todavía no se observan como estructuras diferenciadas. El nucleolo es la única subestructura nuclear que resulta visible bajo el microscopio óptico. En una célula diploide antes de la replicación del ADN existen dos morfologías cromosómicas de cada tipo y la célula se dice que es 2n. En G_{2}, tras la replicación del ADN, la célula es 4n. Existen cuatro copias de cada ADN cromosómico. Debido a que los cromosomas hermanos todavía no se han separado el uno del otro, se denominan cromátidas hermanas.
(b)
Profase temprana. Los centriolos, cada uno con un centriolo hijo recién formado, empiezan a desplazarse hacia polos opuestos de la célula; los cromosomas presentan la apariencia de filamentos alargados. La membrana nuclear empieza a desagregarse, formando pequeñas vesículas.
(c)
Profase intermedia y tardía. Se completa la condensación de los cromosomas; cada estructura visible de cromosoma está compuesta de dos cromátidas que se mantienen unidas por sus centrómeros. Cada cromátida contiene una de las dos moléculas hijas de ADN recién replicadas. El huso acromático empieza a radiar desde las regiones inmediatamente contiguas a los centriolos, que se están desplazando hacia los polos. Algunas fibras del huso abarcan de un polo a otro; la mayoría acaban en cromátidas y se unen en los cinetocoros.
(d)
Metafase. Los cromosomas se desplazan hacia el ecuador de la célula, donde se alinean en el plano ecuatorial. Las cromátidas hijas todavía no se han separado.
(e)
Anafase. Las dos cromátidas hijas se separan formando cromosomas independientes. Cada uno contiene un centrómero que se encuentra unido con una fibra del huso a un polo, hacia el cual se desplaza. De esta manera, se dona una copia de cada cromosoma a cada célula hija. Simultáneamente, la célula se alarga, al igual que los husos, que abarcan de polo a polo. Se inicia la citoquinesis a medida que se empieza formar el surco de segmentación.
(f)
Telofase. Se forman nuevas membranas alrededor de los núcleos hijos; los cromosomas se desenrollan y se desdiferencian, el nucleolo vuelve a ser visible y se forma la membrana nuclear alrededor de cada núcleo hijo. La citoquinesis casi se ha completado y el huso desaparece a medida que los microtúbulos y otras fibras se despolimerizan. En toda la mitosis, el centriolo "hijo" en cada polo crece hasta su longitud completa. En la telofase, se completa la duplicación de cada uno de los centriolos originales, y se producen nuevos centriolos hijos durante la siguiente interfase.
(g)
Interfase. Al completarse la citoquinesis, la célula entra en la etapa G_{1} del ciclo celular y vuelve nuevamente a pasar por todo el ciclo.
Se apreciará que el ciclado celular es un proceso celular extremadamente importante. Las desviaciones del ciclo celular normal pueden resultar en una serie de trastornos médicos. El ciclo celular incrementado y/o no restringido puede resultar en cáncer. El ciclo celular reducido puede resultar en condiciones degenerativas. La utilización del compuesto de la presente invención puede proporcionar un medio para tratar estos trastornos y condiciones.
De esta manera, el compuesto de la presente invención puede resultar adecuado para la utilización en el tratamiento de los trastornos del ciclo celular, tales como los cánceres, incluyendo los cánceres dependientes e independientes de hormonas.
Además, el compuesto de la presente invención puede resultar adecuado para el tratamiento de cánceres, tales como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, sarcomas, melanomas, cáncer de próstata, cáncer pancreático, etc., y otros cánceres sólidos.
Para algunas aplicaciones, se inhibe y/o se impide y/o se detiene el ciclo celular, preferentemente se impide y/o se detiene el ciclo celular. En un aspecto, el ciclo celular puede inhibirse y/o impedirse y/o detenerse en la etapa G_{2}/M. En un aspecto, el ciclo celular puede impedirse y/o inhibirse y/o detenerse irreversiblemente, preferentemente el ciclo celular se impide y/o detiene irreversiblemente.
Con la expresión "impedido y/o inhibido y/o detenido irreversiblemente" se hace referencia a que, tras la aplicación de un compuesto de la presente invención, al retirar el compuesto, los efectos del compuesto, es decir el bloqueo y/o inhibición y/o detención del ciclo celular, todavía resultan observables. Más particularmente, con la expresión "impedido y/o inhibido y/o detenido irreversiblemente" se hace referencia a que, cuando se lleva a cabo el ensayo de acuerdo con el protocolo de ensayo del ciclo celular presentado en la presente memoria, las células tratadas con un compuesto de interés muestran menos crecimiento tras la Etapa 2 del protocolo I que las células de control. Posteriormente se presentan los detalles de este protocolo.
De esta manera, la presente invención proporciona compuestos que: provocan la inhibición in vitro del crecimiento de células de cáncer de mama positivas para el receptor de estrógeno (ER+) y de células de cáncer de mama ER negativas (ER-), al impedir y/o inhibir y/o detener el ciclo celular; y/o provocan la regresión de los tumores mamarios inducidos por nitrosometilurea (NMU) en animales intactos (es decir, no ovariectomizados) y/o impiden y/o inhiben y/o detienen el ciclo celular en las células cancerosas; y/o actúan in vivo impidiendo y/o inhibiendo y/o deteniendo el ciclo celular y/o actuando como agonistas del ciclo celular.
Ensayo de ciclo celular (Protocolo 5)
Procedimiento
Etapa 1
Se sembraron células de cáncer de mama MCF-7 en placas de cultivo multipocillo a una densidad de 10^{5} células/pocillo. Se dejó que las células se adhirieran y crecieran hasta una confluencia de aproximadamente el 30%, momento en el que se trataron de la manera siguiente:
Control (sin tratamiento)
Compuesto de interés (CDI) 20 \muM.
Las células se cultivaron durante 6 días en medio de crecimiento que contenía el CDI con cambios de medio/CDI cada 3 días. Al final de este periodo, se realizó un recuento del número de células utilizando un contador de células Coulter.
Etapa 2
Tras el tratamiento de las células durante un periodo de 6 días con el CDI, las células se sembraron nuevamente a una densidad de 10^{4} células/pocillo. No se añadió ningún tratamiento adicional. Se dejó que las células continuarán creciendo durante 6 días adicionales en presencia de medio de crecimiento. Al final de este periodo, se realizó un nuevo recuento del número de células.
Cáncer
Tal como se ha indicado, los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en el tratamiento de un trastorno del ciclo celular. Un trastorno particular del ciclo celular es el cáncer.
El cáncer sigue siendo un causa importante de mortalidad en la mayoría de países occidentales. Las terapias para el cáncer desarrolladas hasta el momento incluyen el bloqueo de la acción o de la síntesis de hormonas con el fin de inhibir el crecimiento de los tumores dependientes de hormonas. Sin embargo, en la actualidad se utiliza quimioterapia más agresiva para el tratamiento de los tumores independientes de hormonas.
Por lo tanto, el desarrollo de un fármaco para el tratamiento anticáncer de los tumores dependientes y/o independientes de hormonas que carezca de algunos o todos los efectos secundarios asociados con la quimioterapia representaría un avance terapéutico importante.
Se conoce que los estrógenos experimentan varias reacciones de hidroxilación y de conjugación tras su síntesis. Hasta hace poco se creía que estas reacciones eran parte de un proceso metabólico que finalmente hacía que los estrógenos fuesen solubles en agua y que facilitaba su eliminación del cuerpo. En la actualidad resulta evidente que algunos metabolitos hidroxi (por ejemplo 2-hidroxi y 16-alfa-hidroxi) y conjugados (por ejemplo sulfato de estrona, E1S) resultan importantes para determinar algunas de las acciones complejas que los estrógenos presentan en el cuerpo.
Algunos trabajadores han investigado la formación de estrógenos 2-hidroxilados y 16-hidroxilados en relación a las condiciones que alteran el riesgo de cáncer de mama. En la actualidad existe evidencia de que los factores que incrementan la actividad 2-hidroxilasa se relacionan con un menor riesgo de cáncer, mientras que aquellos que incrementan la 16-alfa-hidroxilación podrían incrementar el riesgo de cáncer de mama. La creciente evidencia de que el 2-metoxiestradiol es un metabolito endógeno con propiedades antimitóticas ha despertado el interés por el papel biológico de los metabolitos del estrógeno. La catecol-estrógeno-metil-transferasa, un enzima ampliamente distribuido en todo el cuerpo, forma 2-MeOE2 a partir de 2-hidroxi-estradiol (2-OHE2).
Algunos trabajadores han demostrado que 2-MeOE2 inhibe el crecimiento in vivo de los tumores que aparecen con la inyección subcutánea de sarcoma Meth A, melanoma B16 o células de cáncer de mama negativas (ER-) para el receptor MDA-MB-435 de estrógeno. También inhibe la proliferación y migración de las células endoteliales y la angiogénesis in vitro. Se ha sugerido que la capacidad de 2-MeOE2 de inhibir el crecimiento tumoral in vivo podría deberse a su capacidad para inhibir la angiogénesis inducida por tumores y no a la inhibición directa de la proliferación de las células tumorales.
El mecanismo por el que 2-MeOE2 ejerce sus potentes efectos antimitogénicos y antiangiogénicos todavía se está investigando. Existe evidencia de que a elevadas concentraciones puede inhibir la polimerización de los microtúbulos y actuar como un inhibidor débil de la unión de la colchicina a la tubulina. Sin embargo, recientemente se ha descubierto que a concentraciones que bloquean la mitosis, los filamentos de tubulina en las células no se encuentran despolimerizados sino que presentan una morfología idéntica a la observada tras el tratamiento con taxol. Por lo tanto, resulta posible que, al igual que con el taxol, un fármaco utilizado para la terapia del cáncer de mama y de ovario y mama, 2-MeOE2 actúe estabilizando la dinámica de los microtúbulos.
Aunque la identificación de 2-MeOE2 como nueva terapia para el cáncer representa un avance importante, la biodisponibilidad de los estrógenos administrados oralmente es pobre. Además, pueden experimentar cambios metabólicos extensivos durante su primera pasada por el hígado. Como parte de un programa de investigación para el desarrollo de un inhibidor de la sulfatasa esteroide para la terapia del cáncer de mama, se ha identificado el 3-O-sulfamato de estrona (EMATE) como potente inhibidor activo dirigido. Inesperadamente, EMATE ha demostrado poseer potentes propiedades estrogénicas, siendo su actividad uterotrófica oral en ratas 100 veces superior a la del estradiol. Su estrogenicidad incrementada se cree que resulta de su absorción por parte de los glóbulos rojos (rbcs), que lo protege de la inactivación durante su paso por el hígado y que permite que los globulos rojos actúen de reservorios para su liberación lenta durante un periodo prolongado de tiempo. Se han sintetizado y ensayado varios análogos de anillo A modificado, incluyendo el 3-O-sulfamato de 2-metoxiestrona. Aunque este compuesto es igual de potente que EMATE como inhibidor de la sulfatasa esteroide, carece de estrogenicidad.
Los presentes inventores creen que el compuesto de la presente invención proporciona un medio para el tratamiento de los cánceres y, especialmente, del cáncer de mama.
Adicionalmente o alternativamente, el compuesto de la presente invención puede resultar útil en el bloqueo del crecimiento de cánceres, incluyendo la leucemia y los tumores sólidos, tales como los tumores de mama, endometrio, próstata, ovario y páncreas.
Terapia que afecta al estrógeno
Los presentes inventores creen que algunos de los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en el control de los niveles de estrógenos en el cuerpo, en particular en la mujer. De esta manera, algunos de los compuestos pueden resultar útiles al proporcionar un medio de control de la fertilidad, tal como una tableta, píldora, solución o pastilla anticonceptiva oral. Alternativamente, el compuesto podría prepararse en forma de implante o como parche.
De esta manera, los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en el tratamiento de las condiciones hormonales asociadas con el estrógeno.
Adicionalmente o alternativamente, el compuesto de la presente invención puede resultar útil en el tratamiento de condiciones hormonales además de las asociadas con el estrógeno. Por lo tanto, el compuesto de la presente invención también podría ser capaz de afectar la actividad hormonal y la respuesta inmunológica.
Enfermedades neurodegenerativas
Los presentes inventores creen que algunos de los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas y de condiciones similares.
Por ejemplo, se cree que los inhibidores de STS pueden resultar útiles en el incremento de la función de la memoria de pacientes que padecen enfermedades tales como amnesia, lesiones de la cabeza, enfermedad de Alzheimer, demencia epiléptica,demencia presenil, demencia post-traumática, demencia senil, demencia vascular y demencia secundaria a ictus o para individuos que deseen mejorar su memoria.
TH1
Los presentes inventores creen que algunos de los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en implicaciones de TH1.
Por ejemplo, se cree que la presencia de inhibidores de STS dentro de los macrófagos o de otras células presentadoras de antígenos puede conducir a una menor capacidad de las células T sensibilizadas de establecer una respuesta de TH1 (IL-2 elevado, IFN?, IL-4 reducido). Por lo tanto, predominaría la influencia reguladora normal de otros esteroides, tales como los glucocorticoides.
Condiciones inflamatorias
Los presentes inventores creen que algunos de los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en el tratamiento de condiciones inflamatorias, tales como las condiciones asociadas a uno o más cualesquiera de entre: autoinmunidad, incluyendo por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes de tipo I y de tipo II, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, tiroiditis, vasculitis, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, trastornos de la piel, por ejemplo soriasis y dermatitis de contacto, enfermedad de injerto contra huésped; eccema y rechazo de órgano tras un trasplante.
Por ejemplo, se cree que los inhibidores de STS pueden impedir los efectos fisiológicos normales de DHEA o de esteroides relacionados sobre las respuestas inmunológicas y/o inflamatorias.
Los compuestos de la presente invención pueden resultar útiles en la preparación de un medicamento para revelar un efecto endógeno similar al de los glucocorticoides.
Otras terapias
También queda entendido que el compuesto/composición de la presente invención puede presentar otras implicaciones médicas importantes.
Por ejemplo, el compuesto o composición de la presente invención pueden resultar útil en el tratamiento de los trastornos listados en la patente WO-A-99/52890, a saber:
Adicionalmente o alternativamente, el compuesto o composición de la presente invención puede resultar útil en el tratamiento de los trastornos listados en la patente WO-A-98/05635. A fines de una referencia más sencilla, se proporciona parte de dicha lista: cáncer, inflamación o enfermedad inflamatoria, trastornos dermatológicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, respuesta de coagulación y de fase aguda, caquexia, anorexia, infección aguda, infección por VIH, estados de choque, reacciones de injerto contra huésped, enfermedad autoinmunológica, daño por reperfusión, meningitis, migraña y antitrombosis dependiente de aspirina; crecimiento, invasión y extensión tumoral, angiogénesis, metástasis, ascites maligna y efusión pleural maligna; isquemia cerebral, enfermedad cardíaca isquémica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis múltiple, neurodegeneración, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, ictus, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; soriasis, dermatitis atópica, úlceras crónicas, epidermolisis bullosa; ulceración corneal, retinopatía y cicatrización de heridas quirúrgicas; rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, anafilaxis; restenosis, enfermedad cardíaca congestiva, endometriosis, aterosclerosis o endosclerosis.
Adicionalmente o alternativamente, el compuesto o composición de la presente invención puede resultar útil en el tratamiento de los trastornos listados en la patente WO-A-98/07859. A fines de una referencia más sencilla, se proporciona parte de dicha lista: actividad de proliferación/diferenciación de células y de citoquinas; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (por ejemplo para el tratamiento de las inmunodeficiencias, incluyendo la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana; regulación del crecimiento de los linfocitos; tratamiento del cáncer y de muchas enfermedades autoinmunológicas, y para prevenir el rechazo de los trasplantes o para inducir la inmunidad tumoral); regulación de la hematopoyesis, por ejemplo el tratamiento de las enfermedades mieloides o linfoides; estimulación del crecimiento del tejido de hueso, cartílago, tendón, ligamento y tejido nervioso, por ejemplo para la cicatrización de heridas, el tratamiento de quemaduras, úlceras y para la enfermedad y neurodegeneración periodontales; inhibición o activación de la hormona folículo-estimulante (modulación de la fertilidad); actividad quimotáctica/quimocinética (por ejemplo para movilizar tipos celulares específicos hacia sitios de lesión o infección); actividad hemostática y trombolítica (por ejemplo para el tratamiento de la hemofilia y el ictus); actividad antiinflamatoria (para el tratamiento de, por ejemplo, el choque séptico o la enfermedad de Crohn); como antimicrobiano; moduladores de, por ejemplo, el metabolismo o el comportamiento; como analgésicos; en el tratamiento de trastornos de deficiencia específicos; en el tratamiento de, por ejemplo, la soriasis, en medicina humana o veterinaria.
Adicionalmente o alternativamente, la composición de la presente invención puede resultar útil en el tratamiento de los trastornos listados en la patente WO-A-98/09985. A fines de una referencia más sencilla, a continuación se proporciona parte de dicha lista: actividad inhibitoria de macrófagos y/o de células T y, de esta manera, actividad antiinflamatoria; actividad antiinmunológica, es decir efectos inhibitorios contra una respuesta inmunológica celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada a inflamación; inhibición de la capacidad de los macrófagos y de las células T de adherirse a los componentes de la matriz extracelular y a la fibronectina, así como expresión regulada positivamente del receptor fas en las células T; inhibición de reacciones inmunológicas y de inflamación no deseadas, incluyendo artritis, artritis reumatoide, inflamación asociada a hipersensibilidad, reacciones alérgicas, asma, lupus sistémico eritematoso, enfermedades del colágeno y otras enfermedades autoinmunológicas, inflamación asociada a aterosclerosis, arterioesclerosis, enfermedad cardiaca aterosclerótica, daño por reperfusión, fallo cardíaco, infarto de miocardio, trastornos vasculares inflamatorios, síndrome del distrés respiratorio u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada a úlcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tracto gastrointestinal, fibrosis hepática, cirrosis hepática u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epidídimo-orquitis, infertilidad, orquitis traumática u otras enfermedades testiculares relacionadas inmunológicamente, disfunción placentaria, insuficiencia placentaria, aborto habitual, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecológicas relacionadas inmunológicamente y/o inflamatoriamente, uveitis posterior, uveitis intermedia, uveitis anterior, conjuntivitis, corioretinitis, uveoretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo retinitis o edema macular cistoide, oftalmia simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunológicos e inflamatorios de la enfermedad degenerativa del fondo del ojo, componentes inflamatorios del traumatismo ocular, inflamación ocular provocada por infección, vítreo-retinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo tras operación de filtración de glaucoma, reacción inmunológica y/o inflamatoria contra los implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas inmunológicamente e inflamatoriamente relacionadas, inflamación asociada con enfermedades o condiciones o trastornos autoinmunológicos en los que resultaría beneficiosa la supresión inmunológica y/o de la inflamación en el sistema nervioso central (SCN) o en cualquier otro órgano, enfermedad de Parkinson, complicaciones y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, encefalopatía por VIH/complejo demencia-SIDA, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades, condiciones o trastornos degenerativos del SNC, componentes inflamatorios del ictus, síndrome postpolio, componentes inmunológicos e inflamatorios de los trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, pan-encefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, pseudotumor cerebral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de la compresión o traumatismo o infecciones del SCN, componentes inflamatorios de atrofias o distrofias musculares, y enfermedades, condiciones o trastornos inmunológicamente e inflamatoriamente relacionados de los sistemas nerviosos central y periférico, inflamación post-traumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones o efectos secundarios inflamatorios de cirugía, trasplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios de trasplantes, complicaciones y/o efectos secundarios inflamatorios y/o inmunológicos de la terapia génica, por ejemplo debido a infección con un portador vírico, o inflamación asociada con el SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunológica humoral y/o celular, para el tratamiento o mejora de las enfermedades proliferativas de los monocitos o leucocitos, por ejemplo la leucemia, mediante la reducción de la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o tratamiento del rechazo de injerto en casos de trasplante de células naturales o artificiales, tejidos y órganos, tales como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos y tejido cutáneo natural o
artificial.
Preparación del compuesto
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse haciendo reaccionar un alcohol apropiado con un cloruro adecuado. Por ejemplo, los compuestos sulfamato de la presente invención pueden prepararse haciendo reaccionar un alcohol apropiado con un cloruro de sulfamoilo adecuado, de fórmula R_{1}R_{2}NSO_{2}Cl.
Las condiciones típicas para llevar a cabo la reacción son las siguientes.
Se añaden hidruro sódico y un cloruro de sulfamoilo a una solución agitada del alcohol en dimetil formamida anhidra a 0ºC. Seguidamente, la reacción se deja que se caliente hasta la temperatura ambiente, después de lo cual se continúa la agitación durante 24 horas adicionales. La mezcla de reacción se vierte sobre una solución saturada fría de bicarbonato sódico y la fase acuosa resultante se extrae con diclorometano. Los extractos orgánicos agrupados se secan sobre MgSO_{4} anhidro. La filtración, seguida de la evaporación del disolvente en el vacío y la coevaporación con tolueno proporciona un residuo crudo que se purifica adicionalmente mediante cromatografía flash.
Preferentemente, previamente a la reacción, el alcohol se derivatiza, según resulte apropiado, con el cloruro de sulfamoilo. En caso necesario, pueden protegerse los grupos funcionales en el alcohol de manera conocida y el grupo o grupos protectores pueden eliminarse al final de la reacción.
Preferentemente, los compuestos sulfamato se preparan de acuerdo con las enseñanzas de Page et al. (Tetrahedron 46:2059-2068, 1990).
Sumario
En resumen, la presente invención proporciona nuevos compuestos para la utilización como inhibidores de la sulfatasa esteroide, y composiciones farmacéuticas que los contienen.
Ejemplos
A continuación se describe la presente invención únicamente a título de ejemplo haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 presenta un esquema general de reacción;
la figura 2 presenta un esquema general de reacción;
la figura 3 presenta una fórmula de compuesto;
la figura 4 presenta una tabla de datos;
la figura 5 presenta un gráfico;
la figura 6 presenta una fórmula de compuesto;
la figura 7 presenta una tabla de datos;
la figura 8 presenta un gráfico;
la figura 9 presenta un gráfico;
la figura 10 presenta una fórmula de compuesto;
la figura 11 presenta una fórmula de compuesto;
la figura 12 presenta un gráfico; y
la figura 13 presenta un gráfico.
Los compuestos siguientes según la presente invención (ver las figuras 3, 6, 10 y 11) se prepararon de acuerdo con el esquema sintético general presentado en la figura 2. En particular, se prepararon los compuestos 1, 2, 3, 5, 6, 8 y 9 (ver Esquema 1 en la figura 1) tal como describen Page et al. (Tetrahedron 46:2059-2068, 1990).
A continuación, los compuestos se sometieron a ensayo de acuerdo con los protocolos indicados anteriormente. Los resultados (ver las figuras 4, 5, 7, 8, 9, 12 y 13) demostraron que eran capaces de actuar como inhibidores de STS.
También se estimó la IC_{50} de cada uno de los compuestos 4, 7, 10 y 13. A continuación se proporcionan estos valores.
Compuesto IC_{50}
4 2-bromo-EMATE 1,65 nM
7 2-yodo-EMATE 6,1 nM
10 2-cloro-EMATE 0,8 nM
13 2-fluoro-EMATE 5,6 nM
Acetato de estrona (1)
Se calentó bajo reflujo durante 2 horas una mezcla de estrona (10 g, 36,82 mmoles), anhídrido acético (17,5 ml) y piridina (75 ml). La mezcla de reacción enfriada se concentró al vacío y seguidamente se refrescó con agua helada. El precipitado que se formó se separó por filtración, se lavó con agua, se secó y se recristalizó a partir de etanol acuoso (al 95%), proporcionando 1 en forma de cristales blancos (11,2 g, 97%); p.f.: 115 a 118ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:1): R_{f} 0,83; \numax (KBr) 1770, 1720 (C=O) cm^{-1}; \delta_{H} (400 MHz, CDCl_{3}) 0,91 (3H, s, C-18-CH_{3}), 1,42-2,19 (11H, m), 2,29 (3H, s, CH_{3}CO), 2,38-2,54 (2H, m), 2,9 (2H, t, J=4,43 Hz, C-6-CH_{2}), 6,81 (1H, d, J_{C-2-H,C-4-H} = 2,14 Hz, C-4-H), 6,86 (1H, dd, J_{C-4-H,C-2-H} = 2,44 Hz y J_{C-1-H,C-2-H} = 8,54 Hz, C-2-H) y 7,28 (1H, d, J_{C-2-H,C-1-H} = 8,24 Hz, C-1-H); MS m/z (FAB^{+}) 466,2 [10, (M+H+NBA)^{+}], 313,2 [65, (M+H)^{+}], 270,2 [100, (M+H-CH_{3}CO)^{+}]; MS m/z (FAB^{-}) 269,2 [100, (M-CH_{3}CO)^{-}]. Valores observados: C, 76,9; H, 7,83. C_{20}H_{24}O_{3} requiere: C, 76,89; H, 7,74%.
Acetato de 2-bromoestrona (2)
Se añadió trifluoroacetato tálico (6,958 g, 12,80 mmoles) a una solución de 1 (2,0 g, 6,402 mmoles) en ácido trifluoroacético (TFA, 50 ml) y la mezcla resultante se agitó a 0ºC bajo nitrógeno durante 24 horas. Tras eliminar el TFA bajo presión reducida a <40ºC, el complejo cristalino de estrona-talio (III) que se obtuvo se lavó dos veces con 1,2-dicloroetano, 1,4-dioxano (30 ml) y seguidamente se añadió bromuro de cobre (8,58 g, 38,41 mmoles) a este complejo lavado y la mezcla resultante se calentó bajo reflujo durante 3 horas. Tras la evaporación del disolvente, seguidamente se añadió agua (100 ml) a este complejo lavado. Tras la evaporación del disolvente, se añadió agua (100 ml) al residuo resultante y el producto crudo se extrajo en diclorometano (3 x 150 ml). Los extractos orgánicos agrupados se lavaron con agua, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se evaporaron. El producto crudo obtenido se fraccionó mediante cromatografía flash (acetato de etilo/hexano, 1:4) y el sólido blanco pálido obtenido (2,05 g) se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de metanol, proporcionando 2 en forma de cristales incoloros (1,79 g, 72%); p.f.: 229 a 231ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y acetato de etilo/hexano, 4:1); R_{fS} 0,89 y 0,62, respectivamente; \numax (KBr) 1770, 1730 (C=O) cm^{-1}; \delta_{H} (400 MHz, CDCl_{3}) 0,91 (3H, s, C-18-CH_{3}), 1,25-2,3 (12H, m), 2,34 (3H, s, CH_{3}CO), 2,5 (1H, m), 2,86 (2H, t, J=4,58 Hz, C-6-CH_{2}), 6,85 (1H, s, C-4-H) y 7,49 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB^{+}) 545,2 [90, (M+H+MBA)^{+}], 391,2 [100, (M)^{+}], 348,1 [90, (M-CH_{3}CO)^{+}], 330,1 (10); Acc. MS (FAB^{+}) 391,08559. C_{20}H_{24}BrO_{3} requiere 391,09088. Observado: C, 61,2; H, 5,89; C_{20}H_{23}BrO_{3} requiere C, 61,39; H, 5,92%.
2-bromoestrona (3)
Se calentó una mezcla de 3 (1,5 g, 3,832 mmoles), carbonato potásico (2,65 g, 19,17 mmoles) en metanol (70 ml) bajo reflujo durante 3 horas. Tras la evaporación del disolvente, se añadió agua (50 ml) al residuo obtenido y el producto crudo se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml). Los extractos orgánicos agrupados se lavaron con agua, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se evaporaron, proporcionando un sólido amarillo (1,3 g) que se purificó mediante recristalización a partir de acetato de etilo/éter de petróleo (60 a 80ºC) (3:2), proporcionando 3 en forma de cristales amarillo pálido (1,23 g, 93%), p.f.: 190 a 193ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y 4:1): R_{fS} 0,51 y 0,64, respectivamente; \numax (KBr) 1710 (C=O) cm^{-1}; \delta_{H} (400 MHz, CDCl_{3}) 0,87 (3H, s, CH_{3}), 1,4-2,52 (13H, m), 2,84 (2H, m, C-6-CH_{2}), 5,32 (1H, br s, intercambiado por D_{2}O, OH), 6,73 (1H, s, C-4-H) y 7,52 (1H, s, C-1-H); \delta_{C} (400 MHz, CDCl_{3}) 13,81 (1, C-18), 21,56 (t), 25,89 (t), 26,26 (t), 29,9 (t), 31,54 (t), 31,91 (t), 38,04 (d), 43,6 (d), 47,93 (s, Cl_{3}), 50,38 (d), 114,94 (d, C-4), 135,04 (d, C-1), 128,84 (s), 130,92 (s), 139,02 (s), 152,7 (s, C-3) y 220 (s, C-17-C=O); MS m/z (FAB^{+}) 502,1 [20, (M+NBA)^{+}], 349,1 [100, (M)^{+}], 271,0 (20); MS m/z (FAB^{-}) 502,2 [40, (M+NBA)^{-}],
348,1 [100, (M-H)^{-}]; Acc. MS (FAB^{+}) 348,07532. C_{18}H_{21}BrO_{2} requiere 348,07249. Observado: C, 60,72; H, 5,94. C_{18}H_{21}BrO_{2} requiere C, 61,9; H, 6,06%.
3-O-sulfamato de 2-bromoestrona (4)
Tras la sulfamoilación, 3 (500 mg, 1,431 mmoles) proporcionó un producto crudo (620 mg) que se fraccionó mediante cromatografía flash (cloroformo/acetona, 8:1). El residuo de color beige obtenido (510 mg) se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de acetona/hexano (1:2), proporcionando 3 en forma de cristales de color beige (405 mg, 66%), p.f. > 155ºC (dec.); TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y 4:1): R_{fS} 0,43 y 0,61, respectivamente; \numax (KBr) 3500, 3300 (NH_{2}); 1730 (C=O), 1390 (SO_{2}N) cm^{-1}; \delta_{H} (400 MHz, acetona-d_{6}) 0,92 (3H, s, CH_{3}), 1,41-2,49 13H, m), 2,86 (2H, m, C-6-H_{2}), 7,27 (1H, s, C-4-H), 7,32 (2H, br s, intercambiado por D_{2}O, OSO_{2}NH_{2}) y 7,55 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB^{+}) 428,1 [100, (M)^{+}], 349,2 [40, (M+H-SO_{2}NH_{2})^{+}]; MS m/z (FAB^{-}) 580,2 [M-H+NBA], 428,1 [100, (M)^{-}], 349,1 [30, (M+H- SO_{2}NH_{2})^{-}]; Acc. MS (FAB^{+}) 428,04299. C_{18}H_{23}BrNO_{4}S requiere 428,05311. Observado: C, 49,1; H, 5,18; N, 3,60; C_{18}H_{22}BrNO_{4}S requiere C, 50,47; H, 5,18; N, 3,27%.
Acetato de 2-yodoestrona (5)
Se preparó el compuesto del título a partir de 1 (5,0 g, 16,01 mmoles) de la misma manera que en la preparación de 2, excepto en que se utilizó yoduro de cobre(18,29 g, 96,03 mmoles). El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía flash con acetato de etilo/hexano (1:4) y el sólido amarillo obtenido (6,25 g) se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de metanol, proporcionando 5 en forma de cristales amarillo pálido (5,89 g, 84%); p.f.: 170 a 172ºC (los cristales adquirieron un color marrón a >145ºC); TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y acetato de etilo, 4:1): R_{fS} 0,8 y 0,67, respectivamente; \numax (KBr) 1770, 1730 (C=O), \delta_{H} (400 MHz, CDCl_{3}) 0,92 (3H, s, C-18-CH_{3}), 1,4-2,31 (12H, m), 2,34 (3H, s, CH_{3}CO), 2,5 (1H, m), 2,87 (2H, t, J=4,27 Hz, C-6-CH_{2}), 6,82 (1H, s, C-4-H) y 7,69 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB^{+}) 592,1 [20, (M+H+NBA)^{+}], 439,1 [80, (M+H)^{+}], 396,1 [100, (M+H-CH_{3}CO)^{+}],
270,2 (40); Acc. MS (FAB^{+}) 439,07667. C_{20}H_{24}IO_{3} requiere 430,07702. Observado: C, 54,2; H, 5,3. C_{20}H_{23}IO_{3} requiere C, 54,81; H, 5,29%.
2-yodoestrona (6)
El compuesto del título se preparó a partir de 5 (4,0 g, 9,126 mmoles) de la misma manera que en la preparación de su análogo bromo 3. El producto crudo amarillo obtenido se recristalizó a partir de metanol, proporcionando 6 en forma de cristales amarillo pálido (3,29 g, 91%); p.f.: 207 a 209ºC (los cristales adquirieron un color marrón a >169ºC); TLC (cloroformo/acetona, 8:1): R_{f} 0,75; \numax (KBr) 3400 (OH), 1730 (C=O) cm^{-1}; \deltaH (270 MHz, CDCl_{3}) 0,91 (3H, s, C-18-CH_{3}), 1,4-2,56 (13H, m), 2,83 (2H, m, C-6-CH_{2}), 5,24 (1H, s, intercambiado por D_{2}O, C-3-OH), 6,74 (1H, s, C-4-H) y 7,52 (1H, s, C-1-H); \delta_{C} (400 MHz, CDCl_{3}) 13,82 (q, C-18), 21,57 (t), 25,89 (t), 26,26 (t), 29,98 (t), 31,57 (t), 31,81 (t), 39,0 (d), 43,9 (d), 48,3 (s, Cl_{3}), 50,38 (d), 116,54 (d, C-4), 138,14 (d, C-1), 129,64 (s), 131,92 (s), 138,02 (s), 153,6 (s, C-3) y 220 (s, C- 17, C=O); MS m/z (FAB^{+}) 550,1 [20, (M+H+NBA)^{+}], 396,1 [100, (M)^{+}], 271,2 (40); MS m/z (FAB^{-}) 549,2 [20, (M+H+NBA)^{+}], 395,1 [100, (M)^{+}];
Acc. MS (FAB^{+}) 397,0651. C_{18}H_{22}IO_{2} requiere 397,06646. Observado: C, 53,7; H, 5,34. C_{18}H_{21}IO_{2} requiere C, 54,56; H, 5,34%.
3-O-sulfamato de 2-yodoestrona (7)
Tras la sulfomoilación, 6 (500 mg, 1,262 mmoles) proporcionó un producto crudo que se fraccionó mediante cromatografía flash (cloroformo/acetona, 8:1). El residuo de color beige obtenido (450 mg) se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de acetona/hexano (1:2), proporcionando 7 en forma de cristales de color beige (342 mg, 57%); p.f. >145ºC (dec.); TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y 4:1): R_{fS} 0,61 y 0,73, respectivamente; \numax (KBr) 3500, 3200 (NH_{2}), 1720 (C=O), 1390 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (400 MHz, acetona-d_{6}) 0,92 (3H, s, CH_{3}), 1,4-2,53 (13H, m), 2,83 (2H, m, C-6-H_{2}), 7,25 (1H, s, C-4-H), 7,32 (2H, br s, intercambiado por D_{2}O, OSO_{2}NH_{2}) y 7,76 (1H, s, C-1-H); MS m/z (FAB^{+}) 629,1 [40, (M+H+NBA)^{+}], 476,1 [100, (M+H)^{+}], 396,1 [40, (M+H-SO_{2}NH_{2})^{+}]; MS m/z (FAB^{-}) 628,1 [35, (M+NBA^{-})], 474,1 [100, (M-H)^{-}], 395,1 [20, (M-SO_{2}NH_{2})^{-}]; Acc. MS (FAB^{+}) 476,03874. C_{18}H_{23}INO_{4}S requiere 476,03926. Observado: C, 45,8; H, 4,74; N, 2,85; C_{18}H_{22}INO_{4}S requiere C, 45,48; H, 4,66; N, 2,95%.
El compuesto del título, que se representa gráficamente en la figura 6, en ocasiones se denomina "2-yodo-EMATE". Los resultados para este compuesto se presentan en las figuras 7 y 8.
Acetato de 2-cloroestrona (8)
El compuesto del título se preparó a partir de 1 (500 mg, 1,603 mmoles) de la misma manera que en la preparación de 2 excepto en que se utilizó cloruro de cobre (475 mg, 4,798 mmoles). El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía flash con acetato de etilo/hexano (1:4), y el sólido amarillo pálido obtenido (526 mg) se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de metanol, proporcionando 8 en forma de cristales blancos (436 mg, 78%); p.f.: 195 a 197ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y acetato de etilo, 4:1): R_{fS} 0,78 y 0,67, respectivamente; \numax (KBr) 1770, 1730 (C=O), \delta_{H} (400 MHz, CDCl_{3}) 0,90 (3H, s, C-18-CH_{3}), 1,38-2,29 (12H, m), 2,33 (3H, s, CH_{3}CO), 2,5 (1H, m), 2,87 (2H, m, C-6-CH_{2}), 6,85 (1H, s, C-4-H) y 7,34 (1H, s, C-1-H).
2-cloroestrona (9)
El compuesto del título se preparó a partir de 8 (400 mg, 1,15 mmoles) de la misma manera que en la preparación de su análogo bromo 3. El producto crudo amarillo pálido obtenido se recristalizó a partir de metanol, proporcionando 9 en forma de cristales blancos (320 mg, 90%); p.f.: 221 a 223ºC; TLC (cloroformo/acetona, 8:1): R_{f} 0,70; \numax (KBr) 3400 (OH), 1730 (C=O) cm^{-1}; \delta_{H} (270 MHz, CDCl_{3}) 0,91 (3H, s, C-18-CH_{3}), 1,4-2,54 (13H, m), 2,84 (2H, m, C-6-CH_{2}), 5,27 (1H, s, intercambiado por D_{2}O, C-3-OH), 6,71 (1H, s, C-4-H) y 7,31 (1H, s, C-1-H).
3-O-sulfamato de 3-cloroestrona (10)
Tras la sulfamoilación, 6 (200 mg, 655 \mumoles) proporcionó un producto crudo que se fraccionó mediante cromatografía flash (cloroformo/acetona, 8:1). El residuo de color beige que se obtuvo (190 mg) se purificó adicionalmente mediante recristalización a partir de acetona/hexona (1:2), proporcionando 10 en forma de cristales blancos (170 mg, 68%); p.f. >163ºC (dec.); TLC (cloroformo/acetona, 8:1 y 4:1): R_{fS} 0,63 y 0,74, respectivamente; \numax (KBr) 3500, 3200 (NH_{2}), 1720 (C=O), 1390 (SO_{2}) cm^{-1}; \delta_{H} (400 MHz, CDCl_{3}/DMSO-d_{6}, 10:1) 0,93 (3H, s, CH_{3}), 1,4-2,51 (13H, m), 2,86 (2H, m, C-6-H_{2}), 7,01 (2H, br s, intercambiado por D_{2}O, OSO_{2}NH_{2}), 7,25 (1H, s, C-4-H) y 7,35 (1H, s, C-1-H).
Acetato de 2-fluoroestrona (11)
Se sometieron a reflujo bajo nitrógeno durante 24 horas, estrona (1,50 g, 5,5 mmoles) y triflato de N-fluoropiridinio (2,74 g, 11,0 mmoles) en 1,1,2-tricloroetano (24 ml). Se eliminó el disolvente bajo presión reducida, y el residuo se vertió en agua y se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó, proporcionando un aceite crudo de color pardo que se disolvió en piridina (10,5 ml) y se trató con anhídrido acético (2,62 ml) bajo reflujo durante dos horas. El disolvente se evaporó y el residuo se vertió en agua helada. La solución se extrajo con diclorometano (3 x 100 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó, proporcionando un sólido crudo. La purificación mediante cromatografía flash en columna utilizando éter de petróleo (p.e.: 60 a 80ºC):acetato de etilo (9:1 a 7:3) como eluyente proporcionó 0,85 g de una mezcla cruda tras la evaporación. La recristalización a partir de éter de petróleo (p.e. 60 a 80ºC):etanol absoluto (2:8) proporcionó como primer producto predominantemente el acetato de 2-fluoroestrona 11 (pureza de entre el 75% y el 80%, estimada por ^{1}H-RMN) (215 mg, rendimiento del 12%) en forma de cristales incoloros.
2
Ref. ver P.C. Bulman, Page, F. Hussain, J.L. Maggs, P. Morgan y B. Kevin Park, Tetrahedron 46:2059-2068, 1990.
C_{20}H_{23}FO_{3}
P.M.: 330,39
P.f. (ºC): 83 a 88 (litt. 88 a 90)
^{1}H-RMN 270 MHz (CDCl_{3}): 0,91 (s, 3H, C-18-CH_{3}), 1,38-1,75 (m, 6H), 1,90-2,45 (m, 6H), 2,32 (s, 3H, CH_{3}) 2,46-2,57 (m, 1H), 2,80-2,95 (m, 2H, C-6-H), 6,83 (d, 1H, J=8,3 Hz, C-4-H), 7,07 (d, 1H, J=13,2 Hz, C-1-H).
M/S m/z (FAB modo positivo, rel. int.): 331,1 (59, M^{+}+1), 288,1 (100), 270,1 (22).
HRMS (FAB modo positivo) m/z calculado para C_{20}H_{23}FO_{3} (M^{+}+1) 331,170948, observado: 331,170464.
2-fluoroestrona (12)
Se disolvió el acetato de 2-fluoroestrona 11 (185 mg, 0,56 mmoles) en metanol (5 ml) y se desacetiló mediante calentamiento con K_{2}CO_{3} (387 mg, 5 equivalentes) bajo reflujo durante 3 horas. Tras la evaporación del disolvente, se añadió agua (25 ml) y el producto se extrajo a partir de diclorometano (3 x 20 ml). El extracto se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó bajo presión reducida. La recristalización a partir de éter de petróleo (p.e.: 60 a 80ºC):etanol absoluto (2:8) proporcionó 2-fluoroestrona (121 mg, pureza estimada mediante ^{1}H-RMN: 75%) en forma de cristales incoloros (p.f.: 220 a 227ºC). La purificación adicional mediante HPLC preparativa, disolvente MeOH:H_{2}O = 60:40, caudal de 20 ml/min, columna Waters Radialpak C18 de 100 x 25 mm, detección a 254 y a 270 nm, proporcionó, tras la evaporación de los disolventes, 2-fluoroestrona 12 en forma de sólido de color blanco (72 mg, rendimiento del 45%).
Ref. ver P.C. Bulman Page et al., Tetrahedron 46:2059-2068, 1990.
3
C_{18}H_{21}FO_{2}
P.M.: 288,36
P.f. (ºC): 220 a 223 [Litt. 220 a 222 (éter de petróleo-etanol absoluto)].
^{1}H-RMN 400 MHz (CDCl_{3}): 0,78 (s, 3H, C-18-CH_{3}), 1,37-1,79 (m, 6H), 1,91-2,40 (m, 6H), 2,46-2,56 (m, 1H), 2,80-2,90 (m, 2H, C-6-H), 5,02 (d, 1H intercambiado por D_{2}O, J=3,9 Hz, -OH), 6,72 (d, 1H, J=9,4 Hz, C-4-H), 6,98 (d, 1H, J=12,5 Hz, C-1-H).
^{19}F-RMN 376 MHz (CDCl_{3}): -144,50 (t, 1F, J=9,2 Hz).
HPLC Waters: eluyente MeOH:H_{2}O = 60:40, caudal: 2 ml/min, columna Waters Radialpak C18 de 8 x 100 mm, detección a 270 nm, TR de la 2-fluoroestrona = 11,69 min, 96,85%, TR de impurezas: 9,69 min, 3,15%.
M/S m/z (FAB^{+}, rel. int.): 289,0 [100, (M^{+}+1)], 149,0 (33), 120,0 (35).
M/S m/z (FAB^{-}, rel. int.): 287.1.0 [100, (M^{-}-1)], 200,0 (25), 140,0 (25), 123,0 (43).
HRMS (FAB modo positivo) m/z calculado para C_{18}H_{21}FO_{2}, M^{+} de 288,152558, observado: 288,151993.
3-O-sulfamato de 2-fluoroestrona (13)
A una solución de 2-fluoroestrona 12 (65 mg, 0,23 mmoles) en DMF anhidro (7 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno se añadió a temperatura ambiente DMBP (139 mg, 0,68 mmoles), después una solución de cloruro de sulfamoilo 0,68 M en tolueno (1,61 ml, 1,13 mmoles) mediante jeringa. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añadieron agua (50 ml) y acetato de etilo (60 ml) y, tras separarse, la capa orgánica se lavó con solución hipersalina (3 x 50 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó bajo presión reducida. El producto crudo obtenido se purificó mediante cromatografía flash (\diameter de la columna = 2,5 cm, h = 20 cm) utilizando como eluyente, cloroformo:acetona = 8,1, proporcionando 3-O-sulfamato de 2-fluoroestrona 13 en forma de sólido de color blanco (47 mg, rendimiento del 57%).
4
C_{18}H_{22}NO_{4}FS
PM: 367,44
P.f.: 189 a 193ºC
^{1}H-RMN 400 MHz (CDCl_{3}): 0,91 (s, 3H, C-18-CH_{3}), 1,36-1,70 (m, 6H), 1,92-2,36 (m, 6H), 2,46-2,57 (m, 1H), 2,80-2,95 (m, 2H, C-6-H), 5,03 (s ancho, 2H intercambiado por D_{2}O, -NH_{2}), 7,11 (d, 1H, J=9,7 Hz, C-4-H), 7,13 (d, 1H, J=15,5 Hz, C-1-H).
^{19}F-RMN 376 MHz (CDCl_{3}): -113,24 (dd, 1F, J=15,5 Hz y J=9,7 Hz).
M/S m/z (FAB^{+}, rel. int.): 367,0 (100, M^{+}), 350,0 (30), 288,1 (49), 258,0 (32), 243,1 (38), 178 (34), 133,0 (30), 97,0 (35).
M/S m/z (FAB^{-}, rel. int.): 366,0 [100, (M-H)^{-}], 77,9 (21).
HRMS (FAB^{+}) m/z calculado para C_{18}H_{22}NO_{4}S M^{+} 367,125358, observado: 367,126663
R_{f} 0,32 (CHCl_{3}:acetona = 8:1), SM R_{f} 0,58.
Inhibición de la actividad de la estrona sulfatasa por halo-EMATEs en microsomas placentarios
Se utilizó una placenta humana positiva para la sulfatasa como fuente de microsomas placentarios. El tejido se homogeneizó y los núcleos y residuos celulares se separaron mediante centrifugación a 2.000 x g durante 30 minutos. Los microsomas placentarios se obtuvieron mediante centrifugación del sobrenadante resultante a 100.000 x g durante 1 hora.
Para los estudios de inhibición, los microsomas placentarios (125 \mug/ml) se incubaron en ausencia o en presencia de inhibidores (1 pm-1,0 \muM) con sulfato de ^{3}H-estrona (E1S, 2 x 10^{5} dpm ajustado a 20 \muM con E1S no marcado durante 60 minutos. Se añadió [4-^{14}C-E1] (7 x 10^{3} dpm) para corregir las pérdidas debidas al procedimiento y los esteroides libres y sulfatados se separaron mediante partición en disolvente utilizando tolueno. Se eliminó una parte del disolvente y se determinó el contenido de ^{3}H y de ^{14}C mediante espectrometría de centelleo líquido.
En la figura 12 se representan los datos obtenidos.
Se proporcionan datos adicionales en la tabla siguiente.
\newpage
Compuesto Ensayo en placa de células MCF-7 (% de inhibición a 10 \muM)
2-Cl-EMATE 35
2-Br-EMATE 33
2-I-EMATE 25
Efecto de los halo-EMATEs sobre el crecimiento de células T47D (ensayo en placa)
Se sembraron células de cáncer de mama positivas para el receptor T47D en una placa de cultivo de 96 pocillos y se dejaron crecer hasta una confluencia de aproximadamente el 70%. Las células se trataron con vehículo (controles, tetrahidrofurano en el medio) o con halo-EMATEs (1 ó 10 \muM), y se cultivaron durante 24 horas adicionales. Al final de este periodo, se determinaron los efectos de los fármacos sobre el número de células utilizando un ensayo de microtitulación en placa (ensayo de proliferación celular Cell Titre 96, Promega). En este ensayo, la conversión de sustrato por las células no tratadas al final del periodo de cultivo se estableció que constituía el 100%.
En la figura 13 se representan los datos obtenidos.
Se proporcionan datos adicionales en la tabla siguiente.
Compuesto Ensayo celular con células T47D
% de inhibición a 1 \muM % de inhibición a 10 \muM Morfología
2-F-EMATE <1 30 +
2-Cl-EMATE 1 7,5 +
2-Br-EMATE - - +
2-I-EMATE - - +
+ presenta un efecto sobre la morfología celular.

Claims (12)

1. Compuesto que presenta una estructura anular esteroidea y con la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que
Rh_{1} es un grupo halo;
Rh_{2} es un grupo halo opcional;
Rs es un grupo sulfamato; y
en la que la estructura de anillo esteroideo se selecciona de entre:
estrona, 4-OH-estrona, 6\alpha-OH-estrona, 7\alpha-OH-estrona, 16\alpha-OH-estrona, 16\beta-OH-estrona, 17-desoxiestrona, 4-OH-17\beta-estradiol, 6\alpha-OH-17\beta-estradiol, 7\alpha-OH-17\beta-estradiol, 4-OH-17\alpha-estradiol, 6\alpha-OH-17\alpha-estradiol, 7\alpha-OH-17\alpha-estradiol, 16\alpha-OH-17\alpha-estradiol, 16\alpha-OH-17\beta-estradiol, 16\beta-OH-17\alpha-estradiol, 16\beta-OH-17\beta-estradiol, 17\alpha-estradiol, 17\beta-estradiol, 17\alpha-etinil-17\beta-estradiol, 17\beta-etinil-17\alpha-estradiol, 17-desoxiestradiol, estriol, 4-OH-estriol, 6\alpha-OH-estriol, 7\alpha-OH-estriol y 17-desoxiestriol.
2. Compuesto según la reivindicación 1, que presenta una estructura de anillo esteroideo y con la fórmula siguiente:
6
en la que Rh_{1}, Rh_{2} y R_{2} son tal como se han definido en la reivindicación 1.
3. Compuesto según la reivindicación 1 ó 2, en el que el grupo R_{5} presenta la fórmula siguiente:
7
en la que R_{1} y R_{2} se seleccionan independientemente de entre H, alquilo, cicloalquilo, alquenilo y arilo, o combinaciones de los mismos, o conjuntamente representan alquileno, en la que el alquilo o cicloalquilo o alquenilo, o cada uno de ellos, contiene opcionalmente uno o más heteroátomos o heterogrupos.
4. Compuesto según la reivindicación 3, en la que por lo menos uno de entre R_{1} y R_{2} es H.
5. Compuesto según la reivindicación 3, en el que cada uno de entre R_{1} y R_{2} es H.
\newpage
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en:
8
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su utilización en medicina.
8. Composición farmacéutica que comprende el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, opcionalmente mezclado con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
9. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de una condición o enfermedad asociada con la sulfatasa esteroide.
10. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado a su utilización en la terapia de una condición o enfermedad asociada con niveles adversos de sulfatasa esteroide.
11. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento destinado a su utilización en el tratamiento del cáncer.
12. Utilización según la reivindicación 11, en la que el cáncer es el cáncer de mama.
ES00985490T 1999-12-13 2000-12-07 Compuestos halogenos de sulfamato, fosfonato, tiofosfonato, sulfonato y sulfonamida como inhibidores de sulfatasa esteoride. Expired - Lifetime ES2250224T3 (es)

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