ES2250223T3 - Metodo de produccion de celulas animales adherentes. - Google Patents

Metodo de produccion de celulas animales adherentes.

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ES2250223T3 ES00985397T ES00985397T ES2250223T3 ES 2250223 T3 ES2250223 T3 ES 2250223T3 ES 00985397 T ES00985397 T ES 00985397T ES 00985397 T ES00985397 T ES 00985397T ES 2250223 T3 ES2250223 T3 ES 2250223T3
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Abstract

Proceso de producción en un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal de células animales o humanas no recombinantes adherentes que comprende: (i) una primera etapa en la que un dispositivo de cultivo que comprende un soporte de adhesión, un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal y que contiene una polivinilpirrolidona con un peso molecular medio comprendido entre 20 kDa y 360 kDa se siembra con una suspensión de células animales o humanas no recombinantes; (ii) una segunda etapa en la que las células se multiplican bajo agitación en el mismo medio de cultivo; y (iii) una tercera etapa en la que se recogen las células cuando han alcanzado un plató de crecimiento.

Description

Método de producción de células animales adherentes.
La presente invención se refiere a un método de producción de células animales adherentes en un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal para la fabricación de vacunas virales así como a la utilización de una molécula de polivinilpirrolidona (PVP).
Antecedentes de la técnica
Los medios de cultivo están constituidos generalmente por un medio básico, que contiene los elementos nutritivos esenciales para el desarrollo de las células, complementado con suero sanguíneo, la mayoría de las veces suero de ternera o suero de ternera fetal.
Se ha publicado que los medios de cultivo desprovistos de suero de origen animal inducen la proliferación de células no adherentes en suspensión, especialmente el cultivo de líneas de hibridomas (Kovar y Franek, Biotechnol. Lett. 9:259-264 (1987); Murakami H., en Growth of cells hormonally defined media (G. Sato et al., eds), Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, Nueva York, p. 711-715 (1982); Patente JP 63084487).
Se sabe que los medios de cultivo desprovistos de suero de origen animal no están adaptados para el cultivo de células adherentes (Kovar J., In vitro Cell. Dev. Biol. 25:395-396 (1989)). La unión de las células adherentes a un soporte necesita los factores de unión que aporta el medio de cultivo tales como fibronectina, vitronectina, laminina, colágeno (Koller M. R. y Papoutsakis E. T., Bioprocess. Technol. 20:61-110 (1995). Estos factores de unión están presentes esencialmente en el suero de origen animal (Hayman E., et al., Exp. Cell. Res. vol. 160: 245 (1985)).
La solicitud WO 88/00967 describe un proceso para el cultivo de células de mamíferos adherentes en un biogenerador que comprende una etapa de cultivo en un medio que contiene suero para favorecer la unión de las células a un soporte y permitir la proliferación de las células hasta una concentración deseada, seguida de una etapa en la que el medio de cultivo se elimina y se reemplaza por un medio desprovisto de suero que contiene una polivinilpirrolidona, polietilenglicol o un polímero constituido por uno o varios grupos óxido para proteger las células adherentes reduciendo el drenaje filmógeno alrededor de las células. Este proceso sirve para la producción de moléculas recombinantes por las células. No se ha mencionado que una PVP actúe sobre la proliferación celular.
La solicitud FR 2 635 008 describe un medio de cultivo definido, desprovisto de suero, que contiene una PVP que tiene un peso molecular de 40 KD (PVP 40) a una concentración de al menos 3% en el medio para favorecer la producción de interleuquina 2 en el sobrenadante del cultivo de una línea CHO adherente recombinante cultivada sobre microtransportadores situados en un reactor sometido a agitación mecánica. También se indica claramente que un medio de cultivo con una PVP 40 no es mejor que el mismo medio sin PVP 40 para garantizar el crecimiento de esa línea (página 7, líneas 15 a 25; página 8, líneas 5 a 8).
La solicitud WO 98/24883 describe la composición de un medio de cultivo desprovisto de suero, que contiene un compuesto esteroideo y PLURONIC F68 como agente tensioactivo y una PVP de 10 KD (PVP 10) como agente detoxificante, para favorecer el crecimiento de líneas adherentes, como la línea Vero en un entorno estático, es decir, un entorno en el que la línea no está sometida al flujo de agitación del medio de cultivo. La presencia de esteroides en el medio de cultivo es indispensable para observar crecimiento celular.
Según las indicaciones de la técnica anterior, se puede dudar razonablemente de que un medio sin suero que contiene una PVP pueda garantizar la multiplicación de líneas adherentes cuando se sitúan en un medio de cultivo agitado de manera regular, un entorno que se encuentra frecuentemente durante la producción de células en grandes cantidades o a gran escala. En efecto, la solicitud FR 2 635 008 muestra que una PVP utilizada como sustituto del suero no incrementa la multiplicación de las células adherentes en los microtransportadores sometidos a una agitación ambiental regular. El artículo de Gyun M. et al. (Hybridoma, Vol 8: 639-645), precisa, por otro lado, que el suero es indispensable cuando el medio de cultivo se agita de manera regular (página 639).
Existe una necesidad en el ámbito del cultivo de células de encontrar un sustituto para el suero de origen animal ya que su utilización es muy apremiante. Como producto de origen biológico, el suero es objeto de obligaciones reglamentarias muy estrictas respecto a su utilización con el fin de evitar la transmisión de virus animales al ser humano. Además, los componentes del suero no están bien identificados y están presentes en cantidades variables de un lote a otro, de ahí la necesidad de controlar la actividad biológica de esos lotes y, más especialmente, su acción sobre el crecimiento celular de manera que se seleccionen los mejores. La presencia de una gran cantidad de proteínas en el suero también puede complicar en gran medida los métodos de aislamiento y purificación de los componentes celulares y los derivados de las células como los virus.
Igualmente, existe una necesidad de encontrar un medio de cultivo desprovisto de suero que favorezca el crecimiento de las células en un medio agitado de manera regular, un entorno que se encuentra generalmente durante la producción de células en grandes cantidades. La agitación mecánica del medio mediante un flujo gaseoso es, en efecto, una condición necesaria ya que favorece el aporte de nutrientes aunque tiene el inconveniente de debilitar las células a causa de las fuerzas de cizalladura que produce.
El objetivo de la presente invención es paliar esas necesidades mediante la proposición de un método nuevo de producción de un tipo de células animales o humanas especiales.
Resumen de la invención
A este efecto, la presente invención se refiere, en primer lugar, a un proceso de producción en un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal de células animales o humanas no recombinantes adherentes que comprende:
(i)
una primera etapa en la que se siembra un dispositivo de cultivo que comprende un soporte de adhesión, un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal y que contiene una polivinilpirrolidona con un peso molecular medio comprendido entre 20 KD y 360 KD con una suspensión de células animales o humanas no recombinantes;
(ii)
una segunda etapa en la que las células se multiplican bajo agitación en el mismo medio de cultivo; y
(iii)
una tercera etapa en la que se recogen las células cuando han alcanzado un plató de crecimiento.
También se refiere a un proceso en el que el medio de cultivo tiene una composición químicamente definida.
Según un modo de realización del proceso, la polivinilpirrolidona tiene un peso molecular medio de 40 kDa.
Según otro modo de realización, el porcentaje de polivinilpirrolidona en el medio de cultivo está comprendido entre 0,01% y 2%.
De manera especial, el porcentaje de polivinilpirrolidona en el medio de cultivo es 0,1%.
La invención también se refiere a un proceso en el que el soporte de adhesión está constituido por microtransportadores.
De manera preferida, los microtransportadores están constituidos por una matriz de dextrano sustituido con grupos N,N-dietilaminoetilo.
La invención también tiene por objeto un proceso en el que el dispositivo de cultivo es un biogenerador.
En otro aspecto del proceso de la invención, el modo de cultivo es un modo discontinuo, semi-continuo, o por perfusión continua.
La invención tiene finalmente por objeto un proceso en el que las células son células de la línea Vero o MRC5.
Contra toda previsión, una PVP de 20 KD a 360 KD, y preferentemente una PVP de 40 KD en un medio de cultivo desprovisto de suero puede garantizar con una eficacia comparable a la de un medio con suero, el crecimiento de células adherentes sometidas a un flujo de agitación del medio. De una manera más sorprendente, una PVP de 10 KD ensayada en las mismas células y utilizada en las mismas condiciones no tiene un efecto significativo sobre el crecimiento cuando la solicitud WO 98/24883 relata un medio de cultivo definido que contiene una PVP de 10 KD, compuestos esteroides en presencia de tensioactivos para favorecer el crecimiento de líneas adherentes situadas en un entorno estático.
Descripción detallada de la invención
En el contexto de la presente invención, los diferentes términos utilizados se definen a continuación:
Por "Polivinilpirrolidona o PVP" se entiende un encadenamiento del monómero 1-vinil-2-pirrolidona mediante enlaces covalentes, de manera que se obtiene un polímero del monómero. Cuando el encadenamiento es lineal y no posee ramificaciones se considera que la polivinilpirrolidona no está reticulada.
Por "medio de cultivo que tiene una composición químicamente definida" se entiende un medio que comprende un número definido de componentes bien caracterizados a nivel molecular y utilizados en concentraciones también determinadas. Un medio de cultivo que contiene suero de origen animal no es un medio de cultivo químicamente definido.
Por "medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal" se entiende un medio de cultivo que no contiene suero o productos extraídos de sueros animales y, especialmente, los que provienen de mamíferos, aves, peces o crustáceos. El medio de cultivo puede tener una composición químicamente definida o químicamente no definida si contiene, por ejemplo, extractos de microorganismos, levaduras, u hongos o plantas que no están bien caracterizados a nivel químico.
Por "células adherentes" se entiende células establecidas en líneas o células obtenidas directamente a partir de la extracción de tejidos animales o humanos sanos o tumorales que necesitan un soporte sólido para multiplicarse y desarrollarse normalmente. Una característica esencial de las células adherentes es que forman una capa unicelular uniforme sobre su soporte debido al fenómeno de inhibición por contacto. Por lo tanto, se excluyen las células que no necesitan un soporte sólido para multiplicarse. En general, estas células crecen en suspensión en el medio de cultivo, como por ejemplo, las líneas de hibridomas. Las líneas adherentes pueden obtenerse de cultivos primarios de células sanas o tumorales aunque también pueden obtenerse mediante la transformación de células con la ayuda de agentes inmortalizantes. Las líneas adherentes utilizadas pueden ser mortales (duración de vida limitada) o inmortales (duración de vida ilimitada).
Por "flujo de agitación del medio" se entiende un medio de cultivo agitado mecánicamente y/o bajo la acción de una corriente gaseosa.
Por "índice de proliferación" se entiende la relación entre el número máximo de células obtenido por ml de medio de cultivo que contiene una PVP como sustituto del suero y el número máximo de células obtenido por ml del mismo medio de cultivo aunque desprovisto de PVP. Para el cálculo de este índice, se entiende que las células y las condiciones de cultivo son idénticas. El número máximo de células obtenido en cada uno de los dos medios ensayados no tiene en cuenta el momento en el que la curva de crecimiento observada para cada uno de los medios ha alcanzado una fase denominada estacionaria, o "plató" que muestra la parada de la proliferación de las células. Un valor del índice de proliferación \geq de 1 + 2 \sigma (siendo \sigma la incertidumbre del recuento celular expresado en %) significa que el medio que contiene una PVP incrementa la proliferación de las células.
Por "modo discontinuo" se entiende un modo de cultivo en medio cerrado sin aporte de elementos nutritivos adicionales, ni dispositivos de eliminación de los desechos tóxicos que se acumulan a lo largo de la duración del cultivo.
Por "modo semi-continuo" se entiende un modo de cultivo en medio semi-cerrado con al menos un aporte puntual de elementos nutritivos adicionales a lo largo de la duración del cultivo aunque este modo de cultivo no comprende dispositivos de eliminación de los desechos tóxicos que se acumulan.
Por "modo de cultivo continuo" se entiende un modo de cultivo en el que se aporta constantemente medio de cultivo nuevo para sustituir al mismo tiempo que se elimina una cantidad equivalente de medio utilizado.
Por "modo de cultivo continuo bajo perfusión" se entiende un modo de cultivo continuo en el que existe un dispositivo suplementario que retiene las células.
Por "soporte de adhesión" se entiende una superficie sólida cuyos componentes químicos externos que están en contacto con el medio de cultivo permiten la unión de las células adherentes.
Por "bio-generador" se entiende un depósito de cultivo, generalmente de acero inoxidable, con un volumen superior a 2 litros, que comprende un sistema de agitación, un dispositivo de inyección de una corriente gaseosa de CO_{2} y un dispositivo de oxigenación. Está equipado con sondas que determinan los parámetros internos del biogenerador tales como pH, oxígeno disuelto, temperatura, presión del depósito o determinados parámetros físico-químicos del cultivo (tales como el consumo de glucosa, de glutamina o la producción de lactatos e iones amonio). Las sondas de pH, de oxígeno y de temperatura están conectadas a un bio-procesador que garantiza el control de estos parámetros.
Por "microtransportadores" se entiende microbolas esféricas de 100 a 200 \mum de diámetro, porosas o no, cuya densidad es muy ligeramente superior a la del medio de cultivo y que están recubiertas de una matriz electrostática adhesiva. Los microtransportadores se mantienen en suspensión mediante agitación mecánica.
Por "etapa de infección" se entiende el tiempo de contacto necesario para que los agentes infecciosos con un ciclo de reproducción intracelular estricto tales como los virus, preparados bajo la forma de una suspensión en un medio adaptado, calificado como medio de infección, puedan penetrar en la célula.
Por "etapa de propagación" se entiende el tiempo necesario para que los agentes infecciosos con un ciclo de reproducción intracelular estricto, tales como los virus, puedan efectuar su ciclo de reproducción completo en la célula y para que se produzcan como una forma madura. La etapa de propagación se realiza en un medio de cultivo adaptado, calificado como medio de propagación, que puede ser diferente del medio de infección. Las formas maduras de determinados virus, como los virus de la varicela, permanecen intracelulares; por lo tanto, la recogida de los virus se realiza mediante la lisis de las células infectadas. En otros casos, las formas maduras son extracelulares y pueden reinfectar otras células que permanecen indemnes volviendo a iniciar nuevos ciclos de reproducción intracelular. La recogida de los virus puede realizarse en una sola vez mediante la toma de medio de propagación o a intervalos regulares, reemplazándose el medio de propagación tomado por medio nuevo hasta la finalización del ciclo de reproducción intracelular mediante la destrucción completa de la envoltura celular.
Por lo tanto, la invención se refiere a la utilización de una polivinilpirrolidona, preferentemente no reticulada, con un peso molecular medio comprendido entre 20 KD y 360 KD (PVP), y, de manera preferida, una PVP con un peso molecular medio de 40 KD, en un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal para favorecer la multiplicación de células animales o humanas adherentes sometidas a un flujo de agitación del medio. El efecto óptimo en la proliferación de células adherentes como por ejemplo las células de embriones de pollo, líneas murinas como la línea 3T3, NTCT, WEHI, líneas de hamster como la línea BHK o CHO, líneas caninas como la línea MDCK o células primarias de riñón de perro, líneas porcinas como la línea PK15, líneas de simios como la línea Vero, LLC-MK2, FRHL2 o líneas humanas como la línea MRC5, Hela, ECV o A 431 o líneas de melanomas como la línea A 375, se obtiene cuando se utiliza una PVP a una concentración en el medio de cultivo comprendida entre 0,01% y 2% (Peso/Volumen). Los expertos en la técnica están capacitados para adaptar las concentraciones de utilización de la PVP en el medio de cultivo en función del peso molecular medio de ésta. En efecto, se sabe que cuanto más elevado es el peso molecular de la PVP mayor es la viscosidad de un medio que la contiene. Una viscosidad muy considerable es perjudicial para el crecimiento celular. A título indicativo, los expertos en la técnica pueden referirse al valor de la viscosidad de un medio que contiene una PVP de 40 KD a una concentración de 0,1%, compatible con un buen crecimiento celular, para determinar las concentraciones de utilización de una PVP en el intervalo de pesos moleculares medios designados para realizar la invención.
Una PVP con un peso molecular medio comprendido entre 20 KD y 360 KD y, preferentemente 40 KD, utilizada a una concentración comprendida entre 0,01% y 2% en un medio de cultivo sin suero de origen animal también favorece la adhesión de esas células o de esas líneas celulares a su soporte en las horas que siguen a su siembra y esto a pesar de la agitación del medio de cultivo.
Por último, debe remarcarse que una PVP utilizada en las mismas condiciones en un medio de cultivo sin suero de origen animal redujo de manera notable la mortalidad celular a lo largo de la duración del cultivo.
Una PVP según la invención, está caracterizada generalmente por su peso molecular medio aunque también puede definirse mediante su valor K, que tiene en cuenta no solamente el peso molecular medio de una PVP sino también las variaciones de peso molecular a ambos lados del valor medio. Para el cálculo del valor K nos referimos a la ecuación como se define en el artículo Cryobiology, 8, 453-464 (1971): El valor K se calcula a partir de la viscosidad relativa de una disolución al 1% de PVP según la fórmula
Log \ \eta \ rel/C = 75 K_{0}{}^{2}/(1+1,5 K_{0}C) + K_{0}
K = 1.000 K_{0}
C representa la concentración en gramos de PVP por 100 ml de medio.
\eta rel es la viscosidad de la disolución comparada con la del disolvente.
Este valor K representa en definitiva la viscosidad intrínseca de una PVP que, para todos los efectos de la invención, deberá tener un valor comprendido entre 20 y 100 para una PVP con un peso molecular medio comprendido entre 20 KD y 360 KD.
El medio de cultivo básico en el cual se incorpora una PVP según la invención puede ser medio MEM, MEM-\alpha, DMEM, RPMI, ISCOVE, Ham F12, HAM F10, M199, L15, 6M, NCTC109, medio de Fischer, de Waymouth, medio Néphros (medio definido producido por Biowhittaker con la referencia nº 12-735Q), medio VPSFM (medio definido producido por la compañía Gibco Life Technologies y con la referencia nº 11002086), medio de Williams o mezclas de estos medios básicos. Estos medios básicos pueden estar enriquecidos en función de las necesidades de las células, con factores nutritivos adicionales como por ejemplo con azúcares tales como glucosa, con ácidos aminados tales como glutamina, con una mezcla de ácidos aminados no esenciales (producidos principalmente por la compañía Gibco Life technologies) o con otros ácidos aminados esenciales, con péptidos y más especialmente con péptidos de origen vegetal, con ácidos o sales de ácidos tales como piruvato de sodio, sales de EDTA, derivados del ácido cítrico o más generalmente con derivados de ácidos implicados en el ciclo de Krebs, con alcoholes como el etanol, con amino-alcoholes como etanolamina, con vitaminas como las vitaminas C y E, con agentes anti-oxidantes como el glutation o el selenio, con ácidos grasos con cadenas saturadas o insaturadas como el ácido linoleico, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido esteárico o ácido palmítico, con lípidos o lipopéptidos y también con fosfolípidos tales como lecitinas y preferentemente lecitinas de origen vegetal o con precursores de éstos. La adición de una disolución tampón con base de HEPES o de bicarbonatos podrá ser necesaria para determinados cultivos celulares frágiles o que producen grandes cantidades de CO_{2}, o eventualmente para tamponar los medios de cultivo fuertemente complementados con ácidos. De manera general, se procurará respetar un pH del medio de cultivo comprendido entre 6 y 8, la mayoría de las veces entre 7
y 8 y más específicamente entre 7,2 y 7,5. Se procurará en lo posible respetar la isotonicidad del medio de cultivo.
En función de las necesidades particulares de determinados tipos celulares, se pueden añadir al medio de cultivo ventajosamente en beneficio del objetivo de la invención derivados esteroides como cortisol, factores de crecimiento de origen sintético o recombinante, tales como, por ejemplo, citoquinas, hormona del crecimiento (Growth hormone), IGF (insulin growth factor), EGF (epidermal growth factor), FGF (Fibroblast growth factor), PDGF (platelet derivated growth factor), factores de unión tales como colágeno recombinante. Sin embargo, estos factores no son absolutamente necesarios para llevar a cabo la invención. Incluso si se utiliza preferentemente una PVP en un medio de cultivo químicamente definido, determinados cultivos celulares, especialmente los cultivos primarios obtenidos a partir de explantes
de órganos, pueden necesitar complementos en el cultivo a base de extractos bacterianos, levaduras o incluso vegetales.
Se entiende que el enunciado de los aditivos no es más que indicativo y no podría en ningún caso considerarse como restrictivo para los expertos en la técnica que quieran reproducir el objetivo de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a los diferentes procesos de cultivo que pueden utilizarse para garantizar el crecimiento de las células adherentes con un medio de cultivo conforme con la invención. Los cultivos de células adherentes con un medio de cultivo según la invención, pueden efectuarse en "modo discontinuo", "semi-continuo" o en modo de "cultivo continuo" cuando el crecimiento celular alcanza su plató en un intervalo de 7 días y cuando la concentración celular máxima no excede 3 10^{6} células/mL. Por el contrario, cuando se desean obtener concentraciones celulares máximas superiores a 3 10^{6} células/mL y/o cuando la duración del cultivo es muy importante, el medio de cultivo inicial según la invención se empobrece en determinados nutrientes esenciales como la glucosa o la glutamina mientras que se acumulan los desechos tóxicos resultantes del metabolismo celular como los lactatos o el amoníaco. En este caso se utiliza el modo "Semi-continuo" o el modo de "cultivo continuo". El modo "Semi-continuo" consiste en volver a añadir de manera puntual algunos de los componentes nutritivos básicos contenidos en el medio de cultivo inicial según la invención que han sido consumidos rápidamente por las células. Generalmente, se trata de volver a añadir glutamina, o mezclas de ácidos aminados, glucosa y algunas veces, según los cultivos, compuestos lipídicos. En el modo de "cultivo continuo", el problema de la acumulación de desechos se palia renovando de manera constante el medio de cultivo según la invención. Los expertos en la técnica, siguiendo la evolución de los parámetros del metabolismo celular, como la determinación del consumo de glucosa o glutamina, o siguiendo los niveles de amoníaco y lactatos en el medio de cultivo, están perfectamente capacitados para determinar el modo de cultivo más conveniente. Los dispositivos de cultivo que permiten una agitación del medio de cultivo comprenden frascos rodantes, frascos de tipo "spinners", bio-generadores. Los soportes del cultivo pueden estar constituidos por las paredes de los frascos sin haber sido necesariamente tratados previamente con agentes adhesivos especiales. Igualmente, se utilizan microtransportadores que incrementan considerablemente la superficie disponible para las células adherentes sin aumentar, sin embargo, de manera importante el volumen del medio de cultivo necesario. Este tipo de soporte ventajoso requiere sin embargo una agitación permanente y frecuentemente una buena oxigenación del medio de cultivo. Se puede aprovechar la utilización de los microtransportadores en los frascos rodantes, frascos de tipo spinners o bio-generadores. Los microtransportadores pueden estar constituidos, según los tipos celulares utilizados, por una matriz de dextrano sustituido con grupos N,N-dietilaminoetilo (Cytodex 1 y Cytodex 2), o eventualmente con factores de unión de origen sintético o recombinante como poli D lisina, colágeno recombinante o péptido RGD constituido por cadenas de arginina, glicina y ácido aspártico. Los microtransportadores también pueden ser de poliestireno, vidrio, celulosa o poliacrilamida. Pueden utilizarse a una concentración entre 1 g/litro y 100 g/litro de medio de cultivo según la invención. Los microtransportadores de tipo Cytodex1, se utilizan de manera preferente a una concentración comprendida entre 3 g/litro y 30 g/litro y de manera aún más preferida a una concentración comprendida entre 3 g/litro y
15 g/litro.
Cuando los microtransportadores de tipo Cytodex1 se sitúan en un biogenerador a una concentración de 3 g/litro, la concentración celular máxima que puede obtenerse con un medio según la invención depende del tamaño de las células y de las condiciones iniciales de la siembra de las células. En efecto, para que haya un recubrimiento uniforme de la superficie de los microtransportadores por las células, cada microtransportador debe ser colonizado por al menos una célula durante la siembra. Se ha constatado que está condición se cumple cuando la concentración inicial de la siembra de las células está comprendida entre 15 y 50 x 10^{3} células por cm^{2} de superficie de los microtransportadores. Sin embargo, en estas condiciones de siembra, la concentración celular máxima no excede generalmente de 3 10^{6} células/mL en el biogenerador, cuando se cultivan células de gran tamaño como las células de la línea Vero o MRC5. El plató del crecimiento se obtiene generalmente con un retraso de 7 días después del inicio del cultivo de manera que puede utilizarse el modo "discontinuo", "semi-continuo" o "cultivo continuo". Por el contrario, cuando los microtransportadores de tipo Cytodex1 se utilizan a una concentración de 15 g/litro se obtienen, en las mismas condiciones óptimas de siembra, densidades celulares con células Vero o MRC5 que sobrepasan 5 10^{6} células/mL utilizando un medio según la invención. El modo "semi-continuo" o el modo de "cultivo continuo" se utiliza para paliar el déficit en nutrientes esenciales y/o el problema de la acumulación de desechos tóxicos. Cualquiera que sea el modo utilizado, el medio de cultivo se agita permanentemente utilizando, por ejemplo, una pala de agitación mecánica, del tipo "delta" (patente Fr: Nº8018608). Cuando se utiliza un modo de "cultivo continuo bajo perfusión", la pala de agitación está situada preferentemente respecto al dispositivo que retiene las células en el biogenerador, siendo este dispositivo, por ejemplo, una alcachofa. El medio, cualquiera que sea el modo de cultivo utilizado, también se oxigena regularmente mediante un tubo hueco sumergido, alimentado con oxígeno. También puede utilizarse un proceso de oxigenación del medio según la invención situado en el exterior del biogenerador, denominado oxigenador. El oxigenador puede estar constituido por un sistema de fibras huecas cuya membrana de polisulfona, permeable al oxígeno, permite la transferencia de oxígeno en el medio de cultivo. El medio de cultivo del biogenerador también está alimentado con CO_{2} cuando el pH disminuye. La velocidad de agitación del medio, al igual que la cantidad de oxígeno del medio según la invención, son parámetros que pueden dominar los expertos en la técnica. Los índices de proliferación obtenidos utilizando un proceso de cultivo según la invención y, especialmente, el proceso de cultivo en biogenerador con microtransportadores a base de cytodex, sobrepasan frecuentemente 1,5 y algunas veces son cercanos a los observados con los medios de cultivo que contienen suero de origen animal utilizados para la producción industrial de
células.
El objetivo de la presente invención se comprenderá mejor con la lectura de los ejemplos que siguen pero que no tienen, sin embargo, ningún carácter limitativo.
Ejemplo 1 Estudio del crecimiento de una población de células Vero cultivadas en un biogenerador en medios de cultivo químicamente definidos que contienen una PVP 1A- Características de la línea Vero utilizada
La cepa utilizada proviene de la American Type Culture Collection (ATCC) con el código de referencia ATCC cclVERO F 1415, propagación 124. Se constituyó un banco celular de trabajo con la propagación 137 de esta cepa. Las células Vero se cultivan mediante propagaciones sucesivas a partir del banco de trabajo en medio de cultivo complementado con suero de ternera hasta la propagación 140. Después, éstas se sometieron a 2 a 3 propagaciones en uno de los dos medios definidos sin suero siguientes: el primero constituido a partes iguales por medio de Williams y por medio Néphros, el segundo constituido a partes iguales por medio VPSFM y medio de Williams, realizándose estas propagaciones adicionales de manera que se dispone de una cantidad suficiente de células como para sembrar un biogenerador, un spinner o frascos rodantes.
1B- Medios de cultivo y reactivos utilizados Preparación de los medios de cultivo básicos químicamente definidos
Todas las disoluciones preparadas se filtran sobre una unidad Millex 0.22 \mum (Millipore) con el fin de esterilizarlas.
\bullet Medio de Williams (véase el anexo 1)
- Mezcla en polvo Williams (Gibco) cuyos componentes 1 sobre
\hskip0.16cm expresados en gramos se muestran en la Figura 1
- NaHCO_{3} (Merck) 2,20 g
- Gentamicina (Unicet) 50 mg
- H_{2}O ultrafiltrada QSP 1 l
\bullet Medio Néphros (Biowhittaker- Ref nº 12-735Q): medio listo para utilizarse
Adición inmediata de:
- Glutamina 200 mM 10 ml/l
- Neomicina 1 ml/l
\bullet Medio VPSFM (Gibco Life Technologies- Ref nº 11002086) listo para utilizarse
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmulas y preparaciones de las disoluciones y tampones utilizados en el cultivo
\bullet PBS sin Ca^{2+} ni Mg^{2+}
- Disolución 10 x c (Gibco) 10 ml
- H_{2}O ultrafiltrada QSP 1 l
\bullet Tampón Citrato
- NaCl 8,00 g
- KCl 0,20 g
- Na_{2}HPO_{4}, 2H_{2}O 1,25 g
- KH_{2}PO_{4} 0,20 g
- Citrato trisódico, 2H_{2}O 7,40 g
- H_{2}O ultrafiltrada QSP 1 l
\bullet Tripsina Sigma al 2,5%
- Tripsina recristalizada 2 x (Sigma) 25,00 g
- NaCl (Merck) 9,00 g
- H_{2}O ultrafiltrada QSP 1 l
El tampón citrato y la tripsina Sigma se filtraron sobre cartuchos Millipack 0.22 \mum (Millipore). El PBS se filtró sobre membrana 0.22 \mum (Sartorius).
\bullet Disolución de inhibidor trípsico de Soja a 1 mg por litro
- Inhibidor trípsico de soja (Boehringer) 20 mg
- Medio E de Williams básico 20 ml
Esta disolución puede utilizarse inmediatamente o conservarse a -20ºC de dos a tres semanas.
1C- Disolución madre de PVP al 10% (Peso/Volumen)
Se disuelven 50g de PVP 40 KD (Sigma-ref 97H0571), o 50g de PVP 360 KD (Sigma-ref P5288) en 500ml de agua ultrafiltrada seguido de una filtración esterilizante sobre una unidad Millex 0,22 \mum (Millipore). Las diferentes disoluciones madre preparadas de esta manera se conservan a +4ºC y se añaden en una cantidad adecuada al medio de cultivo en el momento de su utilización en función de las concentraciones finales de PVP deseadas.
1D- Descripción del bio-generador y del Spinner Biogenerador de 3 litros
Éste está constituido por un depósito de acero inoxidable con fondo redondo provisto de un sistema de agitación constituido por una pala delta. Está equipado con sondas de pH, presión de O_{2}, temperatura y conectado a una consola BP 2.10 IM (PMC) que garantiza continuamente el control de los diferentes parámetros por medio de la inyección de CO_{2}, el de la cantidad de oxígeno disuelto mediante una exploración del aire en la superficie y de una inyección de oxígeno en el fondo. La temperatura se controla mediante un criostato RM6 Lauda que mantiene el cultivo a 37ºC gracias a una doble cubierta en la que el agua del criostato circula por un circuito cerrado.
Para determinados ensayos de cultivo continuo bajo perfusión, se han utilizado otros sistemas. Un sistema de perfusión se situó (Applikon Biosep ADI 1015) haciendo intervenir una cámara de resonancia con ultrasonidos que permite eliminar el medio utilizado alargando los microtransportadores en el biogenerador. Este sistema necesita la utilización de 2 bombas, una bomba de recirculación (Masterflex console drive, modelo 7518-02) y una bomba con dos cabezas Minipulse 2 (Gilson), para la alimentación y la salida de desechos del biogenerador. Todo está gestionado por una unidad Applikon Biosep ADI 1015 que regula la potencia y frecuencia del sistema y que controla la bomba de recirculación y la cámara de resonancia.
Spinner de 250 ml (Integra Biosciences)
Éstos son de vidrio con dos tapones en cada lado. El sistema de agitación necesita un agitador magnético. El sistema en el spinner está constituido por 2 vástagos lisos y redondos que contienen una barra imantada. La rotación está garantizada por un plato magnético Cellspin (Integra Biosciences). La determinación de los parámetros se realiza manualmente.
pH metro
El pH de los medios de cultivo después de la preparación y durante el cultivo se controla mediante un pH metro (PHM 220) Minissis 5000 Tacussel electrónico.
1E- Cultivo de las células Vero en Bio-generador de 3 litros (o en Spinner de 250ml) sobre microtransportadores de tipo Cytodex1
Las bolas de Cytodex1 (Pharmacia) se hidratan durante 24 horas a razón de 1 g de bolas por aproximadamente 50ml de tampón fosfato (0,1 M, p H= 7,4) seguido de 5 a 10 lavados con el mismo tampón hasta que el pH del tampón vuelve al valor normal. Las bolas se esterilizan a continuación durante 1 hora a 121ºC bajo 1,5-2 bares. Justo antes de su utilización los microtransportadores se lavan 2 veces con el medio que va a utilizarse para el cultivo celular antes de situarlos a razón de 3 g/litro de medio en un Spinner o un Biogenerador para una producción de células poco concentrada ("cultivo de baja densidad") o a razón de 15 g/litro de medio en un Biogenerador para una producción de células muy concentrada ("cultivo de alta densidad"). Las células Vero listas para utilizarse se siembran a razón de 30 x 10^{3} células por cm^{2} de superficie cultivable. El volumen final de medio corresponde al volumen recomendado para el sistema de cultivo utilizado (3 litros para un Bio-generador, 200 ml para un Spinner de 250 ml). Según el caso, el medio de cultivo utilizado está constituido por una mezcla a partes iguales de medio Nephros y de medio de Williams al cual se añade una PVP 40 KD a la concentración final de 0,1%, por una mezcla a partes iguales de medio VPSFM y de medio de Williams al cual se añade una PVP 40 KD a la concentración final de 0,1%, por una mezcla a partes iguales de medio VPSFM y de medio de Williams al cual se añade suero de ternera a la concentración final de 4%, o, por último, un medio de cultivo de referencia optimizado para la producción industrial de células Vero constituido por una base ISCOVE al cual se añade suero de ternera a la concentración de 4%. La agitación mecánica del medio se fija a aproximadamente 30 giros/minuto. Para el "cultivo de baja densidad", la aireación de la superficie se realiza mediante una mezcla de aire con 5% de CO_{2} mientras que la oxigenación se realiza en profundidad de manera que se tenga como mínimo una cantidad de oxígeno disuelto en el medio equivalente al menos al 10% de la saturación máxima de oxígeno del medio. El cultivo puede mantenerse en estas condiciones durante 5 a 7 días sin cambios o aporte de medio en Spinner o en Bio-generador. Para el "cultivo de alta densidad" realizado en Bio-generador, el medio de cultivo se renueva a partir del segundo día de cultivo hasta el séptimo día de cultivo a razón de dos volúmenes de medio de cultivo cada 24 horas (cultivo según un modo de cultivo continuo bajo perfusión). La agitación mecánica de la pala se fija a aproximadamente 15 giros/minuto. La cantidad de oxígeno disuelto en el medio es equivalente al 25% de la saturación máxima de oxígeno del medio.
1F- Estudio de los parámetros metabólicos del cultivo
El seguimiento de los nutrientes esenciales y metabolitos está garantizado por un sistema de análisis Nova Biomedical (Bio Profile 200) que determina el pH, la osmolaridad del medio, y las cantidades de glutamina, glucosa, glutamato, lactato, amoníaco y determinados iones tales como Ca^{2+}, K^{+} y Na^{+}. Este analizador necesita una muestra de sobrenadante del medio de 500 \mul.
Los compuestos más interesantes para controlar son por una parte glucosa y glutamina, fuentes de energía de la célula, y por otra parte sus productos de degradación que son lactato y amoníaco. La determinación de estos elementos permite controlar el estado celular del cultivo.
1G- Estudio del crecimiento celular
El crecimiento celular se evalúa diariamente por medio del número de células fijadas sobre las bolas mediante la técnica de tinción de núcleos según el método de Sanford K. et al (J. Nat. Cancer Inst., vol.11, 773-795 (1951)) y de Van Wezel A. (Microcarrier culture of animal cells. Tissue culture: methods and applications, Kruse P.F. y Patterson M.K., Eds, Academic Press, Nueva York, 372-377(1973)).
En un tubo de 15 ml, se introducen 5 ml de una toma homogénea de un cultivo en un biogenerador o spinner. Después de decantar las bolas y de eliminar el sobrenadante, las bolas colonizadas por las células se lavan 2 veces con un tampón fosfato. Sobre el precipitado del último lavado se añaden 5ml de una disolución de cristal violeta al 0,1%. Después de una incubación de 45 minutos a 37ºC, el ácido cítrico contenido en el cristal violeta se libera y tiñe todos los núcleos de las células. La suspensión de núcleos se homogeniza por agitación y después los núcleos se cuentan sobre una cámara de Fuchs-Rosenthal. El número de núcleos refleja el número de células fijadas sobre los microtransportadores que se muestra como número de células por ml de medio. La incertidumbre de la determinación es de +/-10%. Los resultados de los recuentos celulares expresados como número de células/ml se indican en la tabla que aparece más abajo.
TABLA 1
N/W N/W+PVP VPSFM/W VPSFM/W+PVP VPSFM/W+SVD ISCOVE+SVD
J0 675.000* 675.000 405.000 405.000 405.000 405.000
J1 307.810 1.562.500 533.000 781.250 881.000 573.000
J2 646.875 2.375.000 997.000 ND 2.210.000 1.430.000
J3 868.750 3.250.000 1.390.000 2.006.250 2.230.000 1.740.000
J4 1.765.625 2.906.250 1.670.000 2.162.500 2.590.000 1.950.000
J5 1.187.500 2.468.750 1.800.000 1.993.750 ND 2.330.000
J6 1.023.440 2.046.875 1.610.000 1.887.500 1.990.000 1.920.000
Leyendas:
\begin{minipage}[t]{150mm} J0, J1, J2, J3, J4, J5, J6 representan los tiempos de las tomas para el recuento de las células, correspondiendo el tiempo J0 a la concentración celular en el medio después de sembrar las células en el Bio-generador en el caso de un cultivo "de baja densidad", J1 el tiempo después de 24 horas de cultivo, J2 el tiempo 48 horas, J3 el tiempo 72 horas, J4 el tiempo 96 horas, J5 el tiempo 120 horas, J6 el tiempo 144 horas.\end{minipage}
*: número de células/ml
N/W: Medio de Néphros (Biowhittaker)/Williams
N/W+PVP: Medio de Néphros (Biowhittaker)/Williams suplementado con una PVP 40 KD al 0,1%
VPSFM/W: Medio VPSFM (Life Technology)/Williams
VPSFM/W+PVP: Medio VPSFM (Life Technology)/Williams suplementado con una PVP 40 KD al 0,1%
VPSFM+SVD: Medio VPSFM/Williams suplementado con 4% de suero de ternera
ISCOVE+SVD: Medio Iscove suplementado con 4% de suero de ternera.
ND: No determinado
Conclusiones
Aunque las condiciones de operación y las concentraciones celulares de la siembra son idénticas, el medio N/W+
PVP incrementa la proliferación de las células Vero y permite alcanzar concentraciones celulares máximas significativamente mayores que las obtenidas con el medio N/W solo (3.250.000 a J3 frente a 1.765.625 a J4). El índice de proliferación constatado con el medio N/W+PVP es 1,84 y está claramente por encima de 1,2 (1+2X0,1 (siendo 10% la incertidumbre sobre la medida determinada en las condiciones experimentales). Se observa igualmente la misma tendencia con el medio VPSFM/W en el que la PVP también acelera el crecimiento celular (el índice de proliferación es 1,201).
La acción de la PVP sobre el crecimiento celular de las células adherentes no depende, por lo tanto, del medio utilizado. Además, la PVP 40 proporciona unos resultados sustancialmente similares a los obtenidos con el suero de ternera ya que las concentraciones celulares determinadas durante los días 1 a 6 son prácticamente del mismo orden. Los resultados obtenidos con una PVP 360 KD a la concentración final de 0,5% en el medio de cultivo son similares a los obtenidos con una PVP 40. Por el contrario, un medio que contiene una PVP 10 KD a la concentración final de 0,1% en el medio de cultivo no tiene efecto positivo sobre el crecimiento celular.
También hemos estudiado el crecimiento de las células Vero en Biogenerador, en las condiciones de cultivo denominadas de "alta densidad" y en las cuales el medio de cultivo es una mezcla a partes iguales de VPSFM y de medio Williams al cual se ha añadido una PVP 40 KD a la concentración final de 0,1%. Los valores de las concentraciones celulares obtenidos entre J0 y J6 se muestran en la tabla nº 2 y se expresan en millones de células/ml.
TABLA 2
J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6
VPSFM/W+PVP 2,05 2,00 2,85 4,05 5,85 5,95 5,80
Estos resultados muestran que la concentración celular se ha triplicado entre J0 y J6. Un medio exento de suero de origen animal y que contiene una PVP como sustituto del suero puede, por lo tanto, utilizarse para los cultivos denominados de "alta densidad" en biogenerador.
Ejemplo 2 Estudio de la acción de PVP sobre la mortalidad celular
Las condiciones de operación del estudio son idénticas a las desarrolladas en los párrafos 1A a 1 F.
La mortalidad celular se evaluó diariamente mediante el número de células muertas o la determinación de LDH (lactato deshidrogenasa) en el medio de cultivo. La mortalidad celular se evaluó mediante una tinción con azul de tripán. A partir de la toma diaria de 1 ml del cultivo celular se añadió 1 ml de azul de tripán al 10%. Las células muertas que captan colorante se cuentan mediante una célula de Fuchs-Rosenthal. La incertidumbre de la determinación es +/- 10%. Los resultados de la mortalidad celular, expresados en número de células/ml, se indican en la tabla 3.
La evaluación de la mortalidad celular puede realizarse también mediante la determinación de la lactato deshidrogenasa en el sobrenadante del cultivo. En efecto, se ha mostrado que una evaluación de la mortalidad celular durante la fermentación en los biorreactores puede llevarse a cabo mediante la determinación de la LDH en el sobrenadante del cultivo. Una toma diaria de 0,5 ml se centrifuga a 800 giros/minuto durante 5 minutos para eliminar las células. Después, se incuba con la mezcla de reactivos del kit (Cytoxicity Detection kit (LDH), Boehringer Mannheim, Cat. No 1644 793) según el procedimiento descrito en el paquete. Un incremento de la mortalidad celular o de las lesiones de la membrana que produce un incremento de la actividad LDH se traduce en un incremento de la densidad óptica (o de tinción) en el ensayo utilizado. La dosificación se realizó en placas de 96 pocillos (Evergreen Scientific) con fondo plano con una cubierta de poliestireno sin tratar. En 2 pocillos se pusieron 200 \mul de sobrenadante a dosificar o de las diluciones de éste. Se añaden 100 \mul de reactivo del kit por pocillo. Después de una incubación de 10 minutos a 37ºC en una estufa seca la reacción enzimática se paró con 50 \mul de HCl 1N. La densidad óptica (DO) se determinó a 490nm mediante un lector de microplacas (dispositivos moleculares Emax). La precisión de la determinación es +/- 10%. Cuanto más se eleva la DO más considerable es la mortalidad celular. Los resultados comparativos entre los diferentes medios ensayados, expresados en D.O. de la muestra ensayada, están reagrupados en la tabla 4.
TABLA 3
Toma NIW+PVP VPSFM/W VPSFM/W+PVP ISCOVE+SVF
J0 N.D. N.D. N.D. N.D.
J1 < 19.063 < 51.250
J2 < 23.125 < 48.440
J3 < 35.313 < 52.810
J4 < 16.875 < 42.500
J5 < 61.560 < 74.690
N.D.: no determinado
<: inferior a 5.000 células/ml 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
Toma N/W+PVP VPSFM/W VPSFM/W+PVP ISCOVE.+SVF
J0 N.D. N.D. N.D. N.D.
J1 0,027 0,110 0,028 0,055
J2 0,028 0,230 N.D. 0,073
J3 0,065 0,390 0,066 0,153
J4 0,112 0,510 0,115 0,155
J5 0,140 0,600 0,226 0,268
N.D.: no determinado
Conclusiones
Mientras que los resultados obtenidos con los medios sin suero o con suero muestran una mortalidad celular que fluctúa entre 10^{4} y 10^{5} células muertas/ml en ausencia de PVP, los obtenidos con los medios definidos a los que se añadió PVP muestran una disminución muy significativa de la mortalidad celular.
Los resultados de la determinación de la actividad LDH en los sobrenadantes del cultivo también muestran una actividad menor en los sobrenadantes del cultivo que proviene de medios que contienen una PVP respecto a aquellos desprovistos de PVP. Igualmente, puede indicarse que la actividad LDH es más elevada en los sobrenadantes del cultivo proveniente de un medio a base de suero que la presente en los medios que contienen una PVP. Estos resultados se correlacionan con los de la mortalidad celular. Por lo tanto, se puede concluir que los medios de cultivo que contienen una PVP garantizan una mejor integridad celular disminuyendo muy sensiblemente la mortalidad celular, siendo esta acción más considerable que la observada con un medio que contiene suero de ternera.
Ejemplo 3 Estudio de la acción de PVP sobre la adhesión de las células a su soporte
Las condiciones de operación del estudio son idénticas a las desarrolladas en los párrafos 1A a 1 F.
Para evaluar el efecto de una PVP sobre la adhesión de las células, se determina el número de células que están fijadas sobre los microtransportadores 4 horas después de la siembra del Bio-generador o del Spinner según la técnica desarrollada en el párrafo 1 G. Se considera que al cabo de 4 horas, las células Vero están siempre en la misma fase de su ciclo celular, aquel en el que el número de núcleos contados corresponde al número de células unidas. La incertidumbre de la determinación es +/- 10%. Los resultados expresados en número de células/ml están reagrupados en la tabla que aparece más abajo.
TABLA 5
Toma N/W N/W+PVP VPSFM/W VPSFMIW+PVP
0 675.000* 675.000 405.000 405.000
4 h 453.125 787.500 394.000 439.250
Conclusiones
Estos resultados muestran claramente que la concentración celular es más considerable al cabo de 4 horas cuando los medios desprovistos de suero contienen una PVP.
Ejemplo 4 Papel de una PVP en el crecimiento, adhesión y mortalidad de células Vero cultivadas en frascos rodantes
Las células Vero como las descritas en el párrafo 1A se siembran en frascos rodantes de 300ml (Ref: Falcon 3007) a razón de 30.000 a 50.000 células por cm^{2} de soporte. Diferentes medios de cultivo definidos o no definidos sin suero de origen animal pero que contienen una PVP 40 KD al 0,1% se ensayaron como se ha descrito en el párrafo 1 A. Una PVP de 100 KD al 0,5% así como una PVP de 360 KD al 0,05% también se ensayaron utilizando los mismos medios de cultivo.
Las células Vero en suspensión en los diferentes medios de cultivo ensayados se introducen en los frascos rodantes que se ponen inmediatamente en los rodillos en los que la velocidad de rotación se fija entre 0,1 giros/mn y 0,5 giros/mn. Cuatro horas después de la siembra de los frascos, después diariamente durante 6 días, se realiza en estos frascos rodantes un estudio del crecimiento y adhesión de las células en las paredes del frasco después de haber quitado el medio de cultivo, lavar los frascos con un tampón fosfato y despegar las células con tripsina al 2,5% (Sigma) diluída 1/5.000 en un tampón citrato. El recuento de las células se llevó a cabo mediante azul de tripán. El estudio de la mortalidad de las células se siguió igualmente durante un periodo de 5 días a partir de la determinación de la LDH en el sobrenadante del cultivo. Los resultados de estos estudios corroboran los descritos en los ejemplos precedentes e indican que se puede utilizar una PVP con un intervalo amplio de pesos moleculares medios pero superiores a 10 KD y en un intervalo amplio de concentraciones en un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal para favorecer la proliferación y unión de las células adherentes y para disminuir muy considerablemente la mortalidad celular.
Ejemplo 5 Papel de una PVP en el crecimiento, adhesión y mortalidad de células MRC5 cultivadas en frascos rodantes
Las células MRC5 (Ref: NIBSC (pdl8)) utilizadas entre la propagación 20 y 50 se siembran en frascos rodantes de 300 ml (Ref: Falcon 3007) a razón de 50.000 células por cm^{2} de soporte. Diferentes medios de cultivo definidos sin suero de origen animal pero que contienen una PVP 40 KD al 0,1% se ensayaron como se ha descrito en el párrafo 1A. Una PVP de 100 KD al 0,1% así como una PVP de 360 KD al 0,05% también se ensayaron utilizando los mismos medios de cultivo.
Los frascos rodantes que contienen las células MRC5 así como los diferentes medios de cultivo mencionados se sitúan inmediatamente en los rodillos en los que la velocidad de rotación se fija entre 0,1 giros/mn y 0,5 giros/mn. 4 horas después de la siembra de los frascos, después diariamente durante 4 días, se realizó en estos frascos rodantes un estudio del crecimiento y adhesión de las células en las paredes del frasco después de haber quitado el medio de cultivo, lavar los frascos con un tampón fosfato y despegar las células con tripsina al 2,5% (Sigma) diluída 1/5.000 en un tampón citrato. El recuento de las células se llevó a cabo mediante azul de tripán. El estudio de la mortalidad de las células se siguió igualmente durante un periodo de 4 días a partir de la determinación de la LDH en el sobrenadante del cultivo. Los resultados de estos estudios se corresponden con los obtenidos con las células Vero y muestran que los efectos de una PVP en el crecimiento, mortalidad y adhesión celulares no están limitados a un único tipo celular.

Claims (10)

1. Proceso de producción en un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal de células animales o humanas no recombinantes adherentes que comprende:
(i)
una primera etapa en la que un dispositivo de cultivo que comprende un soporte de adhesión, un medio de cultivo desprovisto de suero de origen animal y que contiene una polivinilpirrolidona con un peso molecular medio comprendido entre 20 kDa y 360 kDa se siembra con una suspensión de células animales o humanas no recombinantes;
(ii)
una segunda etapa en la que las células se multiplican bajo agitación en el mismo medio de cultivo; y
(iii)
una tercera etapa en la que se recogen las células cuando han alcanzado un plató de crecimiento.
2. Proceso según la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo tiene una composición químicamente definida.
3. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la polivinilpirrolidona tiene un peso molecular medio de 40 kDa.
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el porcentaje de polivinilpirrolidona en el medio de cultivo está comprendido entre 0,01% y 2%.
5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el porcentaje de polivinilpirrolidona en el medio de cultivo es 0,1%.
6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el soporte de adhesión está constituido por microtransportadores.
7. Proceso según la reivindicación 6, en el que los microtransportadores están constituidos por una matriz de dextrano sustituido con grupos N,N-dietilaminoetilo.
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el dispositivo de cultivo es un biogenerador.
9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el modo de cultivo es el modo discontinuo, semi-continuo o por perfusión continua.
10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células son células de la línea Vero o MRC5.
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