ES2249794T3 - Enzima que participa en la regeneracion de la luciferina. - Google Patents
Enzima que participa en la regeneracion de la luciferina.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UNA PROTEINA QUE POSEE LA CAPACIDAD DE REGENERAR LA LUCIFERINA ACTUANDO SOBRE LA OXILUCIFERINA Y LA D TEINA. AÑADIENDO ESTA PROTEINA A UN SISTEMA DE LUCIFERINA/LUCIFERASA, LA LUMINISCENCIA PUEDE PERSISTIR Y LA CANTIDAD DE LUCIFERASA Y LUCIFERINA UTILIZADA PUEDE REDUCIRSE.
Description
Enzima que participa en la regeneración de la
luciferina.
La presente invención se refiere a una enzima que
participa en la regeneración de luciferina.
La bioluminiscencia es una reacción de oxidación
catalizada por la luciferasa con la luciferina como sustrato de
luminiscencia, y se forma oxiluciferina como el producto de la
reacción. La enzima luciferasa se ha aislado y se ha purificado a
partir de la Luciola cruciata
(EP-A-0318915, Kikkoman
Corporation).
Esta oxiluciferina se conoce como inhibidor de
esta reacción de la luciferasa, por lo que se sabe que la
luminiscencia de la reacción luciferina/luciferasa disminuye
rápidamente tras la luminiscencia instantánea inmediatamente tras la
reacción.
Se ha sugerido la posibilidad de conversión de
oxiluciferina a luciferina in vivo (Okada et al,
Tetrahedron Letters
Nº 32, págs. 2771 - 2774, 1974). Sin embargo, no se aisló, ni se purificó, ninguna enzima que actuara sobre la oxiluciferina para regenerar la luciferina como sustrato de luminiscencia. De hecho, Okada et al establecen que la transformación de oxiluciferina en luciferina puede que no se catalice enzimáticamente.
Nº 32, págs. 2771 - 2774, 1974). Sin embargo, no se aisló, ni se purificó, ninguna enzima que actuara sobre la oxiluciferina para regenerar la luciferina como sustrato de luminiscencia. De hecho, Okada et al establecen que la transformación de oxiluciferina en luciferina puede que no se catalice enzimáticamente.
Si se encontrara y se añadiera tal enzima al
sistema de reacción luciferina/luciferasa, caben esperarse mejoras
en la durabilidad de la luminiscencia y conducirán, por ejemplo, a
la reducción de la cantidad de luciferasa y luciferina
utilizadas.
El objeto de la presente invención es
proporcionar una enzima que tenga la capacidad de regenerar
luciferina actuando sobre la oxiluciferina y la
D-cisteína.
Como resultado de una intensa investigación, los
presentes inventores encontraron que una enzima que tiene la
capacidad de regenerar la luciferina actuando sobre la
oxiluciferina y la D-cisteína está presente en los
coleópteros vivos, y aislaron y purificaron satisfactoriamente la
enzima.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una enzima derivada de los coleópteros, con un peso
molecular de aproximadamente 40.000, tal como se determina por
SDS-PAGE, y que regenera la luciferina a partir de
la oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la
que el pH óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima
regenera la luciferina son pH 7 - 8 y de 35 a 50ºC, respectivamente.
La presente invención también proporciona una enzima derivada de los
coleópteros, con un peso molecular de aproximadamente 40.000, tal
como se determina por SDS-PAGE, y que regenera la
luciferina a partir de la oxiluciferina en presencia de
D-cisteína, en la que el pH óptimo y la temperatura
óptima a la que la enzima regenera la luciferina son pH 8 - 9 y de
50 a 70ºC, respectivamente. La invención también proporciona el uso
de la enzima de la invención en un sistema de reacción
luciferina/luciferasa.
Tal enzima con capacidad para regenerar la
luciferina actuando sobre la oxiluciferina y la
D-cisteína, puede obtenerse mediante la purificación
de un extracto a partir de un coleóptero a través de etapas de
purificación que incluyen una etapa cromatográfica. La enzima puede
obtenerse así a partir de un coleóptero, normalmente una
luciérnaga. La luciérnaga puede ser la Photinus pyralis
(luciérnaga de Norteamérica). Alternativamente, la luciérnaga es
una luciérnaga japonesa, en concreto la Luciola cruciata o
la Luciola lateralis.
La enzima de la invención tiene un peso molecular
de aproximadamente 40.000 tal como se determina por
SDS-PAGE. El pH óptimo y la temperatura óptima a la
que la enzima regenera la luciferina son pH 7 - 8 y de 35 a 50ºC,
respectivamente. Alternativamente, el pH óptimo y la temperatura
óptima a la que la enzima regenera la luciferina son pH 8 - 9 y de
50 a 70ºC, respectivamente.
La presente invención se describe en detalle a
continuación.
Para producir la presente enzima, puede
utilizarse cualquier método. Por ejemplo, puede mencionarse el
método siguiente.
Las fuentes de la presente enzima incluyen
coleópteros, tales como las luciérnagas, extractos de enzimas
brutos obtenidos a partir de luciérnagas comercialmente
disponibles, y recombinantes producidos mediante el uso de medios de
recombinación genética.
A continuación, tales fuentes que contienen la
presente enzima se disgregan, se lisan o se solubilizan en un
tampón.
El tampón no está limitado, a menos que la
presente enzima se inactive en él. Ejemplos son el tampón Tris, el
tampón fosfato, el tampón glicilglicina, etc.
Para su destrucción puede utilizarse: un mortero
y mano de mortero, un homogeneizador, una trituradora ("waring
blender"), una prensa francesa ("French press"), etc. Para
el lisado puede utilizarse un tratamiento con lisozima,
etc.
etc.
A continuación, se obtiene una solución de enzima
bruta mediante la centrifugación o la filtración de los materiales
disgregados, lisados o solubilizados de una manera habitual para la
eliminación residuos. Si es necesario, puede obtenerse polvo de
enzima bruta a partir de la solución de enzima bruta mediante la
elección adecuada de precipitación con sulfato de amonio,
precipitación con alcohol, precipitación con acetona, etc.
Puede obtenerse una preparación de enzima
purificada a partir de la solución de enzima bruta o polvo de enzima
bruta mediante una elección adecuada de una de las técnicas
siguientes: filtración en gel utilizando Sephadex (marca
registrada), Ultrogel (marca registrada), Bio-Gel
(marca registrada), etc., un método de adsorción - elución
utilizando intercambiadores iónicos, electroforesis utilizando gel
de poliacrilamida, etc., un método de adsorción - elución
utilizando hidroxiapatita, sedimentación tal como la centrifugación
en gradiente de densidad de sacarosa, etc., separación basada en
una diferencia en el punto isoeléctrico, cromatografía de afinidad,
fraccionamiento utilizando una membrana de tamiz molecular, membrana
de fibra hueca, etc.
El efecto de la presente invención es tal como
sigue: se proporciona una enzima con la capacidad de regenerar la
luciferina mediante actuación sobre la oxiluciferina y la
D-cisteína según la presente invención, y mediante
la adición de esta enzima a un sistema de reacción
luciferina/luciferasa, puede persistir la luminiscencia y pueden
reducirse la cantidad de luciferasa y luciferina utilizadas.
A continuación, la presente invención se describe
en más detalle haciendo referencia a los ejemplos.
Se disolvieron 4 g de extracto del órgano
luminoso de la luciérnaga (SIGMA) en 200 ml de tampón A (pH 7,0),
es decir, tampón Tris(hidroximetil)aminometano -
ácido clorhídrico (Tris-HCl) 25 mM que contiene
cloruro de sodio 100 mM, ditiotreitol 1 mM,
etilendiaminotetraacetato de disodio 1 mM, y glicerol al 10%
(p/v).
La solución así obtenida se precipitó con sulfato
de amonio de manera habitual, y el precipitado que se produce entre
el 40% y el 60% de saturación con sulfato de amonio se disolvió en
20 ml de tampón A.
A continuación, esta solución se sometió a
cromatografía de filtración en gel haciéndola pasar a través de una
columna de Ultrogel (marca registrada) AcA34 (IBF) previamente
equilibrada con el tampón A para dar una fracción activa.
La fracción así obtenida se dializó frente al
tampón B (pH 6,5), es decir, tampón TRIS-HCl que
contenía ditiotreitol 1 mM, etilendiaminotetraacetato de disodio 1
mM, glicerol al 5% (p/v) y cloruro de sodio 1 mM.
La solución resultante se adsorbió en una columna
de S-Sepharose FF (Pharmacia Biotech) previamente
equilibrada con el tampón B, y la enzima se eluyó en un gradiente
lineal de NaCl 1 - 100 mM para dar una fracción activa.
La fracción activa así obtenida se dializó frente
al tampón C (una solución a pH 8,0 con la misma composición que el
tampón B), después se adsorbió en una columna de HPLC de
intercambio iónico (gel TSK Super Q-5PW, disponible
de Tosoh Corporation) previamente equilibrada con el tampón C, y la
enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1 - 100 mM para dar
una fracción activa.
La fracción activa así obtenida pudo purificarse
satisfactoriamente haciéndola pasar a través de una columna de HPLC
de filtración en gel (gel TSK G3000SWXL, disponible de Tosoh
Corporation) previamente equilibrada con el tampón A.
La fracción tras esta filtración en gel se
analizó mediante SDS-PAGE (Laemmli, U.K.: Nature,
227, 680, (1970). El resultado indicó que el peso molecular
de la enzima purificada era de aproximadamente 40.000.
El pH óptimo y la temperatura óptima de la
presente enzima fueron pH 7 - 8 y 35 - 50ºC, respectivamente. La
presente enzima mantuvo el 80% o más de la actividad original
incluso tras el tratamiento térmico a 50ºC durante 30 minutos.
Se añadieron los órganos luminosos de 200
luciérnagas (Luciola cruciata) (adquiridos de Seibu
Department Store) a 15 ml de tampón A, después se disgregaron con
Hiscotoron^{MR} (NITI-ON Medical y Physical
Instrument Manufacturing), y se centrifugaron a 12.000 r.p.m.
durante 20 minutos para dar 14 ml de sobrenadante como una enzima
bruta.
Esta solución de enzima bruta se precipitó con
sulfato de amonio y los precipitados que se produjeron entre el 30
y el 60% de saturación con sulfato de amonio, se separaron mediante
centrifugación a 12.000 r.p.m. durante 10 minutos y después se
disolvieron en 20 ml de tampón A.
Esta solución se sometió a filtración en gel a
través de Ultrogel (marca registrada) AcA34 (IBF) previamente
equilibrada con tampón A para dar una fracción activa.
La solución así obtenida se dializó frente al
tampón B (pH 6,5), y después se adsorbió en una columna de
S-Sepharose FF (Pharmacia Biotech) previamente equilibrada con tampón B, y la enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1 - 100 mM para dar una fracción activa.
S-Sepharose FF (Pharmacia Biotech) previamente equilibrada con tampón B, y la enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1 - 100 mM para dar una fracción activa.
La fracción activa así obtenida se dializó frente
al tampón C (una solución a pH 8,0 con la misma composición que el
tampón B), después se adsorbió en una columna de HPLC de
intercambio iónico (gel TSK Super Q-5PW, disponible
de Tosoh Corporation) previamente equilibrada con tampón C, y la
enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl
1 - 100 mM para dar una fracción activa.
1 - 100 mM para dar una fracción activa.
La fracción activa así obtenida pudo purificarse
satisfactoriamente haciéndola pasar a través de una columna de HPLC
de filtración en gel (gel TSK G3000SWXL, disponible de Tosoh
Corporation) previamente equilibrada con tampón A.
El pH óptimo y la temperatura óptima de la
presente enzima fueron pH 7 - 8 y 35 - 50ºC, respectivamente. La
presente enzima mantuvo el 80% o más de la actividad original
incluso tras el tratamiento térmico a 50ºC durante 30 minutos.
Se añadieron los órganos luminosos de 300
luciérnagas (Luciola lateralis) (adquiridos de Seibu
Department Store) a 15 ml de tampón A, después se disgregaron con
Hiscotoron^{MR} (NITI-ON Medical y Physical
Instrument Manufacturing), y se centrifugaron a 12.000 r.p.m.
durante 20 minutos para dar 13 ml de sobrenadante como una enzima
bruta.
Esta solución de enzima bruta pudo purificarse
satisfactoriamente con los mismos procedimientos que en el ejemplo
2.
El pH óptimo y la temperatura óptima de la
presente enzima fueron pH 8 - 9 y 50 - 70ºC, respectivamente. La
presente enzima mantuvo el 80% o más de la actividad incluso tras el
tratamiento térmico a 50ºC durante 30 minutos, o el 60% o más de la
actividad incluso tras el tratamiento térmico a 60ºC durante 30
minutos.
Se examinó el efecto sobre la reacción de
luciferina/luciferasa de la enzima purificada en el ejemplo 1. Se
añadieron 10 \mul de la enzima purificada en el ejemplo 1 a una
mezcla de 10 \mul de luciferasa de luciérnaga americana 0,5
\mug/ml, 40 \mul de luciferina 1 mM, 40 \mul de
D-cisteína 10 mM y 300 \mul de un tampón de
medición de la actividad (glicilglicina 25 mM más sulfato de
magnesio 5,4 mM (pH 7,8)). Se introdujeron 100 \mul de ATP 10 mM a
esta disolución y se midió la intensidad de la luminiscencia que se
producía a intervalos de 10 segundos durante 1 minuto. Los
resultados se muestran en la tabla siguiente. Como control se
utilizaron 10 \mul del tampón de medición de la actividad en
lugar de la enzima. Como resultado, se encontró que la adición de
la presente enzima mejora la durabilidad de la luminiscencia.
| Tiempo (segundos) | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| Enzima añadida (conteo x 10^{3}) | 7,9 | 6,5 | 6,5 | 6,5 | 6,0 | 6,0 |
| Control (conteo x 10^{3}) | 5,1 | 3,7 | 3,2 | 3,0 | 3,0 | 2,8 |
| * Conteo = número de fotones regenerados |
Además pudo confirmarse el mismo efecto cuando se
utilizó la enzima purificada en el ejemplo 2 y 3.
Se preparó una mezcla de sustrato añadiendo 1 ml
de D-cisteína 0,01 mM y 0,5 ml de oxiluciferina 1
mM a 8,5 ml del tampón de medición de la actividad (glicilglicina 25
mM más sulfato de magnesio 5,4 mM (pH 7,8)).
Se añadieron 10 \mul de la muestra de medición
a 100 \mul de la mezcla anterior y se hicieron reaccionar a 37ºC
durante 4 horas. Esta solución de reacción, 10 \mul, se añadió a
200 \mul de tampón de medición de la actividad, seguido de la
introducción de 100 \mul de la mezcla de ATP / luciferasa (es
decir, luciferasa 0,5 mg/ml en ATP 10 mM) y se acumuló la
luminiscencia que se produjo durante 5 segundos.
Claims (5)
1. Enzima derivada de coleópteros, con un peso
molecular de aproximadamente 40.000, tal como se determina por
SDS-PAGE, y que regenera luciferina a partir de
oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la que
el pH óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera
luciferina son pH 7 - 8 y de 35 a 50ºC, respectivamente.
2. Enzima derivada de coleópteros, con un peso
molecular de aproximadamente 40.000, tal como se determina por
SDS-PAGE, y que regenera luciferina a partir de
oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la que
el pH óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera
luciferina son pH 8 - 9 y de 50 a 70ºC, respectivamente
3. Enzima según la reivindicación 1 ó 2, que se
deriva de una luciérnaga.
4. Enzima según la reivindicación 3, que se
deriva de Luciola cruciata o Luciola lateralis o
Photinus pyralis.
5. Uso de una enzima según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en un sistema de reacción
luciferina/luciferasa.
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