ES2244145T3 - Vectores de aporte de genes provistos de un tropismo para las celulas de los musculos lisos y/o las celulas endoteliales. - Google Patents
Vectores de aporte de genes provistos de un tropismo para las celulas de los musculos lisos y/o las celulas endoteliales.Info
- Publication number
- ES2244145T3 ES2244145T3 ES99203878T ES99203878T ES2244145T3 ES 2244145 T3 ES2244145 T3 ES 2244145T3 ES 99203878 T ES99203878 T ES 99203878T ES 99203878 T ES99203878 T ES 99203878T ES 2244145 T3 ES2244145 T3 ES 2244145T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- adenovirus
- cells
- fiber
- protein
- subgroup
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 105
- 230000010415 tropism Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 228
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 184
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 title abstract description 29
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 title description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 214
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 55
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 claims abstract description 33
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 241000701190 Human adenovirus 11 Species 0.000 claims abstract 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 115
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 84
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 77
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 45
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 23
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 2
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 101001046870 Homo sapiens Hypoxia-inducible factor 1-alpha Proteins 0.000 claims 1
- 102100022875 Hypoxia-inducible factor 1-alpha Human genes 0.000 claims 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 claims 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 claims 1
- 102000012335 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 100
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 50
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 23
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 19
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 19
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 17
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 17
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 13
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 11
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 101000817629 Homo sapiens Dymeclin Proteins 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 9
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 5
- 101150076401 16 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 2
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 2
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000012936 Angiostatins Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710094396 Hexon protein Proteins 0.000 description 1
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 description 1
- 241001428587 Human adenovirus 16 Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 1
- 102000008052 Nitric Oxide Synthase Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010075520 Nitric Oxide Synthase Type III Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000005228 Pericardial Effusion Diseases 0.000 description 1
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 1
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 1
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000003090 iliac artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 210000001349 mammary artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000004912 pericardial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 206010038464 renal hypertension Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6009—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses dsDNA viruses
- C12N2810/6018—Adenoviridae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un vector adenoviral recombinante de un serotipo del subgrupo C, que se ha proporcionado con al menos un tropismo de tejido para células de músculo liso y/o células endoteliales y que se ha privado de al menos un tropismo de tejido para células hepáticas, donde dicho vector adenoviral comprende una cápsida que comprende un fragmento determinante de tropismo de una proteína de fibra de un adenovirus de un serotipo del subgrupo B, y donde dicho serotipo de adenovirus del subgrupo B se selecciona entre el grupo compuesto por; adenovirus 11, adenovirus 16, adenovirus 35 y adenovirus 51.
Description
Vectores de aporte de genes provistos de un
tropismo para las células de los músculos lisos y/o las células
endoteliales.
La invención se refiere al campo de la genética
molecular y la médicina. En particular la presente invención se
refiere al campo de la terapia génica, más en particular a la
terapia génica utilizando adenovirus.
En terapia génica, la información genética es
usualmente distribuida a una célula huésped ya sea con el fin de
corregir (suplementar) una deficiencia genética en dicha célula, o
para inhibir una función no deseada en la célula, o para eliminar la
célula huésped. Por supuesto, se puede intentar también proporcionar
información genética a la célula huésped, con una función deseada,
por ejemplo, suministrar una proteína secretada para tratar otras
células del huésped, etc.
Han sido desarrollados muchos métodos diferentes
para introducir nueva información genética a las células. Aunque
muchos sistemas diferentes pueden funcionar sobre líneas celulares
cultivadas in vitro, únicamente el grupo de métodos de
distribución de genes, mediados por vectores virales, parece ser
capaz de cumplir la eficiencia requerida de la transferencia de
genes in vivo. De este modo, para fines de terapia génica se
dirige la mayor parte de la atención hacia el desarrollo de
vectores virales adecuados. Hoy en día, la mayor parte de la
atención para el desarrollo de vectores virales adecuados está
dirigida hacia aquellos vectores que están basados en adenovirus.
Estos vectores adenovirales pueden distribuir información genética
extraña de manera muy eficiente a las células objetivo in
vivo. Además, la obtención de grandes cantidades de vectores
adenovirales no es un problema para la mayoría de los tipos
adenovirales. Los vectores adenovirales son relativamente fáciles de
concentrar y purificar. Además, los estudios en pruebas clínicas han
proporcionado información valiosa sobre el uso de estos vectores en
pacientes.
Existe un gran número de razones para utilizar
vectores adenovirales para la distribución de ácido nucleico a las
células objetivo en protocolos de terapia génica. No obstante,
algunas características de los actuales vectores limitan su uso en
aplicaciones específicas. Por ejemplo, las células endoteliales y
las células del músculo liso no son fácilmente transducidas mediante
la generación actual de vectores adenovirales. Para muchas
aplicaciones de terapia génica, tales como aplicaciones en el área
cardiovascular, preferentemente estos tipos de células deben ser
genéticamente modificadas. Por otra parte, en algunas aplicaciones,
incluso la muy buena capacidad de distribución in vivo de los
vectores adenovirales no es suficiente, y se requieren eficiencias
de transferencia más altas. Este es el caso, por ejemplo, cuando la
mayoría de las células de un tejido objetivo necesitan ser
transducidas.
La presente invención fue realizada en el curso
de la manipulación de vectores adenovirales. En la siguiente sección
se da por lo tanto una breve introducción a los adenovirus.
Los adenovirus contienen una molécula de ADN 25
lineal de doble hebra de aproximadamente 36.000 pares de bases. Ésta
contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR), idénticas de
aproximadamente 90 a 140 pares de bases con la longitud exacta
dependiendo del serotipo. Los orígenes virales de la replicación
están dentro de las ITRs exactamente en los extremos del genoma. Las
unidades de transcripción están divididas en reqiones temprana y
tardía. Poco después de la infección, las proteínas E1A y E1B son
expresadas y funcionan en la transactivación de los genes celulares
y adenovirales. Las regiones tempranas E2A y E2B codifican para las
proteínas (proteína de enlace al ADN, proteína
pre-terminal y polimerasa) requeridas para la
replicación del genoma adenoviral (revisado en van der Vliet, 1995)
. La región temprana E4 codifica para varias proteínas con funciones
pleiotrópicas, por ejemplo transactivación del promotor temprano E2,
facilitando el transporte y la acumulación de ARNms virales en la
fase tardía de la infección, e incrementando la estabilidad nuclear
de los pre-ARNms tardíos, mayores (revisado en
Leppard, 1997). La región temprana 3 codifica para proteínas que
están involucradas en la modulación de la respuesta inmune del
huésped (Wold y colaboradores, 1995). La región tardía es transcrita
a partir de un promotor simple (promotor tardío mayor) y es activada
al inicio de la replicación del ADN. El empalme complejo y los
mecanismos de poliadenilación dan origen a más de 12 especies de ARN
que codifican para las proteínas del núcleo, las proteínas de
cápsida (pentón, hexón, fibra y proteínas asociadas), la proteasa
viral y las proteínas necesarias para el ensamblaje de la cápsida y
la parada o interrupción de la traducción de la proteína del huésped
(Imperiale, M.J., Akusjnarvi, G. y Leppard, K.N. (1995)
Post-transcriptional control of adenovirus gene
expression. En: The molecular repertoire of adenoviruses I.
P139-171. W. Doerfler y P. Bohm (eds),
Springer-verlag Berlin Heidelberg).
La interacción del virus con la célula huésped ha
sido investigada principalmente con los virus Ad2 y Ad5, serotipo C.
El enlace ocurre por medio de la interacción de la región de perilla
o protuberancia de la fibra que se proyecta hacia afuera, con un
receptor celular. El receptor para Ad2 y Ad5 y probablemente más
adenovirus es conocido como el "Coxsackievirus y Receptor
Adenoviral" o la proteína CAR (Bergelson y colaboradores, 1997).
La internalización o introducción es mediada a través de la
interacción de la secuencia RGD presente en la base de pentón con
las integrinas celulares (Wickham y colaboradores, 1993) . Esto no
puede ser cierto para todos los serotipos, por ejemplo los serotipos
40 y 41 no contienen una secuencia RGD en su secuencia de base de
pentón (Kidd y colaboradores, 1993).
El paso inicial para la infección exitosa es el
enlace del adenovirus a su célula blanco u objetivo, un proceso
mediado a través de la proteína de fibra. La proteína de fibra tiene
una estructura trimérica (Stouten y colaboradores, 1992) con
diferentes longitudes dependiendo del serotipo del virus (Signas y
colaboradores, 1985; Kidd y colaboradores, 1993). Diferentes
serotipos tienen polipéptidos con extremos N y C estructuralmente
similares, pero diferentes regiones de tallo intermedio. Los
primeros 30 aminoácidos en el extremo N están involucrados en el
anclaje de la fibra a la base pentón (Chroboczek y colaboradores,
1995), especialmente la región FNPVVP conservada en la cola (Arnberg
y colaboradores, 1997). El extremo C, o perilla o protuberancia, es
responsable de la interacción inicial con el receptor adenoviral
celular. Después de este enlace inicial, el enlace secundario entre
la base pentón de cápsida y las integrinas de la superficie celular
conduce a la introducción de las partículas virales en pocillos
recubiertos, y la endositosis (Morgan y colaboradores, 1969;
Svensson y Persson, 1984; Varga y colaboradores, 1991; Greber y
colaboradores, 1993; Wickham y colaboradores, 1993). Las integrinas
son \alpha,\beta-heterodímeros de los cuales al
menos 14 \alpha-subunidades y 8
\beta-subunidades han sido identificadas (Hynes,
1992). El arreglo de las integrinas expresadas en las células es
complejo y variará entre los tipos celulares y el ambiente celular.
Aunque la perilla o protuberancia contiene algunas regiones
conservadas, entre los serotipos, las proteínas de perilla muestran
un alto grado de variabilidad, indicando que existen diferentes
receptores adenovirales.
A la fecha, han sido propuestos seis diferentes
subgrupos de los adenovirus humanos los cuales en total abarcan
aproximadamente 50 distintos serotipos de adenovirus. Además de
estos adenovirus humanos, han sido identificados muchos adenovirus
animales (ver por ejemplo Ishibashi y Yasue, 1984). Un serotipo es
definido con base en su distintividad inmunológica, como es
determinada mediante neutralización cuantitativa con antisuero
animal(caballo, conejo). Si la neutralización muestra un
cierto grado de reacción cruzada entre dos virus, se asume la
distintividad de serotipos si A) las hemaglutininas no están
relacionadas, como se muestra por la falta de reacción cruzada sobre
la inhibición de la hemaglutinación, o B) existen diferencias
biofísicas/bioquímicas sustanciales en el ADN (Francki y
colaboradores, 1991). Los serotipos identificados últimamente
(42-49), fueron aislados por primera vez a partir de
pacientes infectados con el VIH (Hierholzer y colaboradores, 1988;
Schnurr y colaboradores, 1993). por razones no bien comprendidas, la
mayoría de tales pacientes inmunocomprometidos esparcieron
adenovirus que nunca fueron aislados de los individuos
inmunocompetentes (Hierholzer y colaboradores, 1988, 1992; Khoo y
colaboradores, 1995).
Además de las diferencias hacia la sensibilidad
contra anticuerpos neutralizadores de diferentes serotipos de
adenovirus, los adenovirus en el subgrupo C tales como Ad2 y Ad5 se
enlazan a diferentes receptores en comparación a los adenovirus
provenientes del subgrupo B tales como Ad3 y Ad7 (Defer y
colaboradores, 1990; Gall y colaboradores, 1996). De igual modo, se
demostró que la especificidad del receptor podría ser alterada
mediante el intercambio de la proteína de perilla Ad3 con la
proteína de perilla Ad5, y viceversa (Krasnykh y colaboradores,
1996; Stevenson y colaboradores, 1995, 1997). Los serotipos 2, 4, 5
y 7 tienen todos una afiliación natural hacia el epitelio pulmonar y
otros tejidos respiratorios. En contraste, los serotipos 40 y 41
tienen una afiliación natural hacia el tracto gastrointestinal.
Estos serotipos difieren en al menos las proteínas de cápsida
(pentón-base, hexón), proteínas responsables para el
enlace a la célula (proteína de fibra), y proteínas involucradas en
la replicación del adenovirus. Se desconoce a qué grado las
proteínas de cápsida determinan las diferencias en el tropismo
encontrado entre los serotipos. Puede ser muy bien que los
mecanismos de post-infección determinen la
especificidad de tipo celular de los adenovirus. Se ha mostrado que
los adenovirus provenientes de los serotipos A (Ad12 y Ad31), C (Ad2
y Ad5), D (Ad9 y Ad15), E (Ad4) y F(Ad41) son todos capaces
de enlazarse a la proteína CAR soluble, marcada (SCAR) cuando son
inmovilizados sobre microcelulosa. Además, el enlace de los
adenovirus provenientes de estos serotipos a las células Ramos, que
expresan altos niveles de CAR pero carecen de integrinas (Roelvink y
colaboradores, 1996), podría ser eficientemente bloqueado por la
adición de sCAR a los virus antes de la infección (Roelvink y
colaboradores, 1998). Sin embargo, el hecho de que (al menos
algunos) miembros de estos subgrupos sean capaces de enlazarse a CAR
no excluye que estos virus tengan diferentes eficiencias de
infección en diversos tipos celulares. por ejemplo los serotipos del
subgrupo D tienen tallos o ejes de fibra relativamente cortos en
comparación a los virus del subgrupo A y C. Se ha postulado que el
tropismo de los virus del subgrupo D es a un grado mayor determinado
por la base pentón que se enlaza a las integrinas (Roelvink y
colaboradores, 1996; Roelvink y colaboradores, 1998). Otro ejemplo
más es provisto por Zabner y colaboradores, 1998 quienes han probado
14 diferentes serotipos sobre la infección de epitelios ciliados
humanos de las vías respiratorias (CAE) y encontraron que el
serotipo 17 (subgrupo D) estuvo enlazado e internalizado o
introducido más eficienteniente que todos las otros virus,
incluyendo otros miembros del subgrupo D. Experimentos similares
utilizando serotipos provenientes del subgrupo A-F
en células de rata fetal primarias, mostraron que los adenovirus
provenientes del subgrupo A y B fueron ineficientes, mientras que
los virus del subgrupo D fueron más eficientes (Law y colaboradores,
1998). También en este caso, los virus dentro de un subgrupo
mostraron diferentes eficiencias. La importancia del enlace de las
fibras para la infección mejorada de Ad17 en CAE fue mostrada por
Armentano y colaboradores (WO 98/22609) quien realizó un virus LacZ
Ad2 recombinante con un gen de fibra proveniente de Adl7 y mostró
que los virus quiméricos infectaron CAE de manera más eficiente que
los virus LacZ Ad2 con fibras Ad2.
De este modo, a pesar de su habilidad comparada
para enlazarse a CAR, las diferencias en la longitud de la fibra, la
secuencia de perilla y otras proteínas de cápsida, por ejemplo, la
base de pentón de los diferentes serotipos, puede determinar la
eficiencia mediante la cual un adenovirus infecta una cierta célula
objetivo. De interés a este respecto es la habilidad de las fibras
Ad2 y Ad5 pero no de las fibras Ad3 para enlazarse a la fibronectina
III y los péptidos derivados de NHC clase 1 \alpha2. Esto sugiere
que los adenovirus son capaces de utilizar receptores celulares
diferentes de CAR (Hong y colaboradores, 1997). Los serotipos 40 y
41 (subgrupo F) se sabe que poseen dos proteínas de fibra que
difieren en la longitud del eje principal. La fibra 41L de eje o
tallo largo se muestra que se enlaza a CAR, mientras que 41S de eje
o tallo corto no es capaz de enlazarse a CAR (Roelvink y
colaboradores, 1998). El receptor para la fibra corta no es
conocido.
La mayoría de los vectores adenovirales para la
distribución de genes actualmente utilizados en terapia génica, son
derivados de los adenovirus Ad2 o Ad5, serotipo C. Los vectores
tienen una supresión en la región E1, donde puede ser introducida
nueva información genética. La supresión E1 hace defectuosa la
replicación del virus recombinante. Se ha demostrado extensamente
que los adenovirus recombinantes, en particular el serotipo 5 son
adecuados para la transferencia eficiente de genes in vivo
hacia el hígado, el epitelio de las vías respiratorias y los tumores
sólidos en modelos animales y xenoinjertos humanos en ratones
inmunodeficientes (Bout 1996, 1997, Blaese y colaboradores,
1995).
Los vectores de transferencia de genes derivados
de adenovirus (vectores adenovirales) tienen un número de
características que los hace particularmente útiles para la
transferencia de genes:
- 1)
- la biología de los adenovirus está bien caracterizada,
- 2)
- el adenovirus no está asociado con patología humana severa,
- 3)
- el virus es extremadamente eficiente en la introducción de su ADN dentro de la célula huésped,
- 4)
- el virus puede infectar una variedad amplia de células y tiene una amplia gama o intervalo de huéspedes,
- 5)
- el virus puede ser producido a títulos altos en cantidades grandes,
- 6)
- y el virus puede ser hecho defectuoso en la replicación, mediante supresión de la región temprana 1 (E1) del genoma viral (Brody y Crystal, 1994).
No obstante, existe todavía un número de
inconvenientes asociados con el uso de los vectores
adenovirales:
1) los adenovirus, especialmente los serotipos
Ad2 y Ad5 bien investigados, usualmente promueven una respuesta
inmune por el huésped dentro del cual éstos son introducidos,
2) actualmente no es factible dirigir el virus
hacia ciertas células y tejidos,
3) be replicación y otras funciones de los
adenovirus no son siempre muy bien adecuadas para las células, las
cuales van a ser provistas con el material genético adicional,
4) los serotipos Ad2 o Ad5, no son idealmente
adecuados para la distribución de material genético adicional a los
órganos diferentes del hígado. El hígado puede ser particularmente
bien transducido con vectores derivados de Ad2 o Ad5. La
distribución de tales vectores vía la corriente sanguínea conduce a
una distribución significativa de los vectores hacia las células del
hígado. En terapias donde otros tipos celulares diferentes de
células hepáticas necesitan ser transducidas, deben ser aplicados
algunos medios de exclusión del hígado, para prevenir la captación
del vector por estas células. Los métodos actuales confían en la
separación física del vector de las células hepáticas, la mayoría de
estos métodos confían en la localización del vector y/o del órgano
objetivo por medio de cirugía, angioplastia de globo o inyección
directa dentro de un órgano vía, por ejemplo, agujas. La exclusión
hepática está también siendo practicada a través de la distribución
del vector a los compartimientos en el cuerpo que están
esencialmente aislados de la corriente sanguínea, con lo cual se
previene el transporte del vector hacia el hígado. Aunque éstos
métodos principalmente tienen éxito en evitar la distribución burda
del vector hacía el hígado, la mayoría de los métodos son crudos y
todavía tienen fugas considerables y/o tienen pobres características
de penetración al tejido objetivo. En algunos casos, la distribución
accidental del vector a las células hepáticas puede ser tóxica para
el paciente. Por ejemplo, la distribución de un gen de la
timidina-quinasa (TK) del virus del herpes simple
(HSV) para la muerte subsecuente de las células cancerosas en
división, a través de la administración de ganciclovir, es muy
peligrosa cuando también son transducidas una cantidad significativa
de células hepáticas por el vector. La distribución significativa y
la expresión subsecuente del gen HSV-TK hacia las
células del hígado está asociada con toxicidad severa. De este modo
existe una necesidad discreta para un vector inherentemente seguro
provisto con la propiedad de una eficiencia de transducción reducida
de las células hepáticas.
Tabla 1: Los oligonucleótidos y oligonucleótidos
degenerados utilizados para la amplificación del ADN que codifica
para las proteínas de fibra derivadas de serotipos de adenovirus
alternativos. (Las letras negritas representan el sitio de
restricción NdeI (A-E), el sitio de restricción NsiI
(1-6, 8) a el sitio de restricción PacI (7).
Tabla II: Biodistribución del adenovirus
quimérico después de la inyección intravenosa en la vena de la cola.
Los valores representan la actividad de luciferasa/\mug de
proteína total. Todos los valores debajo de 200 unidades luminosas
relativas/\mug de proteínas son considerados como antecedentes. ND
= no determinado.
Tabla III: Expresión de CAR y de integrinas sobre
la superficie celular de células endoteliales y células del músculo
liso. 70%: células cosechadas para el análisis FACS a una densidad
celular de 70% de confluencia. 100%: células cosechadas para el
análisis FACS a una densidad celular de 100% de confluencia. Células
PER.C6 fueron tomadas como un control para la tinción del
anticuerpo. Los valores representan los porcentajes de las células
que expresan CAR a cualquiera de las integrinas a niveles por arriba
del antecedente. Como control antecedente, se incubaron HUVECS o
HUVsmc únicamente con el anticuerpo secundario, marcado con PE, de
rata, anti IgGi de ratón.
Tabla IV: Determinación de la expresión del
transgen 20 (actividad de luciferasa) por \mug de proteína celular
total después de la infección de las células A549.
Figura 1: Dibujo esquemático de la construcción
pBr/Ad.Bam-rITR.
Figura 2: Dibujo esquemático de la estrategia
utilizada para suprimir el gen de fibra de la construcción
pBr/Ad.Bam-rITR.
Figura 3: Dibujo esquemático de la construcción
pBr/Ad.BamR\Deltafib.
Figura 4: Secuencias de las fibras quiméricas
Ad5/12, Ad5/16, Ad5/28 y Ad5/40-L.
Figura 5: Dibujo esquemático de la construcción
pClipsal-Luc.
Figura 6: Dibujo esquemático del método para
generar adenovirus quiméricos utilizando tres fragmentos que se
traslapan. Las regiones temprana (E) y tardía (L) son indicadas
también. L5 es la secuencia de codificación de la fibra.
Figura 7: A) Infección de células HUVEC
utilizando diferentes cantidades de partículas virales por célula y
diferentes adenovirus quiméricos de fibra. Concentración del virus:
10.000 vp/célula (= barra blanca), 5.000 vp/célula (= barra gris),
2.500 vp/célula (= barra negra), 1.000 vp/célula (barra gris clara),
250 y 50 vp/célula sin actividad detectable de luciferasa por arriba
del antecedente. La actividad de luciferasa es expresada en unidades
de luz relativas (RLU) por microgramo de proteína celular. B)
Infección de células HUVEC utilizando diferentes concentraciones de
células (22,500, 45,000, 90,000, ó 135,000 células sembradas por
pocillo) y ya sea el adenovirus serotipo 5 (barra negra) o el
adenovirus quimérico de fibra 16 (barra blanca). La actividad de
luciferasa es expresada en unidades de luz relativas (RLU) por
microgramo de proteína celular. C) Análisis citométrico de flujo
sobre EC de aorta humana transducida con 500 (barra negra) o 5,000
(barra gris) partículas virales por célula de Ad5, o el virus
quimérico de fibra 16 (Fib16). Se Utilizaron células no infectadas
para establecer el antecedente al 1%, y una fluorescencia media de
5.4. El desplazamiento máxima en la fluorescencia media que puede
ser observada sobre el citómetro de flujo es 9,999. Esto último
indica que a 5,000 vp/célula, ambos Ad5 y Fibl6 están fuera de la
escala de sensibilidad del citómetro de flujo.
Figura 8: A) Infección de las células HUVsmc
utilizando diferentes cantidades de partículas virales por célula y
diferentes adenovirus basados en Ad5 mutante, de fibra.
Concentración del virus: 5,000 vp/célula (= barra blanca), 2,500
vp/célula (= barra gris), 1,250 vp/célula (= barra gris obscura),
250 vp/célula (= barra negra), o 50 vp/célula (= barra gris claro).
La actividad de luciferasa es expresada como unidades de luz
relativa (RLU) por microgramo de proteína celular. B) Infección de
células HUVsmc utilizando diferentes concentraciones de células
(10,000, 20,000, 40,000, 60,000 ó 80,000 células por pocillo) y ya
sea adenovirus serotipo 5 (barras blancas) o el adenovirus quimérico
de la fibra 16 barras negras). Se observa una meseta después de la
infección con el adenovirus quimérico de la fibra 16, debido al
hecho de que la expresión del transgen es más alta que el intervalo
de sensibilidad del bioluminómetro utilizado. C) SMC de vena
umbilical humana transducido con 500 vp/célula (barra negra) o 5,000
vp/célula (barra gris) utilizando ya sea Ad5 o el mutante de la
fibra 16 (Fibl6). Se utilizaron células no transducidas para ajustar
una fluorescencia media antecedente de aproximadamente 1. Se muestra
la fluorescencia media de la expresión de GFP como es medida
mediante citometría de flujo. D) las HUVsmc fueron infectadas con
312 (barra gris clara), 625 (barra gris), 1,250 (barra negra), 2,500
(barra gris oscuro), 5,000 (barra gris claro) o 10,000 (barra
blanca) partículas virales por célula ya sea del virus quimérico de
fibra 11, 16, 35 ó 51. La expresión del transgen de luciferasa
expresado como unidades de luz relativa (RLU) por microgramo de
proteína se midió 48 horas después de la exposición al virus. E)
Fotografías macroscópicas de tinción de LacZ sobre muestras de
safenas. LacZ dirigida al núcleo (ntLacZ) produce un color azul
oscuro el cual parece negro o gris oscuro en impresiones no de
color. F) Fotografías macroscópicas de tinción con Lacz sobre
muestras de pericardio. LacZ dirigido al núcleo (ntLacZ) da un color
azul oscuro el cual parece negro en impresiones no de color. G)
Fotografías macroscópicas de la tinción con LacZ sobre muestras de
arteria coronaria derecha. LacZ dirigido al núcleo (ntLacZ), da un
color azul oscuro que parece negro en las impresiones no de color.
H) Tinción con LacZ sobre muestras de arteria izquierda descendente
(LAD). LacZ dirigido al núcleo (ntLacZ) da un color azul oscuro el
cual parece negro en impresiones no de color.
Figura 9: Secuencias que incluyen el gen que
codifica para la proteína de fibra 16 de adenovirus, como son
publicadas en Genbank y secuencias que incluyen un gen que codifica
para una fibra proveniente de una variante del adenovirus 16, como
es aislada en la presente invención, en donde las secuencias de la
proteína de fibra son provenientes del sitio NdeI. Figure 9A:
Comparación de la secuencia nucleotídica. Figura 9B: Comparación de
los aminoácidos.
La presente invención proporciona los métodos,
compuestos y medicinas para terapia génica. La presente invención es
particularmente útil en aplicaciones de terapia génica donde las
células endoteliales y/o las células del músculo liso forman el tipo
de célula objetivo. La presente invención se refiere a los vehículos
de distribución de genes provistos con un tropismo de tejido para al
menos células endoteliales y/o células del músculo liso. La presente
invención se refiere además a los vehículos de distribución de genes
que han sido privados de un tropismo de tejidos para células
hepáticas.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar materiales y métodos pare superar las limitaciones de
los vectores adenovirales mencionados anteriormente. En un sentido
amplio, la invención proporciona nuevos adenovirus, derivados
totalmente a en parte de diferentes serotipos provenientes de Ad5.
Los genes específicos de serotipos con características preferidas
pueden ser combinados en un vector quimérico para dar origen a un
vector que es mejor adecuado para aplicaciones específicas. Las
características preferidas incluyen, pero no están limitadas a,
infección mejorada de una célula objetivo especifica, infección
reducida de células no objetivo, estabilidad mejorada de los virus,
captación reducida en células presentadoras de antígeno (APC), o
captación incrementada en APC, toxicidad reducida a las células
objetivo, neutralización reducida en humanos o en animales,
respuesta CTL reducida o incrementada en humanos o en animales,
expresión de transgen mejor y/o prolongada, capacidad incrementada
de penetración en los tejidos, rendimientos mejorados en líneas
celulares de empaquetamiento, etc.
Un aspecto de la presente invención facilita la
combinación de la baja inmunogenicidad de algunos adenovirus con las
características de otros adenovirus que permiten la terapia génica
eficiente. Tales características pueden ser una alta especificidad
para ciertas células huésped, una buena maquinara de replicación
para ciertas células, una alta tasa o proporción de infección en
ciertas células huésped, baja eficiencia de infección en células no
objetivo, alta a baja eficiencia de infección APC, etc. La invención
proporciona de este modo los adenovirus quiméricos que tienen las
propiedades útiles de al menos dos adenovirus de diferentes
serotipos.
Típicamente, dos o más requerimientos de la lista
no exhaustiva anterior son requeridos pare obtener un adenovirus
capaz de transferir eficientemente material genético a una célula
huésped. Por lo tanto, la presente invención proporciona vectores
derivados de adenovirus, los cuales pueden ser utilizados como
casete para insertar diferentes genes adenovirales provenientes de
diferentes serotipos adenovirales, en los sitios requeridos. De esta
manera se puede obtener un vector capaz de producir un adenovirus
quimérico, con lo cual por supuesto también puede ser insertado un
gen de interés (por ejemplo en el sitio de E1 del adenovirus
original). De esta manera, el adenovirus quimérico que va a ser
producido puede ser adaptado a los requerimientos y a las
necesidades de ciertos huéspedes en necesidad de terapia génica para
ciertos desórdenes. Para hacer posible la producción de este virus,
una célula de empaquetamiento será en general necesaria con el fin
de producir cantidad suficiente de adenovirus quiméricos
seguros.
En uno de sus aspectos la presente invención
proporciona vectores adenovirales que comprenden al menos un
fragmento de una proteína de fibra de un adenovirus proveniente del
subgrupo B. La proteína de fibra puede ser la proteína de fibra
nativa del vector adenoviral o puede ser derivada de un serotipo
diferente del serotipo en que está basado el vector adenoviral. En
el último caso el vector adenoviral de acuerdo a la invención es un
adenovirus quimérico que muestra al menos un fragmento de la
proteína de fibra derivada del adenovirus del subgrupo B, cuyo
fragmento comprende al menos la secuencia de enlace al receptor.
Típicamente, tal virus será producido utilizando un vector
(típicamente un plásmido, un cósmido un vector baculoviral). Tales
vectores son también objetivo de la presente invención. Un vector
preferido es un vector que puede ser utilizado para elaborar un
virus recombinante quimérico, específicamente adaptado al huésped
que va a ser tratado, y al desorden que va a ser tratado.
La presente invención también proporciona un
adenovirus quimérico basado en adenovirus tipo 5 pero que tiene al
menos Un fragmento de la secuencia de fibra proveniente del
adenovirus tipo 16, mediante lo cual el fragmento de la fibra del
Ad16 comprende el fragmento de la proteína de fibra que está
involucrada en el enlace de una célula huésped. La presente
invención también proporciona vectores adenovirales quiméricos que
muestran infección mejorada en comparación a adenovirus provenientes
de otros subgrupos en células huésped específicas por ejemplo, pero
no limitadas a, células endoteliales y células del músculo liso de
origen humano o animal. Una característica importante de la presente
invención es los medios para producir los virus quiméricos.
Típicamente, se desea que un lote de adenovirus sea administrado a
la célula huésped, el cual contiene el adenovirus competente para la
replicación. En general, por lo tanto, se desea omitir un número de
genes (pero al menos uno) del genoma adenoviral sobre el vector que
codifica para el virus quimérico, y suministrar estos genes en el
genoma de la célula en la cual es llevado el vector para producir
adenovirus quiméricos. Tal célula es usualmente denominada una
célula de empaquetamiento. La invención también proporciona de este
modo una célula de empaquetamiento para producir un adenovirus
quimérico de acuerdo a la invención, que comprende en posición todo
trans los elementos necesarios para la producción del adenovirus, no
presentes en el vector adenoviral de acuerdo a la invención.
Típicamente, el vector y la célula de empaquetamiento tienen que ser
adaptados uno al otro, ya que todos ellos tienen los e elementos
necesarios, pero éstos no tienen elementos de traslape que conduzcan
a vectores de replicación competentes mediante recombinación. De
este modo, la invención también proporciona un equipo de partes que
comprenden una célula de empaquetamiento de acuerdo a la invención y
un vector recombinante de acuerdo a la invención, con lo cual no
existe esencialmente ninguna secuencia de traslape que conduzca a la
recombinación, dando como resultado la producción del adenovirus de
replicación competente, entre la célula y el vector. Para ciertas
aplicaciones por ejemplo, cuando la terapia está dirigida a la
erradicación de células tumorales, el vector adenoviral de acuerdo a
la invención puede ser competente a la replicación o capaz de
replicarse bajo ciertas condiciones, por ejemplo en tipos de células
específicas como células tumorales o células endoteliales
tumorales.
Está dentro del alcance de la invención el
insertar más genes, o una parte funcional de estos genes
provenientes del mismo o de otros serotipos dentro del vector
adenoviral reemplazando las secuencias nativas correspondientes. De
este modo, por ejemplo el reemplazo de (una parte funcional de) las
secuencias de fibra con las secuencias correspondientes de los otros
serotipos puede ser combinado por ejemplo con reemplazos de (una
parte funcional de) otros genes de cápsida como el pentón base o el
hexón con secuencias correspondientes de dicho serotipo o de otros
serotipos distintos. Las personas expertas en la técnica comprenden
que otras combinaciones no limitadas a dichos genes son posibles y
están dentro del alcance de la invención. El vector adenoviral
quimérico de acuerdo a la invención puede originarse de al menos dos
diferentes serotipos. Esto puede proporcionar el vector con
características preferidas tales como infección mejorada de las
células objetivo y/o menor infección de las células no objetivo,
estabilidad mejorada de los virus, inmunogenicidad reducida en
humanos o animales (por ejemplo, captación reducida en APC,
neutralización reducida en el huésped y/o respuesta de linfocitos T
citotóxicos reducida (CTL)), penetración incrementada de tejido,
mejor longevidad de la expresión del transgen, etc. En este aspecto
se prefiere utilizar genes de cápsida, por ejemplo, genes de pentón
y/o hexón provenientes de serotipos menos inmunogénicos, como se
define por la ausencia o la presencia de cantidades bajas de
anticuerpos neutralizadores en la vasta mayoría de los huéspedes. Se
prefiere también utilizar secuencias de fibras y/o de pentón
provenientes de serotipos que muestran enlace mejorado e
internalización en las células objetivo. Además, se prefiere
suprimir del vector viral aquellos genes que conducen a la expresión
de genes adenovirales en las células objetivo. En este aspecto un
vector suprimido de todos los genes adenovirales es también
preferido. Además, se prefiere que el promotor que impulsa al gen de
interés sea expresado en las células objetivo como un promotor
específico de tipo celular.
Con el fin de hacer posible el adaptar de manera
precisa el vector viral y proporcionar el virus quimérico con las
propiedades deseadas a voluntad, se prefiere que se proporcione una
genoteca de genes adenovirales mediante la cual los genes que van a
ser intercambiados sean colocados sobre las construcciones
adenovirales basadas en plásmido a en cósmido, con lo cual los genes
o las secuencias que van a ser intercambiadas son flanqueados por
sitios de restricción. Los genes o secuencias preferidos pueden ser
seleccionados de la genoteca e insertados en las construcciones
adenovirales que son utilizadas para generar los virus. Típicamente
tal método comprende un número de pasos de restricción y de ligadura
y la transfección de una célula de empaquetamiento.El vector
adenoviral puede ser transfectado en una sola pieza, o como dos o
más fragmentos que se traslapan, con lo cual son generados virus
mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, el vector adenoviral
estará constituido de dos o más secuencias que se traslapan para la
inserción o los reemplazos de un gen de interés por ejemplo en la
región E1, para la inserción o los reemplazos en secuencias de
pentones y/o hexones, y para inserciones o reemplazos dentro de
secuencias de fibra. De este modo, la invención proporciona un
método para la producción de adenovirus quiméricos que tienen una a
más propiedades deseadas como un intervalo de huésped deseado y
antigenicidad disminuida, que comprende la provisión de uno a más
vectores de acuerdo a la invención que tienen los sitios de
inserción deseados, insertando dentro de dichos vectores al menos
una parte funcional de una proteína de fibra derivada de un serotipo
de adenovirus que tiene el intervalo de huésped deseado y/o la
inserción de una parte funcional de una proteína de cápsida derivada
de un serotipo adenoviral que tiene antigenicidad relativamente baja
y la transfección de dichos vectores en una célula de
empaquetamiento de acuerdo a la invención, y permitiendo la
producción de partículas virales quiméricas. por supuesto, pueden
también ser insertadas otras combinaciones de otros genes virales
que se originan de diferentes serotipos, como se describe
anteriormente en la presente. Los virus quiméricos que tienen
únicamente una secuencia no nativa además de una inserción o
reemplazo de un gen de interés en la región El, están también dentro
del alcance de la invención. Una respuesta inmunogénica al
adenovirus que ocurre típicamente es la producción de anticuerpos
neutralizadores por parte del huésped. Esta es típicamente una razón
para la selección de una proteína de cápsida como pentón, hexón y/o
fibra de un serotipo menos inmunogénico.
Por Supuesto, puede no ser necesario el elaborar
adenovirus quiméricos que tengan proteínas completas de diferentes
serotipos. Está muy por dentro de la experiencia de la técnica el
producir proteínas quiméricas, por ejemplo en el caso de proteínas
de fibra es muy posible tener la base de un serotipo y el eje o
tallo y la protuberancia o perilla de otro serotipo más. De esta
manera se vuelve posible el tener las partes de la proteína
responsables para el ensamblaje de las partículas virales que se
originan de un serotipo, con lo cual se aumenta la producción de
partículas virales intactas. De este modo, la invención también
proporciona un adenovirus quimérico de acuerdo a la invención, en
donde el hexón, pentón, fibra y/o las otras proteínas de cápsida
son proteínas quiméricas que se originan de diferentes
serotiposadenovirales. Además de la generación de adenovirus
quiméricos mediante intercambio o reemplazo de los genes de la
cápsida completa de tipo silvestre (proteína), etc.,o partes de los
mismos, está también dentro del alcance de la presente invención el
insertar los genes de la cápsida (proteína), etc., que poseen
secuencias no adenovirales o mutaciones tales como mutaciones
puntuales, supresiones, inserciones, etc., las cuales pueden ser
fácilmente seleccionadas para características preferidas tales como
estabilidad a la temperatura, ensamblaje, anclaje, infección
redirigida, respuesta inmune alterada, etc. Una vez más pueden
también ser producidas otras combinaciones quiméricas, y están
dentro del alcance de la presente invención.
Se ha demostrado en ratones y en ratas que
después de la distribución sistémica in vivo de adenovirus
recombinantes de serotipos comúnmente utilizados para fines de
terapia génica, más del 90% de los virus están atrapados en el
hígado (Herz y colaboradores, 1993; Kass-Eisler y
colaboradores, 1994; Huard y colaboradores, 1995). Es también sabido
que los hepatocitos humanos son eficientemente transducidos por
vectores adenovirales del serotipo 5 (Castell, J.V., Hernandez, D.
Gomez-Foix, A.M., Guillen, I, Donato, T. y
Gomez-Lechon, M.J. (1997) La transferencia de genes
mediada por adenovirus dentro de hepatocitos humanos: análisis de la
funcionalidad bioquímica de las células transducidas. Gene Ther.
4(5), p455-464). De este modo, en la terapia
génica in vivo mediante distribución sistémica de vectores
basados en Ad2 o Ad5 es seriamente entorpecida por la captación e
eficiente de los virus en el hígado, conduciendo a toxicidad no
deseada y a que menos virus esté disponible para la transducción de
las células objetivo. Por lo tanto, la alteración del intervalo de
célula huésped del adenovirus de serotipo 5, para ser capaz de
dirigirse a otros órganos in vivo, es un interés principal de
la invención.
Para obtener la infección redirigida del
adenovirus recombinante serotipo 5, han estado o están todavía bajo
investigación diversos procedimientos. Wickham y colaboradores han
alterado la porción RGD (Arg, Gly, Asp) en la base pentón, la cual
se cree que es responsable del enlace de la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} a la base
pentón. Ellos han reemplazado a esta porción RGD por otra porción
peptídica la cual es específica para el receptor de
\alpha_{4}\beta_{1}. De esta manera la dirección del
adenovirus a una célula objetivo específica podría ser lograda
(Wickham y colaboradores, 1995). Krasnykh y colaboradores (1998) han
hecho uso del rizo HI disponible en la protuberancia o perilla. Este
rizo, con base en la cristalografía de rayos X, está localizado
sobre la parte exterior de la estructura quimérica de perilla o
protuberancia y por lo tanto se piensa que no contribuye a las
interacciones intramoleculares de la protuberancia. La inserción de
una secuencia de codificación FLAG (bandera) dentro del rizo HI dio
como resultado proteínas de fibra que fueron capaces de trimerizarse
y se mostró además que los virus que contiene la secuencia FLAG en
la región de protuberancia podrían ser elaborados también. Aunque
las interacciones de la protuberancia que contiene FLAG con CAR no
son cambiadas, la inserción de ligandos dentro del rizo HI puede
conducir a redirección de la infección. Aunque la introducción
exitosa de cambios en la fibra y el pentón base del adenovirus
serotipo 5, han sido reportados, la estructura completa de la
protuberancia y el conocimiento limitado de los aminoácidos precisos
que interactúan con CAR, hacen a tales procedimientos de dirección
al objetivo, laboriosos y difíciles. El uso de anticuerpos que se
enlazan a CAR y a un receptor celular específico ha sido también
descrito (Wickham y colaboradores, 1996; Rogers y colaboradores,
1997). No obstante, este procedimiento está limitado por la
disponibilidad de un anticuerpo específico y por la Complejidad del
producto de la terapia génica.
Para superar las limitaciones descritas
anteriormente se utilizaron fibras de adenovirus preexistentes,
proteínas de base de pentón, proteínas de hexón u otras proteínas de
cápsida derivadas de otros serotipos adenovirales. Mediante la
generación de genotecas de adenovirus quiméricos del serotipo 5 que
contienen proteínas estructurales de los serotipos de adenovirus
alternativos, se ha desarrollado una tecnología, la cual hace
posible la rápida selección de un vector adenoviral recombinante con
características preferidas. Es un objetivo de la presente invención
proporcionar métodos para la generación de cápsidas quiméricas, las
cuales pueden ser dirigidas a tipos celulares específicos in
vitro, así como in vivo, y de este modo tienen un
tropismo alterado para ciertos tipos celulares. Es un objetivo
adicional de la presente invención el proporcionar los métodos y los
médicos mediante los cuales un adenovirus o una cápsida de
adenovirus pueden ser utilizados como un vehículo de distribución de
proteína o de ácido nucleico a un tipo celular o tejido
específico.
Se describe la generación de adenovirus
quiméricos basados en el adenovirus serotipo 5, con genes tardíos
modificados. Para este propósito, fueron construidos tres plásmidos,
los cuales conjuntamente contienen el genoma completo del
adenovirus serotipo 5. A partir de uno de estos plásmidos, parte del
ADN que codifica para la proteína de fibra del adenovirus del
serotipo 5 fue removido y reemplazado por secuencias de ADN
ligadoras que facilitan la clonación fácil. Este plásmido sirvió
subsecuentemente como plantilla para la inserción del ADN que
codifica para la proteína de fibra derivado de los diferentes
serotipos de adenovirus. Las secuencias de ADN derivadas de los
diferentes serotipos fueron obtenidas utilizando la técnica de
reacción en cadena de polimerasa en combinación con oligonucleótidos
(degenerados). En el primer sitio El en el genoma del adenovirus
serotipo 5, puede ser clonado cualquier gen de interés. Un
procedimiento de transfección simple de los tres plásmidos
conjuntamente, da como resultado la formación de un adenovirus
quimérico recombinante. Alternativamente, la clonación de las
secuencias obtenidas a partir de la genoteca puede sen tal que el
vector adenoviral quimérico está constituido de uno a dos
fragmentos. Por ejemplo una construcción contiene al menos el ITR
izquierdo y las secuencias necesarias para el empaquetamiento del
virus, un casete de expresión para el gen de interés y las
secuencias que se traslapan con be segunda construcción, que
comprende todas las secuencias necesarias para la replicación y la
formación del virus no presentes en la célula de empaquetamiento,
así como las secuencias no nativas que proporcionan las
características preferidas. Esta tecnología de las bibliotecas o
genotecas que consisten de adenovirus quiméricos, permite de este
modo una rápida selección para vectores adenovirales recombinantes
mejorados, para fines de terapia génica in vitro e in
vivo.
El uso del adenovirus tipo 5 para la terapia
génica in vivo está limitado por la incapacidad aparente para
infectar ciertos tipos celulares, por ejemplo, células endoteliales
humanas y células del músculo liso, y la preferencia de la infección
de ciertos órganos, por ejemplo, el hígado y el bazo.
Específicamente, éste tiene consecuencias para el tratamiento de
enfermedades cardiovasculares como restenosis e hipertensión
pulmonar. La distribución mediada por adenovirus, de ceNOS humana
(sintasa del óxido nítrico endotelial constitutivo) ha sido
propuesta como tratamiento para la restenosis después de la
angioplastia coronaria transluminal coronaria (PTCA). La restenosis
está caracterizada por remodelación arterial progresiva, formación
de matriz extracelular e hiperplasia íntima en el sitio de la
angioplastia (Schwartz y colaboradores, 1993; Carter y
colaboradores, 1994; Shi y colaboradores, 1996). NO es uno de los
factores vasoactivos que se muestra son perdidos después del daño
inducido por PTCA a la barrera endotelial (Lloyd Jones y Bloch,
1996). De este modo, la restauración de los niveles de NO después
del daño inducido por globo, por medio de distribución adenoviral de
ceNOS puede prevenir la restenosis (Varenne y colaboradores, 1998).
Otras aplicaciones para la terapia génica mediante la cual los virus
o virus quiméricos de acuerdo a la invención son superiores a los
virus basados en Ad2 o Ad5, dados como ejemplos no limitantes, son
la producción de proteínas por células endoteliales que son
secretadas hacia la sangre, el tratamiento de la hipertensión, el
tratamiento preventivo de la estenosis durante el injerto de venas,
la angiogénesis, la insuficiencia cardiaca, la hipertensión renal y
otros.
En una modalidad, esta invención describe los
vectores adenovirales que son, entre otros, especialmente adecuados
para la distribución de genes a las células endoteliales y a las
células del músculo liso, importantes para el tratamiento de
desórdenes cardiovasculares. Los vectores adenovirales son
preferentemente derivados de los adenovirus del subgrupo B o
contienen al menos una parte funcional de la proteína de fibra
proveniente de un adenovirus del subgrupo B que comprende al menos
la porción de enlace a las células de la proteína de fibra. En una
modalidad preferida, adicional, los vectores adenovirales son
vectores quiméricos basados en adenovirus del tipo 5 y contienen al
menos una parte funcional de la proteína de fibra proveniente del
adenovirus tipo 16.
En otra modalidad más, esta invención proporciona
los vectores adenovirales a los vectores adenovirales quiméricos que
escapan al hígado después de la administración sistémica.
Preferentemente, estos vectores adenovirales son derivados del
subgrupo A, B, D o F, en particular los serotipos 12, 16, 28 y 40 o
contienen al menos la porción de enlace a las células de la proteína
de fibra derivada de dichos adenovirus.
Se entiende que en todas las modalidades los
vectores adenovirales pueden ser derivados del serotipo que tiene
las propiedades deseadas, o que el vector adenoviral está basado en
un adenovirus proveniente de un serotipo, y contiene las secuencias
que comprenden las funciones deseadas de otro serotipo, reemplazando
estas secuencias a las secuencias nativas en dicho serotipo.
En otro aspecto más esta invención describe los
adenovirus quiméricos y los métodos para generar estos virus que
tienen un tropismo alterado, diferente de aquel del adenovirus del
tipo 5. Por ejemplo, los virus basados en el adenovirus serotipo 5
pero que muestran cualquier fibra de adenovirus, existen en la
naturaleza. Este adenovirus serotipo 5 quimérico es capaz de
infectar ciertos tipos celulares de manera más eficiente, o de
manera menos eficiente in vitro e in vivo que el
adenovirus serotipo 5. Tales células incluyen, pero no están
limitadas a células endoteliales, células del músculo liso, células
dendríticas, células neuronales, células gliales, células
sinoviales, células epiteliales pulmonares, células de la serie
hematopoyética, células monocíticas/macrófagos, células tumorales,
células del músculo esquelético, células mesoteliales, sinoviocitos,
etc.
En otro aspecto más la invención describe la
construcción y el uso de genotecas que consisten de distintas partes
del adenovirus serotipo 5 en el cual uno a más de los genes o
secuencias han sido reemplazados con el ADN derivado de los
serotipos humanos o animales alternados. Este grupo de
construcciones, que abarcan en total el genoma completo del
adenovirus, permite la construcción de adenovirus quiméricos únicos,
diseñados para una cierta enfermedad, grupo de pacientes o incluso
un individuo único.
En todos los aspectos de la invención, los
adenovirus quiméricos pueden o no contener supresiones en la región
E1 e inserciones de genes heterólogos ligados ya sea o no a un
promotor. Además, los adenovirus quiméricos pueden o no contener
supresiones en la región E3 e inserciones de los genes heterólogos
ligados a un promotor. Además, los adenovirus quiméricos pueden o no
contener supresiones en la región E2 y/o E4, e inserciones de genes
heterólogos ligados a un promotor. En el último caso las líneas
celulares que complementan a E2 y/o a E4 son requeridas pare generar
adenovirus recombinantes. De hecho cualquier gen en el genoma del
vector viral puede ser tomado y suministrado en posición trans. De
este modo, en la situación extrema, los virus quiméricos no
contienen ningún gen adenoviral en su genoma, y son por definición
vectores adenovirales mínimos. En este caso, todas las funciones
adenovirales son suministradas en posición trans utilizando líneas
celulares estables y/o la expresión transitoria de estos genes. Un
método para la producción de vectores adenovirales mínimos se
describe en WO 97/00326 y es tomada como referencia en la presente.
En otro caso más, las moléculas quiméricas de Ad/AAV son
empaquetadas en las cápsidas adenovirales de la invención. Un método
para la producción de vectores quiméricos Ad/AAV se describe en la
Patente Europea EP 97204085.1 y es tomada por referencia en la
presente. En principio, cualquier ácido nucleico puede estar
provisto con cápsidas adenovirales de la invención.
En una modalidad la invención proporciona un
vehículo para la distribución de genes que ha sido provistos con al
menos un tropismo tisular para células del músculo liso y/o células
endoteliales. En otra modalidad más, la invención proporciona un
vehículo para la distribución de genes desprovisto de un tropismo de
tejido para al menos las células hepáticas. Preferentemente, dicho
vehículo de distribución de genes está provisto con un tropismo de
tejido pare al menos las células del músculo liso y/o las células
endoteliales, y desprovisto de un tropismo de tejido para al menos
las células hepáticas. En una modalidad preferida de la invención,
dicho vehículo de distribución de genes está provisto con un
tropismo de tejido para al menos las células del músculo liso y/o
las células endoteliales y/o desprovisto de un tropismo de tejido
para al menos las células hepáticas, utilizando una proteína de
fibra derivada de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del
adenovirus 16. En un aspecto preferido de la invención, dicho
vehículo de distribución de genes comprende una cápsida viral.
Preferentemente la cápsida de virus comprende una cápsida de virus
derivada total o parcialmente de un adenovirus del subgrupo B,
preferentemente del adenovirus 16, o éste comprende las proteínas, o
parte de las mismas, provenientes de un adenovirus del subgrupo B,
preferentemente del adenovirus 16. En la modalidad preferida de la
invención, dicha cápsida del virus comprende proteínas, o fragmentos
de las mismas, provenientes de al menos dos virus diferentes,
preferentemente adenovirus. En una modalidad preferida de este
aspecto de la invención, al menos uno de los virus es un adenovirus
del subgrupo B, preferentemente adenovirus 16.
En una modalidad preferida de la invención el
vehículo de distribución de genes comprende una proteína de fibra de
adenovirus o fragmentos de la misma. La proteína de fibra es
preferentemente derivada de un adenovirus del subgrupo B,
preferentemente del adenovirus 16. El vehículo de distribución de
genes puede además comprender otras proteínas de fibra, o fragmentos
de las mismas, provenientes de otros adenovirus. El vehículo de
distribución de genes puede o no comprender otras proteínas
adenovirales. El ácido nucleico puede estar ligado directamente a
las proteínas de fibra, o fragmentos de las misinas, pero puede
también estar ligado indirectamente. Los ejemplos de enlaces
indirectos incluyen, poro no están limitados a, el empaquetamiento
de ácido nucleico dentro de las cápsidas adenovirales o
empaquetamientode ácido nucleico dentro de liposomas, en donde una
proteína de fibra, o un fragmento de la misma, es incorporado dentro
de la cápsida del adenovirus o ligada a un liposoma. En enlace
directo de ácido nucleico a una proteína de fibra, o un fragmento de
la misma, puede ser realizado cuando la proteína de fibra o un
fragmento de la misma, no es parte de un complejo, a cuando la
proteína de fibra, o un fragmento de la misma, es parte del complejo
tal como una cápsida de adenovirus.
En una modalidad de la invención se proporciona
un vehículo de distribución de genes que comprende una proteína de
fibras de adenovirus, en donde la proteína de fibra comprende un
fragmento de determinación tisular de un adenovirus del subgrupo B,
preferentemente de adenovirus 16. La proteína de fibra de adenovirus
comprende tres dominios funcionales. Un dominio, la base, es
responsable del anclaje de la fibra a una base de pentón de la
cápsida del adenovirus. Otro dominio más, la protuberancia, es
responsable del reconocimiento del receptor, mientras que el dominio
de tallo funciona como un espaciador que separa la base de la
protuberancia. Los diferentes dominios pueden también tener otra
función. Por ejemplo, el tallo está presumiblemente también
involucrado en la especificidad de las células objetivo. Cada uno de
los dominios mencionados anteriormente puede ser utilizado para
definir un fragmento de una fibra. Sin embargo, los fragmentos
pueden también ser identificados de otra manera. Por ejemplo el
dominio de protuberancia comprende un fragmento de enlace al
receptor y un fragmento de enlace al tallo. El dominio de la base
comprende un fragmento de enlace a la base de pentón y un fragmento
de enlace al tallo. Además, el tallo comprende tramos repetidos de
aminoácidos. Cada uno de estos tramos repetidos puede ser un
fragmento.
Un fragmento que determina tropismo tisular de
una proteína de fibra,puede ser un fragmento simple de una proteína
de fibra o una combinación de fragmentos de al menos una proteína de
fibra, en donde el fragmento de determinación del tropismo tisular,
ya sea solo a en combinación con una cápsida viral, determina la
eficiencia con la cual el vehículo de distribución del gen puede
transducir una célula dada o un tipo celular, preferentemente pero
no necesariamente de una manera positiva. Con un tropismo de tejido
para células hepáticas, se entiende un tropismo de tejido para
células que radican en el hígado, preferentemente células del
parénquima hepático.
Un tropismo de tejido para un cierto tipo celular
puede ser provisto mediante el incremento de la eficiencia con la
cual las células de dicho tejido son transducidas, alternativamente,
un tropismo de tejido para un cierto tejido puede ser proporcionado
mediante la disminución de la eficiencia con la cual son
tnansducidas otras células diferentes de las células de dicho
tejido.
Las proteínas de fibra poseen propiedades que
determinan el tropismo de tejido. El fragmento más perfectamente
descrito de la proteína de fibra involucrada en el tropismo de
tejido es el dominio de la protuberancia. No obstante, el dominio
del tallo de La proteína de fibra también posee propiedades que
determinan el tropismo de tejido. No obstante, no todas las
propiedades que determinan el tropismo de tejido de una cápsida
adenoviral son incorporadas dentro de una proteína de fibra.
En una modalidad preferida de la invención, una
proteína de fibra derivada de un adenovirus del subgrupo B,
preferentemente el adenovirus 16, es combinada con las proteínas de
cápsida no de fibra provenientes de un adenovirus del subgrupo C,
preferentemente del adenovirus 5.
En un aspecto de la invención se proporciona un
vehículo de distribución de genes que comprende un ácido nucleico
derivado de un adenovirus. En una modalidad preferida de la
invención dicho ácido nucleico adenoviral comprende al menos una
secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de fibra,
que comprende al menos un fragmento de determinación de tropismo de
tejido de una proteína de fibra del adenovirus del subgrupo B,
preferentemente del adenovirus 16. En un aspecto preferido dicho
adenovirus comprende el ácido nucleico proveniente de al menos dos
diferentes adenovirus. En un aspecto preferido el adenovirus
comprende el ácido nucleico proveniente de al menos dos diferentes
adenovirus, en donde al menos una secuencia de ácido nucleico que
codifica para una proteína de fibra, comprende al menos un fragmento
de determinación del tropismo de tejido, de una proteína de fibra
del adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus
16.
En una modalidad preferida de la invención, el
ácido nucleico del adenovirus es modificado tal que la capacidad del
ácido nucleico adenoviral para replicarse en una célula objetivo, ha
sido reducida o suprimida. Esto puede ser logrado a través de la
inactivación o supresión de genes que codifican para las proteínas
de la región temprana 1.
En otra modalidad preferida el ácido nucleico
adenoviral es modificado tal que la capacidad del sistema inmune de
un huésped para montar una respuesta inmune contra las proteínas
adenovirales codificadas por dicho ácido nucleico adenoviral, ha
sido reducida o suprimida. Esto puede ser logrado a través de la
supresión de genes que codifican para proteínas de la región
temprana 2 y/o la región temprana 4.
Alternativamente, los genes que codifican para
las proteínas de la región temprana 3, pueden ser suprimidos, o por
el contrario, considerando la función del sistema
anti-inmune de algunas de las proteínas codificadas
por los genes en la región temprana 3, la expresión de las proteínas
de la región temprana 3 puede ser aumentada para algunos propósitos.
También, el ácido nucleico adenoviral puede ser alterado por una
combinación de dos o más de las alteraciones específicas del ácido
nucleico adenoviral anteriormente mencionado. Es claro que cuando
son suprimidos los genes esenciales del ácido nucleico adenoviral,
los genes deben ser complementados en la célula que va a producir el
ácido nucleico adenoviral, el vector adenoviral, el vehículo o la
cápsida quimérica. El ácido nucleico adenoviral puede también ser
modificado tal que haya sido reducida o suprimida la capacidad del
sistema inmune de un huésped para montar una respuesta inmune contra
proteínas adenovirales codificadas por el ácido nucleico adenoviral,
en otras maneras diferentes a las mencionadas anteriormente, por
ejemplo a través del intercambio de proteínas de cápsida, o
fragmentos de las mismas, por proteínas de cápsida, o fragmentos de
las mismas, provenientes de otros serotipos para los cuales los
humanos no tienen, o tienen niveles bajos de, anticuerpos
neutralizadores. Otro ejemplo más de esto es el intercambio de genes
que codifican para las proteínas de cápsida, con los genes que
codifican para las proteínas de cápsida provenientes de otros
serotipos. También las proteínas de cápsida, o los fragmentos de las
mismas, pueden sen intercambiados por otras proteínas de cápsida, o
fragmentos de las mismas, para las cuales los individuos no son
capaces de, o tienen una baja capacidad de, originar una respuesta
inmune contra ellos.
Un ácido nucleico adenoviral puede sen alterado
además de o en vez de una o más de las alteraciones mencionadas
anteriormente, por inactivación o supresión de genes que codifican
para las proteínas tardías del adenovirus, tales como, pero no
limitadas a, hexón, pentón, fibra y/o proteína IX.
En una modalidad preferida de la invención todos
los genes que codifican para las proteínas adenovirales están
suprimidos del ácido nucleico adenoviral, volviendo a dicho ácido
nucleico un vector adenoviral mínimo.
En otra modalidad preferida de la invención, el
ácido nucleico adenoviral es un vector quimérico Ad/AAV, en donde al
menos los medios de integración de un virus adenoasociado (AAV)
están incorporados dentro del ácido nucleico adenoviral.
En una modalidad preferida de la invención, un
vector o un ácido nucleico, el cual puede ser uno y el mismo o no,
de acuerdo a la invención comprende además al menos un gen no
adenoviral. Preferentemente, al menos uno del gen no adenoviral se
selecciona del grupo de genes que codifican para: una
apolipoproteína, un ceNOS, una timidina-quinasa del
virus del herpes simple, una interleucina 3, una interleucina
1\alpha, una proteína (anti)angiogénesis tal como la
angiostatina, una proteína de antiproliferación, un factor de
crecimiento endotelial vascular (VGAF), un factor de crecimiento de
fibroblastos básico (bFGF), un factor inducible por hipoxia 1a
(HIF-1a) , un PAI-1 o una proteína
antimigración de células del músculo liso.
En otro aspecto más, la invención proporciona una
célula para la producción de un vehículo de distribución de genes
provisto con al menos un tropismo de tejido para células del músculo
liso y/o células endoteliales. En otro aspecto más, la invención
proporciona una célula para la producción de un vehículo de
distribución de genes desprovisto de al menos un tropismo de tejido
para las células hepáticas. En otro aspecto más, la invención
proporciona una célula para la producción de un vehículo de
distribución de genes provisto con al menos un tropismo de tejido
para células del músculo liso y/o células endoteliales y desprovisto
de al menos un tropismo de tejido para células hepáticas. En una
modalidad preferida de la invención, dicha célula es una célula de
empaquetamiento de adenovirus, en donde un ácido nucleico del
adenovirus está empaquetado dentro de una cápsida del adenovirus. En
un aspecto de una célula de empaquetamiento del adenovirus de la
invención, todas las proteínas requeridas para la replicación y el
empaquetamiento de un ácido nucleico del adenovirus, excepto por las
proteínas codificadas por la región temprana 1, son proporcionadas
por genes incorporados en el ácido nucleico del adenovirus. Las
proteínas codificadas por la región temprana 1, en este aspecto de
la invención, pueden ser codificadas por genes incorporados dentro
del ADN genómico de las células. En una modalidad preferida de la
invención dicha célula es PER.C6 (número de depósito de la ECACC
96022940). En general, cuando los productos génicos requeridos para
la replicación y el empaquetamiento del ácido nucleico del
adenovirus dentro de la cápsida del adenovirus no son proporcionados
por un ácido nucleico del adenovirus, éstos son proporcionados por
la célula de empaquetamiento, ya sea mediante transfección
transitoria, o a través de transformación estable de la célula de
empaquetamiento. No obstante, un producto génico proporcionado por
la célula de empaquetamiento puede también ser proporcionado por un
gen presente sobre el ácido nucleico del adenovirus. Por ejemplo, la
proteína de fibra puede ser proporcionada por la célula de
empaquetamiento, por ejemplo, a través de la transfección
transitoria, puede ser codificada por el ácido nucleico del
adenovirus. Esta característica puede entre otras ser utilizada para
generar cápsidas adenovirales que comprenden proteínas de fibra
provenientes de dos virus diferentes.
Los vehículos para la distribución de genes de la
invención son útiles para el tratamiento de enfermedad
cardiovascular o enfermedad tratable por la distribución de ácido
nucleico a las células endoteliales o a las células del músculo
liso. Un ejemplo no limitante de la última es por ejemplo el cáncer,
donde el ácido nucleico transferido comprende un gen que codifica
para una proteína anti-angiogénesis.
Los vehículos para la distribución de genes de la
invención pueden ser utilizados como un producto farmacéutico para
el tratamiento de dichas enfermedades.
Alternativamente, los vehículos para la
distribución de genes de la invención pueden ser utilizados para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de dichas
enfermedades.
En un aspecto, la invención proporciona una
cápsida adenoviral con o provista con un tropismo de tejido para
células del músculo liso y/o células endoteliales, en donde la
cápsida comprende preferentemente proteínas de al menos dos
diferentes adenovirus y en donde al menos un fragmento de
determinación de tropismo de tejido de una proteína de fibra es
derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del
adenovirus 16. En otro aspecto más, la invención proporciona una
cápsida adenoviral desprovista de un tropismo de tejido para células
hepáticas, en donde la cápsida comprende preferentemente proteínas
de al menos dos diferentes adenovirus y en donde al menos un
fragmento de determinación del tropismo de tejido de una proteína de
fibra, es derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente
del adenovirus 16.
En una modalidad, la invención comprende el uso
de una cápsida de adenovirus, para la distribución del ácido
nucleico a las células del músculo liso y/o a las células
endoteliales. En otra modalidad más, la invención comprende el uso
de una cápsida de adenovirus, para prevenir la distribución del
ácido nucleico a las células del hígado. Las cápsidas adenovirales
de la invención pueden ser utilizadas para el tratamiento de
enfermedad cardiovascular o enfermedad tratable por la distribución
de ácido nucleico a las células endoteliales o a las células del
músculo liso. El ejemplo de la última es por ejemplo el cáncer donde
el ácido nucleico transferido comprende un gen que codifica para una
proteína anti-angiogénesis.
Las cápsidas adenovirales de la invención pueden
ser utilizadas como un producto farmacéutico para el tratamiento de
dichas enfermedades.
Alternativamente, las cápsidas adenovirales de la
invención pueden ser utilizadas para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades.
En otro aspecto más de la invención, se
proporciona la construcción pBr/Ad.BamR\DeltaFib, que comprende
las secuencias 21562-31094 y
32794-35938 del adenovirus 5.
En otro aspecto más de la invención, se
proporciona la construcción pBr/AdBamRfib16, que comprende las
secuencias 21562-31094 y 32794-35938
del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que
codifica para la proteína de fibra.
En otro aspecto más de la invención, se
proporciona la construcción pBr/AdBamR.pac/fib16, que comprende las
secuencias 21562-31094 y 32794-35938
del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que
codifica para la proteína de fibra y que comprende además un sitio
PacI único en proximidad de la repetición terminal derecha del
adenovirus 5, en la cadena principal o columna vertebral de la
secuencia no adenoviral de dicha construcción.
En otro aspecto más de la invención, se
proporciona la construcción pWE/Ad.Af1IIrITRfib16 que comprende las
secuencias 3534-31094 y 32794-35938
del Ad5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica
para la proteína de fibra.
En otro aspecto más de la invención, se
proporciona la construcción pWE/Ad.Af1IIrITRDE2Afib16 que comprende
las secuencias 3534-22443 y
24033-31094 y 32794-35938 del Ad5,
que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la
proteína de fibra.
En la numeración de las secuencias mencionadas
anteriormente, el número es descrito hasta y no hasta más.
En una modalidad preferida de la invención dichas
construcciones son utilizadas para la generación de un vehículo para
la distribución de genes o una cápsida de adenovirus con un tropismo
de tejido para células del músculo liso y/o células
endoteliales.
En otro aspecto más la invención proporciona una
genoteca de vectores adenovirales, o vehículos para la distribución
de genes los cuales pueden ser uno y el mismo o no, que comprenden
una selección grande de ácidos nucleicos no adenovirales. En otro
aspecto más de la invención, los genes adenovirales que codifican
para las proteínas de cápsida son utilizados para generar una
genoteca de cápsidas adenovirales que comprenden proteínas derivadas
de al menos dos diferentes adenovirus, siendo derivados
preferentemente dichos adenovirus de dos diferentes serotipos, en
donde preferentemente un serotipo es un adenovirus del subgrupo B.
En una modalidad particularmente preferida de la invención, es
generada una genoteca de cápsidas adenovirales que comprende
proteínas de al menos dos diferentes adenovirus y en donde al menos
un fragmento de determinación del tropismo de tejido de la proteína
de fibra es derivado de un adenovirus del subgrupo B,
preferentemente del adenovirus 16.
Una proteína de fibra del adenovirus 16 comprende
preferentemente la secuencia dada en la Figura 9. No obstante,
dentro del alcance de la presente invención pueden ser obtenidas
secuencias análogas a través del uso de la degeneración del codón.
Alternativamente, pueden ser realizadas sustituciones o inserciones
o supresiones de aminoácidos, siempre y cuando la propiedad de
determinación del tropismo de tejido no sea significativamente
alterada. Tales sustituciones de aminoácidos pueden estar dentro del
mismo grupo de polaridad o fuera de él.
En lo subsecuente la invención es ilustrada por
un número de ejemplos no limitantes.
La secuencia de codificación para la fibra, del
adenovirus serotipo 5, está localizada entre los nucleótidos 31042 y
32787. Para eliminar el ADN del adenovirus serotipo 5 que codifica
para la fibra se comenzó con la construcción
pBr/Ad.Bam-rITR (Figura 1; ECACC depósito
P97082122). De esta construcción se eliminó primeramente un sitio
NdeI. Para este propósito, el ADN del plásmido pBr322 digerido con
NdeI, después de lo cual fueron rellenados los extremos
sobresalientes utilizando la enzima de Klenow. Este plásmido pBr322
fue luego religado, digerido con NdeI y transformado dentro de E.
coli DH5\alpha. El plásmido pBr/ANdeI obtenido fue digerido
con ScaI y SalI y el fragmento vector resultante de 3198 pares de
bases fue ligado al fragmento ScaI-SalI de 15349
pares de bases derivado de pBr/Ad.BamrITR, dando como resultado el
plásmido pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI el cual tenia
por lo tanto un sitio NdeI único. Enseguida se realizó una PCR con
los oligonucleótidos "NY-arriba" y
"NY-abajo" (Figura 2). Durante la
amplificación, los sitios de restricción NdeI y NsiI fueron
introducidos para facilitar la clonación de los ADNs de fibra
amplificados. La amplificación consistió de 25 ciclos de 45 segundos
cada uno a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 45 segundos a 72ºC. La reacción
de PCR contenía 25 pmol de los oligonucleótidos
NY-arriba o NY-abajo, dNTP 2 mM,
amortiguador de PCR con cloruro de magnesio 1,5 mM y una unidad de
la polimerasa estable al calor, Elongase (Gibco, Holanda). Un décimo
del producto PCR fue corrido sobre un gel de agarosa el cual
demostró que el fragmento de ADN esperado de \pm2200 pares de
bases fue amplificado. Este fragmento de PCR fue subsecuentemente
purificado utilizando el sistema del equipo Geneclean (Biol01 Inc.)
Luego, la construcción pBr/Ad.Bam-rITR\DeltaNdeI
así como el producto de PCR fueron digeridos con las enzimas de
restricción NdeI y SbfI. El fragmento de PCR fue subsecuentemente
clonado utilizando la enzima ligasa T4 dentro de los sitios NdeI y
SbfI generando de este modo el pBr/Ad.BamR\DeltaFib (Figura
3).
Para hacer posible la amplificación de los ADNs
que codifican para la proteína de fibra derivada de los serotipos
alternativos, fueron sintetizados oligonucleótidos degenerados. Para
este propósito, primeramente las secuencias de ADN conocidas que
codifican para la proteína de fibra de serotipos alternativos,
fueron alineadas para identificar las regiones conservadas en la
región de cola, así como la región de protuberancia de la proteína
de fibra. A partir del alineamiento, el cual contenía la secuencia
nucleotídica de 19 diferentes serotipos que representan los 6
subgrupos, se sintetizaron los oligonucleótidos (degenerados) (ver
Tabla I). También en la Tabla 3 se muestra la combinación de los
oligonucleótidos utilizados para amplificar el ADN que codifica para
la proteína de fibra de un serotipo especifico. La reacción de
amplificación (50 \mul) contenía dNTPs 2 mM, 25 pmol de cada
oligonucleótido, lx de amortiguador estándar de PCR, cloruro de
magnesio 1,5 mM y la polimerasa estable al calor Unit Pwo
(Boehringer Mannheim) por reacción. El programa ciclador contenía 20
ciclos, consistiendo cada uno de 30 segundos a 94ºC, 60 segundos a
60-64ºC y 120 segundos a 72ºC. Un décimo del
producto de PCR fue corrido sobre un gel de agarosa para demostrar
que un fragmento de ADN fue amplificado. De cada plantilla
diferente, se realizaron dos reacciones de PCR independientes.
Todos los ADNs de fibra amplificados, así como el
vector (pBr/Ad.BamR\DeltaFib) fueron digeridos con NdeI y NsiI.
Los ADNs digeridos fueron subsecuentemente corridos sobre gel de
agarosa, después de lo cual los fragmentos fueron aislados del gel y
purificados utilizando el equipo Geneclean (Bio101 Inc). Los
fragmentos de PCR fueron luego clonados dentro de los sitios NdeI y
NsiI de pBr/AdBamR\DeltaFib, generando de este modo
pBr/AdBamRFibXX (donde XX representa el número de serotipo del cual
fue aislado el ADN de fibra). Los insertos generados por PCR fueron
secuenciados para confirmar la amplificación correcta. Las
secuencias obtenidas de los diferentes genes de fibra se muestran en
la Figura 4.
Para hacer posible la generación eficiente de los
virus quiméricos se subclonó un fragmento AvrII a partir de las
construcciones pBr/AdBamRFib16, pBr/AdBamRFib28,
pBr/AdBamRFib40-L, dentro del vector
pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 (ECACC depósito #P97082121)
reemplazando las secuencias correspondientes en este vector.
pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 tiene el mismo inserto
adenoviral que pBr/Ad.Bam-rITR pero tiene un sitio
PacI cerca de rITR que hace posible que ITR sea separado de las
secuencias vector. La construcción pWE/AD.AflII-Eco
fue generada como sigue. Se digirió PWE.pac con ClaI y los extremos
sobresalientes de cebadura 5' fueron rellenados con la enzima de
Klenow. El ADN fue luego digerido con PacI y se aisló a partir de
gel de agarosa. PWE/AflIIrITR fue digerido con EcoRI y después del
tratamiento con la enzima de Klenow se digirió con PacI. El
fragmento grande de 24 kb que contenía las secuencias adenovirales
fue asilado del gel de agarosa y ligado al vector pWE.Pac digerido
con ClaI y hecho romo. Se hizo uso del equipo de expresión de
ligadura de Clontech. Después de la clonación de las células
XL10-gold de Stratagene, fueron identificados los
clones que contenían la construcción esperada.
PWE/Ad.AlfII-Eco contiene las secuencias Ad5 de los
pares de bases 3534 al 27336. Tres construcciones,
pClipsal-Luc (Figura 5) digerida con SalI,
pWE/Ad.AflII-Eco digerida con PacI y EcoRI y
pBr/AdBamR.pac/fibXX digerida con BamHI y PacI se transfectaron
dentro de las células productoras de adenovirus (PER.C6, Fallaux y
colaboradores, 1998). La Figura 6 describe esquemáticamente el
método y los fragmentos utilizados para generar los virus
quiméricos. Únicamente se utilizó pBr/Ad.BamRfib12 sin subclonación
en el vector que contiene PacI y por lo tanto no se liberó de las
secuencias vector utilizando PacI, sino que se digirió con ClaI el
cual rompe aproximadamente 160 pares de bases de las secuencias
vector acopladas al ITR derecho. Además, el pBr/Ad.BamRfibl2 y el
pBr/Ad.BamRfib28 contienen un sitio BamHI interno en las secuencias
de fibra y fueron por lo tanto digeridos con SalI el cual corta en
las secuencias vector que flanquean el sitio BamHI. Para la
transfección, se diluyeron 2 \mug de pCLIPsal-Luc
y 4 \mug de pWE/Ad.AflII-Eco y
pBr/AdBamR.pac/fibXX en DMEM libre de suero hasta un volumen total
de 100 \mul. A esta suspensión de ADN se agregaron 100 \mul de
lipofectamina diluida 2,5x (Gibco) en medio libre de suero. Después
de 30 minutos a temperatura ambiente, la solución de complejo de
lipofectamina-ADN fue agregada a 2,5 ml del DMEM
libre de suero el cual se agregó subsecuentemente a un matraz de
cultivo de tejidos de 25 cm^{2}. Este matraz contenía las células
PER.C6 que fueron sembradas 24 horas antes de la transfección a una
densidad de 1x10^{6} células/matraz. Dos horas más tarde, se
diluyó el complejo de ADN-lipofectamina que contenía
el medio, una vez por la adición de 2,5 ml de DMEM suplementado con
20% de suero fetal de ternera. Nuevamente 24 horas más tarde el
medio fue reemplazado con DMEM fresco suplementado con 10% de suero
fetal de ternera. Las células fueron cultivadas por 6 a 8 días,
subsecuentemente cosechadas y congeladas/descongeladas tres veces.
El desecho celular fue removido mediante centrifugación 5 minutos a
3.000 rpm, a temperatura ambiente. Del sobrenadante (12,5 ml) se
utilizaron 3-5 ml para infectar nuevamente las
células PER.C6 (matraces de cultivo de tejido de 80 cm^{2}). Esta
reinfección da como resultado el efecto citopatogénico completo
(CPE) después de 5 a 6 días, después de lo cual el adenovirus se
cosecha como se describe
anteriormente.
anteriormente.
10 ml del lisado crudo anteriormente descrito se
utilizaron para inocular un fermentador de 1 litro el cual contenía
1 - 1,5 x 10^{6} células PER.C6/ml que se desarrollan en
suspensión. Tres días después de la inoculación, las células fueron
cosechadas y concentradas mediante centrifugación por 10 minutos a
1.750 rpm a temperatura ambiente. El adenovirus quimérico presente
en las células concentradas se extrajo subsecuentemente y se
purificó utilizando el siguiente protocolo de procesamiento
corriente abajo. La pella o botón celular se disolvió en 50 ml de
NaPO_{4}^{-} 10 mM y se congeló a -20ºC. Después del
descongelamiento a 37ºC, se agregaron 5,6 ml de desoxicolato (al 5%
p/v) después de lo cual la solución se homogeneizó. La solución se
incubó subsecuentemente por 15 minutos a 37ºC para romper
completamente las células. Después de la homogeneización de la
solución, se agregaron 1875 \mul de cloruro de magnesio (1 M) y 5
ml de glicerol al 100%. Después de la adición de 375 \mul de
ADNasa (10 mg/ml) la solución se incubó por 30 minutos a 37ºC. El
desecho celular se eliminó mediante centrifugación a 1880xg por 30
minutos a temperatura ambiente, sin frenado. El sobrenadante se
purificó subsecuentemente de las proteínas al cargar sobre 10 ml de
gas freón. Después de la centrifugación por 15 minutos a 2.000 rpm
sin frenado a temperatura ambiente, son visibles tres bandas, de las
cuales la banda superior presenta el adenovirus. Esta banda fue
aislada mediante toma con pipeta, después de lo cual ésta se cargó
sobre un gradiente en bloque de cloruro de cesio amortiguado con
Tris/HCl (1 M) (intervalo: 1,2 a 1,4 gr/ml). Después de la
centrifugación a 21.000 rpm por 2,5 horas a 10ºC, el virus se
purificó de la proteína remanente y del desecho celular, ya que el
virus, en contraste a los otros componentes, no migra hacia la
solución de cloruro de cesio a 1,4 gr/ml. La banda de virus es
aislada, después de lo cual se realiza una segunda purificación
utilizando un gradiente continuo amortiguado con Tris/HCl (1 M) de
1,33 gr/ml de cloruro de cesio. Después de la carga del virus sobre
la parte superior de este gradiente, el virus se centrifuga por 17
horas a 55.000 rpm a 10ºC. Subsecuentemente, la banda de virus se
aísla y después de la adición de 30 \mul de sucrosa (50% p/v) se
elimina el exceso de cloruro de cesio por tres rondas de diálisis,
comprendiendo cada ronda 1 hora. Para la diálisis el virus se
transfiere a portaobjetos de diálisis
(Slide-a-lizer, corte de 10.000 kDa,
Pierce, Estados Unidos). Los amortiguadores utilizados para la
diálisis son PBS, los cuales son suplementados con una concentración
cada vez mayor de sucrosa (ronda 1 a la 3:30 ml, 60 ml y 150 ml de
sucrosa (50% de p/v)/1,5 litros de PBS, todos suplementados con 7,5
ml de CaMgCl_{2} al 2% (p/v). Después de la diálisis, el virus se
elimina del slide-a-lizer, después
de lo cual éste es tomado como alícuota en porciones de 25 y 100
\mul, después de lo cual el virus se almacena a -85ºC. Para
determinar el número de partículas virales por ml, se corren 50
\mul del lote de virus sobre un cromatógrafo de líquidos a alta
presión (HPLC) como se describe por Shamram y colaboradores (1997).
Se encontró que los títulos virales estaban en el mismo intervalo
que el lote de virus Ad5.Luc (Ad5.Luc: 2,2 x 10^{11} vp/ml;
Ad5.LucFib12: 1,3 x 10^{11} vp/ml; Ad5.LucFib16: 3,1 x 10^{12}
vp/ml; Ad5.LucFib28: 5,4 x 10^{10} vp/ml;
Ad5.LucFib40-L: 1,6 x 10^{12}
vp/ml).
vp/ml).
Para investigar la biodistribución de los
adenovirus quiméricos que poseen fibra 12, 16, 28 ó
40-2, lx10^{10} partículas de cada uno de los
lotes virales generados se diluyó en 1 ml de PBS, después de lo cual
el virus fue inyectado en la vena de la cola de ratas macho adultas
Wag/Rij (3 ratas/virus). Como un control, se utilizó el Ad5 que
posee el transgen de la luciferasa. Cuarenta y ocho horas después de
la administración del virus, las ratas fueron sacrificadas, después
de lo cual se disectaron el hígado, el bazo, el pulmón, el riñón, el
corazón y el cerebro. Estos órganos fueron subsecuentemente
mezclados con 1 ml de amortiguador de lisis (1% de Tritón
X-100/PBS) y se desmenuzaron por 30 segundos para
obtener un lisado de proteína. El lisado de proteína fue
subsecuentemente probado para la presencia de la expresión del
transgen (actividad de luciferasa) y se determinó la concentración
de proteína para expresar la actividad de luciferasa por \mug de
proteína. Los resultados, mostrados en la Tabla II, demuestran que
en contraste al adenovirus serotipo 5 control, ninguna de las
quimeras de fibra son dirigidas específicamente al hígado o al bazo.
Este experimento muestra que es posible evitar la captación de los
adenovirus por parte del hígado, al hacer uso de fibras de otros
serotipos. Éste muestra también que la captación por parte del
hígado no está correlacionada con la longitud del tallo de la fibra,
o determinada únicamente por la habilidad de la protuberancia de la
fibra para enlazarse a CAR. Las fibras utilizadas tienen diferentes
longitudes de tallo y, excepto por la fibra 16, son derivadas de los
subgrupos que se sabe tienen una fibra que puede enlazarse a CAR
(Roelvink y colaboradores
1998).
1998).
Se aislaron células endoteliales humanas (HUVEC),
se cultivaron y se caracterizaron como se describe previamente
(Jaffe y colaboradores 1973; Wijnberg y colaboradores 1997). En
resumen, las células fueron cultivadas sobre cajas recubiertas con
gelatina en M199 suplementario con HEPES 20 mM, pH 7,3 (Flow Labs.,
Irvine, Escocia), 10% (v/v) de suero humano (banco de sangre local),
10% (v/v) de suero de ternera neonata inactivado por calor (NBCS)
(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), 150 \mug/ml del factor de
crecimiento de células endoteliales crudo, 5 U/ml de heparina (Leo
Pharmaceutics Products, Weesp, Holanda), penicilina (100
Ul/ml)/estreptomicina (100 \mug/ml) (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania) a 37ºC bajo una atmósfera de 5% (v/v) de
CO_{2}/95% (v/v) de aire. Las células utilizadas por los
experimentos estuvieron entre el pase 1 y 3. En un primer grupo de
experimentos se sembraron 40.000 células HUVEC (un combinado
proveniente de 4 diferentes individuos) en cada pocillo de placas de
24 pocillos, en un volumen total de 200 \mul. Veinticuatro horas
después de la siembra, las células fueron luego lavadas con PBS,
después de lo cual se agregaron a las células 200 \mul de DMEM
suplementado con 2% de FCS. Este medio contenía diversas cantidades
de virus (MOI = 50, 250, 1000, 2500, 5000 y 10000). Los virus
utilizados fueron además del control Ad5, las quimeras de fibras 12,
16, 28 y 40-L (cada infección por triplicado). Dos
horas después de la adición de los virus, el medio se reemplazó con
medio normal. Nuevamente, cuarenta y ocho horas más tarde las
células fueron lavadas y lisadas mediante la adición de 100 \mul
de amortiguador de lisis. En la Figura 7a, los resultados se
muestran sobre la expresión del transgen por microgramo de proteína
total después de la infección de las células HUVEC. Estos resultados
muestran que las quimeras de fibra 12 y 28 son incapaces de infectar
las células HUVEC, que 40-L infecta las HUVECs con
eficiencia similar que el virus Ad5 control y que la fibra quimera
16 infecta las HUVECs significativamente mejor. En un siguiente
grupo de experimentos (n = 8) la quimera de fibra 16 fue comparada
con el vector Ad5.Luc sobre HUVEC para la actividad de luciferasa
después de la transducción con 2500 partículas virales por célula,
de cada virus. Estos experimentos demostraron que la fibra 16
produce, en promedio, actividad de luciferasa incrementada en 8,1
veces (desviación estándar \pm4,6) en comparación con Ad5. En un
siguiente experimento, se agregaron un número igual de partículas
virales a los pocillos de placas de 24 pocillos que contenían
diferentes concentraciones de células HUVEC. Este experimento fue
realizado ya que se sabía que las HUVECs son menos eficientemente
infectadas con el adenovirus serotipo 5 cuando estas células
alcanzan la confluencia. Para este propósito, las HUVECs fueron
sembradas a 22500, 45000, 90000 y 135000 células por pocillo de
placas de 24 pocillos (por triplicado). Veinticuatro horas más tarde
estas células fueron infectadas como se describe anteriormente con
el medio que contenía 4,5 x 10^{8} partículas virales. Los virus
utilizados fueron, además del adenovirus serotipo 5, control, la
fibra quimera 16. El resultado de la expresión del transgen (RLU)
por microgramo de proteína determinado 48 horas después de la
infección (ver figura 7b) muestra que el adenovirus de la fibra 16
quimérica es también mejor, adecuado para infectar las células HUVEC
incluso cuando éstas células son 100% confluentes, lo cual imita
mejor una situación in vivo. Ya que el gen marcador de la
luciferasa no proporciona la información concerniente al número de
células infectadas, se realizó otro experimento con el adenovirus
serotipo 5 y la fibra 16 quimera, ambos llevando una proteína
fluorescente verde (GFP) como un gen marcador. Esta expresión de
proteína puede ser detectada utilizando un citómetro de flujo el
cual realiza la información respecto al porcentaje de células
transducidas, así como la fluorescencia por célula. En este
experimento las células fueron sembradas a una concentración de
40000 células por pocillo y fueron expuestas a virus por 2 horas. El
virus utilizado fue Ad5.GFP (8,4 x 10^{11} vp/ml) y Ad5.Fib16.GFP
(5,1 x 10^{11} vp/ml). Las células fueron expuestas a una
concentración viral de 500 partículas de virus por célula. El
análisis citométrico de flujo, 48 horas después de la exposición al
virus, demostró que el virus de la fibra 16 da más altos niveles de
expresión del transgen por célula, ya que la fluorescencia media, un
parámetro que identifica la cantidad de expresión de GFP por célula,
es más alta con la fibra 16 en comparación a Ad5 (Figura 7c). Estos
resultados son de este modo consistentes y demuestran que el virus
quimérico de la fibra 16 es mejor, adecuado para infectar células
endoteliales primarias humanas, en comparación al Ad5.
Células del músculo liso fueron aisladas después
del aislamiento de EC (Weinberg y colaboradores 1997). Las venas
fueron incubadas con medio (DMEM) suplementado con
penicilina/estreptomicina que contenía 0,075% (p/v) de colagenasa
(Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ, E.U.A). Después de 45
minutos el medio de incubación que contenía las células desacopladas
se lavó a chorro desde las venas. Las células fueron lavadas y
cultivadas sobre cajas recubiertas con gelatina en medio de cultivo
suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 10% de suero humano
a 37ºC bajo una atmósfera de 5% (v/v) de CO_{2}/95% (v/v) de aire.
Las células utilizadas para los experimentos estuvieron entre el
pase 3-6. Se probó primeramente el panel de virus de
fibra quimérica versus el control de adenovirus serotipo 5, para la
infección de células del músculo liso humano. Para este propósito,
se sembraron 40000 células del músculo liso de la vena umbilical
humana (HUVsmc) en los pocillos de placa de 24 pocillos en un
volumen total de 200 \mul. Veinticuatro horas después de la
siembra, las células se lavaron con PBS después de lo cual se
agregaron 200 \mul DMEM suplementado con 2% de FCS a las células.
Este medio contenía diversas cantidades de virus (MOI = 50, 250,
1250, 2500 y 5000). Los virus utilizados fueron además del control
Ad5, las quimeras de fibra 12, 16, 28 y 40-L (cada
infección por triplicado). Dos horas después de la adición del
virus, el medio se reemplazó con medio normal. Nuevamente, cuarenta
y ocho horas después las células fueron lavadas y usadas mediante la
adición de 100 \mul de amortiguador de lisis. En la Figura 8a, se
muestran los resultados de la expresión del transgen por microgramo
de proteína total después de la infección de las células HUVsmc.
Estos resultados muestran que las quimeras de fibras 12 y 28 son
incapaces de infectar las células HUVsmc, que 40-L
infecta HUVsmc con similar eficiencia que el virus Ad5 control y que
la fibra quimera 16 infecta HUVsmc significativamente mejor. En un
siguiente grupo de experimentos, las células del músculo liso
derivadas de la vena safena, arteria ilíaca, arteria mamaria
interior izquierda (LIMA) y la aorta, fueron probadas para la
infección con la fibra 16 quimera y Ad5 (ambas poseyendo la
luciferasa como un gen marcador). Estos experimentos (n = 11)
demostraron que, en promedio, la fibra 16 quimera produjo niveles
incrementados en 61,4 veces en la actividad de luciferasa
(desviación estándar (SD \pm 54,8) en comparación al Ad5. La alta
desviación estándar (SD) es obtenida debido al hallazgo de que los
adenovirus utilizados varían en su eficiencia de infección de SMC
derivado de diferentes vasos humanos. En un siguiente experimento,
se agregó un número igual de partículas virales a los pocillos de
placas de 24 pocillos que contenían diferentes concentraciones de
células HUVsmc en confluencia. Para este propósito, se sembraron las
células HUVsmc a 10000, 20000, 40000, 60000 y 80000 células por
pocillo de placas de 24 pocillos (por triplicado). Veinticuatro
horas más tarde estas células fueron infectadas como se describe
anteriormente con el medio que contenía 2 x 10^{8} partículas
virales. Los virus utilizados fueron, además del control adenovirus
serotipo 5, la fibra quimera 16. El resultado de la expresión del
transgen (RLU) por microgramo de proteína determinado 48 horas
después de la infección (ver figura 8b) , muestra que el adenovirus
de la fibra 16 quimérica es mejor, adecuado para infectar células
del músculo liso incluso cuando estas células son 100% confluentes,
lo cual imita o copia mejor una situación
in vivo.
in vivo.
Para identificar el número de SMCs transducidas
con la fibra 16 quimera y Ad5, se realizaron experimentos de
transducción con Ad5.GFP y Ad5Fib16.GFP (lotes idénticos a los
utilizados para las infecciones con EC). SMC de vena umbilical
humana fueron sembradas a una concentración de 60000 células por
pocillo, en placas de 24 pocillos y expuestas por 2 horas a 500 ó
5000 partículas virales por célula de Ad5.GFP o Ad5Fib16.GFP.
Cuarenta y ocho horas después de la exposición, las células fueron
cosechadas y analizadas utilizando un citómetro de flujo. Los
resultados obtenidos muestran que la fibra 16 mutante produce
aproximadamente 10 veces mayor transducción de SMC, ya que la
expresión de GFP medida después de la transducción con 5000
partículas virales de Ad5.GFP es igual a la expresión de GFP después
de la transducción con 500 partículas virales por célula de la fibra
16 quimera
(Figura 8c).
(Figura 8c).
El tallo y la protuberancia de la fibra 16 son
derivados de adenovirus serotipo 16 los cuales, como se describió al
principio, pertenecen al subgrupo B. Con base en los ensayos de
hemaglutinación, los patrones de restricción de ADN y los ensayos de
neutralización de los virus del subgrupo B han sido además
subdivididos en el subgrupo Bl y B2 (Wadell y colaboradores 1984).
Los miembros del subgrupo B1 incluyen los serotipos 3, 7, 16, 21 y
51. Los miembros del subgrupo B2 incluyen 11, 14, 34 y 35. Para
probar si la infección incrementada de las células del músculo liso
es un tráfico de todas las fibras derivadas del subgrupo B o
específicas para una o más moléculas de fibras del subgrupo B, se
compararon la fibra 16 y la fibra 51 (ambas del subgrupo B1) con la
fibra 11 y la fibra 35 (ambas del subgrupo B2). Para este propósito
se infectaron células HUVsmc con cantidades cada vez mayores de
partículas virales por célula (156, 312, 625, 1250, 2500, 5000). Los
mutantes de fibra poseen todos el gen marcador de la luciferasa
(Ad5Fib11.Luc: 1,1 x 10^{12} vp/ml; Ad5Fib35Luc: 1,4 x 10^{12}
vp/ml; Ad5Fib51Luc: 1,0 x 10^{12} vp/ml). Con base en la actividad
de luciferasa medida y mostrada en la Figura 8d, la infección
eficiente de SMC no es un tráfico general de todas las moléculas de
fibra del subgrupo B. Claramente, la fibra 16 y la fibra 11 son
mejores, adecuadas para la infección de SMC que la fibra 35 y la
fibra 51. No obstante, todos los mutantes de fibra del subgrupo B
probados infectan SMC mejor, en comparación a Ad5.
Se identificó enseguida si la diferencia
observada en la transducción de EC y SMC utilizando la quimera de la
fibra 16 o el Ad5 puede también ser demostrada en experimentos de
cultivo de órganos. Hasta aquí, nos hemos enfocado a los siguientes
tejidos:
1) vena safena humana: la vena utilizada en
aproximadamente 80% de todos los procedimientos clínicos de injerto
de vena.
2) pericardio/epicardio humano: para la
distribución de adenovirus recombinantes al fluido pericardial, lo
cual después de la infección de las células del pericardio o del
epicardio producen la proteína de interés proveniente del transgen
llevado por el adenovirus.
3) arterias coronarias humanas: para la
angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) para prevenir
la restenosis. De las arterias coronarias nos enfocamos a la arteria
izquierda descendente (LAD) y a la arteria coronaria derecha
(RCA).
Las partes de una vena safena humana colocada
después de una cirugía de injerto de vena se empalmaron en piezas de
aproximadamente 0,5 cm. Estas piezas (n = 3) fueron subsecuentemente
cultivadas por 2 horas en 200 ml de 5 x 10^{10} partículas virales
por ml. Después de dos horas de la exposición al virus, las piezas
fueron lavadas con PBS y cultivadas por otras 48 horas a 37ºC en una
incubadora de CO_{2} al 10%. Las piezas fueron luego lavadas,
fijadas y teñidas para la expresión del transgen LacZ. Los virus
fueron Ad5.LacZ (2,2 x 10^{12} vp/ml), la fibra 16 quimera
Ad5Fib16.LacZ (5,2 x 10^{11} vp/ml y una fibra 51 quimera:
Ad5Fib51.LacZ (2,1 x 10^{12} vp/ml). Las piezas de vena safena
fueron macroscópicamente fotografiadas utilizando una cámara
digital. Con base en la expresión del transgen LacZ obtenido después
de 2 horas de la exposición al virus sobre empalmes de vena safena,
los virus quiméricos de la fibra 16 y la fibra 51 dan mayor
infección, ya que se observa mucho más tinción azul utilizando estos
virus en comparación a Ad5.LacZ (Figura 8e). Se realizaron
experimentos idénticos como se describen sobre la vena safena, con
el pericardio humano y las arterias coronarias humanas: RCA y LAD.
Los resultados de estos experimentos (Figuras
8f-8g-8h respectivamente) junto con
los experimentos realizados sobre células primarias, confirmaron la
superioridad de los mutantes de la fibra 16 y 51 en comparación a
Ad5 en la infección de tejidos cardiovasculares humanos.
A partir de los resultados anteriormente
descritos es claro que el adenovirus quimérico con el tallo y la
protuberancia proveniente de la fibra 16, es muy adecuado para
infectar células endoteliales y células del músculo liso. De este
modo, al cambiar la proteína de fibra sobre los virus Ad5 se hizo
posible el incrementar la infección de células que son pobremente
infectadas por Ad5. La diferencia entre Ad5 y Ad5Fib16, aunque
significativas sobre ambos tipos celulares, es menos impactante
sobre las células endoteliales en comparación a las células del
músculo liso. Esto puede reflejar diferencias en la expresión del
receptor. Por ejemplo, HUVsmc expresa significativamente más
integrinas \alpha_{v}\beta5 que HUVEC (ver más adelante).
Alternativamente, esta diferencia puede ser debida a diferencias en
la expresión del receptor de la fibra 16. Ad5.LucFib16 infecta
células de músculo liso de vena umbilical, aproximadamente 8 veces
mejor que las células endoteliales de vena umbilical, mientras que
en el caso de los virus Ad5.Luc las células endoteliales son
infectadas mejor que las células del músculo liso. Para probar si la
infección por Ad5 correlacionaba con la expresión del receptor de
estas células, se evaluó la presencia de CAR
\alpha_{v}-integrinas en un citómetro de flujo.
Para este propósito 1x10^{5} células HUVEC o HUVsmc fueron lavadas
una vez con PBS/0,5% de BSA, después de lo cual las células fueron
concentradas mediante centrifugación por 5 minutos a 1750 rpm a
temperatura ambiente. Subsecuentemente, se agregaron al botón
celular 10 \mul de un anticuerpo \alpha_{v}\beta3 diluido
100 veces (Mab 1961, Brunswick chemie, Amsterdam, Holanda), un
anticuerpo \alpha_{v}\beta5 diluido a 100 veces (anticuerpo
Mab 1976, Brunswick chemie, Amsterdam, Holanda), o anticuerpo CAR
diluido a 2000 veces que fue una donación del Dr. Bergelson, Harvard
Medical School, Boston, E.U.A (Hsu y colaboradores) después de lo
cual las células fueron incubadas por 30 minutos a 4ºC en un
ambiente obscuro. Después de esta incubación, las células fueron
lavadas dos veces con PBS/0,5% de BSA y nuevamente concentradas
mediante centrifugación por 5 minutos a 1750 rpm a temperatura
ambiente. Para marcar las células, se agregaron 10 ml de IgG1 de
rata anti-ratón marcado con ficoeritrina (PE) al
botón celular, después de lo cual las células fueron nuevamente
incubadas por 30 minutos a 4ºC en un ambiente obscuro. Finalmente,
las células fueron lavadas dos veces con PBS/0,5% de BSA y
analizadas sobre un citómetro de flujo. Los resultados de estos
experimentos se muestran en la Tabla III. A partir de los resultados
se puede concluir que HUVsmc no expresa niveles detectables de CAR,
confirmando que estas células son diferentes para transducir con un
adenovirus que entra a las células vía el receptor CAR.
Como un control para los experimentos realizados
sobre células endoteliales y células del músculo liso, se infectaron
células A549 para establecer si una cantidad igual de partículas
virales de diferentes adenovirus quiméricos muestran diferencias
significativas en la expresión del transgen sobre líneas celulares
que son fácilmente infectadas por el adenovirus. Esto es para
investigar si las diferencias observadas en la eficiencia de
infección sobre células endoteliales y del músculo liso son
específicas del tipo celular. Para este propósito, se sembraron
10^{5} células A549 en placas de 24 pocillos, en un volumen de 200
\mul. Dos horas después de la siembra, el medio fue reemplazado
con medio que contenía cantidades diferentes de partículas de fibra
quimera 5, 12, 16, ó 40-L (MOI = 0, 5, 10, 25, 100,
500). Veinticuatro horas después de la adición del virus, las
células fueron lavadas una vez con PBS después de lo cual las
células fueron usadas por la adición de 100 \mul de amortiguador
de lisis a cada pocillo (1% de Tritón X-100 en PBS)
después de lo cual se determinó la expresión del transgen (actividad
de luciferasa) y la concentración de la proteína. Subsecuentemente,
la actividad de luciferasa por \mug de proteína fue calculada. Los
datos, mostrados en la tabla IV, demuestran que los virus Ad5.Luc
infectan las células A549 de manera más eficiente, mientras que la
eficiencia de infección de Ad5LucFib16 o
Ad5LucFib40-L es unas pocas veces más baja. Esto
significa que la infección eficiente de las células endoteliales y
especialmente las células del músculo liso, es debida a diferencias
en el enlace de los virus a estas células y no a la cantidad de
virus o a la calidad de los virus utilizados.
| Serotipo | Oligonucleótido de cola | Oligonucleótido de protuberancia |
| 4 | A | 1 |
| 8 | B | 2 |
| 9 | B | 2 |
| 12 | E | 3 |
| 16 | C | 4 |
| 19p | B | 2 |
| 28 | B | 2 |
| 32 | B | 2 |
| 36 | B | 2 |
| 37 | B | 2 |
| 40-1 | D | 5 |
| 40-2 | D | 6 |
| 41-s | D | 5 |
| 41-1 | D | 7 |
| 49 | B | 2 |
| 50 | B | 2 |
| 51 | C | 8 |
| A: | 5'- CCC GTC TAT CCA TAT GAT GCA GAC AAC GAC CGA CC- 3' |
| B: | 5'- CCC GTC TAC CCA TAT GGC TAC GCG CGG -3' |
| C: | 5'- CCK GTS TAC CCA TAT GAA GAT GAA AGC- 3' |
| D: | 5'- CCC GTC TAC CCA TAT GAC ACC TYC TCA ACT C- 3' |
| E: | 5'- CCC GTT TAC CCA TAT GAC CCA TTT GAC ACA TCA GAC- 3' |
| 1: | 5'- CCG ATG CAT TTA TTG TTG GGC TAT ATA GGA - 3' |
| 2: | 5'- CCG ATG CAT TYA TTC TTG GGC RAT ATA GGA - 3' |
| 3: | 5'- CCG ATG CAT TTA TTC TTG GGR AAT GTA WGA AAA GGA - 3' |
| 4: | 5'- CCG ATG CAT TCA GTC ATC TTC TCT GAT ATA - 3' |
| 5: | 5'- CCG ATG CAT TTA TTG TTC AGT TAT GTA GCA - 3' |
| 6: | 5'- GCC ATG CAT TTA TTG TTC TGT TAC ATA AGA - 3' |
| 7: | 5'- CCG TTA ATT AAG CCC TTA TTG TTC TGT TAC ATA AGA A - 3' |
| 8: | 5'- CCG ATG CAT TCA GTC ATC YTC TWT AAT ATA - 3' |
| Órgano | Control Ad5 | Fib 12 | Fib 16 | Fib 28 | Fib 40-L |
| Hígado | 740045 | 458 | 8844 | 419 | 2033 |
| Bazo | 105432 | 931 | 3442 | 592 | 16107 |
| Pulmón | 428 | 315 | 334 | 316 | 424 |
| Riñón | 254 | 142 | 190 | 209 | 224 |
| Corazón | 474 | 473 | 276 | 304 | 302 |
| Cerebro | 291 | 318 | 294 | 323 | 257 |
| Línea celular | \alpha, \beta3 | \alpha, \beta5 | CAR |
| HUVEC 70% | 98,3% | 18,9% | 18,1% |
| HUVEC 10 0% | 97,2% | 10,5% | 7,2% |
| HUVsmc 70% | 95,5% | 76, 6% | 0,3% |
| HUVsmc 100% | 92,2% | 66,5% | 0,3% |
| PER.C6 | 7,8% | 16,8% | 99, 6% |
| MOI (VP/Célula) | Control Ad5 | Fibra 12 | Fibra 16 | Fibra 40-L |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | 1025 | 46 | 661 | 443 |
| 10 | 1982 | 183 | 1704 | 843 |
| 25 | 4840 | 200 | 3274 | 2614 |
| 100 | 21875 | 1216 | 13432 | 11907 |
| 500 | 203834 | 3296 | 93163 | 71433 |
Arnberg N., Mei Y. y Wadell
G., 1997, Fiber Genes of adenovirus with tropism for the eye
and the genital tract. Virology 227:
239-422.
Bargelson, J. M., Cunningham, J.A.,
Droguett, G., Kurt-Jones, S.A.,
Krithivas, A., Hong, J.S. Horwitz, M.S.,
Crowell, R. L. And Finberg, R.W. (1997)
Isolation of a common receptor for coxsackie B virus and adenovirus
2 y 5. Science 275: 1320-1323.
Bout A. (1997) Gene therapy,
p. 167-182. In: D.J.A. Crommelin and R.D. Sindelar
(ed.) Pharmaceutical Biotechnology, Harwood Academic
Publisbners.
Bout, A. (1996) Prospects for human
gene therapy. Eur. J. Drug Met. And Pharma. 2,
175-179.
Blaese, M., Blankenstein, T.,
Brenner, M., Cohen-Hagenauer, O.,
Gansbacher, B., Russel, S., Sorrentino, B. and
Velu, T. (1995) Cáncer Gene Ther. 2:
291-297.
Brody, S.L. and Crystal, R.G.
(1994) Adenovirus mediated in vivo gene transfer.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 716:90-101.
Carter, A.J., Laired, J.R.,
Farb, A., Kufs, W., Wortham, D.C. and
Virmani, R. (1994) Morphologic characteristics of
lesion formation and time course of smooth muscle cell proliferation
in a porcine proliferative restenosis model. J. Am. Coll.
Cardiol. 24: 1398-1405.
Chroboczek J., Ruigrok R.W.H. and
Cusack S., 1995. Adenovirus fiber, p.
163-200. In: W. Doerfler and P. Bohm (ed). The
molecular repertoire of adenoviruses, I.
Springer-Verlag, Berlin.
Defer C, Belin M.,
Caillet-Boudin M. and Boulanger P.,
1990. Human adenovirus-host cell
interactions; comparative study with members of subgroup B and C.
Journal of Virology 64 (8): 3661-3673.
Fallaux, F.J. Bout, A, van der
Velde, I et al. New helper cells and matched
El-deleted adenovirus vectors prevent generation of
replication competent adenovirus. Human Gene Therapy, 9
(1998), p 1909-1917.
Francki, R.I.B., Fauquet, C.M.,
Knudson, D.L. and Brown, F. (1991)
Classification and nomenclature of viruses. Pifth report of the
international Committee on taxonomy of viruses. Aren. Virol.
Suppl. 2: 140-144.
Gall J.,
Kass-Eisler A., Leinwand L. And
Falck-Pedersen E. (1996) Adenovirus
type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor
tropism without affecting primary inmune neutralization epitope.
Journal of Virology 70 (4): 2116-2123.
Greber, U.F., Willets, M.,
Webster, P., and Helenius, A. (1993). Stepwise
dismanteling of adenovirus 2 during entry into cells. Cell
75: 477-486.
Hynes, R.O. (1992) Integrins:
versatility, modulation and signalling in cell adhesion. Cell
69: 11-25.
Herz, J. And Gerard, R.D.
(1993) Adenovirus-mediated transfer of low
density lipoprotein receptor gene acutely accelerates cholesterol
clearence in normal mice. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 96:
2812-2816.
Hierholzer, J.C. (1992) Adenovirus
in the immunocompromised host. Clin. Microbiol Rev 5,
262-274.
Hierholzer, J.C., Wigand, R.,
Anderson, L.J., Adrian, T., and Gold, J.W.M.
(1988) Adenovirus from patients with AIDS: a plethora of
serotypes and a description of five new serotypes of subgenus D
(types 43-47). J. Infect. Dis. 158,
804-813.
Hong, S.S., Karayan, L,
Tournier, J., Curiel, D.T. and Boulanger, P.A.
(1997) Adenovirus type 5 fiber knob binds to MHC class I
\alpha2 domain at the surface of human epithelial and B
lymphoblastoid cells. EMBO J. 16:
2294-2306.
Hsu, K.H.,
Lonberg-Holm, K., Alstein, B. and
Crowell, R.L. (1988) A monoclonal antibody specific
for the cellular receptor for the group B coxaackieviruses. J.
Virol 62(5): 1647-1652.
Huard, J., Lochmuller, H.,
Acsadi, G., Jani. A., Massie, B. and
Karpati, G. (1995) The route of administration is a
major determinant of the transducction efficiency of rat tissues by
adenoviral recombinants. Gene Ther. 2:
107-115.
Ishibashi, M. and Yasue, H.
(1984) The adenoviruses, H.S. Ginsberg, ed., Plenum
Press, Londen, New York. Capítulo 12,
497-561.
Jaffe, E.A., Nachman, R.L.,
Becker, C.G., Minick, C.R. (1973) Culture of
endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by
morphologic and immunologic criteria, J. Clin. Invest. 52,
2745-2756.
Kass-Eisler, A.,
Falck-Pederson, E., Elfenbein, D.H.,
Alvira, M., Buttrick, P.M. and Leinwand, L.A.
(1994) The impact of developmental stage, route of
administration and the inmune system on
adenovuris-mediated gene transfer. Gene Ther.
1.
Khoo, S.H., Bailey, A.S., De
Jong, J.C., and Mandal, B.K. (1995). Adenovirus
infections in human immunodeficiency virus-positive
patients: Clinical features and molecular epidemiology, J.
Infect. Dis 172, 629-637.
Kidd, A.H., Chroboczek, J.,
Cusack, S., and Ruigrok, R.W. (1993) Adenovirus
type 40 virions contain two distinct fibers. Virology 192,
73-84.
Krasnykh V.N., Mikheeva G.V.,
Douglas J.T. and Curiel D.T. (1996) Generation
of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering
viral tropism. J. Virol. 70(10):
6839-6446.
Krasnykh V.N., Dmitriev I.,
Mikheeva G., Miller C.R., Belousova N. And
Curiel D.T. (1998) Characterization of an adenovirus
vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of
the fiber knob, J. Virol. 72 (3) :
1844-1852.
Law, L., Chillon, M., Bosch,
A., Armentano, D., Welsh, M.J. and Davison,
B.L. (1998) Infection of primary CNS cells by different
adenoviral serotypes: Searching for a more efficient vector.
Abstract 1º Annual Meeting American Society of Gene Therapy,
Seattle, Washington.
Leppard, K.N. (1997) E4 gene
function in adenovirus, adenovirus vector and
adeno-associated virus infections. J. Gen.
Virol. 78: 2131-2138.
Lloyd Jones, D.M. and Bloch, K.D.
(1996) The vascular biology of nitric oxide and its role in
atherogenesis. Annu. Rev. Med. 47:
365-375.
Morgan, C, Rozenkrantz, H.S., and
Mednis, B. (1996) Structure and development of viruses
as observed in the electron microscope. X. Entry and uncoating of
adenovirus. J. Virol 4, 777-796.
Roelvink, P.W., Kovesdi, I. and
Wickham, T.J. (1996) Comparative analysis of
adenovirus fiber-cell interaction: Adenovirus type 2
(Ad2) and Ad9 utilize the same cellular fiber receptor but use
different binding stratagies for attachemnt. J. Virol. 70:
7614-7621.
Roelvink. P.W., Lizonova, A.,
Lee, J.G.M., Li, Y., Bergelson, J.M.,
Finberg, R.W., Brough, D.E., Kovesdi, I. and
Kickham, T.J. (1998) The
coxsackie-adenovirus receptor protein can function
as a cellular attachment protein for adenovirus serotypes from
subgroups A, C, D, E, and F. J. Virol, 72:
7909-7915.
Rogers, B.E., Douglas J.T.,
Ahlem, C, Buchsabum, D.J., Frincke, J. and
Curiel, D.T. (1997) Use of a novel
cross-linking method to modify adenovirus tropism.
Gene Ther. 4: 1387-1392.
Schulick, A.H., Vassalli, G.,
Dunn, P.F., Dong, G., Rade J.J.,
Zamarron, C. and Dichek, D.A. (1997).
Established immunity precludes adenovirus-mediated
gene transfer in rat Carotid arteries.
Schnurr, D and Dondero, M.E.
(1993) Two new candidate adenovirus serotypes
Intervirol. 36, 79-83.
Schwartz, R.S., Edwards, W.D.,
Huber, K.C., Antoniudes, L.C. Bailey, K.R.,
Camrud, A.R., Jorgenson, M.A. and Holmes, D.R.
Jr. (1993) Coronary restenosis: Prospects for solution and
new perspectives from a porcine model. Mayo Clin. Proc. 68:
54-62.
Shi, Y., Pieniek, M., Fard,
A., O'Brien, J., Mannion, J.D. and Zalewski, A.
(1996) Adventitial remodelling after coronary arterial
injury. Circulation 93: 340-348.
Shabram, P.W., Goroux, D.D.,
Goudreau, A.M., Gregory, R.J., Horn, M.T.,
Huyghe, B.G.,. Liu, X., Nunnally, M.H.,
Sugarman, B.J. and Sutjipto, S. (1997)
Analytical anion-exchange HPLC of recombinant
type-5 adenoviral particles. Hum. Gene Ther.
8(4): 453-465.
Signas, G., Akusjarvi, G., and
Petterson, U. (1985). Adenovirus 3 fiberpolypeptide
gene: Complications for the structure of the fiber protein. J.
Virol. 53, 672-678.
Stevenson S.C., Rollence M.,
White B., Weaver L. And McClelland A.,
(1995) Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to tow
different cellular receptors vía the fiber head domain. J.
Virol 69(5): 2850-2857.
Stevenson S.C., Rollence M.,
Marshall-Neff J. And McClelland A.
(1997) Selective targenting of human cells by a chimaeric
adenovirus vector containing a modified fiber protein. J.
Virology 71(6): 4782-4790.
Stouten, P.W.F., Sander, C,
Ruigrok, R.W.H., and Cusack, S. (1992) New
triple helical model for the shaft of the adenovirus fiber. J.
Mol. Biol. 226, 1073-1084.
Svensson, V. and Persson, R.
(1984). Entry of adenovirus 2 into Hela cells. J.
Virol. 51. 687-694.
Van der Vliet, P.C. (1995)
Adenovirus DNA replication In: W. Doerfler and P. Bóhm (eds.), The
molecular repertoire of adenovirus II.
Springer-Verlag, Berlín.
Varga, M.J., Weibull, C, and
Everitt, E. (1991). Infectious entry pathway of
adenovirus type 2. J. Virol 65,
6061-6070.
Varenne, O., Pislaru, S., H.,Van
Pelt, N., Gerard, R.D., Zoldhelyi, P., Van de
Werf, F., Collen, D. and Janssens, S.P.
(1998) Local adenovirus-mediated transfer of
human endothelial nitric oxide synthetase reduces luminal narrowing
after coronary angioplasty in pigs. Circulation 98:
919-926.
Wadell G (1984) Molecular
Epidemiology of human adenoviruses Curr. Top. Microbiol.
Immunol. 110, 191-220.
Wickham T. J., Carrion M.E. and
Kovesdi I., 1995. Targeting of adenovirus pentón base
to new receptors through replacement of its RGD motif with other
receptor-specific peptide motifs. Gene
Therapy 2: 750-756.
Wickham T.J., Segal, D.M.,
Roelvink, P.W., Carrion M.E., Lizonova, A.,
Lee, G-M., and Kovesdi, I.
(1996) Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and
smooth muscle cells by using bispecific antibodies. J. Virol.
70 (10), 6831-6838.
Wickham, T.J., Mathias, P.,
Cherish, D.A., and Nemerow, G.R. (1993)
Integrins \alpha_{v}\beta3 and \alpha_{v}\beta5 promote
adenovirus internalization but not virus attachment. Cell 73,
309-319.
Wijnberg, M.J., Quax, P.H.A.,
Nieuwenbroek, N.M.E., Verheijen J.H. (1997).
The migration of human smooth muscle cells in vitro is
mediated by plasminogen activation and can be inhibited by
alpha(2)- macro globulin receptor associated protein.
Thromb. And Haemostas. 78, 880-886.
Wold, W.S., Tollefson, A.E. and
Hermiston, T.W. (1995) E3 transcription unit of
adenovirus In: W. Doerfler and P. Bohm (eds.), The molecular
repertoire of adenoviruses I.
Springer-Verlag, Berlín.
Zabner, J., Armentano, D.,
Chillón, M., Wadsworth, S.C. and Welsh, M.J.
(1998) Type 17 fiber enhances gene transfer. Resumen 1^{a}
Junta Anual de la Sociedad Americana de Terapia Génica, Seattle,
Washington.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el
mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica
la citada invención, es el que resulta claro de la presente
descripción de la invención.
Claims (10)
1. Un vector adenoviral recombinante de un
serotipo del subgrupo C, que se ha proporcionado con al menos un
tropismo de tejido para células de músculo liso y/o células
endoteliales y que se ha privado de al menos un tropismo de tejido
para células hepáticas, donde dicho vector adenoviral comprende una
cápsida que comprende un fragmento determinante de tropismo de una
proteína de fibra de un adenovirus de un serotipo del subgrupo B, y
donde dicho serotipo de adenovirus del subgrupo B se selecciona
entre el grupo compuesto por; adenovirus 11, adenovirus 16,
adenovirus 35 y adenovirus 51.
2. Un vector adenoviral recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1, que comprende además un ácido nucleico
adenoviral de un adenovirus del subgrupo C, comprendiendo dicho
ácido nucleico una secuencia que codifica una proteína de fibra,
comprendiendo dicha proteína de fibra al menos un fragmento
determinante de tropismo de tejido de una proteína de fibra de un
adenovirus de un serotipo del subgrupo B, y donde dicho serotipo de
adenovirus del subgrupo B se selecciona entre el grupo compuesto
por: adenovirus 11, adenovirus 16, adenovirus 35 y adenovirus
51.
3. Un vector adenoviral recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2, donde dicho serotipo del subgrupo C es
adenovirus 5.
4. Un vector adenoviral recombinante de acuerdo
con la reivindicación 3, donde dicho ácido nucleico adenoviral se
modifica de tal forma que la capacidad de dicho ácido nucleico
adenoviral para replicarse en una célula diana se ha reducido o
impedido.
5. Un vector adenoviral recombinante de acuerdo
con las reivindicaciones 3 ó 4, que comprende además al menos un
ácido nucleico que no es de adenovirus.
6. Un vector adenoviral recombinante de acuerdo
con la reivindicación 5, donde al menos uno de dichos ácidos
nucleicos que no son de adenovirus es un gen seleccionado entre el
grupo de genes que codifican: una apoliproteína, una óxido nítrico
sintasa, una timidina quinasa del virus del herpes simple, una
interleuquina-3, una
interleuquina-1alfa, una proteína
(anti)angiogénesis tal como la angioestatina, una proteína
anti-proliferación, una proteína
anti-migración de células de músculo liso, un factor
de crecimiento del endotelio vascular (VGEF), un factor de
crecimiento de fibroblastos básico, un factor 1alfa inducible por
hipoxia (HIF-1alfa) o un PAI-1.
7. El uso de un vector adenoviral recombinante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso
como un agente farmacéutico.
8. Construcción pBr/Ad.BamR\DeltaFib, que
comprende las secuencias 21562-31094 y
32794-35938 del adenovirus 5, donde dicha
construcción carece de los nucleótidos 31095-32793
del adenovirus 5 que comprende el ácido nucleico que codifica al
menos la parte determinante de tropismo de tejido de la proteína de
fibra y que comprende además un ácido nucleico localizado entre la
posición 31094 y 32794 del adenovirus 5, codificando dicho ácido
nucleico al menos un fragmento determinante de tropismo de tejido de
la proteína de fibra del adenovirus 16, 11, 35 ó 51.
9. Construcción pBr/Ad BamR.pac/Fib16, que
comprende las secuencias 21562-31094 y
32794-35938 del adenovirus 5, que comprende un ácido
nucleico localizado entre la posición 31094 y 32794 del adenovirus
5, codificando dicho ácido nucleico al menos un fragmento
determinante de tropismo de tejido de la proteína de fibra del
adenovirus 16, y que comprende además un sólo sitio de restricción
pacI cerca de la repetición terminal invertida derecha del
adenovirus 5, en la estructura de secuencia no adenoviral de dicha
construcción.
10. El uso de una construcción de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9 para la generación de un
vector adenoviral recombinante de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98203921 | 1998-11-20 | ||
| EP98203921 | 1998-11-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2244145T3 true ES2244145T3 (es) | 2005-12-01 |
Family
ID=8234363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99203878T Expired - Lifetime ES2244145T3 (es) | 1998-11-20 | 1999-11-19 | Vectores de aporte de genes provistos de un tropismo para las celulas de los musculos lisos y/o las celulas endoteliales. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4683682B2 (es) |
| AT (1) | ATE296894T1 (es) |
| AU (1) | AU770780B2 (es) |
| CA (1) | CA2318492C (es) |
| DE (1) | DE69925567T2 (es) |
| ES (1) | ES2244145T3 (es) |
| IL (1) | IL133032A (es) |
| MX (1) | MXPA99010682A (es) |
| NO (1) | NO995697L (es) |
| NZ (1) | NZ501214A (es) |
| WO (1) | WO2000031285A1 (es) |
| ZA (1) | ZA997213B (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6929946B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| ATE403006T1 (de) * | 1999-03-04 | 2008-08-15 | Crucell Holland Bv | Verwendung eines adenovirusvektors zur transduktion von synovialen zellen |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| CA2410665C (en) | 2000-05-31 | 2017-11-07 | University Of Saskatchewan | Modified bovine adenovirus having altered tropism |
| WO2002024730A2 (en) * | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Crucell Holland B.V. | Transduction of dendritic cells using adenoviral vectors |
| US6905678B2 (en) * | 2001-07-07 | 2005-06-14 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors with cell type specificity for mesenchymal stem cells |
| EP1482052A1 (en) * | 2003-05-27 | 2004-12-01 | Cytos Biotechnology AG | Modified polypeptides for targeting cell-entry of the adenoviruses of subtype B |
| NZ759833A (en) | 2017-05-26 | 2023-01-27 | Epicentrx Inc | Recombinant adenoviruses carrying transgenes |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770442A (en) * | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| CA2222140C (en) * | 1995-06-15 | 2010-11-23 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| JP3420586B2 (ja) * | 1995-11-28 | 2003-06-23 | ジェンベク、インコーポレイティッド | 細胞への遣伝子導入のためのベクターおよび方法 |
| US5877011A (en) * | 1996-11-20 | 1999-03-02 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors |
| FR2758822B1 (fr) * | 1997-01-30 | 1999-07-02 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'un polypeptide a titre de recepteur cellulaire des adenovirus |
| FR2761689B1 (fr) * | 1997-04-02 | 1999-06-25 | Transgene Sa | Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles |
-
1999
- 1999-11-18 IL IL133032A patent/IL133032A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-11-19 DE DE69925567T patent/DE69925567T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-19 ZA ZA9907213A patent/ZA997213B/xx unknown
- 1999-11-19 MX MXPA99010682A patent/MXPA99010682A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-11-19 ES ES99203878T patent/ES2244145T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-19 NO NO995697A patent/NO995697L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-11-19 AT AT99203878T patent/ATE296894T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-11-22 NZ NZ501214A patent/NZ501214A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-11-22 AU AU59600/99A patent/AU770780B2/en not_active Ceased
- 1999-11-22 JP JP33203399A patent/JP4683682B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-22 CA CA2318492A patent/CA2318492C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-22 WO PCT/NL1999/000717 patent/WO2000031285A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO995697L (no) | 2000-05-22 |
| AU5960099A (en) | 2000-05-25 |
| IL133032A0 (en) | 2001-03-19 |
| MXPA99010682A (es) | 2002-03-08 |
| WO2000031285A1 (en) | 2000-06-02 |
| AU770780B2 (en) | 2004-03-04 |
| ZA997213B (en) | 2000-05-22 |
| IL133032A (en) | 2007-06-03 |
| CA2318492C (en) | 2010-05-11 |
| JP4683682B2 (ja) | 2011-05-18 |
| ATE296894T1 (de) | 2005-06-15 |
| CA2318492A1 (en) | 2000-06-02 |
| JP2000157289A (ja) | 2000-06-13 |
| NO995697D0 (no) | 1999-11-19 |
| NZ501214A (en) | 2002-02-01 |
| DE69925567T2 (de) | 2006-05-04 |
| DE69925567D1 (de) | 2005-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7968087B2 (en) | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells | |
| ES2256302T3 (es) | Vectores adenovirales para la transduccion de condrocitos. | |
| ES2263250T3 (es) | Un adenovirus quimerico. | |
| JP4683727B2 (ja) | 線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞の形質導入のための手段と方法 | |
| US20050181507A1 (en) | Gene delivery vectors with cell type specificity for mesenchymal stem cells | |
| AU2002315947A1 (en) | Adenoviral vectors with cell type specificity for mesenchymal cells | |
| EP1020529B1 (en) | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells | |
| US7238528B2 (en) | Means and methods for fibroblast-like or macrophage-like cell transduction | |
| ES2244145T3 (es) | Vectores de aporte de genes provistos de un tropismo para las celulas de los musculos lisos y/o las celulas endoteliales. | |
| EP1191105A1 (en) | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for T-lymphocytes | |
| AU2001294348B2 (en) | Transduction of chondrocytes using adenoviral vectors | |
| NZ527634A (en) | Means and methods for synoviocyte cell transduction | |
| AU2001294348A1 (en) | Transduction of chondrocytes using adenoviral vectors |