MXPA99010682A - Vectores para la distribucion de genes, provistoscon tropismo de tejido para celulas de musculo liso y/o celulas endoteliales. - Google Patents
Vectores para la distribucion de genes, provistoscon tropismo de tejido para celulas de musculo liso y/o celulas endoteliales.Info
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Abstract
La invencion se refiere al campo de la genetica molecular y la medicina. En particular la presente invencion, se refiere al campo de la terapia genica, mas en particular a la terapia genica utilizando adenovirus.
Description
VECTORES PARA LA DISTRIBUCIÓN DE GENES, PROVISTOS CON TROPISMO DE TEJIDO PARA CÉLULAS DE MÚSCULO LISO Y/O CÉLULAS ENDOTELIALES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de la genética molecular y la medicina. En particular la presente invención se refiere al campo de la terapia génica, más en particular a la terapia génica utilizando adenovirus.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En terapia con _ genes, la información genética es usualmente distribuida a una célula huésped ya sea con el fin de corregir (suplementar) una deficiencia genética en dicha célula, o para inhibir una función no deseada en la célula, o para eliminar la célula huésped. Por supuesto, se puede intentar también proporcionar información genética a la célula huésped, con una función deseada, por ejemplo, suministrar una proteina secretada para tratar otras células del huésped, etc. REF.: 32165 Han sido desarrollados muchos métodos diferentes para introducir nueva información genética a las células. Aunque muchos sistemas diferentes pueden funcionar sobre lineas celulares cultivadas i n vi tro, únicamente el grupo de métodos de distribución de genes, mediados por vectores virales, parece ser capaz de cumplir la eficiencia requerida de la transferencia de genes in vi vo . De este modo, para fines de terapia génica se dirige la mayor parte de la atención hacia el desarrollo de vectores virales adecuados. Hoy en dia, la mayor parte de la atención para el desarrollo de vectores virales adecuados está dirigida hacia aquellos vectores que están basados en adenovirus. Estos vectores adenovirales pueden distribuir información genética extraña de manera muy eficiente a las células objetivo in vi vo . Además, la obtención de grandes cantidades de vectores adenovirales no es un problema para la mayoria de los tipos adenovirales. Los vectores adenovirales son relativamente fáciles de concentrar y purificar. Además, los estudios en pruebas clínicas han proporcionado información valiosa sobre el uso de estos vectores en pacientes. Existe un gran número de razones para utilizar vectores adenovirales para la distribución de ácido nucleico a las células objetivo en protocolos de terapia génica. No obstante, algunas características de los actuales vectores limitan su uso en aplicaciones especificas. Por ejemplo, las células endoteliales y las células del músculo liso no son fácilmente transducidas mediante la generación actual de vectores adenovirales. Para muchas aplicaciones de terapia génica, tales como aplicaciones en el área cardiovascular, preferentemente estos tipos de células deben ser genéticamente modificadas. Por otra parte, en algunas aplicaciones, incluso la muy buena capacidad de distribución in vi vo de los vectores adenovirales no es suficiente, y se requieren eficiencias de transferencia más altas. _ Este es el caso, por ejemplo, cuando la mayoria de las células de un tejido objetivo necesitan ser transducidas. La presente invención fue realizada en el curso de la manipulación de vectores adenovirales. En la siguiente sección se da por lo tanto una breve introducción a los adenovirus.
Adenovirus Los adenovirus contienen una molécula de ADN lineal de doble hebra de aproximadamente 36,000 pares de bases. Ésta contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) , idénticas de aproximadamente 90 a 140 pares de bases con la longitud exacta dependiendo del serotipo. Los orígenes virales de la replicación están dentro de las ITRs exactamente en los extremos del genoma. Las unidades de transcripción están divididas en regiones temprana y tardia. Poco después de la infección, las proteínas E1A y E1B son expresadas y funcionan en la transactivación de los genes celulares y adenovirales. Las regiones tempranas E2A y E2B codifican para las proteínas
(proteina de enlace al ADN, proteina pre-ter inal y polimerasa) requeridas para la replicación del genoma adenoviral (revisado en van der Vliet, 1995) . La región temprana E4 codifica^ para varias proteínas con funciones pleiotrópicas, por ejemplo transactivación del promotor temprano E2, facilitando el transporte y la acumulación de ARNms virales en la fase tardia de la infección, e incrementando la estabilidad nuclear de los pre-ARNms tardíos, mayores (revisado en Leppard, 1997) . La región temprana 3 codifica para proteínas que están involucradas en la modulación de la respuesta inmune del huésped (Wold y colaboradores, 1995) . La región tardia es transcrita a partir de un promotor simple (promotor tardío mayor) y es activada al inicio de la replicación del ADN. El empalme complejo y los mecanismos de poliadenilación dan origen a más de 12 especies de ARN que codifican para las proteínas del núcleo, las proteínas de cápside (pentón, hexón, fibra y proteínas asociadas), la proteasa viral y las proteínas necesarias para el ensamblaje de la cápside y la parada o interrupción de la traducción de la proteina del huésped (Imperiale, M.J., Akusjnarvi, G. y Leppard, K.N. (1995) Post-transcriptional control of adenovirus gene expression. En: The molecular repertoire of adenoviruses I. P139-171. . Doerfler y P. Bohm (eds), Springer-Verlag Berlin Heidelberg) .
Interacción entre virus y cél ula huésped La interacción del virus con la célula huésped ha sido investigada principalmente con los virus Ad2 y Ad5, serotipo C. El enlace ocurre por medio de la interacción de la región de perilla o protuberancia de la fibra que se proyecta hacia afuera, con un receptor celular. El receptor para Ad2 y Ad5 y probablemente más adenovirus es conocido como el 'Coxsac ievirus y Receptor Adenoviral" o la proteina CAR (Bergelson y colaboradores, 1997) . La internalización o introducción es mediada a través de la interacción de la secuencia RGD presente en la base de pentón con las integrinas celulares (Wickham y colaboradores, 1993) . Esto no puede ser cierto para todos los serotipos, por ejemplo los serotipos 40 y 41 no contienen una secuencia RGD en su secuencia de base de pentón (Kidd y colaboradores, 1993) .
La pro teina de fibra El paso inicial para la infección exitosa es el enlace del adenovirus a su célula blanco u objetivo, un proceso mediado a través de la proteina de fibra. La proteina de fibra tiene una estructura trimérica (Stouten y colaboradores, 1992) con diferentes longitudes dependiendo del serotipo del virus (Signas y colaboradores, 1985; Kidd y colaboradores, 1993). Diferentes serotipos tienen polipéptidos con extremos N y C estructuralmente similares, pero diferentes regiones de tallo intermedio. Los primeros 30 aminoácidos en el extremo N están involucrados en el anclaje de la fibra a la base pentón (Chroboczek y colaboradores, 1995), especialmente la región FNPVYP conservada en la cola (Arnberg y colaboradores, 1997) . El extremo C, o perilla o protuberancia, es responsable de la interacción inicial con el receptor adenoviral celular. Después de este enlace inicial, el enlace secundario entre la base pentón de cápside y las integrinas de la superficie celular conduce a la introducción de las partículas virales en pozos recubiertos, y la endositosis (Morgan y colaboradores, 1969; Svensson y Persson, 1984; Varga y colaboradores, 1991; Greber y colaboradores, 1993; Wickham y colaboradores, 1993) . Las integrinas son a, ß-heterodimeros de los cuales al menos 14 a-subunidades y 8 ß-subunidades han sido identificadas (Hynes, 1992). El arreglo de las integrinas expresadas en las células es complejo y variará entre los tipos celulares y el ambiente celular. Aunque la perilla o protuberancia contiene algunas regiones conservadas, entre los serotipos, las proteínas de perilla muestran un alto grado de variabilidad, indicando que existen diferentes receptores adenovirales .
Serotipos adenoviral es A la fecha, han sido propuestos seis diferentes subgrupos de los adenovirus humanos los cuales en total abarcan aproximadamente 50 distintos serotipos de adenovirus. Además de estos adenovirus humanos, han sido identificados muchos adenovirus animales (ver por ejemplo Ishibashi y Yasue, 1984) . Un serotipo es definido con base en su distintividad inmunológica, como es determinada mediante neutralización cuantitativa con antisuero animal (caballo, conejo) . Si la neutralización muestra un cierto grado de reacción cruzada entre dos virus, se asume la distintividad de serotipos si A) las hemaglutininas no están relacionadas, como se muestra por la falta de reacción cruzada sobre la inhibición de la hemaglutinación, o B) existen diferencias biofísicas/bioquímicas sustanciales en el ADN
(Francki y colaboradores, 1991). Los serotipos identificados últimamente (42-49), fueron aislados por primera vez a partir de pacientes infectados con el VIH (Hierholzer y colaboradores, 1988; Schnurr y colaboradores, 1993) . Por razones no bien comprendidas, la mayoria de tales pacientes inmunocomprometidos esparcieron adenovirus que nunca fueron aislados de los individuos inmunocompetentes (Hierholzer y colaboradores, 1988, 1992; Khoo y colaboradores, 1995) . Además de las diferencias hacia la sensibilidad contra anticuerpos neutralizadores de diferentes serotipos de adenovirus, los adenovirus en el subgrupo C tales como Ad2 y Ad5 se enlazan a diferentes receptores en comparación a los adenovirus provenientes del subgrupo B tales como Ad3 y Ad7 (Defer y colaboradores, 1990; Gall y colaboradores, 1996) . De igual modo, se demostró que la especificidad del receptor podria ser alterada mediante el intercambio de la proteina de perilla Ad3 con la proteina de perilla Ad5, y viceversa (Krasnykh y colaboradores, 1996; Stevenson y colaboradores, 1995, 1997) . Los serotipos 2, 4, 5 y 7 tienen todos una afiliación natural hacia el epitelio pulmonar y otros tejidos respiratorios. En contraste, los serotipos 40 y 41 tienen una afiliación natural hacia el tracto gastrointestinal. Estos serotipos difieren en al menos las proteínas de cápside (pentón-base, hexón) , proteínas responsables para el enlace a la célula (proteína de fibra) , y proteínas involucradas en la replicación del adenovirus. Se desconoce a qué grado las proteínas de cápside determinan las diferencias en el tropismo encontrado entre los serotipos. Puede ser muy bien que los mecanismos de post-infección determinen la especificidad de tipo celular de los adenovirus. Se ha mostrado que los adenovírus provenientes de los serotipos A (Adl2 y Ad.31), C (Ad2 y Ad5), D (Ad9 y Adl5), E (Ad4) y F (Ad41) son todos capaces de enlazarse a la proteína CAR soluble, marcada (sCAR) cuando son inmovilizados sobre microcelulosa . Además, el enlace de los adenovirüs provenientes de estos serotipos a las células Ramos, que expresan altos niveles de CAR pero carecen de integrinas (Roelvink y colaboradores, 1996) , podria ser eficientemente bloqueado por la adición de sCAR a los virus antes de la infección (Roelvink y colaboradores, 1998) . Sin embargo, el hecho de que (al menos algunos) miembros de estos subgrupos sean capaces de enlazarse a CAR no excluye que estos virus tengan diferentes eficiencias de infección en diversos tipos celulares. Por ejemplo los serotipos del subgrupo D tienen tallos o ejes de fibra relativamente cortos en comparación a los virus ael subgrupo A y C. Se ha postulado que el tropismo de los virus del subgrupo D es a un grado mayor determinado por la base pentón que se enlaza a las integrinas (Roelvink y colaboradores, 1996; Roelvink y colaboradores, 1998) . Otro ejemplo más es provisto por Zabner y colaboradores, 1998 quienes han probado
14 diferentes serotipos sobre la infección de epitelios ciliados humanos de las vías respiratorias
(CAE) y encontraron que el serotipo 17 (subgrupo D) estuvo enlazado e internalizado o introducido más eficientemente que todos los otros virus, incluyendo otros miembros del subgrupo D. Experimentos similares utilizando serotipos provenientes del subgrupo A-F en células de rata fetal primarias, mostraron que los adenovirus provenientes del subgrupo A y B fueron ineficientes, mientras que los virus del subgrupo D fueron más eficientes (Law y colaboradores, 1998) . También en este caso, los virus dentro de un subgrupo mostraron diferentes eficiencias. La importancia del enlace de las fibras para la infección mejorada de Adl7 en CAE fue mostrada por Armentano y colaboradores (WO 98/22609) quien realizó un virus LacZ Ad2 recombinante con un gen de fibra proveniente de Adl7 y mostró que los virus quiméricos infectaron CAE . de manera más eficiente que los virus LacZ Ad2 con fibras Ad2. De este modo, a pesar de su habilidad comparada para enlazarse a CAR, las diferencias en la longitud de la fibra, la secuencia de perilla y otras proteínas de cápside, por ejemplo, la base de pentón de los diferentes serotipos, puede determinar la eficiencia mediante la cual un adenovirus infecta una cierta célula objetivo. De interés a este respecto es la habilidad de las fibras Ad2 y Ad5 pero no de las fibras Ad3 para enlazarse a la fibronectina III y los péptidos derivados de MHC clase 1 a2. Esto sugiere que los adenovirus son capaces de utilizar receptores celulares diferentes de CAR (Hong y colaboradores, 1997) . Los serotipos 40 y 41 (subgrupo F) se sabe que poseen dos proteínas de fibra que difieren en la longitud del eje principal. La fibra 41L de eje o tallo largo se muestra que se enlaza a CAR, mientras que 41S de eje o tallo corto no es capaz de enlazarse a CAR (Roelvink y colaboradores, 1998) . El receptor para la fibra corta no es conocido.
Vectores adenoviral es para la di stribuci ón de genes La mayoria de los vectores adenovirales para la distribución de genes _actualmente utilizados en terapia génica, son derivados de los adenovirus Ad2 o Ad5, serotipo C. Los vectores tienen una supresión en la región El, donde puede ser introducida nueva información genética. La supresión El hace defectuosa la replicación del virus recombinante. Se ha demostrado extensamente que los adenovirus recombinantes, en particular el serotipo 5 son adecuados para la transferencia eficiente de genes in vi vo hacia el hígado, el epitelio de las vias respiratorias y los tumores sólidos en modelos animales y xenoinjertos humanos en ratones inmunodeficientes (Bout 1996, 1997, Blaese y colaboradores, 1995) . Los vectores de transferencia de genes derivados de adenovirus (vectores adenovirales) tienen un número de características que los hace particularmente útiles para la transferencia de genes : 1) la biología de los adenovirus está bien caracterizada, el adenovirus no está asociado con patología humana severa, 3) el virus es extremadamente eficiente en la introducción de su ADN dentro de la célula huésped, 4) el virus puede infectar una variedad amplia de células y tiene una amplia gama o intervalo de huéspedes, 5) el virus puede ser producido a títulos altos en cantidades grandes, 6) y el virus puede ser hecho defectuoso en la replicación, mediante supresión de la región temprana 1 (El) del genoma viral (Brody y
Crystal, 1994) .
No obstante, existe todavía un número de inconvenientes asociados con el uso de los vectores adenovirales : 1) los adenovirus, especialmente los serotipos Ad2 y Ad5 bien investigados, usualmente promueven una respuesta inmune por el huésped dentro del cual éstos son introducidos, 2) actualmente no es factible dirigir el virus hacia ciertas células y tejidos, 3) la replicación y otras funciones de los adenovirus no son siempre muy bien adecuadas para las células, las cuales van a ser provistas con el material genético adicional, 4) los serotipos Ad2 o Ad5, no son idealmente adecuados para la distribución de material genético adicional a los órganos diferentes del higado. El hígado puede ser particularmente bien transducido con vectores derivados de Ad2 o Ad5. La distribución de tales vectores via la corriente sanguínea conduce a una distribución significativa de los vectores hacia las células del hígado. En terapias donde otros tipos celulares diferentes de células hepáticas necesitan ser transducidas, deben ser aplicados algunos medios de exclusión del hígado, para prevenir la captación del vector por estas células. Los métodos actuales confían en la separación fisica del vector de las células hepáticas, la mayoria de estos métodos confian en la localización del vector y/o del órgano objetivo por medio de cirugía, angioplastia de globo o inyección directa dentro de un órgano vía, por ejemplo, agujas. La exclusión hepática está también siendo practicada a través de la distribución del vector a los compartimientos en el cuerpo que están esencialmente aislados de la corriente sanguínea, con lo cual se previene el transporte del vector hacia el higado_. Aunque éstos métodos principalmente tienen éxito en evitar la distribución^ burda del vector hacia el hígado, la mayoría de los métodos son crudos y todavía tienen fugas considerables y/o tienen pobres características de penetración al tejido objetivo. En algunos casos, la distribución accidental del vector a las células hepáticas puede ser tóxica para el paciente. Por ejemplo, la distribución de un gen de la timidina-cinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV) para la muerte subsecuente de las células 'cancerosas en división, a través de la administración de ganciclovir, es muy peligrosa cuando también son transducidas una cantidad significativa de células hepáticas por el vector. La distribución significativa y la expresión subsecuente del gen HSV-TK hacia las células del higado está asociada con toxicidad severa. De este modo existe una necesidad discreta para un vector inherentemente seguro provisto con la propiedad de una eficiencia de transducción reducida de las células hepáticas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Tabla 1: Los oligonucleótidos y oligonucleótidos degenerados utilizados_ para la amplificación del
ADN que codifica para las proteínas de fibra derivadas de serotipos de adenovirus alternativos. (Las letras negritas representan el sitio de restricción Ndel (A-E) , el sitio de restricción Nsil (1-6, 8) o el sitio de restricción Pací (7) . Tabla II: Biodistribución del adenovirus quimérico después de la inyección intravenosa en la vena de la cola. Los valores representan la actividad de luciferasa/µg de proteína total. Todos los valores debajo de 200 unidades luminosas relativas/µg de proteínas son considerados como antecedentes. ND = no determinado . - Tabla III: Expresión de CAR y de integrinas sobre la superficie celular de células endoteliales y células del músculo liso. 70%: células cosechadas para el análisis FACS a una densidad celular de 70% de confluencia. 100%: células cosechadas para el análisis FACS a una densidad celular de 100% de confluencia. Células PER.C6 fueron tomadas como un control para la tinción del anticuerpo. Los valores representan los porcentajes de las células que expresan CAR o cualquiera de las integrinas a niveles por arriba del antecedente. Como control antecedente, se incubaron HUVECs o HUVsmc únicamente con el anticuerpo secundario, marcado con PE, de rata, anti IgGl de ratón. Tabla IV: Determinación de la expresión del transgen (actividad de luciferasa) por µg de proteína celular total después de la infección de las células A549.
Figura 1: Dibujo esquemático de la construcción pBr/Ad.Bam-rITR.
Figura 2: Dibujo esquemático de la estrategia utilizada para suprimir el gen de fibra de la construcción pBr/Ad.Bam-rITR. Figura 3: Dibujo esquemático de la construcción pBr/Ad.BamR?fib. Figura 4: Secuencias de las fibras quiméricas Ad5/12,
Ad5/16, Ad5/28 y Ad5/40-L. Figura 5: Dibujo esquemático de la construcción pClipsal-Luc . Figura 6: Dibujo esquemático del método para generar adenovirus quiméricos utilizando tres fragmentos qué se traslapan. Las regiones temprana (E) y tardia (L) son indicadas también. _L5 es la secuencia de codificación de la fibra. Figura 7: A) Infección de_ células HUVEC utilizando diferentes cantidades de partículas virales por célula y diferentes adenovirus quiméricos de fibra. Concentración del virus: 10,000 vp/célula
(= barra blanca), 5,000 vp/célula (= barra gris), 2,500 vp/célula (= barra negra), 1,000 vp/célula
(barra gris claro) , 250 y 50 vp/célula sin actividad detectable de luciferasa por arriba del antecedente. La actividad de luciferasa es expresada en unidades de luz relativas (RLU) por microgramo de proteina celular. B) Infección de células HUVEC utilizando diferentes concentraciones de células (22,500, 45,000, 90,000, ó 135,000 células sembradas por pozo) y ya sea el adenovirus serotipo 5 (barra negra) o el adenovirus quimérico de fibra 16 (barra blanca) . La actividad de luciferasa es expresada en unidades de luz relativas (RLU) por microgramo de proteína celular. C) Análisis citométrico de flujo sobre EC de aorta humana transducida con 500 (barra negra) o 5,000 (barra gris) partículas virales por célula de Ad5, o el virus quiméri.co de fibra 16 (Fibl6) . Se utilizaron células no infectadas para establecer el antecedente al 1%, y una fluorescencia media de 5.4. El desplazamiento máximo _en la fluorescencia media que puede ser observada sobre el citómetro de flujo es 9,999. Esto último indica que a 5,000 vp/célula, ambos Ad5 y Fibl6 están fuera de la escala de sensibilidad del citómetro de flujo. Figura 8: A) Infección de las células HUVsmc utilizando diferentes cantidades de partículas virales por célula y diferentes adenovirus basados en Ad5 mutante, de fibra. Concentración del virus: 5,000 vp/célula (= barra blanca), 2,500 vp/célula (= barra gris), 1,250 vp/célula (= barra gris obscura) , 250 vp/célula (= barra negra), o 50 vp/célula (= barra gris claro) . La actividad de luciferasa es expresada como unidades de luz relativa (RLU) por microgramo de proteina celular. B) Infección de células HUVsmc utilizando diferentes concentraciones de células
(10,000, 20,000, 40,000, 60,000 ó 80,000 células por pozo) y ya sea adenovirus serotipo 5 (barras blancas) o el adenovirus quimérico de la fibra 16
(barras negras) . Se observa una meseta después de la infección con el adenovirus quimérico de la fibra 16, debido al hecho de que la expresión del transgen es más alta que el intervalo de sensibilidad del bioluminómetro utilizado. C) SMC de vena umbilical Jiumana transducido con 500 vp/célula (barra negra) o 5, 000 vp/célula (barra gris) utilizando ya sea Ad5 o el mutante de la fibra 16 (Fibl6) . Se utilizaron células no transducidas para ajustar una fluorescencia media antecedente de aproximadamente 1. Se muestra la fluorescencia media de la expresión de GFP como es medida mediante citometría de flujo. D) las HUVsmc fueron infectadas con 312 (barra gris claro), 625 (barra gris), 1,250 (barra negra), 2,500 (barra gris oscuro), 5,000 (barra gris claro) o 10,000 (barra blanca) partículas virales por célula ya sea del virus quimérico de fibra 11, 16, 35 ó 51. La expresión del transgen de luciferasa expresado como unidades de luz relativa (RLU) por microgramo de proteina se midió 48 horas después de la exposición al virus. E) Fotografías macroscópicas de tinción de LacZ sobre muestras de safenas. LacZ dirigida al núcleo (ntLacZ) produce un color azul oscuro el cual parece negro o gris oscuro en impresiones no de color. F) Fotografías macroscópicas de tinción con LacZ sobre muestras de pericardio. LacZ dirigido al núcleo (ntLacZ) da un color azul oscuro el cual parece negro en impresiones no de color. G) Fotografías macroscópicas de la tinción con LacZ sobre muestras de arteria coronaria derecha. LacZ dirigido al núcleo
(ntLacZ) , da un color azul oscuro que parece negro en las impresiones no de color. H) Tinción con LacZ sobre muestras de arteria izquierda descendente (LAD) . LacZ dirigido al núcleo
(ntLacZ) da un color azul oscuro el cual parece negro en impresiones no de color. Figura 9: Secuencias que incluyen el gen que codifica para la proteína de fibra 16 de adenovirus, como son publicadas en Genbank y secuencias que incluyen un gen que codifica para una fibra proveniente de una variante del adenovirus 16, como es aislada en la presente invención, en donde las secuencias de la proteina de fibra son provenientes del sitio Ndel. Figura 9A: Comparación de la secuencia nucleotídica. Figura 9B : Comparación de los aminoácidos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona los métodos, compuestos y medicinas para terapia génica. La presente invención es particularmente útil en aplicaciones de terapia génica donde las células endoteliales y/o las células del músculo liso forman el tipo de célula objetivo. La presente invención se refiere a los vehículos de distribución de genes provistos con un tropismo de tejido para al menos células endoteliales y/o células del músculo liso. La presente invención se refiere además a los vehículos de distribución de genes que han sido privados de un tropismo de tejidos para células hepáticas .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DÉ LA INVENCIÓN
Un objetivo de la presente invención es proporcionar materiales y métodos para superar las limitaciones de los vectores adenovirales mencionados anteriormente. En un sentido amplio, la invención proporciona nuevos adenovirus, derivados totalmente o en parte de diferentes serotipos provenientes de Ad5. Los genes específicos de serotipos con características preferidas pueden ser combinados en un vector quimérico para dar origen a un vector que es mejor adecuado para aplicaciones específicas. Las características preferidas incluyen, pero_ no están limitadas a, infección mejorada de una célula objetivo especifica, infección reducida de células no objetivo, estabilidad mejorada de los virus, captación reducida en células presentadoras de antígeno (APC) , o captación incrementada en APC, toxicidad reducida a las células objetivo, neutralización reducida en humanos o en animales, respuesta CTL reducida o incrementada en humanos o en animales, expresión de transgen mejor y/o prolongada, capacidad incrementada de penetración en los tejidos, rendimientos mejorados en lineas celulares de empaquetamiento, etc.
Un aspecto de la presente invención facilita la combinación de la baja inmunogenicidad de algunos adenovirus con las características de otros adenovirus que permiten la terapia génica eficiente. Tales características pueden ser una alta especificidad para ciertas células huésped, una buena maquinara de replicación para ciertas células, una alta tasa o proporción de infección en ciertas células huésped, baja eficiencia de infección en células no objetivo, alta o baja eficiencia de infección APC, etc. La invención proporciona de este modo los adenovirus quiméricos que tienen las propiedades útiles de al menos dos adenovirus de diferentes serotipos. Tipicamente, dos q más requerimientos de la lista no exhaustiva anterior son requeridos para obtener un adenovirus capaz de transferir eficientemente material genético a una célula huésped. Por lo tanto, la presente invención proporciona vectores derivados de adenovirus, los cuales pueden ser utilizados como cásete para insertar diferentes genes adenovirales provenientes de diferentes serotipos adenovirales, en los sitios requeridos. De esta manera se puede obtener un vector capaz de producir un adenovirus quimérico, con lo cual por supuesto también puede ser insertado un gen de interés (por ejemplo en el sitio de El del adenovirus original) . De esta manera, el adenovirus quimérico que va a ser producido puede ser adaptado a los requerimientos y a las necesidades de ciertos huéspedes en necesidad de terapia génica para ciertos desórdenes. Para hacer posible la producción de este virus, una célula de empaquetamiento será en general necesaria con el fin de producir cantidad suficiente de adenovirus quiméricos seguros. En uno de sus aspectos la presente invención proporciona vectores adenovirales que comprenden al menos un fragmento de una proteina de fibra de un adenovirus proveniente del subgrupo B. La proteína de fibra puede ser la proteína de fibra nativa del vector adenoviral o puede ser derivada de un serotipo diferente del serotipo en que está basado el vector adenoviral. En el último caso el vector adenoviral de acuerdo a la invención es un adenovirus quimérico que muestra al menos un fragmento de la proteina de fibra derivada del adenovirus del subgrupo B, cuyo fragmento comprende al menos la secuencia de enlace al receptor. Tipicamente, tal virus será producido utilizando un vector (típicamente un plásmido, un cósmido o un vector baculoviral) . Tales vectores son también objetivo de la presente invención. Un vector preferido es un vector que puede ser utilizado para elaborar un virus recombinante quimérico, específicamente adaptado al huésped que va a ser tratado, y al desorden que va a ser tratado. La presente invención también proporciona un adenovirus quimérico basado en adenovirus tipo 5 pero que tiene al menos un fragmento de la secuencia de fibra proveniente del adenovirus tipo 16, mediante lo cual el fragmento de la fibra del Adl6 comprende el fragmento de la proteína de fibra que está involucrada en el enlace de una célula huésped. La presente invención también proporciona vectores adenovirales quiméricos que muestran infección mejorada en comparación a adenovirus provenientes de otros subgrupos en células huésped especificas por ejemplo, pero no limitadas a, células endoteliales y células del músculo liso de origen humano o animal. Una característica importante de la presente invención es los medios para producir los virus quiméricos. Típicamente, se desea que un lote de adenovirus sea administrado a la célula huésped, el cual contiene el adenovirus competente para la replicación. En general, por lo tanto, se desea omitir un número de genes (pero al menos uno) del genoma adenoviral sobre el vector que codifica para el virus quimérico, y suministrar estos genes en el genoma de la célula en la cual es llevado el vector para producir adenovirus quiméricos. Tal célula es usualmente denominada una célula de empaquetamiento. La invención también proporciona de este modo una célula de empaquetamiento para producir un adenovirus quimérico de acuerdo a la invención, que comprende en posición todo trans los elementos necesarios para la producción del adenovirus, no presentes en el vector adenoviral de acuerdo a la invención. Tipicamente, el vector y la célula de empaquetamiento tienen que ser adaptados uno al otro, ya que todos ellos tienen los elementos necesarios, pero éstos no tienen elementos de traslape que_ conduzcan a vectores de replicación competentes mediante recombinación. De este modo, la invención también proporciona un equipo de partes que comprenden una célula de empaquetamiento de acuerdo a la invención y un vector recombinante de acuerdo a la invención, con lo cual no existe esencialmente ninguna secuencia de traslape que conduzca a la recombinación, dando como resultado la producción del adenovirus de replicación competente, entre la célula y el vector. Para ciertas aplicaciones por ejemplo, cuando la terapia está dirigida a la erradicación de células tumorales, el vector adenoviral de acuerdo a la invención puede ser competente a la replicación o capaz de replicarse bajo ciertas condiciones, por ejemplo en tipos de células especificas como células tumorales o células endoteliales tumorales. Está dentro del alcance de la invención el insertar más genes, o una parte funcional de estos genes provenientes del mismo o de otros serotipos dentro del vector adenoviral reemplazando las secuencias nativas correspondientes. De este modo, por ejemplo el reemplazo de (una parte funcional de) las secuencias de fibra con las secuencias correspondientes de los otros serotipos puede ser combinado por ejemplo con _ reemplazos de (una parte funcional de) otros genes de cápside como el pentón base o el hexón con secuencias correspondientes de dicho serotipo o de otros serotipos distintos. Las personas expertas en la técnica comprenden que otras combinaciones no limitadas a dichos genes son posibles y están dentro del alcance de la invención. El vector adenoviral quimérico de acuerdo a la invención puede originarse de al menos dos diferentes serotipos. Esto puede proporcionar el vector con características preferidas tales como infección mejorada de las células objetivo y/o menor infección de las células no objetivo, estabilidad mejorada de los virus, inmunogenicidad reducida en humanos o animales (por ejemplo, captación reducida en APC, neutralización reducida en el huésped y/o respuesta de linfocitos T citotóxicos reducida (CTL) ) , penetración incrementada de tejido, mejor longevidad de la expresión del transgen, etc. En este aspecto se prefiere utilizar genes de cápside, por ejemplo, genes de pentón y/o hexón provenientes de serotipos menos inmunogénicos, como se define por la ausencia o la presencia de cantidades bajas de anticuerpos neutralizadores en la vasta mayoria de los huéspedes. Se prefiere también utilizar secuencias de fibras y/o de pentón provenientes de serotipos que muestran enlace mejorado e internalización en las células objetivo. Además, se prefiere suprimir del vector viral aquellos genes que conducen a la expresión de genes a'denovirales en las células objetivo. En este aspecto un vector suprimido de todos los genes adenovirales es también preferido. Además, se prefiere que el promotor que impulsa al gen de interés sea expresado en las células objetivo como un promotor especifico de tipo celular.
Con el fin de hacer posible el adaptar de manera precisa el vector viral y proporcionar el virus quimérico con las propiedades deseadas a voluntad, se prefiere que se proporcione una genoteca de genes adenovirales mediante la cual los genes que van a ser intercambiados sean colocados sobre las construcciones adenovirales basadas en plásmido o en cósmido, con lo cual los genes o las secuencias que van a ser intercambiadas son flanqueados por sitios de restricción. Los genes o secuencias preferidos pueden ser seleccionados de la genoteca e insertados en las construcciones adenovirales que son utilizadas para generar los virus. Tipicamente tal método comprende un número de pasos de restricción y de ligadura y la transfección de una célula de empaquetamiento. El vector adenoviral puede ser transfectado en una sola pieza, o como dos o más fragmentos que se traslapan, con lo cual son generados virus mediante recombinación homologa. Por ejemplo, el vector adenoviral estará constituido de dos o más secuencias que se traslapan para la inserción o los reemplazos de un gen de interés por ejemplo en la región El, para la inserción o los reemplazos en secuencias de pentones y/o hexones, y para inserciones o reemplazos dentro de secuencias de fibra. De este modo, la invención proporciona un método para la producción de adenovirus quiméricos que tienen una o más propiedades deseadas como un intervalo de huésped deseado y antigenicidad disminuida, que comprende la provisión de uno o más vectores de acuerdo a la invención que tienen los sitios de inserción deseados, insertando dentro de dichos vectores al menos una parte funcional de una proteína de fibra derivada de un serotipo de adenovirus que tiene el intervalo de huésped deseado y/o la inserción de una parte funcional de una proteína de cápside derivada de un serotipo adenoviral que tiene antigenicidad relativamente baja y la transfección de dichos vectores en una célula de empaquetamiento de acuerdo a la invención, y permitiendo la producción de partículas virales quiméricas. Por supuesto, pueden también ser insertadas otras combinaciones de otros genes virales que se originan de diferentes serotipos, como se describe anteriormente en la presente. Los virus quiméricos que tienen únicamente una secuencia no nativa además de una inserción o reemplazo de un gen de interés en la región El, están también dentro del alcance de la invención. Una respuesta inmunogénica al adenovirus que ocurre tipicamente es la producción de anticuerpos neutralizadores por parte del huésped. Esta es típicamente una razón para la selección de una proteína de cápside como pentón, hexón y/o fibra de un serotipo menos inmunogénico. Por supuesto, puede no ser necesario el elaborar adenovirus quiméricos que tengan proteínas completas de diferentes serotipos. Está muy por dentro de la experiencia de la técnica el producir proteínas quiméricas, por ejemplo en el caso de proteínas de fibra es muy posible tener la base de un serotipo y el eje o tallo y la protuberancia o perilla de otro serotipo más. De esta manera se vuelve, posible el tener las partes de la proteína responsables para el ensamblaje de las partículas virales que se originan de_ un serotipo, con lo cual se aumenta la producción de partículas virales intactas. De este modo, la invención también proporciona un adenovirus quimérico de acuerdo a la invención, en donde el hexón, pentón, fibra y/o las otras proteínas de cápside son proteínas quiméricas que se originan de diferentes serotipos adenovirales. Además de la generación de adenovirus quiméricos mediante intercambio o reemplazo de los genes de la cápside completa de tipo silvestre (proteína), etc., o partes de los mismos, está también dentro del alcance de la presente invención el insertar los genes de la cápside (proteína), etc., que poseen secuencias no adenovirales o mutaciones tales como mutaciones puntuales, supresiones, inserciones, etc., las cuales pu 1eden ser fácilmente seleccionadas para características preferidas tales como estabilidad a la temperatura, ensamblaje, anclaje, infección redirigida, respuesta inmune alterada, etc. Una vez más pueden también ser producidas otras combinaciones quiméricas, y están dentro del alcance de la presente invención. Se ha demostrado en ratones y en ratas que después de la distribución sistémica in vi vo de adenovirus recombinantes de serotipos comúnmente utilizados para fines de terapia génica, más del 90% de los virus están atrapados en el higado (Herz y colaboradores, 1993; Kass-Eisler y colaboradores, 1994; Huard y colaboradores, 1995) . Es también sabido que los hepatocitos humanos son eficientemente transducidos por vectores adenovirales del serotipo 5 (Castell, J.V., Hernández, D. Gomez-Foix, A.M., Guillen, I, Donato, T. y Gomez-Lechon, M.J. (1997) . La transferencia de genes mediada por adenovirus dentro de hepatocitos humanos: análisis de la funcionalidad bioquímica de las células transducidas.
Gene Ther. 4(5), p455-464). De este modo, en la terapia génica i n vi vo mediante distribución sistémica de vectores basados en Ad2 o Ad5 es seriamente entorpecida por la captación eficiente de los virus en el hígado, conduciendo a toxicidad no deseada y a que menos virus esté disponible para la transducción de las células objetivo. Por lo tanto, la alteración del intervalo de cé'lula huésped del adenovirus de serotipo 5, para ser capaz de dirigirse a otros órganos in vi vo, es un interés principal de la invención. Para obtener la infección redirigida del adenovirus recombinante serotipo 5, han _ estado o están todavía bajo investigación diversos procedimientos. Wickham y colaboradores han alterado la porción RGD (Arg, Gly, Asp) en la base pentón, la cual se cree que es responsable del enlace de la integrina avß3 y otvßs a la base pentón. Ellos han reemplazado a esta porción RGD por otra porción peptídica la cual es especifica para el receptor de aß? . De esta manera la dirección del adenovirus a una célula objetivo específica podría ser lograda
(Wickham y colaboradores, 1995) . Krasnykh y colaboradores (1998) han hecho uso del rizo Hl disponible en la protuberancia o perilla. Este rizo, con base en la cristalografía de rayos X, está localizado sobre la parte exterior de la estructura quimérica de perilla o protuberancia y por lo tanto se piensa que no contribuye a las interacciones intramoleculares de la protuberancia. La inserción de una secuencia de codificación FLAG (bandera) dentro del rizo Hl dio como resultado proteínas de fibra -que fueron capaces de trimerizarse y se mostró además que los virus que contiene la secuencia FLAG en la región de protuberancia podrían ser elaborados también. Aunque las interacciones de la protuberancia que contiene FLAG con CAR no son cambiadas, la inserción de ligandos dentro_ del rizo Hl puede conducir a redirección de la infección. Aunque la introducción exitosa de cambios en la fibra y el pentón base del adenovirus serotipo 5, han sido reportados, la estructura completa de la protuberancia y el conocimiento limitado de los aminoácidos precisos que interactúan con CAR, hacen a tales procedimientos de dirección al objetivo, laboriosos y difíciles. El uso de anticuerpos que se enlazan a CAR y a un receptor celular especifico ha sido también descrito (Wickham y colaboradores, 1996; Rogers y colaboradores, 1997) . No obstante, este procedimiento está limitado por la disponibilidad de un anticuerpo específico y por la complejidad del producto de la terapia génica. Para superar las limitaciones descritas anteriormente se utilizaron fibras de adenovirus preexistentes, proteínas de base de pentón, proteínas de hexón u otras proteínas de cápside derivadas de otros serotipos adenovirales. Mediante la generación de genotecas de adenovirus quiméricos del serotipo 5 que contienen proteínas estructurales de los serotipos de adenovirus alternativos, se ha desarrollado una tecnología, la cual hace posible la rápida selección de un vector adenoviral recombinante con características preferidas. Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos para la generación de cápsides quiméricas, las cuales pueden ser dirigidas a tipos celulares específicos i n vi tro, así como in vi vo, y de este modo tienen un tropismo alterado para ciertos tipos celulares. Es un objetivo adicional de la presente invención el proporcionar los métodos y los medios mediante los cuales un adenovirus o una cápsíde de adenovirus pueden ser utilizados como un vehiculo de distribución de proteina o de ácido nucleico a un tipo celular o tejido específico.
Se describe la generación de adenovirus quiméricos basados en el adenovirus serotipo 5, con genes tardíos modificados. Para este propósito, fueron construidos tres plásmidos, los cuales conjuntamente contienen el genoma completo del adenovirus serotipo 5. A partir de uno de estos plásmidos, parte del ADN que codifica para la proteína de fibra del adenovirus del serotipo 5 fue removido y reemplazado por secuencias de ADN ligadoras que facilitan la clonación fácil. Este plásmido sirvió subsecuentemente como plantilla para la inserción del ADN que codifica para la proteína de fibra derivado de los diferentes serotipos de adenovirus. Las secuencias de ADN derivadas de los diferentes serotipos fueron obtenidas utilizando la técnica de reacción en cadena de polimerasa en combinación con oligonucleótidos (degenerados) . En el primer sitio El en el genoma del adenovirus serotipo 5, puede ser clonado cualquier gen de interés. Un procedimiento de transfección simple de los tres plásmidos conjuntamente, da como resultado la formación de un adenovirus quimérico recombinante. Alternativamente, la clonación de las secuencias obtenidas a partir de la genoteca puede ser tal que el vector adenoviral quimérico está constituido de uno o dos fragmentos. Por ejemplo una construcción contiene al menos el ITR izquierdo y las secuencias necesarias para el empaquetamiento del virus, un cásete de expresión para el gen de interés y las secuencias que se traslapan con la segunda construcción, que comprende todas las secuencias necesarias para la replicación y la formación del virus no presentes en la célula de empaquetamiento, asi como las secuencias no nativas que proporcionan las características preferidas. Esta nueva tecnología de las bibliotecas o genotecas que consisten de adenovirus quiméricos, permite de este modo una rápida selección para vectores adenovirales recombinantes mejorados, para fines de terapia génica in vi tro o in vi vo . El uso del adenovirus tipo 5 para la terapia génica i n vi vo está limitado por la incapacidad aparente para infectar ciertos tipos celulares, por ejemplo, células endoteliales humanas y células del músculo liso, y la preferencia de la infección de ciertos órganos, por ejemplo, el hígado y el bazo. Específicamente, éste tiene consecuencias para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares como restenosis e hipertensión pulmonar. La distribución mediada por adenovirus, de ceNOS humana (sintasa del óxido nítrico endotelial constitutivo) ha sido propuesta como tratamiento para la restenosis después de la angioplastia coronaria transluminal coronaria (PTCA) . La restenosis está caracterizada por remodelación arterial progresiva, formación de matriz extracelular e hiperplasia intima en el sitio de la angíoplastia (Schwartz y colaboradores, 1993; Cárter y colaboradores, 1994; Shi y colaboradores, 1996). NO es uno de los factores vasoactivos que se muestra son perdidos después del daño inducido por PTCA a la barrera endotelial (Lloyd Jones y Bloch, 1996) . De este modo, la restauración de los niveles de NO después del daño inducido por globo, por medio de distribución adenoviral de ceNOS puede prevenir la restenosis (Varenne y colaboradores, 1998) . Otras aplicaciones para la terapia génica mediante la cual los virus o virus quiméricos de acuerdo a la invención son superiores a los virus basados en Ad2 o Ad5, dados como ejemplos no limitantes, son la producción de proteínas por células endoteliales que son secretadas hacia la sangre, el tratamiento de la hipertensión, el tratamiento preventivo de la estenosis durante el injerto de venas, la angiogénesis, la insuficiencia cardiaca, la hipertensión renal y otros.
En una modalidad, esta invención describe los vectores adenovirales que son, entre otros, especialmente adecuados para la distribución de genes a las células endoteliales y a las células del músculo liso, importantes para el tratamiento de desórdenes cardiovasculares. Los vectores adenovirales son preferentemente derivados de los adenovirus del subgrupo B o contienen al menos una parte funcional de la proteína de fibra proveniente de un adenovirus del subgrupo B que comprende al menos la porción de enlace a las células de la proteína de fibra. En una modalidad preferida, adicional, los vectores adenovirales son_ vectores quiméricos basados en adenovirus del tipo 5 y contienen al menos una parte funcional de la proteína de fibra proveniente del adenovirus tipo 16. En otra modalidad más, esta invención proporciona los vectores adenovirales o los vectores adenovirales quiméricos que escapan al higado después de la administración sistémica. Preferentemente, estos vectores adenovirales son derivados del subgrupo A, B, D o F, en particular los serotipos 12, 16, 28 y 40 o contienen al menos la porción de enlace a las células de la proteina de fibra derivada de dichos adenovirus.
Se entiende que en todas las modalidades los vectores adenovirales pueden ser derivados del serotipo que tiene las propiedades deseadas, o que el vector adenoviral está basado en un adenovirus proveniente de un serotipo, y contiene las secuencias que comprenden las funciones deseadas de otro serotipo, reemplazando estas secuencias a las secuencias nativas en dicho serotipo. En otro aspecto más esta invención describe los adenovirus quiméricos y los métodos para generar estos virus que tienen un tropismo alterado, diferente de aquel del adenovirus del tipo 5. Por ejemplo, los virus basados en el adenovirus serotipo 5 pero que muestran cualquier fibra de adenovirus, existen en la naturaleza. Este adenovirus serotipo 5 quimérico es capaz de infectar ciertos tipos celulares de manera más eficiente, o de manera menos eficiente in vi tro e in vi vo que el adenovirus serotipo 5. Tales células incluyen, pero no están limitadas a células endoteliales, células del músculo liso, células dendríticas, células neuronales, células gliales, células sinoviales, células epiteliales pulmonares, células de la serie hematopoyética, células monociticas/macrófagos, células tumorales, células del músculo esquelético, células mesoteliales, sinoviocitos, etc. En otro aspecto más la invención describe la construcción y el uso de genotecas que consisten de distintas partes del adenovirus serotipo 5 en el cual uno o más de los genes o secuencias han sido reemplazados con el ADN derivado de los serotipos humanos o animales alternados. Este grupo de construcciones, que abarcan en total el genoma completo del adenovirus, permite la construcción de adenovirus quiméricos únicos, diseñados para una cierta enfermedad, grupo de pacientes o incluso un individuo único. En todos los aspectos de la invención, los adenovirus quiméricos pueden o no contener supresiones en la región El e inserciones de genes heterólogos ligados ya sea o no a un promotor. Además, los adenovirus quiméricos pueden o no contener supresiones en la región E3 e inserciones de los genes heterólogos ligados a un promotor. Además, los adenovirus quiméricos pueden o no contener supresiones en la región E2 y/o E4, e inserciones de genes heterólogos ligados a un promotor. En el último caso las lineas celulares que complementan a E2 y/o a E4 son requeridas para generar adenovirus recombinantes. De hecho cualquier gen en el genoma del vector viral puede ser tomado y suministrado en posición trans. De este modo, en la situación extrema, los virus quiméricos no contienen ningún gen adenoviral en su genoma, y son por definición vectores adenovirales mínimos. En este caso todas las funciones adenovirales son suministradas en posición trans utilizando líneas celulares estables y/o la expresión transitoria de estos genes. Un método para la producción de vectores adenovirales mínimos se describe en WO97/00326 y es tomada como referencia en la presente. En otro caso más, las moléculas quiméricas de Ad/AAV son empaquetadas en las cápsides adenovirales de la invención. Un método para la producción de vectores quiméricos Ad/AAV se describe en la Patente Europea EP 97204085.1 y es tomada por referencia en la presente. En principio, cualquier ácido nucleico puede estar provisto con cápsides adenovirales de la invención. En una modalidad la invención proporciona un vehiculo para la distribución de genes que ha sido provistos con al menos un tropismo tisular para células del músculo liso y/o células endoteliales. En otra modalidad más, la invención proporciona un vehiculo para la distribución de genes desprovisto de un tropismo de tejido para al menos las células hepáticas. Preferentemente, dicho vehículo de distribución de genes está provisto con un tropismo de tejido para al menos las células del músculo liso y/o las células endoteliales, y desprovisto de un tropismo de tejido para al menos las células hepáticas. En una modalidad preferida de la invención, dicho vehiculo de distribución de genes está provisto con un tropismo de tejido para al menos las células del músculo liso y/o las células endoteliales y/o desprovisto de un tropismo de tejido para al menos las células hepáticas, utilizando una proteina de fibra derivada de un adeno irus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. En un aspecto preferido de la invención, dicho vehículo de distribución de genes comprende una cápside viral. Preferentemente la cápside de virus comprende una cápside de virus derivada total o parcialmente de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16, o éste comprende las proteínas, o parte de las mismas, provenientes de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. En la modalidad preferida de la invención, dicha cápside del virus comprende proteínas, o fragmentos de las mismas, provenientes de al menos dos virus diferentes, preferentemente adenovirus. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, al menos uno de los virus es un adenovirus del subgrupo B, preferentemente adenovirus 16. En una modalidad preferida de la invención el vehículo de distribución de genes comprende una proteína de fibra de adenovirus o fragmentos de la misma. La proteína de fibra es preferentemente derivada de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. El vehiculo de distribución de genes puede además comprender otras proteínas de fibra, o fragmentos de las mismas, provenientes de otros adenovirus. El vehiculo de distribución de genes puede o no comprender otras proteínas adenovirales. El ácido nucleico puede estar ligado directamente a las proteínas de fibra, o fragmentos de las mismas, pero puede también estar ligado indirectamente. Los ejemplos de enlaces indirectos incluyen, pero no están limitados a, el empaquetamiento de ácido nucleico dentro de las cápsides adenovirales o empaquetamiento de ácido nucleico dentro de liposomas, en donde una proteina de fibra, o un fragmento de la misma, es incorporado dentro de la cápside del adenovirus o ligada a un liposoma. En enlace directo de ácido nucleico a una proteína de fibra, o un fragmento de la misma, puede ser realizado cuando la proteina de fibra o un fragmento de la misma, no es parte de un complejo, o cuando la proteína de fibra, o un fragmento de la misma, es parte del complejo tal como una cápside de adenovirus . En una modalidad de la invención se proporciona un vehiculo de distribución de genes que comprende una proteína de fibras de adenovirus, en donde la proteína de fibra comprende un fragmento de determinación tisular de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente de adenovirus 16. La proteína de fibra de adenovirus comprende tres dominios funcionales. Un dominio, la base, es responsable del anclaje de la fibra a una base de pentón de la cápside del adenovirus. Otro dominio más, la protuberancia, es responsable del reconocimiento del receptor, mientras que el dominio de tallo funciona como un espaciador que separa la base de la protuberancia. Los diferentes dominios pueden también tener otra función. Por ejemplo, el tallo está presumiblemente también involucrado en la especificidad de las células objetivo. Cada uno de los dominios mencionados anteriormente puede ser utilizado para definir un fragmento de una fibra.
Sin embargo, los fragmentos pueden también ser identificados de otra manera. Por ejemplo el dominio de protuberancia comprende un fragmento de enlace al receptor y un fragmento de enlace al tallo. El dominio de la base comprende un fragmento de enlace a la base de pentón y un fragmento de enlace al tallo. Además, el tallo comprende tramos repetidos de aminoácidos. Cada uno de estos tramos repetidos puede ser un fragmento. Un fragmento que determina tropismo tisular de una _ proteína de fibra, puede ser un fragmento simple de una proteina de fibra o una combinación de fragmentos de al menos una proteína de _fibra, en donde el fragmento de determinación del tropismo tisular, ya sea solo o en combinación con una cápside viral, determina la eficiencia con la cual el vehículo de distribución del gen puede transducir una célula dada o un tipo celular, preferentemente pero no necesariamente de una manera positiva. Con un tropismo de tejido para células hepáticas, se entiende un tropismo de tejido para células que radican en el hígado, preferentemente células del parénquima hepático. Un tropismo de tejido para un cierto tipo celular puede ser provisto mediante el incremento de la eficiencia con la cual las células de dicho tejido son transducidas, alternativamente, un tropismo de tejido para un cierto tejido puede ser proporcionado mediante la disminución de la eficiencia con la cual son transducidas otras células diferentes de las células de dicho tejido. Las proteínas de fibra poseen propiedades que determinan el tropismo de tejido. El fragmento más perfectamente descrito de la proteina de fibra involucrada en el tropismo de tejido es el dominio de la protuberancia. No obstante, el dominio del tallo de la proteina de fibra también posee propiedades que determinan el tropismo de tejido. No obstante, no todas las propiedades que determinan el tropismo de tejido de una cápside adenoviral son incorporadas dentro de una proteína de fibra. En una modalidad preferida de la invención, una proteína de fibra derivada de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente el adenovirus 16, es combinada con las proteínas de cápside no de fibra provenientes de un adenovirus del subgrupo C, preferentemente del adenovirus 5. En un aspecto de la invención se proporciona un vehículo de distribución de genes que comprende un ácido nucleico derivado de un adenovirus. En una modalidad preferida de la invención dicho ácido nucleico adenoviral comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteina de fibra, que comprende al menos un fragmento de determinación de tropismo de tejido de una proteína de fibra del adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. En un aspecto preferido dicho adenovirus comprende el ácido nucleico proveniente de al menos dos diferentes adenovirus. En un aspecto preferido el adenovirus comprende el ácido nucleico proveniente de al menos dos diferentes adenovirus, en donde al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica _ para una proteína de fibra, comprende al menos un fragmento de determinación del tropismo _de tejido, de una proteina de fibra del adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. En una modalidad preferida de la invención, el ácido nucleico del adenovirus es modificado tal que la capacidad del ácido nucleico adenoviral para replicarse en una célula objetivo, ha sido reducida o suprimida. Esto puede ser logrado a través de la inactivación o supresión de genes que codifican para las proteínas de la región temprana 1.
En otra modalidad preferida el ácido nucleico adenoviral es modificado tal que la capacidad del sistema inmune de un huésped para montar una respuesta inmune contra las proteínas adenovirales codificadas por dicho ácido nucleico adenoviral, ha sido reducida o suprimida. Esto puede ser iogrado a través de la supresión de genes que codifican para proteínas de la región temprana 2 y/o la región temprana 4. Alternativamente, los genes que codifican para las proteínas de la región temprana 3, pueden ser suprimidos, o por el contrario, considerando la función del sistema anti-inmune de algunas de las proteínas codificadas por los genes en la región temprana 3, la expresión _ de las proteínas de la región temprana 3 puede ser aumentada para algunos propósitos. También, el ácido nucleico adenoviral puede ser alterado por una combinación de dos o más de las alteraciones especificas del ácido nucleico adenoviral anteriormente mencionado. Es claro que cuando son suprimidos los genes esenciales del ácido nucleico adenoviral, los genes deben ser complementados en la célula que va a producir el ácido nucleico adenoviral, el vector adenoviral, el vehiculo o la cápside quimérica. El ácido nucleico adenoviral puede también ser modificado tal que haya sido reducida o suprimida la capacidad del sistema inmune de un huésped para montar una respuesta inmune contra proteínas adenovirales codificadas por el t ácido nucleico adenoviral, en otras maneras diferentes a las mencionadas anteriormente, por ejemplo a través del intercambio de proteínas de cápside, o fragmentos de las mismas, por proteínas de cápside, o fragmentos de las mismas, provenientes de otros serotipos para los cuales los humanos no tienen, o tienen niveles bajos de, anticuerpos neutralizadores. Otro ejemplo más de esto es el intercambio de genes que codifican para las_ proteínas de cápside, con los genes que codifican para las proteínas de cápside provenientes de otros serotipos. También las proteínas de cápside, o los fragmentos de las mismas, pueden ser intercambiados por otras proteínas de cápside, o fragmentos de las mismas, para las cuales los individuos no son capaces de, o tienen una baja capacidad de, originar una respuesta inmune contra ellos. Un ácido nucleico adenoviral puede ser alterado además de o en vez de una o más de las alteraciones mencionadas anteriormente, por inactivación o supresión de genes que codifican para las proteínas tardías del adenovirus, tales como, pero no limitadas a, hexón, pentón, fibra y/o proteína IX. En una modalidad preferida de la invención todos los genes que codifican para las proteínas adenovirales están suprimidos del ácido nucleico adenoviral, volviendo a dicho ácido nucleico un vector adenoviral minimo. En otra modalidad preferida de la invención el ácido nucleico adenoviral es un vector quimérico Ad/AAV, en donde al menos los medios de integración de un virus adenoasociado (AAV) están incorporados dentro ..del ácido nucleico adenoviral. En una modalidad preferida de la invención, un vector o un ácido nucleico, el cual puede ser uno y el mismo o no, de acuerdo a la invención comprende además al menos un gen no adenoviral. Preferentemente, al menos uno del gen no adenoviral se selecciona del grupo de genes que codifican para: una apolipoproteína, un ceNOS, una timidina-cinasa del virus del herpes simple, una interleucina 3, una interleucina la, una proteina (anti) angiogénesis tal como la angiostatina, una proteína de antiproliferación, un factor de crecimiento endotelial vascular (VGAF) , un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , un factor inducible por hipoxia la (HIF-la) , un PAI-1 o una proteina antimigración de células del músculo liso. En otro aspecto más, la invención proporciona una célula para la producción de un vehículo de distribución de genes provisto con al menos un tropismo de tejido para células del músculo liso y/o células endoteliales. En otro aspecto más, la invención proporciona una célula para la producción de un vehículo de distribución de genes desprovisto de al menos un tropismo de tejido para las células hepáticas. En otro aspecto más, la invención proporciona una célula para la producción de un vehículo de distribución de genes provisto con al menos un tropismo de tejido para células del músculo liso y/o células endoteliales, y desprovisto de al menos un tropismo de tejido para células hepáticas. En una modalidad preferida de la invención, dicha célula es una célula de empaquetamiento de adenovirus, en donde un ácido nucleico del adenovirus está empaquetado dentro de una cápside del adenovirus. En un aspecto de una célula de empaquetamiento del adenovirus de la invención, todas las proteínas requeridas para la replicación y el empaquetamiento de un ácido nucleico del adenovirus, excepto por las proteínas codificadas por la región temprana 1, son proporcionadas por genes incorporados en el ácido nucleico del adenovírus . Las proteínas codificadas por la región temprana 1, en este aspecto de la invención, pueden ser codificadas por genes incorporados dentro del ADN genómico de las células. En una modalidad preferida de la invención dicha célula es PER.C6 (número de depósito de la ECACC 96022940) . En general, cuando los productos génicos requeridos para la replicación y el empaquetamiento del ácido nucleico del adenpvirus dentro de la cápside del adenovirus no son proporcionados por un ácido nucleico del adenovirus, éstos son "proporcionados por la célula de empaquetamiento, ya sea mediante transfección transitoria, o a través de transformación estable de la 'célula de empaquetamiento. No obstante, un producto génico proporcionado por la célula de empaquetamiento puede también ser proporcionado por un gen presente sobre el ácido nucleico del adenovirus. Por ejemplo, la proteina de fibra puede ser proporcionada por la célula de empaquetamiento, por ejemplo, a través de la transfección transitoria, puede ser codificada por el ácido nucleico del adenovirus. Esta característica puede entre otras ser utilizada para generar cápsides adenovirales que comprenden proteínas de fibra provenientes de dos virus diferentes. Los vehículos para la distribución de genes de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedad cardiovascular o enfermedad tratable por la distribución de ácido nucleico a las células endoteliales o a las células del músculo liso. Un ejemplo no limitante de la última es por ejemplo el cáncer, donde el ácido nucleico transferido comprende un gen que codifica para una proteina anti-angiogénesis . Los vehículos para la distribución de genes de la invención pueden ser utilizados como un producto farmacéutico para_ el tratamiento de dichas enfermedades . Alternativamente, los vehículos para la distribución de genes de la invención pueden ser utilizados para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades. En un aspecto, la invención proporciona una cápside adenoviral con o provista con un tropismo de tejido para células del músculo liso y/o células endoteliales, en donde la cápside comprende preferentemente proteínas de al menos dos diferentes adenovirus, y en donde al menos un fragmento de determinación de tropismo de tejido de una proteina de fibra es derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. En otro aspecto más, la invención proporciona una cápside adenoviral desprovista de un tropismo de tejido para células hepáticas, en donde la cápside comprende preferentemente proteínas de al menos dos diferentes adenovirus, y en donde al menos un fragmento de determinación del tropismo de tejido de una proteína de fibra, es derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. En una modalidad, la invención comprende el uso de una cápside de adenovirus, para la distribución del ácido nucleico a las células del músculo liso y/o a las células endoteliales. En otra modalidad más, la invención comprende el uso de una cápside de adenovirus, para prevenir la distribución del ácido nucleico a las células del hígado. Las cápsides adenovirales de la invención pueden ser utilizadas . para el tratamiento de enfermedad cardiovascular o enfermedad tratable por la distribución de ácido nucleico a las células en'doteliales o a las células del músculo liso. El ejemplo de la última es por ejemplo el cáncer donde el ácido nucleico transferido comprende un gen que codifica para una proteina anti-angiogénesis. Las cápsides adenovirales de la invención pueden ser utilizadas como un producto farmacéutico para el tratamiento de dichas enfermedades. Alternativamente, las cápsides adenovirales de la invención pueden ser utilizadas para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dichas enfermedades . En otro aspecto más de la invención, se proporciona la construcción pBr/Ad . BamR?Fib, que comprende las secuencias 21562-31094 y 32794-35938 del ade?ovirus 5. En otro aspecto más de la invención, se proporciona la construcción pBr/AdBamRfibl 6, que comprende las secuencias 21562-31094 y 32794-35938 del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteína de fibra. En otro aspecto más de la invención, se proporciona la construcción pBr/AdBamR.pac/fibl 6, que comprende las secuencias 21562-31094 y 32794-35938 del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteina de fibra, y que comprende además un sitio Pací único en proximidad de la repetición terminal derecha del adenovirus 5, en la cadena principal o columna vertebral de la secuencia no adenoviral de dicha construcción. . - En otro aspecto más de la invención, se proporciona la construcción pWE/Ad.AfHlrlTRfibl6 que comprende las secuencias 3534-31094 y 32794-35938 del
Ad5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteina de fibra. En otro aspecto más de la invención, se "proporciona la construcción pWE/Ad . AfII IrITRDE2Afibl 6 que comprende las secuencias 3534-22443 y 24033-31094 y 32794-35938 del Ad5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteína de fibra . En la numeración de las secuencias mencionadas anteriormente, el número es descrito hasta y no hasta más. En una modalidad preferida de la invención dichas construcciones son utilizadas para la generación de un vehículo para la distribución de genes o una cápside de adenovirus con un tropismo de tejido para células del músculo liso y/o células endoteliales . En otro aspecto más la invención proporciona una genoteca de vectores adenovirales, o vehículos para la distribución de genes los cuales pueden ser uno y el mismo o no, que comprenden una selección grande de ácidos nucleicos no adenovirales. En otro aspecto más de la invención, los genes adenovirales que codifican para las proteínas de cápside son utilizados para generar una genoteca de cápsides adenovirales que comprenden proteínas derivadas de al menos dos diferentes adenovirus, siendo derivados preferentemente dichos adenovirus de dos diferentes serotipos, en donde preferentemente un serotipo es un adenovirus del subgrupo B. En una modalidad particularmente preferida de la invención, es generada una genoteca de cápsides adenovirales que comprende proteínas de al menos dos diferentes adenovirus, y en donde a . menos un fragmento de determinación del tropismo de tejido de la proteina de fibra es derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16. Una proteína de fibra del adenovirus 16 comprende preferentemente la secuencia dada en la Figura 9. No obstante, dentro del alcance de la presente invención pueden ser obtenidas secuencias análogas a través del uso de la degeneración del codón. Alternativamente, pueden ser realizadas sustituciones o inserciones o supresiones de aminoácidos, siempre y cuando la propiedad de determinación del tropismo de tejido no sea significativamente alterada. Tales sustituciones de aminoácidos pueden estar dentro del mismo grupo de polaridad o fuera de él. En lo subsecuente la invención es ilustrada por un número de ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Generación de virus basados en el adenovirus serotipo 5 con proteínas de fibra quiméricas
Generación de clones plantilla de adenovirus que carecen del ADN que codifica para la fibra
La secuencia de codificación para la fibra, del adenovirus serotipo 5, está localizada entre los nucleótidos 31042 y 32787. Para eliminar el ADN del adenovirus serotipo 5 que codifica para la fibra se comenzó con la construcción pBr/Ad. Bam-rITR (Figura 1; ECACC depósito P97082122) . De esta construcción se eliminó primeramente un sitio Ndel. Para este propósito, el ADN del plásmido pBr322 digerido con Ndel, después de lo cual fueron rellenados los extremos sobresalientes utilizando la enzima de Klenow. Este plásmido pBr322 fue luego religado, digerido con Ndel y transformado dentro de E. coli DH5a. El plásmido pBr/?Ndel obtenido fue digerido con Scal y Salí y el fragmento vector resultante de 3198 pares de bases fue ligado al fragmento Scal-Sall de 15349- pares de bases derivado de pBr/Ad. BamrITR, dando como resultado el plásmido pBr/Ad. Bam-rITR?Ndel el cual tenía por lo tanto un sitio Ndel único. Enseguida se realizó una PCR con los oligonucleótidos *NY-arriba" y NY-abajo" (Figura 2) . Durante la amplificación, los sitios de restricción Ndel y Nsil fueron introducidos para facilitar la clonación de los ADNs de fibra amplificados. La amplificación consistió de 25 ciclos de 45 segundos cada uno a 94°C, 1 minuto a 60°C y 45 segundos a 72°C. La reacción de PCR contenía 25 pmol de los oligonucleótidos NY-arriba o NY-abajo, dNTP 2 mM, amortiguador de PCR con cloruro de magnesio 1.5 mM, y una unidad de la polimerasa estable al calor, Elongase (Gibco, Holanda) . Un décimo del producto PCR fue corrido sobre un gel de agarosa el cual demostró que el fragmento de ADN esperado de ± 2200 pares de bases fue amplificado. Este fragmento de PCR fue subsecuentemente purificado utilizando el sistema del equipo Geneclean (BiolOl Inc.) Luego, la construcción pBr/Ad.Bam-rITR?Ndel así como el producto de PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción Ndel y SbfI . El fragmento de PCR fue subsecuentemente clonado utilizando la enzima ligasa T4 dentro de los sitios Ndel y Sbfl generando de este modo el pBr/Ad . BamR?Fib (Figura 3) .
Amplificación de las secuencias de fibra provenientes de los serotipos del adenovirus
Para hacer posible la amplificación de los ADNs que codifican para la proteina de fibra derivada de los serotipos alternativos, fueron sintetizados oligonucleótidos degenerados. Para este propósito, primeramente las secuencias de ADN conocidas que codifican para la proteína de fibra de serotipos alternativos fueron alineadas para identificar las regiones conservadas en la región de cola, así como la región de protuberancia de la proteína de fibra. A partir del alineamiento, el cual contenía la secuencia nucleotídica de 19 diferentes serotipos que representan los 6 subgrupos, se sintetizaron los oligonucleótidos (degenerados) (ver Tabla I) . También en la Tabla 3 se muestra la combinación de los oligonucleótidos utilizados para amplificar el ADN que codifica para la proteína de fibra de un serotipo específico. La reacción de amplificación (50 µl) contenía dNTPs 2 mM, 25 pmol de cada oligonucleótido, lx de amortiguador estándar de PCR, cloruro de magnesio 1.5 mM, y la polimerasa estable al calor Unit Pwo (Boehringer Mannheim) por reacción. El programa ciclador contenía 20 ciclos, consistiendo cada uno de 30 segundos a 94°C, 60 segundos a 60-64°C y 120 segundos a 72°C. Un décimo del producto de PCR fue corrido sobre un gel de agarosa para demostrar que un fragmento de ADN fue amplificado. De cada plantilla diferente, se realizaron dos reacciones de PCR independientes.
Generación de construcciones de ADN adenoviral quimérico
Todos los ADNs de fibra amplificados, asi como el vector (pBr/Ad. BamR?Fib) fueron digeridos con Ndel y Nsil. Los ADNs digeridos fueron subsecuentemente corridos sobre un gel de agarosa, después de lo cual los fragmentos fueron aislados del gel y purificados utilizando el equipo Geneclean (BiolOl Inc) . Los fragmentos de PCR fueron luego clonados dentro de los sitios Ndel y Nsil de pBr/AdBamR?Fib, generando de este modo pBr/AdBamRFibXX (donde XX significa el número de serotipo del cual fue aislado el ADN de fibra) . Los insertos generados por PCR fueron secuenciados para confirmar la amplificación correcta. Las secuencias obtenidas de los diferentes genes de fibra se muestran en la Figura 4.
Generación de adenovirus recombinante quimérico para la proteina de fibra
Para hacer posible la generación eficiente de los virus quiméricos _se subclonó un fragmento
Avrll a partir de las construcciones pBr/AdBamRFibl 6, pBr/AdBamRFib28, pBr/AdBamRFib40-L, dentro del vector pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 (ECACC depósito #P97082121) reemplazando las secuencias correspondientes en este vector. pBr/Ad . Bam-rITR . pac#8 tiene el mismo inserto adenoviral que pBr/Ad. Bam-rITR pero tiene un sitio
Pací cerca de rITR que hace posible que ITR sea separado de las secuencias vector. La construcción pWE/AD.Af111-Eco fue generada como sigue. Se digirió PWE.pac con Clal y los extremos sobresalientes de cebadura 5' fueron rellenados con la enzima de Klenow. El ADN fue luego digerido con Pací y se aisló a partir de gel de agarosa. PWE/AflIIrITR fue digerido con EcoRI y después del tratamiento con la enzima de Klenow se digirió con Pací. El fragmento grande de 24 kb que contenía las secuencias adenovirales fue asilado del gel de agarosa y ligado al vector pWE.Pac digerido con Clal y hecho romo. Se hizo uso del equipo de expresión de ligadura de Clontech. Después de la clonación de las células XLlO-gold de Stratagene, fueron identificados lps clones que contenían la construcción esperada. PWE/Ad.AlfII-Eco contiene las secuencias Ad5 de los pares de bases 3534 al 27336. Tres construcciones, pClipsal-Luc (Figura _5 ) digerida con Salí, pWE/Ad.Af111-Eco digerida con Pací y EcoRI y pBr/AdBamR.pac/fibXX digerida con Ba HI y Pací se transfectaron dentro de las células productoras de adenovirus (PER.C6, Fallaux y colaboradores, 1998). La Figura 6 describe esquemáticamente el método y los fragmentos utilizados para generar los virus quiméricos. Únicamente se utilizó pBr/Ad. BamRfibl2 sin subclonación en el vector que contiene Pací, y por lo tanto no se liberó de las secuencias vector utilizando Pací, sino que se digirió con Clal el cual rompe aproximadamente 160 pares de bases de las ( secuencias vector acopladas al ITR derecho. Además, el pBr/Ad.BamRfibl2 y el pBr/Ad.BamRfib28 contienen un sitio BamHI interno en las secuencias de fibra, y fueron por lo tanto digeridos con Salí el cual corta en las secuencias vector que flanquean el sitio BamHI . Para la transfección, se diluyeron 2 µg de pCLIPsal-Luc, y 4 µg de pWE/Ad .Af111-Eco y pBr/AdBamR.pac/fibXX en DMEM libre de suero hasta un volumen total de 100 µl . A esta suspensión de ADN se agregaron 100 µl de lipofectamina diluida 2.5x
(Gibco) en medio libre de suero. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la solución de complejo de lipofectamina-ADN fue agregada a 2.5 ml del DMEM libre de suero el cual se agregó subsecuentemente a un matraz de cultivo de tejidos de 25 cm2. Este matraz contenia las células PER.C6 que fueron sembradas 24 horas antes de la transfección a una densidad de lxlO6 células/matraz. Dos horas más tarde, se diluyó el complejo de ADN-lipofectamina que contenía el medio, una vez por la adición de 2.5 ml de DMEM suplementado con 20% de suero fetal de ternera. .Nuevamente 24 horas más tarde el medio fue reemplazado con DMEM fresco suplementado con 10% de suero fetal de ternera. Las células fueron cultivadas por 6 a 8 días, subsecuentemente cosechadas, y congeladas/descongeladas tres veces. El desecho celular fue removido mediante centrifugación 5 minutos a 3,000 rpm, a temperatura ambiente. Del sobrenadante (12.5 ml) se utilizaron 3-5 ml para infectar nuevamente las células PER.C6 (matraces de cultivo de tejido de 80 cm2) . Est reinfección da como resultado el efecto citopatogénico completo (CPE) después de 5 a 6 dias, después de lo cual el adenovirus se cosecha como se describe anteriormente.
Producción de adenovirus quimérico de fibra
10 ml del lis^do crudo anteriormente
"descrito se utilizaron para inocular un fermentador de 1 litro el cual contenia 1 - 1.5 x 106 células
PER.C6/ml que se desarrollan en suspensión. Tres días después de la inoculación, las células fueron cosechadas y concentradas mediante centrifugación por 10 minutos a 1,750 rpm a temperatura ambiente. El adenovirus quimérico presente en las células concentradas se extrajo subsecuentemente y se purificó utilizando el siguiente protocolo de procesamiento corriente abajo. La pella o botón celular se disolvió en 50 ml de NaP0 " 10 mM y se congeló a -20°C. Después del descongelamiento a 37°C, se agregaron 5.6 ml de desoxicolato (al 5% p/v) después de lo cual la solución se homogeneizó. La solución se incubó subsecuentemente por 15 minutos a 37°C para romper completamente las células. Después de la homogeneización de la solución, se agregaron 1875 µl de cloruro de magnesio (1M) y 5 ml de glicerol al 100%. Después de la adición de 375 µl de ADNasa (10 mg/ml) la solución se incubó por 30 minutos a 37°C. El desecho celular se eliminó mediante centrifugación a 1880xg por 30 minutos a temperatura ambiente, sin frenado. El sobrenadante se purificó subsecuentemente de las proteínas al cargar sobre 10 ml de gas freón. Después de la centrifugación por 15 minutos a 2,000 rpm sin frenado a temperatura ambiente, son visibles tres bandas, de las cuales la banda superior presenta el adenovirus. Esta banda fue aislada mediante toma con pipeta, después de lo, cual ésta se cargó sobre un gradiente en bloque de cloruro de cesio amortiguado con Tris/HCl (1 M) (intervalo: 1.2 a 1.4 gr/ml) . Después de la centrifugación a 21,000 rpm por 2.5 horas a 10°C, el virus se purificó de la proteina remanente y del desecho celular, ya que el virus, en contraste a los otros componentes, no migra hacia la solución de cloruro de cesio a 1.4 gr/ml. La banda de virus es aislada, después de lo cual se realiza una segunda purificación utilizando un gradiente continuo amortiguado con Tris/HCl (1 M) de 1.33 gr/ml de cloruro de cesio. Después de la carga del virus sobre la parte superior de este gradiente, el virus se centrifuga por 17 horas a 55,000 rpm a 10°C. Subsecuentemente, la banda de virus se aisla y después de la adición de 30 µl de sucrosa (50 % p/v) se elimina el exceso de cloruro de cesio por tres rondas de diálisis, cada ronda comprendida de 1 hora. Para la diálisis el virus se transfiere a portaobjetos de diálisis (Slide-a-lizer , corte de 10,000 kDa, Pierce, Estados Unidos) . Los amortiguadores utilizados para la diálisis son PBS, los cuales son suplementados con una concentración cada vez mayor de sucrosa (ronda 1 a la 3: 30 ml, 60 ml, y 150 ml de sucrosa (50% de p/v)/1.5 litros de PBS, todos suplementados con 7.5 ml de CaMgCl2 al 2% (p/v) . Después de la diálisis, el virus se elimina del slide-a-lizer, después de lo cual éste es tomado como alícuota en porciones de 25 y 100 µl, después de lo cual el virus se almacena a -85°C. Para determinar el número de partículas virales por ml, se corren 50 µl del lote de virus sobre un cromatógrafo de líquidos a alta presión (HPLC) como se describe por Shamram y colaboradores (1997) . Se encontró que los títulos virales estaban en el mismo intervalo que el lote de virus Ad5.Luc (Ad5.Luc: 2.2 x 1011 vp/ml; Ad5.LucFibl2: 1.3 x 1011 vp/ml; Ad5. LucFibl 6 : 3.1 x
10 12 vp/ml ; Ad5 . LucFib28 5.4 x 10 10 vp/ml ;
Ad5.LucFib40-L: 1.6 x 101¿ vp/ml)
Ejemplo 2: biodistribución de los virus quiméricos después de la inyección intravenosa en vena de la cola de ratas.
Para investigar la biodistribución de los adenovirus quiméricos que poseen fibra 12, 16, 28 ó
40-2, lxlO10 partículas de cada uno de los lotes virales generados se diluyó en 1 ml de PBS, después de lo cual el virus fue inyectado en la vena de la cola de ratas macho adultas Wag/Rij (3 ratas/virus) . Como un control, se utilizó el Ad5 que posee el transgen de la luciferasa. Cuarenta y ocho horas después de la administración del virus, las ratas fueron sacrificadas, después de lo cual se disectaron el higado, el bazo, el pulmón, el riñon, el corazón y el cerebro. Estos órganos fueron subsecuentemente mezclados con 1 ml de amortiguador de lisis (1% de Tritón X-100/PBS) y se desmenuzaron por 30 segundos para obtener un lisado de proteína. El lisado de proteína fue subsecuentemente probado para la presencia de la expresión del transgen (actividad de luciferasa) y se determinó la concentración de proteina para expresar la actividad de luciferasa por µg de proteína. Los resultados, mostrados en la Tabla II, demuestran que en contraste al adenovirus serotipo 5 control, ninguna de las quimeras de fibra son dirigidas específicamente al higado o al bazo. Este experimento muestra que es posible evitar la captación de los adenovirus por parte del hígado, al hacer uso de fibras de otros serotipos. Éste muestra también que la captación por parte del higado no está correlacionada con la longitud del tallo de la fibra, o determinada únicamente por la habilidad de la protuberancia de la fibra para enlazarse a CAR. Las fibras utilizadas tienen diferentes longitudes de tallo y, excepto por la fibra 16, son derivadas de los subgrupos que se sabe tienen una fibra que puede enlazarse a CAR (Roelvink y colaboradores 1998) .
Ejemplo 3: virus quiméricos muestran diferencias en la transducción de células endoteliales y del músculo liso
A) Infección de células endoteliales Humanas
Se aislaron células endoteliales humanas (HUVEC) , se cultivaron y se caracterizaron como se describe previamente (Jaffe y colaboradores 1973; Wijnberg y colaboradores 1997) . En resumen, las células fueron cultivadas sobre cajas recubiertas con gelati?a en M199 suplementado con HEPES 20 mM, pH 7.3
(Flow Labs., Irvine, Escocia), 10% (v/v) de suero humano (banco de sangre local), 10% (v/v) de suero de ternera neonata inactivadq_ por calor (NBCS) (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) , 150 µg/ml del factor de crecimiento de células endoteliales crudo, 5 U/ml de heparina (Leo Pharmaceutics Products, Weesp, Holanda), penicilina (100 Ul/ml) /estreptomicina (100 µg/ml) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) a 37°C bajo una atmósfera de 5% (v/v) de C02/95% (v/v) de aire. Las células utilizadas por los experimentos estuvieron entre el pase 1 y 3. En un primer grupo de experimentos se sembraron 40,000 células HUVEC (un combinado proveniente de 4 diferentes individuos) en cada pozo de placas de 24 pozos, en un volumen total de 200 µl . Veinticuatro horas después de la siembra, las células fueron luego lavadas con PBS, después de lo cual se agregaron a las células 200 µl de DMEM suplementado con 2% de FCS. Este medio contenía diversas cantidades de virus (MOI = 50, 250, 1000, 2500, 5000, y 10000) . Los virus utilizados fueron además del control Ad5, las quimeras de fibras 12, 16, 28 y 40-L (cada infección por triplicado) . Dos horas después de la adición de los virus, el medio se reemplazó con medio normal. Nuevamente, cuarenta y ocho horas más tarde las células fueron lavadas y lisadas mediante la adición de 100 µl de amortiguador de lisis. En la Figura 7a, los resultados se muestran sobre la expresión del transgen por microgramo de proteína total después de la infección de las células HUVEC. Estos resultados muestran que las quimeras de fibra 12 y 28 son incapaces de infectar las células HUVEC, que 40-L infecta las HUVECs con eficiencia similar que el virus Ad5 control, y que la fibra quimera 16 infecta las HUVECs significativamente mejor. En un siguiente grupo de experimentos (n = 8) la quimera de fibra 16 fue comparada con el vector Ad5.Luc sobre HUVEC para la actividad de luciferasa después de la transducción con 2500 partículas virales por célula, de cada virus. Estos experimentos demostraron que la fibra 16 produce, en promedio, actividad de luciferasa incrementada en 8.1 veces (desviación estándar ± 4.6) en comparación con Ad5. En un siguiente experimento, se agregaron un número igual de partículas virales a los pozos de placas de 24 pozos que contenían diferentes concentraciones de células HUVEC. Este experimento fue realizado ya que se sabía que las HUVECs son menos eficientemente infectadas con el adenovirus serotipo 5 cuando estas células alcanzan la confluencia. Para este propósito, las HUVECs fueron ^sembradas a 22500, 45000, 90000, _ y 135000 células por pozo de placas de 24 pozos (por triplicado) . Veinticuatro horas más tarde estas células fueron infectadas como se describe anteriormente con el medio que contenía 4.5 x 108 partículas virales. Los virus utilizados fueron, además del adenovirus serotipo 5, control, la fibra quimera 16. El resultado de la expresión del transgen (RLU) por microgramo de proteína determinado 48 horas después de la infección (ver figura 7b) muestra que el adenovirus de la fibra 16 quimérica es también mejor, adecuado para infectar las células HUVEC incluso cuando éstas células son 100% confluentes, lo cual imita mejor una situación in vivo . Ya que el gen marcador de la luciferasa no proporciona la información concerniente al número de células infectadas, se realizó otro experimento con el adenovirus serotipo 5 y la fibra 16 quimera, ambos llevando una proteina fluorescente verde (GFP) como un gen marcador. Esta expresión de proteina puede ser detectada utilizando un citómetro de flujo el cual realiza la información respecto al porcentaje de células transducidas, así como la fluorescencia por célula. En este experimento las células fueron sembradas a una concentración de 40000 células por pozo y fueron expuestas a virus por 2 horas. El virus utilizado fue Ad5.GFP (8.4 x 1011 vp/ml) y Ad5.Fibl6.GFP (5.1 x 1011 vp/ml). Las células fueron expuestas a una concentración viral de 500 partículas de virus por célula. El análisis citométrico de flujo, 48 horas después de la exposición al virus, demostró que el virus de la fibra 16 da más altos niveles de expresión del transgen por célula, ya que la fluorescencia media, un parámetro que identifica la cantidad de expresión de GFP por célula, es más alta con la fibra 16 en comparación a Ad5 (Figura 7c) . Estos resultados son de este modo consistentes y demuestran que el virus quimérico de la fibra 16 es mejor, adecuado para infectar células endoteliales primarias humanas, en comparación al Ad5.
B) Infección de células del músculo liso humanas
Células del músculo liso fueron aisladas después del aislamiento de EC (Weinberg y colaboradores 1997) . Las venas fueron incubadas con medio (DMEM) suplementado con penicilina/estreptomicina que contenía 0.075% (p/v) de colagenasa (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ, E.U.A) . Después de 45 minutos el medio de incubación que contenía las células desacopladas se lavó a chorro desde las venas. Las células fueron lavadas y cultivadas sobre cajas recubiertas con gelatina en medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 10% de suero humano a 37°C bajo una atmósfera de 5% (v/v) de C02/95% (v/v) de aire. Las células utilizadas para los experimentos estuvieron entre el pase 3-6. Se probó primeramente el panel de virus de fibra quimérica versus el control de adenovirus serotipo 5, para la infección de células del músculo liso humano. Para este propósito, se sembraron 40000 células del músculo liso de la vena umbilical humana (HUVsmc) en los pozos de placa de 24 pozos en un volumen total de 200 µl . Veinticuatro horas después de la siembra, las células se lavaron con PBS después de lo cual se agregaron 200 µl DMEM suplementado con 2% de FCS a las células. Este medio contenía diversas cantidades de virus (MOI = 50, 250, 1250, 2500, y 5000) . Los virus utilizados fueron además del control Ad5, las quimeras de fibra 12, 16, 28 y 40-L (cada infección por triplicado) . Dos horas después de la adición del virus, el medio se reemplazó con medio normal. Nuevamente, cuarenta y ocho horas después las células fueron lavadas y lisadas mediante la adición de 100 µl de amortiguador de lisis. En la Figura 8a, se muestran los resultados de la expresión del transgen por microgramo de proteína total después de la infección de las células HUVsmc. Estos resultados muestran que las quimeras de fibras 12 y 28 son incapaces de infectar las células HUVsmc, que 40-L infecta HUVsmc con similar eficiencia que el virus Ad5 control, y que la fibra quimera 16 infecta HUVsmc significativamente mejor. En un siguiente grupo de experimentos, las células del músculo liso derivadas de la vena safena, arteria ilíaca, arteria mamaria interior izquierda (LIMA) y la aorta, fueron probadas para la infección con la fibra 16 quimera y Ad5 (ambas poseyendo la luciferasa como un gen marcador) . Estos experimentos (n = 11) demostraron que, en promedio, la fibra 16 quimera produjo niveles incrementados en 61.4 veces en la actividad de luciferasa (desviación estándar (SD + 54.8) en comparación al Ad5. La alta desviación estándar (SD) es obtenida debido al hallazgo de que los adenovirus utilizados varían en su eficiencia de infección de SMC derivado de diferentes vasos humanos. En un siguiente experimento, se agregó un número igual de partículas virales a los pozos de placas de 24 pozos que contenían diferentes concentraciones de células HUVsmc en confluencia. Para este propósito, se sembraron las .células HUVsmc a 10000, 20000, 40000, 60000 y 80000 células por pozo de placas de 24 pozos
(por triplicado) . Veinticuatro horas más tarde estas células fueron infectadas como se describe anteriormente con el medio que contenia 2 x 108 partículas virales. Los virus utilizados fueron, además del control adenovirus serotipo 5, la fibra quimera 16. El resultado de la expresión del transgen (RLU) por microgramo de proteina determinado 48 horas después de la infección (ver figura 8b) , muestra que el adenovirus de la fibra 16 quimérica es mejor, adecuado para infectar células del músculo liso incluso cuando estas células son 100% confluentes, lo cual imita o copia mejor una situación i n vi vo . Para identificar el número de SMCs transducidas con la fibra 16 quimera y Ad5, se realizaron experimentos de transducción con Add.GFP y Ad5Fibl6.GFP (lotes idénticos a los utilizados para las infecciones con EC) . SMC de vena umbilical humana fueron sembradas a una concentración de 60000 células por pozo, en placas de 24 pozos, y expuestas por 2 horas a 500 ó 5000 partículas virales por célula de Ad5.GFP o Ad5Fibl 6. GFP . Cuarenta y ocho horas después de la exposición, las células fueron cosechadas y analizadas utilizando un citómetro de flujo. Los resultados obtenidos muestran que la fibra 16 mutante produce aproximadamente 10 veces mayor transducción de SMC, ya que la expresión de GFP medida después de la transducción con 5000 partículas virales de Ad5.GFP es igual a la expresión de GFP después de la transducción con 500 partículas virales por célula de la fibra 16 quimera (Figura 8c) .
C) Mutantes de fibras del subgrupo B diferentes de la fibra 16
El tallo y la protuberancia de la fibra 16 son derivados de adenovirus serotipo 16 los cuales, como se describió al principio, pertenecen al subgrupo B. Con base en los ensayos de hemaglutinación, los patrones de restricción de ADN, y los ensayos de neutralización de los virus del subgrupo B han sido además subdivididos en el subgrupo Bl y B2 (Wadell y colaboradores 1984) . Los miembros del subgrupo Bl incluyen los serotipos 3, 7, 16, 21 y 51. Los miembros del subgrupo B2 incluyen 11, 14, 34 y 35. Para probar si la infección incrementada de las células del músculo liso es un tráfico de todas las fibras derivadas del subgrupo B o específicas para una o más moléculas de fibras del subgrupo B, se compararon la fibra 16 y la fibra 51 (ambas del subgrupo Bl) con la fibra 11 y la fibra 35 (ambas del subgrupo B2) . Para este propósito se infectaron células HUVsmc con cantidades cada vez mayores de partículas virales por célula (156, 312, 625, 1250, 2500, 5000) . Los mutantes de fibra poseen todos el gen marcador de la luciferasa (Ad5Fibll .Luc : 1.1 x 1012 vp/ml; Ad5Fib35Luc: 1.4 x 1012 vp/ml;
Ad5Fib51Luc: 1.0 x 1012 vp/ml) . Con b-ase en la actividad de luciferasa medida y mostrada en la Figura 8d, la infección eficiente de SMC no es un tráfico general de todas las moléculas de fibra del subgrupo B. Claramente, la fibra 16 y la fibra 11 son mejores, adecuadas para la infección de SMC que la fibra 35 y la fibra 51. No obstante, todos los mutantes de fibra del subgrupo B probados infectan SMC mejor, en comparación a Ad5.
D) Experimentos de cultivo de órganos
Se identificó enseguida si la diferencia observada en la transducción de EC y SMC utilizando la quimera de la fibra 16 o el Ad5 puede también ser demostrada en experimentos de cultivo de órganos. Hasta aquí, nos hemos enfocado a los siguientes tejidos: 1) vena safena humana: la vena utilizada en aproximadamente 80% de todos los procedimientos clínicos de injerto de vena. 2) pericardio/epicardio humano: para la distribución de adenovirus recombinantes al fluido pericardial, lo cual después de la infección de las células del pericardio o del epicardio producen la proteína de interés proveniente del transgen llevado por el adenovirus. 3) arterias coronarias humanas: para la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) para prevenir la restenosis. De las arterias coronarias nos enfocamos a la arteria izquierda descendente (LAD) y a la arteria coronaria derecha (RCA) . Las partes de una vena safena humana colocada después de una cirugía de injerto de vena se empalmaron en piezas de aproximadamente 0.5 cm. Estas piezas (n = 3) fueron subsecuentemente cultivadas por 2 horas en 200 ml de _5 x 1010 partículas virales por ml . Después de dos horas de la exposición al virus, las piezas fueron lavadas con PBS y cultivadas por otras 48 horas a 37°C en una incubadora de C02 al 10%. Las piezas fueron luego lavadas, fijadas y teñidas para la expresión del transgen LacZ. Los virus fueron Ad5.LacZ ( 2 .2 x 1012 vp/ml), la fibra 16 quimera Ad5Fibl 6. LacZ (5.2 x 1011 vp/ml, y una fibra 51 quimera: Ad5Fib51. LacZ (2.1 x
10- vp/ l) Las piezas de vena safena fueron macroscópicamente fotografiadas utilizando una cámara digital. Con base en la expresión del transgen LacZ obtenido después de 2 horas de la exposición al virus sobre empalmes de vena safena, los virus quiméricos de la fibra 16 y la fibra 51 dan mayor infección, ya que se observa mucho más tinción azul utilizando estos virus en comparación a Ad5.LacZ (Figura 8e). Se realizaron experimentos idénticos como se describen sobre la vena safena, con el pericardio humano y las arterias coronarias humanas: RCA y LAD. Los resultados de estos experimentos (Figuras 8f-8g-8h respectivamente) junto con los experimentos realizados sobre células primarias, confirmaron la superioridad de los mutantes de la fibra 16 y 51 en comparación a Ad5 en la infección de tejidos cardiovasculares humanos.
E) Expresión de CAR y de _ integrina sobre EC y SMC humanas
A partir de los resultados anteriormente descritos es claro que el adenovirus quimérico con el tallo y la protuberancia proveniente de la fibra 16, es muy adecuado para infectar células endoteliales y células del músculo liso. De este modo, al cambiar la proteína de fibra sobre los virus Ad5 se hizo posible el incrementar la infección de células que son pobremente infectadas por Ad5. La diferencia entre Ad5 y Ad5Fibl6, aunque significativas sobre ambos tipos celulares, es menos impactante sobre las células endoteliales en comparación a las células del músculo liso. Esto puede reflejar diferencias en la expresión del receptor. Por ejemplo, HUVsmc significativamente más integrinas avß5 que HUVEC (ver más adelante) . Alternativamente, esta diferencia puede ser debida a diferencias en la expresión del receptor de la fibra 16. Ad5.LucFibl6 infecta células de músculo liso de vena umbilical, aproximadamente 8 veces mejor que las células endoteliales de vena umbilical, mientras que en el caso de los virus Ad5.Luc las células endoteliales son infectadas mejor que las células del músculo liso. Para probar si_ la infección por Ad5 correlacionaba con la expresión del receptor de estas células, se evaluó la presencia de CAR y av-integrinas en un citómetro de flujo. Para este propósito IxlO5 células HUVEC o HUVsmc fueron lavadas una vez con PBS/0.5% de BSA, después de lo cual las células fueron concentradas mediante centrifugación por 5 minutos a 1750 rpm a temperatura ambiente. Subsecuentemente, se agregaron al botón celular 10 µl de un anticuerpo avß3 diluido 100 veces (Mab 1961, Brunswick chemie, Amsterdam, Holanda) , un anticuerpo avß5 diluido a 100 veces (anticuerpo Mab 1976, Brunswick chemie, Amsterdam, Holanda) , o anticuerpo CAR diluido a 2000 veces que fue una donación del Dr. Bergelson, Harvard Medical School, Boston, E.U.A (Hsu y colaboradores) después de lo cual las células fueron incubadas por 30 minutos a 4°C en un ambiente obscuro. Después de esta incubación, las células fueron lavadas dos veces con PBS/0.5% de BSA y nuevamente concentradas mediante centrif gación por 5 minutos a 1750 rpm a temperatura ambiente. Para marcar las células, se agregaron 10 ml de IgGl de rata anti-ratón marcado con ficoeritrina (PE) al botón celular, después de lo cual las células fueron nuevamente incubadas por 30 minutos a 4°C en un ambiente obscuro. Finalmente, las células fueron lavadas dos veces con PBS/0.5% de BSA y analizadas sobre un citómetro de flujo. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla III. A partir de los resultados se puede concluir que HUVsmc no expresa niveles detectables de CAR, confirmando que estas células son diferentes para transducir con un adenovirus que entra a las células vía el receptor CAR.
F) Infección de células humanas A549
Como un control para los experimentos realizados sobre células endoteliales y células del músculo liso, se infectaron células A549 para establecer si una cantidad igual de partículas virales de diferentes adenovirus quiméricos muestran diferencias significativas en la expresión del transgen sobre líneas celulares que son fácilmente infectadas por el adenovirus. Esto es para investigar si las diferencias observadas en la eficiencia de infección sobre células endoteliales y del músculo liso son específicas del tipo celular. Para este propósito, se sembraron 105 células A549 en placas de 24 pozos, en un volumen de 200 µl . Dos horas después de la siembra, el medio fue reemplazado con medio que contenía cantidades diferentes de partículas de fibra quimera 5, 12, 16, ó 40-L (MOI = 0, 5, 10, 25, 100, 500) . Veinticuatro horas después de la adición del virus, las células fueron lavadas una vez con PBS después de lo cual las células fueron lisadas por la adición de 100 µl de amortiguador de lisis a cada pozo (1% de Tritón X-100 en PBS) después de lo cual se determinó la expresión del transgen (actividad de luciferasa) y la concentración de la proteína. Subsecuentemente, la actividad de luciferasa por µg de proteína fue calculada. Los datos, mostrados en la tabla IV, demuestran que los virus Ad5.Luc infectan las células A549 de manera más eficiente, mientras que la eficiencia de infección de Ad5LucFibl6 o Ad5LucFib40-L es unas pocas veces más baja. Esto significa que la infección eficiente de las células endoteliales y especialmente las células del músculo liso, es debida a diferencias en el enlace de los virus a estas células y no a la cantidad de virus o a la calidad de los virus utilizados.
Tabla I
Serotipo Oligonucleótido Oligonucleótido de cola de protuberancia
4 A 1 8 B 2 9 B 2 12 E 3 16 C 4 19p B 2 28 B 2 32 B 2 3 6 B 2 37 B 2 4 0 - 1 D 5 4 C -2 D 6 41 - s D 5 41 - 1 D 7 4 9 B .2 50 B 2 51 C 8
A 5 CCC GTG TAT CCA. TAT GAT GCA GAC AAC GAC CGA CC- B 5 CCC GTC TAC CCA TAT GGC TAC GCG CGG- 3* C 5 CCK GTS TAC CCA TAT CAÁ GAT GAA AGC- 3' O 5 CCC GTC TAC CCA TAT GAC ACC TYC TCA ACT C- 3'
E 5 CCC GTT TAC CCA TAT GAC CCA TTT GAC ACA TCA GAC- 1 5 CCG ATG CAT TTA TTG TTG GGC TAT ATA GGA - 3'
2 5 CCG ATG CAT TYA TTC TTG GGC RAT ATA GGA - 3'
3 5 CCG ATG CAT TTA TTC TTG GGR AAT GTA WGA AAA GGA
4 5 CCG ATG CAT TCA GTC ATC TTC TCT GAT ATA - 3'
5 5 CCG ATG CAT TTA TTG TTC AGT TAT GTA GCA - 3'
6 5 GCC ATß CAT TTA TTG TTC TGT TAC ATA AGA - 3'
7 . S - CCG TTA ATT AAG CCC TTA TTG TTC TGT TAC ATA AGA A
B 5 CCG ATG CAT TCA GTC ATC YTC TWT AAT ATA - 3'
Tabla II
Tabla III Tabla IV
REFERENCIAS
Arnberg N., Mei Y. y Wadell G., 1997, Fiber Genes of adenovirus with tropism for the eye and the genital tract. Virology 227: 239-422.
Bargelson, J. M., Cunningham, J.A., Droguett, G., Kurt-Jones, S.A., Krithivas, A., Hong, J.S. Horwitz, M.S., Crowell, R. L. And Finberg, R.W. (1997) Isolation of a common receptor for coxsackie B virus and adenovirus 2 y 5. Science 275: 1320-1323.
Bout A. (1997) Gene therapy, p. 167-182. In : D.J.A. Crommelin and R.D. Sindelar (ed.) Pharmaceutical Biotechnology, Harwood Academic Publishers.
Bout, A. (1996) Prospects for human gene therapy. Eur. J. Drug Met. And Pharma . 2, 175-179.
Blaese, M., Blankenstein, T., Brenner, M., Cohen-Hage auer, O., Gansbacher, B., Russel, S., Sorrentino, B . and Velu, T. (1995) Cáncer Gene Ther.
2: 291-297 Brody, S.L. and Crystal, R.G. (1994) Adenovirus mediated in vivo gene transfer. Ann. N. Y. Acad. Sci. 716:90-101.
Cárter, A.J., Laired, J.R., Farb, A., Kufs, W., Wortham, D.C. and Virmani, R. (1994) Morphologic characteristics of lesión formation and time course of smooth muscle cell proliferation in a porcine proliferative restenosis model. J. Am. Coil. Cardiol. 24: 1398-1405.
Chroboczek J., Ruigrok R.W.H. and Cusack S., 1995. Adenovirus fiber, p. 163-200. In: W. Doerfler and P. Bohm (ed) . The molecular repertoire of adenovíruses , I. Springer-Verlag, Berlín._
Defer C, Belin M., Caillet-Boudin M. and Boulanger P., 1990. Human adenovirus-host cell interactions ; comparative study with members of subgroup B and C. Journal of Virology 64 (8): 3661-3673.
Fallaux, F.J. Bout, A, van der Velde, I et al. New helper cells and matched El-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication competent adenovirus. Human Gene Therapy, 9 (1998), pl909-1917.
Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. and Brown, F. (1991) Classification and nomenclature of víruses. Pifth report of the international Committee on taxonomy of viruses, Arch. Virol. Suppl. 2: 140-144.
Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L. And Falck-Pedersen E. (1996) Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitope. Journal of Virology 70 (4): 2116-2123.
Greber, _ U. F. , Willets, M., Webster, P., and_ Helenius , A. (1993). Stepwise dismanteling of adenovirus 2 during entry into cells. Cell 75: 477-486.
Hynes, R.O. (1992) Integrins: versatility, modulation and signalling in cell adhesión. Cell 69: 11-25.
Herz, J. And Gerard, R.D. (1993) Adenovirus-mediated transfer of low density lipoprotein receptor gene acutely accelerates cholesterol clearence in normal mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2812-2816.
Hierholzer, J.C. (1992) Adenovirus in the immunocompromi sed host. Clin. Microbiol Rev 5, 262-274.
Hierholzer, J.C., Wigand, R., Anderson, L.J., Adrián, T., and Gold, J.W.M. (1988) Adenovirus from patients with AIDS: a plethora of serotypes and a description of five new serotypes of subgenus D (types 43-47) . J. Infect. Dis. 158, 804-813.
Hong, S.S., Karayan, L., Tournier, J., Curiel, D.T. and Boulanger, P.A. (1997) Adenovirus type 5 fiber knob binds to MHC class I a2 domain at the _surface of human epithelial and B lymphoblastoid cells. EMBO J. 16: 2294-2306.
Hsu, K.H., Lonberg-Holm, K., Alstein, B. and Crowell, R.L. (1988) A monoclonal antiboy specific for the cellular receptor for the group B coxaackieviruses. J. Virol 62(5) : 1647-1652.
Huard, J., Lochmuller, H., Acsadi, G., Jani . A., Massie, B. and Karpati, G. (1995) The route of administration is a major determinant of the transducction efficiency of rat tissues by adenoviral recombinants . Gene Ther. 2: 107-115.
Ishibashi, M. and Yasue, H. (1984) The adenoviruses, H.S. Ginsberg, ed., Plenum Press, Londen, New York. Capítulo 12, 497-561.
Jaffe, E.A., Nachman, R.L., Becker, C.G., Minick, C.R. (1973) Culture of endothelial cells derived from umbilical veins . Identification by morphologic and immunologic criteria, J. Clin. Invest. 52, 2745-2756.
Kass-Eisler, A., Falck-Pederson, E., Elfenbein, D.H., Alvira, M., Buttrick, P.M. and Leinwand, L.A. (1994) The impact of developmental stage, route of administration and the immune system on adenovuris-mediated gene transfer. Gene Ther. 1: Khoo, S.H., Bailey, A.S., De Jong, J.C., and Mandal, B.K. (1995). Adenovirus infections in human immunodeficiency virus-positive patients: Clinical features and molecular epide iology, J. Infect. Dis 172, 629-637.
Kidd, A.H., Chroboczek, J., Cusack, S., and Ruigrok, R.W. (1993) Adenovirus type 40 virions contain two distinct fibers. Virology 192, 73-84.
Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T. and Curiel D.T. (1996) Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. J. Virol. 70(10): 6839-6446.
Krasnykh V.N., Dmitriev I., Mikheeva G., Miller C.R., Belousova N. And Curiel D.T. (1998) Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the Hl loop of the fiber knob, J. Virol. 72(3): 1844-1852.
Law, L., Chillón, M., Bosch, A., Armentano, D., Welsh, _M.J. and Davison, B.L. (1998) Infection of primary CTMS cells by different adenoviral serotypes: Searching for a more efficient vector. Abstract 1° Annual Meeting American Society of Gene Therapy, Seattle, Washington.
Leppard, K.N. (1997) E4 gene function in adenovirus, adenovirus yector and adeno-associated virus infections. J. Gen. Virol. 78: 2131-2138.
Lloyd Jones, D.M. and Bloch, K.D. (1996) The vascular biology of nitric oxide and its role in atherogenesis . Annu. Rev. Med. 47: 365-375.
Morgan, C, Rozenkrantz, H.S., and Mednis, B. (1996) Structure and development of viruses as observed in the electrón microscope. X. Entry and uncoating of adenovirus. J. Virol 4, 777-796.
Roelvink, P.W., Kovesdi, I. and Wickham, T.J. (1996) Comparative analysis of adenovirus fiber-cell interaction: Adenovirus type 2 (Ad2) and Ad9 utilize the same cellular fiber receptor but use different binding stratagies for attachemnt. J. Virol. 70: 7614-7621.
Roelvink. P.W., Lizonova, A., Lee, J.G.M._¿ Li, Y., Bergelson, J.M., Finberg, R.W., Brough, D.E., Kovesdi, I. and Kickham, T.J. (1998) The coxsackie-adenovirus receptor protein can function as a cellular attachment protein for adenovirus serotypes from subgroups A, C, D, E, and F. J. Virol, 72: 7909-7915.
Rogers, B.E., Douglas J.T., Ahlem, C, Buchsabum, D.J., Frincke, J. And Curiel, D.T. (1997) Use of a novel cross-linking method to modify adenovirus tropism. Gene Ther. 4: 1387-1392.
Schulick, A.H., Vassalli, G., Dunn, P.F., Dong, G., Rade J.J., Zamarron, C. and Dichek, D.A. (1997) . Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat Carotid arteries.
Schnurr, D and Dondero, M.E. (1993) Two new candidate adenovirus serotypes Intervirol. 36, 79-83.
Schwartz, R.S., Edwards, W.D., Huber, K.C., Antoniudes, L.C. Bailey, K.R., Camrud, A.R., Jorgenson, M.A. and Holmes, D.R. Jr . (1993) Coronary restenosis: Prospects for solution and new perspectives from a porcine model. Mayo Clin. Proc. 68: 54-62.
Shi, Y., Pieniek, M., Fard, A., O'Brien, J., Mannion, J.D. and Zalewski, A. (1996) Adventitial remodelling after coronary arterial injury. Circulation 93: 340-348.
Shabram, P.W., Goroux, D.D., Goudreau, A.M., Gregory, R.J., Horn, M.T., Huyghe, B.G., Liu, X., Nunnally, M.H., Sugarman, B.J. and Sutjipto, S. (1997) Analytical anion-exchange HPLC of recombinant type-5 adenoviral particles. Hum. Gene Ther. 8(4) : 453-465.
Signas, G., Akusjarvi, G., and Petterson, U. (1985). Adenovirus 3 fiberpolypeptide gene: Complications for the structure of the fiber protein. J. Virol. 53, 672-678.
Stevenson S.C., Rollence M., White B., Weaver L. And McClelland A., (1995) Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to tow different cellular receptors via the fiber head domain. J. Virol 69(5): 2850-2857.
Stevenson S.C., Rollence M., Marshall-Neff J. And McClelland A. (1997) Selective targenting of human cells by a chimaeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. J. Virology 71(6): 4782-4790.
Stouten, P.W.F., Sander, C, Ruigrok, R.W.H., and Cusack, S. (1992) New triple helical model for the shaft of the adenovirus fiber. J. Mol. Biol. 226, 1073-1084.
Svensson, V. and Persson, R. (1984). Entry of adenovirus 2 into Hela cells. J. Virol. 51. 687-694.
Van der Vliet, P.C. (1995) Adenovirus DNA replication In: W. Doerfler and P. Bdhm (eds.), The molecular repertoire of adenovirus II. Springer-Verlag, Berlín.
Varga, M.J., Weibull, C, and Everitt, E. (1991) . Infectious entry pathway of adenovirus type 2. J. Virol 65, 6061-6070.
Varenne, O., Pislaru, S., Gillijns, H., Van Pelt, N., Gerard, R.D., Zoldhelyi, P., Van de Werf, F., Collen, D. and Janssens, S.P. (1998) Local adenovirus-mediated transfer of human endothelial nitric oxide synthetase t reduces luminal narrowing after coronary angioplasty in pigs. Circulation 98: 919-926.
Wadell G (1984) Molecular Epidemoilogy of human adenoviruses Curr. Top. Microbiol. Immunol . 110, 191-220.
Wickham T. J., Carrion M.E. and Kovesdi I., 1995. Targeting of adenovirus pentón base to new receptors through replacement of its RGD motif with other receptor-specific peptide motifs. Gene Therapy 2: 750-756.
Wickham T.J., Segal, D.M., Roelvink, P.W., Carrion M.E., Lizonova, A., Lee, G-M., and Kovesdi, I. (1996) Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. J. Virol. 70 (10), 6831-6838.
Wickham, T.J., Mathias, P., Cherish, D.A., and
Nemerow, G.R. (1993) Integrins avb3 and avb5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell 73, 309-319.
Wijnberg, M.J., Quax, P.H. A., Nieuwenbroek, N.M.E., Verheijen J.H. (1997). The migration of human smooth muscle cells in vitro is mediated by plasminogen activation and can be inhibited by al- pha (2)- macro globulin receptor associated protein. Thromb . And Ha emos ta s . 78, 880-886.
Wold, W.S., Tollefson, A.E. and Hermiston, T.W. (1995) E3 transcription unit of adenovirus In: W. Doerfler and P. Bdhm (eds.), The molecular repertoire of adenoviruses I. Springer-Verlag, Berlín.
Zabner, J., Armentano, D., Chillón, M. , Wadsworth, S.C. and Welsh, M.J. (1998) Type 17 fiber enhances gene transfer. Resumen 1* Junta Anual de la Sociedad Americana de Terapia Génica, Seattle, Washington.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (37)
1. Un vehículo para la distribución de genes, caracterizado porque ha sido provisto con al menos un tropismo de tejido para células del músculo liso y/o para células endoteliales.
2. Un vehículo para la distribución de genes, caracterizado porque ha sido desprovisto de al menos un tropismo de tejido para células hepáticas.
3. Un vehículo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vehiculo ha sido desprovisto de al menos un tropismo de tejido para células hepáticas.
4. Un vehiculo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque el tropismo de tejido está siendo provisto por una cápside de virus.
5. Un vehículo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la cápside comprende fragmentos de proteína de al menos dos diferentes virus.
6. Un vehículo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque al menos uno de dichos virus es un adenovirus.
7. Un vehículo de conformidad con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizado porque al menos uno de los virus es un adenovirus del subgrupo B.
8. Un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a la 7, caracterizado porque al menos uno de los fragmentos de proteína comprende un fragmento de determinación de tropismo de tejido, de una proteína de fibra derivada de un adenovirus del subgrupo B.
9. Un vehiculo de conformidad con cualquiera de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8, caracterizado porque el adenovirus del subgrupo B es el adenovirus 16.
10. Un vehiculo de conformidad con las reivindicaciones 7 a la 9, caracterizado porque los fragmentos de proteina no derivados de un adenovirus del subgrupo B son derivados de un adenovirus del subgrupo C, preferentemente del adenovirus 5.
11. Un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 10, caracterizado porque comprende un ácido nucleico derivado de un adenovirus.
12. Un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 11, caracterizado porque comprende un ácido nucleico derivado de al menos dos diferentes adenovirus.
13. Un vehiculo de conformidad con la reivindicación 11 o con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico comprende al menos una secuencia que codifica para una prpteína de fibra que comprende al menos un fragmento de determinación de tropismo de tejido de una proteína de fibra de adenovirus del subqrupo B, preferentemente de adenovirus 16.
14. Un vehículo^ de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 13, caracterizado porque el ácido nucleico del adenovirus es modificado tal que ha sido reducida o suprimida la capacidad de dicho ácido nucleico del adenovirus para replicarse en una célula objetivo.
15. Un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a la 14, caracterizado porque el ácido nucleico del adenovirus es modificado tal que ha sido reducida o suprimida la capacidad del sistema inmune del huésped para montar una respuesta inmune contra las proteínas del adenovírus, codificadas por el ácido nucleico del adenovirus.
16. Un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15, caracterizado porque comprende un vector adenoviral mínimo o un vector quimérico Ad/AAV.
17. Un vehiculo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 16, caracterizado porque además comprende al menos un ácido nucleico no adenoviral.
18. Un vehículo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque al menos uno de los ácidos nucleicos no adenovirales es un gen seleccionado del grupo de genes que codifican para: una apolipoproteína, una sintasa del óxido nítrico, una timidina-cinasa del virus del herpes simple, una interleucina-3, una interleucina-la, una proteína (anti) angiogénesis tal como la angiostatina, una proteína anti-proliferación, una proteina de antimigración de células del músculo liso, un factor de crecimiento endotelial vascular (VGEF) , un factor de crecimiento de fibroblastos básico, un factor la inducible por hipoxia (HIF-la) o un PAI-1.
19. Una célula para la producción de un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 18, caracterizada porque comprende el medio para el ensamblaje de los vectores, en donde el medio incluye un medio para la producción de una proteína de fibra de adenovirus, en donde la proteína de fibra comprende al menos un fragmento de determinación de tropismo de tejido de una proteína de fibra de un adenovirus del subgrupo B.
20. Una célula de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la célula es o es derivada de una célula PER.C6 (ECACC depósito número 96022940) .
21. El uso de un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 18, como un producto farmacéutico.
22 . El uso de conformidad con la reivindicación 21, para el tratamiento de enfermedad cardiovascular.
23. El uso de conformidad con la reivindicación 21, para el tratamiento de una enfermedad, tratable por transferencia de un ácido nucleico terapéutico a las células del músculo liso y/o a las células endoteliales.
24. Una cápside de adenovirus con o provisto con un tropismo de tejido para células del músculo liso y/o células endoteliales, caracterizada la cápside porque comprende preferentemente proteínas de al menos dos diferentes adenovirus, y en donde al menos un fragmento de determinación del tropismo de tejido de una proteína de fibra, es derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16.
25. Una cápside de adenovirus que ha sido desprovista de un tropismo de tejido para células hepáticas, caracterizada la cápside porque comprende preferentemente proteínas de al menos dos diferentes adenovirus, y en donde al menos un fragmento de determinación del tropismo_de tejido de una proteína de fibra, es derivado de un adenovirus del subgrupo B, preferentemente del adenovirus 16.
26. El uso de una cápside de adenovirus de conformidad con la reivindicación 24 y/o la reivindicación 25, para la distribución de ácido nucleico a células del músculo liso y/o a células endoteliales .
27. El uso de una cápside de adenovirus de conformidad con la reivindicación 26, en un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.
28. La construcción pBr/Ad.BamR?Fib, caracterizada porque comprende las secuencias 21562- 31094 y 32794-35938 del adenovirus 5.
29. La construcción pBr/AdBamRfibl6, caracterizada porque comprende las secuencias 21562- 31094 y 32794-35938 del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteína de fibra.
30. La construcción pBr/AdBamR.pac/fibl 6, caracterizada porque comprende las secuencias 21562- 31094, y 32794-35938 del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteína de fibra, y que comprende además_ un sitio Pací único en proximidad de la repetición terminal derecha del adenovirus 5, en la cadena principal de la secuencia no adenoviral de dicha construcción.
31. La construcción pWE/Ad .AfHlrlTRfibl 6, caracterizada porque comprende las secuencias 3534- 31094 y 32794-35938 del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteína de fibra.
32. La construcción pWE/Ad.AfHIrITRDE2Afibl6, caracterizada porque comprende las secuencias 3534-22443, 24033- 31094 y 32794-35938 del adenovirus 5, que comprende además un gen del adenovirus 16 que codifica para la proteína de fibra. -
33. El uso de una construcción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a la 32, para la generación de un vehiculo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 18, o una cápside de adenovirus de conformidad con la reivindicación 24 o con la reivindicación 25.
34. La producción de un vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 18 o una cápside de adenovirus de conformidad con la reivindicación 24 o la reivindicación 25.
35. El uso de un vehiculo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 18, para la generación de una genoteca._
36. El uso de una proteína de fibra del adenovirus 16 para la distribución de ácido nucleico a células del músculo liso y/o a las células endoteliales .
37. El uso de una proteína de fibra del adenovirus 16, en una cápside de adenovirus para privar a dicha cápside de un tropismo de tejido para células hepáticas.
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