ES2244015T3 - Metodo para mejorar la recuperacion de troponina i y t. - Google Patents

Metodo para mejorar la recuperacion de troponina i y t.

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ES2244015T3
ES2244015T3 ES97954145T ES97954145T ES2244015T3 ES 2244015 T3 ES2244015 T3 ES 2244015T3 ES 97954145 T ES97954145 T ES 97954145T ES 97954145 T ES97954145 T ES 97954145T ES 2244015 T3 ES2244015 T3 ES 2244015T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO QUE FACILITA LA RECUPERACION DE TROPONINA I Y/O DE TROPONINA T EN UNA MUESTRA; DICHO PROCEDIMIENTO CONSISTE EN AÑADIR TROPONINA C A DICHA MUESTRA O EN UNA SUPERFICIE DE LA CUAL SE RECUPERA LA TROPONINA I Y/O LA TROPONINA T.

Description

Método para mejorar la recuperación de troponina I y T.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un método para facilitar la recuperación de troponina I y/o troponina T a partir de una muestra, el método comprende: el contacto de la muestra con la superficie, a la que se ha añadido la troponina C, en donde el paso de añadir troponina C comprende la adición de un solución que comprende troponina C y además comprende el secado de la superficie seguido de la adición de la solución, por lo que dicha troponina C reduce la absorción de troponina I y/o troponina T a dicha superficie, y en donde la superficie es un filtro de sangre.
Antecedentes
El infarto de miocardio es una de las causas de muerte más comunes en los Estados Unidos. Aproximadamente 5 millones de individuos que sufren dolor torácico son examinados cada año en hospitales a lo largo de Estados Unidos, pero sin embargo, a menos del 30% de estos individuos se les diagnostica posteriormente un infarto de miocardio. Un diagnostico correcto y rápido del infarto de miocardio es importante tanto para el paciente que sufre el infarto de miocardio como para el sistema sanitario que puede minimizar los costes provocados por una pronta identificación de los individuos que necesitan tratamiento.
El diagnóstico del infarto de miocardio se lleva a cabo normalmente en el departamento de urgencias de un hospital. Un individuo que tiene los síntomas del infarto de miocardio es tratado de forma diferente según la obviedad de su condición. Generalmente se realiza un electrocardiograma para valorar la condición del corazón; sin embargo, aproximadamente el 50% de los pacientes que sufren un infarto de miocardio no presentan un electrocardiograma diagnóstico. El médico se enfrenta entonces a un problema de diagnóstico y tratamiento del paciente con un posible infarto de miocardio. De esta forma el diagnóstico y el tratamiento son difíciles para pacientes con un posible infarto de miocardio cuyos electrocardiogramas no resultan definitivos.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha instituido unas directrices para el diagnostico del infarto de miocardio que estipulan que un individuo debe mostrar dos de los tres criterios siguientes: 1) sufrir dolor torácico o contar con un historial clínico de enfermedad cardiaca; 2) un electrocardiograma diagnóstico; y 3) niveles elevados de creatin quinasa (CK) o isoenzima MB de la creatin quinasa (CKMB). De esta manera, para el 50% de los individuos que se dirigen a hospitales por un posible infarto de miocardio y presentan un electrocardiograma no diagnóstico, el médico debe confiar en los síntomas del dolor torácico y un nivel elevado de CK o CKMB para diagnosticar un infarto de miocardio.
El ensayo de CK o CKMB se lleva a cabo generalmente en laboratorios de hospitales utilizando instrumentos sofisticados. Los ensayos incluyen otros ensayos enzimáticos e inmunoensayos que detectan la actividad o masa que la CK o la CKMB presentan en las muestras de sangre.
Durante un infarto de miocardio, las células musculares mueren y liberan su contenido a la corriente sanguínea. La CKMB se libera entre estos componentes celulares. La CKMB se vuelve elevada por encima del valor nominal y puede servir como diagnóstico para el infarto de miocardio. La especificidad de la CKMB para el diagnóstico de infarto de miocardio no es del 100% porque el músculo esquelético es otra fuente de CKMB en el cuerpo. Puesto que la masa de músculo esquelético corporal supera con creces la masa de músculo cardíaco, la concentración de CKMB en sangre en individuos saludables variará debido al funcionamiento catabólico normal de las células de músculo esquelético. En general, la concentración de CKMB que puede ser indicativa de infarto de miocardio está por encima de los 5-7 ng/ml (Circulation 87, 1542-1550 (1993), Clin. Chem. 39, 1725-1728 (1993)). La concentración de CKMB en los individuos con alguna lesión en el músculo esquelético o que han practicado mucho ejercicio se ha mostrado elevada, por encima de los 9ng/ml (Clin. Chem. 38, 2396-2400 (1992)). Por eso, el problema de especificidad al utilizar la CKMB como marcador para el infarto de miocardio ha llevado a la búsqueda de otros marcadores más específicos que sean liberados únicamente por tejido muscular cardíaco dañado.
Recientemente se ha descubierto que la troponina I y la troponina T son más específicas que la CKMB para el diagnóstico del infarto de miocardio (Circulation 83, 902-912 (1991), Clin. Chem. 40, 1291-1295 (1994)), aunque la troponina T presenta algunas desventajas como marcador, puesto que se encuentra en concentraciones elevadas en pacientes con enfermedades renales (Clin. Chem. 41, 312-317 (1995)). La utilización de la troponina I como marcador diagnóstico para el infarto de miocardio también parece satisfacer muchos de los requisitos médicos (Clin. Chem. 40, 1291-1295 (1994), Clin. Chem. 41, 312-317 (1995)). La Solicitud de Patente Internacional WO 96/33415 revela métodos para mejorar la recuperación de la troponina I y/o de la troponina T añadiendo troponina C a una muestra que en principio comprende troponina I y/o troponina T. La unión de troponina I y/o troponina T a la superficie de, por ejemplo, membranas, filtros o vasos, disminuye significativamente formando complejos con troponina C que muestran una tendencia reducida a la adsorción a esas superficies más que a los monómeros de troponina respectivos.
Bodor, G.S. et al. (Clin. Chem. (1992) 38, 2203-2214) informan sobre la generación y el análisis de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la troponina I cardiaca. Con el propósito de evaluar la presencia de dichos anticuerpos en suero de ratón se realiza un método de capas consecutivas en placas microtitulada con troponina C y troponina I.
El complejo de troponina en músculo está comprendido por troponina I, C y T. Estos componentes de la troponina existen como diferentes isoformas específicas del tejido. La troponina C cuenta con dos isoformas, una de músculo cardiaco con contracción lenta y una de contracción rápida. La troponina I y la T se expresan como diferentes isoformas en contracción lenta, contracción rápida y músculo cardíaco (Biochem. J. 171, 251-259 (1978), J. Biol. Chem. 265, 21247-21253 (1990), Hum. Genet. 88, 101-104 (1991), Circul. Res. 69, 1226-1233 (1991)). Las únicas isoformas cardiacas de la troponina I y T permiten distinguirlas inmunológicamente de otras troponinas del músculo esquelético. Por tanto, la emisión a la sangre de troponina I y T de tejido muscular cardíaco dañado se ha relacionado con casos de angina inestable y de infarto de miocardio. Sin embargo, la pruebas previas no se han dirigido a otras formas de troponina I y T en sangre.
El complejo de troponina en el músculo está estrechamente unido al aparato contráctil. Aproximadamente un 6% de la troponina en el tejido cardíaco existe como una proteína libre en el citoplasma y se cree que esa cantidad de troponina T la libera del músculo dañado (Am. J. Cardiol. 67, 1360-1367 (1991)).
Las conformaciones de troponina I, T y C cambian cuando se unen para formar complejos binarios y ternarios (Biochemistry 33, 12800-12806 (1994), J. Biol. Chem. 254, 350-355 (1979), Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 535-559 (1987)). La comprensión de los cambios conformacionales de la troponina I y la troponina T así como la heterogeneidad de las proteínas en la sangre es básica para el desarrollo de procedimientos de diagnóstico correcto para la medición de concentraciones de troponina I y troponina T. Además, la troponina I se muestra inestable en sangre (Direction Insert for Troponin I Immunoassay, Sanofi/ERIA Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, France), y los mecanismos responsables de esa inestabilidad todavía no se comprenden. Esta invención, en conexión con el método de la invención, proporciona una composición de troponina I y T estable, que es útil en inmunoensa-
yos.
Divulgación de la invención
Se revela un método para facilitar la recuperación de troponina I y/o troponina T de una muestra, como se define en la reivindicación 1. Dicho método comprende: poner en contacto la muestra con una superficie a la que se ha añadido troponina, donde el paso de añadir troponina C incluye añadir una solución que contenga troponina C y posteriormente secar la superficie tras la adición de la solución, de forma que la troponina C reduce la absorción de la troponina I y/o troponina T a dicha superficie, y donde la superficie es un filtro sanguíneo.
Descripción de las figuras
La figura 1a ilustra la cinética de oxidación con aire de la troponina I medida mediante inmunoensayos.
La figura 1b ilustra la cinética de oxidación de la troponina I mediante peróxido medida mediante inmunoensayos.
La figura 2 ilustra la cinética de reducción de la troponina I mediante ditiotreitol y la reoxidación de la troponina I reducida con peróxido medida en inmunoensayos.
La figura 3 ilustra el efecto de la troponina C sobre el inmunoensayo de la troponina I en presencia y ausencia de troponina T y de inhibidores de la unión.
La figura 4 ilustra la cinética de disrupción del complejo ternario de troponina cardiaca humana en presencia o ausencia de inhibidores de la unión medida en inmunoensayos para troponina I.
La figura 5a-5f ilustra el efecto de los inhibidores de sobre troponina I en inmunoensayos de unión en muestras de pacientes con infarto de miocardio confirmado.
Modos de llevar a cabo la invención Definiciones
Tal como se usa aquí, un "anticuerpo" o "proteína receptor" se refiere a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de unión de un anticuerpo, un anticuerpo recombinante, o una proteína receptora que específicamente se une a una diana. La unión específica de una sustancia indica la calidad de dicha sustancia para no unirse a algo a lo que no debe unirse específicamente; a la inversa, la sustancia tendrá una afinidad mayor por algo que se una específicamente que por algo que no se una específicamente.
Tal como se usa aquí, un anticuerpo no sensible en un inmunoensayo es un anticuerpo que para cada forma de troponina de interés produce un valor de respuesta de ensayo que es siempre el mismo, con un factor cercano a 2, y preferiblemente el mismo en alrededor del 20%, como los valores de respuesta de ensayo para las otras formas de interés. Así, un anticuerpo no sensible es aquél que mostrará la detección de más de una forma de troponina en un inmunoensayo.
Tal como se usa aquí, un anticuerpo no sensible en un inmunoensayo es aquél que para una forma o grupo de formas de troponina muestra un valor de respuesta de ensayo que es como mínimo de factor 2 o mayor, y preferiblemente, de factor 5 o mayor, respecto a los valores de respuesta de ensayo para otras formas. Así, un anticuerpo sensible es aquél que manifiesta una detección preferencial de una forma o grupo de formas en un inmunoensayo de troponina.
Tal como se usa aquí, las nueve formas de troponina utilizadas son: 1) el complejo ternario cardíaco; 2) el complejo binario de troponina I(oxidada)/T cardiaca; 3) el complejo binario de troponina I(reducida)/T cardiaca; 4) el complejo binario de troponina I (oxidada)/C; 5) el complejo cardíaco de troponina I (reducida)/C cardiaca; 6) el complejo binario de troponina T/C cardiaca; 7) troponina I (oxidada) cardiaca libre; 8) troponina I (reducida) cardiaca libre; y, 9) troponina T cardiaca libre.
Tal como se usa aquí, una "zona" es un concepto que está correlacionado con la capacidad para identificar distintas señales perceptibles. Una zona, por lo tanto, puede corresponderse con una región geográfica o con la capacidad para identificar de forma separada distintas señales perceptibles. Las señales perceptibles pueden distinguirse, pero no exclusivamente, por variaciones en las siguientes características: longitud de onda de fluorescencia, así como la absorbancia o reflectancia óptica; tiempo de vida o energía de transición entre los estados electrónicos; potenciales de oxidación-reducción; características calorimétricas; o tipo de señal (por ejemplo, fluorescencia contrapuesta a radiactividad, contrapuesta a absorbancia óptica).
Tal como se usa aquí, la troponina libre es troponina que no pertenece a un complejo. Un complejo de troponina puede ser binario o ternario.
Tal como se usa aquí, una "etiqueta", "generador de señal" o "elemento generador de señal" es una entidad que puede tomar un gran número de formas diferentes: Enzimas y sus efectos resultantes sobre un sustrato, partículas metálicas coloidales, partículas de látex o sílice con colorantes incorporados, y partículas teñidas son ejemplos de generadores de señal. Un enzima puede reaccionar en un sustrato para dar un producto que sea perceptible, por ejemplo, mediante fluorescencia de longitud de onda (ultravioleta, visible, infrarrojo), o perceptible por su efecto sobre el pH.
Modos
Esta invención va dirigida en conexión con el método de la invención al ensayo de troponina I y troponina T y los complejos de estas proteínas en fluidos corporales, particularmente, en la sangre, suero y plasma humanos. La presencia de troponina I y T cardiacas en la sangre, a concentraciones por encima de la nominal, sirve de diagnóstico de daños en el tejido muscular cardíaco. La troponina I y T existe en varias conformaciones en la sangre, que puede ser la misma o diferente a sus conformaciones nativas en el tejido muscular. Estas conformaciones de las moléculas de troponina pueden reaccionar de forma diferente con anticuerpos.
Las proporciones de troponina I y T monoméricas y los complejos binarios y ternarios pueden estar relacionadas con el estado metabólico del corazón. Según las reactividades de los anticuerpos con troponina I y T y con complejos purificados de troponina, las concentraciones de troponina I y T y sus complejos pueden ser ahora dilucidados en muestras de sangre de pacientes que padecen infarto de miocardio. Esta invención está relacionada con la mejora de la recuperación de troponina I y/o troponina T de una muestra.
Centrarse en la troponina I y T para su uso como marcador en caso de infarto de miocardio tiene su base, en parte, en su medida molecular: porque las proteínas son relativamente pequeñas, se cree que se filtran de células dañadas más rápido que las proteínas mayores.
Además, los términos "troponina I y T", tal como se usan aquí, pueden referirse a las troponinas libres, que no forman complejos, o a las troponinas en complejos binarios o ternarios. La troponina I cardiaca humana contiene dos cisteínas, en las posiciones 80 y 97 (FEBS Letters, 270, 57-61 (1990). En esta materia, durante la purificación de troponina I de los tejidos, el estado de oxidación de la troponina I está dirigido a la forma reducida utilizando varios reductores, incluyendo el mercaptoetanol, ditiotreitol y similares (Can. J. Biochem. 54, 546-553 (1976), Methods Enzymol. 85, 241-263 (1982)). Tras la purificación, la presente materia también muestra cómo mantener troponina I en la forma reducida para evitar la formación de disulfuros intermoleculares (j. Biol. Chem. 258, 2951-2954 (1983)).
En el desarrollo de inmunoensayos para proteínas diana, la proteína diana purificada actúa como estándar con el que juzgar la sensibilidad y especificidad del inmunoensayo utilizando los anticuerpos que se han seleccionado. Las cisteínas en la troponina I pueden oxidarse rápidamente, de forma intramolecular, para alterar la conformación de la proteína.
Ensayo para complejos de troponina y troponina I y T libre
Se describe un ensayo de troponina I y troponina T, concretamente un inmunoensayo, en el que los anticuerpos seleccionados para dicho ensayo se unen a secuencias específicas cardíacas del complejo ternario, de complejos binarios y de la troponina I o T libre (no forma complejos) para medir las fracciones de troponina I y T en complejos (unidas) y libres, respectivamente. Las secuencias específicas de troponina I y T cardíacas se describen en FEBS Lett. 270, 57-61 (1990) y Genomics 21, 311-316 (1994). En la Solicitud de Patente Internacional con número PCT/US94/05468 (WO 94/27156) se describe un péptido sintético compuesto por 14 aminoácidos que imita una secuencia específica de troponina I cardiaca y los métodos usados para preparar anticuerpos para el péptido.
El inmunoensayo puede formularse con un cóctel de anticuerpos para unir todos los complejos de troponina y las troponinas I y T libres. También se puede formular el inmunoensayo con anticuerpos específicos que reconozcan epítopos de la troponina I y T en los complejos, así como la troponina I y T libre. Además, el inmunoensayo puede formularse con anticuerpos que unen epítopos a las interfases de las proteínas que componen los complejos y anticuerpos que unen la troponina I y T libre.
Un inmunoensayo preferido para troponina I o T conlleva la conjugación de un anticuerpo o un cóctel de anticuerpos a una etiqueta o un generador de señal para formar uno o más conjugados de anticuerpos, que son capaces de unirse a regiones específicas de los complejos de troponina I o T cardiaca o a troponina I y T libre. Un experto en la materia observará que un generador de señal tiene varias formas. Enzimas, partículas metálicas coloidales, partículas de látex y sílice con colorantes incorporados, y partículas colorantes son ejemplos de generadores de señal. Los anticuerpos pueden conjugarse a los generadores de señal de varias formas utilizando reactivos heterobifuncionales, como se enseña en Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Co., Rockford, IL y en Uniform Latex Particles por Leigh B. Bangs, Seragen Diagnostics Inc., Indianápolis. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, se inmoviliza otro anticuerpo o cóctel de anticuerpos, como se enseña en BioTechniques 4, 272-283 (1986), y se pone la membrana en un aparato, por ejemplo, como se describe en las patentes estadounidenses 4.727.019 y 5.458.852. El anticuerpo inmovilizado es complementario al conjugado de anticuerpos. El anticuerpo inmovilizado y el conjugado de anticuerpos forman complejos de sándwich con los complejos de troponina I o T así como con la troponina I y la T respectivamente. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes o complejos de troponina de músculo cardíaco dañado se mezcla con el conjugado de anticuerpos para formar una mezcla de reacción que se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca luego en el aparato antes mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y los componentes y complejos de troponina ligados a los conjugados de anticuerpos se unen a los anticuerpos inmovilizados. Luego se elimina el exceso de conjugados de anticuerpos que no se ha unido con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos.
Un inmunoensayo particularmente preferido para la troponina I implica por lo menos la conjugación de dos anticuerpos a una etiqueta o un generador de señal para formar conjugado de anticuerpos. Uno de los anticuerpos del conjugado es capaz de unirse al componente de la troponina T de los complejos ternarios de troponina y el otro anticuerpo es capaz de unirse a las moléculas de troponina binarias y a las libres. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, se inmoviliza otro anticuerpo o cóctel de anticuerpos, y se coloca la membrana en el aparato, como se ha descrito previamente. El anticuerpo inmovilizado es complementario a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina I unida a complejos de troponina o a la troponina I que no forma complejos. Se mezcla una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes o complejos de troponina de músculo cardiaco dañado con el conjugado de anticuerpos para formar una mezcla de reacción que se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca luego en el aparato antes mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y los componentes y complejos de troponina, unidos a los conjugados de anticuerpos, se unen a los anticuerpos inmovilizados. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, el conjugado de anticuerpos se une a la troponina I en complejos ternarios mediante del anticuerpo específico de la troponina T y a las moléculas libres y binarias de troponina I mediante el anticuerpo específico de la troponina I. El anticuerpo o anticuerpos de captura de la fase sólida se unen a conjugados de anticuerpos que están unidos a troponina I libre y a complejos ternarios de troponina que contienen troponina I.
Un inmunoensayo particularmente preferido para troponina I (oxidada y reducida) implica la conjugación de por lo menos dos anticuerpos a una etiqueta o generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. Uno de los anticuerpos del conjugado es capaz de unirse a la troponina I oxidada y el otro anticuerpo es capaz de unirse a las moléculas de troponina I reducida. En una fase sólida de hasta dos zonas discretas, por ejemplo una membrana, se inmoviliza otro anticuerpo o cóctel de anticuerpos, y la membrana se coloca en un aparato, como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo inmovilizado es complementario a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina I oxidada o reducida. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes de troponina de músculo cardíaco dañado se mezcla con el conjugado de anticuerpos para formar una mezcla de reacción que se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca entonces en dicho aparato. La muestra fluye a través de la membrana y la troponina I oxidada y reducida, unida a los conjugados de anticuerpos, se une a los anticuerpos inmovilizados. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, los conjugados de anticuerpos se unen a la troponina I oxidada mediante un anticuerpo específico para troponina I oxidada y a la troponina I reducida mediante un anticuerpo específico para troponina I reducida. El anticuerpo o anticuerpos de captura en la fase sólida sólo se unen a conjugados de anticuerpos que estén unidos a troponina I oxidada y reducida. Este inmunoensayo puede tener aplicación en la estimación del tiempo después de ocurrido el infarto.
Otro inmunoensayo particularmente preferido para troponina I implica la conjugación de un anticuerpo o un cóctel de anticuerpos a una etiqueta o a un generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. El conjugado de anticuerpos se une o bien a troponina I ligada a complejos de troponina, o bien a troponina I libre. Inmovilizado en una fase sólida, por ejemplo una membrana, en 3 zonas discretas, están inmovilizados anticuerpos o un cóctel de anticuerpos que se une a complejos ternarios, a complejos binarios de troponina I y a troponina I libre. La membrana se coloca en el aparato anteriormente descrito. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina T que se une a la troponina T del complejo ternario se inmoviliza en una zona discreta, un anticuerpo de troponina I que se une a complejos binarios de troponina I (troponina I/C y I/T) se inmoviliza en otra zona discreta y un anticuerpo de troponina I que se liga únicamente a troponina I libre se inmoviliza en otra zona discreta. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina I de complejos o libre, según se defina para cada zona discreta. De forma alternativa, en una fase sólida, por ejemplo una membrana, en 2 zonas discretas, están inmovilizados anticuerpos o un cóctel de anticuerpos que se unen a complejos de troponina I (binaria y ternaria) y a troponina I libre. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina T que se une al complejo ternario de troponina T y un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I de los complejos binarios se inmovilizan en una zona discreta y un anticuerpo de troponina I que se une solamente a la troponina libre se inmoviliza en la segunda zona discreta. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina I formando complejos o libres, como se define para cada zona discreta. Aún otra realización de esta invención utiliza anticuerpos en la fase sólida para la detección de complejos de troponina I que se unen a las interfaces de los dominios de unión de troponina I/T y I/C. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes o complejos de músculo cardiaco dañado se mezcla con el conjugado de anticuerpos para formar una mezcla de reacción que se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca luego en el anteriormente mencionado aparato. La muestra fluye a través de la membrana y los componentes y complejos de troponina, unidos a uno o más conjugados de anticuerpos, se unen a los anticuerpos inmovilizados respectivos en las zonas discretas. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, el conjugado de anticuerpos se une a la troponina I y a complejos binarios y ternarios de troponina I mediante uno o más anticuerpos específicos para troponina I. El anticuerpo o anticuerpos de captura en zonas discretas de la fase sólida se une a conjugados de anticuerpos que se unen a troponina I libre o complejos de troponina que contengan troponina I según se defina en cada zona discreta. Este inmunoensayo permite la cuantificación de las fracciones de troponina I, a saber, las fracciones de troponina libre y en complejos. Las enseñanzas descritas aquí demuestran que la troponina libre o en complejos existe en muestras de plasma y suero de pacientes con infarto de miocardio confirmado. La determinación de las fracciones de troponina I libre y en complejos puede conllevar datos clínicos importantes relacionados con el tipo y la extensión del daño muscular, por ejemplo, en caso de angina inestable o infarto de miocardio, así como el éxito de la terapia trombolítica.
Otro inmunoensayo particularmente preferido mide la troponina cardiaca en complejos ternarios, en complejos binarios (troponina I/T, T/C y I/C) y la troponina I y T cardiaca libre. Este método implica la conjugación de anticuerpos o cócteles de anticuerpos a una etiqueta o un generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. Los conjugados de anticuerpos se unen a la troponina T y I unida a complejos de troponina o bien a la troponina T y I libre. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, en 1 zona discreta, están inmovilizados anticuerpos o cócteles de anticuerpos que se unen a complejos ternarios, complejos binarios de troponina I y T a la troponina I y T libre, y la membrana se coloca en el aparato anteriormente mencionado. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I del complejo ternario, hasta 3 anticuerpos diferentes, cada uno reconoce las interfaces de los dominios de unión de troponina I/T, T/C y I/C, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I libre y un anticuerpo de troponina T que se une a la troponina T libre están inmovilizados en una zona discreta. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina T y I libre y en complejos. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes o complejos de troponina de músculo cardiaco dañado se mezcla con conjugados de anticuerpos para formar una mezcla de reacción que se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca luego en el aparato anteriormente mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y los componentes y complejos de troponina, unidos a uno o más anticuerpos conjugados, se unen a los respectivos anticuerpos inmovilizados en la zona discreta. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, los conjugados de anticuerpos se unen a troponina I y T libre, a troponina I y T de complejos binarios y a la troponina I o T del complejo ternario. Los anticuerpos de captura en la zona discreta de la fase sólida se unen a los conjugados de anticuerpos que son específicos de la troponina I y T libre a los complejos de troponina. Este inmunoensayo permite cuantificar los complejos de troponina ternaria, la troponina T/C, I/T, I/C y la troponina I y T libre. Un experto en la materia observará que los anticuerpos específicos para varias formas de troponina pueden conjugarse con una o más generadores de señal para formar conjugados de anticuerpos y los anticuerpos anteriormente descritos para los conjugados pueden añadirse a la fase sólida en una zona discreta. La determinación de la concentración total de troponina puede llevar a un inmunoensayo más sensible al daño en el músculo cardíaco, que a su vez permitirá un diagnóstico más rápido de angina inestable o infarto de miocardio, y por lo tanto, una administración pronta de terapia trombolítica.
Un inmunoensayo particularmente preferido para troponina T implica la conjugación de por lo menos dos anticuerpos a una etiqueta o una señal generadora para formar un conjugado de anticuerpos. Uno de los anticuerpos del conjugado es capaz de unirse a los componentes de troponina I de los complejos de troponina y el otro anticuerpo es capaz de unirse a las moléculas de troponina T binaria y libre. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, se inmoviliza otro anticuerpo o cóctel de anticuerpos, y la membrana se coloca en el aparato anteriormente descrito. El anticuerpo inmovilizado es complementario a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina T unida a complejos de troponina o a la troponina T libre. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener complejos de troponina o componentes de músculo cardiaco dañado se mezcla con el conjugado de anticuerpos para formar una mezcla de reacción y se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca entonces en el mencionado aparato. La muestra fluye a través de la membrana y los componentes y los complejos de troponina, unidos a los conjugados de anticuerpos, se unen a los anticuerpos inmovilizados. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, el conjugado de anticuerpos se une a los complejos de troponina mediante el anticuerpo específico para troponina I y a todas las moléculas de troponina T libres y binarias mediante el anticuerpo específico para troponina T. El anticuerpo o anticuerpos de captura en la fase sólida se unen a conjugados de anticuerpos que están ligados a troponina T libre y a complejos de troponina que contienen troponina T.
Otro inmunoensayo particularmente preferido para la troponina T implica la conjugación de un anticuerpo o un cóctel de anticuerpos a una etiqueta o generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. El conjugado de anticuerpos se une o bien a la troponina T ligada a complejos de troponina o a troponina T libre. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, en 3 zonas discretas, están inmovilizados anticuerpos o cócteles de anticuerpos que se unen al complejo ternario, los complejos binarios de troponina T y la troponina T libre, y la membrana se coloca en el aparato anteriormente mencionado. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I del complejo ternario es inmovilizada en una zona discreta, un anticuerpo de troponina T que se une a los complejos binarios de troponina T (troponina I/T y C/T) es inmovilizada en otra zona discreta y un anticuerpo de troponina T que se une sólo a la troponina T libre es inmovilizado en aún otra zona discreta. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina T de complejos o libre, como se define en cada zona discreta. De forma alternativa, en una fase sólida, por ejemplo una membrana, en 2 zonas discretas, están inmovilizados anticuerpos o cócteles de anticuerpos que se unen a los complejos de troponina T (binarios y ternarios) y la troponina T libre. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina T que se une a la troponina I del complejo ternario y un anticuerpo de troponina T que se une a la troponina T de los complejos binarios son inmovilizados en una zona discreta y el anticuerpo de troponina T que se une a sólo la troponina T libre es inmovilizado en la segunda zona discreta. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina T libre o en complejos, como se define en cada zona discreta. Una realización de esta invención implica utilizar anticuerpos en la fase sólida para la detección de complejos de troponina T que se unen a las interfaces de los dominios de unión de la troponina C/T e I/T. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes o complejos de troponina de músculo cardiaco dañado se mezcla con conjugados de anticuerpos para formar una mezcla de reacción que se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca entonces en el aparato mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y componentes y los complejos de troponina, ligados a uno o más conjugados de anticuerpos, se unen a sus anticuerpos inmovilizados respectivos en las zonas discretas. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, el anticuerpo conjugado se une a la troponina T y a los complejos de troponina T binarios y ternarios mediante el anticuerpo o anticuerpos específicos de troponina T. Los anticuerpos de captura en zonas discretas en la fase sólida unen los conjugados de anticuerpos que están ligados a la troponina T libre a complejos de troponina que contienen troponina T, según se defina para cada zona discreta. Este inmunoensayo permite cuantificar las fracciones de troponina T, a saber, las fracciones de troponina libre y formando parte de complejos. Las enseñanzas descritas aquí demuestran que la troponina libre y en complejos existe en muestras de plasma y suero de pacientes con infarto de miocardio confirmado. La determinación de las fracciones de troponina T libre y en complejos conlleva datos clínicos importantes relacionados con el tipo y la extensión del daño muscular, por ejemplo, de angina inestable e infarto de miocardio, o el éxito de la terapia trombolítica.
Otro inmunoensayo particularmente preferido mide de forma independiente la troponina cardiaca en complejos ternarios, en complejos binarios (troponina I/T, T/C e I/C) y la troponina I y T libre. Este método implica la conjugación de anticuerpos o un cóctel de anticuerpos a una etiqueta o un generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. Los conjugados de anticuerpos se unen a troponina T e I ligada a complejos de troponina o a la troponina T e I libre. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, en 6 fases discretas, están inmovilizados anticuerpos o cócteles de anticuerpos que se unen a complejos ternarios, a complejos binarios de troponina I y T, y a troponina I y T libre, y luego la membrana se coloca en el aparato anteriormente descrito. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I del complejo ternario es inmovilizada en una zona discreta, 3 anticuerpos diferentes, cada uno reconoce la interfaz del dominio de unión de la troponina I/T, T/C o I/C, se inmovilizan en 3 zonas discretas, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I libre es inmovilizado en otra zona y un anticuerpo de troponina T que se une a la troponina T libre es inmovilizada en otra zona. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina T y I libre y en complejos, según se defina en cada zona discreta. Una muestra de plasma o suero sospechosa de contener componentes o complejos de troponina de músculo cardiaco dañado se mezcla con conjugados de anticuerpos para formar una mezcla de reacción y se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca luego en el aparato mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y los componentes y complejos de troponina, ligados a uno o más conjugados de anticuerpos, se unen a sus respectivos anticuerpos inmovilizados en las zonas discretas. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, los conjugados de anticuerpos se unen a la troponina I y T libre, a la troponina I y T de los complejos binarios y a la de los ternarios. Los anticuerpos de captura en zonas discretas de la fase sólida se unen a los conjugados de anticuerpos, que son específicos para la troponina I y T libre y para los complejos de troponina. Este inmunoensayo permite cuantificar la troponina en complejos ternarios, la troponina T/C, I/T, I/C y la troponina I y T libre. Las enseñanzas descritas aquí demuestran que la troponina libre y en complejos está presente en las muestras de plasma y suero de pacientes con infarto de miocardio confirmado. La determinación de las fracciones de troponina en complejos ternarios, la troponina I y T en complejos binarios y la troponina I y T libre pueden conllevar datos clínicos importantes relacionados con el tipo y la extensión del daño muscular, por ejemplo en la angina inestable o el infarto de miocardio o pueden llevar al éxito en la terapia
trombolítica.
Otro inmunoensayo particularmente preferido mide de forma independiente la troponina cardiaca en complejos ternarios, en complejos binarios (troponina I/T, T/C, I/C, I/T oxidada e I/C oxidada) y la troponina I cardiaca libre (oxidada y reducida) así como la T. Este método implica la conjugación de anticuerpos o un cóctel de anticuerpos a una etiqueta o generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. Los conjugados de anticuerpos se unen a troponina T e I ligada a complejos de troponina o a troponina T e I libre. En una fase sólida, por ejemplo una membrana, en hasta 9 zonas discretas, están inmovilizados anticuerpos o cócteles de anticuerpos que se unen a los complejos ternarios, a los complejos binarios de troponina I e I, y la troponina I y T libre. Luego la membrana se coloca en un dispositivo, como se ha descrito antes. Por ejemplo, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I de los complejos ternarios es inmovilizado en una zona discreta, 5 anticuerpos diferentes, cada uno reconoce las interfaces de los dominios de unión de troponina I/T, T/C, I/C, I/T oxidada y I/C oxidada son inmovilizados en hasta 5 zonas discretas, un anticuerpo de troponina I que se une a la troponina I libre (oxidada y reducida) es inmovilizada en hasta 2 zonas y un anticuerpo de troponina T que se une a la troponina T libre es inmovilizado en otra zona. Los anticuerpos inmovilizados son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos para formar complejos sándwich con troponina T y I libre y en complejos, según se defina en cada zona discreta. Una muestra de plasma y suero sospechosa de contener componentes de troponina de músculo cardiaco dañado se mezcla con conjugados de anticuerpos para formar una mezcla de reacción y se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca luego en el aparato anteriormente mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y los complejos y componentes de troponina, ligados a uno o más conjugados de anticuerpos, se unen a los respectivos anticuerpos inmovilizados en las zonas discretas. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal es desarrollada y observada visualmente o mediante instrumentos. En este procedimiento de ensayo, los conjugados de anticuerpos se unen a la troponina I y T libre, a la troponina I y T de los complejos binarios y a la troponina I y T de los complejos ternarios. Los anticuerpos de captura en las zonas discretas de la fase sólida se unen a los conjugados de anticuerpos que son específicos para la troponina I y T libre y para los complejos de troponina. Este inmunoensayo permite cuantificar la troponina de los complejos ternarios, la troponina T/C, I/T, I/C, I/T oxidada y I/C oxidada, así como la troponina I libre (oxidada y reducida) y la T. La troponina libre o en complejos está presente en las muestras de plasma y suero de pacientes con infarto de miocardio confirmado. La determinación de las fracciones individuales de la troponina en complejos ternarios, de troponina I y T en complejos binarios y la troponina I y T libre puede conllevar datos clínicos importantes con relación al tipo y extensión del daño muscular, por ejemplo, en caso de angina inestable o de infarto de miocardio, o puede llevar al éxito con la terapia
trombolítica.
Un inmunoensayo particularmente preferido para medir la concentración de troponina en dos o más formas, por ejemplo troponina I y T en complejos y libre, utiliza anticuerpos que presentan varios grados de reconocimiento para las diferentes formas de troponina. Un anticuerpo o cóctel de anticuerpos se conjugan a una etiqueta o generador de señal para formar un conjugado de anticuerpos. El conjugado de anticuerpos tiene la capacidad de unirse a cada forma de troponina que hay que cuantificar. El anticuerpo ideal para el conjugado sería un anticuerpo "no sensible", tal y como se ha definido con anterioridad. En una fase sólida, por ejemplo una membrana en un aparato, en zonas discretas, están inmovilizados anticuerpos o cócteles de anticuerpos que son complementarios a los anticuerpos del conjugado de anticuerpos. Las características esenciales de los anticuerpos inmovilizados se definen en términos de su respuesta en el ensayo, y serán, por lo tanto, discutidos tras la descripción del ensayo. Los rasgos esenciales del ensayo pueden ser discutidos para el caso en el que se quiera cuantificar dos formas de troponina. En el caso en el que se quiera cuantificar dos formas de troponina, forma 1 y 2, se utilizará dos zonas discretas. El sistema se calibra usando dos juegos de calibradores en una matriz apropiada, como sangre, plasma o suero. Un juego de calibradores contiene preferiblemente la forma 1 de troponina a varias concentraciones y el otro contiene la
forma 2.
A parte, cada calibrador se mezcla con el conjugado de anticuerpos para formar una mezcla de reacción y se deja incubar. La mezcla de reacción se coloca entonces en el aparato mencionado. La muestra fluye a través de la membrana y la troponina, ligada a uno o más conjugados de anticuerpos, se une a los anticuerpos inmovilizados en las zonas discretas. Los conjugados de anticuerpos excedentes no unidos se eliminan con un tampón de lavado. La señal en las zonas 1 y 2 es desarrollada y se mide para cada calibrador. El sistema más fácil e idóneo sería uno en el que la señal del ensayo sea lineal o lo más aproximado a la linealidad, respecto a la concentración de troponina. En este caso, el procedimiento de calibración conlleva las siguientes cuatro pendientes independientes del ensa-
yo:
m_{11}= pendiente del ensayo determinada en la zona 1 utilizando la forma 1 de troponina como calibrador 
\hskip0.5cm
(Ecn. 1a)
m_{12}= pendiente del ensayo determinada en la zona 1 utilizando la forma 2 de troponina como calibrador 
\hskip0.5cm
(Ecn. 1b)
m_{21}= pendiente del ensayo determinada en la zona 2 utilizando la forma 1 de troponina como calibrador 
\hskip0.5cm
(Ecn. 1c)
m_{22}= pendiente del ensayo determinada en la zona 2 utilizando la forma 2 de troponina como calibrador 
\hskip0.5cm
(Ecn. 1d) 
\newpage
y las siguientes dos constantes independientes del ensayo:
(Ecn. 2a)C_{1}= señal de ensayo en la zona 1 correspondiente a concentración cero de troponina.
(Ecn. 2b)C_{2}= señal de ensayo en la zona 2 correspondiente a concentración cero de troponina.
Un experto en la materia observará que las pendientes y constantes que se muestran en las Ecns. 1 y 2 podrían también determinarse en una calibración en la que las soluciones de calibración comprendieran ambas formas de troponina a varias proporciones de concentración diferentes. El ensayo con una muestra de sangre, plasma o suero sospechosa de contener formas 1 y 2 de troponina se lleva a cabo de la forma descrita arriba para los calibradores. El ensayo conlleva dos valores de señal: S_{1}es la señal medida en la zona 1 y S_{2} es la señal medida en la zona 2. Las dos señales se describen para dos ecuaciones lineales independientes:
(Ecn. 3a)S_{1} = m_{11} [forma 1] + m_{12}[forma 2] + C_{1}
(Ecn. 3b)S_{2} = m_{21} [forma 1] + m_{22}[forma 2] + C_{2}
Donde [forma 1] y [forma 2] son las concentraciones de troponina de la forma 1 y 2 respectivamente en la muestra. Las ecuaciones 3 pueden solucionarse utilizando técnicas estándar de álgebra lineal para determinar valores para la [forma 1] y la [forma 2] en el ejemplo si:
(Ecn. 4)m_{11}m_{22} - m_{12}m_{21} \neq 0
(véase por ejemplo, Mathematical Methods for Physicists, Acad. Press, NY, NY). Las ecuaciones 1 y 4 definen, por lo tanto, las respuestas de ensayo que se requieren para los anticuerpos en la zona 1 y 2 para determinar las concentraciones de forma 1 y 2 de la troponina de las señales S_{1} y S_{2} medidas. En general, la precisión de la determinación de las concentraciones de la forma 1 y 2 aumenta con un incremento en la diferencia que muestra la Ecn. 4. El valor de la diferencia necesaria para obtener un resultado satisfactorio dependerá de la precisión de la calibración y del ensayo, y la precisión necesaria en la concentración de troponina. Para la mayoría de sistemas de ensayo, un ensayo ideal es aquél en el que el anticuerpo o cóctel de anticuerpos en al menos una de las zonas es sensible a si la troponina es de forma 1 o 2, donde "sensible" tiene el significado descrito en la sección anterior. Por ejemplo, o bien la proporción m_{11}/m_{12} o la proporción m_{22}/m_{21}, o ambas, deberían ser mayores que 2. Este procedimiento para determinar las concentraciones de dos formas de troponina puede extenderse a más de dos formas. Si hay que medir N formas, se debe utilizar N zonas discretas. La calibración debe realizarse usando un mínimo de N+1 soluciones calibradoras que comprendan las N formas de troponina. Se ensaya con una muestra sospechosa de contener las N formas de troponina. Se mide la señal de ensayo de cada una de las N zonas; la señal S_{1} de la zona iª puede expresarse así:
(Eqn. 5)S_{i} = \sum\limits_{j=1}^{j=N} m_{ij} [forma \ j]+c_{i}
donde m_{ij} es la pendiente del ensayo determinada en la zona iª utilizando la forma j de la troponina como calibrador y [forma j] es la concentración de forma j de la troponina en la muestra. La Ecn. 5 define un grupo de ecuaciones lineales N que pueden solucionarse para determinar las concentraciones de todas las formas N de troponina utilizando técnicas estándar si el determinante de la matriz constituido por los m_{ij} no es igual a cero. Para la mayoría de sistemas de ensayo, el ensayo ideal es aquél en el que por lo menos N-1 de las zonas contiene un anticuerpo o cóctel de anticuerpos que sea sensible a la forma de troponina en la que se encuentre, esto es, la proporción m_{11}/m_{ij}, donde I\neqj, es mayor que 2. Finalmente, estos conceptos pueden extenderse al caso en el que la respuesta de ensayo no es lineal con la concentración de troponina. En este caso, la señal medida en el iº de N zonas seguirá la siguiente relación:
(Eqn. 6)S_{i}=\sum\limits^{j=N}_{j=1} F_{ij}
donde F_{ij} es una función de [forma j] que describe la dosis-respuesta (señal como función de [forma j]) de la forma j en la zona I y que está determinada en un procedimiento de calibración parecido a los descritos anteriormente. La ecuación 6 describe un sistema de N ecuaciones no lineales que pueden solucionarse para determinar las concentraciones de las N formas de troponina utilizando, por ejemplo, métodos de aproximación (por ordenador) con los que los expertos en la materia están familiarizados.
Los inhibidores que afectan a las constantes de afinidad de la asociación entre complejos de troponina I o de troponina T pueden añadirse a la muestra antes o durante la formación de la mezcla de reacción, de forma que se mide la troponina I libre o la troponina T, respectivamente. Los inhibidores de unión pueden desbaratar los complejos de troponina o pueden abrir o desenmarañar parcialmente el complejo, de forma que algunas o todas las interacciones entre los componentes de la troponina se rompen y los epítopos se vuelven más accesibles para que se unan los anticuerpos. Se puede seleccionar los inhibidores entre un grupo de compuestos que incluyen, pero no únicamente, agentes quelantes metálicos y péptidos que compiten con la troponina I y T para unirse con las proteínas del aparato contráctil. Los agentes quelantes metálicos, particularmente aquéllos que se unen al calcio y al magnesio, disminuyen la constante de afinidad, por ejemplo, de la unión de la troponina I y la C con un factor de 10 comparado con la afinidad en presencia de calcio (Biochemistry 33, 12729-12734 (1994)). Entre los péptidos que afectan a la unión de troponina I y T a las proteínas del aparato contráctil se encuentra el mastoparan, la melitina y las secuencias de péptidos que imitan secuencias de troponina I y T en sus dominios de unión con las proteínas del aparato contráctil (Biochemistry 31, 11326-11334 (1992), J. Biol. Chem. 267, 15715-15723(1992), Biochemistry 33, 8233-8239 (1994)). Otros péptidos que son útiles como inhibidores son los que imitan los dominios de unión de los componentes de la troponina. Los dominios de unión están descritos, por ejemplo, en Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16, 535-559 (1987), y con la información del dominio de unión, un experto sintetiza el péptido que imita al péptido de la proteína en el dominio de unión.
Se puede añadir troponina C a la muestra antes o durante la formación de la mezcla de reacción en el inmunoensayo para que casi toda la troponina I o T de la muestra se ligue debido a la troponina C en el transcurso del ensayo. La concentración de troponina C en la muestra debería oscilar entre 0,5 \mug/ml y 100 \mug/ml, y preferiblemente entre 1 y 10 \mug/ml.
La troponina C e T también puede añadirse a las muestras antes o durante la formación de la mezcla de reacción del inmunoensayo para troponina I para ligar toda o casi toda la troponina I en complejos ternarios de troponina. Las concentraciones de troponina C y T en la muestra deberían oscilar entre 0,5 y 100 \mug/ml y preferiblemente entre 1 y 10 \mug/ml.
Por el contrario, la troponina C y I puede añadirse a muestras antes o durante la formación de la mezcla de reacción en inmunoensayos para troponina T para ligar toda o casi toda la troponina T en la forma de complejo ternario de troponina. Las concentraciones de troponina C y T en la muestra deberían oscilar entre 0,5 y 100 \mug/ml y preferiblemente entre 1 y 10 \mug/ml.
Estas realizaciones donde los componentes de troponina se añaden a la muestra antes o durante la formación de la mezcla de reacción presentan varias ventajas.
Primero, la troponina I adsorbe de forma tenaz a las superficies de cristal y a varias membranas que pueden provocar una concentración de troponina I menor. La troponina T también adsorbe a superficies. Sin embargo, cuando se une a troponina C o en complejos ternarios, las características de adsorción de la troponina I y T pueden reducirse dramáticamente. Así, la recuperación del complejo de troponina I/C o T/C o del complejo ternario puede ser mejor que la troponina I o T.
Segundo, si se necesitan los anticuerpos que se unen sólo a la troponina I o T en complejos, entonces el proceso de selección del anticuerpo es menos estricto porque los anticuerpos no necesitan tener una afinidad similar a la de la troponina I o T libre.
Estabilización de la troponina I o T para los reactores de calibración
Se sabe que la troponina I y T es inestable en formulaciones acuosas, así como en muestras de pacientes. La inestabilidad (aparente) de las proteínas está relacionada con el estado de oxidación de la troponina I, la propensión de la troponina I y T a formar complejos con otras proteínas de troponina y las características de adsorción de la troponina I y T a las superficies.
La estabilización de la troponina I viene dada por la oxidación intramolecular de las cisteínas y la proteína se almacena sin agentes reductores con grupo tiol, como el mercaptoetanol, ditiotreitol y similares.
El almacenaje de la troponina I en soluciones que contienen altas concentraciones de reductores con tiol mantiene las cisteínas, sobre todo, en su forma reducida. Sin embargo, la oxidación y reducción intramolecular de una proteína es un proceso dinámico mediante el cual la proteína existirá durante un tiempo en su forma oxidada aunque haya presencia de reductores. En el caso de reductores, como el mercaptoetanol o la N-acetilcisteína, esto es, moléculas reductoras con un único grupo tiol, se formarán disulfuros mixtos de los reductores y tiol proteico. La semivida de estos disulfuros mixtos será una función de la concentración de reductores y el índice de oxidación intramolecular; es decir, los disulfuros mezclados podrán ser reducidos tanto por el reactor reductor con tiol como por otras cisteínas proteicas, suponiendo que ambas cisteínas no están en forma de disulfuro mixto. En el caso de reducir la troponina I oxidada intramolecularmente, el reductor con un único grupo tiol reducirá la cistina intramolecular para producir una cisteína y un disulfuro mixto de la proteína. Éste último será reducido por la cisteína proteica o por el reductor tiol. Este proceso continúa y finalmente la concentración de reductor se reduce a un nivel en el que ya no puede mantener a la proteína en estado reducido. Como la concentración de reductor se acerca a la concentración de tiol en la troponina I, la cisteína proteica y el reactor reductor con tiol pueden formar disulfuros mixtos, que no se reducirán por el reductor con tiol. De forma alternativa, la proteína se oxida de forma intramolecular, y el reductor con tiol no está en suficiente concentración como para reducir la cistina. El resultado final, tras una disminución del reductor con tiol, será una mezcla de troponina I, que estará en la forma intramolecularmente oxidada, y proteína, que estará en forma de disulfuro mixto. Cada una de estas formas de troponina I tiene diferente conformación.
En el caso de utilizar reactores reductores tiol que cuenten con dos grupos tiol, por ejemplo el ditiotreitol o el ditioeritritol, el resultado final, en el descenso de reductor tiol, será sólo la forma oxidada de la troponina I.
Por lo tanto, los anticuerpos sensibles al estado de oxidación de la troponina I reconocerán de forma diferente las distintas formas de la troponina I en el inmunoensayo. El inmunoensayo medirá entonces una concentración no precisa de troponina I.
La composición ideal de troponina estabilizada comprende una solución acuosa de la troponina I oxidada intramolecularmente.
Una composición particularmente preferida de troponina I y T estabilizada está constituida por una solución tamponada de complejo ternario de troponina I, T y C en presencia o ausencia de sales de calcio y magnesio. La escala ideal de pH de la solución oscila entre 6 y 9, y una escala de concentraciones de sales de calcio y de magnesio, por ejemplo de cloruro cálcico y magnésico, de entre 0,01 mM y 10 mM. Una solución tamponada particularmente idónea consta de un 100% de suero o plasma humano. El complejo ternario puede formarse con la troponina I, T y C componente, o sino puede aislarse y purificarse de músculo cardiaco o esquelético (Methods Enzymol. 85, 241-263 (1982)).
Métodos para mejorar la recuperación de troponina I en membranas
Se conoce que tiene lugar la adsorción de troponina I y T a superficies y a varias proteínas y este fenómeno puede disminuir la concentración de troponina medida. En particular, cuando los inmunoensayos se llevan a cabo en aparatos o instrumentos que tienen una gran superficie, por ejemplo, cuando las membranas o partículas de látex se incorporan a procesos del ensayo, el área de superficie que se expone a la muestra puede disminuir la recuperación de troponina. Las membranas formadas por nailon o composiciones de fibras de vidrio con medidas de entre 2 mm x 2 mm x 1 mm y 40 mm x 40 mm x 5 mm pueden influir en la recuperación de troponina I y T cuando confluyen en el proceso de ensayo. Las moléculas de troponina I y T tienen un nivel alto de aminoácidos básicos. A pH fisiológico, los aminoácidos básicos están en gran parte cargados positivamente y estos grupos de carga contribuyen al comportamiento adsorbente de las proteínas.
Se puede añadir varios componentes a las membranas o las partículas de látex para mejorar la recuperación de troponina I y T en el proceso del inmunoensayo. Concretamente, los péptidos o proteínas que son bases fuertes se añaden a las membranas o partículas de látex o superficies de los aparatos implicadas en el proceso de ensayo antes o durante la adición de la muestra o mezcla de reacción. Entre los compuestos ideales para este uso se encuentran péptidos, proteínas y polímeros con valores de pI mayores que 8. En este grupo se incluye la salmina, lisozima, citocromos, protamina, polilisina, amina de polivinilo, melitina y mastoparan. Las concentraciones de los reactores de bloqueo que se añaden a las superficies o membranas oscilan de 0,01 mg/ml a 100 mg/ml, y típicamente entre 0,1 mg/ml y 10 mg/ml.
Sección experimental Ejemplo 1 Preparación de reactivos para inmunoensayos ELISA de troponina Preparación de los conjugados de fosfatasa alcalina y anticuerpos anti-troponina
Fosfatasa alcalina (Calzyme, San Luis Obispo, CA) en 50 mM de fosfato de potasio, 10 mM de borato de potasio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,0, a 10 mg/ml, se derivó con SMCC (succinimidil 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) a una escala molar de 15/1 de SMCC/enzima. La derivación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 90 min y posteriormente se cromatografió en una columna GH-25 (Amicon Corp., Beverly, MA) equilibrada en 50 mM de fosfato potásico, 10 mM de borato de potasio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,0.
Anticuerpos anti-troponina en 50 mM de fosfato potásico, 10 mM de borato potásico, 150 mM de cloruro sódico, pH 7,0, a 10 mg/ml se derivaron con SPDP (N-succinimidil-3-[2-piridilditiol]propionato, Pierce Chemical Co.) a escala 10/1 molar de SPDP/anticupero. El anticuerpo se diluyó a 2 mg/ml y se añadió Ditiotreitol y taurina a la solución a concentraciones finales de 1 mM y 20 mM, respectivamente. Luego se incubó la solución a temperatura ambiente durante 30 min. El anticuerpo-SPDP se cromatografió en una columna GH-25 (Amicon Corp.) equilibrado en 50 mM de fosfato de potasio, 10 mM de borato de potasio, 150 mM de cloruro de sodio, 0,1 mM de ácido tetraacético etilenodiamina, pH 7,0.
El SMCC-fosfatasa alcalina (en 50 mM de fosfato de potasio, 10 mM de borato de potasio, 150 mM de cloruro de sodio, 5 mM de cloruro de magnesio, pH 7,0) y el tiol-anticuerpo (en 50 mM de cloruro de sodio, 10 mM de borato de potasio, 150 mM de claror de sodio, 0,1 mM de ácido tetraacético etilenodiamina a pH 7,0), ambos diluidos a 1 mg/ml, se añadieron una a otra mezclando en cantidades equimolares. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas, tras las cuales se añadió N-etil maleimida hasta una concentración final de 2 mM.
Preparación de anticuerpos de troponina biotinilada
Se añadió Biotina-XX, (6-((6-((biotinoil)amino) hexanoil)amino)hexanoato de succinimidilo, éster de succinimidilo, Molecular Probes, Eugene, OR) a 40 mM en dimetilformamida lentamente mezclándolo con una solución de anticuerpos a 2 mg/ml en 50 mM de borato de potasio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 8,2, (BBS) para conseguir una escala molar final de 20/1 respecto biotina-XX/anticuerpo. La solución se incubó a temperatura ambiente durante 2 h, tras las cuales la solución se dializó a 4ºC durante por lo menos 12 h.
Preparación del látex magnético de Avidina-HS
Use añadió 1 ml de partículas de látex paramagnético Estapor (0,94 \mu, Bangs Laboratorios, Carmel, IN, a 10% sólido, lavada 4 veces con agua desionizada) en agua a 9 ml de 0,55 mg/ml de avidina-HS (Scripps Laboratories, San Diego, CAJ) en 50 mM de Tris hidrocloruro, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,5. La solución de látex se incubó a 45ºC durante 2h. El látex se lavó 3 veces, cada vez con 10 ml de BBS, y se resuspendió en 10 ml de BBS.
Ejemplo 2 Inmunoensayo de troponina I y troponina T cardiaca humana
Se describen dos protocolos de inmunoensayo. Se utilizaron para detectar la troponina I y la troponina T presentes en suero humano, plasma o en soluciones que contengan proteínas purificadas.
Protocolo A
La muestra que contiene troponina I o troponina T se diluyó a 1-10 ng/ml de troponina I o troponina T en un tampón de ensayo (en adelante tampón de ensayo) que contiene 10 mM de ácido 3-(N-morfolino) propano sulfónico, 650 mM de cloruro de sodio, 1 mM de cloruro de magnesio, 0,1 mM de cloruro de zinc, 1 mg/ml de alcohol polivinilo (10.000 p.m.), 10 mg/ml de albúmina de suero bovino, 1 mg/ml de azida de sodio, pH 7,0. A 25 \mul de muestra diluida en un pozo de la placa microtitulada se añadió 50 \mu de tampón de ensayo que contiene 2,5 \mug/ml de conjugados de anticuerpos para anti-troponina I o troponina T (ejemplo 1) y 2,5 \mug/ml de anticuerpos para anti-troponina I biotinilada o troponina T policlonales (Ejemplo 1) para formar una mezcla de reacción. Tras 30 minutos de incubación de la mezcla de reacción a temperatura ambiente, se añadió 25 \mul de látex magnético recubierto de avidina-HS (Ejemplo 1; 0,5% de látex en el tampón de ensayo) al pozo de la placa microtitulada, y posteriormente se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. El látex magnético se aglomeró usando una placa microtitulada magnética (Perceptive Diagnostics, Cambridge, MA) y se lavó dos veces en BBS-Tween (borato 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, 0,1 mg/ml de azida sódica, 0,02% de polioxietileno-20-Sorbitan Monolaurato ( Tween-20), pH 8,2) y una vez en TBS (40 mM Tris, 150 mM cloruro de sodio, pH 7,5).
El pellet se resuspendió en reactivos de amplificación ELISA (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuando la amplificación se completó, se aglomeró el látex magnético y se traspasó 80 \mul del sobrenadante coloreado a una placa microtitulada magnética. Se midió la absorbancia a 490 nm (DO_{490})utilizando un lector de placas microtitulada (Molecular Devices, Palo Alto, CA).
Protocolo B
Se diluyó la mezcla con troponina I o troponina T en un tampón de ensayo tal y como se ha descrito en el protocolo A. Se añadieron 40 \mul de tampón de ensayo que a su vez contenían 30 \mug/ml de anticuerpos monoclonales de anti-troponina I o troponina T y 7,5 \mug/ml de anticuerpos policlonales anti-troponina I biotinilada o troponina T (Ejemplo 1) que eran complementarios a los anticuerpos monoclonales para así formar la mezcla de reacción. Se sacaron alícuotas (25 \mul) en varios puntos temporales (2 minutos hasta 24 horas) y se añadieron a los pocillos de la placa microtitulada que contenían 25 \mul de látex magnético recubierto con avidina-HS (0,5% de sólidos de látex en el tampón de ensayo). Luego se dejó incubar. El látex magnético se aglomeró y se lavó una vez con BBS-Tween y una vez con tampón de ensayo. El pellet se resuspendió en 25 \mul de tampón de ensayo que a su vez contenía 5 \mug/ml de anticuerpo kappa anti-ratón de cabra conjugado a fosfatasa alcalina (Southern BioTechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) y después se incubó durante 15 minutos. El látex magnético se aglomeró y el resto del ensayo se llevó a cabo como se indica en el Protocolo A.
Ejemplo 3 Elección de anticuerpos de anti-troponina I que se unen a las formas de troponina I humanas cardiacas oxidadas, reducidas, o ambas
Los conjugados de anticuerpos de anti-troponina I (Ejemplo 1) y los anticuerpos policlonales de troponina I biotinilados complementarios se evaluaron para el reconocimiento de troponina I oxidada o reducida intramolecularmente. Los anticuerpos monoclonales de anti-troponina I que se evaluaron fueron: clon 2D5 y clon 1A12 (BiosPacific, Emeryville, CA), clon 110 y 111 (Research Diagnostics, Inc., Flanders, N.J.) y clon TRI-7 F81 (DAKO Corporation, Carpinteria, CA). Los anticuerpos de anti-troponina T biotinilados evaluados eran policlonales de cabra y purificados por afinidad, especificados como péptido 1, péptido 2, péptido 3 o péptido 4 específicos (BiosPacific, Emeryville, CA). Se expuso a la troponina I cardiaca humana (P. Cummins, University of Birmingham, Birmingham, UK) a oxidación aérea a 1,0 \mug/ml como se describe en el ejemplo 4 para formar el disulfuro intramolecular. La troponina I oxidada se diluyó a 1-10 ng/ml en tampón de ensayo sin (muestra oxidada) o con (muestra reducida) ditiotreitol (DTT) hasta una concentración final de 3 mM, seguido por 3 horas de incubación a temperatura ambiente para permitir la reducción del disulfuro por el DDT. Las muestras oxidadas y reducidas se evaluaron sin diluciones posteriores utilizando el Protocolo A del Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 1 y están expresados en términos de proporción de la pendiente del ensayo para la troponina I oxidada (TnI) partido por la pendiente del ensayo para la troponina I reducida. La pendiente del ensayo aumenta con el incremento del reconocimiento de la troponina I por parte de la pareja de anticuerpos.
Los datos demuestran que se pueden seleccionar aproximadamente los mismos anticuerpos que preferentemente se unen a troponina I reducida u oxidada y los que se unen a troponina I reducida y oxidada. La selección de los anticuerpos sin reparar en el estado de oxidación-reducción de la troponina I puede llevar a un error sustancial en la cuantificación de la concentración de troponina I.
TABLA 1
Anticuerpo monoclonal de Anticuerpo policlonal de Proporción de las pendientes
anti-troponina I anti-troponina I de ensayo (TnI oxidada/ Tni
reducida)
Clon 2D5 Específico para Péptido 1 8,3
Clon 2D5 Específico para Péptido 3 10
Clon 1A12 Específico para Péptido 1 0,6
Clon 1A12 Específico para Péptido 3 1,3
Clon 1A12 Específico para Péptido 4 1,2
Clon TRI-7 F81 Específico para Péptido 1 0,5
Clon TRI-7 F81 Específico para Péptido 2 0,5
Clon TRI-7 F81 Específico para Péptido 3 0,5
Clon TRI-7 F81 Específico para Péptido 4 0,5
Clon 110 Específico para Péptido 4 0,8
Clon 111 Específico para Péptido 3 1,0
Clon 111 Específico para Péptido 4 0,4
Ejemplo 4 Oxidación-Reducción de la troponina I cardiaca humana purificada
La cinética de la oxidación y la reducción intramolecular de la troponina I purificada (P. Cummins, University of Birmingham, UK) se midió con un inmunoensayo (Protocolo A, ejemplo 2) utilizando un conjugado de anticuerpos del clon 2D5 y anticuerpo policlonal del péptido 1 de anti-troponina de cabra biotinilado (Ejemplo 1). La pareja de anticuerpos se une fuertemente a troponina I oxidada y de forma débil a troponina I reducida, tal y como se describe en el ejemplo 3. Los resultados del ensayo se expresan en términos de pendiente de ensayo] DO_{490} por ng/ml troponina I total (oxidada + reducida)] en la escala lineal del ensayo. La pendiente de ensayo aumenta con la fracción de troponina I oxidada.
Oxidación por aire de troponina I reducida
Se midió la proporción de oxidación aérea de troponina I a dos concentraciones de troponina I. La troponina I reducida a 0,27 mg/ml en un tampón que contenta 20 mM de Tris-HCl, 0,5M de cloruro de sodio, 60 mM de 2-mercaptoetanol, pH 7,5, se diluyó o bien a 1300 ng/ml o a 10 ng/ml en tampón de ensayo que contenía, o no, 25 mM de 2-mercaptoetanol. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas tras distintos tiempos de incubación, como se indica en la Figura 1a, diluidas a 4 y 8 ng/ml de troponina I en el tampón de ensayo, y evaluadas inmediatamente. Los resultados se muestran en la Figura 1a, donde las barras de error representan 1 desviación estándar (DS).
Oxidación con peróxido de troponina I reducida
Se añadió peroxido (Fisher, inestabilizado), hasta una concentración final de peroxido de 2 mM o 20 mM, a una alícuota de la solución de 1300 ng/ml de troponina I reducida (ver este ejemplo, oxidación aérea). Inmediatamente después se diluyó la troponina de la solución stock de 0,27 mg/ml. Se incubó las soluciones a temperatura ambiente. Se extrajo alícuotas tras diferentes tiempos de incubación, tal y como se indica en la Figura 1b, se trataron con catalasa (Calbiochem, La Jolla, CA; 0,01 mg/ml de concentración final durante 5 minutos) para eliminar el peróxido, diluido a 4 y 8 ng/ml de troponina I, y se evaluaron inmediatamente. Los resultados se muestran en la Figura 1b, donde las barras de error representan 1 DS.
Reducción con DTT de troponina I oxidada
La troponina I que se incubó (oxidada con aire) a 1000 ng/ml en tampón de ensayo durante 15 horas a temperatura ambiente se diluyó a 4 y 8 ng/ml en tampón de ensayo. Se añadió DTT hasta una concentración final de 0, 1,5 y 3,0 mM, seguido de una incubación a temperatura ambiente durante los tiempos indicados en la Figura 2. Las alícuotas se evaluaron para la troponina I. Tras alcanzar el estado estable (aproximadamente 6 horas), las alícuotas (100 \mul) de las muestras de tres concentraciones diferentes de DTT se reoxidaron con 20 mM de peróxido durante 15 minutos. Luego se las trató con catalasa durante 5 minutos y se evaluaron. Los resultados se muestran en la Figura 2, donde las barras de error representan 1 DS.
Los datos muestran que los resultados de un inmunoensayo pueden variar con el tiempo si al estado de oxidación-reducción de la troponina I se le permite cambiar. Los estados de oxidación-reducción de la troponina I, y por tanto los resultados del inmunoensayo, pueden cambiarse de forma reversible y estabilizarse en gran parte con el tiempo mediante el uso de oxidantes y reductores
Ejemplo 5 Alquilación de troponina I reducida
La troponina I se alquiló rápidamente utilizando varios reactivos alquilantes. La troponina I reducida en stock (University of Birmingham) estaba a 0,27 mg/ml y 20 mM de Tris hidrocloruro, 0,5M de cloruro de sodio, 50 mM de 2-mercaptoetanol. Se llevaron a cabo tres reacciones de alquilación (#1-3) y se preparó un control (#4):
1. Se añadieron 20 \mul de troponina I de stock a 20 \mul de borato de potasio 0,5M, ácido etilenodiamina tetraacético 0,2 mM, pH 8,0 y posteriormente se añadieron 10 \mul de yodoacetamida 398 mM.
2. Se añadieron 20 \mul de troponina I de stock a 20 \mul de borato de potasio 0,5M, ácido etilenodiamina tetraacético 0,2 mM, pH 8,0 y posteriormente se añadieron 10 \mul ácido yodoacético 398 mM.
3. Se añadieron 20 \mul de troponina I de stock a 20 \mul de borato de potasio 0,5M, ácido etilenodiamina tetraacético 0,2 mM, pH 8,0 y posteriormente se añadieron 12,5 \mul de etilmaleimida 319 mM.
4. Se añadieron 20 \mul de troponina I de stock a 20 \mul de borato de potasio 0,5M, ácido etilenodiamina tetraacético 0,2 mMM, pH 8ñ,0 y posteriormente se añadieron 10 \mul de borato de potasio 0,5M, ácido etilenodiamina tetraacético 0,2 mM, pH 8,0.
Las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h 25 min. Durante la incubación, se mantuvo en hielo la troponina de stock. Se añadieron alícuotas (24 \mul) de cada solución (1-4) a 0,9 \mul de mercaptoetanol 2,9M y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, tras los cuales, se congelaron las muestras con nitrógeno líquido. Las alícuotas restantes de cada solución (1-4) también fueron congeladas en nitrógeno líquido sin tratamiento posterior.
Ejemplo 6 Inmunoensayo de troponina I alquilada
Se diluyó Troponina I alquilada recién descongelada (Ejemplo 5) con N-etil maleimida (NEM), ácido yodoacético (IHAC), yodoacetamida (IAM), y una troponina no alquilada (muestra de control, ejemplo5), a 1-10 ng/ml en tampón de ensayo. Una alícuota recién descongelada del stock de troponina I reducida (Ejemplo 5) se diluyó (muestra estándar) en un tampón de ensayo que contenía DTT 0 ó 3 mM. Se cogió alícuotas (25 \mul) de todas las diluciones tras 0,5 ó 5,5 horas de incubación a temperatura ambiente y fueron evaluadas (Protocolo A, Ejemplo 2) utilizando un conjugado de anticuerpos monoclonales del clon 2D5 de anti-troponina y anticuerpos policlonales específicos del péptido 1 de la anti-troponina I de cabra biotinilados. Esta pareja de anticuerpos se une fuertemente a la troponina I oxidada y de forma débil a la troponina I reducida (Ejemplos 3 y 4). La troponina I permanece sustancialmente reducida durante 0,5h de incubación pero estará prácticamente oxidada por completo tras una incubación de 5,5 horas, a menos que el DTT esté presente para estabilizar la forma reducida (ver Ejemplo 4). Los resultados se muestran en la Tabla 2 y se encuentran en términos de pendiente de ensayo (DO_{490} por ng/ml de troponina I total) en la escala lineal. Una pendiente de ensayo mayor indica una interacción de unión más fuerte entre los anticuerpos y la troponina I.
Los datos demuestran que la pareja de anticuerpos se une a troponina I alquilada de forma similar a la troponina I reducida, es decir, débil si se compara con troponina I oxidada. Además, la alquilación estabiliza el resultado del inmunoensayo respecto al tiempo, de forma parecida al efecto observado con el uso de oxidantes o reductores para estabilizar el estado de oxidación-reducción de la troponina I (Ejemplo 4). La pendiente de ensayo más baja y más estable de la muestra de control, comparada con la muestra estándar se explica por la presencia de disulfuros mixtos formados entre los dos residuos de cisteína de la muestra de control de troponina I y el 2-mercaptoetanol durante la incubación a temperatura ambiente de la muestra de control a pH 8 (ver ejemplo 5).
TABLA 2
Muestra Pendiente de ensayo Pendiente de ensayo Proporción de pendientes
(incubación de 0,5h) (incubación de 5,5h) de ensayo (5,5h/0,5h)
TnI estándar reducida 0,030 0,030 1,0
(+DDT)
TnI estándar reducida 0,058 0,21 3,6
(-DDT)
TnI de Control 0,037 0,078 2,1
TnI alquilada con NEM 0,023 0,026 1,1
TnI alquilada con IAM 0,013 0,013 1,0
TnI alquilada con IHAC \leq0,01 \leq0, 01
Ejemplo 7 Efecto del peróxido sobre un inmunoensayo de troponina I cardiaca en pacientes con infarto de miocardio confirmado
Se obtuvo de hospitales suero o plasma humanos congelados, sumergidos en tubos de heparina de pacientes con infarto de miocardio confirmado. Se descongeló el suero y el plasma a temperatura ambiente e inmediatamente se separaron en dos alícuotas. Una alícuota fue oxidada a temperatura ambiente mediante la adición de peróxido hasta una concentración final de 20 mM. La segunda alícuota se dejó sin tratar. Se paró la reacción de oxidación tras 20 minutos añadiendo catalasa hasta una concentración final de 0,01 mg/ml. Diez minutos después añadir la catalasa, tanto la alícuota oxidada como la no tratada fueron diluídas en serie por factores de cuatro en tampón de ensayo y evaluadas inmediatamente para la troponina I cardiaca utilizando el conjugado del clon 2D5 de anti-troponina I y anticuerpos específicos para el péptido 3 de la anti-troponina I biotinilados (Ejemplo 2, Protocolo A). Este par de anticuerpos complementarios se une a la troponina I oxidada fuertemente y débilmente a la troponina I reducida (Ejemplo 3). Se evaluó troponina I purificada y oxidada aéreamente (Ejemplo 4)(P. Cummins, University of Birmingham), diluida a 2, 4 y 8 ng/ml en tampón de ensayo, con los mismos reactivos de anticuerpos para construir una curva estándar. La concentración de troponina I en la muestra de plasma o suero limpio oxidado o no tratado (Tabla 3) se calculó a partir de esta curva estándar utilizando las mediciones DO_{490} que se encontraban inscritas en la proporción lineal del ensayo.
Los datos muestran que la oxidación de muestras de suero o plasma de pacientes con infarto de miocardio confirmado pueden tener un efecto sustancial en la concentración de troponina I cardiaca determinada por inmunoensayo. Un inmunoensayo de troponina I en suero o plasma sin contemplar el estado de oxidación de la troponina I puede llevar a subestimaciones serias de la concentración de troponina I y provocar una omisión de diagnóstico de infarto de miocardio.
TABLA 3
Muestra \begin{minipage}[t]{40mm} Tiempo entre la obtención de la muestra y su congelación (horas)\end{minipage} \begin{minipage}[t]{40mm} Concentración de troponina I en ensayo de muestra sin tratar (ng/ml)\end{minipage} \begin{minipage}[t]{40mm} Concentración de Troponina I en ensayo de muestra oxidada por peróxido (ng/ml)\end{minipage}
1 Plasma 2 6,3 9,4
2 Plasma 6,5 0,8 1,0
3 Suero 9,3 6,6 8,3
4 Suero 6,5 31,9 46,5
5 Plasma 6,5 31, 7 49,7
6 Plasma 9,5 0,6 1,0
7 Suero 11,5 0,4 0,4
8 Plasma 5,0 4,5 5,4
9 Suero 10,5 1,6 2,3
10 Plasma o Desconocido 13,6 13,2
Suero
Ejemplo 8 Efecto del peróxido en inmunoensayos de troponina I cardiaca en plasma humano tras 2 ciclos de congelación/des-congelación
La muestra de plasma número 5 (Tabla 3, Ejemplo 7) se mantuvo en hielo sin tratar durante tres horas tras haber sido inicialmente descongelada y después recongelada y guardada a -70ºC durante varios días. El plasma se descongeló a temperatura ambiente y luego se extrajeron dos alícuotas; una fue oxidada con peróxido y la otra se dejó sin tratar, como se describen en el ejemplo 7. La concentración de troponina I en la alícuota oxidada y la no tratada se determinó inmediatamente mediante el inmunoensayo descrito en el ejemplo 7 y resultó ser 53,9 ng/ml en la alícuota no tratada y 56,4 ng/ml en la alícuota oxidada.
Los datos muestran que la oxidación del plasma tras la segunda descongelación no tuvo ningún efecto sustancial sobre la concentración de troponina I cardiaca determinada mediante inmunoensayo.
Ejemplo 9 Inmunoensayos de troponina I cardiaca en plasma oxidado y reducido de un paciente con infarto de miocardio
Se obtuvo de un hospital plasma humano congelado sumergido en tubos de heparina de un paciente con un infarto de miocardio confirmado. El plasma se descongeló a temperatura ambiente e inmediatamente se separó en dos alícuotas. Una alícuota se oxidó con peróxido, como se describe en el Ejemplo 7. La otra alícuota se redujo añadiendo DTT hasta una concentración final de 10 mM, y seguidamente se incubó 3 horas a temperatura ambiente. La alícuota oxidada se diluyó serialmente por factores de 2 en tampón de ensayo y la alícuota reducida se diluyó serialmente por factores de 2 en tampón de ensayo que contiene DTT 3 mM. Las alícuotas se evaluaron para troponina I inmediatamente (Protocolo A, Ejemplo 2) tanto con el anticuerpo complementario del conjugado del clon 2D5 de anti-troponina I como con anticuerpos policlonales del péptido 3 de anti-troponina biotinilada. La troponina I purificada (University of Birmingham) que había sufrido oxidación aérea (Ejemplo 4) se diluyó a 2, 4 y 8 ng/ml en tampón de ensayo y se utilizó para construir la curva estándar, mediante la cual se determinó la concentración de troponina I en la muestra de plasma con oxidación limpia o reducida. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Los datos muestran que la oxidación y la reducción química de troponina I cardiaca en la muestra de plasma afecta al reconocimiento de los pares anticuerpos estudiados para la troponina I de forma parecida a la observada para la troponina I purificada (Ejemplo 3).
TABLA 4
\begin{minipage}[t]{35mm} Conjugado de anticuerpos monoclonales\end{minipage} \begin{minipage}[t]{35mm} Concentración de troponina I evaluada (ng/ml) en plasma oxidado\end{minipage} \begin{minipage}[t]{35mm} Concentración de troponina I evaluada (ng/ml) en plasma reducido\end{minipage} \begin{minipage}[t]{35mm} Proporción de concentraciones de troponina I (plasma oxidado/plasma reducido)\end{minipage}
Clon 2D5 82 <1 >82
Clon TRI-7 52,8 77,5 0,68
F81
Ejemplo 10 Selección de anticuerpos de anti-troponina I que son sensibles o no sensibles a la unión de Troponina C a Troponina I
Se evaluaron conjugados de anti-troponina I monoclonales y anticuerpos policlonales de anti-troponina I biotinilados complementarios (Ejemplo 1) para su reconocimiento de troponina I libre y troponina I unida a troponina C en complejos binarios. Se prepararon muestras de cuatro tipos de troponina I a temperatura ambiente y se evaluaron para troponina I. Éstas son: troponina I oxidada con y sin troponina C añadida y troponina I reducida con y sin troponina C añadida. Se diluyó troponina I (P. Cummins, University of Birmingham) cardiaca humana y oxidada (con aire, ver Ejemplo 4) a 2, 4 y 8 ng/ml en tampón de ensayo que contiene cloruro de calcio 2 mM. Una alícuota de cada concentración de troponina I se dejó sin tratar o se redujo añadiendo DTT hasta una concentración final de 3 mM a partir de una solución de DTT de stock 3 mM en tampón de ensayo para formar una reacción de reducción. Tres horas después de empezar la reacción de reducción, cada alícuota de troponina I reducida y oxidada se transformó en dos alícuotas. A una alícuota se le añadió troponina C cardiaca humana (BioTech International Inc., Seattle, Wa) hasta una concentración final de 0,1 mg/ml a partir de una solución de DDT en stock a 1 mg/ml en fosfato de potasio 20 mM, borato de potasio 4 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 para formar una mezcla de reacción de unión, y a la otra alícuota se le añadió el mismo volumen del buffer anterior sin troponina C. Una hora después de añadir la troponina C, se evaluó todas las alícuotas para troponina I (Protocolo A, Ejemplo 2) utilizando el listado de parejas de anticuerpos de la Tabla 5. Los resultados de la Tabla 5 están expresados como respuestas de ensayo fraccional, determinada dividiendo la pendiente de ensayo en presencia de troponina C por la pendiente de ensayo en ausencia de la troponina C.
Los resultados de la Tabla 5 muestran que algunas parejas de anticuerpos reconocen troponina I libre y troponina I ligada a troponina C igual de bien, mientras que otras parejas de anticuerpos reconocen únicamente la troponina I libre. Un inmunoensayo con anticuerpos que no reconocen la troponina I ligada a troponina c subestimarán la concentración de troponina I total cuando parte de la troponina I está presente como parte del complejo binario de troponina I/C.
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TABLA 5
Conjugado de anticuerpos Anticuerpos policlonales de Respuesta de ensayo fraccional
de anti-troponina I anti-troponina I biotinilados
Troponina Troponina
I oxidada I reducida
Clon 2D5 Específico para el péptido 3 0,81 0,60
Clon 111 Específico para el péptido 1 0,83 Sin determinar
Clon 111 Específico para el péptido 3 0,47 0,52
Clon 111 Específico para el péptido 4 0,59 0,19
Clon 110 Específico para el péptido 4 0,96 0,48
Clon 1A12 Específico para el péptido 1 <0,05 <0,05
Clon 1A12 Específico para el péptido 3 <0,05 <0,05
Clon 1A12 Específico para el péptido 4 <0,05 <0,05
TABLA 5 (continuación)
Conjugado de anticuerpos Anticuerpos policlonales de Respuesta de ensayo fraccional
de anti-troponina I anti-troponina I biotinilados
Troponina Troponina
I oxidada I reducida
Clon TR7 F81 Específico para el péptido 1 0,74 0,79
Clon TR7 F81 Específico para el péptido 2 0,92 1,04
Clon TR7 F81 Específico para el péptido 3 0,94 0,97
Clon TR7 F81 Específico para el péptido 4 0,70 0,79
Ejemplo 11 Efecto de la troponina T, EDTA, melitina y mastoparan sobre inmunoensayos de troponina I con presencia de troponina C muy superior a la de troponina I
El ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) reduce la afinidad de unión de la troponina I con troponina T y troponina C mediante la quelación de iones de magnesio y calcio. La melitina reduce la afinidad de la troponina I con troponina C mediante su unión a troponina C. La efectividad del EDTA y la melitina (en adelante inhibidores de la unión) para romper complejos binarios de troponina I y troponina C en presencia y ausencia de troponina T fue evaluada. La troponina I cardiaca humana oxidada (P. Cummins, University of Birmingham) a 1,0 \mug/ml en tampón de ensayo que contenía cloruro de calcio 2 mM fue reducida con ditiotreitol a una concentración final de 3 mM durante 3 horas a temperatura ambiente. La troponina I reducida se diluyó a 2 y 4 ng/ml en tampón de ensayo que contenía cloruro de calcio 2 mM y ditiotreitol 3 mM. Cada concentración se partió en cuatro alícuotas a las que se añadió troponina C cardiaca humana (Bio-tech Internacional, Inc.) hasta concentraciones finales de 0, 0,1, 1,0 y 10,0 \mug/ml a partir de soluciones stock 100 veces en exceso de fosfato de potasio 20 mM, borato de potasio 4 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0. Cada una de las alícuotas resultantes se dividió luego en dos alícuotas a las que se añadió troponina T humana (Scripps Labs) hasta una concentración final de 0,0 ó 0,1 \mug/ml a partir de una solución stock 100 veces en exceso en agua desionizada. Las alícuotas se incubaron a temperatura ambiente durante una horas tras la adición de troponina T, luego se evaluaron para troponina I (Protocolo B, Ejemplo 2). La solución de anticuerpos añadida a los pocillos de la placa microtitulada contenía 30 \mug/ml del clon 1A12 de anti-troponina y 7,5 \mug/ml de anticuerpos específicos para el péptido 4 de anti-troponina biotinilados (Ejemplo 1) con o sin inhibidores de la unión (EDTA 30 mM y melitina 0,15 mM (Sigma Chemical, Co., St Louis, MO)). Las alícuotas de las mezclas de reacción formadas por la adición de anticuerpos a las muestras de troponina I fueron eliminadas tras 0,5h y luego fueron tratadas como se describe en el Protocolo B, Ejemplo 2. Los resultados del ensayo para las muestras que no contenían troponina C o T ni inhibidores de la unión se usaron para construir la curva estándar de dosis-respuesta. El efecto de la adición de los inhibidores de la unión al ensayo sobre la curva estándar fue evaluado y resultó negligible. La respuesta de ensayo fraccional (mostrada en la Figura 3) para muestras que contenían inhibidores y componentes de troponina se determinó dividiendo la pendiente de ensayo para cada muestra entre la pendiente de la curva estándar.
Los datos muestran que en presencia de troponina C, la concentración de troponina I es subestimada en gran medida. Los inhibidores de la unión invierten casi por completo el efecto de la troponina C. La presencia de troponina T en ausencia de troponina C no tiene efecto sobre el ensayo para troponina I. (Los datos no se muestran en la Figura 3). En presencia de troponina C y T, la concentración de troponina I medida se reduce drásticamente. Los inhibidores de la unión parecen ser menos efectivos cuando se abre o desenmaraña parcialmente el complejo de troponina en caso de que el complejo sea ternario que cuando es binario. Se evaluó el mastoparan y la melitina 0,1 mM como inhibidor de la unión para disociar el complejo I/C en una concentración de troponina C de 10 \mug/ml (Los datos no se muestran). La melitina se mostró tan eficaz como la melitina/EDTA (Figura 3) para incrementar la respuesta de ensayo fraccional, mientras que el mastoparan mostraba una efectividad de prácticamente un tercio que la de melitina a las concentraciones evaluadas.
Ejemplo 12 Efecto de los inhibidores de la unión sobre un inmunoensayo de troponina I en presencia de troponina C o troponina C y T
Se incubaron soluciones que contenían 1,0 \mug/ml de troponina I cardiaca humana purificada (reducida con DTT, Ejemplo 4) y, o bien 1,2 \mug/ml de troponina C cardiaca humana (Bio-tech Internacional, Inc.) ó 1,2 \mug/ml de troponina C junto con 3,1 \mug/ml de troponina T cardiaca humana (Scripps Labs) durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón de ensayo a 3 mM de DDT. Se añadió troponina C a la troponina I antes de añadir troponina T. Las soluciones de troponina estaban diluidas a 2,4 y 8 \mug/ml en términos de concentración de troponina I en tampón de ensayo que contenía cloruro de calcio 2 mM y DTT 0,5 mM. Inmediatamente se evaluaron con y sin inhibidores de la unión, tal y como se describe en el Ejemplo 11. Se extrajeron alícuotas de las mezclas de reacción de anticuerpos y componentes de troponina 0,5 y 2,2 h después de añadir los anticuerpos. Estas alícuotas fueron luego tratadas como se describe en el Protocolo B, Ejemplo 2. La troponina I reducida sin troponina C y T añadida, así como sin inhibidores de la unión, se evaluó para realizar una curva de ensayo. El efecto de la adición de los inhibidores de la unión al ensayo sobre la curva estándar fue evaluado y demostró ser negligible. Los resultados se expresan en la Tabla 6 como una respuesta de ensayo fraccional que se determinó dividiendo la pendiente de ensayo de cada muestra entre la pendiente de la curva estándar.
Los datos muestran que la troponina T y C, presente en un exceso molar de aproximadamente dos veces respecto a la concentración de troponina I, disminuye la cantidad de troponina I medida en el inmunoensayo. La troponina C por sí sola tiene un efecto menor sobre la concentración de troponina I medida para las concentraciones de anticuerpos utilizadas en este ensayo. Los inhibidores de la unión contrarrestan parcialmente el efecto de la troponina C y T al cabo de 0,5h de incubación y totalmente a las 2,2h.
TABLA 6
\begin{minipage}[t]{35mm} Tiempo tras la adición de anti-cuerpos (horas)\end{minipage} Respuesta de ensayo fraccional
Con troponina C Con troponina C y T
Sin inhibidores Con inhibidores Sin inhibidores Con inhibidores
de la unión de la unión de la unión de la unión
0,5 0,88 0,94 0,55 0,75
2,2 1,15 1,02 0,44 1,02
Ejemplo 13 Ensayo del complejo ternario de troponina cardiaca humana purificada para troponina I
Se diluyó una solución stock de complejo ternario de troponina cardiaca humana purificada (Bio-tech Internacional, Inc., solución stock a 3 mg/ml en un tampón que contiene citrato de sodio 20 mM, pH6) hasta concentraciones totales de troponina que oscilan entre 1 y 15 ng/ml en tampón de ensayo que contiene 2 mM de cloruro de calcio pero sin el cloruro de zinc 0,1 mM o el cloruro de magnesio 1 mM (en adelante tampón de ensayo libre de metales). Las soluciones diluídas fueron evaluadas para troponina I con y sin la presencia de inhibidores de la unión, como se describe en el Ejemplo 11. Se extrajo alícuotas de las mezclas de reacción de los anticuerpos con el complejo de troponina a los tiempos indicados en la Figura 4 y posteriormente se trataron como se describe en el Protocolo B, Ejemplo 2. La troponina I purificada (Bio-tech Internacional, Inc.) se evaluó y utilizó para realizar una curva estándar. El efecto de la adición de los inhibidores de unión al ensayo sobre la curva estándar se evaluó y resultó ser negligible. La respuesta de ensayo fraccional que se muestra en la Figura 4 se determinó dividiendo la pendiente de ensayo del complejo (DO_{490} como función de la concentración total de troponina I) entre la pendiente de la curva estándar.
Los resultados muestran que la troponina I que está ligada en el complejo ternario con la troponina C y T no es fácilmente reconocida por los anticuerpos en las concentraciones de anticuerpos y troponina I utilizadas en este ensayo, incluso tras un tiempo largo de incubación. En concreto, el punto temporal de 30 minutos no contaba con troponina I detectable, con y sin inhibidores. Los inhibidores de la unión abren o desenmarañan parcialmente el complejo de forma lenta, cosa que incrementa lentamente la fracción de la troponina I reconocida por los anticuerpos.
Ejemplo 14 Efecto de los inhibidores de la unión en un inmunoensayo de troponina I de suero y plasma de pacientes con infarto de miocardio confirmado
Se obtuvo de hospitales locales suero congelado y plasma sumergido en tubos de heparina y EDTA de pacientes con infarto de miocardio confirmado. Se descongelaron a temperatura ambiente. Se añadió cloruro de calcio hasta una concentración final 6 mM (para unir todo el EDTA) y la solución resultante se incubó durante dos horas a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4ºC. Las muestras incubadas se diluyeron por factores de dilución de 2 hasta un máximo de 256 en tampón de ensayo libre de metales. Las muestras diluídas se evaluaron inmediantamente para troponina I con y sin inhibidores de la unión, como se describe en el Ejemplo 11, con la excepción de que el anticuerpo policlonal era específico para el péptido 3 de la anti-troponina I de cabra. Se extrajo, en los tiempos indicados en las Figuras 5a-f, alícuotas de la mezcla de reacción formada por la adición de anticuerpos a las muestras diluidas y posteriormente se trataron como se describe en el Ejemplo 2, Protocolo B. La troponina I oxidada (University of Birmingham) a 2, 4 y 8 ng/ml en tampón de ensayo libre de metales se evaluó para realizar una curva estándar. El efecto de la adición de los inhibidores de la unión al ensayo sobre la curva estándar fue evaluado y resultó ser negligible. Los valores de DO_{490} medidos para las muestras de suero y plasma diluido fueron trazados como una función del inverso del factor de dilución. La pendiente en la region lineal de la curva resultante (normalmente a DO_{490}<2, que se corresponde con la concentración de troponina I menor que 8 ng/ml) se dividió por la pendiente de la curva estándar para obtener la concentración de troponina I en la muestra de suero o plasma limpio que se muestra en las Figuras 5a-f. Cada Figura, de 5a a 5f, refleja inmunoensayos con suero o plasma de diferentes pacientes.
Los datos muestran que las concentraciones de troponina I medidas en todas las muestras de suero y plasma evaluadas aumentaron con la adición de inhibidores de la unión. Es importante que el perfil del tiempo de la concentración de troponina I medido era en algunos casos bifásico (Figuras 5a-c y 5e). La fase rápida se completó durante el primer tiempo de ensayo de 0,5 h. La fase lenta continuó creciendo durante 6-25 h dependiendo de la muestra. También se observó una fase lenta para las muestras de suero y plasma diluidos, que puede, por tanto, asociarse a la apertura o al desenmarañamiento parcial de un complejo ternario por parte de los inhibidores y los anticuerpos. La fase rápida indica un complejo ligado de troponina I que es más fácil de abrir o desenmarañar parcialmente que el complejo ternario, ya que la fase rápida es inexistente para complejos ternarios purificados (Ejemplo 13). De esta manera, la fase rápida puede asociarse con la apertura o en desenmarañamiento parcial de complejos binarios de troponina I.
Ejemplo 15 Inmunoensayos que son sensibles a troponina I libre, a troponina I ligada en complejos ternarios, y a troponina I tanto libre como ligada
Se evaluó la capacidad de tres grupos de anticuerpos para reconocer troponina I libre y troponina I ligada en complejos ternarios. Se preparó las tres soluciones stock (#1-3) de anticuerpos que seguidamente se describe. Fueron preparadas en tampón de ensayo libre de metales, y con y sin inhibidores de la unión (EDTA 30 mM y melitina 0,15 mM) junto con los siguientes anticuerpos:
1. anticuerpo de anti-troponina I 1A12 a 30 \mug/ml y anticuerpo específico para el péptido 4 de anti-troponina I biotinilado;
2. anticuerpo de anti-troponina I 1A12 a 30 \mug/ml, anticuerpo monoclonal de anti-troponina T 9B1 (Biospacific) a 30 \mug/ml, y 5 \mug/ml de cada anticuerpo biotinilado específico para los péptidos 1, 2, 3 y 4 de la anti-troponina.
3. anticuerpo de anti-troponina T 9B1 a 30 \mug/ml y 5 \mug/ml de cada anticuerpo biotinilado específico para los péptidos 1, 2, 3 y 4.
Se diluyó una solución de complejos ternarios de tropononina cardiaca humana (Bio-tech Internacional, Inc.) hasta 1-15 ng/ml de equivalentes de troponina I en tampón de ensayo libre de metales. También se diluyó troponina I purificada (Bio-tech Internacional, Inc) a 2, 4 y 8 ng/ml en el mismo tampón. Las diluciones de los complejos de troponina y troponina I se evaluaron inmediatamente utilizando el Protocolo B, Ejemplo 2 con soluciones de anticuerpos #1-3. Se extrajo alícuotas de las mezclas de reacción formadas por la adición de los anticuerpos a las muestras con complejos de troponina y troponina I 0,5 y 2,5 h después de añadir los anticuerpos. Posteriormente se trataron como se describe en el Ejemplo 2, Protocolo B. Los resultados se muestran en la Tabla 7 y se expresan en términos de pendiente de ensayo con unidades de DO_{490} por ng/ml de troponina I total en la escala lineal del ensayo. Una pendiente más elevada indica una unión mejor de los anticuerpos a los componentes de troponina. Se estudió la solución #2 de anticuerpos y resultó negativa para la actividad cruzada con troponina I cardiaca humana purificada (Scripps Labs) a 1-6 ng/ml utilizando el protocolo de ensayo aquí descrito (los datos no se muestran).
En los datos se observa que el inmunoensayo que usa los anticuerpos de la solución #1 reconoce la troponina I pero no la troponina I de los complejos ternarios. Los inmunoensayos utilizando los anticuerpos de la solución #2 reconocen la troponina I libre y la troponina I de complejos ternarios casi igual de bien. Así, la solución de anticuerpos #2 es superior a la solución #1 para el estudio de la troponina I total cuando una fracción de la troponina I se encuentra en complejos ternarios. El inmunoensayo utilizando los anticuerpos de la solución #3 reconoce bien los complejos ternarios, pero de forma pobre la troponina I libre. Este reconocimiento pobre de la troponina I provoca un descenso, con el tiempo, de la pendiente de ensayo para la solución #3 de anticuerpos en presencia de inhibidores de la unión. Utilizando las tres soluciones de anticuerpos en inmunoensayos, uno puede estimar las concentraciones de troponina I (solución #1), troponina I total (solución #2) y troponina ligada (solución #3) de forma independiente.
TABLA 7
Solución de Tiempo tras la adición Pendiente de ensayo (DO_{490} por ng/ml de troponina I total)
anticuerpos de anticuerpos (horas)
Troponina I libre \begin{minipage}[t]{28mm} Troponina en complejos ternarios (sin inhibidores de la unión)\end{minipage} \begin{minipage}[t]{28mm} Troponina en complejos ternarios \hskip-0.1cm (con inhibidores de la unión)\end{minipage}
#1 0,5 0,14 <0,006 <0,006
#1 2,5 0,14 0,003 0,021
#2 0,5 0,12 0,18 0,14
#2 2,5 0,22 0,17 0,12
#3 0,5 0,008 0,18 0,17
#3 2,5 0,008 0,17 0,08
Ejemplo 16 Estimación de la troponina I libre, la troponina I ligada y la troponina I total en plasma de un paciente con infarto de miocardio
Las tres soluciones de anticuerpos descritas en el Ejemplo 15 se usaron en inmunoensayos para medir la concentración de troponina I en el plasma de un paciente con un infarto de miocardio confirmado. El plasma congelado se trató y diluyó en un tampón de ensayo libre de metales, como se describe en el Ejemplo 14. El plasma diluido se evaluó para troponina I de forma inmediata utilizando el Protocolo B, Ejemplo 2, con las soluciones de anticuerpos #1-3 (Ejemplo 15). Se extrajo alícuotas 0,5 y 2,5h tras la adición de anticuerpos a las muestras para formar mezclas de reacción y posteriormente se trataron como se describe en el Ejemplo 2, Protocolo B. Tanto la troponina I libre a 1-4 ng/ml como el complejo de troponina (Bio-tech International, Inc.) a 1-8 ng/ml en tampón de ensayo libre de metales fueron estudiadas y se realizó una curva estándar de DO_{490} como función de la concentración total de troponina I para cada solución de anticuerpos. La concentración de troponina I en la muestra de plasma limpio, tal y como se muestra en la Tabla 8, medida por cada solución de anticuerpos, se determinó utilizando o bien la curva estándar para troponina I libre o para troponina I en complejos ternarios en ausencia de inhibidores de la unión, como se indica en la Tabla 8 y se describe en el Ejemplo 14. En dicha tabla también se observa la proporción determinada dividiendo la concentración de troponina I estudiada con inhibidores de la unión entre la concentración en ausencia de inhibidores.
Los datos muestran que la concentración de troponina I determinada por los inmunoensayos utilizando la solución #1 de anticuerpos es mucho más sensible a la presencia de inhibidores de la unión, y por tanto, a la apertura o al desenmarañamiento parcial de los complejos de troponina que la determinada utilizando la solución #2 y #3. Los datos del Ejemplo 15 sugieren que la solución #1 de anticuerpos mide especialmente la troponina I libre, la solución #2 mide tanto la troponina I libre como la ligada en complejos ternarios, y la solución #3 mide sobre todo la troponina I ligada en complejos ternarios. Por lo tanto, las conclusiones del Ejemplo 15, puestas en conjunto con los datos de la Tabla 8, indican que cantidades sustanciales de tanto troponina I libre como ligada están presentes en las muestras de plasma diluidas. Entre las tres soluciones de anticuerpos utilizadas en los inmunoensayos, la solución #2 proporciona el ensayo con una concentración de troponina I mayor, como se esperaba, porque el inmunoensayo utilizando la solución #2 mide tanto la troponina I libre como ligada. Así, la solución #2 de anticuerpos proporciona la medida más exhaustiva de troponina I en la muestra de plasma. La solución #2 de anticuerpos estadarizada con los complejos de troponina purificada proporcionó el ensayo más estable respecto a la adición de inhibidores y al tiempo de incubación del ensayo. El descenso de la concentración de troponina I a las 2,5h, medido con la solución #2 de anticuerpos estandarizada con la troponina I libre es debido a un aumento a las 2,5h de la pendiente de la curva estándar.
TABLA 8
\begin{minipage}[t]{20mm} Solución de anticuerpos\end{minipage} \begin{minipage}[t]{20mm} Tiempo tras la adición de los anticuerpos (horas)\end{minipage} \begin{minipage}[t]{32mm} Estándar utilizado para determinar la concentración de troponina I\end{minipage} \begin{minipage}[t]{50mm} Concentración de troponina I en plasma (ng/ml)\end{minipage} Proporción
Sin Inhibidor Con Inhibidor
de la unión de la unión.
#1 0,5 Troponina I 91 186 2,0
#1 2,5 Troponina I 83 251 3,0
#3 0,5 \begin{minipage}[t]{28mm} Complejo ternario de troponina I\end{minipage} 134 108 0,8
#3 2,5 \begin{minipage}[t]{28mm} Complejo ternario de troponina I\end{minipage} 87 65 0,74
#2 0,5 Troponina I 280 360 1,3
#2 2,5 Troponina I 172 220 1,3
#2 0,5 \begin{minipage}[t]{28mm} Complejo ternario de troponina I\end{minipage} 229 299 1,3
#2 2,5 \begin{minipage}[t]{28mm} Complejo ternario de troponina I\end{minipage} 223 286 1,3
Ejemplo 17 Inmunoensayo de troponina T cardiaca humana libre y troponina T cardiaca humana en complejos ternarios
Se prepararon dos soluciones stock de anticuerpos (#1 y 2), como se describe más adelante, en tampón de ensayo libre de metales, con y sin inhibidores de la unión (EDTA 30 mM y melitina 0,15 mM) y con los siguientes anticuerpos:
1. anticuerpo de anti-troponina I 1A12 a 30 \mug/ml, anticuerpo de la anti-troponina T 9B1 a 30 \mug/ml y anticuerpo específico para el péptido 3 de anti-troponina T biotinilado (Biospacific);
2. anticuerpo de anti-troponina T 9B1 a 30 \mug/ml y anticuerpo biotinilado específico para el péptido 3 de anti-troponina biotinilado a 7,5 \mug/ml;
Se diluyeron complejos ternarios de troponina cardiaca humana (Bio-tech Internacional, Inc.) a 1-20 ng/ml de troponina T en tampón de ensayo libre de metales y se diluyó también troponina T cardiaca humana (Scripps Labs) a 1,5, 3,0 y 6,0 ng/ml en el mismo tampón. Las diluciones del complejo de troponina y la troponina T se evaluaron inmediatamente utilizando el Protocolo B, Ejemplo 2 con las soluciones #1 y #2 de anticuerpos. Se extrajeron alícuotas de las mezclas de reacción formadas por la adición de anticuerpos a las muestras de complejos de troponina y a troponina T 0,5 y 3,0h tras la adición de anticuerpos. Posteriormente se trataron como se describe en el Ejemplo 2, Protocolo B. Los resultados se muestran en la Tabla 9 y se expresan en términos de pendiente de ensayo con unidades de DO_{490} por ng/ml de troponina T total en la escala lineal del ensayo. Una pendiente más elevada indica una unión mejor de los anticuerpos a los componentes de troponina.
Los datos muestran que los anticuerpos en la solución #1 reconocen tanto la troponina T libre como la troponina T ligada en complejos ternarios de forma similar. Los anticuerpos en la solución #2 reconocen la troponina T libre bien, pero la troponina T en complejos ternarios de forma pobre. Así, se espera que la solución #1 de anticuerpos proporcione la medida más exhaustiva y precisa de la concentración total de troponina T en las muestras de sangre humana, en las que está presente una cantidad sustancial de complejos ternarios.
TABLA 9
\begin{minipage}[t]{17mm} Solución de anticuerpos\end{minipage} \begin{minipage}[t]{22mm} Tiempo tras la adición de anticuerpos a la muestra de troponina (horas)\end{minipage} Pendiente de ensayo (DO_{490} por ng/ml de troponina T)
\begin{minipage}[t]{23mm} Troponina T libre sin inhibidores de la unión\end{minipage} \begin{minipage}[t]{24mm} Troponina T libre con inhibidores de la unión\end{minipage} \begin{minipage}[t]{27mm} Troponina en\hskip-0.05cm com- plejos sin inhibidores de la unión\end{minipage} \begin{minipage}[t]{27mm} Troponina en\hskip-0.05cm com- plejos con inhibidores de la unión\end{minipage}
#1 0,5 0,069 0,078 0,061 0,070
#2 0,5 0,078 0,085 0,013 0,012
#3 3,0 >0,08 >0,08 0,018 0,023
Ejemplo 18 Uso de la troponina C para impedir la unión no específica de troponina I a las membranas del filtro
La troponina I cardiaca oxidada (por oxidación aérea, Ejemplo 4, University of Birmingham) a una concentración final de 100 ng/ml en suero humano (Hybritech, Inc., San Diego) se incubó con y sin troponina cardiaca humana a 100 \mug/ml (Gio-tech Internacional, Inc.) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se cortó dos membranas, un filtro CytoSep (Ahlstrom Filtration, Mont Holly Springs, PA) y un filtro de fibra de vidrio (GB-100R, Micro Filtration Systems, Dublín, CA) en rectángulos que medían 1,5 cm por 3,0 cm y se aseguraron mediante una película transparente (catálogo #pp2500, 3M, Austin, TX) con un trozo de cinta adhesiva a través de los filtros. Se aplicó lentamente las soluciones de troponina I con y sin troponina C (300 \mul) en la parte de arriba de los filtros de uno de los extremos y la solución atravesó el filtro hasta el final del otro extremo mediante la acción de mecha. Se extrajo 15 \mul de la solución del extremo final con una punta de pipeta de plástico. Las soluciones obtenidas se diluyeron por factores de 20, 40 y 80 en tampón de ensayo y se evaluaron utilizando el Protocolo A, Ejemplo 2, con el conjugado de anti-troponina I TRI-7 F81 y anticuerpos específicos del péptido 3 de la anti-troponina biotinilados. También se evaluó las alícuotas de las soluciones de troponina I con y sin troponina C que no habían pasado a través de los filtros y se usó los resultados para realizar una curva estándar, a partir de la cual se determinó la concentración de la troponina I en la solución que había pasado a través de la membrana. La concentración calculada se dividió entre 100 ng/ml para obtener la fracción de la troponina I recuperada, mostrada en la Tabla 10. Los errores experimentales que se dan en la Tabla 10 representan una desviación estándar.
Los datos muestran que la presencia de la troponina C ayuda a disminuir la unión no específica de la troponina I a las membranas de los filtros.
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TABLA 10
Filtro Fracción de troponina I recuperada
Sin troponina C Con troponina C
CytoSep 0,03 \pm 0,03 0,15 \pm 0,04
Fibra de vidrio 0,00 \pm 0,03 0,09 \pm 0,04
Ejemplo 19 Uso de las proteínas de puntos isoeléctricos elevados para impedir la unión no especifica de la troponina I a las membranas del filtro
Se empapó durante 16 horas a temperatura ambiente un filtro sanguíneo (CytoSep 1,5 cm x 3,0 cm) en soluciones de agua desionizada que contenían 1 mg/ml de las proteínas de la lista en la Tabla 11. Los filtros se enjuagaron una vez con agua desionizada y se secaron durante 2 horas a 35ºC. Se pasó por los filtros, como se describe en el Ejemplo 18, troponina I cardiaca humana oxidada (Bio-tech International, Inc) a 100 ng/ml en suero humano (Hybritech, Inc., San Diego, CA), que también contenía cloruro de calcio 2 mM añadido. La cantidad de troponina I recuperada de los filtros se determinó por ensayo (Protocolo B, Ejemplo 2) utilizando anticuerpos específicos del péptido 4 de la anti-troponina I TRI-7 F81 biotinilados e inhibidores de la unión añadidos (Ejemplo 11). Los datos de la Tabla 11 se expresan como la fracción de troponina I recuperada, que se determinó como se describe en el Ejemplo 18.
Los resultados muestran que la melitina y el sulfato de protamina reducen sustancialmente la unión no específica entre troponina I y el filtro sanguíneo, mientras que la caseína y la leche desnatada en polvo ejercen poco efecto sobre las concentraciones estudiadas.
TABLA 11
Proteína Fracción de troponina I recuperada
No adición 0,16
Sulfato de protamina 0,77
Caseína 0,16
Melitina 0,72
Leche desnatada en polvo 0,08
Ejemplo 20 Inmunoensayo de complejos ternarios de troponina utilizando anticuerpos del péptido 4 de anti-troponina I biotinilados y anticuerpos de anti-troponina TRI-7 F81
El complejo ternario de troponina purificada (Bio-tech Internacional, Inc.) se evaluó para troponina I como se describe en el Ejemplo 13, aunque el par de anticuerpos utilizado en el inmunoensayo es el que consta en el título y la alícuota de la mezcla de reacción de los anticuerpos con la muestra de troponina se tomó tres horas tras la adición de los anticuerpos a la troponina. La respuesta de ensayo fraccional fue de 0,16 en ausencia de inhibidores de la unión y de 0,49 en presencia de dichos inhibidores.
Los datos muestran que el par de anticuerpos del título reconoce la troponina I en complejos ternarios de forma pobre. En el Ejemplo 10, se demostró que la presencia de troponina C, sin troponina T, tenía poco efecto sobre el reconocimiento del par de anticuerpos del título para la troponina I. Así, el par de anticuerpos del título se puede unir a troponina I presente en el complejo binario con troponina C mejor de lo que se puede unir a la troponina I presente en complejos ternarios.
Ejemplo 21 Inmunoensayo de troponina I en plasma de un paciente con infarto de miocardio confirmado usando anticuerpos conjugados de anti-troponina TRI-7 F81 y anticuerpos específicos del péptido 1 de la anti-troponina I biotinilados
Se descongeló el plasma congelado de un paciente con infarto de miocardio confirmado y luego se diluyó en suero humano (Hybritech Inc., San Diego, CA) que también contenía cloruro de sodio 0,5M añadido. Se evaluó para troponina I con el par de anticuerpos del título utilizando el Protocolo A, Ejemplo 2. Se estudió la troponina I cardiaca humana purificada oxidada (University of Birmingham) y se usó para realizar una curva estándar, con la que se determinó la troponina I en el plasma. La muestra de plasma limpio se volvió a congelar en un congelador a -70ºC después de haber estado en hielo durante varias horas. El plasma congelado se descongeló de nuevo a temperatura ambiente y se evaluó utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente, aunque los estándares de plasma y troponina I se diluyeron en tampón de ensayo. Los estándares mostraron pendientes de ensayo prácticamente idénticas cuando se diluyeron en suero (primer ensayo) o tampón de ensayo (segundo ensayo). La muestra de plasma limpio se incubó posteriormente a 4ºC durante los tiempos indicados en la Tabla 12. Luego se volvieron a evaluar en tampón de
ensayo.
Los datos muestran un aumento sustancial de la concentración de troponina I evaluada tras el ciclo de congelación/descongelación y tras la incubación a 4ºC. Esta inestabilidad del ensayo puede asociarse con la apertura o el desenmarañamiento parcial del complejo de troponina ternario debido al ciclo de congelación/descongelación.
TABLA 12
Tiempo del ensayo Concentración estudiada de troponina I
Tras la primera descongelación del plasma 284 ng/ml
2 horas tras la segunda descongelación del plasma >800 ng/ml
19 horas tras la segunda descongelación del plasma 1760 ng/ml
90 horas tras la segunda descongelación del plasma 2300 ng/ml
Ejemplo 22 Expresión, revisión y selección de anticuerpos recombinantes (fragmentos de unión o fragmentos Fab). Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones mediante el siguiente método. Se inmunizaron intraperitonealmente a 10 ratones utilizando 50 \mug del antígeno proteico (troponina I y complejo ternario de troponina) emulsionado en adyuvante completo de Freund el día 0 y el día 28. Los análisis de sangre de los ratones se obtuvieron mediante la punción del seno retro-orbital. Cuando las concentraciones eran elevadas para el antígeno biotinilado, se suministró al ratón 50 \mug de proteína en el día 70, 71 y 72, con el sacrificio posterior y la esplenectomía el día 77. Si las concentraciones de anticuerpo no eran satisfactorias, se les suministró 50 \mug de antígeno el día 56 y se realizó un análisis de sangre el día 63. Si se obtenía concentraciones satisfactorias se suministraba a los animales 50 \mug de antígeno el día 98, 99 y 100 y se extraía el bazo el día 105.
Bibliotecas de anticuerpos de despliegue en fagos
Se sacrificaron ratones con un título alto de anticuerpos para la proteína-antígeno deseado (troponina I o complejo de troponina ternario), y se purificó el RNA total a partir de células del bazo (Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)). El RNA total (50 \mug) de las células del bazo se usó directamente como plantilla para Superscript^{TM} II transcriptasa reversa (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) con oligo (dT)_{12} como cebador para hacer cDNA para PCR. Se usaron un total de 32 reacciones de PCR para amplificar las regiones variables de cadena pesada usando Taq DNA polimerasa (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), 3 \mul de cDNA por reacción, 32 oligonucleótidos 5' diferentes y un oligonucleótido 3' simple. Las regiones variables de la cadena kappa se amplificaron similarmente usando 29 oligonucleótidos 5' diferentes y un oligonucleótido 3' simple. Los oligonucleótidos previamente fueron diseñados para asegurar que casi todas las regiones variables del anticuerpo presentes en el bazo serían amplificadas con no más de dos cambios en la secuencia genuina de aminoácidos causados por incompatibilidades del oligonucleótido con el cDNA basadas en una compilación de secuencias de anticuerpo de ratón. (Sequences of proteins of immunological interest. Vol 2., 5th edition, 1991, Cambridge, MA.) Una alícuota de cada producto de doble cadena de la PCR se amplificó una segunda vez usando sólo el oligonucleótido 3' para producir DNA de cadena simple (csDNA). Los productos de csDNA de todas las reacciones de amplificación de la cadena kappa, y los productos de csDNA de todas las reacciones de cadena pesada se combinaron separadamente. El csDNA de cada muestra combinada se purificó usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y una columna Genpak Fax HPLC (Waters Inc, Milford, MA). El csDNA purificado se usó para realizar la mutagénesis de una plantilla de uracilo M13 seguida de técnicas de mutagénesis estándar de oligonucleótidos (J. Immunol. 149:3903-3913, 1992). La plantilla M13 contiene secuencias de DNA complementarias a los extremos 5' y 3' del csDNA para las regiones variables de la cadena kappa y la cadena pesada. Como resultado, cuando las regiones variables de cadena kappa y cadena pesada se hibridaron con el vector M13, se creó una mezcla de diferentes secuencias de anticuerpo. Los anticuerpos resultantes se expresaron como fragmentos de anticuerpo Fab comprendiendo la cadena kappa entera y la región variable de la cadena pesada unida a la primera región constante de la cadena pesada. Las células electrocompetentes (DH12S Gibco BRL., Gaithersburg, MD) se transformaron por electroporación con el DNA M13 resultante. Una electroporación típica de 500 ng del vector M13 en 40 \mul de células DH12S produjo de 10^{7}a 10^{8} clones de diferentes anticuerpos. Los clones además se amplificaron para producir una biblioteca de anticuerpos de despliegue en fagos. El vector M13 se diseñó a fin de que la cadena pesada fuera expresada como una proteína de fusión con la mayor proteína de la capa de M13, la proteína Gen VIII. Hay aproximadamente 2700 copias de la proteína Gen VIII en cada partícula de fago. Después de que la proteína de fusión Gen VIII/cadena pesada se secretara al periplasma de E.coli, la cadena kappa secretada se une a la cadena pesada para formar un fragmento Fab del anticuerpo funcional. Esto lleva a la producción de fagos que tienen anticuerpos funcionales en la superficie con el DNA que codifica el anticuerpo incluido dentro del fago. Cribado de bibliotecas de anticuerpos expuestos a fagos.
La biblioteca de anticuerpos de despliegue en fagos obtenida por electroporación de la mutagénesis del DNA de M13 en E.coli consta de varios anticuerpos de despliegue diferentes en partículas de fago (anticuerpo fago). El número de anticuerpos de alta afinidad al antígeno proteína es bajo. El siguiente procedimiento de cribado se desarrolló para aislar anticuerpos específicos para la troponina I y el complejo de troponina ternario. El anticuerpo fago se incubó con troponina I, biotinilada, oxidada (10^{-9}M, 11 biotinas/proteína) en solución en equilibrio. El fago anticuerpo unido a la proteína antígeno biotinilado se aisló por incubación con látex magnético cubierto con avidina. El fago del anticuerpo no específico se lavó, y el fago del anticuerpo unido al látex se eluyó y se amplificó por crecimiento en células XL1 blue E.coli (Stratagene, La Jolla, CA). El fago del anticuerpo amplificado se sometió luego a una segunda ronda de selección. Puesto que la incubación de la proteína antígeno biotinilado y el fago de anticuerpo se realizó en solución, la concentración de la proteína antígeno biotinilado se ajustó para seleccionar sólo los anticuerpos de alta afinidad. El proceso descrito anteriormente se repitió hasta que el anticuerpo fago constaba de un alto porcentaje de fago codificando los anticuerpos de troponina. Las secuencias de los anticuerpos estuvieron entonces listas para subclonar.
Subclonar anticuerpos
La secuencia entera del DNA del anticuerpo se amplificó usando un oligonucleótido 5' unido a la secuencia señal de la cadena kappa, que está en el extremo 5' de la cadena pesada, y un oligonucleótido 3' uniéndose al extremo de la secuencia de región constante de la cadena pesada. Tras la amplificación, el DNA se purificó usando electroforesis en gel de agarosa, luego se fundió y se ligó a un vector de expresión pBR322. La transformación de células DH10B por electroporación se realizó usando este DNA, y las células crecieron en placas de tetraciclina para seleccionar clones que contuvieran el DNA insertado. Las colonias se transfirieron en 3 ml de medio 2YT con 10 \mug/ml de tetraciclina, y los cultivos se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC. Durante la noche los cultivos de células se diluyeron 1:100 en 50 ml de medio 2YT con glicerol 1% y 10 mg/mL de tetraciclina en 250 ml en frascos de agitación para obtener los anticuerpos suficientes para el estudio. Los cultivos crecieron a 37ºC hasta que la absorbancia del cultivo a 600 nm estuvo entre 2 y 4. En este punto, los cultivos se indujeron y crecieron durante la noche a 23ºC. Las células se rompieron en un homogenizador de alta presión, y el anticuerpo se purificó.
Caracterización del anticuerpo por trazado del epítope
Los anticuerpos producidos se caracterizaron en consideración a su capacidad de generarse en un anticuerpo doble, en fase sólida, mediante un inmunoensayo no competitivo enzimático (ensayo sándwich). Los fragmentos del anticuerpo Fab se seleccionaron para unir distintamente diferentes epítopes en el antígeno proteína de modo que la unión de un Fab no obstaculizara la unión del segundo fab. El antígeno proteína se marcó con biotina usando éster biotin-XX-NHS (Molecular Probes, Pórtland, OR). La biotinilación del antígeno proteína fue suficientemente baja en proporción molar de biotina a la proteína (de media, biotina/proteína=4) de modo que la probabilidad de que un epítope sea afectado sustancialmente en consideración a la estructura nativa del sitio de unión al anticuerpo fue mínima. El primer fragmento Fab se incubó en pocillos de una placa microtitulada que contenían Fab de cabra anti-ratón purificado, adsorbido. Los pocillos se lavaron y se colocó una solución bloqueante que contenía un Fab no específico de ratón a altas concentraciones en cada pocillo para saturar los sitios anti-Fab restantes. En los pocillos de una placa microtitulada separada, el segundo fragmento Fab se incubó para equilibrarlo con el antígeno proteína biotinilado. El segundo Fab estaba presente en un exceso molar sustancial sobre la proteína antígeno biotinilada. La mezcla que contenía el segundo Fab y la proteína biotinilada se añadió a los pocillos de la placa microtitulada que fueron cubiertos con el primer Fab y se incubaron. Un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina se añadió a la mezcla para unirse a la proteína biotinilada y así detectar la presencia del antígeno proteína. Los pocillos microtitulada se lavaron y la presencia de fosfatasa alcalina unida se detectó por adición de fenolftaleína monofosfato. La proporción de formación de producto a 560 nm se determinó usando un lector espectrofotométrico de placas microtitulada. El exceso de Fab no específico de ratón en la mezcla evitó la unión del segundo Fab al anti-fab adsorbido a los pocillos de la placa microtitulada. Los controles se realizaron usando el mismo Fab que el primero y el segundo Fab para demostrar que cuando el epítopo unido por el segundo Fab es el mismo que el primero, se observaba una unión muy pequeña de la fosfatasa alacalina a los pocillos de la placa microtitulada. Si los dos fragmentos Fab diferentes que se prueban pueden unirse a diferentes epítopos en la misma proteína, luego la cantidad de actividad fosfatasa alcalina unida al pocillo es sustancialmente mayor que la del control. La ventaja de este procedimiento de ensayo es que los anticuerpos no fueron marcados, de modo que varios anticuerpos pudieron ser rápidamente ensayados para determinar si se unen indistintamente a epítopes diferentes. El número de epítopes distintos se determinó y los anticuerpos se agruparon de acuerdo con su especificidad de
epítopo.
Ejemplo 23 Caracterización y selección de pares de anticuerpos complementarios para el reconocimiento de troponina I libre oxidada y reducida y troponina I del complejo ternario
Los anticuerpos dirigidos a la troponina I fueron probados en un inmunoensayo sándwich en pares compuestos por un anticuerpo de conjugado de anticuerpos y un anticuerpo biotinilado complementario (Ejemplo 1). Los anticuerpos del ensayo eran anticuerpos anti-troponina I recombinante que originalmente fueron cultivados con troponina I libre pero fueron seleccionados para unir tanto la troponina I como la troponina I en el complejo ternario (Ejemplo 22). También se probó el anticuerpo policlonal específico para el péptido 3 de la anti-troponina I de cabra.
El complejo ternario de troponina cardiaca humana purificado (Bio-Tech International) se diluyó en un tampón de ensayo y se estudió (protocolo A, Ejemplo 2) con los pares de anticuerpos complementarios mostrados en la tabla 13. Los resultados se expresaron con una pendiente de ensayo con unidades de troponina I total OD_{490} por ng/ml en el rango linear del ensayo. Una pendiente mayor indica mejor unión de los anticuerpos a la troponina I.
La troponina I se preparó por disociación de los componentes del complejo de troponina ternario bajo condiciones de oxidación y reducción (en adelante, muestra oxidada/reducida). El complejo ternario de troponina cardíaca humana purificado se purificó a 4 \mug/ml durante 4 horas a temperatura ambiente en un tampón de disociación compuesto por ácido 3-(N-morfolino) propoano sulfónico 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, urea 6M, EDTA 10 mM y melitina 0,05 mM, pH 7,0, para formar la muestra disociada/oxidada. La muestra disociada/oxidada se diluyó hasta 1-30 ng/ml (concentración de proteína total) en tampón de ensayo y se ensayó (Protocolo A, Ejemplo 2) con los pares de anticuerpos complementarios mostrados en la Tabla 13. El mismo procedimiento se usó para formar y ensayar la muestra disociada/reducida excepto por la disociación y los tampones de ensayo, que contenían también DTT 1,5 mM para reducir el disulfuro intramolecular de la troponina I.
Para demostrar que el procedimiento de disociación no dañaba la troponina I libre con respecto a los ensayos de troponina I libre, la troponina I oxidada purificada se trató usando el procedimiento para formar la muestra disociada/oxidada y luego se ensayó con los diez pares de anticuerpos complementarios diferentes (pares 19-28 en la Tabla 13). Los resultados de ensayo (no mostrados) se compararon con aquéllos obtenidos para la troponina I oxidada purificada que no se trató con el procedimiento de disociación. No se observaron diferencias significativas entre los resultados del ensayo para la troponina I tratada y la no-tratada purificada para cualquiera de los diez pares de anticuerpos.
El par de anticuerpos (#29, Tabla 13) que consiste en anti-troponina T monoclonal 9B1 biotinilada y anticuerpos del conjugado policlonal específico para el péptido 3 de la anti-troponina I de cabra no reconoce la troponina I que se disocia a partir del complejo ternario (Ejemplo 15), el cual consiste en la pendiente del ensayo cero obtenida para este par de anticuerpos con las muestras disociadas/oxidadas y disociadas/reducidas.
Los datos (Tabla 13) muestran que los anticuerpos dirigidos a la troponina I pueden ser generados y seleccionados para formar un inmunoensayo que da esencialmente la misma respuesta de ensayo (pendiente) para la troponina I en el complejo ternario, las muestras disociadas/oxidadas y las disociadas/reducidas (por ejemplo, par de anticuerpos #17). De este modo, un par de anticuerpos tal como #17 podría ser usado para medir la concentración total de troponina I en una muestra que contiene todas las formas de troponina I que se probaron. El procedimiento usado para generar y seleccionar los anticuerpos produce anticuerpos que son buenos candidatos para el uso en un ensayo que mide la troponina I libre oxidada y reducida, y la troponina I en el complejo ternario en la sangre de pacientes que han sufrido infarto de miocardio.
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Ejemplo 24 Efecto de la protamina y la melitina en la absorción no-específica de troponina a partículas de látex
El látex magnético cubierto con Avidin-HS (Ejemplo 1) se lavó y se resuspendió hasta un 1% sólido en tres diluyentes diferentes: suero (Hybritech Inc., San Diego, CA), suero conteniendo 0,2 mg/ml de cloruro de protamina y suero conteniendo 0,1 mM de melitina. Un volumen de 125 \mul de cada solución de látex resuspendida se mezcló con 125 \mul de volumen de suero conteniendo cada una 6 ng/ml de troponina I oxidada purificada (Bio-tech International, Inc) ó 18 ng/ml de complejo ternario de troponina purificado para formar una solución de troponina sin látex. Las soluciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El látex se aglomeró y los sobrenadantes se recogieron. Los sobrenadantes de las soluciones de troponina y látex, y las soluciones de troponina sin látex se estudiaron para la troponina (Protocolo A, Ejemplo 2, excepto el suero que se usó en lugar del tampón de ensayo) usando el par de anticuerpos #17 (tabla 13) para determinar la concentración de troponina. Para cada diluyente, la fracción de troponina recuperada en los sobrenadantes de las soluciones de troponina y látex (Tabla 14) se determinó por división de las concentraciones medidas de troponina en el sobrenadante de la solución de troponina y látex entre la concentración medida de la troponina en la solución de la troponina sin látex.
Los datos muestran que tanto la melitina y como el cloruro de protamina incrementan la recuperación de troponina, indicando que la melitina y el cloruro de protamina reducen la absorción no-específica de troponina en el látex.
TABLA 14
Fracción de troponina recuperada en el sobrenadante
Forma de troponina No adición + cloruro de protamina + melitina
Troponina I oxidada libre 0,49 0,73 0,80
Complejo de troponina 0,58 0,87 0,77
Ejemplo 25 Efecto de la protamina y melitina en la respuesta de ensayo de un inmunoensayo sándwich para la troponina que utiliza las partículas de látex
El látex magnético Avidin-HS (Ejemplo 1) se lavó y se resuspendió hasta un 1% de sólido en dos diluyentes diferentes: tampón de ensayo y tampón de ensayo conteniendo melitina 0,1 mM. En los pocillos de un placa microtitulada, 25 \mul de cada solución de látex resuspendida se mezclaron con 25 \mul de tampón de ensayo conteniendo la troponina I purificada oxidada (Bio-Tech International) a varias concentraciones entre 0 y 16 ng/ml para formar una solución de troponina I y látex. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. A cada pocillo se añadieron 50 \mul de una solución consistente en los dos anticuerpos del par #17 (Tabla 13), cada uno a 2,5 \mug/ml, para formar una mezcla de reacción. La mezcla de reacción se incubó durante 15 minutos y el látex luego se aglomeró, se lavó y además se trató como se describe en el Protocolo A (Ejemplo 2). Los resultados se expresan en la Tabla 15 como una pendiente de ensayo con unidades de OD_{490} por ng/ml de troponina I.
Los datos muestran que la adición de melitina al ensayo incrementa la respuesta de ensayo en un factor cercano a dos, incrementando así la sensibilidad del ensayo a la troponina I. En datos no mostrados, la incorporación de protamina (a 0,03-0,1 mg/ml) y melitina, (0,017-0,05 mM) en un inmunoensayo para la troponina I que utilizó las partículas de látex, incrementó las respuestas del ensayo por factores de 30% hasta 400%.
TABLA 15
Aditivo Pendiente del ensayo
Ninguno 0,021
Melittina 0,040
Ejemplo 26 Recuperación de troponina I y T de las superficies por encima del uso de troponina C
En otras realizaciones preferidas de esta invención, la recuperación de troponina I y T de varias superficies, incluyendo, pero no limitado a, membranas, filtros de vidrio y poliéster, recipientes y dispositivos de vidrio o plástico, partículas de látex, liposomas, varios componentes de la sangre, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de alta densidad, proteínas de la cascada de la coagulación, varias proteínas de la sangre y similares se mejora formando complejos binarios o ternarios de Troponina I y/o T.
Se descubrió el sorprendente resultado de que cuando se añadió la troponina C a la sangre o al plasma o a una variedad de superficies que entraron en contacto con la troponina I, la recuperación de la troponina I mejoró. Nuestros resultados muestran que los complejos binarios y ternarios de troponina I y T tienen menos tendencia a absorber a superficies o proteínas que los monómeros respectivos.
Para mejorar la recuperación de troponina I, las concentraciones útiles de troponina C y/o troponina T, que se aplican a varias superficies, son desde 1 ng/ml a 1 mg/ml, preferiblemente en presencia de 0-1000 equivalentes en peso molar al calcio o magnesio. Se puede secar, o no, las soluciones aplicadas, dependiendo de la aplicación de la técnica utilizando una recuperación mejorada. La masa de troponina C y/o I necesaria para mejorar las recuperaciones está relacionada con el área de la superficie del medio que está en contacto con la muestra de troponina I. Filtros, membranas, materiales absorbentes y partículas de látex, por ejemplo, tienen un área de superficie relativamente mayor que la superficie de un recipiente liso, por ejemplo, y un experto en la materia reconocerá que una masa mayor de troponina C y/o T será necesaria para recuperaciones máximas.
Para mejorar la recuperación de troponina T, las concentraciones útiles de troponina C y/o troponina I, que se aplican a varias superficies, son desde 1 ng/ml a 1 mg/ml. Se pueden secar, o no, las soluciones aplicadas, dependiendo de la aplicación de la técnica utilizando una recuperación mejorada. La masa actual de troponina C y/o T necesaria para mejorar las recuperaciones está relacionada con el área de la superficie del medio que está en contacto con la muestra de troponina T. Filtros, membranas, materiales absorbentes y partículas de látex, por ejemplo, tienen un área de superficie relativamente mayor que la superficie de un recipiente liso, por ejemplo, y un experto en la materia reconocerá que una masa mayor de troponina C y/o I será necesaria para recuperaciones máximas.
Ejemplo 27 Uso de la troponina C para incrementar la recuperación de troponina I
La troponina I cardiaca humana oxidada (Bio-Tech International) y el complejo ternario de troponina cardiaca humana (Bio-Tech International) se espinaron en sangre o plasma y se estudió en un dispositivo de inmunoensayo (tal como se describe en la Patente Estadounidense 5.458.852) en el que las muestras de sangre o plasma pasan a través de una membrana filtro de sangre (como se describe en, p.ej., la Patente Estadounidense 6.391.265) que contiene varias cantidades de troponina C.
Los filtros de sangre (Ahlstrom; aprox. 1,5 x 1,5 x 0,06 cm) se prepararon añadiendo 150 \mul de una solución acuosa de troponina C (Bio-Tech international; cada una se purificó desde el músculo esquelético del corazón humano o del conejo), con o sin cloruro de calcio, secando el filtro durante una hora a 45ºC e integrándolas en los dispositivos de ensayo. La troponina C (50 \mul/ml, originaria del corazón humano) también se añadió directamente a algunas muestras de sangre o plasma que contienen 0-20 ng/ml de troponina I. Las muestras de sangre o plasma se añadieron a la cámara de adición de muestras de los dispositivos que se alojan en el filtro de sangre. En el caso de muestras de sangre, el filtro separó las células rojas sanguíneas del plasma (como se describe, p.ej, en la Patente Estadounidense 6.391.265). El plasma (de muestras de sangre o plasma) pasó del filtro de sangre a una cámara de reacción que contenía reactivos secos que se reconstituyeron por el plasma para formar una mezcla de reacción.
Los reactivos incluían un conjugado consistente en partículas de látex de transferencia de energía fluorescente (FETL), por ejemplo partículas tales como las divulgadas en la Patente Estadounidense 6.251.687, y los anticuerpos #4 y #57 de la anti-troponina I recombinante (ver Ejemplo 23). El conjugado anticuerpo-FETL se preparó por técnicas de conjugación de proteínas estándar conocidas por aquéllos expertos en la materia (p.ej., haciendo reaccionar SMCC con las partículas de látex que contienen aminas y como consecuencia haciendo reaccionar tiol-anticuerpo (preparado por reacción de SPDP y anticuerpo, con partículas de látex-SMCC para formar un conjugado de anticuerpos, como se destaca en el Pierce Chemical Co. 1994, p. T166 y T192, y los métodos descritos en el Uniform Latex Particles, Seradyn Inc., Indianápolis, IN, p. 31-40; y también los métodos descritos en Microparticle Reagent Optimization, Seradyn Inc., p 91-97). Los reactivos también incluían el anticuerpo policlonal específico para el péptido 3 de la anti-troponina I de cabra biotinilada, que formó pares complementarios con los anticuerpos conjugados #4 y #57 que no eran sensibles a si la troponina era libre, en un complejo binario I/C, I/T o ternario I/C/T.
La mezcla de reacción se mantuvo en la cámara de reacción durante 4 minutos para dejar que la troponina I reaccionara con los anticuerpos. Después de 4 minutos de incubación, la mezcla de reacción se dejó descender (por acción de capilaridad) por la vía de diagnóstico que tenía avidin-HS inmovilizada sobre una superficie en una zona de captura. Los conjugados desenlazados de anticuerpos FETL se lavaron desde la zona de captura, por plasma en exceso del filtro de sangre que descendió por la vía de diagnóstico después de la mezcla de reacción. La cantidad de conjugados de anticuerpo-FETL unidos a la zona de captura incrementó monotónicamente con la concentración de troponina I en la muestra de sangre o plasma y se cuantificó por cribado de la vía de diagnóstico con un fluorómetro que consiste en una fuente de excitación de diodos láser (670 nm) y un detector fotodiodo de silicio midiendo la fluorescencia a una longitud de onda máxima de 760 nm con los filtros ópticos y electrónicos apropiados para obtener la señal fluorescente.
Los resultados del ensayo respecto al efecto de la troponina C sobre el filtro de sangre se muestran en la Tabla 16. La respuesta del ensayo fraccional se calculó por división de l pendiente del ensayo (señal fluorescente por ng/ml de troponina I) para la muestra entre la pendiente de ensayo obtenida en ausencia de troponina C en el filtro de sangre y la muestra. Cada valor de la respuesta de ensayo fraccional es la media de 8 a 10 medidas.
Los resultados (Tabla 16) muestran que la presencia de troponina C en sangre o plasma o en el filtro de membrana de sangre incrementó la recuperación de troponina I a partir del filtro de sangre.
TABLA 16
Muestra Troponina C en filtro de sangre Respuesta del ensayo fraccional
Troponina I en plasma Ninguna 1,0
Complejo de troponina Ninguna 1,5
en plasma
Troponina I en plasma 1 \mug/ml de TnC Humano 1,5
Troponina I en plasma 10 \mug/ml de TnC Humano 1,8
Troponina I en plasma 100 \mug/ml de TnC Humano 1,6
Troponina I en plasma 10 \mug/ml de TnC Humano 1,6
Troponina I en sangre Ninguno 1,0
completa
Troponina I y troponina C Ninguno 3,0
en sangre completa
Complejo de troponina Ninguno 2,1
en sangre completa
Troponina I en sangre 1 \mug/ml de TnC Humano 1,6
completa
Troponina I en sangre 10 \mug/ml de TnC Humano 1,9
completa
Troponina I en sangre 100 \mug/ml de TnC Humano 1,6
completa
Troponina I en sangre 10 \mug/ml de TnC de Conejo 2,9
completa
Troponina I en sangre 10 \mug/ml de TnC de Conejo, 2,9
completa y 20 \muM de CaCl
Cabe destacar que, como se ha usado aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "y", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique lo contrario. De este modo, por ejemplo, hace referencia a "una formulación" que incluye mezclas de diferentes formulaciones y referencia a "el método de tratamiento" que incluye referencia a pasos equivalentes y métodos conocidos por aquéllos entendidos en la materia, y así sucesivamente.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente un entendido en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque algunos métodos y materiales similares a los equivalentes de aquéllos descritos aquí pueden ser usados en la práctica o prueba de la invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.

Claims (6)

1. Un método para facilitar la recuperación de troponina I y/o troponina T a partir de una muestra, comprendiendo el método:
Poner en contacto la muestra con una superficie, a la que se ha añadido la troponina C, en donde el paso de añadir troponina C comprende añadir una solución compuesta por troponina C y además comprende el secado de la superficie seguido de la adición de la solución, así la troponina C reduce la absorción de troponina I y/o troponina T a dicha superficie, y en donde la superficie es un filtro de sangre.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra comprende sangre completa, plasma o suero.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la solución comprende desde 1 ng/ml a 1 mg/ml de troponina C.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la solución comprende 0-1000 equivalentes de peso molecular similar al del calcio o magnesio.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el calcio se proporciona como cloruro de calcio.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el origen de la troponina C es el músculo cardiaco o el músculo esquelético.
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