ES2241277T3 - Uso de canabinoides como agentes anti-inflamatoprios. - Google Patents
Uso de canabinoides como agentes anti-inflamatoprios.Info
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Abstract
Un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad inflamatoria comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente aceptable de canabidiol. El paciente preferiblemente es un mamífero tal como un ser humano. El medicamento puede aplicarse, por ejemplo, por vía oral, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa, por pulverización nasal o por vía tópica. Como proposición general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de canabinoide administrado estará en el intervalo de 1 µg/kg/día a 50 mg/kg/día de peso corporal del paciente, preferiblemente de 2, 5 a 10 mg/kg/día y especialmente será de 5 mg/kg/día. Por consiguiente, la invención también se refiere a preparaciones medicinales, incluyendo formulaciones tópicas, cápsulas, comprimidos y/o formulaciones inyectables que contienen canabidiol. Preferiblemente, de acuerdo con cualquier aspecto previo de la descripción, los canabinoides se usan o combinan con uno o más compuestos anti-inflamatorios conocidos, especialmente compuestos contra la artritis reumatoide, tales como metotrexato. Esto permite combinar propiedades ventajosas de los canabinoides con propiedades conocidas del o de los compuestos conocidos.
Description
Uso de canabinoides como agentes
anti-inflamatorios.
Esta solicitud se refiere a agentes
anti-inflamatorios y, en particular, al uso de
canabidioles para el tratamiento de la artritis reumatoide,
esclerosis múltiple, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, y a
preparaciones medicinales que contienen canabidiol.
Cannabis sativa, comúnmente conocida como
marihuana, se ha usado durante varios años por sus efectos
medicinales, incluyendo sus propiedades antipiréticas y analgésicas.
De forma natural, existen aproximadamente 80 constituyentes del
cannabis, denominados canabinoides, como compuestos de
cannabis con 21 átomos de carbono y análogos de tales
compuestos y sus metabolitos [Mechoulam, en ``Marijuana Chemistry,
Metabolism and Clinical effects, Academic Press, Nueva York (1973),
páginas 1-99].
El componente psicoactivo principal de la
marihuana es el
delta-9-tetrahidrocanabinoide (THC),
que se ha estudiado ampliamente. Ciertos estudios han demostrado que
el THC afecta al crecimiento, al desarrollo y a la actividad
reproductora [Pharmacol Rev. 38 (1986), páginas
1-18 y 151-178; Marihuana,
Pharmacological Aspects of Drug Dependence, Springer Verlag (1996),
páginas 83- 158]. Ciertos estudios en ratones han demostrado que el
THC reprime la formación de anticuerpos contra glóbulos rojos de
oveja y produce cambios en la producción de citoquinas. Sin embargo,
ciertos estudios in vitro han demostrado que el THC puede
reprimir o mejorar (dependiendo de la dosificación) la producción
de diversas citoquinas tales como IL-1,
IL-6 y TNF\alpha por células
leucocí-
ticas.
ticas.
El canabidiol (CBD) está presente en la mayoría
de las preparaciones de cannabis (hachís, marihuana, maría)
en mayores concentraciones que el THC. El canabidiol se aisló por
primera vez en 1940 por Todd y Adams [J. Amer. Chem. Soc.,
62, 2194 (1940)]. Su estructura se esclareció por Mechoulam
y Shvo en 1963 [Tetrahedron, 19 (1963), página 2073]. Su
estereoquímica absoluta se determinó en 1967 [Tet. Lett.,
1109-1111 (1967)]. La síntesis de canabidiol en su
forma racémica y su forma natural se presentaron en los años 1960
[J. Amer. Chem. Soc., 87, 3273-3275 (1965).
Helv. Chim. Acta, 50 719-723 (1967)].
El canabidiol no tiene actividad psicotrópica
(actividad canabimimética) y no se une al cerebro ni a los
receptores periféricos CBI y CB2 respectivamente [Science
169, 611-612 (1970);
"Marijuana/cannabinoids: neurobiology and neurophysiology", ed.
L. Murphy y A. Bartke, CRC Press, Boca Raton, 1-33
(1992)]. Sin embargo, se ha observado que el canabidiol tiene
efectos anticonvulsivantes [Pharmacol, 124, 141-146
(1982)]. El canabidiol también ha sido eficaz en modelos animales
predictivos de actividad antipsicótica, y se ha descubierto que
tiene efectos antipsicóticos en caso de esquizofrenia
[Psychopharmacol., 104, 260-264 (1991); J.
Clin. Psychiatry, 56, 485-486 (1995)].
El canabidiol se ha estudiado esporádicamente por
sus efectos inmunomoduladores in vivo e in vitro.
Smith et al [Proc. Soc. Exp. Bio Med. 214 (1997),
páginas 69-75] demostraron que ratones BALB/C a los
que se había inyectado canabidiol no mostraban un cambio
significativo en el nivel de ARNm de IL-1,
IL-6 y TNF\alpha. A una dosis de
8 mg/kg de canabidiol, no se vio afectada la mortalidad de ratones a los que se había inyectado subletalmente Legio-nella.
8 mg/kg de canabidiol, no se vio afectada la mortalidad de ratones a los que se había inyectado subletalmente Legio-nella.
Ciertos estudios preliminares realizados por
Formukong et al. [Inflammation, 12,
361-371 (1988)] demostraron que el canabidiol
inhibía el retorcimiento inducido por PBQ en ratones cuando se
administraba por vía oral a dosis de hasta 10 mg/kg. También se
demostró que el canabidiol reducía el eritema inducido por TPA, que
es dependiente de la liberación de prostaglandina, en ratones
cuando se aplicaba tópicamente.
En un estudio in vitro, Coffey et
al. [Biochem. Pharmacol, 52 (1996), páginas
743-51] demostraron que el THC y el canabidiol
inhibían el óxido nítrico (NO) producido por macrófagos
peritoneales de ratón activados por LPS e IFN\gamma. Watzl et
al. [Drugs of Abuse, Immunity and Immunodeficiency, Plenum
Press, Nueva York, 63-70 (1991)] estudian in
vitro los efectos del THC y el canabidiol sobre las secreciones
de IL-1, IL-2, IL-6,
TNF\alpha e IFN\gamma por leucocitos humanos después de la
activación por mitógenos. Descubrieron que los dos canabinoides en
bajas concentraciones aumentaban la producción de IFN\gamma,
mientras que en altas concentraciones (5-24
\mug/ml) bloqueaban completamente la síntesis de IFN\gamma, y
el canabidiol reducía tanto la producción de IL-1
como la producción de TNF\alpha y no afectaba a la secreción de
IL-2.
Ahora, los inventores han descubierto que,
inesperadamente, el canabidiol puede usarse para tratar
enfermedades inflamatorias tales como la artritis reumatoide y la
enfermedad de Crohn. Las enfermedades inflamatorias implican la
interacción compleja entre varios componentes tales como
interleuquinas (IL-1, IL-6 e
IL-8), TNF\alpha y diversos mediadores tales como
óxido nítrico, ROI y PGE_{2}.
Los inventores han descubierto que los
canabinoides actúan como agentes anti-inflamatorios
in vivo. Aunque la siguiente descripción es aplicable a todos
los canabinoides, la invención reivindicada se restringe a los
canabidioles.
El canabidiol se usa en la fabricación de un
medicamento para tratar la artritis reumatoide, la esclerosis
múltiple, la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn,
opcionalmente con un segundo compuesto
anti-inflamatorio.
El canabidiol tiene la fórmula:
El término aislado pretende incluir un
canabinoide natural que se ha purificado a partir de una fuente
natural o que se ha sintetizado químicamente.
Un método para tratar a un paciente que padece
una enfermedad inflamatoria comprende la etapa de administrar al
paciente una cantidad farmacéuticamente aceptable de
canabidiol.
El paciente preferiblemente es un mamífero tal
como un ser humano.
El medicamento puede aplicarse, por ejemplo, por
vía oral, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa, por
pulverización nasal o por vía tópica.
Como proposición general, la cantidad
farmacéuticamente eficaz total de canabinoide administrado estará
en el intervalo de 1 \mug/kg/día a 50 mg/kg/día de peso corporal
del paciente, preferiblemente de 2,5 a 10 mg/kg/día y especialmente
será de 5 mg/kg/día.
Por consiguiente, la invención también se refiere
a preparaciones medicinales, incluyendo formulaciones tópicas,
cápsulas, comprimidos y/o formulaciones inyectables que contienen
canabidiol.
Preferiblemente, de acuerdo con cualquier aspecto
previo de la descripción, los canabinoides se usan o combinan con
uno o más compuestos anti-inflamatorios conocidos,
especialmente compuestos contra la artritis reumatoide, tales como
metotrexato. Esto permite combinar propiedades ventajosas de los
canabinoides con propiedades conocidas del o de los compuestos
conocidos.
La invención a continuación se describirá a modo
de ejemplo sólo haciendo referencia a las figuras en las que:
la figura 1 muestra las puntuaciones clínicas
para ratones tratados con CBD (canabidiol). Usando el ensayo U de
Mann-Whitney para comparación de datos no
paramétricos, se obtuvieron los siguientes valores de p comparando
ratones tratados con ratones de control: para 20 mg/kg, p<0,05
en el día 3, día 7 y día 9; para 10 mg/kg, p < 0,05 para los días
3, 5, 7 y 9; para 5 mg/kg, p = 0,0004 en el día 3, p = 0,0096 en el
día 5; p = 0,0269 en el día 7 y p = 0,0285 en el día 9.
La figura 2 muestra el efecto del CBD sobre el
espesor de la pata. Para 10 mg/kg, p = 0,004 en el día 3 y p =
0,0145 en el día 5; para 5 mg/kg, p = 0,0001 en el día 3 y
p<0,0001 en los días 5, 7, 9.
La figura 3 muestra datos histológicos para
tratar ratones con CBD como se describe en los ejemplos. Las patas
traseras se evaluaron como normales, levemente afectadas o
gravemente destruidas.
La figura 4 muestra efectos dependientes de la
dosis de CBD en un modelo de CIA crónica. Desde los primeros signos
de hinchazón de las articulaciones, los ratones se trataron tres
veces por semana durante un periodo de 5 semanas con CBD, 5 mg/kg o
10 mg/kg i.p. Los ratones de control se trataron con vehículo solo,
como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Los
resultados se expresan como una media de 6 ratones. El AUC para el
grupo de control es 38,4 y para el grupo de 5 mg/kg 28,9.
La figura 5 muestra el efecto del suministro oral
de CBD. Desde los primeros signos de artritis, los ratones se
trataron diariamente durante un periodo de 10 días con CBD a las
concentraciones mencionadas. El fármaco se administró por medio de
una sonda oral. A los ratones de control se les suministró vehículo
(aceite de oliva) solo, como se describe en Materiales y Métodos.
Los resultados se expresan como media +/- SEM. El grupo de 25 mg/kg
fue significativamente mejor que el grupo de control desde el día 5
en adelante (p = 0,0411).
La figura 6 muestra el efecto del suministro oral
de CBD sobre CIA crónica. A los ratones se les
suministraron
25 mg/kg de CBD. A los controles se les suministró vehículo (aceite de oliva).
25 mg/kg de CBD. A los controles se les suministró vehículo (aceite de oliva).
La figura 7 muestra los efectos del CBD sobre la
encefalomielitis autoinmune experimental. A dos grupos de 6 ratones
SJL/J hembra se les inyectó homogeneizado de médula espinal de
ratón para inducir EAE. El tratamiento comenzó con la inducción de
la enfermedad (día 0) y continuó una vez al día durante 14 días. El
CBD se inyectó i.p. a una dosis de 10 mg/kg. El grupo de control se
dejó sin tratar.
La figura 8 demuestra que el CBD reduce los
niveles de TNF\alpha en suero después de la estimulación con LPS.
A ratones C57BL/6 hembra se les inyectaron ip (por vía
intraperitoneal) 100 \mug de LPS junto con CBD ip o por vía
subcutánea (s.c.) a 200 \mug/ratón (100 mg/kg). Después de 90
minutos, se extrajo sangre de los ratones y se determinó el nivel de
TNF\alpha en suero por medio de un bioensayo.
La figura 9 muestra el efecto del CBD sobre la
respuesta de los linfocitos a mitógenos. Se incubaron células de
bazo (1 x 10^{6}/pocillo) de ratones BALB/c (figura 9a) o C57BL/b
(figura 9b) en microplacas de fondo plano durante 2 días con medio,
3 \mug/ml de ConA o 50 \mug/ml de LPS, en presencia de las
concentraciones indicadas de CBD. Los cultivos se sometieron a
pulsos de ^{3}H-timidina y se recogieron 6 horas
después.
La figura 10 muestra el efecto del CBD sobre la
reacción de leucocitos mixtos.
Se incubaron células de bazo (1 x
10^{6}/pocillo) de ratones BALB/c en microplacas de fondo plano
durante 3 días con un número igual de esplenocitos singénicos y
alogénicos irradiados (B6), en presencia de las concentraciones
indicadas de CBD. Los cultivos se sometieron a pulsos de
^{3}H-timidina y se recogieron 18 horas
después.
La figura 11 muestra el efecto de CBD sobre la
citotoxicidad mediada por células.
Se incubaron células de bazo (1,25 x 10^{6}/ml)
de ratones B6 (H-2^{b}) durante 5 días con un
número igual de esplenocitos BALB/c (H-2^{d})
irradiados, en presencia de las concentraciones indicadas de CBD
(cultivos de leucocitos mixtos, MLC). Las células recogidas de MLC
se ensayaron con respecto a su actividad citotóxica contra la línea
de células de linfoma P815 (H-2^{d}) marcada con
^{51}Cr. La actividad citotóxica se proporciona en células
LU/10^{6} (véase la sección de Materiales y Métodos).
Se activaron macrófagos peritoneales inducidos
por tioglicolato procedentes de ratones C57BL/6 con LPS e
IFN\gamma. Se estudiaron los efectos de diferentes concentraciones
de CBD sobre la producción de TNF\alpha. El
IFN-\gamma y el IFN-\alpha se
adquirieron en Boehringer Mannheim, Alemania. Los resultados se
muestran en la tabla 1.
| Células y agente | 6 h | % de inhibición | 24 h | % de inhibición |
| 0 | 0,4 | 9 | ||
| LPS | 596 | 277 | ||
| LPS + CBD 6 \mug/ml | 290 | 51 | 34 | 88 |
| LPS + CBD 4 \mug/ml | 271 | 54 | 36 | 87 |
| LPS + CBD 2 \mug/ml | 543 | 9 | 90 | 67 |
| Células y agente | 6 h | % de inhibición | 24 h | % de inhibición |
| 0 | 0,4 | 9 | ||
| LPS + IFN\gamma | 716 | 2664 | ||
| LPS + IFN\gamma + CBD a 6 \mug/ml | 548 | 24 | 207 | 92 |
| LPS + IFN\gamma + CBD a 4 \mug/ml | 478 | 33 | 437 | 84 |
| LPS + IFN\gamma + CBD a 2 \mug/ml | 744 | 0 | 4578 | mejorada 72% |
| Macrófagos peritoneales inducidos por tioglicolato de ratones C57BL/6 |
La tabla 1 demuestra que el CBD inhibe la
producción de TNF\alpha. Las bajas concentraciones de CBD parecen
mejorar la producción de TNF\alpha.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| NO (nM)* | ||||
| Células y agente | 24 h | % de inhibición | 48 h** | % de inhibición |
| Control | 0,1 | 0,3 | ||
| LPS 1 \mug/ml | 5,4 | 7,3 | ||
| LPS 1 \mug/ml + CBD 8 | 0,1 | 99 | 0,4 | 95 |
| LPS 1 \mug/ml + CBD 6 | 0,1 | 99 | 2,1 | 71 |
| LPS 1 \mug/ml + CBD 4 | 0,5 | 90 | 4,6 | 37 |
| LPS 1 \mug/ml + CBD 2 | 3,7 | 32 | 6,7 | 9 |
\vskip1.000000\baselineskip
| NO (nM)* | ||||
| Células y agente | 24 h | % de inhibición | 48 h** | % de inhibición |
| LPS + IFN\gamma | 13,9 | 20,5 | ||
| LPS + IFN\gamma + CBD 8 | 0,2 | 99 | 3,1 | 85 |
| LPS + IFN\gamma + CBD 6 | 5,5 | 61 | 18,1 | 11,5 |
| LPS + IFN\gamma + CBD 4 | 6,9 | 51 | 21,3 | -(\uparrow 4%) |
| LPS + IFN\gamma + CBD 2 | 12 | 14 | 25,4 | -(\uparrow 24%) |
| * Ensayado por el reactivo de Griess | ||||
| ** Después de 48 horas, el M\phi cultivado con 8 \mug/ml de CBD tenía una viabilidad de sólo el 78%. |
De nuevo, las bajas concentraciones de CBD
parecen activar la producción de óxido nítrico, mientras que las
concentraciones mayores inhiben la producción de óxido nítrico.
El CBD se disolvió en etanol/DMSO. El etanol
posteriormente se evaporó por medio de un SpeedVac y el CBD se
resuspendió en medio caliente a una concentración de solución madre
de 1 mg/ml.
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) a partir de la sangre entera de donantes sanos
por un gradiente de Ficoll Hypaque. Se cultivaron a 2 x 10^{5}
células/ml en placas de microtitulación de 96 pocillos
(200 \mu/pocillo) y se incubaron durante 6 horas con un intervalo de dosificación de CBD (de \mug/ml). Después de este periodo de pretratamiento de 6 horas, las células se estimularon con LPS de Salmonella typhimurium, 10 ng/ml, durante 24 horas (para el TNF e IL-1\beta) o con PHA, 5 \mug/ml, durante 72 horas (para el IFN\gamma). La viabilidad de los PBMC se evaluó con el ensayo MTT.
(200 \mu/pocillo) y se incubaron durante 6 horas con un intervalo de dosificación de CBD (de \mug/ml). Después de este periodo de pretratamiento de 6 horas, las células se estimularon con LPS de Salmonella typhimurium, 10 ng/ml, durante 24 horas (para el TNF e IL-1\beta) o con PHA, 5 \mug/ml, durante 72 horas (para el IFN\gamma). La viabilidad de los PBMC se evaluó con el ensayo MTT.
La tabla 3 resume los efectos de CBD sobre PBMC
humanos activados. De manera interesante, se descubrió que las
menores concentraciones de CBD (de 0,1 a 5 \mug/ml) reprimían
significativamente la liberación de las citoquinas proinflamatorias
inducidas por LPS TNF\alpha e IL-1\beta,
mientras que las concentraciones mayores aumentaban su liberación.
Este hallazgo fue reproducible y es importante en vista del hecho
de que también descubrimos un efecto con forma de campana in
vivo cuando se trataban ratones artríticos con CBD. La mayor
dosis de 20 mg/kg i.p. no pudo mejorar la artritis (fig. 1 y
2).
Se cultivaron PBMC humanos y se estimularon con o
sin CBD, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. El
estímulo para la producción de TNF e IL-1 fue LPS, y
el estímulo para la producción de INF\gamma fue PHA. Los
resultados son la media de pocillos por triplicado \pm SEM. ND =
no realizado.
Se purificó colágeno de tipo II bovino (CII) a
partir de cartílago hialino, como se describe [Williams, 1992]. Se
inmunizaron ratones DBA/1 macho (de 8 a 12 semanas de edad) con 100
\mug de CII emulsionado en adyuvante completo de Freund CFA
(Difco, Detroit, MI) por inyección intradérmica en la base de la
cola. Desde el día 15 después de la inmunización en adelante, los
ratones se examinaron diariamente para comprobar el inicio de la
CIA usando dos parámetros clínicos: hinchazón de la pata y
puntuación clínica [Williams, PNAS, Vol. 89, páginas 97848]. La
hinchazón de la pata se evalúo midiendo el espesor de las patas
traseras afectadas con calibres de 0-10 mm
(Kroeplin, Schluchtern, Alemania). Para la puntuación clínica, 0 =
normal; 1 = hinchazón ligera y eritema; 2 = edema pronunciado; 3 =
rigidez de las articulaciones. Se calificó cada miembro, dando como
resultado una puntuación clínica máxima de 12 por animal. La
artritis se controló durante 10 días, después de lo cual se
sacrificaron los ratones.
Para los experimentos crónicos, se inmunizaron
ratones de 6 semanas de edad con CII de ratón (100 \mug de CII
i.d. = intradérmico). Desde el día 30 después de la inmunización en
adelante, los ratones desarrollaron una artritis crónica con
recaídas, que se controló durante 5 semanas, de la misma manera que
se ha descrito anteriormente.
El tratamiento con canabidiol (CBD) comenzó al
principio de la enfermedad y se administró i.p. diariamente hasta
el día 10 de la artritis en el modelo de artritis aguda con CII
bovino. Las concentraciones de CBD usadas fueron
20 mg/kg (n = 17), 5 mg/kg (n = 15) y 2,5 mg/kg (n = 9). El CBD se disolvió en etanol/cremophor (Sigma Chemical Co., Poole, UK) (1/1, v/v) y se diluyó adicionalmente en solución salina. Los ratones a los que sólo se les inyectó vehículo (etanol/cremophor en solución salina) sirvieron como controles (n = 23).
20 mg/kg (n = 17), 5 mg/kg (n = 15) y 2,5 mg/kg (n = 9). El CBD se disolvió en etanol/cremophor (Sigma Chemical Co., Poole, UK) (1/1, v/v) y se diluyó adicionalmente en solución salina. Los ratones a los que sólo se les inyectó vehículo (etanol/cremophor en solución salina) sirvieron como controles (n = 23).
Para el experimento crónico con CII en ratón, los
ratones se trataron desde los primeros síntomas de artritis un día
sí y otro no durante 5 semanas. Para la vía i.p., el CBD se inyectó
a dosis de 10 mg/kg (n = 7) y 5 mg/kg (n = 7). De nuevo los ratones
a los que se les inyectó vehículo solo sirvieron como controles (n
= 7). Para la vía oral, el tratamiento se administró diariamente a
una dosis de 25 mg/kg (n = 6) y a los ratones de control se les
suministró aceite de oliva (n = 6).
Para el protocolo de tratamiento oral en el
modelo de CIA aguda, el CBD se disolvió en aceite de oliva y se
administró por medio de una sonda oral diariamente, desde el
principio de la artritis durante 10 días. Las dosis usadas fueron de
10 mg/kg, 25 mg/kg y 50 mg/kg (n = 6 por grupo), que correspondían
a 2, 5 y 10 mg/kg i.p., respectivamente. A los ratones de control se
les suministró aceite de oliva (n = 6).
Se retiraron las articulaciones de las patas
traseras y de las rodillas post mortem en el décimo día de
la artritis, se fijaron en formalina y se descalcificaron en EDTA al
5%. Después se incluyeron las patas y las rodillas en parafina, se
seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los cambios de
artritis en el tobillo, las articulaciones metatarsofalángicas y las
articulaciones interfalángica proximal e interfalángica distal se
puntuaron de forma ciega como leve (hiperplasia sinovial
leve), moderada (formación de pannus y erosiones limitadas a
la unión cartílago-pannus) o severas (=
erosiones extendidas en hueso y cartílago con pérdida de
arquitectura de la articulación).
El CBD, a las dosis de 20 mg/kg y 10 mg/kg tenía
un efecto terapéutico ligero sobre la CIA, especialmente sobre la
puntuación clínica (fig. 1). El efecto beneficioso de 10 mg/kg
parecía mejor que el de 20 mg/kg, particularmente durante los
primeros días de tratamiento (fig. 1). Por lo tanto, se decidió
reducir la dosis de CBD a 5 mg/kg. Esta concentración produjo una
represión espectacular de la CIA en curso, como se evalúa tanto por
la puntuación clínica (fig. 1) como por el espesor de la pata (fig.
2). La acción terapéutica del CBD se perdió al reducir
adicionalmente la concentración a 2,5 mg/kg (fig. 1 y 2). A esta
baja dosis, se descubrió que el CBD no tenía ningún efecto en
absoluto sobre la progresión de la artritis clínica, como se evalúa
por la puntuación clínica y el espesor de la pata (fig. 1 y fig.
2).
Los efectos dependientes de la dosis del CBD se
confirmaron en el modelo de CIA crónica (fig. 4). Se descubrió que
una dosis de 5 mg/kg era óptima para suprimir la artritis. El área
bajo la curva (AUC) fue de 28,9, en comparación con 38,4 en el grupo
de control. Una dosis de 10 mg/kg era menos eficaz que una dosis de
5 mg/kg.
La dosificación oral diaria de CBD por medio de
una sonda después del inicio de la artritis produjo una supresión
adecuada de la artritis (fig. 5). De nuevo, 25 mg/kg (que
corresponde a 5 mg/kg i.p.) fue la dosis óptima.
La figura 6 demuestra que el suministro oral de
25 mg/kg de CBD producía una supresión de la progresión de la CIA
crónica. El área bajo la curva (AUC) se redujo de 72,3 en los
controles a 49,7 en los animales tratados.
Se evaluaron la hiperplasia y la destrucción de
las articulaciones de las patas traseras de los ratones de control
y de los ratones tratados con CBD, a 5 mg/kg y 10 mg/kg, con un
diseño ciego. En los ratones de control, no se encontraron
articulaciones normales, mientras que el 11% de las articulaciones
de los ratones tratados con 10 mg/kg de CBD y un 33% de las
articulaciones de los ratones tratados con 5 mg/kg de CBD quedaron
completamente protegidas (fig. 3). El 69% de todas las
articulaciones de los ratones de control se vieron afectadas de
manera moderada o severa. En ratones tratados con 5 mg/kg de CBD,
esto se redujo al 42%. De esta manera, los hallazgos histológicos
confirman los resultados clínicos de que CBD, a 5 mg/kg/día, tiene
un efecto terapéutico notable sobre la
CIA.
CIA.
Se estudió el efecto del canabidiol sobre la EAE.
La EAE se parece al estado de enfermedad de la esclerosis múltiple
humana (MS) y la encefalomielitis de diseminación aguda.
Los métodos usados se basaron en los usados por
Lehmann D et. al. J. Neuroimmunology. Vol. 50, páginas
35-42, 1994.
Se adquirieron ratones hembra SJL/J de
6-12 semanas de edad de Jackson Laboratory (Bar
Harbor, ME) y se encerraron en condiciones convencionales en jaulas
con rejilla en la parte superior. Todos los animales se alimentaron
con una dieta regular y recibieron agua acidificada sin
antibióticos.
Se obtuvo homogeneizado de médula espinal de
ratón (MSCH) como se indica a continuación. Se obtuvieron médulas
espinales de ratones de 3-10 meses de edad de
diversas cepas por insuflación y se preparó un MSCH por
homogeneización en PBS (1:1 v/v). El homogeneizado se liofilizó, se
reconstituyó en PBS a una concentración de 100 mg/ml
(peso seco) y se almacenó a -20ºC hasta que se usó.
(peso seco) y se almacenó a -20ºC hasta que se usó.
Se obtuvo derivado de proteína purificada de
tuberculina (PPD) de Statens Serum Institute Copenhagen,
Dinamarca.
La inducción de EAE aguda en ratones se basó en
una modificación del procedimiento de Bernard (Bernard et
al., 1976). En resumen, se emulsionaron volúmenes iguales de
MSCH (100 mg/ml en PBS) y CFA enriquecido con Mycobacterium
tuberculosis H37Ra (6 mg/ml) (Difco Laboratories, Detroit MI).
La emulsión (50-100 \mul) se administró s.c. (por
vía subcutánea) en las cuatro patas traseras de cada ratón.
Inmediatamente después y dos días después, a los ratones se les
inyectó i.v. (por vía intravenosa) pertusígeno. Todos los animales
se examinaron diariamente para controlar los signos de la
enfermedad. Las primeras indicaciones clínicas aparecieron en el día
9-11 después de la inmunización y se puntuaron de
acuerdo con la siguiente escala de seis punto: 0, sin anormalidad;
1, leve debilidad de la cola; 2, parálisis de la cola; 3, parálisis
de la cola y parálisis de las patas traseras; 4, parálisis de las
patas traseras o debilidad leve de las patas delanteras; 5,
cuadriplejia o estado moribundo; 6
muerte.
muerte.
Los ratones se trataron con canabidiol a una
dosis de 10 mg/kg. Los resultados se muestran en la figura 7 y en
la tabla 4.
| Control | CBD | |
| Incidencia | 4/6 | 2/6 |
| Duración (días) | 4,66 | 2,16 |
| Puntuación máxima media | 2 | 1 |
| Los resultados demuestran que el canabidiol reprime de forma notable la EAE en ratones. |
La figura 8 indica que el CBD, a 10 mg/kg reduce
la producción de TNF\alpha en suero en ratones expuestos a
LPS.
Se adquirieron ratones hembra (con edades
comprendidas entre 8 y 12 semanas) de las cepas C57BL/6 (B6,
H-2^{b}) y BALB/c (H-2^{d}) de
Harlan, Jerusalem, y se mantuvieron en condiciones específicas sin
patógenos (SPF) en las instalaciones de animales de la Hebrew
University Medical School, Jerusalem, de acuerdo con las
directrices de la Hebrew University, DMEM (Biological Industries,
Beit Haemek, Israel), con suplemento de piruvato sódico 1 mM, tampón
Hepes 10 mM, asparagina-HCl 0,5 mM, ácido fílico
0,03 mM, ácido L-aspártico 0,5 mM,
2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M, glutamina 2 mM;
antibióticos y FCS al 10% (DMEM completo).
Se cultivaron células de bazo, a una
concentración final de 5 x 10^{6} células/ml, en pocillos por
triplicado de placas de microtitulación de fondo plano (Nunc.
Dinamarca) en medio solo, concanavalina A a 2,5 \mug/ml (ConA,
Biomakor, Israel) o lipopolisacárido a 50 \mug/ml (LPS, Difco).
El volumen final fue de 200 \mul/pocillo. Después de dos días de
incubación a 37ºC en un incubador al aire con un 8% de CO_{2}
(como en todos los demás procedimientos descritos en este
documento), se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina
a cada pocillo. Las células se recogieron 6 horas después, con un
recolector de células Tomtec (USA) y se contaron en un contador de
centelleo MicroBeta (Wallac, Finlandia).
Se cocultivaron células de bazo (1 x
10^{6}/pocillo) en pocillos por triplicado de placas de
microtitulación de fondo plano (Nunc), con un número igual de
esplenocitos singénicos o alogénicos irradiados (25 cGy) en un
volumen final de 200 \mul/pocillo. Después de 3 días de
incubación, las células se marcaron con
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) y se
recogieron, después de una incubación adicional de 18 horas, como
se ha descrito anteriormente.
Se activaron CTL restringidos por MHC en MLC por
cocultivo de 2,5 x 10^{6} células de bazo respondedoras durante 5
días con un número igual de esplenocitos alogénicos irradiados (25
Gy) en 2 ml/pocillo de DMEM completo en placas de 24 pocillos
(Costar).
Se realizaron ensayos citotóxicos como se ha
descrito previamente (Leshem et al., 1999). En resumen, se
diluyeron en serie (tres veces) células efectoras en pocillos por
triplicado de microplacas de fondo cónico (Nunc) y se mezclaron con
células diana marcada con ^{51}Cr lavadas en un volumen final de
200 \mul para obtener relaciones de células
efectoras-diana de 4-6. Las
microplacas se centrifugaron (70 x g, 2 minutos) y se incubaron
durante 4 horas. Después, se centrifugaron a 200 x g durante 5
minutos y los sobrenadantes (150 \mul) se contaron en un contador
c automático (LKB-Wallac, Finlandia). El porcentaje
de actividad citotóxica específica se calculó de acuerdo con la
fórmula: [(cpm experimentales - cpm de fondo)/(cpm máximas - cpm de
fondo) x 100]. Las unidades líticas (LU) se extrajeron de la
citotoxicidad medida a relaciones de células E:T de
4-6. Una LU se define como el número de células
efectoras que producen la lisis de un 30% de células diana (Leshem y
Brass, 1998).
Las figuras 9a y 9b demuestran que el CBD reduce
la respuesta de esplenocitos de ratones BALB/C y esplenocitos de
ratones C57BL/b respectivamente a la exposición a concanavalina A
(ConA) y LPS.
El efecto del CBD sobre la MLR y la citotoxicidad
mediada por células se muestra en la figuras 10 y 11
respectivamente. Se observó una ligera reducción en la captación de
^{3}H-timidina por encima de 4 \mug/ml de CBD.
La figura 11 demuestra que bajas concentraciones de CBD aumentan la
citotoxicidad por encima de aproximadamente 1 \mug/ml de CBD,
aunque se observó una reducción en la citotoxicidad.
Se recogieron granulocitos activados por
tioglicolato a partir de ratones C57BL/6 por lavado estéril con PBS
18 horas después de la inyección intraperitoneal de 1,5 ml de medio
con tioglicolato (1,5 ml en solución al 3%). Las células se lavaron
y se resuspendieron a 5 x 10^{5} células/ml en solución salina
tamponada de Hank sin rojo de fenol y se distribuyeron a 0,5 ml/tubo
en tubos de plástico de un luminómetro. Se añadió CBD disuelto en
etanol y medio a una concentración de 6 \mug/ml a algunos tubos y
finalmente se añadieron 10 \mul de luminol y 30 \mul de Zymosan
durante 0, 1 o 2 horas. El tubo se insertó en el luminómetro
(Biolumate LB 95 oot Berhold Wildbad Alemania) que se había
precalentado a 37ºC. La respuesta de quimioluminiscencia potenciada
con luminol de los granulocitos a Zymosan se consideró el control
positivo.
Todas las células eran viables al final de
experimento. El CBD inhibía el 45-92% del pico de
quimioluminiscencia observado.
| Tratamiento | Pico calculado por | % de inhibición |
| quimioluminiscencia | ||
| Granulocitos (control) | 300 | |
| Granulocitos + Zymosan | 1868 | |
| Granulocitos + Zymosan + CBD 6 \mug/ml (0 h) | 1024 | 45 |
| Granulocitos + Zymosan + CBD 5 \mug/ml (1 h) | 157 | 92 |
| Granulocitos + Zymosan + CBD 6 \mug/ml (2h) | 235 | 87 |
Los granulocitos se pretrataron con CBD a 6
\mug/ml durante 0-2 horas antes de realizar el
ensayo ROI. Después de 1-2 horas de tratamiento con
CBD, las células tenían una disponibilidad de aproximadamente un
100%.
Se obtuvo tejido de membrana sinovial a partir de
un paciente que cumplía los criterios revisados del American
College of Rheumatology para la artritis reumatoide que se
sometieron a una operación quirúrgica de reemplazo de la
articulación. Se prepararon cultivos de células sinoviales como se
ha descrito. En resumen, se digirió tejido de membrana sinovial con
colagenasa de tipo A (1 mg/ml) y DNAasa I (0,15 mg/ml) en RPMI 1640
que contenía FCS al 5% durante 2 horas a 37ºC. El tejido digerido
se empujó a través de una malla de nylon de 200 \mum^{2} y se
cultivo a 10^{6} células/ml/pocillo en RPMI 1640 suplementado con
FCS al 10%, L-glutamina 2 mM y antibióticos, en
placas de cultivo de 24 pocillos a 37ºC en CO_{2} al 5% durante
48 horas en medio completo con o sin CBD a las concentraciones
especificadas.
Se sacrificaron ratones DBA/1 que se habían
inmunizado con CII bovina en CFA para inducir CIA, como se ha
descrito anteriormente, en el día 10 de artritis y se extrajeron las
articulaciones de las rodillas. Se realizaron cultivos de células
sinoviales como se ha descrito previamente. En resumen, se
escindieron membranas sinoviales bajo un microscopio de disección y
se digirieron con colagenasa A (1 mg/ml)
(Boehringer-Mannheim) y DNAasa de tipo IV (0,15
mg/ml) (Sigma, Dorset, UK) a 37ºC durante 20 minutos, en presencia
de polimixina B (33 \mug/ml) (Sigma). Las células después se
lavaron extensivamente y se cultivaron en placas de 96 pocillos a
una densidad de 2 x 10^{6} células/ml (100 \mul/pocillo) en
medio completo con o sin CBD a las concentraciones especificadas. Se
recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se almacenaron a
-20ºC hasta que se midieron las citoquinas.
Se sabe que las células sinoviales de ratones
artríticos en el día 10 producen espontáneamente grandes cantidades
de TNF cuando se cultivan in vitro. Se descubrió que el CBD,
cuando se añadía a los cultivos in vitro, ejercía una
supresión dependiente de la dosis de la liberación de TNF (tabla
6).
De forma similar, las células sinoviales
reumatoides producen espontáneamente citoquinas cuando se cultivan
in vitro. La tabla 7 muestra los efectos del CBD sobre la
liberación de varias citoquinas, medida por ELISA. Descubrimos una
inhibición dependiente de la dosis de IL-6,
IL-8, IL-10 e
IL-11. En este primer experimento inicial, el
TNF\alpha no se suprimió, lo cual es discordante con los
resultados obtenidos en ratones. Debido al número restringido de
células sinoviales humanas en esta muestra, es posible que falte la
dosis óptima para inhibir el TNF\alpha.
| O.D. | TNF (pg/ml) | |
| Células sinoviales (SC) | 0,183 \pm 0,003 | >1000 |
| SC + vehículo | 0,181 \pm 0,004 | >1000 |
| CBD 1 \mug/ml | 0,190 \pm 0,003 | >1000 |
| CBD 2,5 \mug/ml | 0,193 \pm 0,004 | >1000 |
| CBD 5 \mug/ml | 0,422 \pm 0,251 | 100 |
| CBD 10 \mug/ml | 0,922 \pm 0,103 | 2 |
| CBD 20 \mug/ml | 1,152 \pm 0,117 | <0,01 |
| CBD 50 \mug/ml | 1,163 \pm 0,119 | <0,01 |
| Se usó un ensayo de citotoxicidad en pocillo |
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (5)
1. Uso de canabidiol para la fabricación de un
medicamento para tratar la artritis reumatoide.
2. Uso de canabidiol para la fabricación de un
medicamento para tratar la esclerosis múltiple.
3. Uso de canabidiol para la fabricación de un
medicamento para tratar la colitis ulcerosa.
4. Uso de canabidiol para la fabricación de un
medicamento para tratar la enfermedad de Crohn.
5. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación
anterior, donde el canabidiol se combina con el uso de un segundo
compuesto anti-inflamatorio.
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