ES2240404T3 - Composiciones tratadas para inactivar las proteinas infecciosas. - Google Patents

Composiciones tratadas para inactivar las proteinas infecciosas.

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Abstract

Un método para tratar un material con el fin de inactivar priones infecciosos, que comprende las etapas de: la puesta en contacto del material con una composición que contiene: un solvente; un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2, 5 a 4, 5; y un detergente seleccionado de dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3- colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter; y el permitir que la composición permanezca en contacto con el material que elimina la infectividad de los priones infecciosos.

Description

Composiciones tratadas para inactivar las proteínas infecciosas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a composiciones utilizadas para inactivar proteínas infecciosas tales como priones infecciosos.
Antecedentes de la invención
Se conocen composiciones antisépticas desde hace más de 100 años. Además de varias composiciones existe un rango de diferentes métodos que se sabe que son eficaces para destruir bacterias e inactivar virus. Tales métodos incluyen la utilización de una temperatura elevada sola o en combinación con radiación durante periodos de tiempo suficientes para destruir bacterias o para alterar virus e inactivarlos de este modo.
Ejemplos de composiciones antisépticas tópicas de actuación rápida están descritos en la Patente de EE.UU. 6.110.908 publicada el 29 de Agosto de 2000. Otra composición antibacteriana está descrita en la Patente de EE.UU. 6.025.312 publicada el 15 de Febrero de 2000. Ejemplos de otras composiciones antisépticas están descritos en las Patentes de EE.UU. 5.336.432 publicada el 9 de Agosto de 1994; 5.308.611 publicada el 3 de Mayo de 1994; 6.106.773 publicada el 22 de Agosto de 2000 y 6.096.216 publicada el 1 de Agosto de 2000.
Las composiciones antisépticas y las metodologías antisépticas convencionales son generalmente insuficientes para inactivar proteínas infecciosas tales como priones. Aunque los priones pueden ser inactivados mediante temperaturas relativamente elevadas a lo largo de periodos de tiempo muy largos, los rangos de temperatura y los periodo de tiempo utilizados generalmente para destruir bacterias e inactivar virus son insuficientes para inactivar priones. Un planteamiento para resolver este problema es intentar eliminar los priones de las soluciones, y un proceso de extracción cromatográfica está descrito en la Patente de EE.UU. 5.808.011. Además, otros han intentado proporcionar composiciones y metodologías que están destinadas a inactivar priones, según se describe en la Patente de EE.UU. 5.633.349 publicada el 27 de Mayo de 1997. Sin embargo, tales procesos duran generalmente periodos de tiempo relativamente largos, por ejemplo más de 12 horas, y generalmente no proporcionan una solución que pudiera ser fácilmente y económicamente utilizada para inactivar priones en un amplio rango de superficies, tales como los dispositivos médicos. Además, WO 00/72851 describe un método para esterilizar objetos que implica la puesta en contacto del objeto con un dendrímero policatiónico bajo condiciones que tienen como resultado la conversión de una proteína alterada conformacionalmente, tal como un prión, en no infecciosa. Supattapone y col. (P.N.A.S. 96, páginas 14529-14534, 1999) describen la eliminación de proteínas priónicas de células de neuroblastoma en cultivo infectadas con tembladera.
La presente invención ofrece una composición antiséptica y un método para inactivar priones según se describe adicionalmente a continuación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un dibujo esquemático de una molécula de dendrímero que muestra las "generaciones" definidas de una estructura homodispersa creada utilizando una técnica de crecimiento divergente repetitivo. El diagrama específico es de PAMAM, generación 2.0 (núcleo central de etilén diamina).
La Figura 2 incluye los paneles de geles 2A (2 horas) y 2B (5 minutos). En la Figura 2A, la columna 4 (+) muestra que SDS a un pH de 3,3 aproximadamente elimina completamente PrP^{C}, mientras que SDS al 1% a un pH de 7,0 no es eficaz. La Figura 2B muestra en la columna 4 que SDS al 1% a un pH de 3,3 es eficaz para inactivar priones después de solamente 5 minutos de exposición.
La Figura 3 incluye un panel de gel en el que las columnas muestran los resultados llevados a cabo a diferentes temperaturas, indicando que la temperatura óptima de utilización de SDS acético para eliminar priones es mayor de 20ºC.
La Figura 4 muestra cuatro geles separados, cada uno de los geles procesado a nueve diferentes niveles de pH específico, mostrando que SDS desnaturaliza PrP^{Sc} a pH bajo y a pH alto, pero no a un pH relativamente neutro, y mostrando además que un aumento de la concentración en porcentaje de SDS mejora la capacidad de la formulación para desnaturalizar PrP^{Sc}.
La Figura 5 proporciona paneles de geles que muestran que pueden utilizarse tampones de acético distintos de ácido acético y acetato de sodio en combinación con SDS para desnaturalizar PrP^{Sc}.
Resumen de la invención
Se utiliza una composición antiséptica para inactivar completamente priones infecciosos. La composición está formada por un primer agente que mantiene el pH de la composición en el rango de 2,5 a 4,5; y por un segundo agente que comprende un detergente caracterizado por su capacidad para destruir la infectividad de los priones infecciosos en el entorno de pH bajo creado por el primer componente (por ejemplo en dos horas o menos). El primer agente puede ser cualquier ácido bien conocido presente en una solución acuosa a una molaridad suficiente para reducir el pH de la composición antiséptica hasta un valor en el rango de 2,5 a 4,5 y mantener el pH a ese nivel bajo cuando la composición antiséptica sea aplicada a un objeto o mezclada con un material a tratar. La composición variará debido al gran número de ácidos y de agentes detergentes inactivantes diferentes que pueden ser utilizados. A medida que aumenta la temperatura y disminuye el pH, la inactivación tiene lugar más rápidamente. Las composiciones de la invención inactivan preferiblemente a los priones en 2 horas aproximadamente o menos a un pH de 2,5 a 4,0 y a temperaturas de 15ºC a 40ºC aproximadamente. Sin embargo, pueden utilizarse temperaturas bajas (por ejemplo 0ºC o mayor) y temperaturas elevadas (por ejemplo 100ºC o inferior) así como periodos de tiempo más largos. La inactivación puede tener lugar más rápidamente (por ejemplo en un minuto o menos) y a temperaturas más elevadas (por ejemplo mayores de 40ºC).
La composición antiséptica es combinada preferiblemente con un componente adicional, lo cual tiene como resultado la formación de un alimento tratado, material farmacéutico tratado o un objeto tratado seleccionados de una cápsula de gel farmacéutica, una tableta revestida con gel, un expansor sanguíneo o una solución de sustitución de sangre, un implante quirúrgico, un vendaje, una sutura, un instrumento dental, una esponja dental, una esponja quirúrgica, una golosina conteniendo una gelatina tal como una golosina de caramelo, un dulce de merengue blando o una pastilla de menta tal como una pastilla de menta Altoid®, el glaseado de un dónut®, zumos de fruta, vino, cerveza, nata, yogur, requesón, helados, margarina y chicle. En esencia, la composición antiséptica puede ser combinada con, o revestida sobre, cualquier material que pueda incluir priones infecciosos y, particularmente, con cualquier material que comprenda productos animales, más particularmente productos bovinos tales como gelatina
bovina.
Se describe un método mediante el cual cualquier tipo de objeto puede ser esterilizado mediante la combinación de procedimientos normales de esterilización con la utilización de la composición antiséptica descrita en la presente que es capaz de convertir en no infecciosa una proteína alterada conformacionalmente tal como un prión. El método es particularmente útil para esterilizar dispositivos médicos tales como instrumentos quirúrgicos y catéteres que hayan sido utilizados y puestos en contacto con sangre o con tejido cerebral. Los objetos esterilizados mediante este método son también parte de la invención e incluyen cápsulas que estén hechas de gelatina extraída de ganado, ganado que puede estar infectado con priones, esto es que haya sido diagnosticado de BSE, conocida como la "enfermedad de las vacas locas".
Las composiciones antisépticas pueden ser combinadas con agentes antibacterianos y antivirales convencionales en soluciones acuosas o alcohólicas para producir agentes desinfectantes o agentes para lavado quirúrgico. La esencia de la invención descrita en la presente es que un amplio rango de tipos diferentes de detergentes convertirán a los priones en no infecciosos en un periodo de tiempo relativamente corto (por ejemplo 2 horas o menos) cuando se mantienen a un pH de 2,5 a 4,5 a temperaturas moderadas, por ejemplo de 15 a 30ºC. En algunos casos, el valor comercial de la invención disminuye si la composición no logra su objetivo deseado en un corto periodo de tiempo (por ejemplo menos de 10 minutos a temperatura ambiente aproximadamente, 20ºC \pm 5ºC).
Un aspecto global de la invención es un método para tratar un material con el fin de inactivar priones infecciosos, que comprende las etapas de:
la puesta en contacto del material con una composición que contiene:
un solvente;
un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2,5 a 4,5; y
un detergente; y
el permitir que la composición permanezca en contacto con el material que inactiva completamente los priones infecciosos.
Una ventaja de la invención es que proteínas tales como priones pueden ser convertidas en no infecciosas sin necesidad de condiciones extremas tales como la exposición a calor durante largos periodos de tiempo, por ejemplo sin la necesidad de una exposición de 1 a 10 horas a 100 - 200ºC.
Una característica de la invención es que las composiciones pueden ser útiles aunque contengan solamente concentraciones muy bajas del componente inactivador de priones tal como SDS, por ejemplo del 1% al 0,001%.
Otro aspecto de la invención es que cápsulas hechas de gelatina bovina pueden ser certificadas como libres de priones.
Otro aspecto de la invención es que fármacos producidos a partir de cultivos celulares tratados con un detergente tal como SDS pueden ser certificados como libres de priones.
Otro aspecto más de la invención es que dispositivos médicos que son reutilizados después de la exposición a sangre o a tejido cerebral pueden ser certificados como libres de priones.
Otro aspecto más de la invención es que hospitales, quirófanos y dispositivos y equipos dentro de los mismos pueden ser certificados como libres de priones mediante la puesta en contacto de los mismos con detergentes a temperaturas y presiones estándar.
Una ventaja de la invención es que proteínas conformacionalmente alteradas, tales como priones, pueden ser convertidas en no infecciosas con un método que consiste solamente en aplicar un componente activo tal como SDS mantenido preferiblemente a un pH de 2,5 a 4,5.
Otro aspecto de la invención son jabones, agentes para lavado quirúrgico, detergentes y similares que son formulados para que contengan el componente ácido y el componente detergente inactivador de priones.
Otros aspectos de la invención son métodos para esterilizar equipos de fabricación tales como columnas cromatográficas y la utilización del equipo esterilizado para fabricar productos tales como agentes farmacéuticos.
Otro aspecto es la utilización de las composiciones para esterilizar instrumentos, equipamiento y consultas dentales.
Una ventaja de la invención es que las composiciones compuestas por el componente detergente inactivador y un componente ácido pueden ser utilizadas para inactivar priones que puedan estar presentes en instrumentos quirúrgicos, cuchillos y/u otras herramientas o equipamientos utilizados por los carniceros, particularmente los utilizados en las matanzas de vacas o de otros animales que pudieran estar infectados con priones.
Una característica de la invención es que las composiciones de la invención pueden ser eficaces para inactivar priones cuando el componente detergente inactivante (por ejemplo, SDS) está presente en concentraciones muy bajas, por ejemplo del 1% al 0,001% o menores.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Antes de describir los presentes métodos, objetos y composiciones, debe comprenderse que esta invención no se limita a las etapas, dispositivos o componentes particulares descritos y que los mismos pueden por supuesto variar. Debe comprenderse también que la terminología utilizada en la presente tiene el propósito de describir solamente realizaciones particulares, y no está destinada a ser limitante, ya que el ámbito de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por las personas con experiencia habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse en la práctica o en los ensayos de la presente invención métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación.
Definiciones
El término "ácido" es utilizado para describir cualquier compuesto o grupo de compuestos que tenga una o más características de las siguientes: (a) sabor agrio; (b) vira a rojo el colorante tornasol; (c) reacciona con ciertos metales para formar una sal; (d) reacciona con ciertas bases o álcalis para formar una sal. Un ácido contiene hidrógeno y en agua experimenta ionización, de tal manera que se forman iones H_{3}O^{+} - escritos también como H^{+} y referidos como iones hidronio o simplemente iones hidrógeno. Pueden utilizarse ácidos débiles tales como ácido acético o ácido carbónico así como ácidos fuertes tales como ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido sulfúrico (HCl, H_{2}SO_{4}, H_{2}NO_{3}). En las composiciones de la invención el ácido está presente preferiblemente en una concentración para obtener un pH de 2,5 a 4,5. El componente ácido de la composición antiséptica debe estar presente en una concentración (molaridad) para mantener la composición en el rango de pH deseado. La concentración (molaridad) del ácido utilizado variará algo con el ácido particular empleado, con el solvente utilizado (agua o alcohol) y con otros factores tales como la temperatura y la presión. El componente ácido está presente preferiblemente en una molaridad suficiente y es de un tipo tal que cuando se utiliza la composición antiséptica de la invención (por ejemplo, se mezcla con una muestra a desinfectar), la composición permanece dentro del rango de pH preferido. Por tanto, se prefieren formas del ácido más potentes y/o más concentradas cuando la composición va a ser utilizada sobre o en una situación en la cual la composición será diluida significativamente y/o entrará en contacto con un pH elevado (esto es, un componente muy básico).
Los términos "componente activo", "agente activo", "agente inactivante" y similares son utilizados en la presente indistintamente para describir un compuesto o un grupo de compuestos que cuando son combinados en el componente "ácido" de la invención en la composición antiséptica, convertirán en no infecciosa una proteína conformacionalmente alterada. El componente activo está dentro de un entorno con un pH de 2,5 a 4,5 y preferiblemente en una concentración baja, por ejemplo, menos de un 5% en volumen de la composición, e inactivará a los priones o a otras proteínas conformacionalmente alteradas en dos horas o menos a temperatura ambiente aproximadamente, de 15ºC a 30ºC. Los detergentes preferidos que actúan como componente activo para los priones incluyen SDS.
Los compuestos activos de la presente invención son los detergentes siguientes:
a)
dodecil sulfato de sodio (SDS) (conocido también como lauril sulfato, sal de sodio - otras sales son también útiles incluyendo las sales de litio y potasio)
b)
colato de sodio
c)
desoxicolato de sodio
d)
octilglucósido
e)
óxido de dodecildimetilamina
f)
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfato (CHAPS)
g)
bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB)
h)
bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)
i)
polioxietilen-p-isooctilfenil éter (por ejemplo Triton X-20, Triton X-100, Triton X-114).
Un aspecto de la invención es proporcionar el grupo de compuestos anterior a un material que puede contener priones infecciosos bajo condiciones que inactiven la infectividad de los priones, condiciones que comprenden preferiblemente un pH de 2,5 a 4,5 y una temperatura de 15ºC o superior, donde la inactivación tiene lugar en un periodo de tiempo de 2 o horas o menos, preferiblemente 1 hora o menos y más preferiblemente 10 minutos o
menos.
Información adicional de compuestos y de condiciones que afectan a la conformación de las proteínas puede encontrarse en Voet y col., Biochemistry, páginas 180-280 (1990); Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, páginas 57-71 (1987); y Deutscher, M.P., Guide to Protein Purification, páginas 240-241 (1990).
El término "detergente" es utilizado para indicar cualquier sustancia que reduzca la tensión superficial del agua. Anteriormente se proporcionaron ejemplos de detergentes como posibles componentes activos. El detergente puede ser un agente surfactante que se concentre en interfases aceite-agua, que ejerza una acción emulsionante y que facilite de este modo la eliminación de la suciedad, por ejemplo los jabones de sodio de ácidos grasos comunes. Un detergente puede ser aniónico, catiónico o moniónico dependiendo de su modo de acción química. Los detergentes incluyen sulfonatos de alquilo lineales (LAS) ayudados a menudo por "adyuvantes". Un LAS es preferiblemente un sulfonato de alquil benceno, ABS, que es fácilmente descompuesto por microorganismos (biodegradable). El LAS es generalmente un alquilo de cadena lineal que contiene de 10 a 30 átomos de carbono. El detergente puede estar en forma líquida o en forma sólida.
Los términos "prión", "proteína priónica", "proteína PrP^{Sc}" y similares son utilizados en la presente indistintamente para referirse a la forma infecciosa PrP^{Sc} de una proteína PrP, y es una contracción de las palabras "proteína" e "infección". Las partículas están compuestas en su mayoría, si no exclusivamente, de moléculas de PrP^{Sc} codificadas por un gen PrP. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos infectan a los animales causando la tembladera, una enfermedad transmisible degenerativa del sistema nervioso central de las ovejas y las cabras, así como la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) o "enfermedad de las vacas locas", y la encefalopatía espongiforme felina de los gatos. Cuatro enfermedades debidas a priones que se sabe que afectan a los humanos son (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS) y (4) insomnio fatal (FI). Según se utiliza en la presente, el término "prión" incluye todas las formas de priones que causan todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en cualquier animal utilizado - y en particular en humanos y en animales de granja domesticados.
El término "proteína conformacionalmente alterada" es utilizado en la presente para describir cualquier proteína que tenga una conformación tridimensional asociada con una enfermedad. La proteína conformacionalmente alterada puede causar la enfermedad, puede ser un factor en un síntoma de la enfermedad o puede aparecer como resultado de otros factores. La proteína conformacionalmente alterada aparece en otra conformación que tiene la misma secuencia de aminoácidos. En general, la proteína conformacionalmente alterada formada está "constreñida" en conformación cuando se compara con la otra conformación "relajada" que no está asociada con la enfermedad. Los expertos en la técnica que lean esta descripción reconocerán la aplicabilidad de la composición antiséptica de la invención a otras proteínas conformacionalmente alteradas aunque la invención está descrita en general con respecto a los priones. La lista siguiente es una lista no limitante de enfermedades con proteínas asociadas que reúnen dos o más conformaciones diferentes, en las que al menos una conformación es un ejemplo de una proteína conformacionalmente
alterada.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Enfermedad  \+  \hskip0.5cm   \+  Proteínas
Insolubles \cr \+\+\cr  Enfermedad de Alzheimer \+ \+
 \begin{minipage}[t]{70mm} APP, péptido A \beta,  
 \alpha 1-antiquimotripsina, tau,  componente no
A \beta,  presenilina 1, presenilina 2, apoE \end{minipage} \cr
  \begin{minipage}[b]{78mm} Enfermedades de priones,  enfermedad
de Creutzfeldt-Jakob,    tembladera y encefalopatía
espongiforme bovina \end{minipage}  \+ \+ PrP ^{Sc} \cr  ALS \+
\+ SOD y neurofilamentos\cr  Enfermedad de Pick \+ \+ Cuerpo de
Pick\cr  Enfermedad de Parkinson \+ \+
 \alpha   -  sinucleina en los cuerpos de Lewy\cr 
Demencia frontotemporal \+ \+ tau de las fibrillas\cr  Diabetes Tipo
II \+  \+ Amilina\cr  Mieloma múltiple - discrasias de células 
plasmáticas \+ \+ Cadena L de la IgG\cr  Polineuropatía 
amiloidótica familiar \+ \+ Transtiretina\cr  Carcinoma medular del
tiroides \+ \+ Procalcitonina\cr  Insuficiencia renal crónica \+ \+
 \beta  _{2}   -  microglobulina\cr  Insuficiencia
cardíaca congestiva \+ \+ Factor natriurético auricular\cr 
Amiloidosis cardíaca y  sistémica senil \+ \+ Transtiretina\cr 
Inflamación crónica \+ \+ Amiloide A del suero\cr  Ateroesclerosis
\+ \+ ApoA1\cr  Amiloidosis familiar \+ \+ Gelsolina\cr  Enfermedad
de Huntington \+ \+
Huntingtina.\cr}
Los términos "esterilizar", "hacer estéril" y similares son utilizados en la presente para indicar la conversión de alguna cosa en no infecciosa o la conversión de alguna cosa en incapaz de causar una enfermedad. Específicamente, se refiere a la conversión de una proteína en no infecciosa o en incapaz de causar una enfermedad o los síntomas de una enfermedad. Todavía más específicamente, se refiere a la conversión de una proteína conformacionalmente alterada (por ejemplo PrP^{Sc}, conocidas como priones) en incapaz de causar una enfermedad o los síntomas de una enfermedad.
Por "dosis eficaz" o "cantidad eficaz" se indica una cantidad de un compuesto suficiente para proporcionar el resultado esterilizante deseado, por ejemplo, para eliminar la infectividad de cualquier prión presente. Ésta variará dependiendo de factores tales como (1) el agente activo utilizado, (2) el pH de la composición antiséptica, (3) el tipo de objeto o material que esté siendo esterilizado y (4) la cantidad o concentración de las proteínas infecciosas que puedan estar presentes. La concentración es suficiente si la composición resultante es eficaz para disminuir (preferiblemente eliminar) la infectividad de las proteínas conformacionalmente alteradas, de tal manera que el material tratado no dé lugar a una infección con el tiempo. Debido a que (1) algunos materiales tendrán concentraciones de proteína alterada más elevadas que otros, (2) algunos materiales son puestos en contacto más frecuentemente que otros y (3) las proteínas individuales tienen diferentes grados de infectividad, el rango de dosis o concentraciones eficaz necesario para esterilizar puede variar considerablemente. Se destaca también que la dosis necesaria para tratar una cantidad de material puede variar algo sobre la base del pH al que se lleve a cabo el tratamiento y sobre la base de la cantidad de tiempo durante el cual se mantenga el compuesto en contacto con el material al nivel de pH bajo deseado (2,5 a 4,5) y sobre la base de la temperatura y presión circundantes.
El término "DL_{50}", según se utiliza en la presente, es la dosis de una sustancia activa que tendrá como resultado una letalidad del 50 por ciento en todos los animales experimentales tratados. Aunque ésta se refiere normalmente a una administración invasiva, tal como oral, parenteral o similar, puede ser aplicada también a toxicidad utilizando métodos de administración menos invasivos tales como las aplicaciones tópicas de la sustancia activa.
El término "terminado en amina" incluye aminas primarias, secundarias y terciarias.
Los términos "proteína PrP", "PrP" y similares son utilizados en la presente indistintamente e indicarán la forma de partícula infecciosa PrP^{Sc} que sabe que causa enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales así como la forma PrP^{C} no infecciosa que, bajo las condiciones apropiadas, es convertida en la forma infecciosa PrP^{Sc}.
El término "gen PrP" es utilizado en la presente para describir el material genético que expresa las proteínas, incluyendo polimorfismos conocidos y mutaciones patógenas. El término "gen PrP" se refiere de manera general a cualquier gen de cualquier especie que codifique cualquier forma de una proteína priónica. Algunas secuencias de PrP comúnmente conocidas están descritas en Gabriel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9097-9101 (1992) y en la Patente de EE.UU. Nº 5.565.186. El gen PrP puede proceder de cualquier animal, incluyendo los animales "huésped" y los animales "de ensayo" descritos en la presente, y cualquier y todos los polimorfismos y mutaciones del mismo, reconociéndose que los términos incluyen otros genes PrP que estén todavía por descubrir. La proteína expresada por tal gen puede asumir una forma PrP^{C} (no enfermedad) o bien en una forma PrP^{Sc} (enfermedad).
Los términos "preparación de priones estandarizada", "preparación de priones", "preparación" y similares son utilizados en la presente indistintamente para describir una composición (por ejemplo, homogenado de cerebro) obtenida del tejido cerebral de mamíferos que presentan signos de enfermedad por priones: el mamífero (1) puede incluir un transgén según describe en la presente; (2) puede tener un gen de una proteína priónica endógena eliminado; (3) puede tener un número elevado de genes de proteínas priónicas procedentes de una especie genéticamente diferente y/o (4) puede ser un híbrido con un gen de una proteína priónica endógena eliminado y un gen de una proteína priónica procedente de una especie genéticamente diferente. Son posibles diferentes combinaciones de 1-4, por ejemplo, 1 y 2. Los mamíferos de los que se obtienen las preparaciones de priones estandarizadas muestran signos clínicos de disfunción del SNC como resultado de la inoculación con priones y/o debido al desarrollo de la enfermedad de su composición genéticamente modificada, por ejemplo un número elevado de copias de los genes de las proteínas priónicas. Las preparaciones de priones estandarizadas y los métodos para producir las mismas están revelados y descritos en la Patente de EE.UU. 5.908.969 publicada el 1 de Junio de 1999 y en la Patente de EE.UU. 6.020.537 publicada el 1 de Febrero de 2000.
El término "enfermedad de Alzheimer" (abreviado en la presente como "AD"), según se utiliza en la presente, se refiere a una condición asociada con la formación de placas neuríticas que contienen la proteína amiloide \beta, primariamente en el hipocampo y en la corteza cerebral, así como con un deterioro del aprendizaje y la memoria. El término "AD", según se utiliza en la presente, tiene la intención de abarcar la AD así como patologías de tipo AD.
El término "patología de tipo AD", según se utiliza en la presente, se refiere a una combinación de alteraciones del SNC incluyendo, pero sin limitarse a, la formación de placas neuríticas que contienen la proteína amiloide \beta en el hipocampo y en la corteza cerebral. Tales patologías de tipo AD pueden incluir, pero no se limitan necesariamente a, enfermedades asociadas con la expresión y/o el depósito aberrante de APP, la sobreexpresión de APP, la expresión de productos del gen APP aberrantes y otros fenómenos asociados con la AD. Ejemplos de patologías de tipo AD incluyen, pero no se limitan necesariamente a, patologías de tipo AD asociadas con el Síndrome de Down que están relacionadas con la sobreexpresión de APP.
El término "fenómeno asociado con la enfermedad de Alzheimer", según se utiliza en la presente, se refiere a un acontecimiento estructural, molecular o funcional asociado con la AD, particularmente un acontecimiento tal que es fácilmente determinable en un modelo animal. Tales acontecimientos incluyen, pero no se limitan a, el depósito de amiloide, desarrollos neuropatológicos, déficits de aprendizaje y memoria y otras características asociadas con
la AD.
El término "angiopatía amiloide cerebral" (abreviado en la presente como CAA), según se utiliza en la presente, se refiere a una condición asociada con la formación de un depósito de amiloide en los vasos cerebrales que puede complicarse por una hemorragia parenquimal cerebral. La CAA está asociada también con un riesgo incrementado de derrame cerebral así como con el desarrollo de hemorragias cerebelares y subaracnoideas (Vinters (1987) Stroke 18, 311-324; Haan y col. (1994) Dementia 5, 210-213; Itoh y col. (1993) J. Neurol. Sci. 116, 135-414). La CAA puede estar también asociada con demencia previa a la aparición de las hemorragias. Los depósitos amiloides vasculares asociados con la CAA pueden existir en ausencia de AD, pero están más frecuentemente asociados con
la AD.
El término "fenómeno asociado con la angiopatía amiloide cerebral", según se utiliza en la presente, se refiere a un acontecimiento molecular, estructural o funcional asociado con la CAA, particularmente un evento tal que es fácilmente determinable en un modelo animal. Tales acontecimientos incluyen, pero no se limitan a, el depósito de amiloide, la hemorragia parenquimal cerebral y otras características asociadas con la CAA.
El término "depósito de \beta-amiloide", según se utiliza en la presente, se refiere a un depósito en el cerebro compuesto de A\beta así como de otras sustancias.
Las abreviaturas utilizadas en la presente incluyen:
SNC para sistema nervioso central;
BSE para encefalopatía espongiforme bovina;
CJD para Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob;
FFI para insomnio familiar fatal;
GSS para Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker;
AD para Enfermedad de Alzheimer;
CAA para angiopatía amiloide cerebral;
Hu para humano;
HuPrP para proteína priónica humana;
Mo para ratón;
MoPrP para proteína priónica de ratón;
SHa para hámster sirio;
SHaPrP para proteína priónica de hámster sirio;
PAMAM para dendrímeros de poliamidoamida;
PEI para polietilenimina;
PK para proteinasa K;
PPI para polipropilenimina;
PrP^{Sc} para la isoforma de la tembladera de la proteína priónica;
PrP^{C} para la isoforma normal común contenida en la célula de la proteína priónica;
PrP 27-30 o PrP^{Sc} 27-30 para la forma de PrP^{Sc} resistente al tratamiento con proteasas;
MoPrP^{Sc} para la isoforma de la tembladera de la proteína priónica de ratón;
N2a para una línea celular de neuroblastoma establecida utilizada en los presentes estudios;
ScN2a para una línea celular de neuroblastoma infectada crónicamente con la tembladera;
ALS para esclerosis lateral amiotrófica;
HD para Enfermedad de Huntington;
FTD para demencia frontotemporal;
SDS para dodecil sulfato de sodio;
SOD para superóxido dismutasa.
Aspectos generales de la invención
La invención utiliza un rango de composiciones antisépticas y métodos para convertir en no infecciosas proteínas conformacionalmente alteradas. La composición está formada por un componente ácido y un detergente, aunque un único compuesto podría tener la función de ambos componentes. La composición contiene un componente vehículo disolvente que es generalmente un componente alcohólico o acuoso. El componente ácido se caracteriza porque mantiene el pH de la composición en el rango de 2,5 a 4,5 cuando está en uso. El detergente se caracteriza porque convierte proteínas infecciosas en proteínas completamente no infecciosas. Preferiblemente, el componente activo en el entorno de pH bajo de la composición convierte a las proteínas infecciosas en no infecciosas en dos horas o menos a una temperatura de 40º centígrados o inferior.
Componentes ácidos adecuados incluyen un ácido débil no tóxico tal como ácido acético que lleva disuelto en el mismo el detergente. Las composiciones antisépticas son revestidas sobre, mezcladas con, inyectadas en, o puestas en contacto de otro modo con un material a esterilizar. La composición es mantenida en el rango de pH deseado a temperatura normal (por ejemplo, de 15ºC a 30ºC) durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, menos de 2 horas) para hacer que la proteína conformacionalmente alterada presente sobre o en el material sea destruida (por ejemplo, hidrolizada) o convertida en no infecciosa. Las composiciones preferidas de la invención son útiles para limpieza y esterilización y pueden contener un agente activo tal como SDS y un componente ácido que proporcione un pH menor de 3,5.
Compuestos dendrímeros que eliminan priones
Los dendrímeros son compuestos ramificados conocidos también como polímeros de "explosión estelar" o "estrella" debido a su estructura característica similar a una estrella (ver la Figura 1). Los dendrímeros que pueden ser añadidos a las composiciones de la invención son polímeros con estructuras construidas a partir de monómeros AB_{n}, con n\geq2 y preferiblemente n=2 ó 3. Tales dendrímeros están muy ramificados y tienen tres características estructurales distintas: 1) un núcleo central, 2) múltiples grupos terminales periféricos y 3) unidades de ramificación que unen los dos. Los dendrímeros pueden ser catiónicos (dendrímeros de generación completa) o aniónicos (dendrímeros de media generación). Para una revisión de la síntesis general, de las propiedades físicas y de las aplicaciones de los dendrímeros, ver, por ejemplo, Tomalia y col., Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138-175 (1990); Y. Kim y C. Zimmerman, Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 733-7421 (1997).
Las composiciones esterilizantes pueden contener un dendrímero catiónico disuelto preferiblemente en un solvente de pH bajo tal como ácido acético. Ejemplos de dendrímeros adecuados están descritos en las Patente de EE.UU N^{os} 4.507.466, 4.558.120, 4.568.737, 4.587.329, 4.631.337, 4.694.064, 4.713.975, 4.737.550, 4.871.779 y 4.857.599 de D.A. Tomalia y col. Los dendrímeros tienen típicamente aminas terciarias que tienen un pKa de 5,7. Los dendrímeros pueden ser tratados opcionalmente químicamente o con calor para eliminar algunas de las aminas terciarias. Otros cationes adecuados incluyen polipropilenimina, polietilenimina (PEI), que tiene aminas terciarias con un pKa de 5,9 y poli(4'-aza-4'-metilheptametilén D-glucaramida), que tiene aminas terciarias con un pKa de 6,0. El dendrímero catiónico es disuelto preferiblemente en el solvente de pH bajo, tal como vinagre, a una concentración de 0,0001% o mayor, preferiblemente 0,01% o mayor y más preferiblemente a una concentración del 1% aproximadamente.
Preferiblemente, los dendrímeros son poliamidoaminas (de aquí en adelante "PAMAM"). Los dendrímeros PAMAM son particularmente biocompatibles, ya que los grupos poliamidoamina se asemejan a los enlaces peptídicos de las proteínas.
Los dendrímeros son preparados en niveles denominados generaciones (ver las generaciones 0, 1 y 2 en la Figura 1) y por tanto tienen pesos moleculares específicos. Los dendrímeros PAMAM de generación completa tienen grupos amina terminales y son catiónicos, mientras que los dendrímeros de media generación terminan en carboxilo. Se prefieren por tanto los dendrímeros PAMAM de generación completa para ser utilizados en la presente invención. Pueden prepararse dendrímeros PAMAM que tengan pesos moleculares diferentes y que tengan valores específicos según se describe en la Tabla A siguiente para las generaciones 0 a 10.
TABLA A
Lista de dendrímeros PAMAM y sus pesos moleculares (Núcleo central de etiléndiamina, terminados en amina)
1
Según se muestra en la Tabla A, el número de grupos amina terminales para las generaciones 0 a 10 de los dendrímeros PAMAM varía de 4 a 4.096, con pesos moleculares desde 517 hasta 934.720. Los dendrímeros PAMAM están disponibles comercialmente en Aldrich o Dendritech. Pueden prepararse dendrímeros de polietilenimina o polipropileno o formas cuaternizadas de dendrímeros terminados en amina según está descrito por Tomalia y col., Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 29, 138-175 (1990).
Composiciones esterilizantes
Los ejemplos proporcionados en la presente muestran que varios compuestos activos, tales como SDS, a un pH de 4,0 o menor influyen sobre el grado y la distribución de los depósitos de proteína PrP^{Sc} en células infectadas con tembladera. La presencia de estos compuestos activos en un entorno de pH bajo y a niveles no citotóxicos relativamente bajos, tiene como resultado una reducción significativa de las PrP^{Sc} detectables en células y en homogenados de cerebro. Por tanto, la presente invención incluye la utilización de composiciones para inactivar completamente la infectividad de una proteína. Una composición utilizada en la invención está compuesta por cualquier detergente capaz de destruir proteínas conformacionalmente alteradas cuando está en un entorno de pH bajo (por ejemplo, SDS) en solución, suspensión o mezcla.
Formulaciones esterilizantes
Las composiciones esterilizantes contienen preferiblemente el detergente en una concentración del 0,0001% al 10% de la formulación. Los métodos y excipientes siguientes son meramente un ejemplo y no son de ninguna manera limitantes.
Además de incluir el compuesto detergente en la formulación, es importante mantener ese compuesto en un entorno de pH bajo. Puede utilizarse con la invención cualquier número de ácidos o mezclas de ácidos conocidos. Ejemplos no limitantes de productos comercialmente disponibles con los que podrían suplementarse las composiciones están descritos a continuación. En estas formulaciones puede variar la cantidad en porcentaje de cada ingrediente. En general, un ingrediente disolvente (por ejemplo agua o alcohol) está presente en cantidades del 40% al 100%. Los demás ingredientes están presentes en una cantidad dentro del rango del 1% al 60%, y más generalmente del 5% al 20%. La cantidad añadida es una cantidad necesaria para obtener el efecto deseado.
Formulación 1
Componente % en peso
Agua 10 - 99
Ácido 1 - 20
Detergente 0,01 - 10 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 2
Componente % en peso
Agua 10 - 98
Ácido 1 - 20
Detergente 1 - 20
Dendrímero policatiónico 0,01 - 5 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 3
Componente % en peso
Agua 10 - 98
Ácido acético 1 - 20
Alquil sulfonato lineal 1 - 20
Dendrímero policatiónico 0,01 - 5 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 4
Componente % en peso
Agua 10 - 99
Ácido acético 1 - 20
SDS 0,01 - 10 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 5
Componente % en peso
Agua 1 - 98
Alcohol 0 - 98
Ácido 1 - 20
Detergente 1 - 20
Dendrímero policatiónico 0,1 - 5 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 6
Componente % en peso
Agua 1 - 99
Ácido 1 - 20
Antibacteriano 0,1 - 5
Detergente 1 - 20
Dendrímero policatiónico 0,1 - 5 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 7
Componente % en peso
Agua 3 - 98,889
Agente antimicrobiano activo 0,001- 5
Surfactante aniónico 1 - 80
Agente donador de protones (H^{+}) 0,1 - 12
Dendrímero policatiónico 0,01 - 5 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 8
Componente % en peso
Agua 1 - 98
Alcohol 0 - 98
Ácido 1 - 20
SDS 1 - 20 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 9
Componente % en peso
Agua 1 - 99
Ácido 1 - 20
Agente antibacteriano 0,1 - 5
Detergente 1 - 20 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 10
Componente % en peso
Agua 3 - 98,889
Agente antimicrobiano activo 0,001- 5
Surfactante aniónico 1 - 80
Agente donador de protones (H^{+}) 0,1 - 12
SDS 0,01 - 5 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 11
Componente % en peso
SDS 0,5
Etanol 74,0
Cloruro de benzalconio 0,2
CAE 0,02
Glicerina 1,0
Silicona en cadena 0,5
Triglicérido 0,5
Ácido láctico 10,0
Agua purificada 13,28 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 12
Componente % en peso
Desoxicolato de sodio 0,01
Etanol 75,0
Cloruro de benzalconio 0,2
(Continuación)
Componente % en peso
CAE 0,02
Glicerina 2,0
Silicona en cadena 0,99
Silicona cíclica 2,0
Triglicérido 3,0
Ácido láctico 9
Agua purificada 7,78 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 13
Componente % en peso
SDS 1
Etanol 75,0
Gluconato de clorhexedina 0,2
Cloruro de benzalconio 0,2
CAE 0,02
Glicerina 0,8
Silicona en cadena 0,2
Silicona cíclica 0,2
Triglicérido 0,38
Ácido acético 10
Agua purificada 12 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 14
Componente % en peso
SDS 0,001
Etanol 75,99
Gluconato de clorhexedina 0,2
CAE 0,02
Glicerina 1,0
Silicona en cadena 0,2 
\vskip1.000000\baselineskip
(Continuación)
Componente % en peso
Triglicérido 0,3
Ácido láctico 14
Agua purificada 8,28 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 15
Componente % en peso
Acetato de sodio a pH 4,0 \pm 10%
SDS 4%
Agua 86% 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 16
Componente % en peso
SDS 4%
Ácido peracético 0,1 - 10%
Agua 86 - 95,9% 
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación 17
Componente % en peso
SDS 1 - 20%
Ácido a pH 4,0 \pm 1 1 - 20%
Agua 60 - 98%
Mediante la utilización de la descripción proporcionada en la presente y de otra información tal como la descrita en las Patentes de EE.UU. 5.767.054; 6.007.831; 5.830.488; 5.968.539; 5.416.075; 5.296.158, y las patentes y publicaciones citadas en las mismas, los expertos en la técnica podrán producir innumerables formulaciones de la invención. Además, las formulaciones son ajustadas preferiblemente para que tengan un pH menor de 4,0, y tales formulaciones pueden ser utilizadas según se describe en tales publicaciones y pueden ser envasadas en cualquier recipiente o dispositivo dispensador adecuado, por ejemplo el descrito en 5.992.698. El pH puede ser disminuido con cualquier ácido, por ejemplo puede utilizarse HCl, H_{2}SO_{4}, H_{2}NO_{3}, ácido peracético, etc., como el componente ácido de las fórmulas proporcionadas anteriormente.
El Ejemplo 3 muestra que compuestos tales como el SDS son eficaces para desnaturalizar PrP^{Sc} no sólo a un pH bajo (por ejemplo 5 o inferior) sino que son eficaces a un pH elevado (por ejemplo 9 o mayor), pero no son generalmente eficaces a un pH de 7,0 \pm 1 aproximadamente. El pH de la formulación puede ser ajustado para obtener los resultados deseados en cada uso particular. Por ejemplo, un pH muy elevado o muy bajo puede ser mejor para inactivar PrP^{Sc}, pero pHs extremos pueden ser indeseables en algunas situaciones debido a sus efectos corrosivos. Por tanto, un pH preferido es uno que inactive PrP^{Sc} y que tenga los menos efectos adversos posibles para el uso
deseado.
Las formulaciones utilizadas con un cultivo celular tienen la ventaja de que no son tóxicas. Por ejemplo, la administración parenteral de una solución de las formulaciones de la invención es preferiblemente no tóxica a una dosis de 0,1 mg/ratón, que es una DL_{50} de menos de uno a 40 mg/kg. Diferentes formulaciones de nutrientes y/o diferentes formulaciones inyectables del tipo conocido por los expertos en la técnica pueden ser utilizadas con el fin de preparar formulaciones para el tratamiento de cultivos celulares.
Las personas expertas en la técnica comprenderán que en algunas situaciones puede ser deseable reducir adicionalmente el entorno de pH para obtener los resultados deseados. Esto puede ser realizado añadiendo cualquier ácido deseado. Si se desea, el pH puede ser elevado hasta un nivel normal una vez que el tratamiento se haya completado, esto es una vez que se haya destruido una cantidad suficiente de cualquier proteína conformacionalmente alterada presente.
Los compuestos eficaces para esterilizar composiciones que contengan proteínas conformacionalmente alteradas son determinados mediante un ensayo en cultivo celular y un ensayo en un homogenado de órgano, cada uno de los cuales se describe a continuación con detalle.
Ensayo basado en células ScN2a
Con la lectura de esta revelación y en particular de la descripción proporcionada en la presente de ensayos particulares, a las personas expertas en la técnica se les ocurrirán otros ensayos. El concepto básico es (1) proporcionar un componente ácido en un vehículo acuoso y/o alcohólico, (2) añadir el componente (que no se sabe que es activo) y (3) poner en contacto la composición de ensayo con una muestra que se sabe que contiene una proteína infecciosa. Después de dejar pasar el tiempo (por ejemplo, de 5 minutos a 2 horas) se utilizan los procedimientos descritos en la presente para (4) determinar si el componente es "activo", esto es convierte a la proteína en no infecciosa. Pueden añadirse a la composición múltiples compuestos y analizarse simultáneamente. Si no se encuentra ningún efecto, ninguno de los componentes será activo. Si se encuentra un efecto esterilizante, el grupo de compuestos analizados puede ser dividido en dos y volverse a analizar hasta que se identifique específicamente un compuesto activo. La división de cualquier manera del grupo analizado originalmente y el nuevo análisis pueden llevarse a cabo cualquier número de veces.
El componente activo puede ser examinado frente a una cepa de priones de una vez o frente a múltiples cepas simultáneamente. Algunos componentes activos tales como el SDS inactivarán todas las cepas conocidas de priones, mientras que algunos dendrímeros policatiónicos inactivarán solamente cepas específicas. Cuando el componente activo inactiva todas las cepas, es útil como antiséptico y/o agente terapéutico. Cuando inactiva solamente una cepa específica, puede ser utilizado para determinar la cepa del prión infeccioso en una muestra.
Se han hecho esfuerzos para optimizar la transfección de células ScN2a con los plásmidos de expresión pSPOX (Scott, M.R., Köhler, R., Foster, D. y Prusiner, S.B. Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice. Protein Sci. 1, 986-997 (1992)). En conexión con esos efectos se realizó una evaluación de un protocolo de transfección que utilizaba el reactivo SuperFect (QUIAGEN®). Se encontró que no podía detectarse PrP^{Sc} marcada con un epítopo (MHM2) (Scott, M.R., Köhler, R., Foster, D. y Prusiner, S.B. Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice. Protein Sci. 1, 986-997 (1992)) en células ScN2a después de la transfección mediada por SuperFect, mientras que se formaba MHM2 PrP^{Sc} eficazmente cuando se utilizaba un método de liposomas catiónicos para la administración del ADN. Un examen detallado reveló que, antes de la digestión con proteasa, las muestras transfectadas con SuperFect expresaban bandas de MHM2, que no se observaban en el patrón de fondo de una muestra no transfectada. El anticuerpo monoclonal 3F4 no reacciona con MoPrP, pero presenta una elevada tinción de fondo en transferencias Western de células ScN2a de ratón. Se observó una inmunotinción incrementada en la región de 20-30 kDa, en comparación con la muestra no transfectada. Estas observaciones nos llevaron a concluir que MHM2 PrP se expresaba con éxito utilizando el reactivo de transfección SuperFect, pero que la conversión de MHM2 PrP^{C} en MHM2 PrP^{Sc} resistente a proteasa era inhibida por SuperFect.
Para investigar esta inhibición aparente, una transferencia Western se volvió a sondar con antisuero policlonal RO73 con el fin de detectar MoPrP^{Sc} endógena, la presencia de la cual es un diagnóstico de la infección por priones en células ScN2a (Butler, D.A. y col. Scrapie-infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistant prion proteins. J. Virol. 62, 1558-1564 (1988)). Sorprendentemente, se encontró que las células ScN2a tratadas con SuperFect no contenían ya cantidades detectables de MoPrP^{Sc} - confirmado también en transferencias Western. Con el fin de investigar el mecanismo por el cual SuperFect reducía el nivel de PrP^{Sc} preexistentes en células ScN2a infectadas crónicamente, se realizaron medidas de PrP^{Sc} endógena en células ScN2a expuestas a varias concentraciones de SuperFect en ausencia de ADN plasmídico. Los resultados mostraban que el tratamiento con SuperFect (un policatión ramificado) causaba la desaparición de PrP^{Sc} de las células ScN2a de manera dependiente de la dosis. Se encontró que la concentración de SuperFect requerida para eliminar >95% de las PrP^{Sc} preexistentes con una exposición de tres horas era de 150 \mug/ml aproximadamente. La duración del tratamiento influía también sobre la capacidad de SuperFect para eliminar PrP^{Sc} de las células ScN2a: la exposición a 150 \mug/ml de SuperFect durante 10 minutos no afectó a los niveles de PrP^{Sc}, mientras que 7,5 \mug/ml de SuperFect eliminaron todas las PrP^{Sc} detectables con un t½ = 8 horas.
SuperFect es una mezcla de poliaminas ramificadas derivadas de la degradación inducida por calor de un dendrímero PAMAM (Tang, M.X., Redemann, C.T. y Szoka, F.C.J. In vitro gene delivery by degraded polyamidoamine dendrimers. Bioconjug. Chem. 7, 703-714 (1996)). Se sabe que esta estructura tiene la capacidad de otros diferentes polímeros ramificados y no ramificados para eliminar PrP^{Sc} de células ScN2a (Tabla 1). Los polímeros ramificados investigados incluyen varias preparaciones de PEI, así como los dendrímeros PAMAM y PPI intactos. Los dendrímeros son producidos mediante una técnica repetitiva de crecimiento divergente, permitiendo la síntesis de "generaciones" sucesivas, bien definidas, de estructuras homodispersas (Figura 1). La potencia de los dendrímeros PAMAM y PPI para eliminar PrP^{Sc} de células ScN2a aumentaba al incrementarse el nivel de generación. Los compuestos más potentes con respecto a la eliminación de PrP^{Sc} fueron PAMAM generación 4,0 y PPI generación 4,0, mientras que PAMAM generación 1,0 mostraba una capacidad muy pequeña para eliminar PrP^{Sc} (Tabla 1). De manera similar, una fracción de PEI de alto peso molecular era más potente que PEI de bajo peso molecular.
De los datos precedentes, está claro que para las tres poliaminas ramificadas analizadas, el incremento del peso molecular correspondía con un incremento de la potencia para eliminar PrP^{Sc}. Con el fin de determinar si esta tendencia era atribuible directamente a la densidad superficial incrementada de grupos amino en las moléculas más grandes, se analizó PAMAM-OH generación 4,0. Éste es un dendrímero que se asemeja a PAMAM generación 4,0, excepto en que grupos hidroxilo sustituyen a grupos amino en su superficie. A diferencia de PAMAM generación 4,0, PAMAM-OH generación 4,0 no produjo reducción de los niveles de PrP^{Sc} incluso a la concentración más elevada analizada (10 mg/ml), estableciendo que se requieren los grupos amino para la eliminación de PrP^{Sc} por PAMAM (Tabla 1).
En un esfuerzo para determinar la contribución de la estructura ramificada a la capacidad de las poliaminas para eliminar PrP^{Sc}, se analizaron también las moléculas lineales poli-(L)lisina y PEI lineal. Estos compuestos lineales eran ambos menos potentes que una preparación de PEI ramificado con un peso molecular medio similar (Tabla 1), estableciendo que una arquitectura molecular ramificada optimizada la capacidad de las poliaminas para eliminar PrP^{Sc}, debido presumiblemente a que las estructuras ramificadas alcanzan una mayor densidad de grupos amino en la superficie.
Cinética de eliminación de PrP^{Sc} por poliaminas
Los resultados precedentes demuestran la potente capacidad de las poliaminas ramificadas para eliminar PrP^{Sc} de células ScN2a en unas pocas horas de tratamiento. La utilidad de estos compuestos para actuar como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades causadas por priones fue analizada determinando si eran citotóxicos para células ScN2a, utilizando como criterios el crecimiento celular, la morfología celular y la viabilidad celular medida mediante tinción con Azul Trypan. Ninguno de los compuestos era citotóxico para las células ScN2a después de exposición durante una semana a concentraciones de hasta 7,5 \mug/ml. Para determinar si las poliaminas ramificadas pueden curar a células ScN2a de la infección por tembladera sin afectar la viabilidad celular, se examinó la cinética de eliminación de los priones en presencia de una concentración no citotóxica (7,5 \mug/ml) de tres poliaminas ramificadas diferentes. Células ScN2a fueron expuestas a SuperFect, PEI o PAMAM generación 4,0 durante periodos de tiempo variables. La cinética de eliminación de PrP^{Sc} fue determinada mediante transferencia Western. Los tres compuestos producían una reducción sustancial de los niveles de PrP^{Sc} después de 8-16 horas de tratamiento y, de los tres compuestos, PEI parecía eliminar PrP^{Sc} más rápidamente, con un t½= 4 horas.
Curación de células de neuroblastoma de la infección por tembladera
Los resultados anteriores muestran que es posible revertir la acumulación de PrP^{Sc} en células ScN2a bajo condiciones no citotóxicas. Se encontró también que una exposición ampliada a niveles incluso más bajos de las poliaminas ramificadas (1,5 \mug/ml) era suficiente para eliminar PrP^{Sc}. Sobre la base de estos hallazgos, se utilizó este protocolo para determinar si la fuerte reducción de los niveles de PrP^{Sc} después de la exposición a las poliaminas ramificadas persistiría después de la retirada de los compuestos. Después de la exposición de células ScN2a a 1,5 \mug/ml de SuperFect durante 1 semana, PrP^{Sc} se redujo hasta <1% del nivel basal, pero posteriormente volvió a incrementarse hasta \sim5% del nivel basal después de 3 semanas adicionales en cultivo en ausencia de la poliamina. En contraste, después de la exposición a 1,5 \mug/ml de PEI o de PAMAM generación 4,0 durante 1 semana, se eliminó PrP^{Sc} completamente y no volvió a aparecer incluso después de 3 semanas en cultivo sin las poliaminas. Un curso de tratamiento más intenso con 1,8 \mug/ml de SuperFect durante 9 días curó también totalmente a las células ScN2a de la infección por tembladera, lo cual se manifestó por la ausencia de PrP^{Sc} 1 mes después de la retirada de SuperFect.
Evidencia de que las poliaminas actúan en un compartimento ácido
Los resultados anteriores mostraban la potente actividad de las poliaminas ramificadas para eliminar rápidamente los priones de la tembladera de células ScN2a cultivadas. Sobre la base de estos resultados se investigó el mecanismo mediante el cual actuaban estos compuestos. Se sabe que todos los compuestos que causan la eliminación de PrP^{Sc} de células ScN2a se mueven a través de endosomas (Boussif, O., y col. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethyleneimine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-7301 (1995); Haensler, J. y Szoka, F.C.J. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture. Bioconjug. Chem. 4, 372-379 (1993)). Como PrP^{C} es convertida en PrP^{Sc} en dominios similares a caveolas (CLDs) o balsas (Gorodinsky, A. y Harris, D.A. Glycolipid-anchored proteins in neuroblastoma cells form detergent-resistant complexes without caveolin. J. Cell Biol. 129, 619-627 (1995); Taraboulos, A. y col. Cholesterol depletion and modification of COOH-terminal targeting sequence of the prion protein inhibits formation of the scrapie isoform. J. Cell Biol. 129, 121-132 (1995); Vey, M. y col. Subcellular colocalization of the cellular and scrapie prion proteins in caveolae-like membranous domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14945-14949 (1996); Kaneko, K. y col. COOH-terminal sequence of the cellular prion protein directs subcellular trafficking and controls conversion into the scrapie isoform. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2333-2338 (1997)) y es posteriormente internalizada a través de la ruta endocítica (Caughey, B., Raymond, G.J., Ernst, D. y Race, R.E. N-terminal truncation of the scrapie-associated form of PrP by lisosomal protease(s): implications regarding the site of conversion of PrP to the protease-resistant state. J. Virol. 65, 6597-6603 (1991); Borchelt, D.R., Taraboulos, A. y Prusiner, S.B. Evidence for synthesis of scrapie prion proteins in the endocytic pathway. J. Biol. Chem. 267, 16188-16199 (1992)), se dedujo que las poliaminas actúan sobre las PrP^{Sc} en endosomas o lisosomas. Esta deducción fue investigada determinando el efecto del pretratamiento con los agentes lisosomotrópicos cloroquina y NH_{4}Cl sobre la capacidad de las poliaminas para eliminar PrP^{Sc}. Estos agentes lisosomotrópicos alcalinizan los endosomas y no tienen efecto sobre los niveles de PrP^{Sc} cuando se administran a células ScN2a (Taraboulos, A., Raeber, A.J., Borchelt, D.R., Serban, D. y Prusiner, S.B. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells. Mol. Biol. Cell. 3, 851-863 (1992)). Los resultados experimentales obtenidos muestran que cloroquina 100 \muM, pero no NH_{4}Cl 30 \muM, bloqueaba la capacidad de PEI para eliminar PrP^{Sc}. Se obtuvieron resultados similares con SuperFect y PAMAM, generación 4,0. Aunque el fracaso de NH_{4}Cl para influir sobre los niveles de PrP^{Sc} no es fácilmente explicable, la capacidad de la cloroquina para atenuar la capacidad de las poliaminas ramificadas para eliminar PrP^{Sc} es consistente con la idea de que estos agentes actúan en endosomas o
lisosomas.
Ensayo en un homogenado de órgano
Los resultados anteriores con cultivos celulares indujeron a investigar la posibilidad de que en un entorno ácido las poliaminas ramificadas, por interacción indirecta con PrP^{Sc} o con otro componente celular, pudieran hacer que PrP^{Sc} se convirtiera en susceptible a las hidrolasas presentes en el endosoma/lisosoma. Se desarrolló un ensayo de degradación in vitro para evaluar el efecto del pH sobre la capacidad de las poliaminas para convertir a las PrP^{Sc} en sensibles a la proteasa. Homogenados brutos de cerebro de ratón infectado con tembladera fueron expuestos a un amplio rango de valores de pH en presencia o ausencia de SuperFect y tratados posteriormente con proteinasa K antes de la transferencia Western. Aunque PrP^{Sc} permanecía resistente a la hidrólisis con proteasa a lo largo de todo el rango de pH (3,6-9,6) en ausencia de SuperFect, la adición de la poliamina ramificada a pH 4,0 o inferior hacía que PrP^{Sc} fuera degradada casi completamente por la proteasa.
La adición de la poliamina mostraba un efecto drástico sobre la eliminación in vitro que era optimizado a pH 4 o inferior. Estos resultados muestran que las poliaminas actúan sobre PrP^{Sc} en un compartimento ácido. Con el fin de establecer que el ensayo de degradación in vitro es una aproximación válida al mecanismo por el cual las poliaminas ramificadas incrementan la eliminación de PrP^{Sc} de células cultivadas, se llevó a cabo un análisis de estructura-actividad con varios de los compuestos analizados en células en cultivo. Se encontró una correlación excelente entre la eliminación de PrP^{Sc} de células ScN2a cultivadas (Tabla 1) y la capacidad para convertir las PrP^{Sc} en susceptibles a proteasa a un pH ácido in vitro. Particularmente, PAMAM-OH generación 4,0 no fue capaz de convertir PrP^{Sc} en susceptible a proteasa, mientras que PAMAM generación 4,0 y PPI generación 4,0, presentaban una actividad incluso más potente que SuperFect in vitro, según se esperaba de su potencia observada en las células ScN2a cultivadas
(Tabla 1).
Mecanismo de acción
Cuando se mantenía un pH de 4,0 o inferior los resultados mostraban que ciertas poliaminas ramificadas causaban la eliminación rápida de PrP^{Sc} de células ScN2a de manera dependiente de la dosis y del tiempo. Estos compuestos demuestran una potente capacidad para eliminar priones de células cultivadas a concentraciones que son completamente no citotóxicas. Las células pueden ser mantenidas indefinidamente en cultivo en presencia de niveles terapéuticos de poliaminas ramificadas. Además, cuando las células ScN2a fueron expuestas a estos compuestos durante \sim1 semana, las PrP^{Sc} se redujeron hasta niveles indetectables y permanecieron así durante al menos un mes después de la retirada de la poliamina.
La clarificación del mecanismo exacto de la eliminación de PrP^{Sc} por las poliaminas ramificadas es un objetivo importante. Aunque existen varios escenarios posibles, pueden excluirse ya varias posibilidades. Una posibilidad que fue eliminada era que las poliaminas actúan por inducción de acompañantes tales como proteínas de choque térmico que median el replegamiento de la proteína priónica, ya que los resultados anteriores muestran que era posible reproducir el fenómeno in vitro. Además, las poliaminas parecen ofrecer ventajas sobre otros supuestos agentes terapéuticos que buscarían estimular el replegamiento: a concentraciones muy elevadas, el dimetil sulfóxido (DMSO) y el glicerol actúan como "acompañantes químicos" directos e inhiben la formación de nuevas PrP^{Sc} (Tatzelt, J., Prusiner, S.B. y Welch, W.J. Chemical chaperones inferfere with the formation of scrapie prion protein. EMBO J. 15, 6363-6373 (1996)); pero estos compuestos no pueden reducir los niveles preexistentes de PrP^{Sc}. Además, las poliaminas inhiben la formación de PrP^{Sc} a concentraciones mucho más bajas que estos agentes. La capacidad de las poliaminas para llevar a cabo la desaparición rápida de PrP^{Sc} contrasta también con la actividad de otros agentes terapéuticos potenciales contra los priones. Los polianiones sulfatados pueden inhibir la acumulación de PrP^{Sc} en células ScN2a uniéndose directamente a PrP^{C} (Gabizon, R., Meiner, Z., Halimi, M. y Ben-Sasson, S.A. Heparin-like molecules bind differentially to prion-proteins and change their intracellular metabolic fate. J. Cell. Physiol. 157, (1993); Caughey, B., Brown, K., Raymond, G.J., Katzenstein, G.E. y Thresher, W. Binding of the protease-sensitive form of PrP (prion protein) to sulfated glycosaminoglycan and Congo red. J. Virol. 68, 2135-2141 (1994)), pero como las poliaminas ramificadas son capaces de eliminar las PrP^{Sc} preexistentes, su mecanismo de acción no puede implicar sencillamente la unión a PrP^{C} y la inhibición de la síntesis de novo.
Otro posible mecanismo que puede ser excluido es la ruptura endosómica. Las poliaminas ramificadas que fueron eficaces para eliminar PrP^{Sc} de células ScN2a en nuestros experimentos, PEI, SuperFect y PAMAM, son también potentes agentes osmóticos lisosomotrópicos, que pueden hincharse en entornos ácidos y romper los endosomas (Boussif, O. y col. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethyleneimine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-7301 (1995); Haensler, J. y Szoka, F.C.J. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture. Bioconjug. Chem. 4, 372-379 (1993)). Esto podría sugerir que las poliaminas ramificadas eliminan PrP^{Sc} de las células ScN2a rompiendo los endosomas y exponiendo las PrP^{Sc} a los procesos de degradación citosólicos. Sin embargo, se sabe que los agentes lisosomotrópicos que rompen endosomas, NH_{4}Cl, cloroquina y monesina, no interfieren con la formación de PrP^{Sc} en células ScN2a (Taraboulos, A., Raeber, A.J., Borchelt, D.R., Serban, D. y Prusiner, S.B. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells. Mol. Biol. Cell. 3, 851-863 (1992)). Además, los resultados muestran también que la cloroquina interfiere con la capacidad de las poliaminas ramificadas para eliminar PrP^{Sc} y que las poliaminas pueden eliminar PrP^{Sc} in vitro a un pH ácido en ausencia de membranas celulares. En conjunto, estas observaciones descartan la ruptura de endosomas como el mecanismo mediante el cual las poliaminas ramificadas eliminan PrP^{Sc}.
Sin comprometernos a ningún mecanismo de acción particular, parece probable que las poliaminas ramificadas requieren el entorno ácido de endosomas o lisosomas intactos para destruir PrP^{Sc}. El perfil de estructura-actividad de los polímeros analizados revela que los compuestos más activos poseen grupos amino separados regularmente, empaquetados densamente, sugiriendo que estos compuestos pueden unirse a un ligando que tenga cargas negativas separadas periódicamente. Permanecen posibles varios escenarios. (1) Las poliaminas ramificadas pueden unirse directamente a las PrP^{Sc} dispuestas como un amiloide con restos cargados negativamente expuestos e inducir un cambio conformacional bajo condiciones ácidas. (2) El tratamiento de PrP 27-30 con ácido disminuye la turbidez e incrementa el contenido de hélices \alpha, sugiriendo que tales condiciones podrían disociar las PrP^{Sc} en monómeros (Safar, J., Roller, P.P., Gajdusek, D.C. y Gibbs, C.J., Jr. Scrapie amyloid (prion) protein has the conformational characteristics of an aggregated molten globule folding intermediate). Es por tanto posible que las poliaminas se unan a un producto intermedio de PrP^{Sc} que se despliegue en equilibrio presente bajo condiciones ácidas. (3) Alternativamente, las poliaminas podrían secuestrar un componente críptico, cargado negativamente, unido a PrP^{Sc} que sea esencial para la resistencia a proteasas, pero que es liberado solamente cuando PrP^{Sc} experimenta un cambio conformacional inducido por el ácido. Tal componente podría actuar como acompañante de PrP^{Sc} dentro de los endosomas o lisosomas. (4) Finalmente, otra posibilidad sería que las poliaminas activaran un factor endosómico o lisosómico que pudiera inducir un cambio conformacional en PrP^{Sc}. Claramente, se requiere más trabajo para determinar el mecanismo preciso mediante el cual las poliaminas ramificadas destruyen PrP^{Sc}.
Aplicabilidad general del ensayo
El ensayo in vitro descrito en la presente es generalmente aplicable para la búsqueda de compuestos que eliminen eficazmente proteínas conformacionalmente alteradas presentes en alimentos, impidiendo de este modo varias enfermedades degenerativas, cuando la acumulación de proteínas parece mediar la patogénesis de estas enfermedades. Mediante la estimulación de los lisosomas, en los cuales las proteasas hidrolizan las proteínas bajo condiciones ácidas, el ensayo en homogenado de cerebro in vitro es capaz de evaluar rápidamente la eficacia de una variedad de poliaminas para inducir la degradación de PrP^{Sc}.
El ensayo in vitro que utilizaba homogenado de cerebro infectado con tembladera para analizar compuestos que eliminan PrP^{Sc}, podría ser modificado para ensayar compuestos que eliminen cualquier proteína alterada conformacionalmente. El ensayo es llevado a cabo homogeneizando el órgano o tejido en el que está presente la proteína conformacionalmente alterada en la concentración más elevada. El pH del homogenado es reducido posteriormente hasta menos de 5,0 y preferiblemente hasta 4,0 o menos. Por ejemplo, puede homogeneizarse tejido pancreático con el fin de producir un ensayo para analizar compuestos que eliminen la amilina que está asociada con la Diabetes de tipo II. Podría utilizarse riñón homogeneizado para analizar compuestos que eliminen \beta_{2}-microglobulina y corazón o tejido vascular homogeneizado para analizar compuestos que eliminen el factor natriurético auricular. Los expertos en la técnica reconocerán otros órganos y tipos de tejido que pueden ser homogeneizados para analizar otros compuestos que eliminen otras proteínas conformacionalmente alteradas.
Además de utilizar en ensayo in vitro para seleccionar fármacos potenciales, los compuestos encontrados mediante el ensayo, tales como poliaminas ramificadas, proporcionan una nueva herramienta para explorar la conversión de una proteína en una proteína conformacionalmente alterada, por ejemplo PrP^{C} en PrP^{Sc}. Queda por establecer el mecanismo mediante el cual las poliaminas ramificadas hacen que las PrP^{Sc} sean susceptibles a la proteolisis. No se sabe si la interacción de las poliaminas ramificadas con PrP^{Sc} es reversible. Además, no sabemos si las poliaminas ramificadas son capaces de solubilizar PrP^{Sc} sin desnaturalizar la proteína de manera irreversible. Cualquiera que sea el mecanismo mediante el cual las poliaminas ramificadas interaccionan con PrP^{Sc}, es probable que sea diferente del encontrado con los caotropos así como con los detergentes y disolventes desnaturalizantes (Prusiner, S.B., Groth, D., Serban, A., Stahl, N. y Gabizon, R. Attempts to restore scrapie prion infectivity after exposure to protein denaturants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2793-2797 (1993)).
Utilizando los ensayos descritos y revelados en la presente, se han encontrado ciertas poliaminas ramificadas específicas que median la desaparición de PrP^{Sc} de células cultivadas bajo condiciones no tóxicas. Estos compuestos ofrecen la intrigante posibilidad de ser añadidos a un amplio rango de productos alimenticios de pH bajo para neutralizar las proteínas conformacionalmente alteradas presentes. Como los compuestos encontrados actúan estimulando las rutas celulares normales de degradación de proteínas para destruir PrP^{Sc}, es probable también que esta clase de compuestos tengan valor en el tratamiento de otras enfermedades degenerativas y hereditarias en las que se acumulan proteínas de tipo salvaje o mutantes plegadas de manera anormal. Tal planteamiento podría tener valor para desarrollar agentes terapéuticos eficaces para una o más de las enfermedades degenerativas comunes, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la demencia frontotemporal, la diabetes mellitus de aparición en el adulto y las amiloidosis (Beyreuther, K. y Masters, C.L. Serpents on the road to dementia and death. Accumulating evidence from several studies points to the normal function of presenilin 1 and suggests how the mutant protein contributes to deposition of amyloid plaques in Alzheimer disease. Nature Medicine 3, 723-725 (1997); Masters, C.L. y Beyreuther, K. Alzheimer's disease. B.M.J. 316, 446-448 (1998); Selkoe, D.J. The cell biology of beta-amyloid precursor protein and presenilin in Alzheimer's disease. Trends in Cell Biol. 8, 447-453 (1998); Selkoe, D.J. Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's disease. Nature 399, A23-31 (1999); Wong, P.C. y col. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria. Neuron 14, 1105-1116 (1995); Spillantini, M.G., Crowther, R.A., Jakes, R., Hasegawa, M. y Goedert, M. a-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6469-6473 (1998); Hutton, M. y col. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature 393, 702-705 (1998); Stone, M.J. Amyloidosis: a final common pathway for protein deposition in tissues. Blood 75, 531-545 (1990)). Queda por establecerse si las poliaminas ramificadas podrían demostrar ser también eficaces en una variedad de trastornos heredados en los que la acumulación de proteínas anormales es una característica principal de la enfermedad; estas enfermedades genéticas incluyen las formas heredables de las enfermedades causadas por priones, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la demencia frontotemporal, la enfermedad de Pick y la amiloidosis, así como las enfermedades por repetición de tripletes incluyendo la enfermedad de Huntington, las ataxias cerebelares espinales y la distrofia miotónica (Fu, Y.-H. y col. An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy. Science 255, 1256-1259 (1992); Group, T.H.s.D.C.R. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell 72, 971-983 (1993)). Los compuestos identificados mediante los ensayos anteriormente descritos, tales como las poliaminas ramificadas, serán de utilidad para prevenir o retrasar la aparición de estas enfermedades genéticas en las que los portadores pueden ser a menudo identificados décadas antes de la disfunción neurológica o sistémica detectable.
Se encontró sorprendentemente que varios policationes dendríticos, incluyendo los dendrímeros de explosión estelar SuperFect™ (QIAGEN®, Valencia, CA), poliamidoamida (PAMAM) y el policatión hiperramificado polietilenimina (PEI), eliminaban PrP^{Sc} de células de neuroblastoma cultivadas infectadas con tembladera. Estos compuestos policatiónicos altamente ramificados proporcionan una nueva clase de agentes terapéuticos para combatir las enfermedades causadas por priones y otras enfermedades degenerativas, incluyendo la amiloidosis. La eliminación de PrP^{Sc} depende de la concentración del polímero dendrítico y de la duración de la exposición. Los polímeros dendríticos fueron capaces de eliminar PrP^{Sc} a concentraciones que no eran citotóxicas. Exposiciones repetidas al dendrímero PAMAM de explosión estelar degradado por calor o a PEI producían una drástica reducción de los niveles de PrP^{Sc}, reducción que persistía durante un mes incluso después de la retirada del compuesto. Los policationes dendríticos no parecían destruir PrP^{Sc} purificadas in vitro, y por tanto podrían actuar a través de un mecanismo generalizado. Los policationes dendríticos representan una clase de compuestos que pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en las enfermedades causadas por priones y en otros trastornos que implican depósitos de proteínas insolubles, tales como la amiloidosis.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a las personas con experiencia habitual en la técnica una revelación y descripción completas de cómo realizar y utilizar la presente invención, y no están destinados a limitar el ámbito de lo que los inventores consideran como su invención, ni tampoco están destinados a representar que los experimentos siguientes son todos o los únicos experimentos realizados. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es, o está próxima a, la presión atmosférica.
Métodos y materiales
Productos químicos. Todos los compuestos fueron adquiridos a Sigma-Aldrich. Todos los compuestos de ensayo fueron disueltos en agua a una concentración madre de 3 mg/ml y filtrados a través de un filtro Millipore de 0,22 \mum.
Células cultivadas. Cultivos madre de células ScN2a fueron mantenidas en MEM con un 10% de FBS, un 10% de Glutamax (Gibco BRL), 100 U de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (DME suplementado). Inmediatamente antes de la adición de los compuestos de ensayo, las placas fueron lavadas dos veces con medio DME suplementado nuevo. Después de la exposición a los compuestos de ensayo, se retiró el medio de las placas y las células fueron recogidas mediante lisis en 0,25-1 ml de Tris 20 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 100 mM, NP-40 0,5% y desoxicolato de sodio 0,5% para obtener una concentración total de proteínas de 1 mg/ml medida mediante el ensayo de BCA. Los núcleos fueron eliminados del lisado por centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos. Para las muestras no tratadas con proteinasa K, se mezclaron 40 \mul del lisado total (que representaban 40 \mug de proteína total) con un volumen igual de tampón de muestra reductor SDS 2x. Para la digestión con proteinasa K, se añadieron 20 \mug/ml de proteinasa K (Boehringer Mannheim) (proporción de proteína total:enzima = 50:1) y la muestra se incubó durante 1 hora a 37ºC. La digestión proteolítica fue finalizada por la adición de Pefabloc a una concentración final de 5 mM. Muestras de 1 ml fueron centrifugadas a 100.000 x g durante 1 hora a 4ºC, los sobrenadantes fueron desechados y las pellas fueron resuspendidas en 80 \mul de tampón de muestra reductor SDS para SDS-PAGE.
Homogenados de cerebro. Se prepararon homogenados de cerebro de ratones CD-1 afectados de tembladera RML (10% (p/v) en agua estéril) mediante extrusión repetida a través de agujas de jeringa de tamaño sucesivamente menor, desde 18 hasta 22 gauge. Los núcleos y los desechos celulares fueron eliminados por centrifugación a 1000 x g durante 5 minutos. Para determinar la concentración de proteína se utilizó el ensayo de proteína del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce). Los homogenados fueron ajustados a 1 mg/ml de proteína en NP-40 al 1%. Para las reacciones, se incubaron 0,5 ml de homogenado con 25 ml de tampón 1,0 M (acetato de sodio para pH 3-6 y Tris-acetato para pH 7-10) más o menos 10 ml de la solución madre de poliamina (3 mg/ml) durante 2 horas a 37ºC con agitación constante. El valor del pH final de cada muestra fue medido directamente con un electrodo de pH calibrado (Radiometer Copenhagen). Después de la incubación, cada muestra fue neutralizada con un volumen igual de HEPES 0,2 M, pH 7,5, que contenía NaCl 0,3 M y sarcosilo 4%. Se añadió proteinasa K hasta alcanzar una concentración final de 20 \mug/ml y las muestras fueron incubadas durante 1 hora a 37ºC. La digestión proteolítica fue finalizada por la adición de Pefabloc a una concentración final de 5 \muM. Se mezclaron 10 \mul del homogenado de cerebro digerido con un volumen igual de tampón de muestra SDS 2x y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido por transferencia Western.
Transferencia Western. Después de la electroforesis, se llevó a cabo una transferencia Western según se ha descrito previamente (Scott, M. y col. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell 59, 847-857 (1989)). Las muestras fueron llevadas a ebullición durante 5 minutos y clarificadas por centrifugación durante 1 minuto a 14.000 rpm en una ultrafuga Beckman. La SDS-PAGE se llevó a cabo en geles de poliacrilamida al 12% de 1,5 mm (Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4, Nature 227, 680-685 (1970)). Las membranas fueron bloqueadas con proteína de leche desnatada en PBST (PBS sin calcio ni magnesio más Tween 20 0,1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas bloqueadas fueron incubadas con el anticuerpo policlonal primario RO73 (para detectar MoPrP) (Serban, D., Taraboulos, A., DeArmond, S.J. y Prusiner, S.B. Rapid detection of Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prion proteins. Neurology 40, 110-117 (1990)) o con el anticuerpo monoclonal 3F4 (para detectar MHM2 PrP) (Kascsak, R.J. y col. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins. J. Virol. 61, 3688-3693 (1987)) a una dilución de 1:5000 en PBST durante una noche a 4ºC. Después de la incubación con el anticuerpo primario, las membranas fueron lavadas 3 x 10 minutos en PBST, incubadas con el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (Amersham Life Sciences) diluido 1:5000 en PBST durante 30 a 60 minutos a 4ºC y lavadas de nuevo 3 x 10 minutos en PBST. Después del revelado quimioluminiscente con el reactivo ECL (Amersham) durante 1 minuto, las transferencias fueron cerradas herméticamente en fundas de plástico y expuestas a una película ECL Hypermax (Amersham). Las películas fueron procesadas automáticamente en un procesador de películas Konica.
Ejemplo 1
Los resultados proporcionados en la presente muestran que las condiciones ácidas (<pH 5) incrementan la capacidad de los detergentes (por ejemplo, SDS) para desnaturalizar PrP^{Sc} y destruir la infectividad de los priones. Resultados específicos demuestran que pueden utilizarse condiciones ácidas para formular desinfectantes de priones eficaces enfatizando la importancia de las condiciones ácidas.
Eficacia de SDS al 1% a pH 3,4 para eliminar PrP^{Sc} en 5 minutos o 2 horas
Se preparó un homogenado al 2% en agua de cerebro con tembladera Sc237 mediante extrusión repetida a través de una aguja de 22 G. Los núcleos fueron eliminados por centrifugación durante 5 minutos a 1000 rpm. El homogenado clarificado fue diluido 2 veces e incubado durante 2 horas (panel superior de la Figura 2 A) o durante 5 minutos (panel inferior de la Figura 2B) a 37ºC bajo las condiciones siguientes:
1. NP-40 1%, acetato de sodio 50 mM, pH 7,0
2. NP-40 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4
3. SDS 1%, acetato de sodio 50 mM, pH 7,0
4. SDS 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4
5. Sarcosilo 1%, acetato de sodio 50 mM, pH 7,0
6. Sarcosilo 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4.
Las calles con signo más (+) indican muestras sometidas a proteolisis limitada con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 1 hora a 37ºC. Las calles con un signo menos (-) indican muestras no sometidas a proteolisis. Todas las muestras fueron llevadas a ebullición en tampón de muestra SDS durante 5 minutos antes de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Después de la transferencia a una membrana de transferencia Immobilon de Millipore, se realizó el revelado de la inmunotransferencia con el Fab primario d13.
Efecto de la temperatura sobre la capacidad del SDS al 1% a pH 3,4 para eliminar PrP^{Sc}
Se preparó un homogenado al 2% en agua de cerebro con tembladera Sc237 mediante extrusión repetida a través de una aguja de 22 G. Los núcleos fueron eliminados por centrifugación durante 5 minutos a 1000 rpm. El homogenado clarificado fue diluido 2 veces e incubado durante 5 minutos bajo las condiciones siguientes:
1. SDS 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4 a 4ºC
2. SDS 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4 a 20ºC
3. SDS 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4 a 37ºC
4. NP-40 1%, ácido acético 0,5%, pH 3,4 a 20ºC.
Las calles con signo más (+) de la Figura 3 indican muestras sometidas a proteolisis limitada con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 1 hora a 37ºC. Las calles con un signo menos (-) indican muestras no sometidas a proteolisis. Todas las muestras fueron llevadas a ebullición en tampón de muestra SDS durante 5 minutos antes de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Después de la transferencia a una membrana de transferencia Immobilon de Millipore, se realizó el revelado de la inmunotransferencia con el Fab primario d13.
Ejemplo 2 Formulación de SDS/ácido acético
Muestras de homogenados de cerebro de hámster sirio al 1% que contenían 10^{7} DL_{50} unidades de infectividad de priones/ml fueron incubadas con Tris-acetato 50 mM pH 7,0 o con ácido acético 0,5% en presencia de NP-40 1% o de SDS 1% durante 2 horas a 37ºC. Después de la incubación, cada muestra fue inoculada intracerebralmente a 8 hámsteres sirios separados para un ensayo de tiempo de incubación de la tembladera. Los resultados están mostrados en la tabla siguiente:
Muestra DL_{50}/ml
NP-40 1%, Tris-acetato 50 mM, pH 7,0 10^{7}
NP-40 1%, ácido acético 5%, pH 3,6 10^{7}
SDS 1%, Tris-acetato 50 mM, pH 7,0 10^{5}
SDS 1%, ácido acético 5%, pH 3,6 <10^{2}
Los resultados anteriores demuestran claramente que una formulación compuesta por un 1% aproximadamente de SDS y un 0,5% de ácido acético aproximadamente es eficaz para inactivar priones. Tal formulación podría proporcionar una formulación comercial extremadamente valiosa debido a la fácil disponibilidad del ácido acético y del SDS. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que podrían formularse otros ácidos eficaces y otros detergentes eficaces con estructura similar a la del SDS para obtener los mismos o similares resultados. Con respecto al componente ácido, lo que es importante es crear una formulación que mantenga el pH ácido de la formulación y preferiblemente por debajo de 4,0. El detergente de la composición no necesita ser SDS. Por ejemplo, el componente sodio del detergente podría ser cualquier catión tal como calcio, litio, potasio, magnesio, etc. Además, el componente sulfato podría ser sustituido por restos químicamente equivalentes. El dodecil sulfato de sodio incluye un componente hidrocarbonado con once grupos CH_{2} terminado en un grupo CH_{3}. Podrían utilizarse otros grupos alquilo diferentes tales como otros grupos de cadena lineal, de cadena ramificada o cíclicos. El resto alquilo podría contener de 2 a 40 carbonos y más preferiblemente contiene aproximadamente 12 átomos de carbono \pm 6 átomos de carbono. La formulación puede ser añadida a solventes apropiados, en concentraciones apropiadas. Además, la concentración de la formulación puede ser cambiada inmediatamente antes de su utilización y vendida por tanto como una formulación muy concentrada o vendida en una concentración lista para ser utilizada sin dilución con un solvente tal como agua o alcohol. Todavía más, según se indicó anteriormente, las formulaciones de la invención pueden ser suplementadas con componentes antibacterianos y/o antivirales apropiados así como con componentes que inactiven otros patógenos incluyendo parásitos, de tal manera que la formulación final sea eficaz para destruir o inactivar un amplio rango de componentes infecciosos.
Ejemplo 3 Efecto del detergente y del pH sobre PrP^{Sc} resistentes a proteasas
Muestras de homogenado de cerebro al 1% de SHa infectados con Sc237 fueron incubadas durante 15 minutos a 37ºC con detergente a un rango de valores de pH según se indica. Se utilizaron tampones de acetato de sodio 50 mM para mantener los valores de pH entre 3-6, y se utilizaron tampones Tris-acetato 50 mM para mantener los valores de pH entre 7-10. El valor final del pH de cada muestra indicado sobre las calles correspondientes, fue medido directamente con un electrodo de pH calibrado (Radiometer Copenhagen). Todas las muestras fueron neutralizadas mediante la adición de un volumen igual de Sarcosilo 4%, HEPES 100 mM pH 7,5, NaCl 200 mM y sometidas a proteolisis limitada con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 1 hora a 37ºC. Los pesos moleculares aparentes basados en la migración de estándares de proteína fueron de 30 y 27 kDa. Todas las muestras fueron neutralizadas mediante la adición de un volumen igual de Sarcosilo 4%, HEPES 100 mM pH 7,5, NaCl 200 mM. El símbolo menos (-) indica muestra control no digerida y el símbolo más (+) indica una muestra sometida a proteolisis limitada con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 1 hora a 37ºC. Los pesos moleculares aparentes basados en la migración de estándares de proteína fueron de 30 y 27 kDa. La Figura 3 muestra que SDS desnaturaliza PrP^{Sc} a pH <5 o a pH \geq10.
Ejemplo 4 Caracterización de la desnaturalización de PrP^{Sc} mediada por SDS ácido
Muestras de homogenado de cerebro al 1% de SHa infectados con Sc237 fueron incubadas durante 15 minutos a 37ºC en SDS al 1% más (1) Tris-acetato 50 mM pH 7,0, (2) acetato de sodio 50 mM pH 3,6, (3) glicina 50 mM pH 3,7 y (4) ácido peracético 0,2% pH 3,4. Después de la incubación, se añadió un volumen igual de Sarcosilo 4%, HEPES 100 mM pH 7,5, NaCl 200 mM, para neutralizar cada muestra. El símbolo menos (-) indica una muestra control no digerida y el símbolo más (+) indica una muestra sometida a proteolisis limitada con 20 \mug/ml de proteinasa K durante 1 hora a 37ºC. Los pesos moleculares aparentes basados en la migración de estándares de proteína fueron de 30 y 27 kDa. La Figura 4 muestra que SDS desnaturaliza PrP^{Sc} bajo condiciones ácidas en diferentes tampones ácidos, incluyendo ácido peracético (un desinfectante utilizando comúnmente en los hospitales).

Claims (23)

1. Un método para tratar un material con el fin de inactivar priones infecciosos, que comprende las etapas de:
la puesta en contacto del material con una composición que contiene:
un solvente;
un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2,5 a 4,5; y
un detergente seleccionado de dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter; y
el permitir que la composición permanezca en contacto con el material que elimina la infectividad de los priones infecciosos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el solvente es seleccionado de agua, alcohol y una mezcla de los mismos.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el componente ácido es seleccionado de ácido acético y ácido peracético.
4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el componente ácido es seleccionado de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido carboxílico y en el que el detergente se caracteriza porque reduce la infectividad de los priones infecciosos cuando la composición es puesta en contacto con los priones infecciosos durante una hora o menos a una temperatura de 40ºC o inferior, a una presión de una atmósfera.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el detergente es dodecil sulfato de sodio (SDS).
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el solvente es seleccionado de agua, alcohol y una mezcla de los mismos, presente en una cantidad del 1% al 99,99% en peso, y en el que el detergente está presente en una cantidad del 0,001% al 10% en peso.
7. El método de la reivindicación 6, en el que la composición contiene además:
un compuesto antibacteriano en una cantidad del 0,1% al 20% en peso;
un compuesto antiviral en una cantidad del 0,1% al 20% en peso y
un compuesto antifúngico en una cantidad del 0,1% al 20% en peso;
en el que el detergente está presente en una cantidad del 1% al 10% en peso.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material es seleccionado de entre una cápsula de gel farmacéutica, una tableta revestida con gel, un expansor de sangre o una solución sustitutiva de sangre, un implante quirúrgico, un vendaje, una sutura, un instrumento dental, una esponja dental, una esponja quirúrgica, una golosina conteniendo gelatina, un dulce de merengue blando o una pastilla de menta, el glaseado de un dónut®, zumo de frutas, vino, cerveza, nata, yogur, requesón, helados, margarina y chicle.
9. Un método para formar una cápsula de gelatina, que comprende:
la extracción de las pezuñas de un ungulado;
el tratamiento de las pezuñas para crear un material gelatinoso;
el tratamiento de la gelatina con un ácido de un tipo, y en una cantidad, que reduzca el pH de la gelatina hasta 4,0 o menos;
la adición a la gelatina de un detergente seleccionado de entre dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter, que elimina la infectividad de los priones infecciosos.
10. Una cápsula de gelatina producida mediante el método de la reivindicación 9.
11. La cápsula de gelatina reivindicada en la reivindicación 10, que tiene en la misma un compuesto seleccionado de entre un fármaco farmacéuticamente activo, una vitamina y un nutracéutico.
12. Un método para esterilizar un objeto, que comprende la etapa de:
la puesta en contacto del objeto con una composición antiséptica compuesta por
un solvente;
un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2,5 a 4,5; y
un detergente seleccionado de entre dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter, que elimina la infectividad de la proteína infecciosa.
13. El método de la reivindicación 12, en el que el objeto es seleccionado de entre un instrumento quirúrgico, un instrumento de diagnóstico, un colonoscopio, un sigmoidoscopio, un broncoscopio, un gastroscopio, un instrumento dental, un catéter, un quirófano, un cultivo celular, una columna cromatográfica y material gelatinoso obtenido de una vaca.
14. El método de la reivindicación 12 ó 13, en el que el componente ácido es seleccionado de ácido acético y ácido peracético.
15. El método de la reivindicación 12, en el que el detergente es dodecil sulfato de sodio (SDS).
16.Un método para producir una proteína farmacéuticamente activa en forma estéril, que comprende:
el cultivo de células diseñadas para expresar una proteína de interés;
la extracción de la proteína de interés; y
la puesta en contacto de la proteína de interés con una composición antiséptica que comprende
un solvente;
un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2,5 a 4,5 y
un detergente seleccionado de entre dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter, que elimina la infectividad de la proteína infecciosa.
17. El método de la reivindicación 16, en el que la proteína infecciosa es un prión.
18. Una composición antiséptica que comprende:
un solvente seleccionado de agua, alcohol y una mezcla de los mismos en una cantidad del 1% al 99,99% en peso;
un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2,5 a 4,5;
un detergente seleccionado de entre dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter, en una cantidad del 1% al 10% en peso;
un compuesto antibacteriano en una cantidad del 0,1% al 20% en peso;
un compuesto antiviral en una cantidad del 0,1% al 20% en peso; y
un compuesto antifúngico en una cantidad del 0,1% al 20% en peso.
\newpage
19. La composición de la reivindicación 18, en la que el componente ácido es de un tipo seleccionado de entre ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico y ácido carboxílico.
20. Utilización de una composición que contiene:
un solvente;
un componente ácido caracterizado por, y presente en, una molaridad para mantener el pH de la composición en un rango de 2,5 a 4,5; y
un detergente seleccionado de entre dodecil sulfato de sodio (SDS), dodecil sulfato de litio, dodecil sulfato de potasio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, octilglucósido, óxido de dodecildimetilamina, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS), bromuro de dodeciltrietilamonio (DTAB), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y polioxietilén-p-isooctilfenil éter;
para tratar un material con el fin de eliminar la infectividad de priones infecciosos.
21. El método de la reivindicación 1, 9, 12 ó 16, en el que el polioxietilén-p-isooctilfenil éter es Triton X-20, Triton X-100 o Triton X-114.
22. La composición de la reivindicación 18, en la que el polioxietilén-p-isooctilfenil éter es Triton X-20, Triton X-100 o Triton X-114.
23. La utilización de la reivindicación 20, en la que el polioxietilén-p-isooctilfenil éter es Triton X-20, Triton X-100 o Triton X-114.
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