DE60109897T2

DE60109897T2 - Zur inaktivierung von infektiösen proteinen behandelte zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60109897T2
Application number: DE60109897T
Authority: DE
Inventors: B. Stanley PRUSINER; Surachai Supattapone; R. Michael SCOTT
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2021-01-26
Also published as: EP1251737A2; ES2240404T3; ATE292382T1; EP1251737B1; WO2001054736A3; PT1251737E; WO2001054736A2; DE60109897D1; AU2001232994A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Zusammensetzungen, die zum Inaktivieren von infektiösen Proteinen wie infektiösen Prionen verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Antiseptische Zusammensetzungen sind seit über 100 Jahren bekannt. Zusätzlich zu verschiedenen Zusammensetzungen gibt es einen Bereich an verschiedenen Verfahren, von welchen es bekannt ist, dass sie beim Abtöten von Bakterien und Inaktivieren von Viren wirksam sind. Solche Verfahren schließen die Verwendung von hoher Temperatur allein oder in Kombination mit Bestrahlung über ausreichende Zeitdauern zum Abtöten von Bakterien oder Zerstören von Viren und dadurch deren Inaktivieren ein.
Beispiele für schnell wirkende, topische antiseptische Zusammensetzungen sind in US-Patent 6,110,908, erteilt am 29. August 2000, offenbart. Eine andere antibakterielle Zusammensetzung ist in US-Patent 6,025,312, erteilt am 15. Februar 2000, offenbart. Beispiele für andere antiseptische Zusammensetzungen sind in den US-Patenten 5,336,432, erteilt am 9. August 1994; 5,308,611, erteilt am 3. Mai 1994; 6,106,773, erteilt am 22. August 2000 und 6,096,216, erteilt am 1. August 2000, gelehrt.
Herkömmliche antiseptische Zusammensetzungen und antiseptische Methodologien sind im Allgemeinen zum Inaktivieren von infektiösen Proteinen wie Prionen nicht ausreichend. Obwohl Prionen durch relativ hohe Temperaturen über sehr lange Zeitdauern inaktiviert werden können, sind die Temperaturbereiche und Zeitdauern, die im Allgemeinen zum Abtöten von Bakterien und Inaktivieren der Viren verwendet werden, zum Inaktivieren von Prionen nicht ausreichend. Eine Vorgehensweise zum Lösen dieses Problems ist der Versuch, Prionen aus Lösungen zu entfernen, und ein chromatographisches Entfernungsverfahren ist in US-Patent 5,808,011 offenbart. Ferner versuchten Andere, zum Inaktivieren von Prionen beabsichtigte Zusammensetzungen und Methodologien bereitzustellen, wie in US-Patent 5,633,349, erteilt am 27. Mai 1997, gelehrt. Jedoch dauern solche Verfahren im Allgemeinen relativ lange, z.B. mehr als 12 Stunden, und stellen im Allgemeinen keine Lösung bereit, die leicht und wirtschaftlich verwendet werden könnte, um Prionen auf einem breiten Bereich an Oberflächen wie medizinischen Vorrichtungen zu inaktivieren. Zudem offenbart WO 00/72851 ein Verfahren zum Sterilisieren von Gegenständen, das das Inkontaktbringen des Gegenstands mit einem polykationischen Dendrimer unter Bedingungen, die dazu führen, dass ein konformativ abgewandeltes Protein wie ein Prion nicht-infektiös gemacht wird, beinhaltet. Supattapone et al. (P.N.A.S. 96 Seiten 14529–14534, 1999) beschreibt die Entfernung von Prionproteinen aus mit Traberkrankheit infizierten Neuroblastomazellen in Kultur.
Die vorliegende Erfindung bietet eine antiseptische Zusammensetzung und ein antiseptisches Verfahren zum Inaktivieren von Prionen, wie weiter nachstehend beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Zeichnung eines Dendrimer-Moleküls, das die definierten „Generationen" von homodispergierter Struktur zeigt, die unter Verwendung einer wiederholten divergenten Wachstumstechnik gebildet wird. Das spezifische Diagramm stammt von PAMAM, Generation 2.0 (Ethylendiamin-Kern).
2 schließt Gelplatten 2A (2 Stunden) und 2B (5 Minuten) ein. In 2A zeigt Säule 4 (+), dass SDS bei einem pH-Wert von etwa 3,3 PrP^C vollständig eliminiert, wohingegen 1%iges SDS bei einem pH-Wert von 7,0 nicht wirksam ist. 2 in Säule 4 zeigt, dass 1%iges SDS bei einem pH-Wert von 3,3 beim Inaktivieren von Prionen nach nur fünfminütiger Einwirkung effektiv ist.
3 zeigt eine Gelplatte, in welcher Säulen Ergebnisse zeigen, die bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt wurden, wodurch angezeigt wird, dass die optimale Temperatur zur Verwendung von saurem SDS zum Eliminieren von Prionen größer als 20°C ist.
4 zeigt vier getrennte Gele, wobei jedes der Gele bei neun verschiedenen spezifischen pH-Leveln läuft, wodurch gezeigt wird, dass SDS PrP^C bei geringem pH-Wert und hohem pH-Wert, jedoch nicht bei einem relativ neutralen pH-Wert denaturiert, und ferner gezeigt wird, dass eine Zunahme der prozentualen SDS-Konzentration die Fähigkeit der Bildung zum Denaturieren von PrP^C verbessert.
5 stellt Gelplatten bereit, die zeigen, dass andere saure Puffer wie Essigsäure und Natriumacetat in Kombination mit SDS zum Denaturieren von PrP^C verwendet werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine antiseptische Zusammensetzung wird zum vollständigen Inaktivieren von infektiösen Prionen verwendet. Die Zusammensetzung ist aus einem ersten Mittel, das den pH-Wert der Zusammensetzung im Bereich von 2,5 bis 4,5 hält, und einem zweiten Mittel, das ein Detergens umfasst, das durch seine Fähigkeit zum Zerstören der Infektiösität von infektiösen Prionen in einer Umgebung bei niedrigem pH-Wert, die durch den ersten Bestandteil gebildet wird (z.B. in zwei Stunden oder weniger) gekennzeichnet ist, zusammengesetzt. Das erste Mittel kann eine beliebige bekannte Säure sein, die in einer wässrigen Lösung mit einer solchen ausreichenden Molarität vorliegt, dass der pH-Wert der antiseptischen Zusammensetzung auf einen Wert im Bereich von 2,4 bis 4,5 reduziert wird und der pH-Wert auf diesem geringen Level gehalten wird, wenn die antiseptische Zu sammensetzung auf einen Gegenstand aufgebracht oder mit einem zu behandelnden Material gemischt wird. Die Zusammensetzung variiert aufgrund der großen Anzahl an verschiedenen Säuren und Detergens-inaktivierenden Mitteln, die verwendet werden können. Wird die Temperatur erhöht und der pH-Wert gesenkt, findet die Inaktivierung schneller statt. Zusammensetzungen der Erfindung inaktivieren vorzugsweise Prionen innerhalb etwa zwei Stunden oder weniger bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4,0 bei Temperaturen von etwa 15°C bis 40°C. Jedoch können niedrigere Temperaturen (0°C oder höher) und höhere Temperaturen (z.B. 100°C oder weniger) verwendet werden, wenn längere Zeitdauern verwendet werden können. Die Inaktivierung kann schneller (z.B. innerhalb einer Minute oder weniger) und bei höheren Temperaturen (z.B. höher als 40°C) stattfinden.
Die antiseptische Zusammensetzung wird vorzugsweise mit einem zusätzlichen Bestandteil kombiniert, was zur Bildung von behandelten Nahrungsmitteln, pharmazeutischem Material oder einem Gegenstand, ausgewählt aus einer pharmazeutischen Gelkapsel, einer gelbeschichteten Tablette, einem Blutstreckmittel oder einer Blutersatzlösung, einem chirurgischen Implantat, einer Bandage, einer Wundnaht, einem Zahnimplantat, einem Dentaltupfer, einem chirurgischen Tupfer, einem Gelatine enthaltenden Bonbon wie einem Karamellbonbon, einem Marshmallow oder einem Pfefferminz wie einem Altoid^®-Pfefferminz, Doughnutglasur, Fruchtsaft, Wein, Bier, saurer Sahne, Joghurt, Hüttenkäse, Eiskrem, Margarine und Kaugummi führt. Im Wesentlichen kann die antiseptische Zusammensetzung mit einem beliebigen Material, das infektiöse Prionen einschließt und insbesondere mit einem beliebigen Material, das tierische Produkte, insbesondere Rinderprodukte wie Rindergelatine umfasst, kombiniert oder darauf aufgetragen werden.
Ein Verfahren ist offenbart, durch welches jeder beliebige Gegenstandstyp durch Kombinieren von gewöhnlichen Sterilisationsverfahren mit der Verwendung der hier offenbarten antiseptischen Zusammensetzung, die ein konformativ abgewandeltes Protein wie ein Prion nicht-infektiös machen kann, sterilisiert wird. Das Verfahren ist beim Sterilisieren von medizinischen Vorrichtungen wie chirurgischen Instrumenten und Kathedern, die verwendet und mit Blut oder Gehirngewebe in Kontakt gebracht wurden, besonders nützlich. Gegenstände, die durch das Verfahren sterilisiert werden, sind ebenso Teil der Erfindung und schließen Kapseln ein, die aus Gelatine hergestellt sind, die vom Rind extrahiert wurde, wobei das Rind möglicherweise mit Prionen infiziert war, d.h. möglicherweise undiagnostiziertes BSE, bekannt als „Rinderwahn", aufwies.
Die antiseptischen Zusammensetzungen können mit herkömmlichen antibakteriellen und antiviralen Mitteln in wässrigen oder Alkohollösungen kombiniert werden, um Desinfektionsmittel oder chirurgische Scheuermittel herzustellen. Das Wesen der hier offenbarten Erfindung ist es, dass ein breiter Bereich an verschiedenen Typen von Detergenzien Prionen innerhalb einer relativ kurzen Zeitdauer (z.B. zwei Stunden oder weniger) nicht-infektiös gemacht werden kann, wenn sie bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5 bei mäßigen Temperaturen, z.B. 15 bis 30°C, gehalten werden. In einigen Fällen wird der kommerzielle Wert der Erfindung vermindert, wenn die Zusammensetzung ihren beabsichtigten Zweck in einer kurzen Zeitdauer (z.B. weniger als 10 Minuten bei etwa Raumtemperatur 20°C ± 5°C) nicht erreicht.
Ein Gesamtaspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Materials zum Inaktivieren von infektiösen Prionen, umfassend die Schritte:
Inkontaktbringen des Materials mit einer Zusammensetzung, umfassend:
ein Lösungsmittel,
einen Säurebestandteil, gekennzeichnet durch eine und vorliegend in einer Molarität, bei welcher der pH-Wert der Zusammensetzung in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, und
ein Detergens; und
Inkontaktlassen der Zusammensetzung mit dem Material, das infektiöse Prionen vollständig inaktiviert.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass Proteine wie Prionen ohne die Notwendigkeit von extremen Bedingungen wie Einwirken von Wärme über lange Zeitdauern, z. B. ohne die Notwendigkeit einer 1–10-stündigen Einwirkung von 100 bis 200°C, nicht-infektiös gemacht werden können.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass Zusammensetzungen nützlich sein können, während sie nur sehr geringe Konzentrationen des Prionen-inaktivierenden Bestandteils wie SDS, z.B. 1% bis 0,001%, enthalten.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist, dass mit Rindergelatine hergestellte Kapseln als prionenfrei bescheinigt werden können.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist, dass Arzneimittel, die aus mit einem Detergens wie SDS behandelten Zellkulturen hergestellt sind als prionenfrei bescheinigt werden können.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist, dass medizinische Vorrichtungen, die nach Kontakt mit Blut oder Gehirngewebe wieder verwendet werden, als prionenfrei bescheinigt werden können.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist, dass Krankenhäuser, Operationssäle und Vorrichtungen und die Apparatur darin als prionenfrei bescheinigt werden können, indem sie mit Detergenzien bei Standardtemperaturen und -drücken in Kontakt gebracht werden.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass konformativ abgewandeltes Protein wie Prionen mit einem Verfahren nicht-infektiös gemacht werden kann, das nur aus dem Anwenden eines Wirkbestandteils wie SDS, der vorzugsweise bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, besteht.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist, dass Seifen, chirurgische Scheuermittel, Detergenzien und dergleichen so formuliert werden können, dass sie den Säurebestandteil und das Detergens als Prionen-inaktivierenden Bestandteil enthalten.
Andere Aspekte der Erfindung sind Verfahren zum Sterilisieren von Herstellungsapparaturen wie chromatographischen Säulen und die Verwendung der sterilisierten Apparaturen zur Herstellung von Produkten wie Arzneimittel.
Ein anderer Aspekt ist die Verwendung von Zusammensetzungen zum Sterilisieren von Dentalinstrumenten, -apparaturen und -praxen.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass aus einem inaktivierenden Detergensbestandteil und einem Säurebestandteil zusammengesetzte Zusammensetzungen zum Inaktivieren von Prionen verwendet werden können, die auf chirurgischen Instrumenten, Messern und/oder anderen Werkzeugen oder Apparaturen, die von Metzgern verwendet werden, insbesondere denjenigen, die beim Schlachten von Kühen oder anderen Tieren verwendet werden, die mit Prionen infiziert sein könnten, vorliegen können.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass Zusammensetzungen der Erfindung beim Inaktivieren von Prionen wirksam sind, wenn der inaktivierende Detergensbestandteil (z.B. SDS) in sehr geringen Konzentrationen, z.B. 1% bis 0,001% oder weniger vorliegt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bevor die vorliegenden Verfahren, Aufgaben und Zusammensetzungen beschrieben werden, sollte es klar sein, dass diese Erfindung auf die jeweiligen beschriebenen Schritte, Vorrichtungen oder Bestandteile nicht beschränkt ist und als solche natürlich variieren kann. Es sollte auch klar sein, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Zwecke des Beschreibens der besonderen Ausführungsformen dient und nicht als Beschränkung betrachtet werden soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die anhängigen Ansprüche beschränkt ist.
Wenn nicht anders definiert, weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselben Bedeutungen auf, wie sie üblicherweise dem Fachmann, welchem diese Erfindung gehört, verständlich sind. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die denjenigen hier beschrieben ähneln bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind nun die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
DEFINITIONEN
Der Begriff „Säure" wird verwendet, um eine beliebige Verbindungsgruppe zu beschreiben, die eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) sauren Geschmack; (b) schlägt Litmusfarbstoff nach Rot um; (c) reagiert mit bestimmten Metallen unter Bildung eines Salzes; (d) reagiert mit bestimmten Basen oder Alkalis unter Bildung eines Salzes. Eine Säure umfasst Wasserstoff und unterzieht sich in Wasser einer Ionisierung, so dass H₃O⁺-Ionen gebildet werden – die auch als H⁺ beschrieben und Hydroniumionen oder einfach Wasserstoffionen genannt werden. Schwache Säuren wie Essigsäure oder Carbonsäure können wie viele starke Säuren wie Salzsäure, Salpetersäure und Schwefelsäure (HCl, H₂SO₄, HNO₃ verwendet werden. In Zusammensetzungen der Erfindung liegt die Säure vorzugsweise in einer solchen Konzentration vor, dass ein pH-Wert von 2,5 bis 4,5 erhalten wird. Der Säurebestandteil der antiseptischen Zusammensetzung muss in einer solchen Konzentration (Molarität) vorliegen, dass die Zusammensetzung im gewünschtem pH-Bereich gehalten wird. Die Konzentration (Molarität) oder die verwendete Säure variiert mit der jeweiligen verwendeten Säure, dem verwendeten Lösungsmittel (Wasser oder Alkohol) und anderen Faktoren wie Temperatur und Druck ein wenig. Der Säurebestandteil liegt vorzugsweise in ausreichender Molarität vor und ist von solchem Typ, dass die Zusammensetzung bei Verwendung der antiseptischen Zusammensetzung der Erfindung (z.B. mit einer zu desinfizierenden Probe gemischt wird) im bevorzugten pH-Bereich bleibt. Folglich sind stärkere und/oder konzentriertere Säurenformen bevorzugt, wenn die Zusammensetzung bei oder in einer Situation verwendet werden soll, in welcher die Zusammensetzung deutlich verdünnt und/oder mit einen hohen pH-Wert (d.h. sehr basischen Bestandteil) in Kontakt kommt.
Die Begriffe „Wirkbestandteil", „Wirkstoff", „Inaktivierungsmittel" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet, um eine Verbindung oder eine Verbindungsgruppe zu beschreiben, die beim Kombinieren im „Säure"-Bestandteil der Erfindung in der antiseptischen Zusammensetzung ein konformativ abgewandeltes Protein nicht-infektiös macht. Der Wirkbestandteil liegt in einer Umgebung mit einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5 und vorzugsweise in einer geringen Konzentration, z.B. weniger als 5 Volumenprozent der Zusammensetzung vor und inaktiviert Prionen oder andere konformativ abgewandelte Proteine innerhalb von zwei Stunden oder weniger bei Raumtemperatur, 15°C bis 30°C. Bevorzugte Detergenzien, die als Wirkbestandteil für Prionen wirken, schließen SDS ein.
Bei den Wirkverbindungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um die folgenden Detergenzien:

a) Natriumdodecylsulfat (SDS) (auch bekannt als Laurylsulfat, Natriumsalz- oder andere Salze sind ebenso nützlich, die Lithium und Kaliumsalze einschließen);
b) Natriumcholat
c) Natriumdeoxycholat
d) Deoctylglucosid
e) Dodecyldimethylaminoxid
f) 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)
g) Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB)
h) Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)
i) Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether (z.B. Triton X-20, Triton X-100, Triton X-114).

Ein Aspekt der Erfindung ist das Bereitstellen der vorstehenden Verbindungsgruppe mit einem Material, das infektiöse Prionen enthalten kann, unter Bedingungen, die die Infektiösität der Prionen inaktivieren, wobei die Bedingungen vorzugsweise einen pH-Wert von 2,5 bis 4,5 und eine Temperatur von 15°C oder höher umfassen, wobei die Inaktivierung in einer Zeitdauer von 2 Stunden oder weniger, vorzugsweise einer Stunde oder weniger und stärker bevorzugt 10 Minuten oder weniger stattfindet.
Eine weitere Information über Verbindungen und Bedingungen, die eine Proteinkonformation bewirken, ist in Voet et. al., Biochemistry, S. 180–280 (1990); Scopes, RK, Protein Purification: Principles and Practice, S. 57–71 (1987); und Deutscher, MP., Guide to Protein Purification, S. 240–241 (1990) zu finden.
Der Begriff „Detergens" wird verwendet, um eine Substanz zu bezeichnen, die die Oberflächenspannung von Wasser reduziert. Beispiele für Detergenzien sind vorstehend als mögliche Wirkverbindungen bereitgestellt. Bei dem Detergens kann es sich um ein oberflächenaktives Mittel, das eine Öl-Wasser-Grenzfläche konzentriert, Emulgierungswirkung ausübt und dadurch die Entfernung von Schmutz unterstützt, z.B. übliche Natriumseifen von Fettsäuren handeln. Ein Detergens kann je nach dessen chemischen Wirkungsmodus anionisch, kationisch oder monoionisch sein. Detergenzien schließen lineare Alkylsulfonate (LAS) ein, die häufig von „Gerüststoffen" unterstützt werden. Ein LAS ist vorzugsweise ein Alkylbenzolsulfonat-ABS, das durch Mikroorganismen leicht zersetzt wird (biozersetzbar ist). Das LAS ist im Allgemeinen ein geradkettiges Alkyl, das 10 bis 30 Kohlenstoffatome umfasst. Das Detergens kann in flüssiger oder fester Form vorliegen.
Die Begriffe „Prion", „Prionprotein", „PrP^Sc-Protein" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet, um die infektiöse PrP^Sc-Form eines PrP-Proteins zu bezeichnen, und sind eine Verkürzung der Wörter „Protein" und „Infektion". Die Teilchen sind größtenteils, wenn nicht ausschließlich aus PrP^Sc-Molekülen zusammengesetzt, die durch ein PrP-Gen kodiert sind. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Bekannte Prionen infizieren Tiere unter Verursachung von Traberkrankheit, einer übertragbaren, degenerativen Erkrankung des Nervensystems des Schafs und der Ziege, sowie spongiformer Rinder-Enzephalopathie (BSE) oder „Rinderwahn" und spongiformer Katzen-Enzephalopathie von Katzen. Vier Prionerkrankungen, von welchen bekannt ist, dass sie Menschen befallen, sind (1) Kuru, (2) Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) tödlich verlaufende Insomnie (FI). Wie hier verwendet schließt „Prion" alle Formen von Prionen ein, die alle oder beliebige dieser Krankheiten oder andere in beliebigen verwendeten Tieren und insbesondere in Menschen und domestizierten Farmtieren verursachen.
Der Begriff „konformativ abgewandeltes Protein" wird hier verwendet, um ein beliebiges Protein zu beschreiben, das eine mit einer Krankheit verbundene dreidimensionale Konformation aufweist. Das konformativ abgewandelte Protein kann die Krankheit verursachen, ein Faktor in einem Symptom der Krankheit sein oder als Ergebnis von anderen Faktoren auftreten. Das konformativ abgewandelte Protein tritt in einer anderen Konformation auf, die dieselbe Aminosäuresequenz aufweist. Im Allgemeinen ist das gebildete konformativ abgewandelte Protein in der Konformation, verglichen mit der anderen „entspannten" Konformation, die nicht mit einer Krankheit verbunden ist, „eingeschränkt". Der diese Offenbarung lesende Fachmann erkennt die Anwendbarkeit der antiseptischen Zusammensetzung der Erfindung auf andere konformativ abgewandelte Proteine, auch wenn die Erfindung im Allgemeinen im Hinblick auf Prionen beschrieben ist. Folgendes ist eine nicht-beschränkende Liste von Krankheiten, die mit Proteinen verbunden sind, die zwei oder mehrere verschiedene Konformationen annehmen, wobei mindestens eine Konformation ein Beispiel für ein konformativ abgewandeltes Protein ist.
Die Begriffe „Sterilisieren", „steril machen" und dergleichen werden hier verwendet, zu bedeuten, dass etwas nicht-infektiös gemacht oder etwas unfähig dazu gemacht wird, eine Krankheit zu bewirken. Insbesondere bedeuten sie, dass ein Protein nicht-infektiös oder unfähig dazu gemacht wird, eine Krankheit oder die Symptome einer Krankheit zu verursachen. Noch spezifischer bedeuten sie, dass ein konformativ abgewandeltes Protein (z.B. PrP^Sc, bekannt als Prionen) unfähig dazu gemacht wird, eine Krankheit oder die Symptome einer Krankheit zu verursachen.
Die Begriffe „wirksame Dosis" oder „wirksame Menge" bedeuten eine Menge einer Verbindung, die zum Bereitstellen des gewünschten Sterilisierungsergebnisses, z.B. Eliminieren der Infektiösität von beliebigen vorliegenden Prionen ausreichend ist. Dies variiert abhängig von Faktoren wie (1) dem verwendeten Wirkstoff, (2) dem pH-Wert der antiseptischen Zusammensetzung, (3) dem Typ des Gegenstands oder Materials, das sterilisiert wird und (4) der Menge oder Konzentration von infektiösen Proteinen, die vorliegen könnten. Die Konzentration ist ausreichend, wenn die erhaltene Zusammensetzung beim Vermindern (vorzugsweise Eliminieren) der Infektiösität von konformativ abgewandelten Proteinen wie diejenigen des behandelten Materials über einen Zeitraum zu keiner Infektion führen würde. Aufgrund dessen, dass (1) einige Materialien höhere Konzentrationen von abgewandeltem Protein als andere aufweisen, (2) einige Materialien häufiger als andere kontaktiert werden und (3) einzelne Proteine unterschiedliche Infektiösitätsgrade aufweisen, kann der wirksame Dosis- oder Konzentrationsbereich, der zum Sterilisieren benötigt wird, deutliche variieren. Es wird auch betont, dass die zum Behandeln einer Materialmenge benötigte Dosis auf der Basis des pH-Werts, bei welchem die Behandlung durchgeführt wird, und der Zeitmenge, mit welcher die Verbindung mit dem Material bei dem gewünschten niedrigen pH-Wert von 2,5 bis 4,5 und der Umgebungstemperatur und dem Umgebungsdrucks in Kontakt gehalten wird, ein wenig variieren kann.
Der Begriff „LD₅₀" ist wie hier verwendet die Dosis einer Wirksubstanz, die bei allen behandelten Versuchstieren zu einer 50%igen Tödlichkeit führt. Obwohl dieser üblicherweise die invasive Verabreichung wie oral, parenteral und dergleichen bedeutet, kann er auch auf Toxizität unter Verwendung von weniger invasiven Verfahren der Verabreichung wie topischen Verabreichungen der Wirksubstanz angewandt werden.
Der Begriff „Amin-terminiert" schließt primäre, sekundäre und tertiäre Amine ein.
Die Begriffe „PrP-Protein", „PrP" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet und sollen sowohl die infektiöse Teilchenform PrP^Sc, von welcher bekannt ist, dass sie Krankheiten (spongiforme Enzephalopathien) bei Menschen und Tieren verursacht, als auch die nicht-infektiöse Form PrP^C. die unter geeigneten Bedingungen zu der infektiösen PrP^Sc-Form umgewandelt wird, bedeuten.
Der Begriff „PrP-Gen" wird hier verwendet, um genetisches Material zu beschreiben, das Proteine, einschließlich bekannte Polymorphismen und pathogene Mutationen exprimiert. Der Begriff „PrP-Gen" bedeutet im Allgemeinen ein beliebiges Gen einer beliebigen Spezies, die eine beliebige Form eine Prionproteins kodiert. Einige üblicherweise bekannte PrP-Sequenzen sind in Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097–9101 (1992) und US-Patent Nr. 5,565,186 beschrieben. Das PrP-Gen kann von einem beliebigen Tier, einschließlich den hier beschriebenen „Wirts"- und „Test"-Tieren und beliebiger und aller Polymorphismen und Mutationen davon stammen, wobei es erkennbar ist, dass die Begriffe andere solche PrP-Gene einschließen, die noch zu entdecken sind. Das Protein, das durch ein solches Gen exprimiert wird, kann entweder die Form eines PrP^C (Nicht-Krankheitsform) oder PrP^Sc (Krankheitsform) annehmen.
Die Begriffe „standardisiertes Prionpräparat", „Prionpräparat", „Präparat" und dergleichen, werden hier abwechselnd verwendet, um eine Zusammensetzung (z. B. ein Gehirnhomogenat) zu beschreiben, die von dem Gehirngewebe von Säugern erhalten wird, die Anzeichen einer Prionerkrankung zeigen: Der Säuger kann (1) ein wie hier beschriebenes Transgen einschließen, (2) ablatierte endogene Prionprotein-Gene aufweisen, (3) eine hohe Anzahl an Prionprotein-Genen von einer genetisch unterschiedlichen Spezies aufweisen und/oder (4) ein Hybrid mit einem ablatierten endogenen Prionprotein-Gen und einem Prionprotein-Gen von einer genetisch unterschiedlichen Spezies sein. Verschiedene Kombinationen von (1) bis (4), z.B. (1) und (2) sind möglich. Die Säuger, von welchen standardisierte Prionpräparate erhalten werden, zeigen als Ergebnis der Animpfung mit Prionen und/oder aufgrund der Entwicklung der Erkrankung ihres genetisch modifizierten Aufbaus, z.B. einer hohen Kopienanzahl von Prionprotein-Genen klinische Anzeichen einer ZNS-Dysfunktion. Standardisierte Prionpräparate und Verfahren zur Herstellung solcher sind in US-Patent 5,908,969, erteilt am 1. Juni 1999, und US-Patent 6,020,537, erteilt am 1. Februar 2000, beschrieben und offenbart.
Der Begriff „Alzheimer-Krankheit" (hier abgekürzt mit „AD") wird hier verwendet, um einen Zustand zu bezeichnen, der mit der Bildung von Amyloid-β-Protein umfassenden neuritischen Plaques primär im Hypocampus und in der Hirnrinde sowie mit der Beeinträchtigung sowohl des Lernens als auch des Gedächtnisses verbunden ist. „AD" bedeutet, wie hier verwendet, dass er sowohl AD als auch Pathologien vom AD-Typ umfasst.
Der Begriff „Pathologie vom AD-Typ" bedeutet, wie hier verwendet, eine Kombination aus ZNS-Abwandlungen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Bildung von Amyloid-β-Protein im Hypocampus und in der Hirnrinde enthaltenen neuritischen Plaques. Solche Pathologien vom AD-Typ können Störungen, die mit anormaler Expression und/oder Ablagerung von APP, Überexpression von APP, Expression von abnormalen APP-Genprodukten verbunden sind, und andere mit AD verbundene Phänomene einschließen, sind jedoch nicht unbedingt darauf beschränkt. Beispielhafte Pathologien vom AD-Typ schließen Pathologien vom AD-Typ, die mit dem mit einer Überexpression von APP verbundenen Down-Syndrom verbunden sind ein, sind jedoch nicht unbedingt darauf beschränkt.
Der Begriff „mit Alzheimer-Krankheit verbundenes Phänomen" bedeutet, wie hier verwendet, einen mit AD verbundenen strukturellen, molekularen oder funktionellen Fall, insbesondere einen solchen Fall, der in einem Tiermodell leicht ab- schätzbar ist. Solche Fälle schließen Amyloid-Ablagerung, neuropathologische Entwicklungen, Lern- und Gedächtnisdefizite und andere mit AD verbundene Eigenschaften ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „zerebrale Amyloidangiopathie" (hier abgekürzt mit CAA) bedeutet, wie hier verwendet, einen Zustand, der mit der Bildung von Amyloid-Ablagerung in den Gehirngefäßen verbunden ist, die durch zerebrale Parenchymalblutung kompliziert werden kann. CAA ist auch mit einem erhöhten Schlaganfallrisiko sowie der Entwicklung von zerebralen und subarachnoiden Blutungen verbunden (Vinters (1987) Stroke 18: 311–324; Haan et al. (1994) Dementia 5: 210–213; Itoh et al. (1993) J. Neurol. Sci. 116: 135–414). CAA kann vor dem Einsatz von Blutungen auch mit Demenz verbunden sein. Die mit CAA verbundenen Gefäß-Amyloid-Ablagerungen können in Abwesenheit von AD vorliegen, sind jedoch häufiger mit AD verbunden.
Der Begriff „mit zerebraler Amyloidangiopathie verbundenes Phänomen" bedeutet, wie hier verwendet, einen mit CAA verbundenen molekularen, strukturellen oder funktionellen Fall, insbesondere einen solchen Fall, der in einem Tiermodell leicht abschätzbar ist. Solche Fälle schließen Amyloid-Ablagerung, zerebrale Parenchymalblutung und andere, mit CAA verbundene Eigenschaften ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „β-Amyloid-Ablagerung" bedeutet, wie hier verwendet, eine Ablagerung im Gehirn, die aus Aβ, sowie anderen Substanzen zusammengesetzt ist.
Hier verwendete Abkürzungen schließen ein:
ZNS für zentrales Nervensystem;
BSE für spongiforme Rinder-Enzephalopathie;
CJD für Creutzfeldt-Jakob-Krankheit;
FFI für tödliche verlaufende familiäre Insomnie;
GSS für Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Krankheit;
AD für Alzheimer-Krankheit;
CAA für zerebrale Amyloid-Angiopathie;
Hu für human;
HuPrP für Human-Prionprotein;
Mo für Maus;
MoPrP für Mäuse-Prionprotein;
SHa für Syrischer Hamster;
SHaPrP für Syrischer-Hamster-Prionprotein;
PAMAM für Polyamidoamid-Dendrimer;
PEI für Polyethylenimin;
PK für Proteinase-K;
PPI für Polypropylenimin;
PrP^Sc für die Traberkrankheit-Isoform des Prionproteins;
PrP^C für die zellulär enthaltene übliche, gewöhnliche
Isoform des Prionproteins;
PrP 27–30 oder PrP^Sc 27–30 für die Behandlung oder Proteaseresistenzform von PrP^Sc;
MoPrP^Sc für die Traberkrankheit-Isoform des
Mäuse-Prionproteins;
N2a für eine etablierte Neuroblastom-Zelllinie, die in den vorliegenden Studien verwendet wird;
ScN2a für eine chronische mit Traberkrankheit infizierte Neuroblastom-Zelllinie;
ALS für amyotrophische laterale Sklerose;
HD für Huntington-Krankheit;
FTD für frontotemporale Demenz;
SDS für Natriumdodecylsulfat;
SOD für Superoxiddismutase.
ALLGEMEINE ASPEKTE DER ERFINDUNG
Die Erfindung verwendet einen Bereich an antiseptischen Zusammensetzungen und Verfahren, um konformativ abgewandelte Proteine nicht-infektiös zu machen. Die Zusammensetzung ist aus einem Säurebestandteil und einem Detergens zu sammengesetzt, obwohl eine einzelne Verbindung die Funktion von beiden Komponenten ausüben könnte. Die Zusammensetzung umfasst eine Lösungsmittelträgerkomponente, die im Allgemeinen auf Alkohol- oder Wasserbasis vorliegt. Der Säurebestandteil ist dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Zusammensetzung bei Verwendung im Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird. Das Detergens ist dadurch gekennzeichnet, dass es infektiöse Proteine vollständig nicht-infektiös macht. Vorzugsweise macht der Wirkbestandteil in der Umgebung mit geringem pH-Wert der Zusammensetzung infektiöse Proteine innerhalb von zwei Stunden oder weniger bei einer Temperatur von 40°C oder weniger nicht-infektiös.
Geeignete Säurebestandteile schließen eine nicht-toxische schwache Säure, wie Essigsäure mit darin gelöstem Detergens ein. Die antiseptischen Zusammensetzungen werden auf ein zu sterilisierendes Material aufgetragen, damit gemischt, in es injiziert oder auf andere Weise mit ihm in Kontakt gebracht. Die Zusammensetzung wird bei normaler Temperatur (z.B. 15 bis 30°C) für eine ausreichende Zeitdauer (z. B. weniger als zwei Stunden) im gewünschten pH-Bereich gehalten, um zu bewirken, dass das auf oder in dem Material vorliegende konformativ abgewandelte Protein zerstört (z.B. hydrolysiert) oder nicht-infektiös gemacht wird. Bevorzugte Zusammensetzungen der Erfindung sind beim Reinigen und Sterilisieren nützlich und können aus einem Wirkstoff wie SDS und einem Säurebestandteil, der einen pH-Wert von weniger als 3,5 bereitstellt, zusammengesetzt sein.
DENDRIMER-VERBINDUNGEN, DIE PRIONEN BESEITIGEN
Dendrimer sind verzweigte Verbindungen, auch bekannt als „sich sternenförmig erweiternde" oder „Sternen"-Polymere aufgrund einer charakteristischen, sternenartigen Struktur (siehe 1). Dendrimer, die auf die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung angepasst werden können, sind Polymere mit Strukturen, die aus AB_n-Monomeren aufgebaut sind, wobei n ≥ 2 und vorzugsweise n = 2 oder 3. Solche Dendrimer sind hoch verzweigt und weisen drei ausgeprägte Merkmale auf: 1) einen Kern, 2) mehrere periphere Endgruppen und 3) Verzwei gungseinheiten, die die beiden verbinden. Dendrimer können kationisch (Dendrimer der vollständigen Generation) oder anionisch (Dendrimer der halben Generation) sein. Für eine Übersicht über die allgemeine Synthese, die physikalischen Eigenschaften und die Anwendung von Dendrimern siehe z.B. Tomalia et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29: 138–175, (1990); Y. Kim und C. Zimmerman, Curr Opin Chem Biol, 2: 733–7421 (1997).
Sterilisationszusammensetzungen können einen kationischen Dendrimer umfassen, der vorzugsweise in einem Lösungsmittel mit niedrigem pH-Wert wie Essigsäure gelöst ist. Beispiele für geeignete Dendrimer sind in den US-Patenten Nr. 4,507,466; 4,558,120; 4,568,737; 4,587,329; 4,631,337; 4,694,064; 4,713,975; 4,737,550; 4,871,779 und 4,857,599 an D. A. Tomalia et al. offenbart. Dendrimer weisen typischerweise tertiäre Amine mit einem pKa-Wert von 5,7 auf. Die Dendrimer können wahlweise chemisch oder wärmebehandelt werden, um einen Teil der tertiären Amine zu entfernen. Andere geeignete Kationen schließen Polypropylenimin, Polyethylenimin (PEI), das tertiäre Amine mit einem pKa-Wert von 5,9 aufweist, und Poly(4'-aza-4'-methylheptamethylen-D-glucaramid), das tertiäre Amine mit einem pKa-Wert von 6,0 aufweist, ein. Der kationische Dendrimer ist vorzugsweise in einem Lösungsmittel mit niedrigem pH-Wert wie Essig in einer Konzentration von 0,001% oder mehr, vorzugsweise 0,01% oder mehr und stärker bevorzugt etwa 1% gelöst.
Vorzugsweise sind die Dendrimer Polyamidoamine (hier „PAMAM"). PAMAM-Dendrimer sind besonders bioverträglich, da Polyamidoamingruppen Peptidbindungen von Proteinen ähneln.
Dendrimer werden in Rängen, genannt Generationen (siehe Generationen 0, 1 und 2 in 1) hergestellt und weisen deshalb spezifische Molekulargewichte auf. Die PAMAM-Dendrimer der vollständigen Generation weisen terminale Amingruppen auf und sind kationisch, wohingegen die Dendrimer der halben Generation Carboxyl-terminiert sind. PAMAM-Dendrimer der vollständigen Generation sind folglich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. PAMAM-Dendrimer können mit unterschiedlichen Molekulargewichten hergestellt werden und weisen wie in nachstehender Tabelle A für die Generationen 0 bis 10 beschrieben spezifische Werte auf.
TABELLE A LISTE VON PAMAM-DENDRIMERN UND DEREN MOLEKULARGEWICHTEN (Ethylendiamin-Kern, Amin-terminiert)
Wie in Tabelle A dargestellt, liegt die Anzahl der terminalen Amingruppen für PAMAM-Dendrimer-Generationen 0 bis 10 im Bereich von 4 bis 4.096 mit Molekulargewichten von 517 bis 934.720. PAMAM-Dendrimer sind im Handel von Aldrich oder Dendritech erhältlich. Polyethylenimin- oder Polypropylen-Dendrimer oder quarternisierte Formen von Amin-terminierten Dendrimern können wie von Tomalia et al., Angew. Cherm. Int. Ed. Engl., 29: 138–175 (1990) beschrieben hergestellt werden.
STERILISATIONSZUSAMMENSETZUNGEN
Hier bereitgestellte Beispiele zeigen, dass verschiedene Wirkverbindungen wie SDS bei einem pH-Wert von 4,0 oder weniger den Grad und die Verteilung von PrP^Sc-Proteinablagerungen in mit Traberkrankheit infizierten Zellen beeinflussen. Die Gegenwart dieser Wirkverbindungen in einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert und mit relativ niedrigen, nicht-zytotoxischen Gehalten führt zu einer deutlichen Reduktion an nachweisbarem PrP^Sc in Zellen und Gehirnhomogenaten. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von Zusammensetzungen zur vollständigen Inaktivierung der Infektiösität eines Proteins. Eine in der Erfindung verwendete Zusammensetzung ist aus einem beliebigen Detergens zusammengesetzt, das konformativ abgewandelte Proteine in einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert (z.B. SDS) in Lösung, Suspension oder Gemisch zerstören kann.
STERILISIERUNGSFORMULIERUNGEN
Sterilisierungszusammensetzungen enthalten vorzugsweise das Detergens in einer Konzentration von 0.0001 bis 10% der Formulierung. Die folgenden Verfahren und Exzipienten sind nur beispielhaft und in keinster Weise beschränkend.
Zusätzlich zum Einschluss der Detergens-Verbindung in der Formulierung ist es wichtig, diese Verbindung in einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert zu halten. Eine beliebige Anzahl an bekannten Säuren oder Gemischen von Säuren könnte mit der Erfindung verwendet werden. Nicht-beschränkende Beispiele für im Handel erhältliche Produkte, die in die Zusammensetzungen ergänzt werden könnten, sind nachstehend beschrieben. In diesen Formulierungen kann die prozentuale Menge jedes Inhaltsstoffes variieren. Im Allgemeinen liegt ein Lösungsmittel-Inhaltsstoff (z.B. Wasser oder Alkohol) in Mengen von 40% bis 100% vor. Die anderen Inhaltsstoffe liegen in einer Menge im Bereich von 1% bis 60% und allgemeiner 5% bis 20% vor. Die zugesetzte Menge ist eine Menge, die zum Erhalt der gewünschten Wirkung benötigt wird.
Durch Verwendung der hier bereitgestellten Offenbarung und andere Information, wie in den US-Patenten 5,767,054; 6,007,831; 5,830,488; 5,968,539; 5,419,075; 5,296,158 und in den darin zitierten Patenten und Veröffentlichungen gelehrt, kann der Fachmann unzählige andere Formulierungen der Erfindung herstellen. Ferner werden die Formulierungen vorzugsweise so eingestellt, dass sie einen pH-Wert von weniger als 4,0 aufweisen, und solche Formulierungen können, wie in solchen Publikationen beschrieben, verwendet und in einem beliebigen geeigneten Behälter oder einer beliebigen geeigneten Spendevorrichtung, z.B. gelehrt in 5,992,698, verpackt werden. Der pH-Wert kann mit einer beliebigen Säure gesenkt werden, z.B. können HCl, H₂SO₄, HNO₃ Peressigsäure, usw. als Säurebestandteil in der vorstehend bereitgestellten Formel verwendet werden.
Beispiel 3 zeigt, dass Verbindungen wie SDS beim Denaturieren von PrP^Sc nicht nur bei einem geringen pH-Wert (z.B. 5 oder weniger), sondern auch bei einem hohen pH-Wert (z.B. 9 oder mehr) wirksam sind, jedoch bei einem pH-Wert von etwa 7,0 ± 1 im Allgemeinen nicht wirksam sind. Der pH-Wert der Formulierung kann so eingestellt werden, dass die gewünschten Ergebnisse in jedem bestimmten Fall erhalten werden. Zum Beispiel kann ein sehr hoher oder sehr niedriger pH-Wert zum Inaktivieren von PrP^Sc der beste sein, jedoch können extreme pH-Werte in manchen Situationen aufgrund ihrer korrosiven Wirkungen unerwünscht sein. Folglich ist ein bevorzugter pH-Wert einer, der PrP^Sc inaktiviert und die geringstmöglichen negativen Wirkungen für die beabsichtigte Verwendung aufweist.
Formulierungen, die mit einer Zellkultur verwendet werden, weisen den Vorteil auf, dass sie nicht-toxisch sind. Zum Beispiel ist eine parenterale Verabreichung einer Lösung der Formulierungen der Erfindung vorzugsweise mit einer Dosierung von 0,1 mg/Maus, wobei es sich um einen LD₅₀ von weniger als 1 bei 40 mg/kg handelt, nicht-toxisch. Verschiedene Nährstoffformulierungen und/oder injizierbare Formulierungen des dem Fachmann bekannten Typs können zur Herstellung von Formulierungen zur Behandlung von Zellkulturen verwendet werden.
Es ist dem Fachmann klar, dass es in manchen Situationen erwünscht sein kann, die pH-Umgebung weiter zu reduzieren, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Dies kann durch Zugabe einer beliebigen gewünschten Säure erzielt werden. Falls gewünscht, kann der pH-Wert nach Abschluss der Behandlung, d.h. nachdem eine ausreichende Menge eines beliebigen vorliegenden konformativ abgewandelten Proteins zerstört ist auf einen normalen Grad angehoben werden.
Verbindungen, die in konformativ abgewandelte Proteine enthaltenden Sterilisationszusammensetzungen wirksam sind, werden durch einen Zellkulturtest und einen Organhomogenattest bestimmt, wobei jeder davon nachstehend detailliert beschrieben ist.
TEST AUF DER BASIS VON ScN2a
Beim Lesen dieser Offenbarung und insbesondere der hier bereitgestellten Beschreibung über bestimmte Tests begegnen dem Fachmann andere Tests. Das Grundkonzept ist (1) das Bereitstellen eines Säurebestandteils in einem wässrigen und/oder Alkoholträger, (2) Zugabe des Bestandteils (nicht als wirksam bekannt) und (3) Inkontaktbringen der Testzusammensetzung mit einer Probe, von welcher es bekannt ist, dass sie infektiöses Protein enthält. Nach Verstreichenlassen einer Zeitdauer (z.B. 5 Minuten bis 2 Stunden) werden die hier beschriebenen Verfahren verwendet, um (4) zu bestimmen, ob der Bestandteil „wirksam" ist, d.h. das Protein nicht-infektiös macht. Mehrere Verbindungen können der Zusammenset zung zugesetzt und gleichzeitig getestet werden. Wird keine Wirkung gefunden, dann sind alle Verbindungen unwirksam. Wird eine Sterilisierungswirkung gefunden, kann die Gruppe an getesteten Verbindungen in zwei aufgeteilt und erneut getestet werden, bis eine wirksame Verbindung speziell identifiziert wurde. Das Aufteilen der organisch getesteten Gruppe in beliebiger Weise und erneute Testen kann beliebig oft durchgeführt werden.
Die Wirkverbindung kann zu einem Zeitpunkt auf einen Prionstamm oder gleichzeitig auf mehrere Stämme überprüft werden. Einige Wirkverbindungen wie SDS inaktivieren alle bekannten Prionstämme, während einige polykationische Dendrimer nur spezifische Stämme inaktivieren. Inaktiviert die Wirkverbindung alle Stämme, ist sie als Antiseptikum und/oder Therapeutikum nützlich. Inaktiviert sie nur einen spezifischen Stamm, kann sie zum Bestimmen des infektiösen Prionstamms in einer Probe verwendet werden.
Bemühungen wurden unternommen, die Transfektion von ScN2a-Zellen mit pSPOX-Expressionsplasmiden zu optimieren (Scott, M. R., Köhler, R., Foster, D. & Prusiner, S. B. Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice. Protein Sci. 1, 986–997 (1992)). In Verbindung mit diesen Wirkungen wurde eine Auswertung eines Transfektionsprotokolls durchgeführt, das Super-Fect-Reagens (QIAGEN^®) verwendete. Es wurde gefunden, dass Epitopmarkiertes (MHM2) PrP^Sc (Scott, M. R., Köhler, R., Foster, D. & Prusiner, S. B. Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice. Protein Sci. 1, 986–997 (1992)) in ScN2a-Zellen infolge der SuperFect-vermittelten Transfektion nicht nachgewiesen werden konnte, wohingegen MHM2-PrP^Sc effizient gebildet wurde, als ein kationisches Liposom-Verfahren zur DNA-Abgabe verwendet wurde. Eine genaue Überprüfung zeigte, dass SuperFect-transfektierte Proben vor dem Proteaseaufschluss MHM2-Banden exprimierten, die im Hintergrundsmuster einer untransfektierten Probe nicht zu sehen waren. Der monoklonale 3F4-Antikörper reagiert mit MoPrP nicht, zeigt jedoch eine hohe Hintergrundfärbung auf Western-Blots von Mäuse-ScN2a-Zellen. Ein erhöhtes Immunfärben in der Region von 20–30 kDa wurde im Vergleich zu der nicht-transfektierten Probe beobachtet. Diese Beobachtungen führen uns zu dem Rückschluss, dass MHM2-PrP unter Verwendung des SuperFect-Transfektionsreagenzes erfolgreich exprimiert wurde, dass jedoch die Umwandlung von MHM2-PrP^C zu Proteaseresistentem MHM2-PrP^Sc durch SuperFect gehemmt wurde.
Zum Untersuchen dieser offensichtlichen Hemmung wurde ein Western-Blot mit polyklonalem RO73-Antiserum erneut sondiert, um endogenes MoPrP^Sc nachzuweisen, wobei die Gegenwart davon für eine Prioninfektion in ScN2a-Zellen diagnostisch ist (Butler, D. A., et al. Scrapie-infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistant prion proteins. J. Virol. 62, 1558–1564 (1988)). Überraschend wurde gefunden, dass die mit SuperFect behandelten ScN2a-Zellen keine nachweisbaren Mengen an MoPrP^Sc mehr enthielten, was auch in Western-Blots bestätigt wurde. Zum Untersuchen des Mechanismus, durch welchen SuperFect den Grad an vorexistierendem PrP^Sc in chronisch infizierten ScN2a-Zellen reduzierte, wurden Messungen des endogenen PrP^Sc in ScN2a-Zellen durchgeführt, die mit verschiedenen Konzentrationen von SuperFect in Abwesenheit von Plasmid-DNA in Kontakt waren. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Behandlung mit SuperFect (einem verzweigten Polykation) das Verschwinden von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen in dosisabhängiger Weise verursachte. Die SuperFect-Konzentration, die zum Eliminieren von > 95% des schon existierenden PrP^Sc mit einer dreistündigen Einwirkung erforderlich war, wurde als etwa 150 μg/ml befunden. Die Behandlungsdauer beeinflusste auch die Fähigkeit von SuperFect zum Entfernen von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen: Eine Einwirkung von 150 μg/ml SuperFect für eine Dauer von 10 Minuten beeinflusste die PrP^Sc-Gehalte nicht, wohingegen 7,5 μg/ml SuperFect das gesamte nachweisbare PrP^Sc mit einer t1/2 = 8 Std. eliminierte.
SuperFect ist ein Gemisch aus verzweigten Polyaminen, die von der wärmeinduzierten Zersetzung eines PAMAM-Dendrimers abgeleitet sind (Tang, M. X., Redemann, C. T. & Szoka, F. C. J. In vitro gene delivery by degraded polyamidoamine dendrimers. Bioconjug. Chem. 7, 703–714 (1996)). Es ist bekannt, dass diese Struktur die Fähigkeit von verschiedenen anderen verzweigten und unverzweigten Polymeren zum Eliminieren von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen (Tabelle 1) aufweist. Die untersuchten, verzweigten Polymere schließen verschiedene Präparate von PEI, sowie intakte PAMAM- und PPI-Dendrimer ein. Dendrimer werden durch wiederholte divergente Wachstumstechnik hergestellt, was die Synthese von aufeinander folgenden, genau definierten „Generationen" von homodispersen Strukturen (1) erlaubt. Die Leistungsfähigkeit von sowohl PAMAM- als auch PPI-Dendrimern beim Eliminieren von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen nahm zu, als der Generationsgrad zunahm. Die leistungsstärksten Verbindungen in Bezug auf das Eliminieren von PrP^Sc waren PAMAM, Generation 4,0, und PPI, Generation 4,0, wohingegen PAMAM, Generation 1,0, eine sehr geringe Fähigkeit zum Eliminieren von PrP^Sc zeigte (Tabelle 1). Gleichermaßen war eine Fraktion mit hohem MG von PEI leistungsstärker als PEI mit niedrigem MG.
Aus den vorstehenden Daten ist es klar, dass bei allen getesteten drei verzweigten Polyaminen eine Zunahme der Molekulargröße einer zunehmenden Leistungsfähigkeit zum Eliminieren von PrP^Sc entsprach. Zum Bestimmen dessen, ob dieser Trend direkt der erhöhten Oberflächendichte von Aminogruppen auf den größeren Molekülen zuzuschreiben war, wurde PAMAM-OH, Generation 4,0, getestet. Dies ist ein Dendrimer, der PAMAM, Generation 4,0, ähnelt, außer dass Hydroxygruppen die Aminogruppen auf seiner Oberfläche ersetzen. Anders als PAMAM, Generation 4,0, verursachte PAMAM-OH, Generation 4,0, sogar bei der höchsten getesteten Konzentration (10 mg/ml) keine Reduktion an PrP^Sc-Gehalten, wodurch es sich erwies, dass die Aminogruppen für die Eliminierung von PrP^Sc durch PAMAM erforderlich sind (Tabelle 1).
In einer Bemühung zum Ermitteln des Beitrags der verzweigten Architektur an der Beseitigungsfähigkeit von Polyaminen für PrP^Sc wurden auch die linearen Moleküle Poly(L)lysin und lineares PEI getestet. Beide dieser linearen Verbindungen waren weniger leistungsstark als ein Präparat aus verzweigtem PEI mit ähnlichem mittleren Molekulargewicht (Tabelle 1), wodurch es sich erwies, dass eine verzweigte Molekulararchitektur die Fähigkeit von Polyaminen zum Eliminieren von PrP^Sc, vermutlich aufgrund dessen, dass die verzweigten Strukturen eine höhere Dichte von Aminogruppen auf der Oberfläche erzielen, optimiert.
Kinetiken von PrP^Sc-Eliminierung durch Polyamine
Die vorangehenden Ergebnisse zeigen die leistungsstarke Fähigkeit von verzweigten Polyaminen zum Beseitigen von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen bei einer Behandlung von wenigen Stunden. Die Nützlichkeit dieser Verbindungen zum Wirken aus Therapeutika für die Behandlung einer Prionerkrankung wurde unter Verwendung der Kriterien Zellwachstum, Morphologie und Lebensfähigkeit, wie gemessen durch Färben mit Trypanblau, durch Bestimmen dessen getestet, ob sie für ScN2a-Zellen zytotoxisch sind. Keine der Verbindungen war für ScN2a-Zellen nach Einwirken für eine Dauer von einer Woche von Konzentrationen bis zu 7,5 μg/ml zytotoxisch. Zum Bestimmen dessen, ob verzweigte Polyamine ScN2a-Zellen von Traberkrankheitsinfektion ohne Beeinflussen der Zelllebensfähigkeit heilen können, wurden die Kinetiken der Prionbeseitigung in Gegenwart einer nicht-zytotoxischen Konzentration (7,5 μg/ml) für drei verschiedene verzweigte Polyamine getestet. ScN2a-Zellen wurden mit SuperFect, PEI oder PAMAM, Generation 4,0, für variierende Zeitdauern in Kontakt gebracht. Die Kinetiken einer PrP^Sc-Eliminierung wurden durch Western-Blotten ermittelt. Alle drei Verbindungen verursachten eine wesentliche Reduktion in den PrP^Sc-Gehalten nach einer Behandlung von 8 bis 16 Stunden, und unter diesen drei Verbindungen schien PEI PrP^Sc am schnellsten innerhalb t1/2 = 4 Std. zu entfernen.
Von Traberkrankheitsinfektion heilende Neuroblastoma-Zellen
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Anhäufung von PrP^Sc in ScN2a-Zellen unter nicht-zytotoxischen Bedingungen umzukehren. Es wurde auch gefunden, dass eine verlängerte Einwirkung von sogar noch geringeren Gehalten an verzweigten Polyaminen (1,5 μg/ml) zum Eliminieren von PrP^Sc ausreichend war. Auf der Basis dieser Funde wurde dieses Protokoll zum Bestimmen dessen verwendet, ob die starke Reduktion in den PrP^Sc-Gehalten nach der Einwirkung von verzweigten Polyaminen nach der Entfernung der Verbindungen weiter besteht. Nach dem Kontakt von ScN2a-Zellen mit 1,5 μg/ml SuperFect für eine Dauer von einer Woche war PrP^Sc auf < 1% des Grundgehalts reduziert, stieg jedoch dann wieder auf ungefähr 5% des Grundgehalts nach zusätzlichen drei Wochen in Kultur in Abwesenheit von Polyamin an. Im Gegensatz dazu wurde nach dem Kontakt mit 1,5 μg/ml entweder von PEI oder PAMAM, Generation 4,0, für eine Dauer von einer Woche PrP^Sc vollständig eliminiert und kehrte sogar nach drei Wochen in Kultur ohne Polyaminen nicht zurück. Ein intensiverer Weg der Behandlung mit 1,8 μg/ml SuperFect für eine Dauer von 9 Tagen heilte ScN2a-Zellen von Traberkrankheitsinfektion auch vollständig, was sich durch die Abwesenheit von PrP^Sc ein Monate nach der Entfernung von SuperFect manifestierte.
Nachweis von Polyaminen, die mit einer sauren Abteilung wirken
Die vorstehenden Ergebnisse zeigten die leistungsstarke Aktivität von verzweigten Polyaminen beim schnellen Beseitigen von Traberkrankheitsprionen aus gezüchteten ScN2a-Zellen. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde der Mechanismus, durch welchen diese Verbindungen wirken, untersucht. Über alle der Verbindungen, die eine Entfernung von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen bewirken, ist bekannt, dass sie durch Endosome wandern (Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethyleneimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297–7301 (1995); Haensler, J. & Szoka, F. C. J. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture. Bioconjug. Chem. 4, 372–379 (1993)). Da PrP^C zu PrP^Sc in Caveola-ähnliche Domänen (CLDs) oder Floße (Gorodinsky, A. & Harris, D. A. Glycolipid-anchored proteins in neuroblastoma cells from detergent-resistant complexes without caveolin. J. Cell Biol. 129, 619–627 (1995); Taraboulos, A., et al. Cholesterol depletion and modification of COOH-terminal targeting sequence of the prion protein inhibits formation of the scrapie isoform. J. Cell Biol. 129, 121–132 (1995); Vey, M., et al. Sucellular colocalization of the cellular and scrapie prio proteins in caveolae-like membranous domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14945–14949 (1996); Kaneko, K., et al. COOH-terminal sequence of the cellular prion protein directs subcellular trafficking and controls conversion into the scrapie isoform. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2333–2338 (1997)) umgewandelt und dann durch den endozytischen Weg verinnerlicht wird (Caughey, B., Raymond, G. J., Ernst, D. & Race, R. E. N-terminal truncation of the scrapie-associated form of PrP by lysosomal protease(s); implications regarding the site of conversion of PrP to the protease-resistant state. J. Virol. 65, 6597–6603 (1991); Borchelt, D. R., Taraboulos, A. & Prusiner, S. B. Evidence for synthesis of scrapie prion proteins in the endocytic pathway. J. Biol. Chem. 267, 16188–16199 (1992)), wurde gefolgert, dass Polyamine auf PrP^Sc in Endosomen oder Lysosomen wirken. Diese Folgerung wurde durch Bestimmen der Wirkung der Vorbehandlung mit den lysosomotropen Mitteln Chloroquin und NH₄Cl auf die Fähigkeit von Polyaminen zum Eliminieren von PrP^Sc untersucht. Diese lysosomotropen Mittel alkalisieren Endosome und weisen keine Wirkung auf PrP^Sc-Gehalte bei Verabreichung an ScN2a-Zellen auf (Taraboulos, A., Raeber, A. J., Borchelt, D. R., Serban, D. & Prusiner, S. B. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells. Mol. Biol. Cell 3, 851–863 (1992)). Erhaltene Versuchsergebnisse zeigen, dass 100 μM Chloroquin, jedoch nicht 30 μM NH₄Cl die Fähigkeit von PEI zum Eliminieren von PrP^Sc blockierten. Ähnliche Ergebnisse wurden mit SuperFect und PAMAM, Generation 4,0, erhalten. Obwohl das Versagen von NH₄Cl beim Beeinflussen von PrP^Sc-Gehalten nicht leicht zu erklären ist, stimmt die Fähigkeit von Chloroquin zum Abschwächen der Fähigkeit von verzweigten Polyaminen zum Entfernen von PrP^Sc mit der Ansicht überein, dass diese Mittel in Endosomen oder Lysosomen wirken.
ORGANHOMOGENAT-TEST
Die vorstehenden Ergebnisse mit Zellkulturen veranlassten das Untersuchen der Möglichkeit, dass in einer sauren Umgebung verzweigte Polyamine entweder durch indirektes Wechselwirken mit PrP^Sc oder mit einem anderen Zellbestandteil verursachen könnten, dass PrP^Sc für im Endosom/Lysosom vorliegende Hydrolasen empfänglich ist. Ein Zersetzungstest in vitro wurde entwickelt, um die Wirkung des pH-Werts auf die Fähigkeit von Polyaminen zum Empfindlichmachen von PrP^Sc für Protease zu bewerten. Rohe Homogenate von mit Traberkrankheit infiziertem Mäusegehirn wurden mit einem breiten Bereich an pH-Werten in Gegenwart oder Abwesenheit von SuperFect in Kontakt gebracht und dann vor dem Western-Blotten mit Proteinase K behandelt. Während PrP^Sc für Proteasehydrolyse innerhalb des pH-Bereichs (3,6–9,6) in Abwesenheit von SuperFect resistent blieb, verursachte die Zugabe des verzweigten Polyamins bei einem pH-Wert von 4,0 oder darunter, dass PrP^Sc nahezu vollständig durch Protease zersetzt wurde.
Eine Polyaminzugabe zeigte eine drastische Wirkung auf die Beseitigung in vitro, die bei einem pH-Wert von 4 oder weniger optimiert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass Polyamine auf PrP^Sc in einer sauren Abteilung wirken. Zum Bestätigen dessen, dass der Zersetzungstest in vitro ein gültiger Abgleich an den Mechanismus ist, durch welchen verzweigte Polyamine die Beseitigung von PrP^Sc aus gezüchteten Zellen verbessern, wurde eine Strukturaktivitätsanalyse mit mehreren der in Kulturzellen getesteten Verbindungen durchgeführt. Eine ausgezeichnete Übereinstimmung wurde zwischen der Beseitigung von PrP^Sc in gezüchteten ScN2a-Zellen (Tabelle 1) und der Fähigkeit, PrP^Sc für Protease bei saurem pH-Wert in vitro empfänglich zu machen, gefunden. Bemerkenswerterweise versagte PAMAM-OH, Generation 4,0, beim Empfänglichmachen von PrP^Sc für Protease, wohingegen PAMAM, Generation 4,0, und PPI, Generation 4,0, wie aus ihrer beobachteten Leistungsstärke in gezüchteten ScN2a-Zellen erwartet, eine noch stärkere Aktivität als SuperFect in vitro zeigte (Tabelle 1).
WIRKUNGSMECHANISMUS
Wenn ein pH-Wert von 4,0 oder weniger beibehalten wurde, zeigen die Ergebnisse, dass bestimmte verzweigte Polyamine die schnelle Eliminierung von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen in dosis- und zeitabhängiger Weise verursachen. Diese Verbindungen zeigen eine leistungsstarke Fähigkeit zum Entfernen von Prionen aus gezüchteten Zellen bei Konzentrationen, die völlig nicht-toxisch sind. Die Zellen können unbegrenzt in Gegenwart von therapeutischen Gehalten von verzweigten Polyaminen in Kultur gehalten werden. Weiterhin wurde, als ScN2a-Zellen mit diesen Verbindungen für eine Dauer von ungefähr einer Woche in Kontakt waren, PrP^Sc auf nicht nachweisbare Gehalte reduziert und blieb so für eine Dauer von mindestens einem Monat nach Entfernen des Polyamins.
Eine Klärung des genauen Mechanismus der PrP^Sc-Eliminierung durch verzweigte Polyamine ist eine wichtige Aufgabe. Obwohl eine Anzahl an möglichen Szenarien vorliegt, können mehrere Möglichkeiten schon ausgeschlossen werden. Eine Möglichkeit, die eliminiert wurde, war, dass Polyamine durch Induktion von Chaperonen wie Wärmeschockproteinen wirken, die eine Neubildung eines Prionprotein vermitteln, da die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich war, das Phänomen in vitro zu reproduzieren. Weiterhin scheinen Polyamine Vorteile gegenüber anderen möglichen Therapeutika, die danach streben, die Neubildung zu unterstützen, zu bieten: Bei sehr hohen Konzentrationen wirken Dimethylsulfoxide (DMSO) und Glycerin als direkte „chemische Chaperone" und hemmen die Bildung von neuem PrP^Sc (Tatzelt, J., Prusiner, S. B. & Welch, W. J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein. EMBO J., 15, 6363–6373 (1996)), jedoch können diese Verbindungen die schon existierenden PrP^Sc-Gehalte nicht reduzieren. Weiterhin hemmen Polyamine die PrP^Sc-Bildung bei viel geringeren Konzentrationen als diese Mittel. Die Fähigkeit von Polyaminen zum Bewirken von schneller Beseitigung von PrP^Sc steht auch im Gegensatz zu der Aktivität von anderen möglichen Prion-Therapeutika. Sulfatierte Polyanionen können die PrP^Sc-Anhäufung in ScN2a-Zellen durch direktes Binden an PrP^C hemmen (Gabizon, R., Meiner, Z., Halimi, M. & Ben-Sasson, S. A. Heparin-like molecules bind differentially to prion-proteins and change their intracellular metabolic fate. J. Cell. Physiol. 157, (1993); Caughey, B., Brown, K., Raymond, G. J., Katzenstein, G. E. & Thresher, W. Binding of the protease-sensitive form of PrP (prion protein) to sulfated glycosaminoglycan and Congo red. J. Virol. 68, 2135–2141 (1991)), da jedoch verzweigte Polyamine zum Beseitigen von schon existierendem PrP^Sc fähig sind, kann der Wirkungsmechanismus einfach das Binden an PrP^Sc und Hemmen von neuen Synthesen beinhalten.
Ein anderer möglicher Mechanismus, der ausgeschlossen werden kann, ist der Endosomalbruch. Die verzweigten Polyamine, die beim Beseitigen von PrP^Sc aus ScN2a-Zellen in unseren Versuchen wirksam waren, PEI und SuperFect und PAMAM, sind auch leistungsfähige lysosomotrope, osmotische Mittel, die in sauren Umgebungen quellen und Endosome brechen können (Boussif O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethyleneimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297–7301 (1995); Haensler, J. & Szoka, F. C. J. Polyamidoamine cascade polymers mediate efficient transfection of cells in culture. Bioconjug. Chem. 4, 372–379 (1993)). Dies könnte nahe legen, dass verzweigte Polyamine PrP^Sc aus ScN2a-Zellen durch Aufbrechen von Endosomen und Inkontaktbringen von PrP^Sc mit zytosolen Zersetzungsverfahren beseitigen. Jedoch ist es bekannt, dass die lysosomotropen Endosomaufbrechenden Mittel NH₄Cl, Chlorochin und Monensin die Bildung von PrP^Sc in ScN2a-Zellen nicht stören (Taraboulos, A., Raeber, A. J., Borchelt, D. R., Serban, D. & Prusiner, S. B. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells. Mol. Biol. Cell 3, 851–863 (1992)). Weiterhin zeigen die Ergebnisse auf, dass Chlorochin die Fähigkeit von verzweigten Polyaminen zum Beseitigen von PrP^Sc stört und dass Polyamine PrP^Sc in vitro bei saurem pH-Wert in Abwesenheit von Zellmembranen beseitigen können. Zusammen schließen diese Beobachtungen einen Endosomalbruch als den Mechanismus, durch welchen verzweigte Polyamine PrP^Sc entfernen, aus.
Ohne sich auf einen beliebigen besonderen Wirkungsmechanismus festzulegen, scheint es wahrscheinlich, dass verzweigte Polyamine die saure Umgebung von intakten Endosomen oder Lysosomen zum Zerstören von PrP^Sc erfordern. Das Struktur-Aktivitätsprofil von getesteten Polymeren zeigt, dass die meisten aktiven Verbindungen dicht gepackte, regulär beabstandete Aminogruppen besitzen, was nahe legt, dass diese Verbindungen an einen Liganden binden können, der periodisch beabstandete negative Ladungen enthält. Mehrere Szenarien können möglich sein: (1) Verzweigte Polyamine können direkt an PrP^Sc, angeordnet als Amyloid mit freigelegten negativ geladenen Einheiten binden und eine konformative Änderung unter sauren Bedingungen induzieren. (2) Die Behandlung von PrP 27–30 mit Säure vermindert die Trübung und erhöht den a-helikalen Gehalt, was nahe legt, dass solche Bedingungen PrP^Sc in Monomere dissoziieren könnte (Safar, J., Roller, P. P., Gajdusek, D. C. & Gibbs, C. J., Jr. Scrapie amyloid (prion) protein has the conformational characteristics of an aggregated molten globule folding intermediate). Es ist deshalb möglich, dass sich Polyamine an eine im Gleichgewicht entfaltende Zwischenverbindung von PrP^Sc, die unter sauren Bedingungen vorliegt, binden. (3) Alternativ dazu könnten Polyamine einen kryptischen, negativ geladenen Bestandteil, der an PrP^Sc gebunden ist, maskieren, was für die Proteaseresistenz wesentlich ist, der jedoch nur freigesetzt wird, wenn PrP^Sc sich einer säureinduzierten Konformationsänderung unterzieht. Ein solcher Bestandteil könnte innerhalb der Endosome oder Lysosome als Chaperon für PrP^Sc wirken. (4) Schließlich ist es eine andere Möglichkeit, dass Polyamine einen endosomalen oder lysosomalen Faktor aktivieren, der eine Konformationsänderung in PrP^Sc induzieren kann. Offensichtlich sind mehr Arbeiten erforderlich, um den genauen Mechanismus zu bestimmen, durch welchen verzweigte Polyamine PrP^Sc zerstören.
ALLGEMEINE TESTANWENDBARKEIT
Der hier beschriebene In-vitro-Test ist bei der Suche nach Verbindungen, die konformativ abgewandelte Proteine, die in Nahrungsmitteln vorliegen, effizient besei tigen, allgemein anwendbar, wodurch eine Anzahl von degenerativen Erkrankungen verhindert wird, in welchen die Anhäufungen von Proteinen die Pathogenese dieser Krankheiten zu vermitteln scheinen. Durch Simulieren von Lysosomen, in welchen Proteasen Proteine unter sauren Bedingungen hydrolysieren, kann der Gehirnhomogenat-Test in vitro die Effizienz einer Vielzahl von Polyaminen zum Induzieren der Zersetzung von PrP^Sc schnell bewerten.
Der In-vitro-Test, der mit Traberkrankheit infiziertes Gehirngewebe zum Testen für Verbindungen verwendet, die PrP^Sc beseitigen, könnte modifiziert werden, um Verbindungen zu testen, die ein beliebiges konformativ abgewandeltes Protein beseitigen könnten. Der Test wird durch Homogenisieren des Organs oder Gewebes durchgeführt, in welchem das konformativ abgewandelte Protein in der höchsten Konzentration vorliegt. Der pH-Wert des Homogenats wird dann auf weniger als 5,0 und vorzugsweise 4,0 oder weniger reduziert. Zum Beispiel kann Bauchspeicheldrüsengewebe zur Herstellung eines Tests homogenisiert werden, um es auf Verbindungen zu testen, die mit Diabetes, Typ II, verbundenes Amylin zu beseitigen. Homogenisierte Niere könnte zum Testen für Verbindungen verwendet werden, die β₂-Mikroglobulin beseitigen, und homogenisiertes Herz- oder Gefäßgewebe könnte zum Testen von Verbindungen verwendet werden, die atriellen natriuretischen Faktor beseitigen. Der Fachmann kennt andere Organe und Gewebetypen, die zum Testen für andere Verbindungen, die andere konformativ abgewandelte Proteine beseitigen, homogenisiert werden können.
Neben der Verwendung des In-vitro-Tests zum Durchmustern auf leistungsstarke Arzneimittel stellen die durch den Test gefundenen Verbindungen wie verzweigte Polyamine ein neues Hilfsmittel zum Erklären der Umwandlung eines Proteins zu konformativ abgewandeltem Protein, z.B. PrP^C zu PrP^Sc, bereit. Der Mechanismus, durch welchen verzweigte Polyamine PrP^Sc für Proteolyse empfänglich machen, bleibt zu begründen. Ob die Wechselwirkung von verzweigten Polyaminen mit PrP^Sc umkehrbar ist, ist unbekannt. Zudem wissen wir nicht, ob verzweigte Polyamine PrP^Sc ohne nicht-umkehrbares Denaturieren des Proteins anlösen kön nen. Wie immer der Mechanismus ist, durch welchen verzweigte Polyamine mit PrP^Sc wechselwirken, ist es wahrscheinlich, dass er sich von demjenigen, der mit chaotropen sowie Denaturierungsmitteln und Lösungsmitteln gefunden wird, unterscheidet (Prusiner, S. B., Groth, D., Serban, A., Stahl, N. & Gabizon, R. Attempts to restore scrapie prion infectivity after exposure to protein denaturants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2793–2797 (1993)).
Unter Verwendung der hier beschriebenen und offenbarten Tests wurden bestimmte spezifische verzweigte Polyamine gefunden, die die Beseitigung von PrP^Sc aus gezüchteten Zellen unter nicht-zytotoxischen Bedingungen vermitteln. Diese Verbindungen bieten die faszinierende Möglichkeit, einem breiten Bereich an Nahrungsmittelprodukten mit niedrigem pH-Wert zugesetzt zu werden, um vorliegende konformativ abgewandelte Proteine zu neutralisieren. Da die gefundenen Verbindungen durch Stimulieren von normalen Zellwegen der Proteinzersetzung zum Zerstören von PrP^Sc wirken, wäre diese Verbindungsklasse auch wahrscheinlich bei der Behandlung von anderen degenerativen und erblichen Störungen von Wert, wo sich abnormal gefaltete, Wildtyp- oder Mutantproteine anhäufen. Ein solcher Zugang kann sich bei der Entwicklung eines wirksamen Therapeutikums für eine oder mehrere der üblichen degenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophischer lateraler Sklerose, frontotemporaler Demens, Diabetes mellitus im Einsatz bei Erwachsenen und den Amyloidosen auszeichnen (Beyreuther, K. & Masters, C. L. Serpents on the road to dementia and death. Accumulating evidence from several studies points to the normal function of presenilin I and suggests how the mutant protein contributes to deposition of amyloid plaques in Alzheimer's disease. Nature Medicine 3, 723–725 (1997); Masters, C. L. & Beyreuther, K. Alzheimer's disease. BMJ 316, 446–448 (1998); Selkoe, D. J. The cell biology of beta-amyloid precursor protein and presenilin in Alzheimer's disease. Trends in Cell Biol. 8, 447–453 (1998); Selkoe, D. J. Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's disease. Nature 399, A23–31 (1999); Wong, P. C., et al. An adverse property of a familial ALS-linked SOD1 mutation causes motor neuron disease characterized by vacuolar degeneration of mitochondria. Neuron 14, 1105–1116 (1995); Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M. & Goedert, M. a-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6469–6473 (1998); Hutton, M., et al. Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature 393, 702–705 (1998); Stone, M. J. Amyloidosis: a final common pathway for protein deposition in tissues. Blood 75, 531–545 (1990)). Ob verzweigte Polyamine sich auch in einer Vielzahl an erblichen Störungen als wirksam erweisen, wo die Anhäufung von abnormalen Proteinen ein Markenzeichen der Krankheit ist, bleibt zu begründen. Diese genetischen Krankheiten schließen erbliche Formen von Prionkrankheit, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophischer lateraler Sklerose, frontotemporaler Demens, Pick'-Krankheit und Amyloidosen sowie die Triplet-Wiederholungskrankheiten, einschließlich Huntington-Krankheit, spinalzerebraler Ataxias und myotonischer Dystrophie ein (Fu, Y.–H., et al. An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy. Science 255, 1256–1259 (1992); Group, T.H.s.D.C.R. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell 72, 971–983 (1993)). Verbindungen, die durch die vorstehend beschriebenen Tests identifiziert wurden, wie verzweigte Polyamine, finden bei der Verhütung oder Verzögerung des Einsatzes dieser genetischen Krankheiten, in welchen Träger häufig identifiziert sind, beim Fortschreiten von nachweisbarer neurologischer oder systernischer Dysfunktion seit Jahrzehnten Anwendung.
Es wurde überraschend gefunden, dass mehrere dendritische Polykationen, einschließlich der sich sternenförmig ausbreitende Dendrimer Superfect^TM (QIAGEN^®, Valencia, CA), Polyamidoamid (PAMAM) und die hyperverzweigten Polykation-Polyethylenimine (PEI) PrP^Sc aus gezüchteten, mit Traberkrankheit infizierten Neuroblastom-Zellen eliminieren. Diese hoch verzweigten polykationischen Verbindungen stellen eine neue Klasse an therapeutischen Mitteln zum Bekämpfen von Prionerkrankungen und anderen degenerativen Krankheiten, ein schließlich der Amyloidosen ein. Die Entfernung von PrP^Sc hängt sowohl von der Konzentration des dendritischen Polymers als auch der Kontaktzeit ab. Dendritische Polymere konnten PrP^Sc mit Konzentrationen beseitigen, die nicht-toxisch waren. Wiederholte Einwirkungen von wärmezersetzten sich sternenförmig ausbreitenden PAMAM-Dendrimern oder PEI verursachten eine drastische Reduktion in den PrP^Sc-Gehalten, die für eine Dauer von einem Monat sogar nach Entfernung der Verbindung anhielt. Dendritische Polykationen schienen gereinigtes PrP^Sc in vitro nicht zu zerstören und können deshalb durch einen verallgemeinerten Mechanismus wirken. Dendritische Polykationen stellen eine Verbindungsklasse dar, die als therapeutische Mittel in Prionkrankheiten und anderen Störungen, die unlösliche Proteinablagerungen, beinhalten, wie die Amyloidosen, verwendet werden können.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind dargelegt, damit dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dessen bereitgestellt wird, wie die vorliegende Erfindung durchzuführen und zu verwenden ist, und sollen den Umfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, weder beschränken, noch sollen sie vorgeben, dass es sich bei den nachstehenden Versuchen um alle Versuche oder die einzigen durchgeführten Versuche handelt. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, ist Molekulargewicht Gewichtsmittel des Molekulargewichts, liegt die Temperatur in Grad Celsius vor und liegt der Druck bei oder nahe Atmosphärendruck.
VERFAHREN UND MATERIALIEN
Alle Verbindungen wurden von Sigma-Aldrich erworben. Alle Testverbindungen wurden in Wasser bei einer Stammkonzentration von 3 mg/ml gelöst und durch einen Milliporen-Filter mit 0,22 mm filtriert.
Gezüchtete Zellen. Stammzellen von ScN2a-Zellen wurden in MEM mit 10% FBS, 10% Glutamax (Gibco BRL), 100 U Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin (ergänztes DME) aufbewahrt. Unmittelbar vor der Zugabe der Testverbindungen wurden die Platten zweimal mit frisch ergänztem DME-Medium gewaschen. Nach dem Kontakt mit den Testverbindungen wurde das Medium von den Platten abgezogen und die Zellen durch Lyse in 0,25–1 ml 20 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 100 mM NaCl, 0,5% NP-40 und 0,5% Natriumdeoxycholat, geerntet, um eine Gesamtproteinkonzentration von 1 mg/ml, gemessen durch den BCA-Test, zu erhalten. Die Keime wurden aus dem Lysat durch Zentrifugation mit 2000 UpM für eine Dauer von 5 Minuten entfernt. Für Proben, die nicht mit Proteinase K behandelt wurden, wurden 40 μl des gesamten Lysats (darstellend 40 μg Gesamtprotein) mit einem gleichen Volumen an zweimal SDS-reduzierendem Probenpuffer gemischt. Für den Proteinase-K-Aufschluss wurden 20 μg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim) (Gesamtprotein-zu-Enzymverhältnis = 50:1) zugesetzt, und die Probe wurde für eine Dauer von 1 Std. bei 37°C inkubiert. Der proteolytische Aufschluss wurde durch die Zugabe von Pefabloc auf eine Endkonzentration von 5 mM beendet. Proben mit 1 ml wurden bei 100.000 × g für eine Dauer von 1 Std. bei 4°C zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen, und die Pellets wurden in 80 μl reduzierenden SDS-Probenpuffer für SDS-PAGE resuspendiert.
Gehirnhomogenate. Gehirnhomogenate von mit RML-Traberkrankheit infizierten CD-1-Mäusen (10% (G/V) in sterilem Wasser) wurden durch wiederholte Extrusion durch Spritzennadeln von nacheinander kleiner werdender Größe von 18 bis 22 Gauge hergestellt. Keime und Debris wurden durch Zentrifugation mit 1000 × g für eine Dauer von 5 Minuten entfernt. Der Bicinchnoninsäure-(BCA)-Proteintest (Pierce) wurde zum Bestimmen der Proteinkonzentration verwendet. Homogenate wurden auf 1 mg/ml Protein in 1%igem NP-40 eingestellt. Für die Reaktionen wurden 0,5 ml Homogenat mit 25 ml 1,0 M-Puffer (Natriumacetat für pH 3–6 und Tris-Acetat für pH 7–10) plus oder minus 10 ml Polyaminstammlösung (3 mg/ml) für eine Dauer von 2 Std. bei 37°C unter konstantem Schütteln inkubiert. Der End-pH-Wert jeder Probe wurde direkt mit einer kalibrierenden pH-Elektrode (Radiometer Kopenhagen) gemessen. Nach der Inkubation wurde jede Probe mit einem gleichen Volumen an 0,2 M HEPES, pH 7,5, enthaltend 0,3 M NaCl und 4% Sarkosyl, neutralisiert. Proteinase K wurde zugesetzt, um eine Endkonzentration von 20 μg/ml zu erzielen, und die Proben wurden für eine Dauer von 1 Std. bei 37°C inkubiert. Proteolytischer Aufschluss wurde durch die Zugabe von Pefabloc auf eine Endkonzentration von 5 μM terminiert. 10 μl aufgeschlossenes Gehirnhomogenat wurden mit einem gleichen Volumen an 2 × SDS-Probenpuffer gemischt und durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blotten analysiert.
Western-Blotten. Nach der Elektrophorese wurde ein Western-Blotten, wie früher beschrieben (Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell 59, 847–857 (1989)) durchgeführt. Proben wurden für eine Dauer von 5 Min. gekocht und durch Zentrifugation für eine Dauer von 1 Min. mit 14.000 UpM in einer Beckman-Ultrafuge geklärt. SDS-PAGE wurde in 1,5 mm 12%igen Polyacrylamidgelen (Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature 227, 680–685 (1970)) durchgeführt. Membrane wurden mit 5% nicht fettem Milchprotein in PBST (Calcium- und Magnesium-freies PBS plus 0,1% Tween 20) für eine Dauer von 1 Std. bei Raumtemperatur blockiert. Die blockierten Membranen wurden mit primärem polyklonalem RO73-Antikörper (zum Nachweis von MoPrP) (Serban, D., Taraboulos, A., DeArmond, S. J. & Prusiner, S. B. Rapid detection of Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prion proteins. Neurology 40, 110–117 (1990)) oder monoklonalem 3F4-Antikörper (zum Nachweis von MHM2 PrP) (Kascsak, R. J., et al. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins. J. Virol. 61, 3688–3693 (1987)) mit einer Verdünnung von 1:5000 in PBST über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation mit primärem Antikörper wurden die Membranen 3 × 10 Minuten in PBST gewaschen, mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem sekundärem Antikörper (Amersham Life Sciences), verdünnt auf 1:5000 in PBST, für eine Dauer von 30 bis 60 Min. bei 4°C inkubiert und wieder für eine Dauer von 3 × 10 Minuten in PBST gewaschen. Nach Chemolumineszenzentwicklung mit ECL-Reagenz (Amersham) für eine Dauer von 1 Minute wurden die Blots in Kunststoffabdeckungen verschlossen und mit einem ECL-Hypermaxfilm (Amersham) in Kontakt begracht. Die Filme wurden automatisch in einem Konica-Filmentwickler entwickelt.
BEISPIEL 1
Die hier bereitgestellten Ergebnisse zeigen, dass saure Bedingungen (< pH 5) die Fähigkeit von Detergenzien (z.B. SDS) zum Denaturieren von PrP^Sc und Zerstören von Prioneninfektiösität verbessern. Spezifische Ergebnisse zeigen, dass saure Bedingungen verwendet werden können, um wirksame Prionendesinfektionsmittel, die die Wichtigkeit von sauren Bedingungen betonen, zu formulieren.
DIE WIRKSAMKEIT VON 1% SDS ALS pH 3,4 ZUM ELIMINIEREN VON PrP^Sc NACH 5 MINUTEN ODER 2 STUNDEN
Ein 2%-iges Homogenat von mit Traberkrankheit infiziertem Sc237-Gehirn in Wasser wurde durch wiederholte Extrusion durch eine Nadel mit 22 G hergestellt. Die Keime wurden durch Zentrifugation für eine Dauer von 5 Minuten bei 1000 UpM entfernt. Das geklärte Homogenat wurde auf das Zweifache verdünnt und für eine Dauer von 2 Std. (obere Platte von 2A) oder 5 Minuten (Bodenplatte von 2B) bei 37°C unter den folgenden Bedingungen inkubiert:

1. 1% NP40, 50 mM Natriumacetat pH 7,0
2. 1% NP40, 0,5% Essigsäure pH 3,4
3. 1% SDS, 50 mM Natriumacetat pH 7,0
4. 1% SDS, 0,5% Essigsäure pH 3,4
5. 1% Sarkosyl, 50 mM Natriumacetat pH 7,0
6. 1% Sarkosyl, 0,5% Essigsäure pH 3,4

Plus- (+)-Banden weisen auf Proben hin, die einer begrenzten Proteolyse mit 20 μg/ml Proteinase K für eine Dauer von 1 Std bei 37°C unterzogen wurden. Minus- (–)-Banden weisen auf Proben hin, die keiner Proteolyse unterzogen wurden. Alle Proben wurden in SDS-Probenpuffer für eine Dauer von 5 Min. vor der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekocht. Nach der Überführung auf eine Milliporen-Immobilon-Überführungsmembran wurde die Entwicklung des Immunoblots mit d13-primären Fab durchgeführt.
DIE WIRKUNG VON TEMPERATUR AUF DIE FÄHIGKEIT VON 1%IGEM SDS BEI pH 3,4 ZUM ELIMINIEREN VON PrP^Sc
Ein 2%iges Homogenat von mit Traberkrankheit infiziertem Sc237-Gehirn in Wasser wurde durch wiederholte Extrusion durch eine Nadel mit 22 G hergestellt. Die Keime wurden durch Zentrifugation für eine Dauer von 5 Min. mit 1000 UpM entfernt. Das geklärte Homogenat wurde auf das Zweifache verdünnt und für eine Dauer von 5 Minuten unter den folgenden Bedingungen inkubiert:

1. 1% SDS, 0,5% Essigsäure pH 3,4 bei 4°C
2. 1% NP40, 0,5% Essigsäure pH 3,4 bei 20°C
3. 1% SDS, 0,5% Essigsäure pH 3,4 bei 37°C
4. 1% NP40, 0,5% Essigsäure pH 3,4 bei 20°C

Plus- (+)-Banden von 3 weisen auf Proben hin, die einer begrenzten Proteolyse mit 20 μg/ml Proteinase K für eine Dauer von 1 Std. bei 37°C unterzogen wurden. Minus- (–)-Banden weisen auf Proben hin, die keiner Proteolyse unterzogen wurden. Alle Proben wurden in SDS-Probenpuffer für eine Dauer von 5 Min. vor der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekocht. Nach der Überführung auf eine Milliporen-Immobilon-Überführungsmembran wurde die Entwicklung des Immunoblots mit d13-primären Fab durchgeführt.
BEISPIEL 2
SDS/ESSIGSÄURE-FORMULIERUNG
Proben von 1%igem Syrischem-Hamster-Gehirnhomogenat, enthaltend 10⁷ LD₅₀-Einheiten Prioninfektiösität/ml wurden mit entweder 50 mM Tris-Acetat, pH 7,0, oder 0,5%iger Essigsäure in Gegenwart entweder von 1%igem NP-40 oder 1%igem SDS für eine Dauer von 2 Std. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde jede Probe intrazerebral in 8 getrennte Syrische Hamster für einen Traberkrankheit-Inkubationszeittest eingeimpft. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt:

Probe LD₅₀/ml

1% NP40, 50 mM Tris-Acetat pH 7,0 10⁷

1% NP40, 5% Essigsäure, pH 3,6 10⁷

1% SDS, 50 mM Tris-Acetat pH 7,0 10⁵

1% SDS, 5% Essigsäure, pH 3,6 < 10²
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine Formulierung, zusammengesetzt aus etwa 1% SDS und etwa 0,5% Essigsäure, beim Inaktivieren von Prionen wirksam ist. Eine solche Formulierung könnte aufgrund der leichten Verfügbarkeit sowohl der Essigsäure als auch von SDS eine äußerst wertvolle kommerzielle Formulierung bereitstellen. Jedoch erkennt der Fachmann, dass andere wirksame Säuren und wirksame Detergenzien mit einer SDS-ähnlichen Struktur formuliert werden könnten, um dieselben oder ähnliche Ergebnisse zu erhalten. In Bezug auf den Säurebestandteil, der zum Bilden einer Formulierung wichtig ist, die den pH-Wert der Formulierung sauer hält und vorzugsweise unter 4,0 hält. Die Detergens-Zusammensetzung muss nicht SDS sein. Zum Beispiel könnte der Natriumbestandteil ein beliebiges Kation wie Calcium, Lithium, Kalium, Magnesium usw. sein. Ferner könnte der Sulfatbestandteil mit chemisch äquivalenten Einheiten substituiert sein. Natriumdodecylsulfat schließt einen Kohlenwasserstoff-Bestandteil mit 11 CH₂-Gruppen, terminiert durch eine CH₃-Gruppe, ein. Ver schiedene andere Alkylgruppen, wie andere geradkettige, verzweigte oder cyclische Gruppen, könnten verwendet werden. Die Alkyleinheit könnte 2 bis 40 Kohlenstoffatome enthalten und enthält vorzugsweise etwa 12 Kohlenstoffatome ± 6 Kohlenstoffatome. Die Formulierung kann geeigneten Lösungsmitteln in geeigneten Konzentrationen zugesetzt werden. Ferner kann die Konzentration der Formulierung unmittelbar vor der Verwendung verändert werden und folglich mit einer hochkonzentrierten Formulierung oder in einer Fertigkonzentration ohne Verdünnung mit einem Lösungsmittel wie Wasser oder Alkohol vertrieben werden. Noch weiter können, wie vorstehend angegeben, die Formulierungen der Erfindung mit geeigneten antibakteriellen und/oder antiviralen Bestandteilen sowie Bestandteilen, die andere Pathogene, einschließlich Parasiten inaktivieren, so ergänzt werden, dass die Endformulierung beim Abtöten oder Inaktivieren eines breiten Bereichs an infektiösen Komponenten wirksam ist.
BEISPIEL 3
WIRKUNG VON DETERGENS UND pH-WERT AUF PROTEASERESISTENTES PrP^Sc
Proben von 1%igem Sc237-infiziertem SHa-Gehirnhomogenat wurden für eine Dauer von 15 Min. bei 37°C mit einem Detergens bei einem wie angegebenen pH-Bereich inkubiert. 50 millimolare Natriumacetatpuffer wurden zum Beibehalten der pH-Werte 3–6 und 50 mM Tris-Acetatpuffer zum Beibehalten der pH-Werte 7–10 verwendet. Der End-pH-Wert jeder Probe, die die vorstehenden Banden anzeigt, wurde direkt mit einer kalibrierten pH-Elektrode (Radiometer Kopenhagen) gemessen. Alle Proben wurden durch Zugabe von gleichem Volumen 4%-igem Sarkosyl, 100 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM NaCl neutralisiert und einer beschränkten Proteolyse mit 20 μg/ml Proteinase K für eine Dauer von 1 Std. bei 37°C unterzogen. Scheinbare Molekulargewichte auf der Basis der Migration von Proteinstandards betragen 30 und 27 kDa. Alle Proben wurden durch Zugabe von gleichem Volumen 4%igem Sarkosyl, 100 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM NaCl neutralisiert. Ein Minus- (–)-Symbol gibt eine unaufgeschlossene Kontroll probe an und Plus- (+)-Symbol bezeichnet eine Probe, die einer beschränkten Proteolyse mit 20 μg/ml Proteinase K für eine Dauer von 1 Std. bei 37°C unterzogen wurde. Scheinbare Molekulargewichte auf der Basis der Migration von Proteinstandards betragen 30 und 27 kDa. 3 zeigt, dass SDS PrP^Sc bei pH < 5 oder pH ≥ 10 denaturiert.
BEISPIEL 4
CHARAKTERISIERUNG VON PrP^Sc DENATURIERUNG, VERMITTELT DURCH SAURES SDS
Proben von 1%igem Sc237-infiziertem SHa-Gehirnhomogenat wurden für eine Dauer von 15 Min. bei 37°C in 1%-igem SDS plus (1) 50 mM Tris-Acetat, pH 7,0, (2) 50 mM Natriumacetat, pH 3,6, (3) 50 mM Glycin, pH 3,7 und (4) 0,2% Peressigsäure, pH 3,4 inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein gleiches Volumen an 4%igem Sarkosyl, 100 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM NaCl zum Neutralisieren jeder Probe zugesetzt. Ein Minus- (–)-Symbol gibt eine unaufgeschlossene Kontrollprobe an und ein Plus- (+)-Symbol bezeichnet eine Probe, die einer beschränkten Proteolyse mit 20 μg/ml Proteinase K für eine Dauer von 1 Std. bei 37°C unterzogen wurde. Scheinbare Molekulargewichte auf der Basis der Migration von Proteinstandards betragen 30 und 27 kDa. 4 zeigt, dass SDS PrP^Sc unter sauren Bedingungen in verschiedenen sauren Puffern, einschließlich Peressigsäure (ein üblicherweise verwendetes Krankenhaus-Desinfektionsmittel), denaturiert.

Claims

Verfahren zum Behandeln eines Materials, um infektiöse Prionen zu inaktivieren, umfassend die Schritte: Inkontaktbringen des Materials mit einer Zusammensetzung, umfassend: ein Lösungsmittel einen Säurebestandteil, gekennzeichnet durch eine und vorliegend in einer Molarität, bei welcher der pH-Wert der Zusammensetzung in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, und ein Detergens, ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdodecylsulfat, Kaliumdodecylsulfat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Octylglucosid, Dodecyldimethylaminoxid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether, und Inkontaktlassen der Zusammensetzung mit dem Material, das die Infektiösität der infektiösen Prionen eliminiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus Wasser, Alkohol und einem Gemisch davon.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Säurebestandteil ausgewählt ist aus Essigsäure und Peressigsäure.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Säurebestandteil ausgewählt ist aus Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure und einer Carbonsäure und wobei das Detergens durch Reduzieren der Infektiösität der infektiösen Prionen gekennzeichnet ist, wenn die Zusammensetzung mit den infektiö sen Prionen über eine Dauer von einer Stunde oder weniger bei einer Temperatur von 40°C oder weniger bei einem Druck von einer Atmosphäre in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus Wasser, Alkohol und einem Gemisch davon, das in einer Menge von 1 bis 99 Gew.-% vorliegt, und wobei das Detergens in einer Menge von 0,001 bis 10 Gew.-% vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung ferner Folgendes umfasst: eine antibakterielle Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%, eine antivirale Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-% und eine fungizide Verbindung in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-%.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Material ausgewählt ist aus einer pharmazeutischen Gelkapsel, einer gelbeschichteten Tablette, einem Blutstreckmittel oder einer Blutersatzlösung, einem chirurgischen Implantat, einer Bandage, einem Zahnimplantat, einem Dentaltupfer, einem chirurgischen Tupfer, einem Gelatine enthaltenden Bonbon, einem Marshmallow, Doughnutglasur, Fruchtsaft, Wein, Bier, saurer Sahne, Yoghurt, Hüttenkäse, Eiscreme, Margarine und Kaugummi.
Verfahren zum Formen einer Gelatinekapsel, umfassend Extrahieren von Hufen von Huftieren, Behandeln der Hufe so, dass ein Gelatinematerial gebildet wird, Behandeln der Gelatine mit einer Säure eines solchen Typs und in einer solchen Menge, dass der pH-Wert der Gelatine 4,0 oder weniger beträgt, Zugabe zur Gelatine eines Detergenzes, ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdodecylsulfat, Kaliumdodecylsulfat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Octylglucosid, Dodecyldimethylaminoxid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether, das die Infektiösität von infektiösen Prionen eliminiert.
Gelatinekapsel, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 9.
Gelatinekapsel nach Anspruch 10, die darin eine Verbindung, ausgewählt aus einem pharmazeutisch aktiven Arzneimittel, einem Vitamin und einem Nährstoff, aufweist.
Verfahren zum Sterilisieren eines Gegenstands, umfassend den Schritt Inkontaktbringen des Gegenstands mit einer antiseptischen Zusammensetzung, zusammengesetzt aus einem Lösungsmittel einem Säurebestandteil, gekennzeichnet durch eine und vorliegend in einer Molarität, bei welcher der pH-Wert der Zusammensetzung in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, und einem Detergens, ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdodecylsulfat, Kaliumdodecylsulfat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Octylglucosid, Dodecyldimethylaminoxid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat (CHAPS), Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether, das die Infektiösität der infektiösen Prionen eliminiert.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Gegenstand ausgewählt ist aus einem chirurgischen Instrument, einem diagnostischen Instrument, einem Kolonoskop, einem Sigmoidoskop, einem Bronchoskop, einem Gastroskop, einem Dentalinstrument, einem Katheter, einem Operationssaal, einer Zellkultur, einer Chromatografiesäule und einem von einer Kuh erhaltenen Gelatinematerial.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Säurebestandteil ausgewählt ist aus Essigsäure und Peressigsäure.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.
Verfahren zum Herstellen eines pharmazeutisch aktiven Proteins in steriler Form, umfassend Züchten von Zellen, die zum Exprimieren eines Proteins von Interesse bestimmt sind, Extrahieren des Proteins von Interesse und Inkontaktbringen des Proteins von Interesse mit einer antiseptischen Zusammensetzung, umfassend ein Lösungsmittel einen Säurebestandteil, gekennzeichnet durch eine und vorliegend in einer Molarität, bei welcher der pH-Wert der Zusammensetzung in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, und ein Detergens, ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdodecylsulfat, Kaliumdodecylsulfat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Octylglucosid, Dodecyldimethylaminoxid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether, das die Infektiösität der infektiösen Prionen eliminiert.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das infektiöse Protein ein Prion ist.
Antiseptische Zusammensetzung, umfassend ein Lösungsmittel, ausgewählt aus Wasser, Alkohol und einem Gemisch davon in einer Menge von 1 bis 99,99 Gew.-%, einen Säurebestandteil, gekennzeichnet durch eine und vorliegend in einer Molarität, bei welcher der pH-Wert der Zusammensetzung in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, und ein Detergens, ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdodecylsulfat, Kaliumdodecylsulfat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Octylglucosid, Dodecyldimethylaminoxid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether, eine antibakterielle Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%, eine antivirale Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-% und eine fungizide Verbindung in einer Menge von 1 bis 20 Gew.-%.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei der Säurebestandteil von einem Typ, ausgewählt aus Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure und Carbonsäure, ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Lösungsmittel, einen Säurebestandteil, gekennzeichnet durch eine und vorliegend in einer Molarität, bei welcher der pH-Wert der Zusammensetzung in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, und ein Detergens, ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdodecylsulfat, Kaliumdodecylsulfat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Octylglucosid, Dodecyldimethylaminoxid, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Dodecyltriethylammoniumbromid (DTAB), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) und Polyoxyethylen-p-isooctylphenylether, eine antibakterielle Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%, zur Behandlung eines Materials zum Eliminieren der Infektösität von infektiösen Prionen.
Verfahren nach Anspruch 1, 9, 12 oder 16, wobei der Polyoxyethylen-p-isooctylether Triton X-20, Triton X-100 oder Triton X-114 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei der Polyoxyethylen-p-isooctylether Triton X-20, Triton X-100 oder Triton X-114 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der Polyoxyethylen-p-isooctylether Triton X-20, Triton X-100 oder Triton X-114 ist.