ES2237460T3 - Dispositivo de ensayo. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de ensayo para cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido, comprendiendo: una primera porción que comprende una zona de flujo lateral; una zona de recepción de muestra en la primera porción en contacto con la zona de flujo lateral; y una segunda porción que tiene medios para soportar una almohadilla absorbente, en donde la primera porción está dispuesta en relación deslizante con la segunda porción, de forma que la segunda porción es movible entre una primera posición en la que hay una holgura entre una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción y la zona de flujo lateral y una segunda posición en la que una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción está en contacto íntimo con la zona de flujo lateral y en donde la zona de flujo lateral comprende una cámara capilar plana.

Description

Dispositivo de ensayo.

La presente invención se refiere a un dispositivo adecuado para su uso en la realización de ensayos, por ejemplo ensayos inmunológicos y relacionados

Los ensayos, por ejemplo sobre muestras biológicas, pueden ser ensayos de ligamiento, por ejemplo ensayos sándwich o de ligamiento competitivo. Los ensayos de ligamiento pueden hacer uso de interacciones inmunológicas. Esos ensayos se conocen como ensayos inmunológicos y hacen uso de la alta especificidad y la alta afinidad de la interacción entre un anticuerpo u otra molécula de tipo inmunoglobulina y su antígeno objetivo.

Los ensayos de ligamiento, por ejemplo ensayos inmunológicos, pueden ser útiles en diagnosis médica. Las pruebas de diagnóstico mediante tales ensayos pueden realizarse en un laboratorio, consulta quirúrgica u hospital o en una instalación domiciliaria, bien por el paciente o por un médico. Los dispositivos adecuados para llevar a cabo pruebas de diagnóstico, particularmente aquéllas para su uso por personal médicamente no entrenado, por ejemplo pacientes, pueden proyectarse para dar un resultado visible. Estas pueden comprender un soporte, por ejemplo de nitrocelulosa, sobre el que puede tener lugar una interacción para facilitar el resultado visible. Otros dispositivos adecuados para llevar a cabo pruebas de diagnóstico pueden comprender una cámara de ensayo capilar formada entre un molde de plástico y un portaobjetos de microscopio. Éstas pueden requerir un microscopio u otro instrumento para determinar el resultado del ensayo.

Los ensayos pueden hacer uso de un protocolo de flujo lateral, por ejemplo en el que un material absorbente o no absorbente conduce líquido desde una porción del dispositivo a otra. Ejemplos de dispositivos de pruebas diagnósticas que usan ensayos, particularmente los que hacen uso de un protocolo de flujo lateral, se han descrito, por ejemplo, en US 5,770,460 y en US 4,943,522. Como se establece en US 4,943,522, un material absorbente puede ser capaz de adsorber o embeber uno o más componentes disueltos o dispersados de una muestra de líquido, mientras que un material no absorbente puede no adsorber así tales componentes, de forma que todos los componentes disueltos o dispersados del líquido se transportan en proporciones sustancialmente iguales y con flujo relativamente inalterado lateralmente a través de la membrana. Ejemplos de materiales absorbentes pueden incluir papel sin tratar, nitrocelulosa o nylon y otros materiales que pueden usarse en técnicas de separación cromatográfica.

El aparato descrito en US 4,943,522 comprende una membrana de flujo lateral no absorbente que tiene en su superficie una zona de aplicación de muestra al menos una zona indicadora a una distancia lateral de la zona de aplicación. La membrana puede estar comprendida entre dos láminas.

Un ejemplo adicional de un aparato adecuado para realizar ensayos inmunológicos se describe en US 4,883,760. Hace uso de tubos capilares y un soporte flexible que permite que el extremo del tubo capilar contacte con un material absorbente por aplicación de presión manual moderada sobre el soporte. Sin embargo, tal aplicación es costosa y sólo adecuada para producir un resultado apreciable a la vista.

Los dispositivos de prueba conocidos, por ejemplo los de los documentos citados, pueden ser desventajosos en términos de conveniencia, flexibilidad o exactitud al realizar ensayos complejos. Por ello, se necesita un dispositivo compacto que permita ensayos complejos, por ejemplo los que requieren incubación cronometrada o etapas de lavado, para ser reproducibles. Es un objeto de la presente invención proveer un dispositivo mejorado de ensayo.

La invención provee un dispositivo de ensayo para la cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido,

comprendiendo:

una primera porción comprendiendo

una zona de flujo lateral;

una zona de recepción de muestra en la primera porción en contacto con la zona de flujo lateral; y una segunda porción con medios para soportar una almohadilla absorbente, en donde la primera porción está dispuesta en relación deslizante respecto a la segunda porción de forma que la segunda porción es movible entre una primera posición en la cual hay una holgura entre una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción y la zona de flujo lateral y una segunda posición en la cual una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción está en íntimo contacto con la zona de flujo lateral y en donde la zona de flujo lateral comprende una cámara capilar plana.

Se apreciará que un dispositivo según la invención puede ser útil para realizar un ensayo en el que se detecte la unión de al menos una porción del analizado a un colaborador de unión para el analizado.

La zona de flujo lateral a través de la cámara capilar puede existir cuando el líquido se introduce en la zona de recepción de muestra.

La zona de flujo lateral puede formar o comprender una zona de ligamiento y/o detección. La zona de detección puede ser adecuada para que ocurra el ligamiento entre al menos una porción del analizado y un colaborador específico de unión para dicho analizado, y sea detectada. La zona de ligamiento puede ser adecuada para que ocurra el ligamiento entre al menos una porción del analizado y un colaborador específico de unión para dicho analizado; sin embargo, puede no ser adecuada para que dicho ligamiento sea detectado. La zona de ligamiento y/o detección comprende un reactivo de captura, como se indicará. Se apreciará que la zona de ligamiento puede ser adecuada para detección de tal ligamiento si el dispositivo se desmonta. Se prefiere que la zona de flujo lateral pueda formar o comprender una zona de detección.

Se prefiere que el dispositivo comprenda una placa sustancialmente plana. Se prefiere también que la placa sustancialmente plana forme una pared de o soporte para la zona de flujo lateral. Particularmente se prefiere que la placa sustancialmente plana forme una pared de una cámara capilar comprendida en la zona de flujo lateral.

Se prefiere que el flujo lateral a través de la zona de flujo lateral sea sustancialmente plano.

Se prefiere que la zona de detección y/o ligamiento sea sustancialmente plana. Como se discute más adelante, puede inmovilizarse más de una especie de reactivo de captura en la zona de detección o ligamiento. Se prefiere que todos esos reactivos de captura se inmovilicen en sustancialmente el mismo plano, y aún más preferentemente sustancialmente paralelo a dicha placa sustancialmente plana. Además se prefiere que los reactivos de captura puedan ser inmovilizados en la superficie de dicha placa plana que forma una pared de la cámara capilar. Ello puede ayudar a la detección o ligamiento de dicho reactivo de captura, particularmente cuando se usa un sistema automático de detección.

El dispositivo puede comprender una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción. Los medios para soportar la almohadilla absorbente pueden comprender medios dispuestos para agarrar la almohadilla absorbente, por ejemplo un dispositivo de presión. Alternativamente, el medio puede comprender una parte de la porción a la que la almohadilla puede adherirse, por ejemplo usando un adhesivo adecuado, como es bien conocido por los expertos en la materia.

Se prefiere que todos los componentes disueltos o dispersados de dicho ensayo o reacción de ligamiento (con la excepción del analizado o reactivo ligante al colaborador específico de unión, según proceda) fluyan a través del dispositivo a la zona absorbente a regímenes sustancialmente iguales. Así, en los términos resumidos anteriormente, se prefiere que el flujo lateral sea un flujo lateral no absorbente. Sin embargo, se apreciara que el flujo lateral puede ser flujo lateral absorbente.

Tal flujo no absorbente puede tener lugar si el flujo lateral tiene lugar a través de la cámara capilar, particularmente si las paredes de la cámara son de vidrio o de un material, por ejemplo de material plástico, que se moja por el agua por ejemplo tiene un ángulo de contacto con el agua de menos de 90º, como es conocido por los expertos en la técnica y discutido más adelante. Materiales de plástico adecuados son policarbonato y polímero estireno-acrilonitrilo (SAN). Se prefiere que el flujo lateral tenga lugar a través de la cámara capilar. Se apreciará que en tal realización no se requiere un soporte sólido a través del cual pueda tener lugar el flujo lateral.

De esta forma, el dispositivo puede comprender una cámara capilar, preferentemente una cámara capilar sustancialmente plana. Se prefiere que el flujo lateral a través de la zona de flujo lateral tenga lugar a través de dicha cámara capilar. La cámara capilar puede comprender la zona de detección y/o ligamiento. Preferentemente, la zona de detección y/o ligamiento no se extiende más allá de los límites de la cámara capilar.

La cámara capilar puede estar formada por la primera porción en cooperación con la placa sustancialmente plana. La primera porción puede formar una cámara capilar cuando se coloca directamente en contacto con dicha placa sustancialmente plana. Sin embargo, se apreciará que puede requerirse un espaciador, que puede estar en forma de estructura tipo pórtico, entre dicha placa plana y la primera porción, a fin de formar la cámara capilar. La cámara capilar puede tener una profundidad (por ejemplo distancia entre la placa sustancialmente plana y la parte de dicha porción que forma la cara de la cámara capilar que es sustancialmente paralela al plano de dicha placa) de entre 0,01 mm y 2 mm, preferentemente entre 0,01 mm y 1 mm, aún más preferentemente entre 0,05 mm y 1 mm, aún más preferentemente entre 0,1 mm y 0,5 mm.

Se apreciará que la profundidad debería ser tal que el líquido situado en el borde de la cámara capilar en la zona de recepción de muestra fluya a través de toda la cámara capilar. Se prefiere que el líquido que entre en la cámara capilar fluya sustancialmente en su totalidad en la almohadilla absorbente cuando (pero sólo cuando) la almohadilla absorbente está en contacto de flujo lateral con la cámara capilar, por ejemplo con un borde de la cámara capilar. Cuando hay una holgura entre la almohadilla absorbente y la zona de flujo lateral se apreciará que el líquido no fluye desde la zona de flujo lateral adentro de la almohadilla absorbente. Se apreciará que la profundidad requerida puede depender de la longitud entre bordes de la cámara capilar, la viscosidad del líquido y el ángulo de contacto del líquido a ensayar con la superficie de la cámara capilar (que depende a la vez de la tensión superficial del líquido y de la naturaleza de las superficies). Se apreciará que la profundidad apropiada puede determinarse rápidamente mediante una combinación particular de parámetros, por ejemplo mediante el uso de espaciadores de espesores diferentes para formar cámaras de diferentes profundidades. Los factores que afectan a la capilaridad se discuten por ejemplo en Remington: La Ciencia y Práctica de Farmacia, Edición 19ª, Mack Publishing Company 1995, particularmente en el Capítulo 19 del Volumen 1.

La profundidad de la cámara capilar puede no ser constante en toda su superficie. Por ejemplo, puede ser ventajoso que la profundidad de la cámara sea mayor en un borde de la cámara capilar adyacente o en contacto con la zona de recepción de muestra que en un borde de la cámara capilar que esté en contacto con la almohadilla absorbente. Ello puede ayudar al flujo del líquido a través de la cámara capilar. Puede hacer que la formación de burbujas en la cámara capilar sea menos probable y puede incluso ayudar al flujo de líquido a lo ancho de la cámara capilar.

Puede preferiblemente conseguirse el cambio de profundidad mediante una pendiente en la parte de dicha porción que forma una cara de la cámara capilar (formada en cooperación con la placa sustancialmente plana) Se apreciará que la elección de la pendiente puede requerir un compromiso. Un incremento en el grado de pendiente puede mejorar el flujo de líquido a través de la cámara capilar pero también aumenta el volumen de la cámara capilar (para una profundidad dada en el borde de la cámara capilar que entra en contacto con la almohadilla absorbente) y por ello el volumen de reactivos requerido. La pendiente puede estar preferentemente entre 0,1% y 5%, aún más preferentemente entre 1% y 3%, con mayor preferencia alrededor del 2% (expresado como caída (d) en porcentaje de la longitud (1), como se muestra en la Figura 7).

La profundidad preferida en el borde de la cámara capilar que entra en contacto con la almohadilla absorbente está entre 0,01 mm y 2 mm, preferentemente entre 0,01 mm y 1 mm, aún más preferentemente entre 0,05 mm y 1 mm, aún más preferentemente entre 0,1 mm y 0,5 mm. Se apreciará que la primera porción puede comprender una parte para formar una pared de la cámara capilar que está hecha de o revestida con un material diferente al de otras partes de la primera porción. Por ejemplo, el agua no moja efectivamente el polietileno y por ello una superficie de polietileno puede ser menos deseable que una superficie más polar, por ejemplo una superficie de vidrio. Se apreciará que el uso de un agente humectante en la muestra de líquido o en la superficie de la cámara capilar puede ser beneficiosa.

Se prefiere que la longitud entre bordes de la cámara capilar esté preferentemente entre 1 y 70 mm, aún más preferentemente entre 5 y 25 mm.

Se prefiere que al menos una porción de dicha placa sustancialmente plana sea transparente a la radiación visible, UV y/o infrarroja. Además se prefiere que dicha porción de la placa sustancialmente plana que es transparente comprenda una porción que forma una pared de dicha cámara capilar. Se apreciará que esto puede ser deseable para permitir la detección de cualquier ligamiento al reactivo de captura en la cámara capilar. Alternativamente, al menos una porción de una pared de dicha cámara capilar plana es transparente a la radiación visible, UV y/o infrarroja.

Se prefiere que la superficie de la placa que forma la cámara capilar sea vidrio.

Si el dispositivo comprende un soporte sólido a través del cual tiene lugar el flujo lateral, entonces se prefiere que dicho soporte sólido sea de un material no absorbente, por ejemplo no cromatográfico. Como se describe en US 5,770,460, los materiales absorbentes (por ejemplo papel o nitrocelulosa) pueden convertirse en materiales que exhiben características no absorbentes de flujo por la aplicación de agentes bloqueantes, en particular ciertos detergentes y proteínas, que sirven para opacar las fuerzas interactivas que puedan aparecer debido a la naturaleza absorbente de los soportes antes del tratamiento.

Dicho soporte sólido que soporta el flujo lateral puede estar en forma de membrana. La membrana puede tener un grosor mucho menor que la dimensión de la superficie y es suficientemente hidrofílica para ser mojada y así permitir que soluciones acuosas y suspensiones exhiban flujo lateral libremente, y preferentemente de forma isotrópica, preferentemente a los mismos regímenes sustancialmente para varios componentes de una muestra.

Los materiales intrínsecamente no absorbentes incluyen láminas porosas de polietileno, por ejemplo el material laminar de polietileno de alta densidad o muy alto peso molecular fabricado por Porex Technologies Corp. De Fairburn, Georgia, USA, como se ha descrito, por ejemplo en US 4,943,522. Esta membrana tiene una estructura porosa abierta con una densidad típica, al 40% de volumen hueco, de 0,57 gm/cc (0,57 g/ml) y un diámetro medio de poro de 1 a 250 \mum, siendo generalmente de 3 a 100 \mum. El diámetro óptimo de poro de la membrana para uso en el dispositivo según la invención puede ser de cerca de 10 hasta 50 \mum. El grosor de las membranas va desde 0,0025 cm (0,025 mm) hasta cerca de 0,5 cm (5 mm), típicamente en el rango 0,012 cm a 0,025 cm (0,25 mm). La membrana puede ser revestida por su cara trasera con una capa generalmente impermeable al agua o puede ser autosoportada. Otras membranas que pueden ser adecuadas incluyen membranas formadas de otras olefinas u otros materiales termoplásticos, por ejemplo cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, copolímeros de cloruro de vinilo y acetato de vinilo, policarbonato o poliestireno.

Las propiedades de las membranas adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica, y como se ha indicado, por ejemplo, en US 4,943,522. Así, las membranas adecuadas pueden tener tamaños de poro entre 3 a 100 \mum, preferentemente alrededor de 10-50 \mum, tener un grosor menor a 0,5 cm y estar construidas en material inerte. La membrana es capaz de soportar flujo lateral, preferentemente flujo no absorbente por ejemplo flujo no cromatográfico, y preferentemente flujo isotrópico. El flujo capilar puede ocurrir por un mecanismo que conlleva acción capilar.

Los agentes bloqueantes que pueden usarse para convertir un material absorbente en uno que muestre flujo no absorbente incluyen, como conocen los expertos en la técnica y se describe en US 5,770,460, albúmina de suero bovino (que puede estar metilada o succinilada), suero animal completo u otras proteínas de la sangre, caseína y leche en polvo desgrasada. Puede también usarse agentes bloqueantes basados en detergentes, bien solos o en combinación con un agente bloqueante basado en proteínas. Los detergentes adecuados pueden incluir detergentes de alcohol de sorbitán polioxietilénicos (detergentes Tween), alcoholes polioxietilénicos (p.ej. Nonidet P-40) o éteres polioxietilénicos (p.ej. Triton X-100). Se describen métodos y consideraciones en relación con dichos tratamientos de materiales absorbentes en US 5,770,460. La ventaja de usar un material absorbente tratado como material de soporte puede incluir la facilidad de unión de un reactivo, por ejemplo un polipéptido o un ácido nucleico, al material, lo que puede hacerse antes de dicho tratamiento del material absorbente.

La nitrocelulosa puede ser útil como material de soporte, como es bien sabido por los expertos. La nitrocelulosa es capaz de unir proteínas sin sensibilización previa. Las moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, pueden ser inmovilizadas sobre nitrocelulosa sin necesidad de un tratamiento químico que podría interferir con la actividad ligante específica de la inmunoglobulina. Pueden bloquearse zonas ligantes no usadas como se ha descrito o usando un material como el alcohol polivinílico (PVA). La nitrocelulosa está disponible en un rango de tamaños de poro; el tamaño de poro puede elegirse en función del régimen de flujo requerido de la muestra.

La nitrocelulosa puede preferentemente tener un tamaño de poro de al menos 1 \mum. Más preferiblemente, el tamaño de poro es menor que unos 20 \mum.

Se apreciará que las moléculas de analizado que queden inmovilizadas en el dispositivo como un resultado de interacción con el colaborador específico de ligamiento pueden después no fluir a través del dispositivo en el mismo régimen que otros componentes, pero se prefiere que antes de dicha inmovilización que las moléculas de analizado fluyan a través del dispositivo en el mismo régimen que otros componentes.

Las ventajas de usar un soporte no absorbente pueden incluir que la velocidad de flujo de líquido a través del soporte pueda ser mayor usando un soporte no absorbente que usando un soporte absorbente. Esto puede llevar a que los líquidos de la muestra o del reactivo alcancen todas las porciones de la zona de detección o la de ligamiento en un periodo de tiempo más corto, el cual debe ser sustancialmente el mismo para cada líquido de la muestra o del reactivo, mejorando así la consistencia del periodo de incubación a través de la zona de detección y/o ligamiento.

La zona de recepción de muestra es capaz de tener aplicada a la misma dicha muestra de líquido de forma que el líquido es capaz de fluir dentro de la zona de flujo lateral, que puede comprender una zona de detección y/o ligamiento. Así, la zona de recepción de muestra puede ser una cámara en contacto de flujo lateral con la zona de flujo lateral, que puede comprender una zona de detección y/o ligamiento)por ejemplo, es posible flujo lateral entre la zona de flujo lateral y la cámara). La cámara tiene una abertura a través de la cual se introduce la muestra de líquido.

Se prefiere que la zona de recepción de muestra comprenda una cámara, preferiblemente con un volumen entre cerca de 5 y 2000 \mul, más preferiblemente entre cerca de 10 y 200 \mul.

Alternativamente, la zona de recepción de muestra puede comprender un soporte sólido capaz de conducir flujo lateral de la muestra líquida adentro de la zona de detección y/o ligamiento. El soporte sólido tiene preferentemente buena humectabilidad y acción de drenaje, como es conocido por los expertos y descrito en US 5,770,460 y bajas propiedades retentivas del analizado y del reactivo. Estas propiedades pueden existir en la transferencia de la muestra líquida y el analizado o reactivo a la zona de detección o ligamiento. Se prefiere que la zona de recepción de muestra, comprendiendo por ejemplo un soporte sólido, sea capaz de conducir flujo lateral no absorbente, como se ha definido anteriormente.

La zona de recepción de muestra puede comprender un filtro mecánico para eliminar materia en partículas de la muestra líquida. Por ejemplo el filtro debe ser capaz de eliminar células de una muestra, por ejemplo eritrocitos de una muestra de sangre, y de eliminar desechos de una muestra de comida o ambiental, por ejemplo de una muestra de agua potable.

Se apreciará que la zona de recepción de muestra y una zona de detección y/o ligamiento estén en contacto de flujo lateral a través de una zona (que puede ser una parte de la zona de flujo lateral) del dispositivo, en la que está presente un reactivo, por ejemplo un reactivo de marcado, como se discute más adelante.

La zona de detección y/o ligamiento comprende un reactivo de captura que es inmovilizado en dicha zona de detección y/o ligamiento. El agente de captura inmovilizado en una zona de detección es tal que la cantidad de una etiqueta detectable que queda en la zona de detección cuan do se ha realizado el ensayo es una función d la presencia / ausencia y/o concentración del analizado en la muestra de líquido. Por "inmovilizado" se entiende que el reactivo de captura es retenido en dicha zona de detección a lo largo del procedimiento de ensayo.

Serán bien conocidos para los expertos las combinaciones adecuadas de reactivo de captura, analizado y etiqueta detectable. Sin embargo, se apreciará que el dispositivo de la invención es adecuado para la realización de ensayos en los que se requieren etapas de lavado y/o incubación de duración predefinida y precisa. Dispositivos de ensayo conocidos pueden no ser adecuados para realizar ensayos de estos tipos; así, el rango de ensayos que pueden realizarse usando el dispositivo de la presente invención puede ser mayor que el rango posible con dispositivos conocidos, como los descritos en US 5,770,460.

El reactivo de captura puede ser una molécula biológica, como un polipéptido, ácido nucleico, lípido o polisacárido. Métodos para unir tales reactivos de captura a un soporte sólido o superficie son bien conocidos por los expertos y son discutidos más adelante. Esos medios pueden incluir enlace covalente, adsorción o métodos de atrapamiento físico. Son bien conocidos y pueden emplearse métodos que suponen síntesis in situ. Se puede conseguir adsorción por secado de una solución o suspensión del reactivo de captura en el dispositivo, por ejemplo sobre un elemento del soporte sólido o sobre una pared de la cámara capilar. La derivatización, por ejemplo de una membrana (soporte sólido) puede permitir uniones covalentes, por ejemplo usando glutaraldehido o una carbodiamida. El reactivo de captura puede estar unido a otro material que puede estar físicamente atrapado en la zona de detección y/o ligamiento o inmovilizado de cualquier otra forma en la zona de detección y/o ligamiento por cualquier medio químico o biológico. Así, el reactivo de captura puede estar presente en granulado que puede estar atrapado en el soporte sólido en la zona de detección y/o ligamiento.

La primera y segunda porciones y la placa sustancialmente plana pueden cooperar para formar una cámara para recibir la almohadilla absorbente. La cámara puede contener la almohadilla absorbente de tal forma que la almohadilla absorbente no está en comunicación líquida con el exterior del dispositivo (diferente que cualquier comunicación a través de la zona de flujo lateral), de forma que el líquido mantenido en la almohadilla absorbente es esencialmente incapaz de fugar del dispositivo. Se prefiere que la cámara contenga la almohadilla absorbente como antes se ha descrito cuando la segunda porción está en la segunda posición en relación a la primera posición, es decir cuando la almohadilla absorbente está en contacto íntimo con la zona de flujo lateral.

Se apreciará además que el presente dispositivo es adecuado para uso en procedimientos automáticos. Así, pueden realizarse por un sistema robótico adiciones de líquido a la zona de recepción de muestra y movimiento de la segunda porción del dispositivo entre dichas dos posiciones en relación a la primera porción.

El dispositivo puede ser desechable. Puede esterilizarse, por ejemplo en autoclave o por irradiación, como es bien conocido por los expertos en la técnica. Preferentemente, el dispositivo está formado de manera que no haga falta desmontarlo para la determinación del resultado del ensayo.

La primera y segunda porciones pueden configurarse y disponerse de forma que la segunda porción está cerrada o es cerrable en una conformación en la que la almohadilla absorbente está en contacto íntimo con la zona de flujo lateral. Elementos de cooperación adecuados entre la primera y segunda porciones serán bien conocidos por los expertos en la técnica. En una disposición alternativa, el dispositivo puede comprender medios elásticos que sirven para volver la segunda porción a la primera posición una vez ha desaparecido una fuerza requerida para mover la segunda porción a la segunda posición.

Se apreciará que un aspecto adicional de la invención provee una porción o molde para formar parte de un dispositivo de ensayo, estando configurada la porción para ser unible de forma permanente o desmontable a una placa sustancialmente plana como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7, 9 o 10 de forma que una parte de dicha porción forma una cámara capilar entre dicha placa y dicha porción y una parte de dicha porción participa en la formación de una zona de recepción de muestra, en donde dicha zona de recepción de muestra y dicha cámara capilar están en contacto (esto es, en contacto de flujo lateral). Preferentemente, una parte de la porción participa en la formación de una cámara capaz de acomodar una almohadilla absorbente, en donde la cámara está en contacto con la cámara capilar. Preferentemente, la zona de recepción de muestra y la cámara están en contacto de flujo lateral via la cámara capilar.

Se prefiere que la primera porción y/o la segunda porción sea o comprenda un molde de plástico. Se apreciará que el molde estará formado por procesos conocidos incluyendo moldeado y/o otros procesos de conformación o acabado, por ejemplo prensado. Estos métodos no son críticos para la realización de la invención.

El molde puede, por ejemplo, comprender o estar formado por cualquier plástico adecuado conocido. Se prefiere plástico hidrofílico. Los plásticos preferidos pueden incluir polimetimetacrilato (PMMA), cloruro de polivinilo, policarbonato o poliestireno, por ejemplo polímero estireno-acrilonitrilo (SAN). Son menos preferidos polipropileno y polietileno. Es particularmente preferido el policarbonato. Se apreciará que, en algunas aplicaciones, por ejemplo en las que requieren mediciones densitométricas, puede ser deseable que el plástico sea incoloro Si la detección es por medio de fluorescencia, puede ser deseable que el plástico sea coloreado, preferentemente coloreado en tono oscuro, como negro. Puede ser deseable que la porción comprenda material, como cobre, con alta conductividad térmica, como se discutirá más adelante.

La primera y/o segunda porción pueden fijarse de forma permanente o removible a la placa sustancialmente plana. Así, por ejemplo, la primera porción/molde puede estar unida, por ejemplo usando un adhesivo, sobre la placa. Preferentemente, la porción/molde se unirá de forma removible.

La almohadilla absorbente puede ser de cualquier material poroso o fibroso capaz de absorber líquido rápidamente como e describe por ejemplo en US 5,656,503. La porosidad del material puede ser unidireccional (esto es, con poros o fibras corriendo totalmente o predominantemente paralelos a un eje del elemento) o multidireccional (omnidireccional, de forma que la zona de la almohadilla tiene una textura amorfa esponjosa). Puede usarse un material plástico poroso tal como polipropileno, polietileno (preferentemente de muy alto peso molecular), fluoruro de polivinilideno, vinilacetato de etileno, acrilonitrilo y politetrafluoroetileno. Puede usarse también papel, otro material celulósico como nitrocelulosa, vidrio u otro filtro fibroso. Puede ser adecuado un material como el usado en puntas de rotuladores. Puede ser deseable tratar el material con una agente tensioactivo para reducir cualquier hidrofobicidad inherente. Se prefiere que el material sea robusto en seco y en húmedo de forma que mantenga su forma y por ello pueda ser movido de forma precisa desde una posición en la que no está en contacto con la zona de detección y/o ligamiento a otra en que sí lo está. Ejemplos de materiales absorbentes adecuados son los papeles cromatográficos ED Nº 939 y Whatman 3MM. Un material preferido es CD427 suministrado por Whatman International Ltd, Whatman House, St. Leonards Road, 20-20 Maidstone Allington, Maidstone ME16 0LS.

Se apreciará que las propiedades de la zona o almohadilla absorbente pueden determinarla rapidez de retirada del líquido a través de la cámara capilar desde la zona de muestra o cámara a la zona o almohadilla absorbente. Los expertos en la técnica podrán conocer los métodos para seleccionar las propiedades del material absorbente. Los fabricantes las indican de forma rutinaria.

Se prefiere que la almohadilla porosa sea capaz de absorber un volumen de líquido al menos igual al volumen de la muestra y cualquier reactivo, incluyendo los de lavado, usado durante el ensayo. Se apreciará que la almohadilla absorbente puede comprender uno o más materiales absorbentes, que pueden tener propiedades absorbentes diferentes, como es conocido. La almohadilla debe ser capaz de absorber un volumen de líquido entre 5 y 50 veces el volumen de la cámara capilar, por ejemplo entre 10 y 30 veces el volumen de la cámara capilar.

Otro aspecto adicional de la invención provee un conjunto de partes comprendiendo una porción para formar parte de un dispositivo de ensayo como se ha descrito y una placa sustancialmente plana la que la porción es capaz de estar unida de forma permanente o removible, como se ha dicho. Así, dicha placa sustancialmente plana puede tener inmovilizado sobre ella un conjunto de reactivos. Alternativamente o además de la placa sustancialmente plana, el conjunto puede comprender una segunda porción que soporta o está dispuesta para soportar una almohadilla absorbente. Preferentemente, la segunda porción es capaz de soportar dicha almohadilla absorbente en la cámara capaz de acomodar una almohadilla absorbente. El conjunto puede además comprender un espaciador, como se dirá. El conjunto puede además comprender una almohadilla absorbente que puede estar soportada por la segunda porción. El conjunto puede además comprender reactivos adecuados para llevar a cabo el ensayo en relación a uno o más de los reactivos de captura inmovilizados sobre la placa sustancialmente plana.

Un aspecto adicional de la invención provee un método de formar un dispositivo de ensayo de la invención comprendiendo la etapa de unir de forma permanente o removible una placa sustancialmente plana según definida en relación al conjunto de partes a una porción para formar parte de un dispositivo de ensayo, como definido.

El método puede además comprender la etapa de unir una segunda porción que contiene o está dispuesta para contener una almohadilla absorbente a la placa sustancialmente plana y/o a la porción para formar parte de un dispositivo de ensayo. Se apreciará que la primera y segunda porción y la placa sustancialmente plana pueden montarse en cualquier orden apropiado.

Un aspecto adicional de la invención provee el uso de una placa sustancialmente plana como se ha definido y de una porción para formar parte de un dispositivo de ensayo como se ha definido y/o una segunda porción que contiene o está dispuesta para contener una almohadilla absorbente, en la formación de un dispositivo de ensayo de la invención.

Un aspecto adicional de la invención provee el uso de un dispositivo de ensayo de la invención en un método para la cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido, en donde la muestra líquida se aplica a dicho dispositivo. Un aspecto adicional de la invención provee un método un método para la cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido, comprendiendo las etapas de aplicar la muestra líquida a un dispositivo de la invención. Preferentemente, el dispositivo de la invención está en la primera posición cuando la muestra líquida se aplica a dicho dispositivo y el método comprende además la etapa de mover la segunda porción a la segunda posición. La etapa de mover la segunda porción puede realizarse pasado cierto tiempo desde la aplicación de la muestra líquida al dispositivo. Así, el dispositivo puede usarse en un método de realización de una incubación cronometrada, esto es en realizar un método de ensayo que requiera una incubación cronometrada. Se darán detalles adicionales de tal método más adelante.

Se apreciará que el dispositivo puede ser útil para determinar si un cooperador ligante específico para un reactivo presente en la muestra líquida está presente en una muestra de prueba inmovilizada en el dispositivo, preferentemente en la zona de flujo lateral. Así, el dispositivo puede ser útil, por ejemplo, para realizar un ensayo de hibridación in situ, término conocido por los expertos. Así, la muestra de prueba, por ejemplo células o una muestra de tejido, pueden inmovilizarse en el dispositivo en la zona de flujo lateral. Los reactivos líquidos a aplicar a la muestra de prueba pueden entregarse en la zona de recepción de muestra. Tales reactivos pueden comprender un reactivo de detección, por ejemplo un ácido nucleico, anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado, que es capaz de ligarse específicamente a dicho cooperador ligante específico que se desea detectar. Otros reactivos pueden incluir reactivos de lavado/escurrido y otros necesarios para detectar el agente de detección, como conocen los expertos.

Se apreciará que un dispositivo según la invención puede ser también útil para realizar otras incubaciones en las que no se requiere necesariamente una interacción ligante específica. Así, dicho dispositivo puede ser útil en células de incubación que están inmovilizadas en el dispositivo, por ejemplo en la zona de flujo lateral, con medios diferentes sucesivos o reactivos no específicos de coloración. Los diferentes medios pueden comprender, por ejemplo, diferentes concentraciones o tipos de compuestos biológicamente activos, por ejemplo, el dispositivo puede ser útil para exponer células a un factor de crecimiento.

Se apreciará que algunas realizaciones del anterior dispositivo pueden no ser adecuadas o preferidas para la incubación de células. Así, las realizaciones en las que tiene lugar flujo lateral en la zona de flujo lateral a través de un soporte sólido, por ejemplo a través de la longitud de una membrana, pueden no ser preferidas para tales incubaciones. Las realizaciones en las que tiene lugar flujo lateral en la zona de flujo lateral a través de una cámara capilar pueden ser particularmente preferidas para tales incubaciones.

El dispositivo puede ser particularmente adecuado para uso en la realización de ensayos en los que el resultado se detecta usando un microscopio u otro instrumento y/o de ensayos automáticos. El dispositivo puede ser también adecuado para realizar ensayos múltiples sobre una muestra en un dispositivo único. El dispositivo es también útil para realizar incubaciones cronometradas, particularmente cuando se desea minimizar la cantidad de reactivo usado.

Se describirá ahora la invención en forma de ejemplo, con referencia a los dibujos, de los cuales:

La figura 1 muestra ejemplos de principios de ensayo adecuados que pueden usarse en un dispositivo de la invención, incluyendo un ensayo inmunológico en fase sólida para anticuerpos. Uniendo el anticuerpo a la fase sólida, el sistema puede usarse para asignación de antígeno. Para reducir el ligamiento no específico de IgG a la fase sólida tras la absorción del primer reactivo, es usual añadir una proteína irrelevante como gelatina, o más recientemente glicoproteína para bloquear cualquier sitio libre en el soporte.

Las Figuras 2 a 6 muestran vistas de un dispositivo de una realización de la invención.

La Figura 2 muestra una perspectiva de componentes de un dispositivo antes de su montaje.

La Figura 3 muestra una perspectiva de un dispositivo montado.

La Figura 4 muestra una vista de una primera porción de un dispositivo.

La Figura 5 muestra vistas de un dispositivo con la segunda porción en la primera y segunda posiciones.

La Figura 6 muestra alzados de un dispositivo montado.

La Figura 7 ilustra los principios de una cámara capilar con pendiente (alzado lateral y perspectiva).

Como se muestra en las Figs. 2 a 7, la invención provee un dispositivo generalmente compuesto de un primer molde 1, una placa sustancialmente plana 2, una abertura 6 que conduce a la zona de recepción de muestra 7, un espaciador 4, cámara capilar 3, almohadilla absorbente 8, reactivo de captura inmovilizado 9, segundo molde 10 y medios de cierre 11.

La primera porción o molde 1 está unida de forma permanente o removible a una placa sustancialmente plana tal como un portaobjetos de vidrio o policarbonato 2 de forma que una parte de dicho molde 1 forma una cámara capilar 3 entre dicha placa 2 y dicho molde, comprendiendo además el dispositivo una cámara 5 en la que puede introducirse una muestra de prueba y/o un reactivo y comprendiendo además una cámara 7 capaz de acomodar una almohadilla absorbente 8, en donde dicha cámara en la que se introduce una muestra de prueba y dicha cámara capaz de soportar una almohadilla absorbente 8 están en contacto de flujo lateral vía dicha cámara capilar 3.

El dispositivo comprende además una segunda porción o molde 10 al que se une una almohadilla absorbente 8, en donde dicha almohadilla absorbente 8 está contenida en dicho segundo molde 10 en dicha cámara 7 capaz de acomodar una almohadilla absorbente 8.

El dispositivo tiene al menos dos conformaciones, caracterizadas porque en la primera la almohadilla absorbente 8 no está en contacto de flujo lateral con dicha cámara capilar 3 y en donde en la segunda la almohadilla absorbente 8 está en contacto de flujo lateral, es decir está en íntimo contacto con dicha cámara capilar 3.

La transición entre las dos conformaciones puede efectuarse moviendo el segundo molde 10 en relación al primer molde 1 y/o dicha placa plana 2. Preferentemente, el segundo molde 10 es capaz de deslizar a lo largo del primer molde y/o dicha placa plana 2.

La placa plana 2 tiene preferentemente las dimensiones sustanciales de un portaobjetos de microscopio normal de laboratorio (ver, por ejemplo, portaobjetos Sigma; números de producto S8902, S8400 o S9027; Sigma. Aldrich Company Ltd, Fancy Road, Poole, Dorset, BH12 4QH, UK). Las dimensiones de un portaobjetos de microscopio normal de laboratorio son 25 mm x 75 mm x 1 mm. Se prefiere que dicha placa plana sea un portaobjetos normal de microscopio en vidrio o policarbonato. Esa placa puede tener la ventaja de ser fácilmente disponible, de un tamaño capaz de adaptarse a un equipo normal de laboratorio, y de propiedades superficiales adecuadas para soportar flujo capilar y permitir la unión de moléculas biológicas, por ejemplo polipéptidos o ácidos nucleicos, a su superficie, como es conocido por los expertos en la técnica. Se prefiere vidrio por sus propiedades ópticas y por la facilidad con que moléculas tales como ácidos nucleicos y polipéptidos se unen a una superficie de vidrio. Sin embargo, se apreciará que un plástico de grado óptico, por ejemplo policarbonato de grado óptico, puede usarse en lugar de vidrio.

La cámara 5 en la que puede introducirse el líquido de prueba puede tener una abertura 6 a través de la cual el líquido de prueba puede introducirse en la cámara. Pueden introducirse además reactivos en la cámara 5 al mismo tiempo, antes o después que el líquido de prueba. Una vea que el líquido y/o los reactivos han sido alojados en la cámara capilar y opcionalmente a través de la cámara en la almohadilla absorbente, una muestra adicional de líquido y/o reactivo puede añadirse a la cámara 5. Así, por ejemplo, puede añadirse un reactivo de lavado, por ejemplo agua destilada o una solución tampón. El líquido puede introducirse vía la abertura mediante la administración manual del líquido, por ejemplo usando una pipeta o jeringa, o por administración automática, por ejemplo por máquina robotizada. El volumen de la cámara 5 está preferentemente entre 5 y 2000 o 4000 \mum. Preferentemente, el volumen de la cámara 5 está entre 10 o 20 y 500 o 1000 \mum, más preferentemente entre 10 o 20 y 200 o 400 \mum.

Se apreciará que el dispositivo puede comprender una cámara de recepción de muestra 5 y una cámara adicional (no mostrada) a la que puede añadirse una muestra o reactivo adicional. Así, el dispositivo puede comprender una cámara de volumen menor que, por ejemplo, 50 \mum en la que puede introducirse la muestra de prueba, y una cámara de un volumen entre, por ejemplo, 200 \mum y 1500 mm a la que puede introducirse un reactivo, por ejemplo un reactivo de lavado.

La segunda porción o molde 10 puede igualmente estar hecha en material plástico. El segundo molde 10 puede encajar en dicho primer molde 1, por ejemplo cuando está unido a dicha placa plana 2, y puede ser capaz de deslizar a lo largo de dicho primer molde 1 desde una primera posición a una segunda posición. La almohadilla absorbente 8 está contenida por el segundo molde 10, por ejemplo mediante ajuste a presión o por unión, usando por ejemplo un adhesivo. En una primera posición del segundo molde 10 en relación al primer molde 1 y/o placa 2, hay una holgura entre un borde abierto de la cámara capilar 3 y la almohadilla absorbente 8, tal que el líquido presente en la cámara capilar 3 no está en contacto con la almohadilla absorbente 8 y no se integra en la almohadilla absorbente 8. En una segunda posición del segundo molde 10, la almohadilla absorbente 8 está en contacto, preferentemente íntimo, con el borde abierto de la cámara capilar 3, de forma que el líquido presente en la cámara capilar 3 está en contacto con la almohadilla absorbente 8 y es retirado de la cámara capilar 3 a la almohadilla absorbente 8. Se apreciará que, cuando el líquido es retirado de la cámara capilar 3 a la almohadilla absorbente, cualquier otro líquido presente en la cámara de muestra 5 (o cámara adicional como se ha indicado) puede alojarse en la cámara capilar 3 y posteriormente en la almohadilla absorbente 8.

Se apreciará que dicho segundo molde 10 puede ser movido entre dichas primera y segunda posición, por ejemplo desde dicha primera posición a dicha segunda posición y luego vuelto a dicha primera posición, repetidamente de forma que el líquido puede ser llevado a, y retirado de, la cámara capilar 3 bajo el control del operador (que puede ser un sistema robótico). De esta forma, el tiempo que un líquido dado permanece en la cámara capilar 3 puede ser controlado por el operador. El dispositivo puede ser elástico de forma vuelva a una de dichas primera y segunda posiciones salvo que se aplique una fuerza sobre él. Alternativamente el dispositivo puede estar formado de forma que una vez que dicho segundo molde 10 ha sido movido a dicha segunda posición, se bloquea en la posición. Los medios de cierre 11 se indican, por ejemplo, en las Figs. 4, 5 y 6 y pueden comprender estructuras cooperantes, como es conocido por los expertos en la técnica, en la primera y segunda porción de forma que el movimiento de la primera posición a la segunda posición se permite mientras que el movimiento contrario se dificulta.

Dicho segundo molde 10 puede interactuar con dicho primer molde 1 de tal forma que los dos no pueden desencajarse fácilmente de forma accidental. Ello es deseable para evitar que se desperdicie el contenido del dispositivo cuando se usa. Preferentemente, el dispositivo no debe desmontarse en uso o tras su uso.

Como se ha indicado, la velocidad a la que el líquido entra y sale de la cámara 5 puede variar dependiendo de las propiedades del líquido, la cámara capilar 3 y la almohadilla absorbente 8. Sin embargo, se apreciará que estos tiempos pueden ser cortos en comparación a los períodos deseables de permanencia del líquido en la cámara capilar 3.

El dispositivo puede ser útil en la realización de los ensayos descritos. Pueden usarse antígenos por ejemplo como el reactivo de captura, en la detección de anticuerpos (el analizado) capaces de unirse al antígeno y viceversa. Los expertos pueden concebir una variedad de técnicas de ensayos inmunológicos en los que la lectura final del ensayo comprende un reactivo conjugado con una etiqueta detectable apropiada. El radiomarcado, por ejemplo con I_{131}, I_{125}, puede usarse. Sin embargo, puede preferirse una etiqueta que pueda detectarse por medios visuales o fluorescentes. Así, el reconocimiento específico cuando se detecta un antígeno se facilita por el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) pero el sistema secundario de detección puede utilizar anticuerpos fluorescentes, enzimas u otros anticuerpos secundarios conjugados.

El ligamiento de antígeno marcado (por ejemplo, por radiación o fluorescencia) a una cantidad fijada de anticuerpo (el reactivo de captura, inmovilizado en la zona de detección y/o ligamiento) puede inhibirse parcialmente por adición de antígeno no marcado (el analizado que se prueba en la muestra líquida), y la intensidad de esta inhibición puede usarse como una medida del analizado no marcado añadido.

El contenido de anticuerpo específico para un antígeno particular en, por ejemplo, un suero puede determinarse por la capacidad de ligarse al antígeno que está inmovilizado en la zona de detección (el reactivo de captura); la inmunoglobulina ligada puede entonces estimarse por adición de un anti-Ig extraído de especies con anteras. Se apreciará que un ensayo tal requiere una etapa de lavado para eliminar la inmunoglobulina no ligada de la zona de detección. Así, este tipo de ensayo no puede realizarse fácilmente usando dispositivos de ensayo en los que no se contempla el lavado, pero pueden realizarse fácilmente usando un dispositivo de la invención. Por ejemplo, suero de un paciente (muestra líquida) se añade en la zona de recepción de muestra 5 y fluye adentro de la zona de detección 9 (en la zona de flujo lateral, esto es, la cámara capilar 3) en la que el antígeno inmovilizado (reactivo de captura) está presente. Anticuerpos específicos apropiados se unen al antígeno inmovilizado. La muestra líquida se retira de la zona de detección 9 hacia la cámara capilar 3 mediante la puesta en contacto de flujo lateral de la almohadilla absorbente 8 con la cámara capilar 3 (es decir, colocando el dispositivo en dicha segunda conformación). Se añade entonces un tampón de lavado a la zona de recepción de muestra 5 y las restantes proteínas del suero se lavan de la cámara capilar 3 (incorporando la zona de detección 9) hacia la zona absorbente 8 a medida que el líquido de lavado fluye a través de la zona de flujo lateral y desde la zona de detección. Puede estimarse entonces el anticuerpo ligado por adición de una solución de anti-inmunoglobulina marcada, por ejemplo anti.IgG, anti-IgM o anti-IgE, anticuerpo o fragmento de anticuerpo a la zona de recepción de muestra 5, seguido por un segundo lavado. La anti-inmunoglobulina anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado puede, por ejemplo, ser anti IgG purificado de conejo marcado con I_{125} o de forma fluorescente. Ello se detectará por medios conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo usando un dispositivo de imagen fluorescente.

Para la estimación del antígeno, por ejemplo, se inmovilizan anticuerpos en la zona de detección 9 y la muestra líquida que está siendo probada para el antígeno (analizado) se añade a la zona de recepción de muestra 5, y fluye a la zona de detección 9. El dispositivo se coloca en dicha segunda conformación, de forma que la muestra líquida fluye fuera de la zona de detección 9 y entra en la zona absorbente 8. Después del lavado, como se ha descrito, la cantidad de antígeno ligado en la zona de detección 9 puede estimarse por la adición de un exceso de anticuerpo marcado, por ejemplo de forma fluorescente. La especificidad del método puede mejorarse por el método de ensayo sándwich, como se muestra en las Figs. 1 y 2, en el que el anticuerpo inmovilizado y los anticuerpos marcados tienen especificidades para partes diferentes del antígeno.

Se apreciará que puede usarse un sistema de ensayo similar a los descritos en US 5,770,460 En un sistema tal, se pone en contacto la muestra líquida con un reactivo marcado que liga específicamente con el analizado. El reactivo de captura inmovilizado en la zona de detección se une a sitios diferentes del analizado de los que están unidos al reactivo marcado, de forma que ambos reactivos se unen simultáneamente a la molécula de analizado. El reactivo marcado puede ser añadido ala muestra líquida en la zona de recepción de muestra 5 o puede estar presente en una zona de marcado 12 entre la zona de recepción de muestra 5 y la zona de detección 9, como se ha indicado. La zona de marcado 12 puede estar en la zona de flujo lateral, esto es, en la cámara capilar 3. A medida que la muestra líquida de prueba pasa a través de la zona de marcado 12, el reactivo marcado se une al analizado en la muestra de prueba. El flujo de líquido lleva al reactivo marcado a la zona de detección 9. El reactivo marcado que está ligado al analizado es retenido en la zona de detección 9 por unión del analizado al reactivo d captura. El reactivo marcado que no está unido al analizado no es retenido en la zona de detección 9.

En un segundo sistema de ese tipo, el reactivo marcado compite con el analizado para unirse al reactivo de captura en es retenido en la zona de detección 9. Así, la presencia del analizado en la muestra líquida de prueba conduce a un menor nivel de reactivo marcado retenido en es retenido en la zona de detección 9 que en ausencia del analizado en la muestra líquida de prueba.

Se apreciará que se prefiere que cualesquiera dos de: reactivo de captura, analizado, reactivo marcado u otro reactivo requerido por el diseño de ensayo, ineractúen específicamente. Al menos uno de: reactivo de captura, reactivo marcado u otro reactivo requerido por el diseño de ensayo interactúe específicamente con el analizado, es decir sea un colaborador específico de ligado para dicho analizado. Se prefiere que la interacción sea de alta afinidad. Por "alta afinidad" se entiende una interacción con un K_{d} de entre 10^{-8}y 10^{-16}M, preferentemente entre10^{-13}y10^{-16}M. Por "interactúa específicamente" se entiende que dicho componente interactúa con una afinidad al menos 100 veces superior (y preferentemente al menos 500 veces, o al menos 1000 veces, o al menos 2000 veces mayor afinidad) con el pretendido componente de ligado que con otras moléculas que puedan encontrarse por cualquiera de dichos componentes cuando se realiza el ensayo, por ejemplo en una muestra tomada de un paciente, por ejemplo sangre, suero u orina, o en una bebida/comida de muestra ambiental.

Puede usarse enzimas que dan un producto coloreado de reacción como reactivo marcado. Enzimas tales como peroxidasa y fosfatasa de rábano silvestre han sido ampliamente empleadas en ensayos ligados a enzimas. Una forma de ampliar la reacción de la fosfatasa es usar NADP como sustrato para generar NAD que ahora actúa como una coenzima para un segundo sistema enzimático. La pirofosfatasa de E. Coli provee un buen conjugado porque la enzima no está presente en tejidos, es estable y da un buen color de reacción. Pueden usarse también sistemas químico-lumuniscentes basados en enzimas como la luciferaza. Otros marcadores enzimáticos adecuados incluyen por ejemplo los del grupo oxidasa, que catalizan la producción de peróxido de hidrógeno reaccionando con el sustrato. La oxidasa de glucosa se prefiere especialmente porque tiene buena estabilidad y su sustrato (glucosa) es fácil de conseguir. La actividad de una etiqueta de oxidasa puede ensayarse midiendo la concentración de peróxido de hidrógeno formado por la reacción enzima/anticuerpo marcado/sustrato. Además de las enzimas, otros marcadores adecuados incluyen radioisótopos, como yodo (I^{125}, I^{121}), carbono (C^{14}), azufre (S^{36}), tritio (H^{3}), indio (In^{112}) y tecnecio (Tc^{99}), y marcadores fluorescentes, como un marcador Eu^{152}, un marcador de isotiocianato, o de rodamina, focoerotrina, ficocianina, aloficocianina, o.ftaldehido, marcador fluoróforo de proteína fluorescente verde (GFP), y marcador de fluorescamina. Ejemplos de químico-lumuniscencia comprenden un marcador luminal, o isoluminal, o de éster de acridinio aromático, o de imidazol, o de sal de acridinio, o éster de oxalato, luciferina, luciferasa y ecuorina. Otros marcadores adecuados incluyen sonda de nanopartículas y métodos de amplificación de señal asociados basados en reducción de plata promovida por nanopartículas, por ejemplo como se describe en Taton y otros (2000) Science 289, 1757-1760 y sus referencias.

Técnicas típicas para ligar los marcadores descritos a anticuerpos se encuentran en Kennedy y otros, Clin. Chim. Acta 70:1-31 (1976), y Schurs y otros, Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977). Las técnicas de acoplamiento mencionadas en el último son el método glutaraldehido, el método periodato, el método dimaleintida, el método mmaleimidobencilo-N-hidroxisuccinimida, todos los cuales se incorporan aquí por referencia.

Como alternativa al ligamiento directo de la enzima a un reactivo marcado que se une al analizado, el reactivo marcado puede ser marcado con vitamina biotina, como conocen los expertos. El reactivo biotinilado puede entonces detectarse fácilmente por su reacción con la avidina ligada a enzimas o estreptavidina a la que se liga con gran especificidad y afinidad, como es conocido.

En este documento, el término "anticuerpo" (Ab) se emplea con un significado que incluye moléculas intactas y fragmentos de anticuerpo (como Fab y F(ab')2, moléculas sintéticas tipo anticuerpo fragmentos Fv de cadena simple (ScFv) y anticuerpos de dominio (dAbs), y otras moléculas ligantes de antígeno de tipo anticuerpos) que son capaces de ligar específicamente con, por ejemplo, el analizado. A los fragmentos Fab y F(ab')2 les falta el fragmento Fc de anticuerpo intacto. La adecuación o no de los fragmentos de anticuerpo al uso en protocolos de ensayo particulares será bien conocida por los expertos. Se apreciará que puede ser deseable usar un anticuerpo monoclonal (Mab) o fragmento en etapas determinadas del ensayo, como saben los expertos. Una revisión general de las técnicas relacionadas con la síntesis de fragmentos de anticuerpo que retienen sus zonas específicas de ligamiento puede encontrarse en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Se apreciará que el analizado y un reactivo de ensayo, por ejemplo el reactivo de captura, pueden ser ácidos nucleicos, por ejemplo ADN o ARN. Cuando se analiza la hibridación de un analizado ácido nucleico a un reactivo de ensayo, puede ser importante controlar la temperatura del ensayo y, en particular, puede ser importante realizar diferentes etapas del ensayo a temperaturas diferentes. Así, puede ser deseable construir el dispositivo o una parte del mismo de forma que tenga una buena conductividad térmica desde al menos una superficie exterior del dispositivo hasta la zona de detección y/o ligamiento. Así, una porción del dispositivo en contacto con o formando parte de la zona de detección y/o ligamiento 9 puede estar hecha de material con buena conductividad térmica, por ejemplo un metal, especialmente cobre, como saben los expertos. Así, en una realización se prefiere que la temperatura en la zona de detección y/o ligamiento 9 cambie desde al menos 90ºC a menos de 65ºC cuando en contacto con una placa de cobre cuya temperatura cambia desde 96ºC a 60ºC en un período de 2 minutos, 1 minuto 30s, en no más de un período adicional de 2 minutos, 1 minuto 30s o 15s desde que dicha placa de cobre ha alcanzado 60ºC.

Así se apreciara que un dispositivo de la invención puede usarse en un ensayo para detectar la presencia o ausencia o cuantificar la cantidad presente en una muestra de un (analizado) ácido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente a un segundo (reactivo) ácido nucleico. El reactivo ácido nucleico puede ser un reactivo de captura inmovilizado en la zona de detección 9.

Por "hibridarse selectivamente" se entiende que el analizado ácido nucleico tiene suficiente similitud de secuencia de nucleótidos con dicho segundo ácido nucleico y que puede hibridizar bajo condiciones alta o moderadamente rigurosas, y preferentemente no hibridiza a otros ácidos nucleicos similares en las mismas condiciones. Co se sabe bien, el rigor de la hibridación del ácido nucleico depende de factores como la longitud de ácido nucleico en la que ocurre la hibridación, grado de identidad de las secuencias de hibridación y de factores tales como la temperatura, fuerza iónica y contenido CG y AT de la secuencia.

Las condiciones típicas de hibridación alta o moderadamente rigurosas que conducen a la hibridación selectiva se conocen, por ejemplo las descritas en Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Sambrook y otros (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.

Se apreciará que los métodos de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de replicasa y ligasa QB, pueden realizarse en un dispositivo de la invención o puede usarse en la preparación de una muestra para ensayo usando un dispositivo de la invención. También, la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, también conocida como 3SR) puede usarse como se describe en Compton (1991), Nature 350, 91-92 y AIDS (1993), Volumen7 (Suppl. 2), S108 o SDA (amplificación de desplazamiento de cordón) como se describe en Walker y otros (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696. La PCR es particularmente preferida por su simplicidad.

Puede usarse un ácido nucleico comprendiendo una etiqueta detectable en la realización de un ensayo en un dispositivo de la invención. En "etiqueta detectable" se incluye cualquier etiqueta radiactiva convencional, como P^{32}, P^{33} o S^{35} que pueden, como se sabe, incorporarse fácilmente a una molécula de ácido nucleico por métodos conocidos incluyendo etiquetas fluorescentes o quimioluminiscentes. Adicionalmente, el término "etiqueta detectable" también incluye una fracción que puede detectarse en virtud de su unión a otra fracción (como biotina, que puede detectarse en virtud de su unión a estreptavidina); y una fracción, como una enzima, que puede detectarse en virtud de su capacidad para convertir un componente incoloro en coloreado o viceversa (por ejemplo, la fosfatasa alcalina puede convertir 0-nitrofenilfosfato incoloro en 0-nitrofenol coloreado).Pares supresores de fluoróforo o polarización de fluorescencia puede ser también útil, como conocen los expertos. Se prefiere un fluorocromo o un marcado fluorescente. Pueden ser particularmente útiles la sonda de nanopartículas y métodos de amplificación de señal asociados basados en reducción de plata promovida por nanopartículas, como se describe por ejemplo en Taton y otros (2000) Science 289, 1757-1760 y sus referencias.

Se apreciará que puede inmovilizarse más de una especie de reactivos de captura en la zona de detección y/o ligamiento 9. Por ello, el dispositivo puede ser adecuado para realizar ensayos en relación a más de un analizado en una muestra de líquido. Así, la zona de detección y/o ligamiento 9 puede tener inmovilizada sobre ella una batería de diferentes reactivos de captura.

Tal batería puede ser similar a una batería usada en un ensayo chip biológico, como conocen los expertos en la materia y se describe más adelante. Las nuevas tecnologías, llamadas VLSIPS^{TM} han permitido la producción de chips extremadamente pequeños que contienen cientos de miles o más de sondas de diferentes, como se describe por ejemplo en US 5,874,219 concedida en 23 Febrero 1999 a Rava y otros. Estos chips biológicos tienen sondas dispuestas en batería, cada sonda con una posición asignada. Se han producido chips biológicos en los que cada posición tiene una escala de por ejemplo diez micras. Los chips pueden usarse para determinar si la molécula objetivo interactúa con cualquiera de las sondas del chip. Después de exponer la batería a las moléculas objetivo bajo condiciones seleccionadas de prueba, dispositivos de escaneado pueden examinar cada posición en la batería y determinar si una molécula objetivo ha interactuado con la sonda de esa posición.

Los chips biológicos o baterías son útiles en una variedad de técnicas de detección para obtener información sobre las sondas o las moléculas objetivo. Por ejemplo, puede usarse una biblioteca de péptidos como sondas para detectar drogas. Los péptidos pueden exponerse a un receptor, y las sondas que ligan al receptor pueden ser identificadas.

Pueden usarse baterías de ácidos nucleicos para extraer información de secuencia de, por ejemplo, muestras de ácidos nucleicos. Las muestras se exponen a las sondas bajo condiciones que permiten hibridación- las baterías se escanean después para determinar a qué sondas han hibridizado las moléculas de la muestra. Puede obtenerse la información de secuencia por una cuidadosa selección de sondas y usando algoritmos para comparar modelos de hibridación y no- hibridación. Este método es útil para secuenciar ácidos nucleicos así como para comprobar su secuencia. Por ejemplo, el método es útil en la selección de diagnóstico de enfermedades genéticas o para la presencia y/o identidad de un particular patógeno o cepa de patógenos. Por ejemplo, se puede usar baterías de ADN para examinar una muestra de ácido nucleico de un virus para determinar a qué cepa pertenece.

Se apreciara que tales chips biológicos no están generalmente disponibles mientras entras el presente dispositivo puede estar disponible. Un dispositivo de la invención puede generalmente comprender entre 1 y 5, 10, 15, 20, 50, 100, 150, 200, 500, 1000 y 2000 diferentes reactivos de captura, por ejemplo en forma de batería. Puede preferirse que un dispositivo comprenda entre 50 y 500 diferentes reactivos de captura, por ejemplo 200 diferentes reactivos de captura.

La batería puede formarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Así, pueden ser adecuadas varias técnicas de impresión, usando por ejemplo microjeringas, plumas con bombas dosificadoras, impresión directa o por chorro de tinta. Se han descrito métodos adecuados en US 5,856,101, US 5,153,854, WO92/10092, WP98/40105, Service (2000), Science 289, 1673, MacBeath & Schreiber (2000), Science 289, 1760-1763, de UIT y otros (2000) Nature Biotech 18, 989-994, y Irving & Hudson (2000) Nature Biotech 18, 932-933. Se describen también soluciones de impresión adecuadas en estos documentos, y son bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede usarse solución salina tampón fosfato (PBS), como 1xPBS, comprendiendo un detergente no iónico, por ejemplo éster de sorbitán polioxietilenglicol, por ejemplo un detergente Tween® tal como Tween 20, Tween 40, Tween 60 o Tween 80, como conocen los expertos. La inclusión de un estabilizante (o inhibidor potencial de evaporación) tal como polivinilpirrolidona (PVP), sucrosa o glicerol puede ser también beneficioso.

Se apreciará que si los reactivos de captura están dispuestos en batería, se puede usar el mismo marcador, por ejemplo la misma entidad fluorescente, en relación con cada reactivo de captura, ya que la identidad del analizado presente puede determinarse por la posición en la batería de la señal desde la etiqueta capturada. Alternativamente, si en una realización menos preferente los reactivos de captura no están presentes en posiciones definidas y separadas de la zona de detección y/o ligamiento 9 (por ejemplo, los reactivos de captura están mezclados antes de ser inmovilizados en la zona de detección y/o ligamiento 9), entonces es preferible usar diferentes marcadores en relación con cada reactivo de captura/analizado, de forma que las señales en relación con cada analizado puedan ser distinguidas.

Se apreciará que la señal no necesita generarse y/o medirse a cada reactivo de captura inmovilizado en la zona de detección 9. Así, por ejemplo, un dispositivo comprendiendo más de un reactivo de captura puede ser vendido (por ejemplo, con reactivos adicionales adecuados) como adecuado para realizar un ensayo con relación a cualquier (o más) reactivo de captura. No se genera señal significativa alguna en relación con los reactivos de captura para los que no se hayan añadido reactivos adicionales necesarios durante el uso del dispositivo. Así, un tipo de dispositivo puede venderse para uso en relación con varios ensayos de analizado sencillo o múltiple.

Se apreciará que puede ser deseable incluir en el dispositivo solamente reactivos de captura que sean compatibles, ya que se puede usar la misma secuencia de etapas de ensayo en relación con cada ensayo reactivo de captura/analizado. Así, reactivos de captura que no requieren una etapa de lavado en el ensayo asociado pueden agruparse en un dispositivo de ensayo. Reactivos de captura que requieren una etapa de lavado en el ensayo asociado pueden, de forma similar, agruparse conjuntamente. Ello puede tener la ventaja de que pueden obtenerse resultados, si se desea, a partir de una única muestra líquida de prueba, para cada ensayo reactivo de captura/analizado, o para cualquier combinación disponible de ensayos reactivo de captura/analizado. Sin embargo, se apreciará que no es esencial agrupar los reactivos de captura de esta forma.

Se prefiere que los resultados se obtengan usando el mismo método de detección en relación con cada reactivo de captura/analizado incluido en un dispositivo. Así, se prefiere que, por ejemplo, se use una etiqueta fluorescente en relación con cada dicho reactivo de captura. Alternativamente, puede usarse una etiqueta detectable visualmente en relación con cada dicho reactivo de captura. Se apreciará que un dispositivo en el que se inmovilice más de una especie de reactivos de captura puede ser particularmente adecuado para usarse en un procedimiento automático y/o un procedimiento en el que los resultados de ensayo no se determinen por examen visual no asistido.

Se prefiere que pueden realizarse los ensayos relativos a cada reactivo de captura inmovilizado en un dispositivo, particularmente cuando se usa un sistema automático, pero los resultados de ensayos seleccionados solamente pueden comunicarse al usuario. Así, los reactivos en relación con todos los reactivos de captura pueden introducirse en el dispositivo y determinarse la señal relativa a cada reactivo de captura, pero solamente deben comunicarse al usuario los resultados de ensayos por los que haya pagado. Resultados adicionales pueden obtenerse a cambio del pago de tarifas adicionales, lo que puede hacerse por medio de un sistema de crédito electrónico. Así, si, por ejemplo, el dispositivo comprende reactivos de captura para su uso con reactivos para los que se requiere un aparato de detección, puede requerirse al usuario que pague una tasa por resultado transmitido aunque se hayan generado señales significativas en relación con dicho reactivo de captura/analizado.

Debe notarse que las propiedades físicas o químicas del dispositivo pueden determinar qué reactivos de captura pueden ser incorporados en un dispositivo y por tanto qué combinaciones de reactivos de captura son posibles en una realización dada del dispositivo.

Se apreciará que la concentración o elección de reactivos adicionales, por ejemplo anticuerpos marcados, en relación con cada reactivo de captura puede ser tal que el tiempo requerido para cada etapa de un ensayo sea satisfactoria u óptima para cada reactivo de captura para el que se desee determinar la presencia o concentración del analizado relevante. Así, si un primer par analizado/anticuerpo marcado tiene una mayor afinidad de ligamiento que un segundo par analizado/anticuerpo marcado, entonces la concentración de dicho segundo anticuerpo marcado usado en el ensayo puede ser mayor que la concentración de dicho primer anticuerpo marcado.

En algunas circunstancias se prefiere que el ligamiento de al menos una parte de un analizado a un colaborador específico de ligamiento para ese analizado sea capaz de detectarse por medio de una señal visual. Marcadores que pueden usarse para proveer una señal visual son bien conocidos por los expertos e incluyen reactivos tales como soluciones coloreadas, partículas coloreadas de látex (por ejemplo de entre 0,05 y 0,5 micras), liposomas o células como se describe, por ejemplo, en US 5,656,503, US 4,943,522 y US 5,770,460. Puede preferirse una señal visual si el dispositivo debe usarse por un paciente, o por un médico para obtener un resultado inmediato. Puede ser beneficioso si la zona de detección 9 tiene un fondo de color contrastante con la señal visual para ayudar a la observación de la señal visual cuando se ve contra el fondo. Si el dispositivo comprende un soporte sólido como antes descrito, éste puede ser de un color contrastante con la señal visual.

Puede alternativamente preferirse que dicho ligamiento de al menos una porción del analizado a un colaborador específico de ligamiento para ese analizado sea capaz de detectarse por medio de una señal fluorescente o quimioluminiscente. Los marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes se han descrito anteriormente. Una señal fluorescente o quimioluminiscente puede preferirse si el dispositivo debe usarse en procedimientos automatizados de prueba, particularmente si se desea analizar más de un analizado en un dispositivo.

El dispositivo puede ser útil para ensayar analizados en muestras tales como sangre, suero u orina o en muestras ambientales, por ejemplo agua potable, o muestras de comida o bebida.

Los analizados adecuados serán bien conocidos por los expertos e incluyen cualquier molécula para la que puede encontrarse un colaborador específico de ligamiento, por ejemplo un anticuerpo que es capaz de ligarse específicamente a dicha molécula. Se dan ejemplos en US 5,656,503, US 4,943,522 y US 5,770,460 e incluyen hormonas, drogas, por ejemplo drogas de abuso, bacterias o antígenos virales, inmunoglobulinas, antígenos de cáncer, citoquinas, alergenos y ácidos nucleicos.

Claims (25)

1. Un dispositivo de ensayo para cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido, comprendiendo:

una primera porción que comprende

una zona de flujo lateral;

una zona de recepción de muestra en la primera porción en contacto con la zona de flujo lateral; y una segunda porción que tiene medios para soportar una almohadilla absorbente, en donde la primera porción está dispuesta en relación deslizante con la segunda porción, de forma que la segunda porción es movible entre una primera posición en la que hay una holgura entre una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción y la zona de flujo lateral y una segunda posición en la que una almohadilla absorbente soportada por la segunda porción está en contacto íntimo con la zona de flujo lateral y en donde la zona de flujo lateral comprende una cámara capilar plana.

2. El dispositivo de la reivindicación 1 en donde la profundidad de la cámara capilar es mayor en un borde de la cámara capilar en contacto con la muestra - zona receptora que en el borde de la cámara capilar que entra en contacto con la almohadilla absorbente.

3. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la zona de flujo lateral comprende una zona de detección y/o de ligamiento.

4. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde en donde la cámara capilar plana comprende una zona de detección y/o de ligamiento.

5. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el dispositivo comprende una placa plana.

6. El dispositivo de la reivindicación 5 en donde dicha placa plana o una porción de la misma forma una pared de dicha cámara capilar plana.

7. El dispositivo de la reivindicación 5 o 6 en donde la placa plana tiene dimensiones de alrededor de 25 mm x 75 mm x 1 mm.

8. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde al menos una porción de la placa plana o una porción de una pared de la cámara capilar plana a la radiación visible, UV y/o infrarroja.

9. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 en donde dicha placa plana es un portaobjetos de microscopio.

10. El dispositivo de la reivindicación 9 en donde dicho portaobjetos de microscopio es un portaobjetos de vidrio de microscopio.

11 El dispositivo de la reivindicación 1 en donde la primera y/o segunda porción comprende un molde de plástico.

12. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el dispositivo comprende material, por ejemplo cobre, con alta conductividad térmica.

13. El dispositivo de la reivindicación 12 en donde dicho material con alta conductividad térmica está en contacto con, o forma parte de la zona de flujo lateral.

14. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en donde la cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido se realiza por medio de una señal visual.

15. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en donde en donde la cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido se realiza por medio de una señal fluorescente.

16. Una porción para formar parte de un dispositivo de ensayo, estando la porción configurada para ser unible de forma permanente o desmontable a una placa plana como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7, 9 o 10 de forma que una parte de dicha porción forma una cámara capilar plana entre dicha placa y dicha porción y una parte de dicha porción participa en la formación de una zona de recepción de muestra, en donde dicha zona de recepción de muestra y dicha cámara capilar están en contacto.

17. La porción según reivindicación 16 en donde una parte de una porción participa en la formación de una cámara capaz de acomodar una almohadilla absorbente, en donde la cámara está en contacto con la cámara capilar.

18. Un conjunto de partes comprendiendo una porción para formar parte de un dispositivo de ensayo según reivindicaciones 16 o 17 y una placa plana a la cual la porción es capaz de estar unida de forma permanente o desmontable como mencionado de manera que forme una cámara capilar plana.

19. Un conjunto de partes según reivindicación 18 en donde la placa plana tiene inmovilizado sobre ella un reactivo de captura.

20. Un conjunto de partes según reivindicación 18 en donde la placa plana tiene inmovilizado sobre ella un conjunto de reactivos de captura.

21. Un conjunto de partes según reivindicación 18, 19 o 20 comprendiendo además una segunda porción que soporta o está dispuesta para soportar una almohadilla absorbente y/o una almohadilla absorbente y/o reactivos adecuados para llevar a efecto un ensayo.

22. Un método de formación de un dispositivo de ensayo según reivindicación 1, comprendiendo la etapa de unir de forma permanente o desmontable una placa plana como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones18 a 20 a una porción para la formación de una parte de un dispositivo de ensayo según reivindicaciones 16 o 17.

23. El método de la reivindicación 22 comprendiendo además la etapa de unir una segunda porción que soporta o está dispuesta para soportar una almohadilla absorbente a la placa plana y/o la porción para formar parte de un dispositivo de ensayo.

24. Uso de una placa plana como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 y/o una porción para formar parte de un dispositivo de ensayo según reivindicaciones 16 o 17, en la formación de un dispositivo de ensayo según reivindicación 1.

25. Un método para cuantificación o detección de la presencia o ausencia de un analizado en una muestra de líquido, comprendiendo las etapas de aplicar la muestra de líquido a un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en donde el dispositivo está en la primera posición cuando la muestra de líquido está aplicada al dispositivo, comprendiendo además el método la etapa de mover la segunda porción a la segunda posición.

26. El método de la reivindicación 25 en donde la etapa de mover la segunda porción se realiza tras transcurrir un tiempo determinado desde la aplicación de la muestra del líquido al dispositivo.